CN110066889A

CN110066889A - 同时检测四种黄热病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN110066889A
Application number: CN201910423499.XA
Authority: CN
Inventors: 田绿波; 石莹; 高国龙; 樊学军
Original assignee: Sichuan International Travel Sanitary Health-Care Center
Current assignee: Sichuan International Travel Sanitary Health-Care Center
Priority date: 2019-05-21
Filing date: 2019-05-21
Publication date: 2019-07-30
Anticipated expiration: 2039-05-21
Also published as: CN110066889B

Abstract

本发明属于病毒检测技术领域，公开了一种同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组、试剂盒及其应用。本发明基于GeXP技术设计了四对特异性引物和一对通用引物，并在此基础上构建了多重PCR体系，能够同时检测出寨卡病毒、黄热病毒、登革病毒和西尼罗病毒，有效缩短检测时间，并且具有特异性强、灵敏度高、准确率高、方便高效等优点，对由这四种病毒引起的虫媒病毒性疾病的诊断和防控具有重要意义。

Description

同时检测四种黄热病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

黄热病毒属病毒简称黄病毒，是黄病毒科的最大家族，包含8个血清学亚群，由70多种病毒构成，其中40多种病毒与人类疾病相关，包括登革病毒(DENV)、乙型脑炎病毒(JEV)、寨卡病毒(ZIKV)、蜱传脑炎病毒(TBEV)、西尼罗病毒(WNV)、Kujun病毒(KUN)和黄热病毒(YFV)等，其中大多数为虫媒病毒。这类病毒结构相似，大多数为有包膜的RNA病毒，能够在节肢动物体内增殖但对节肢动物不致病，可以通过昆虫叮咬传染给人或其他脊椎动物。

寨卡病毒是一种新现虫媒黄病毒，近期在美洲爆发流行，并有向全球扩散的趋势，已成为国际关注的突发性公共卫生事件。ZIKA为单链RNA病毒。1947年，科学家在乌干达一只患病猴子体内分离出了ZIKV，而后又在尼日利亚地区人身上检测到该病毒。ZIKA病毒于2014年传入美国并呈现出扩大蔓延趋势，引起世界卫生组织高度重视，2016年，在我国确诊了ZIKV输入性感染病例。ZIKV对成人不会造成生命危险，感染后出现发烧、头疼、皮疹、关节疼痛和结膜炎等温和症状，但其与罕见的格林巴利综合征及新生儿小头症有关。由于寨卡病毒最近几年才发生大规模流行，之前并未引起人们重视，目前对寨卡病毒的认识还很缺乏，开发寨卡病毒感染早期诊断技术对我国寨卡疾病的防控，尤其对育龄妇女有效防止新生儿小头畸形具有重要的意义。

黄热病毒基因组为不分节段的单股正链RNA，只有一个血清型。黄热病是由黄热病毒引起的急性传染病，蚊是主要传播媒介。黄热病分为城市型和丛林型两种，在非洲和南美洲热带地区性流行，WHO估计全球每年发病20万例，约3万例死亡，其中，90％以上发生在非洲。尽管目前我国至今尚无黄热病流行或者确诊病例的报告，但随着全球经济的发展，国际间人群交往日渐密切，全球一体化进程逐渐加速，使得黄热病毒通过各种传播媒介易在各个国家之间传播，而其一旦传入我国，将会对人群构成极大威胁。

登革病毒是一种通过蚊媒传播引起急性发热性传染病的病毒，根据病毒基因结构的特征，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型共四型。登革病毒主要在亚洲、非洲和南美洲的热带、亚热带地区流行，感染登革病毒后主要引起症状较轻的登革热，但少数病例会出现登革出血热，甚至在不及时治疗的情况下出现死亡。由于登革热是一种蚊传播疾病，一旦某一地区发生，极容易传播扩散。登革热在全球100多个国家发生过，25亿人具有感染的风险，每年大约有5000万人感染登革热病毒。

西尼罗病毒是近年来在全球广泛流行的一种鸟宿主虫媒病毒，以色列、法国、南非、阿尔及利亚和俄罗斯等国都有过暴发流行，但未引起广泛重视。1996年，该病毒袭击了罗马尼亚首都布加勒斯特，造成约400人发生脑炎、近40人死亡的严重后果，1999年，美国纽约暴发了西尼罗病毒感染，在随后的几年中，该病毒在美国广泛传播。

目前，国内外对上述病毒的诊断方法，主要还是依靠血清学试验、组织培养和常规的PCR检测，其中，血清学试验和组织培养具有灵敏度低、免疫交叉反应以及周期长等缺点，虽然传统多重PCR能同时扩增出多个目的基因片段进而实现多种病毒的快速诊断，降低检测成本，但扩增过程中易受到目的基因模板的特性、引物浓度等因素的影响，导致扩增效率不一致，检测准确性低。GenomeLab GeXP将多重PCR技术和毛细管电泳技术相结合，由用于设计引物的GeXP eXpression Profiler软件和用于结果分析GenomeLabTM GeXP GeneticAnalysis System毛细管电泳仪两部分组成。多重PCR是在同一个PCR反应体系中加上2对或2对以上的引物，并能同时扩增出相应多个核酸片段的PCR反应，该技术主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定、某些遗传病及癌基因的分型鉴定等。GeXP系统扩增采用荧光标记的通用引物和末端连接有通用引物序列的特异性嵌合引物相结合引发多重体系扩增。PCR产物经GeXP毛细管电泳分离，含有荧光标记的PCR产物经GeXP检测窗口检测，依据检测片段与标准分子片段迁移时间计算出扩增片段的长度，根据片段大小区分基因类型，荧光信号强度代表该分离片段的扩增含量，该系统很好地解决了传统多重PCR技术存在的扩增效率不一的问题。

我国自加入WTO后，经国境口岸的人员和货物往来极其频繁，寨卡、黄热、登革、西尼罗等病毒随时都有可能被感染的人或蚊虫带入国内，且具有临床症状相似、传染快、易流行等特点，一旦发生，将严重威胁人们健康和社会安定，因此，为了有效防控上述虫媒病毒性疾病的发生与传播，在疾病发生早期实行快速诊断是非常重要的环节，并且，若能应用在出入境口岸，对来往人员和货物的病毒携带情况进行快速检测，防止病毒传入，将具有重大意义。目前，尚未有能够同时检测寨卡、黄热、登革、西尼罗四种病毒的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组、试剂盒及其应用，能够同时对寨卡病毒、黄热病毒、登革病毒和西尼罗病毒进行检测，可对四种虫媒病毒性疾病进行有效防控，保障人们健康和社会安定。

本发明采用的技术方案如下：

同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组，包括四对特异性引物，分别是引物对ZK-F和ZK-R、DG-F和DG-R、YF-F和YF-R、WN-F和WN-R，分别对应序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.8的碱基序列。

进一步地，同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组，还包括一对通用引物，分别是G-F和G-R，分别对应序列表SEQ.ID.No.9至SEQ.ID.No.10的碱基序列。

同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测试剂盒，包括PCR Buffer 5×、25mM MgCl₂、Taq Polymerasw、四对特异性引物、一对通用引物、ddH₂O，所述四对特异性引物分别为引物对ZK-F和ZK-R、DG-F和DG-R、YF-F和YF-R、WN-F和WN-R，一对通用引物为G-F和G-R，分别对应序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.10的碱基序列。

进一步地，引物对ZK-F和ZK-R、引物对DG-F和DG-R、引物对YF-F和YF-R、引物对WN-F和WN-R在PCR反应体系中对应的摩尔浓度均为10μM；所述通用引物G-F和G-R在PCR反应体系中的摩尔浓度为10μM。

进一步地，同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测试剂盒，其PCR反应体系每管20μL，其中，PCR Buffer 5×2μL、MgCl₂ 2μL、Taq Polymerasw 0.35μL、四对特异性引物各2μL、通用引物2μL，ddH₂O补足至20μL。

同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组或同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测试剂盒在检测黄热病毒、寨卡病毒、登革病毒和西尼罗病毒中的应用。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：本发明基于GeXP技术设计了四对特异性引物和一对通用引物，并在此基础上构建了多重PCR体系，能够同时检测出寨卡病毒、黄热病毒、登革病毒和西尼罗病毒，有效缩短检测时间，并且具有特异性强、灵敏度高、准确率高、方便高效等优点，对由这四种病毒引起的虫媒病毒性疾病的诊断和防控具有重要意义。

附图说明

图1是退火温度优化的琼脂糖凝胶电泳结果；

图2是ZIKV的GeXP单重PCR检测结果；

图3是DENV的GeXP单重PCR检测结果；

图4是YFV的GeXP单重PCR检测结果；

图5是WNV的GeXP单重PCR检测结果；

图6是GeXP多重PCR检测结果；

图7是ZIKV和YFV的双重PCR检测结果；

图8是YFV和WNV的双重PCR检测结果；

图9是ZIKV、DENV和YFV的三重PCR检测结果。

图2-9中，横坐标为PCR扩增产物的碱基数，纵坐标为荧光信号值。

具体实施方式

本说明书中公开的所有特征，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

下述实施例中所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

以GeBank公布的引物序列为参考，从NCBI上下载DENV(Ⅰ-Ⅳ型)、ZIKV、WNV、YFV基因序列，选取保守区域，采用primer premier 5.0软件设计特异性引物，并在特异性引物的5’端连接通用引物G-F，3’端连接通用引物G-R，G-F的5’端用cy5荧光染料标记。本发明引物信息见表1，所有引物由成都擎科梓熙生物有限公司合成。

表1引物信息

表1中的四对特异性引物对ZK-F和ZK-R、DG-F和DG-R、YF-F和YF-R、WN-F和WN-R，分别用于检测ZIKV、DENV、YFV和WNV。

实施例2

模板的制备：

1)单克隆质粒标准品的制备：人工合成各特异性引物对应靶基因，并将靶基因连接到PMD19-T载体上，靶基因由成都擎科梓熙生物有限公司合成并连接到PMD19-T载体上。采用质粒小提试剂盒提取ZK-PMD19T,DG-PMD19T，YF-PMD19T,WN-PMD19T质粒，作为后续PCR验证及质控品制备的基础材料。各病毒靶基因对应序列如下：

ZK(350bp)

CACCAGCACTATGATGGAAACCATGGAGCGACTGCAACGTAGGCATGGGGGAGGATTAGTCAGAGTGCCATTGTGTCGCAACTCCACACATGAGATGTACTGGGTCTCTGGGGCAAAGAGCAACATCATAAAAAGTGTGTCCACCACAAGTCAGCTCCTCCTGGGACGCATGGATGGCCCCAGGAGGCCAGTGAAATATGAGGAGGATGTGAACCTCGGCTCGGGTACACGAGCTGTGGCAAGCTGTGCTGAGGCTCCTAACATGAAAATCATCGGCAGGCGCATTGAGAGAATCCGCAATGAACATGCAGAAACATGGTTTCTTGATGAAAACCACCCATACAGGACAT

DG(292bp)

GTTGTTAGTCTACGTGGACCGACAGGAACAGTTTCGAATCGGAAGCTTGCTTAACGTAGTTCTAACAGTTTTTTATTAGAGAGCAGATCTCTGATGAACAACCAACGGAAAAAGACGGGTCGACCGTCTTTCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCGCGTGTCAACTGTTTCACAGTTGGCGAAGAGATTCTCAAAAGGATTGCTTTCAGGCCAAGGACCCATGAAACTGGTGATGGCTTTTATAGCATTCCTAAGATTTCTAGCCATACCTCCAACAGCAGGAATTTTGG

YF(247bp)

GAAACCGGGATAAAAACTACGGATGGAGAACCGGACTCCACACATTGAGACAGAAGAAGTTGTCAGCCCAGAACCCCACACGAGTTTTGCCACTGCTAAGCTGTGAGGCAGTGCAGGCTGGGACAGCCGACCTCCAGGTTGCGAAAAACCTGGTTTCTGGGACCTCCCACCCCAGAGTAAAAAGAACGGAGCCTCCGCTACCACCCTCCCACGTGGTGGTAGAAAGACGGGGTCTAGAGGTTAGAGG

WN(210bp)

AGAGTTGATGTGCGGCTTGATGATGATGGAAACTTCCAGCTCATGAATGATCCAGGAGCACCTTGGAAGATATGGATGCTCAGAATGGTCTGTCTCGCGATTAGTGCGTACACCCCCTGGGCAATCTTGCCCTCAGTAGTTGGATTTTGGATAACTCTCCAATACACAAAGAGAGGAGGCGTGTTGTGGGACACTCCCTCACCAAAGGAG

2)逆转录：本发明靶基因为人工合成DNA，实际应用时，使用DNA/RNA共提试剂盒(购自成都百奥诺维生物科技有限公司)提取的RNA样本需按照下述反应体系和反应条件进行逆转录，逆转录的反应液在冰上进行配置。

反应体系：总体积10μL，5×PrimeScript Buffer 2μL、PrimeScript RT EnzymeMixI 0.5μL、50μM Oligo dT Primer 0.5μL、100μM Random 6mers 0.5μL，RNase FreeddH₂O补足至10μL。

反应条件：42℃反应15min，然后再85℃反应5s，循环三次，置于-20℃保存。

实施例3

一、单重RT-PCR法验证特异性引物：

1)退火温度优化：分别以实施例2获得的四种病毒质粒为模板进行单重PCR扩增(多功能梯度PCR仪器Veriti96，购自美国Applied Biosystems公司)，选择退火温度分别为55℃，56.5℃，58℃，59.5℃，61℃进行梯度筛选，确定各对特异性引物对的最佳退火温度。

反应体系：10×PCR Buffer 2.5μL、MgCl₂ 1.5μL、dNTP Mixture 2μL、Hot StarTaq DNA Po lymerase(5U/μL)0.2μL、F/R primer(10μM)各取0.5μL、模板20ng，RNase FreeddH₂O补足至25μL。

反应条件：94℃预变性5min，94℃变性25s，然后分别以55℃，56.5℃，58℃，59.5℃，61℃退火25s，72℃延伸30s，共35个循环，72℃延伸5min，4℃保存。扩增产物以2.5％琼脂糖，电压为120V进行电泳(MODEL200/2.0Power Supply电泳仪，购自美国Bio-Red公司)后通过凝胶成像系统(购自北京君意东方电泳设备有限公司)观察结果，如图1所示，从55℃到61℃各病毒扩增效率及引物特异性无明显差异，因此选取60℃作为后续PCR退火温度。

2)以单引物混合模板进行单重PCR反应，反应体系为：总体积10μL，其中，PCRBuffer5×2μL、25mM MgCl₂ 2μL、Taq Polymerasw 0.35μL、特异性引物对2μL、通用引物2μL、混合模板30μg，ddH₂O补足至10μL，采用ddH₂O作为无模板对照，四种病毒质粒混合作为混合模板。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性25s，60℃退火45s，共35个循环，4℃保存。

扩增产物采用GeXP多重分析表达仪(购自美国Beckman公司)进行片段分析，具体操作方法为：取出-20℃存放的甲酰胺(美国Beckman公司)于室温下充分融化，取出PCR产物，以甲酰胺进行稀释制备成备用样品，稀释倍数依实际出峰信号强弱进行调整，避光保存待用。以GeXP多重基因表达分析仪专用96孔样品板进行试验，按照说明书配置片段分析上机样品，每孔总体系40μL，包含38.5μL甲酰胺和0.5μL的Size Standard 400(美国Beckman公司)，以及1uL上述PCR产物稀释液，用封膜封住样品板，将96孔板置于涡旋震荡仪上进行充分混匀，排除气泡后于台式冷冻离心机(购自湖南湘仪)高速离心1min，每孔悬空滴加1滴矿物油防止样品在分析过程中受热挥发，取GeXP多重基因表达分析仪专用缓冲液板，在与上样板对应排孔内加入约6-8滴分离缓冲液(美国Beckman公司)，保证每孔液面相对平齐。打开GeXP仪器预热数分钟，在Set Up模块设置样品名称和分离方法，各参数默认值，开始运行，待片段分析结束后进入GeXP体系的Fragment程序，选择Size Standard 400分析程序，分析记录结果，结果如图2-5所示，无模板对照无扩增，引物对ZK-F和ZK-R扩增ZIKV，引物对DG-F和DG-R扩增DENV，引物对YF-F和YF-R扩增YFV，引物对WN-F和WN-R扩增WNV，单重特异性引物对只对靶基因有良好扩增。

二、以多引物混合模板进行多重PCR反应，反应体系为：总体积20μL，其中，PCRBuffer5×2μL、MgCl₂ 2μL、Taq Polymerasw 0.35μL、四对特异性引物各2μL、通用引物2μL、混合模板30μg，ddH₂O补足至20μL。采用ddH₂O作为无模板对照，四种病毒质粒混合作为混合模板。各特异性引物对在PCR反应体系中对应的摩尔浓度均为10μM，通用引物对在PCR反应体系中的摩尔浓度为10μM，其他条件与本实施例2)中的一致。结果如图6所示，无模板对照无扩增，四个靶基因可被同时检出，验证了多重检测体系中的引物特异性。

三、人源DNA和RNA干扰：在上述多重PCR体系中分别加入10ng、100ng、1000ng人源DNA并分别进行反应，反应结束后，PCR产物采用GeXP多重分析表达仪进行片段分析，结果显示，三次反应均只出现特异信号；在实施例2的逆转录体系中分别加入10ng、100ng、1000ng人源RNA进行逆转录，然后分别加入上述多重PCR体系中，并分别进行多引物PCR反应，反应结束后，PCR产物采用GeXP多重分析表达仪进行片段分析，结果显示，三次反应均只出现特异信号，表明本发明方法特异性强，不受人源DNA和RNA干扰。

实施例4

灵敏度：将实施例2提取的四种病毒的质粒标准品等比例混合后进行10倍梯度稀释至10⁶-10¹拷贝/μL，然后按实施例3建立的方法进行GeXP多重PCR检测体系灵敏度的检测与分析，每个浓度重复三次，结果表明，本发明方法的灵敏度为10³拷贝/μL。将实施例2提取的四种病毒的质粒标准品分别进行10倍梯度稀释至10⁶-10¹拷贝/μL，然后按实施例3建立的方法进行单重PCR检测体系灵敏度的检测与分析，每个浓度重复三次，结果表明，本发明检测DENV和ZIKV的灵敏度均为10²拷贝/μL，检测WNV和YFV的灵敏度均为10³拷贝/μL。

实施例5

从上述四种病毒质粒中随机选择若干种混合，分为以下三组：

第一组：ZK-PMD19T和YF-PMD19T混合，作为模板；

第二组：YF-PMD19T和WN-PMD19T混合，作为模板；

第三组：ZK-PMD19T、DG-PMD19T和YF-PMD19T混合，作为模板。

按照实施例3中多引物混合模板进行多重PCR反应，第一组可检测出284.71bp和387.52bp两个目的峰(图7)，表明样品中含有ZIKV和YFV的模板，与实际相符；第二组可检测出247.69bp和284.94bp两个目的峰(图8)，表明样品中含有WNV和YFV的模板，与实际相符；第三组可检测出284.34bp、329.29bp、387.48bp三个目的峰(图9)，表明样品中含有ZIKV、DENV和YFV的模板，与实际相符。

如上所述即为本发明的实施例。本发明不局限于上述实施方式，任何人应该得知在本发明的启示下做出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。

Claims

1.同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组，其特征在于，包括四对特异性引物，分别是引物对ZK-F和ZK-R、DG-F和DG-R、YF-F和YF-R、WN-F和WN-R，分别对应序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.8的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组，其特征在于，还包括一对通用引物，分别是G-F和G-R，分别对应序列表SEQ.ID.No.9至SEQ.ID.No.10的碱基序列。

3.同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测试剂盒，包括PCR Buffer5×、25mMMgCl₂、Taq Polymerasw、四对特异性引物、一对通用引物、ddH₂O，其特征在于，所述四对特异性引物分别为引物对ZK-F和ZK-R、DG-F和DG-R、YF-F和YF-R、WN-F和WN-R，一对通用引物为G-F和G-R，分别对应序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.10的碱基序列。

4.根据权利要求3所述的同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测试剂盒，其特征在于，所述引物对ZK-F和ZK-R、引物对DG-F和DG-R、引物对YF-F和YF-R、引物对WN-F和WN-R在PCR反应体系中对应的摩尔浓度均为10μM；所述通用引物G-F和G-R在PCR反应体系中的摩尔浓度为10μM。

5.根据权利要求3所述的同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系每管20μL，其中，PCR Buffer5×2μL、MgCl₂ 2μL、TaqPolymerasw0.35μL、四对特异性引物各2μL、通用引物2μL，ddH₂O补足至20μL。

6.权利要求1或2所述的同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组或权权利要求3-5中任意一项所述的同时检测四种黄病毒属病毒的GeXP的快速检测试剂盒在检测黄热病毒、寨卡病毒、登革病毒和西尼罗病毒中的应用。