CN103911463A - 一种检测多种蚊媒病原体的试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测多种蚊媒病原体的试剂盒及检测方法，其利用多重聚合酶链反应（PCR）结合液相芯片来检测多重蚊媒传染病病原体，可以一次平行检测包括黄热病毒（YFV）、登革热病毒（DV）Ⅰ-Ⅳ型、流行性乙型脑炎（日本脑炎）病毒（JEV）、疟原虫（Plasmodium）（4种，包括：间日疟原虫（PV）、恶性疟原虫（PF）、三日疟原虫（PM）、卵形疟原虫（PO））、西尼罗病毒（WNV）及基孔肯雅病毒（CHIKV），具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，操作简单，检测速度快的优点。

Description

一种检测多种蚊媒病原体的试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物芯片和诊断试剂技术领域，具体涉及一种检测多种蚊媒病原体的试剂盒及检测方法，其针对多种蚊媒传染病病原体设计特异性核酸探针并与多重聚合酶链反应（PCR）技术结合、采用液相芯片同步快速检测多种蚊媒病原体及其分型。
背景技术
蚊媒传染病是指有蚊虫叮咬人体而传播的疾病，近年来呈逐年上升趋势。蚊媒传染病一旦发生流行或暴发，将给社会稳定、人民群众的健康、生活、生产带来极大影响。根据国境口岸传染病排查需要，将黄热病、登革热、流行性乙型脑炎（日本脑炎）、疟疾、西尼罗热及基孔肯雅热六种疾病作为口岸重点关注的蚊媒传染病。这六种疾病在非洲等国家广泛流行、极易造成国际间的流行和传播，而这些疾病均有发热等症状，没有实验室的检测结果很难确诊。
在对上述病原体检测方面，目前常规的检测手段包括分离培养方法、免疫学方法，以及核酸检测方法，如PCR、多重PCR、RT-PCR和基于Taqman探针技术的实时荧光PCR方法等。但这些方法或多或少存在一些缺陷：如分离培养方法在技术上比较困难，且获得病原学诊断和药敏结果常需要3～5天以上，在临床上难以及早进行病原学诊断和耐药性测定，无法满足临床救治危重感染者的需要；免疫学方法检测病毒的特异性抗体时，不仅需分别在患者感染的急性期及恢复期采集双份血清，并且还可能存在抗原抗体间的交叉反应而干扰检测，不利于疾病的早期诊断；在核酸检测方法方面，PCR、多重PCR、RT-PCR方法及基于Taqman探针技术的实时荧光PCR方法等的灵敏度高，特异性好，适合于快速检测鉴定，但这些方法大多基于单一反应或较少数重数的多重反应的检测，在对临床样本进行检测时，对每一个样本的数十种指标进行检测和排除时，需要耗费大量的劳动和成本。
对于分子实验室中大量样本的常规检测，研究者正致力于开发和建设以多重快速检测为目标的检测平台，典型的高通量多重分析技术包括生物芯片、毛细电泳和质谱等，由于其能在同一反应容器中同时检测多个核酸序列，因此在节约时间、劳动和成本方面更具有优势，是高通量、特异、可靠、快速和经济的核酸检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测多种蚊媒病原体的试剂盒及检测方法，其利用多重聚合酶链反应（PCR）结合液相芯片来检测多重蚊媒传染病病原体，可以平行一次检测12种病原体或亚型，操作便捷，特异性强，灵敏度高，稳定性好。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种检测多种蚊媒病原体的试剂盒，该试剂盒包括用于检测下列病原体的探针：黄热病毒的探针YFV-PF、基孔肯雅病毒的探针CHIKV-PF、西尼罗WNV-PF、乙型脑炎病毒的探针JEV-PF、登革I型病毒的探针DV1-PF、登革Ⅱ型病毒的探针DV2-PF、登革Ⅲ型病毒的探针DV3-PF、登革Ⅳ型病毒的探针DV4-PF、间日疟原虫的探针PV-PF、三日疟原虫的探针PM-PF、卵形疟原虫的探针PO-PF和恶性疟原虫的探针PF-PF，上述探针的核苷酸序列分别参见表1，SEQ ID No：1-12。
表1 用于检测病原体的探针序列
名称 序列 SEQ ID No：
YFV-PF CCATCGCCTCAACCAAT 1
CHIKV-PF TCCAGGACATTTCCGCTACG 2
WNV-PF TACCCGGAGACGCCACA 3
JEV-PF GAGGCGCACGCCACAAA 4
DV1-PF AATAGCCATGACTGACACC 5
DV2-PF GGGGCCATATTCACTGATG 6
DV3-PF GGAAAGCCTACGCCCAA 7
DV4-PF CAGATGGATTGTTGAGAGA 8
PV-PF GCAACGCTTCTAGCTTAAT 9
PM-PF CGTTAAGAATAACCGCCAA 10
PO-PF GATGCTTAGACAATACAACG 11
PF-PF CTAGGGGAACTATTTTAGCT 12
优选的，所述试剂盒还包括用于扩增下列病原体目的片段的PCR引物对：
黄热病毒的引物对YFV-F和YFV-R、基孔肯雅病毒的引物对CHIKV-F和CHIKV-R、西尼罗的引物对WNV-F和WNV-R、乙型脑炎病毒的引物对JEV-F和JEV-R、登革I型病毒的引物对DV1-F和DV1-R、登革Ⅱ型病毒的引物对DV2-F 和DV2-R、登革Ⅲ型病毒的引物对DV3-F和DV3-R、登革Ⅳ型病毒的引物对DV4- F和DV4-R、以及疟原虫的通用引物对PU-F和PU-R，其核酸序列参见表2，SEQ ID No：13-30。
表2 用于PCR扩增的引物对序列
名称 序列 SEQ ID No：
YFV-F ACAGCGGCAATCAATAAA 13
YFV-R GTGGGTTCACCTCAATCA 14
CHIKV-F ACCCTCCGAAGGACCACA 15
CHIKV-R GCTGCAACAGCGACAACC 16
WNV-F GATGTGGAAGCCTGGATG 17
WNV-R GAGTCTGGAAACGGAACG 18
JEV-F GCACAGCGTGGAGAAACA 19
JEV-R CCAAGAGCAACAACGGACT    20
DV1-F GAGGTCAAGCCATCAGG  21
DV1-R TGTTGTCCAAAGGGTGT   22
DV2-F AAAAGACACCCAGGATGTGC 23
DV2-R CCTACTATCTTCAACAGCCTCA 24
DV3-F GAGCGGGATGGAGCCTTAG 25
DV3-R        TGGCGTTGGATGCTAATC 26
DV4-F AGTATCAAGAGGGTCCAGTAAG 27
DV4-R TGAGTGTCGCCATGTAATAAG 28
PU-F TTGTTGCAGTTAAAACGCTCG 29
PU-R GCTTTGAACACTCTAATTTACTC 30
进一步的，所述试剂盒还包括反转录引物混合液，其序列参见表3，SEQ ID NO：31-38。
表3 反转录引物序列
名称 序列 SEQ ID No：
YFV-RT AAAGGCAGAGCCAAACACC 31
CHIKV-RT GAACGACACGCATAGCA 32
WNV-RT TTTCCACCACGACACTCA 33
JEV-RT AATGACAACTGTTCCGTGGC   34
DV1-RT GTGCTGTGCCTCGTTTCG         35
DV2-RT CTGTGCCTCTTGGTGTTGGT 36
DV3-RT TTGCTGTGGGTATGTTCTGG 37
DV4-RT CTCCTGACACCCAATACATC   38
本发明还提供了一种多种蚊媒病原体的检测方法，基于微球的液相芯片技术，具体包括以下步骤：
①合成上述的引物对和探针，将每对引物中的下游引物5’端进行生物素标记；将每个探针5’端进行胺基化修饰且连有C12邻接臂序列；
②将所述探针分别与相应荧光编码的微球偶联、然后等数目混合，制得偶联有特异性核酸探针的微球组；
③抽提待测样本的DNA和RNA，并采用多重反转录反应的方法对RNA的特定基因序列反转录成cDNA；
④以cDNA/DNA为模板、采用步骤①中的引物对进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
⑤将PCR扩增产物与微球组温育杂交，然后加入链霉亲和素－藻红蛋白与微球（英文全称Streptavidin-R-phycoerythrin，缩写SA-PE）上捕获的PCR扩增产物上的生物素结合，形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物，利用液相芯片系统对待测样品进行定性和定量分析。
本发明采用基于微球的液相芯片技术，所述微球为直径5.6μm的聚苯乙烯微球，其内部染有两种可以进行光谱区分的荧光染料。精确控制两种荧光染料的量，可获得具有特异荧光编码的100种不同微球组。每种微球表面都可以修饰上不同的反应物。因为可以根据微球的特异荧光编码来区分不同的微球组，所以可以将它们混合在一起，在同一个反应容器中同时检测高达100种不同的分析物。在报告分子上还耦合有第三种荧光用于定量分析发生于微球表面的生物分子间的相互作用。微球在高速液流中经由液相芯片分析仪的两个独立激光进行分别检测。一个635nm、10mW的红色二极管激光激发微球上的两种荧光，另一个532nm、13mW的钇铝石榴石（YAG）激光激发结合在微球表面的报告分子的荧光（R-藻红蛋白，Alexa532，或Cy3）。高速数字信号处理器根据荧光编码地址对微球进行分类并定量微球表面的反应。每秒检测数千个微球的能力使该分析系统可以在数秒内对同一反应容器中的每个样品同时分析和报告高达100个不同的反应。与其它检测方法相比，本发明具有需标本量少、高通量检测；高速度、低成本；灵敏度高、有重复性好、线性范围广、操作简便等特点。
采用上述技术方案产生的有益效果在于：（1）本发明对RNA病毒特异基因进行多重特异性反转录，增加了病毒检测的特异性，减少了后期PCR扩增中非特异序列对扩增的影响，提高扩增效率，具有较高的灵敏度；（2）本发明选用的引物对各自扩增的病毒特异序列都有很高的灵敏度，在进一步改进的方案中，采用不对称PCR的方法，增加生物标记单链的产量，提高后期PCR产物与偶联有特异性核酸探针的微球杂交结合的效率，提高了检测的灵敏度；（3）本发明探针碱基成分合理，具有比较均一的Tm值，探针与PCR产物的杂交温度条件基本一致，有利于同一温度下杂交的同步性，提高检测的准确性；（4）本发明利用多重PCR反应结合液相芯片，可以一次平行检测包括黄热病毒（YFV）、登革热病毒（DV）Ⅰ-Ⅳ型、流行性乙型脑炎（日本脑炎）病毒（JEV）、疟原虫（Plasmodium）（4种，包括：间日疟原虫（PV）、恶性疟原虫（PF）、三日疟原虫（PM）、卵形疟原虫（PO））、西尼罗病毒（WNV）及基孔肯雅病毒（CHIKV），具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，操作简单，检测速度快的优点。
具体实施方式
一、按照表1和表2中的核酸序列合成所需的引物对和探针，将每对引物中的下游引物5’端进行生物素标记；并将将每个探针5’端进行胺基化修饰且连有C12邻接臂序列。
二、将所述探针分别与相应荧光编码的微球偶联、然后等数目混合，制得偶联有特异性核酸探针的微球组。
选取编号为22、39、15、12、18、30、36、42、45、49、56、52共12种微球（BioRad公司），按照如下方法进行核酸探针的偶联：
1．  将储存于2-10℃的编号为22、39、15、12、18、30、36、42、45、49、56、52的12种微球及储存于-20℃的2瓶未开封EDC粉末（10mg/瓶）置于室温平衡30分钟-60分钟。
2．  将YFV-PF、CHIKV-PF、WNV-PF、JEV-PF、DV1-PF、DV2-PF、DV3-PF、DV4-PF、PV-PF、PM-PF、PO-PF、PF-PF核酸探针分别用ddH2O溶解，浓度分别为0.1 nmol/μL；              
3．  将12种微球分别高速漩涡振荡30秒，再超声振荡30秒；
4．  各取100μL（1.25×106个）微球分别加入12个1.5mL Eppendorf管中；
5．  14000g离心4分钟沉淀微球；
6．  小心弃上清液，加入8.5μL 0.1M MES（pH4.5）重悬微球，并振荡混匀；
7．  每种核酸探针各取1μL（0.1 nmol/μL）分别加入上述对应编码的Eppendorf管中，并振荡混匀；
8．  新鲜制备10mg/ml浓度的EDC溶液，向上述Eppendorf管中每管加入0.5μl EDC溶液，并立即振荡混匀；
9．  避光，室温孵育30分钟；
10．            重复步骤8-9一次； 
11．            每管Eppendorf管中加入1ml 0.02% Tween 20，并短暂振荡混匀；
12．            14000g离心4分钟沉淀微球；
13．            弃上清液，加入1ml 0.1% SDS重悬微球，并振荡混匀40秒；
14．            16000g离心4分钟沉淀微球；
15．            弃上清液，加入20μ1 TE（pH8.0）重悬微球，并高速振荡混匀30秒；
16．            微球计数：
(1)     将偶联好的微球振荡混匀40秒；
(2)     用ddH2O将微球悬液稀释100倍，充分振荡混匀；
(3)     取10μL微球稀释液加入到血球计数板上；
(4)     对四个角上的计数室内的微球计数；
(5)     计算微球悬液的浓度；
12种微球悬液的计数结果都约为：4×104个/μl。
将偶联好的核酸探针微球等体积进行混合，以1.5×TMAC缓冲液稀释到每种微球的终浓度为150个/μl，2-10℃避光储存，即为可用于多种蚊媒病原体检测的特异性核酸探针微球组。
三、抽提待测样本的DNA和RNA，并采用多重反转录反应的方法对RNA病毒的特定基因序列反转录成cDNA。
（一）、样本的准备
用常规方法抽提1-12号临床样本的总RNA及基因组DNA，测浓度，备用。所述样本可以是蚊虫，还可以是血清。对于每个样本，需要同时抽提样本的DNA及RNA，抽提方法采取常规方法即可。
（二）、反转录反应
1、按照表3合成各反转录引物。
2、准备混合反转录引物工作液：
（1）  合成的每个反转录引物用TE（pH8.0）配制成100μmol/L的储存液；
（2）  分别取各反转录引物储存液10μl加入到同一1.5ml Eppendorf管中，加入420μl TE（pH8.0）补足到总体积为500μL，并振荡混匀，即为混合反转录引物工作液。
3、样本总RNA反转录反应
反应体系：使用TaKaRa公司反转录反应试剂对样本的总RNA进行反转录反应，反转录反应体系为10μl，其中，5×PrimeScriptTM Buffer 2μL、PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I 0.5μL、混合反转录引物工作液0.5μL、总RNA  1μg，补RNase Free dH2O至总体积为10μL。
反应程序：42℃ 15分钟→85℃ 5秒。
四、以cDNA/DNA为模板、采用步骤①中的引物对进行PCR扩增，制得PCR扩增产物。
本实施例中所述PCR扩增采用三个PCR反应体系，分别为PCR反应体系I、PCR反应体系Ⅱ和PCR反应体系Ⅲ；其中PCR反应体系I含有西尼罗引物对WNV-F和WNV-R，PCR反应体系Ⅱ含有黄热病毒的引物对YFV-F和YFV-R、登革I型病毒的引物对DV1-F和DV1-R、以及登革Ⅳ型病毒的引物对DV4- F和DV4-R；PCR反应体系Ⅲ包括CHIKV-F和CHIKV-R、JEV-F和JEV-R、DV2-F和DV2-R、DV3-F和DV3-R、PU-F和PU-R。具体的，三个PCR反应体系的工作液和反应条件如下：
（1）PCR反应体系I：PCR扩增反应体系为20μL，其中包括10×PCR Buffer 2μL、dNTP（2.5mmoL/L）2μL、goLdTaq酶（5U/μL）0.07μL、WNV-F（5μM）0.3μL、WNV-R（5μM） 1.5μL、样本反转录产物cDNA 1μL、补ddH2O 13.13μL至终体积为20μL。
PCR反应程序I：94℃ 5分钟；94℃ 30秒、56℃ 30秒、72℃ 30秒，进行40个循环；72℃ 10分钟；10℃保温。
（2）PCR反应体系II：PCR扩增反应体系为20μL，其中包括10×PCR Buffer 2μL、dNTP（2.5mmoL/L）2μL、goLdTaq酶（5U/μL）0.07μL、YFV-F（5μM）0.3μL、YFV-R（5μM） 1.5μL、DV1-F（5μM）0.3μL、DV1-R（5μM） 1.5μL、DV4-F（5μM）0.3μL、DV4-R（5μM） 1.5μL、样本反转录产物cDNA 1μL，补ddH2O 9.53μL至终体积为20μL；
PCR反应程序II：94℃ 5分钟；94℃ 30秒、56℃ 30秒、72℃ 30秒，进行40个循环；72℃ 10分钟；10℃保温。
（3）PCR反应体系Ⅲ：PCR扩增反应体系为20μL，其中包括10×PCR Buffer 2μL、dNTP（2.5mmoL/L）2μL、goLdTaq酶（5U/μL）0.07μL、CHIKV-F（5μM）0.3μL、CHIKV-R（5μM） 1.5μL、JEV-F（5μM）0.3μL、JEV-R（5μM） 1.5μL、DV2-F（5μM）0.3μL、DV2-R（5μM） 1.5μL、DV3-F（5μM）0.3μL、DV3-R（5μM） 1.5μL、PU-F（5μM）0.3μL、PU-R（5μM） 1.5μL、样本反转录产物cDNA 1μL、样本基因组DNA 1μL（约10-50ng），补ddH2O 4.93μL至终体积为20μL；
PCR反应程序Ⅲ：94℃ 5分钟；94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒，进行40个循环；72℃ 10分钟；10℃保温。
对于本发明的引物对，西尼罗需独立进行PCR扩增，因其与其他病原体在同一体系扩增时会出现干扰；其他病原体的引物对均可在同一体系中进行扩增，但本实施例中扩增体系是20μl，如果其他8种都放在一个体系中，体积会超出20μl，另外YFV、DV1、DV4在56℃条件下延伸，能得到更好的效果；CHIKV、JEV、DV2、DV3、PU-F在60℃条件下延伸能得到更好的效果。因此分成三个体系进行扩增。杂交时再将三个扩增体系中的扩增产物进行混合。
五、将PCR扩增产物与微球组温育杂交，然后加入链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR扩增产物上的生物素结合，形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物，利用液相芯片系统对待测样品进行定性和定量分析。
1、杂交
对于每个临床样本，分别取所对应的PCR扩增产物I、PCR扩增产物II、和PCR扩增产物Ⅲ各5μL加入到同一个洁净的0.25ml PCR反应管中，分别加入7μl TE（pH8.0）缓冲液和33μl核酸探针微球组（含12种核酸探针，每种核酸探针的微球数量约为5000个），振荡混匀后96℃变性5分钟，55℃杂交30分钟；同时按照上述比例制备阴性对照（模板为ddH2O）。
2、信号标记
每管杂交产物中分别加入100μL SA-PE（20μg/ml）标记试剂，振荡混匀后50℃孵育20分钟，形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物。
    3、检测
各取80μL信号标记产物加入96孔板中，使用Bio-PlexTM 200对杂交结果进行检测，检测数据见表4。
表4、样品1-12和阴性对照的定量检测结果
并根据下述标准进行结果判定：以每种病毒特异性核算探针的阴性对照检测读数作为背景值；对于登革病毒（DV1，DV2，DV3，DV4），针对每种病毒特异性核酸探针，其样本检测读数/背景值≥2，则判定此样本的该种病毒检测结果为阳性；其样本检测读数/背景值＜2，则判定此样本的该种病毒检测结果为阴性。对于其他八种病原体（WNV，YFV，CHIKV，JEV，PF，PO，PV，PM），针对每种病原体特异性核酸探针，其样本检测读数/背景值≥3，则判定此样本的该种病原体检测结果为阳性；其样本检测读数/背景值＜3，则判定此样本的该种病毒检测结果为阴性。
表5、样品1-12定性判定结果
上述检测结果与临床确诊结果完全相同，没有出现假阳性的情况，证明本发明检测方法的可靠性。
综上所述，本发明利用多重PCR反应结合液相芯片，可以一次平行检测包括黄热病毒（YFV）、登革热病毒（DV）Ⅰ-Ⅳ型、流行性乙型脑炎（日本脑炎）病毒（JEV）、疟原虫（Plasmodium）（4种，包括：间日疟原虫（PV）、恶性疟原虫（PF）、三日疟原虫（PM）、卵形疟原虫（PO））、西尼罗病毒（WNV）及基孔肯雅病毒（CHIKV），具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，操作简单，检测速度快的优点。 
<110>  河北国际旅行卫生保健中心
 
<120>  一种检测多种蚊媒病原体的试剂盒及检测方法
 
<130>  0
 
<160>  38   
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
ccatcgcctc aaccaat                                                    17
 
 
<210>  2
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tccaggacat ttccgctacg                                                 20
 
 
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tacccggaga cgccaca                                                    17
 
 
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gaggcgcacg ccacaaa                                                    17
 
 
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aatagccatg actgacacc                                                  19
 
 
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ggggccatat tcactgatg                                                  19
 
 
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ggaaagccta cgcccaa                                                    17
 
 
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cagatggatt gttgagaga                                                  19
 
 
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gcaacgcttc tagcttaat                                                  19
 
 
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cgttaagaat aaccgccaa                                                  19
 
 
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gatgcttaga caatacaacg                                                 20
 
 
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ctaggggaac tattttagct                                                 20
 
 
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acagcggcaa tcaataaa                                                   18
 
 
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gtgggttcac ctcaatca                                                   18
 
 
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accctccgaa ggaccaca                                                   18
 
 
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gctgcaacag cgacaacc                                                   18
 
 
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gatgtggaag cctggatg                                                   18
 
 
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gagtctggaa acggaacg                                                   18
 
 
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gcacagcgtg gagaaaca                                                   18
 
 
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ccaagagcaa caacggact                                                  19
 
 
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gaggtcaagc catcagg                                                    17
 
 
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tgttgtccaa agggtgt                                                    17
 
 
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aaaagacacc caggatgtgc                                                 20
 
 
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cctactatct tcaacagcct ca                                              22
 
 
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gagcgggatg gagccttag                                                  19
 
 
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tggcgttgga tgctaatc                                                   18
 
 
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agtatcaaga gggtccagta ag                                              22
 
 
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tgagtgtcgc catgtaataa g                                               21
 
 
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ttgttgcagt taaaacgctc g                                               21
 
 
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gctttgaaca ctctaattta ctc                                             23
 
 
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aaaggcagag ccaaacacc                                                  19
 
 
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gaacgacacg catagca                                                    17
 
 
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tttccaccac gacactca                                                   18
 
 
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aatgacaact gttccgtggc                                                 20
 
 
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gtgctgtgcc tcgtttcg                                                   18
 
 
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ctgtgcctct tggtgttggt                                                 20
 
 
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ttgctgtggg tatgttctgg                                                 20
 
 
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ctcctgacac ccaatacatc                                                 20

Claims (9)

1.一种检测多种蚊媒病原体的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括用于检测下列病原体的探针：黄热病毒的探针YFV-PF、基孔肯雅病毒的探针CHIKV-PF、西尼罗病毒WNV-PF、乙型脑炎病毒的探针JEV-PF、登革I型病毒的探针DV1-PF、登革Ⅱ型病毒的探针DV2-PF、登革Ⅲ型病毒的探针DV3-PF、登革Ⅳ型病毒的探针DV4-PF、间日疟原虫的探针PV-PF、三日疟原虫的探针PM-PF、卵形疟原虫的探针PO-PF和恶性疟原虫的探针PF-PF，上述探针的核苷酸序列分别依次如SEQ ID NO：1-12所示。
2.根据权利要求1所述的检测多种蚊媒病原体的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括用于扩增下列病原体目的片段的PCR引物对：
黄热病毒的引物对YFV-F和YFV-R，其序列参见SEQ ID NO：13-14；
基孔肯雅病毒的引物对CHIKV-F和CHIKV-R，其序列参见SEQ ID NO：15-16；
西尼罗病毒的引物对WNV-F和WNV-R，其序列参见SEQ ID NO：17-18；
乙型脑炎病毒的引物对JEV-F和JEV-R，其序列参见SEQ ID NO：19-20；
登革I型病毒的引物对DV1-F和DV1-R，其序列参见SEQ ID NO：21-22；
登革Ⅱ型病毒的引物对DV2-F 和DV2-R，其序列参见SEQ ID NO：23-24；
登革Ⅲ型病毒的引物对DV3-F和DV3-R，其序列参见SEQ ID NO：25-26；
登革Ⅳ型病毒的引物对DV4- F和DV4-R，其序列参见SEQ ID NO：27-28；
疟原虫的通用引物对PU-F2和PU-R2，其序列参见SEQ ID NO：29-30。
3.根据权利要求2所述的检测多种蚊媒病原体的试剂盒，其特征在于每对引物对中有一个5’端修饰有生物素标记，每个探针5’端均带有胺基化修饰且连有C12邻接臂序列、并分别与相应荧光标记的微球偶联。
4.根据权利要求2或3所述的检测多种蚊媒病原体的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括反转录引物混合液，其反转录引物序列参见SEQ ID NO：31-38。
5.一种多种蚊媒病原体的检测方法，基于微球的液相芯片技术，其特征在于具体包括以下步骤：
①合成权利要求2所述的引物对和探针，将每对引物中的下游引物5’端进行生物素标记；将每个探针5’端进行胺基化修饰且连有C12邻接臂序列；
②将所述探针分别与相应荧光编码的微球偶联、然后等数目混合，制得偶联有特异性核酸探针的微球组；
③抽提待测样本的DNA和RNA，并采用多重反转录反应的方法将RNA的特定基因序列反转录成cDNA；
④以cDNA/DNA为模板、采用步骤①中的引物对进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
⑤将PCR扩增产物与微球组温育杂交，然后加入链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR扩增产物上的生物素结合，形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物，利用液相芯片系统对待测样品进行定性和定量分析。
6.根据权利要求5所述的多种蚊媒病原体的检测方法，其特征在于步骤③中所述反转录采用权利要求3中的反转录引物混合液。
7.根据权利要求5所述的多种蚊媒病原体的检测方法，其特征在于步骤④中的PCR扩增采用不对称扩增，每对引物对中下游引物的浓度是上游引物浓度的3~8倍。
8.根据权利要求5所述的多种蚊媒病原体的检测方法，其特征在于步骤④中所述PCR扩增采用三个PCR反应体系，分别为PCR反应体系I、PCR反应体系Ⅱ和PCR反应体系Ⅲ；其中PCR反应体系I含有西尼罗病毒引物对WNV-F和WNV-R，PCR反应体系Ⅱ含有黄热病毒的引物对YFV-F和YFV-R、登革I型病毒的引物对DV1-F和DV1-R、以及登革Ⅳ型病毒的引物对DV4- F和DV4-R；PCR反应体系Ⅲ包括CHIKV-F和CHIKV-R、JEV-F和JEV-R、DV2-F和DV2-R、DV3-F和DV3-R、PU-F和PU-R；
步骤⑤中，首先将PCR反应体系I、PCR反应体系Ⅱ和PCR反应体系Ⅲ中取等体积的扩增产物加入至同一试管内，然后再与微球组温育杂交。
9.根据权利要求5所述的多种蚊媒病原体的检测方法，其特征在于步骤⑤中温育杂交的条件为：96℃变性5分钟，55℃杂交30分钟。
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