CN107447055A - 猪细小病毒微滴数字pcr绝对定量检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪细小病毒微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒。本发明提供的引物探针组，由序列1所示的引物F2、序列2所示的引物R2和探针P2组成；探针P2的核苷酸序列如序列表的序列3所示，一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团。所述引物探针组的用途为：鉴定猪细小病毒；检测待测样本是否含有猪细小病毒；检测待测样本中猪细小病毒的含量。本发明对于猪细小病毒的防控具有重大的应用价值，有助于从源头控制疫情、有效预防猪疫病的大规模爆发。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种猪细小病毒微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒。
背景技术
猪细小病毒(PPV)是Mayr和Mahnl于1966年在用猪肾原代细胞进行猪瘟病毒组织培养时发现的，随后被鉴定为一种DNA病毒，是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一，Cartwight等首次证实了其致病性。自20世纪60年代中期以来，欧洲、美洲、亚洲等很多国家分离到该病毒或检测出其抗体。国内潘雪珠等(1982)在上海首次分离到该病毒，此后在全国不同省份均有分离到PPV的报道。其特征是母猪孕前期受到感染，经胎盘使胚胎或胎儿受到侵袭，引起初产母猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕等，同时还可引起仔猪的皮炎和腹泻，由于怀孕母猪感染该病毒后临床症状不明显，而且该病在世界范围内广泛传播和流行，严重影响着养猪业的发展。因此本病一直是猪病研究的热点之。在长期的生产实践及研究中发现各种类型、年龄段的猪均可感染PPV，但除怀孕母猪和仔猪外，其他类型的猪感染后均无明显临床症状。PPV又常同猪伪狂犬病毒、乙型脑炎病毒、圆环病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒等混合感染而加重了其危害，PPV与2型猪圆环病毒协同感染是导致断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要原因之一。相关统计资料显示，自20世纪60年代中期以来，相继从欧洲、美洲、亚洲等很多国家分离到猪细小病毒病毒或其抗体，在我国也广泛存在，并在大多数猪场呈地方性流行，给养猪业造成了巨大的经济损失，特别是近几年，随着我国规模化养猪业的发展和品种的引进，PPV感染呈扩大上升的趋势。
传统的PPV检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接免疫荧光试验(IFA)和间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)等。目前最常用核酸检测方法有PCR和Realtime PCR。传统的PPV检测方法存在需要使用高成本仪器设备，试验所需时间较长等不足。PCR和Realtime PCR较之以往方法具有特异性更强、灵敏度高、重复性好且自动化程度高等特点。以上各个方法均只能实现定性和半定量的检测，无法对病毒核酸进行精确定量，在灵敏度和敏感性特异性上仍存在一定的局限性。
数字化PCR(Digital PCR，dPCR)的概念早在1999年就由Bert Vogelstein采用并发表相关文献，其初衷是为了能够从临床样品(如尿液、淋巴液、血浆、粪便等)大量的正常体细胞中检测出微量的突变细胞，但由于当时能用于稀释样品的耗材只是384孔板，因此还不能非常好地体现数字PCR的核心理念——“无限稀释”(terminal dilution)。Bio-Rad公司的QX200系统核心的微滴化技术能够将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，本质上将传统定量PCR的一个test变成20,000个test，大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度，是对“无限稀释”这一概念的完美演绎，其方法原理可称为微滴式数字化PCR(DropletDigital PCR，ddPCR)。QX200ddPCR系统包括两台仪器：微滴发生器和微滴分析仪，及其相关的耗材。微滴发生器将每个样品分成20,000个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。随后微滴转移至96孔PCR板上，开展终点PCR扩增。采用微滴分析仪(droplet reader)逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。与传统的定量PCR相比，数字PCR的精确度和灵敏度更佳。利用微滴式数字PCR技术，研究人员可以检测稀有突变，精确测定拷贝数变异，并对基因表达进行绝对定量。凭借QX200系统的高灵敏度，研究人员如今可检测浓度低至1/1,000,000的靶分子。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪细小病毒微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒。
本发明首先提供了一种引物探针组，由引物F2、引物R2和探针P2组成；
所述引物F2为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物R2为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述探针P2，一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团，核苷酸序列为如下(a5)或(a6)：
(a5)如序列表的序列3所示；
(a6)如将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加所示。
所述探针P2的5’末端标记荧光基团FAM，3’末端标记荧光淬灭基团BHQ1。
所述引物探针组的用途为如下(b1)、(b2)、(b3)、(b4)、(b5)或(b6)：
(b1)鉴定猪细小病毒；
(b2)制备用于鉴定猪细小病毒的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否含有猪细小病毒；
(b4)制备用于检测待测样本是否含有猪细小病毒的试剂盒；
(b5)检测待测样本中猪细小病毒的含量；
(b6)制备用于检测待测样本中猪细小病毒含量的试剂盒。
本发明还保护所述引物探针组的应用，为如下(b1)、(b2)、(b3)、(b4)、(b5)或(b6)：
(b1)鉴定猪细小病毒；
(b2)制备用于鉴定猪细小病毒的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否含有猪细小病毒；
(b4)制备用于检测待测样本是否含有猪细小病毒的试剂盒；
(b5)检测待测样本中猪细小病毒的含量；
(b6)制备用于检测待测样本中猪细小病毒含量的试剂盒。
本发明还保护一种试剂盒，包括所述引物探针组；所述试剂盒的功能为如下(c1)、(c2)或(c3)：(c1)鉴定猪细小病毒；(c2)检测待测样本是否含有猪细小病毒；(c3)检测待测样本中猪细小病毒的含量。
所述试剂盒还包括记载有方法Ⅰ和/或方法Ⅱ的和/或方法Ⅲ的载体。
本发明还保护一种检测待测病毒是否为猪细小病毒的方法(方法Ⅰ)，包括如下步骤：以待测病毒的基因组DNA为模板，采用所述引物探针组进行数字PCR，如果检测结果为阳性、待测病毒为或候选为猪细小病毒，如果检测结果为阴性、待测病毒为或候选为非猪细小病毒。
本发明还保护一种检测待测样本是否含有猪细小病毒的方法(方法Ⅱ)，包括如下步骤：以待测样本的总DNA为模板，采用所述引物探针组进行数字PCR，如果检测结果为阳性、待测样本含有猪细小病毒，如果检测结果为阴性、待测样本不含有猪细小病毒。
本发明还保护一种检测待测样本中猪细小病毒的含量的方法(方法Ⅲ)，包括如下步骤：以待测样本的总DNA为模板，采用所述引物探针组进行数字PCR，根据猪细小病毒阳性微滴的数量得到待测样本中猪细小病毒的含量。
所述方法Ⅰ或方法Ⅱ或方法Ⅲ中，所述数字PCR的反应体系中，引物F2的浓度为0.9μM，引物R2的浓度为0.9μM，探针的浓度为0.4μM。
所述方法Ⅰ或方法Ⅱ或方法Ⅲ中，所述数字PCR的反应体系可由2×ddPCRSupermix for Probes、引物F2、引物R2、探针P2、模板和RNase Free dH2O组成。
所述方法Ⅰ或方法Ⅱ或方法Ⅲ中，所述数字PCR的反应程序可为：95℃预变性10min；94℃变性30sec、58℃退火60sec，共40个循环；98℃10min。
所述方法Ⅰ或方法Ⅱ或方法Ⅲ中，所述数字PCR的反应程序中，升降温速度设置为2.5℃/sec。
本发明还保护一种预混液，其中含有所述引物F2、所述引物R2和所述探针P2；所述预混液中，引物F2的浓度为1μM，引物R2的浓度为1μM，探针P2的浓度为4/9μM。所述预混液由2×ddPCR Supermix for Probes，所述引物F2、所述引物R2、所述探针P2和RNase FreedH2O组成。所述预混液的功能为如下(c1)、(c2)或(c3)：(c1)鉴定猪细小病毒；(c2)检测待测样本是否含有猪细小病毒；(c3)检测待测样本中猪细小病毒的含量。
本发明还保护一种试剂盒，包括所述预混合和微滴发生油。所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为RNase Free dH2O；所述阳性对照为含有猪细小病毒的基因组DNA的溶液。所述试剂盒的功能为如下(c1)、(c2)或(c3)：(c1)鉴定猪细小病毒；(c2)检测待测样本是否含有猪细小病毒；(c3)检测待测样本中猪细小病毒的含量。
所述试剂盒还包括记载有方法Ⅳ和/或方法Ⅴ和/或方法Ⅵ的载体。
所述方法Ⅳ为一种通过数字PCR检测待测病毒是否为猪细小病毒的方法，包括如下步骤：将待测病毒的基因组DNA或其稀释液作为模板溶液，将2μL模板溶液和18μL所述预混液混合后与70μL微滴发生油同置于微滴生成仪中形成微滴，然后进行PCR扩增，然后在微滴分析仪中进行检测，如果检测结果为阳性、待测病毒为或候选为猪细小病毒，如果检测结果为阴性、待测病毒为或候选为非猪细小病毒。
所述方法Ⅴ为一种通过数字PCR检测待测样本是否含有猪细小病毒的方法，包括如下步骤：将待测样本的总DNA或其稀释液作为模板溶液，将2μL模板溶液和18μL所述预混液混合后与70μL微滴发生油同置于微滴生成仪中形成微滴，然后进行PCR扩增，然后在微滴分析仪中进行检测，如果检测结果为阳性、待测样本含有猪细小病毒，如果检测结果为阴性、待测样本不含有猪细小病毒。
所述方法Ⅵ为一种通过数字PCR检测待测样本中猪细小病毒的含量的方法，包括如下步骤：将待测样本的总DNA或其稀释液作为模板溶液，将2μL模板溶液和18μL所述预混液混合后与70μL微滴发生油同置于微滴生成仪中形成微滴，然后进行PCR扩增，然后在微滴分析仪中进行检测，根据猪细小病毒阳性微滴的数量得到待测样本中猪细小病毒的含量。
所述方法Ⅳ或方法Ⅴ或方法Ⅵ中，所述PCR扩增的反应程序可为：95℃预变性10min；94℃变性30sec、58℃退火60sec，共40个循环；98℃10min。
所述方法Ⅳ或方法Ⅴ或方法Ⅵ中，所述数字PCR的反应程序中，升降温速度设置为2.5℃/sec。
本发明还保护所述预混液或所述试剂盒的应用，为如下(c1)、(c2)或(c3)：(c1)鉴定猪细小病毒；(c2)检测待测样本是否含有猪细小病毒；(c3)检测待测样本中猪细小病毒的含量。
以上任一所述数字PCR具体可为微滴式数字化PCR。
以上任一所述试剂盒具体可为微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒。
以上任一所述数字PCR具体采用QX200Droplet Digital PCR系统。
以上任一所述待测样本可为待测动物组织样本，例如猪肺。
以上任一所述待测病毒可为猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型、猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型、2型猪圆环病毒、伪狂犬病病毒或猪传染性胃肠炎病毒。
本发明摸索了引物和探针的浓度，找到了最适ddPCR的引物和探针的工作浓度。摸索了ddPCR反应过程中最适的升降温速度，以提高ddPCR的扩增效率。
本发明提供了具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、可实现精确定量的微滴式数字化PCR试剂盒，用于猪细小病毒的检测，可直接定量，无需标准曲线、操作简便、结果准确可靠，特别适合现场检测。本发明对于猪细小病毒的防控具有重大的应用价值，有助于从源头控制疫情、有效预防猪疫病的大规模爆发。
附图说明
图1为引物探针组的筛选对应的结果。
图2为升降温速度的优化对应的结果。
图3为退火温度的优化对应的结果。
图4为引物、探针浓度的优化对应的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例中的数字PCR均采用Bio-Rad Laboratories,Inc.的QX200DropletDigital PCR系统(包括两个仪器：QX200微滴生成仪和QX200微滴分析仪)。实施例中所用的热封仪为PX1TM PCR热封仪，实施例中所用的微滴发生卡为DG8TM微滴发生卡(8×3)，实施例中所用的底座为发生卡底座，实施例中所用的微滴发生油为微滴发生油(用于探针)，均为Bio-Rad Laboratories,Inc.的产品。2×ddPCR Supermix for Probes，为Bio-RadLaboratories,Inc.的产品。
实施例中所用的猪细小病毒毒株为NADL-2，VR-742TM，在GENBANK中的序列号为KF913351。实施例中所用的猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型毒株为VR-2332TM，在GENBANK中的序列号为U87392。实施例中所用的猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型毒株为LV(Lelystad virus)，在GENBANK中的序列号为M96262。实施例中所用的2型猪圆环病毒毒株为08TJ，在GENBANK中的序列号为HQ395021。实施例中所用的伪狂犬病病毒毒株为Bartha，在GENBANK中的序列号为JF797217。实施例中所用的猪传染性胃肠炎病毒为VR-743TM，在GENBANK中的序列号为DQ811785。
实施例1、引物及探针的设计与筛选
一、引物和探针的设计与筛选
通过大量序列获取、分析、比对以及预实验，设计并初步筛选得到四条引物和两条探针，核苷酸序列如下：
F1：5’-CCCACTGATGACACCTTTG-3’；
R1：5’-AACAGAGGCTCATCCTGGT-3’；
P1：5’-CGCGTAGAACTGACAACAACGCTGA-3’；
F2(序列表的序列1)：5’-AGTGGGTCGGAGCACCAGTTC-3’；
R2(序列表的序列2)：5’-CGCAGACACGAATCCAGAGGCT-3’；
P2(序列表的序列3)：5’-AACTGTGACAACTGGAACGCTGACGCA-3’。
F1和F2均为上游引物，R1和R2均为下游引物，P1和P2均为探针。P1的5’末端标记荧光基团FAM，3’末端标记荧光淬灭基团BHQ1。P2的5’末端标记荧光基团FAM，3’末端标记荧光淬灭基团BHQ1。
二、引物探针组的筛选
将步骤一筛选得到的四条引物和两条探针进行随机组合，形成八个引物探针组：由F1、R1和P1组成的引物探针组F1R1P1，由F1、R1和P2组成的引物探针组F1R1P2，由F1、R2和P1组成的引物探针组F1R2P1，由F1、R2和P2组成的引物探针组F1R2P2，由F2、R1和P1组成的引物探针组F2R1P1，由F2、R1和P2组成的引物探针组F2R1P2，由F2、R2和P1组成的引物探针组F2R2P1，由F2、R2和P2组成的引物探针组F2R2P2。
1、取猪细小病毒，提取基因组DNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，分别采用各个引物探针组进行实时荧光定量PCR。
PCR的反应体系(20μL)：Probe qPCR Master Mix，1.2μL引物溶液(引物溶液中上游引物和下游引物的浓度均为10μM)，0.6μL探针溶液(探针溶液中探针的浓度为10μM)，2μL模板，6.2μL dH2O。
PCR的反应程序：95℃2min；95℃15s，60℃1min，40个循环。
结果见图1。采用引物探针组F2R2P2进行实时荧光定量PCR，扩增曲线的信号值最强。
实施例2、数字PCR中相关反应参数的优化
一、升降温速度的优化
1、取猪细小病毒，提取基因组DNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用引物探针组F2R2P2进行数字PCR。
(1)配制如下体系(20μL)：10μL 2×ddPCR Supermix for Probes，1.8μL上游引物，1.8μL下游引物，0.8μL探针，2μL模板，3.6μL RNase Free dH2O。体系中，上游引物的浓度为0.9μM，下游引物的浓度为0.9μM，探针的浓度为0.4μM。
(2)取微滴发生卡固定于底座上，中间一排的8个孔内每孔加入20μL步骤(1)配制的体系，底部一排的8个孔内每孔加入70μL微滴发生油，然后将固定有微滴发生卡的底座放置于微滴生成仪中形成微滴(微滴生成于微滴发生卡顶部一排的8个孔内)。
(3)取一个96孔板(命名为96孔板甲)，完成步骤(2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板甲的8个孔中，用热封仪进行封膜。取一个96孔板(命名为96孔板乙)，完成步骤(2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板乙的8个孔中，用热封仪进行封膜。
(4)将完成步骤(3)的96孔板甲和96孔板乙置于不同的PCR仪中，进行PCR扩增。
PCR扩增程序：95℃预变性10min；94℃变性30sec、58℃退火60sec，共40个循环；98℃10min。
96孔板甲采用的升降温速度设置为5℃/sec。
96孔板乙采用的升降温速度设置为2.5℃/sec。
(5)完成步骤(4)后，取96孔板，在微滴分析仪中进行检测，猪细小病毒阳性的微滴显示蓝色荧光。
结果见图2，A为96孔板甲的结果，B为96孔板乙的结果。升降温速度设置为2.5℃/sec，每微升模板中，猪细小病毒的检测值为1794copies，扩增效率高，阴性微滴和阳性微粒之间的距离分的很开、很容易区分。升降温速度设置为5℃/sec，每微升模板中，猪细小病毒的检测值为1700copies，扩增效率低，阴性微滴和阳性微粒之间的距离分的不开、不容易区分。
二、退火温度的优化
1、取猪细小病毒，提取基因组DNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用引物探针组F2R2P2进行数字PCR。
(1)配制如下体系(20μL)：10μL 2×ddPCR Supermix for Probes，1μL上游引物，1μL下游引物，0.5μL探针，2μL模板，5.5μL RNase Free dH2O。体系中，上游引物的浓度为0.5μM，下游引物的浓度为0.5μM，探针的浓度为0.25μM。
(2)取微滴发生卡固定于底座上，中间一排的8个孔内每孔加入20μL步骤(1)配制的体系，底部一排的8个孔内每孔加入70μL微滴发生油，然后将固定有微滴发生卡的底座放置于微滴生成仪中形成微滴(微滴生成于微滴发生卡顶部一排的8个孔内)。
(3)取一个96孔板(命名为96孔板Ⅰ)，完成步骤(2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板Ⅰ的8个孔中，用热封仪进行封膜。取一个96孔板(命名为96孔板Ⅱ)，完成步骤(2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板Ⅱ的8个孔中，用热封仪进行封膜。取一个96孔板(命名为96孔板Ⅲ)，完成步骤(2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板Ⅲ的8个孔中，用热封仪进行封膜。取一个96孔板(命名为96孔板Ⅳ)，完成步骤(2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板Ⅳ的8个孔中，用热封仪进行封膜。取一个96孔板(命名为96孔板Ⅴ)，完成步骤(2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板Ⅴ的8个孔中，用热封仪进行封膜。取一个96孔板(命名为96孔板Ⅵ)，完成步骤(2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板Ⅵ的8个孔中，用热封仪进行封膜。
(4)将完成步骤(3)的各个96孔板置于不同的PCR仪中，进行PCR扩增。
PCR扩增程序：95℃预变性10min；94℃变性30sec、退火60sec，共40个循环；98℃10min。采用的升降温速度设置为2.5℃/sec。
96孔板Ⅰ至96孔板Ⅵ所在的PCR仪，依次设置如下退火温度：50.0℃、52.0℃、55.0℃、57.0℃、58.0℃、60.0℃。
(5)完成步骤(4)后，取96孔板，在微滴分析仪中进行检测，猪细小病毒阳性的微滴显示蓝色荧光。
结果见图3。采用50.0℃的退火温度，每微升模板中，猪细小病毒的检测值为1278copies。采用52.0℃的退火温度，每微升模板中，猪细小病毒的检测值为1352copies。采用55.0℃的退火温度，每微升模板中，猪细小病毒的检测值为1476copies。采用57.0℃的退火温度，每微升模板中，猪细小病毒的检测值为1503copies。采用58.0℃的退火温度，每微升模板中，猪细小病毒的检测值为1552copies。采用60.0℃的退火温度，每微升模板中，猪细小病毒的检测值为1512copies。
采用58.0℃的退火温度，检测值与实际值最接近。
结果表明，退火温度可以选择57-60℃，最优退火温度为58℃。
三、引物、探针浓度的优化
1、取猪细小病毒，提取基因组DNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用引物探针组F2R2P2进行数字PCR。
(1)配制不同体系，具体见表1(表格中的数字为各个组分的加入体积，单位为μL)。用于配制体系的上游引物浓度、下游引物浓度和探针浓度均为10μM。
表1
(2)取微滴发生卡固定于底座上，中间一排的8个孔内每孔加入20μL步骤(1)配制的体系，底部一排的8个孔内每孔加入70μL微滴发生油，然后将固定有微滴发生卡的底座放置于微滴生成仪中形成微滴(微滴生成于微滴发生卡顶部一排的8个孔内)。
(3)取96孔板，完成步骤(2)后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板的8个孔中，用热封仪进行封膜。
(4)将完成步骤(3)的96孔板置于PCR仪中，进行PCR扩增。
PCR扩增程序：95℃预变性10min；94℃变性30sec、60℃退火60sec，共40个循环；98℃10min。采用的升降温速度设置为2.5℃/sec。
(5)完成步骤(4)后，取96孔板，在微滴分析仪中进行检测，猪细小病毒阳性的微滴显示蓝色荧光。
结果见图4。采用体系1，每微升模板中，猪细小病毒的检测值为4040copies。采用体系2，每微升模板中，猪细小病毒的检测值为5180copies。采用体系3，每微升模板中，猪细小病毒的检测值为6060copies。采用体系4，每微升模板中，猪细小病毒的检测值为6360copies。
采用体系4，检测值与实际值最接近。
结果表明，反应体系中，最优的引物探针浓度为：上游引物0.9μM，下游引物0.9μM，探针0.4μM。
实施例3、试剂盒的制备
一、各个试剂的配制
溶液A为一步法ddPCR探针法预混液。每900μL溶液A的组成如下：500μL 2×ddPCRSupermix for Probes，90μL F2溶液(F2溶液中F2的浓度为10μM)，90μL R2溶液(R2溶液中R2的浓度为10μM)，40μL P2溶液(P2溶液中P2的浓度为10μM)，180μL RNase Free dH2O。
溶液B为微滴发生油。
溶液C为阳性对照。溶液C的制备方法：提取猪细小病毒的基因组DNA，使用Tris-EDTA缓冲液(pH8.0、0.01M)稀释，使其浓度为10000个拷贝数/微升。
溶液D为阴性对照。溶液D为RNase Free dH2O。
二、微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒的组装
试剂盒组成如下：溶液A、溶液B、溶液C、溶液D，分别独立包装。
三、试剂盒的使用方法
待测样本为待测病毒或待测猪组织，猪组织具体可为猪肺。
1、提取待测样本的DNA，将DNA或其稀释液作为模板溶液。待测样本为待测病毒时，提取基因组DNA。待测样本为待测猪组织时，提取总DNA。
2、取18μL溶液A，加入2μL模板溶液。用等体积溶液D代替模板溶液作为阴性对照处理。用等体积溶液C代替模板溶液作为阳性对照处理。
3、取微滴发生卡固定于底座上，中间一排的8个孔内每孔加入20μL步骤2配制的体系，底部一排的8个孔内每孔加入70μL溶液B，然后将固定有微滴发生卡的底座放置于微滴生成仪中形成微滴(微滴生成于微滴发生卡顶部一排的8个孔内)。
4、取96孔板，完成步骤3后，从微滴发生卡顶部一排的8个孔中，每个孔取40μL，以一一对应的方式加入96孔板的8个孔中，用热封仪进行封膜。
5、将完成步骤4的96孔板置于PCR仪中，进行PCR扩增。
PCR扩增程序：95℃预变性10min；94℃变性30sec、58℃退火60sec，共40个循环；98℃10min。采用的升降温速度设置为2.5℃/sec。
6、完成步骤5后，取96孔板，在微滴分析仪中进行检测，猪细小病毒阳性的微滴显示蓝色荧光。
同时满足如下两个条件说明结果可信：①每微升阳性对照中，猪细小病毒的检测值为10000±100拷贝数；②每微升阴性对照中，猪细小病毒的检测值为0。如果模板中检测到猪细小病毒阳性的微滴，说明待测样本中含有猪细小病毒，可根据阳性微滴数量得到猪细小病毒的拷贝数；如果模板中没有检测到猪细小病毒阳性的微滴，说明待测样本中不含有猪细小病毒。
实施例4、特异性检验
待测样本分别为：3D4/21猪肺细胞株、猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型毒株、猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型毒株、2型猪圆环病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒。
1、提取各个待测样本的核酸。
3D4/21猪肺细胞株、2型猪圆环病毒、伪狂犬病病毒分别提取基因组DNA，作为模板溶液。猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型毒株、猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型毒株、猪传染性胃肠炎病毒分别提供总RNA并反转录为cDNA，作为模板溶液。
2、采用实施例3制备的试剂盒，按照试剂盒的使用方法的步骤2至6进行检测。
各个待测样本均为阴性结果。
实施例5、临床样本检测
待测样本分别为70份猪肺，10份为已经通过发病表型与病毒培养鉴定为猪细小病毒感染的猪肺，10份为已经通过发病表型与病毒培养鉴定为2型猪圆环病毒感染的猪肺，10份为已经通过发病表型与病毒培养鉴定为伪狂犬病病毒感染的猪肺，10份为已经通过发病表型与病毒培养鉴定为猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型毒株感染的猪肺肉，10份为已经通过发病表型与病毒培养鉴定为猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型毒株感染的猪肺，10份为已经通过发病表型与病毒培养鉴定为猪传染性胃肠炎病毒的猪肺肉，10份为无任何发病表型且病毒培养不含以上6种病毒的猪肺。
采用实施例3制备的试剂盒，按照试剂盒的使用方法进行检测。
10份已经通过发病表型与病毒培养鉴定为猪细小病毒感染的猪肺均为阳性结果，其他各个待测样本均为阴性结果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国动物疫病预防控制中心
<120> 猪细小病毒微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒
<130> GNCYX171440
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
agtgggtcgg agcaccagtt c 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
cgcagacacg aatccagagg ct 22
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
aactgtgaca actggaacgc tgacgca 27
Claims (10)
1.一种引物探针组，由引物F2、引物R2和探针P2组成；
所述引物F2为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物R2为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述探针P2，一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团，核苷酸序列为如下(a5)或(a6)：
(a5)如序列表的序列3所示；
(a6)如将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加所示。
2.权利要求1所述引物探针组的应用，为如下(b1)、(b2)、(b3)、(b4)、(b5)或(b6)：
(b1)鉴定猪细小病毒；
(b2)制备用于鉴定猪细小病毒的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否含有猪细小病毒；
(b4)制备用于检测待测样本是否含有猪细小病毒的试剂盒；
(b5)检测待测样本中猪细小病毒的含量；
(b6)制备用于检测待测样本中猪细小病毒含量的试剂盒。
3.一种试剂盒，包括权利要求1所述引物探针组；所述试剂盒的功能为如下(c1)、(c2)或(c3)：
(c1)鉴定猪细小病毒；
(c2)检测待测样本是否含有猪细小病毒；
(c3)检测待测样本中猪细小病毒的含量。
4.一种检测待测病毒是否为猪细小病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述引物探针组进行数字PCR，如果检测结果为阳性、待测病毒为或候选为猪细小病毒，如果检测结果为阴性、待测病毒为或候选为非猪细小病毒。
5.一种检测待测样本是否含有猪细小病毒的方法，包括如下步骤：以待测样本的总DNA为模板，采用权利要求1所述引物探针组进行数字PCR，如果检测结果为阳性、待测样本含有猪细小病毒，如果检测结果为阴性、待测样本不含有猪细小病毒。
6.一种检测待测样本中猪细小病毒的含量的方法，包括如下步骤：以待测样本的总DNA为模板，采用权利要求1所述引物探针组进行数字PCR，根据猪细小病毒阳性微滴的数量得到待测样本中猪细小病毒的含量。
7.一种用于通过数字PCR检测猪细小病毒的预混液，其中含有权利要求1中所述的引物F2、引物R2和探针P2；所述预混液中，引物F2的浓度为1μM，引物R2的浓度为1μM，探针P2的浓度为4/9μM。
8.一种用于通过数字PCR检测猪细小病毒的试剂盒，包括权利要求7所述预混合和微滴发生油。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为RNase Free dH2O；所述阳性对照为含有猪细小病毒的基因组DNA的溶液。
10.权利要求7所述预混液或权利要求8所述试剂盒或权利要求9所述试剂盒的应用，为如下(c1)、(c2)或(c3)：
(c1)鉴定猪细小病毒；
(c2)检测待测样本是否含有猪细小病毒；
(c3)检测待测样本中猪细小病毒的含量。
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| CN101294224A (zh) * | 2007-05-08 | 2008-10-29 | 深圳太太基因工程有限公司 | 一种用于检测猪细小病毒核苷酸片段的引物和探针序列 |
| CN104364392A (zh) * | 2012-02-27 | 2015-02-18 | 赛卢拉研究公司 | 用于分子计数的组合物和试剂盒 |
| CN105483294A (zh) * | 2016-02-01 | 2016-04-13 | 北京佰鸥创投生物科技有限公司 | Prrsv美洲型经典株数字pcr绝对定量检测试剂盒 |
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2017
- 2017-09-19 CN CN201710845526.3A patent/CN107447055A/zh active Pending
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