CN102154513B

CN102154513B - 一种检测猪Hokovirus的PCR方法

Info

Publication number: CN102154513B
Application number: CN 201110063355
Authority: CN
Inventors: 李彬; 何孔旺; 毛立; 温立斌; 张雪寒; 倪艳秀; 郭容利; 周俊明; 茅爱华; 王小敏
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-03-16
Filing date: 2011-03-16
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2031-03-16
Also published as: CN102154513A

Abstract

本发明涉及一种检测猪Hokovirus的PCR检测方法，属于生物技术领域。具体采用25μl的PCR反应体系，在0.2mlPCR反应管内分别加入缓冲液，上、下游引物，DNA聚合酶以及提取的DNA模板，用灭菌超纯水加至总体积，将试剂混合均匀后，至于PCR扩增仪中，进行变性、退火、延伸，共循环35次；PCR反应结束后，取10μl产物在琼脂糖凝胶上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外投射仪下观察PCR产物，并与标准分子量相对照，阳性样品可出现540bp片段。本发明所提供的检测方法敏感性高、特异性好、操作简便、迅速，并且对检测材料质量要求低，便于临床上的应用。

Description

一种检测猪Hokovirus的PCR方法

技术领域

本发明属于动物病毒学与动物传染病学技术领域。具体涉及一种对猪Hokovirus进行检测的PCR方法。

背景技术

猪Hokovirus（PHoV）是2008年在香港新发现的一种猪细小病毒（Lau 等Identification of novel porcine and bovine parvoviruses closely related to human parvovirus 4. J. Gen. Virol. 2008, 89: 1840-1848），其与牛Hokovirus同属于Hokovirus亚型，两者都属于细小病毒属（Parvovirinae）。猪Hokovirus与人4型和5型细小病毒（PARV4/5）的亲缘关系非常接近。

猪细小病毒可引起猪的繁殖障碍病，以怀孕母猪发生流产、死产、产木乃伊为特征。各种不同年龄、性别的家猪和野猪均易感。传染源主要来自感染细小病毒的母猪和带毒的公猪，后备母猪比经产母猪易感染，病毒能通过胎盘垂直传播，感染母猪所产的死胎、仔猪及子宫内的排泄物中均含有很高滴度的病毒，而带毒猪所产的活猪可能带毒排毒时间很长甚至终生。

猪Hokovirus虽然属于细小病毒属，但目前尚无其致病的报道，不过Lau等学者研究发现，在健康猪群和患病猪群猪的淋巴结、血清、肝脏、鼻拭子和粪便中都能检测出该病毒的存在，且感染率非常高，可达44.4%。从而，推测猪Hokovirus病毒可能会感染猪的大部分组织，而且由于在健康猪和患病猪中猪Hokovirus的感染率没有差异，所以该病毒是否会导致发病还需进一步的研究。同时研究者发现猪Hokovirus与猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）发生混合感染的现象十分普遍，混合感染率在64%左右。

2010年，德国柏林的研究者Cornelia Adlhoch及其同事报道了猪Hokovirus在野猪中流行的研究（Adlhoch等 High prevalence of porcine Hokovirus in German wild boar populations. Virol. J. 2010, 7: 171）。该研究发现，在德国接受检测的野猪当中大约有三分之一携带猪Hokovirus病毒。另外，研究学者采用最新确立的定量实时PCR方法，在德国五个不同地区对野猪当中猪Hokovirus感染情况进行调查。在对收集的肝脏和血清样本进行分析之后发现，野猪中猪Hokovirus总体流行率非常高（32.7%，51/156）。而且他们发现，该病毒的流行率因地区而异，随年龄增大而升高。在1年龄以内的野猪当中，流行率为22%，但在成年野猪当中流行率上升为41%。对来自不同地区的三个分离株的两个接近全长的基因组和一个基因大片段进行了序列测定，并进行了遗传进化分析。结果表明，德国野猪Hokovirus的基因序列与香港分离株表现出非常近的亲缘关系，其推测是由于动物产品的贸易往来导致该病毒从香港传入德国。

到目前为止，人们对猪Hokovirus在除香港和德国以外的世界其它地方的存在与流行情况一无所知。而在2010年以来，我国大陆地区新发现了3种新亚型的细小病毒，分别为：猪博卡病毒（porcine bocavirus）、猪细小病毒4型（PPV4）和猪Cnvirus（Huang等Detection of a novel porcine parvovirus, PPV4, in Chinese swine herds. Virol. J. 2010，7: 333；Wang等Novel parvovirus sublineage in the family of Parvoviridae. Virus Genes. 2010，41: 305-308；Zhai等High prevalence of a novel porcine bocavirus in weanling piglets with respiratory tract symptoms in China. Arch. Virol. 2010, 155: 1313-1317）。因此，猪Hokovirus是否会和这些新的细小病毒一同在我国大陆出现成为研究的热点。基于以上研究，申请人根据香港和德国研究者登录在GenBank中猪Hokovirus的基因序列（登录号：GQ869539-GQ869543）设计并合成了一对检测猪Hokovirus的引物，建立了检测猪Hokovirus的PCR方法，并发现了该病毒确实存在于我国猪群当中。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种操作简单、特异性强、敏感性高、成本低的检测猪Hokovirus的PCR方法。

技术方案

参考GenBank登录的猪Hokovirus基因组序列（登录号：GQ869539-GQ869543），设计检测猪Hokovirus PCR方法的引物，其上、下游引物序列分别为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2：

上游引物PHoVF: 5’- GTTGGTCCTGGTAATCCTTTGG-3’ ，在基因组中的位置为2775-2796 bp；

下游引物PHoVR: 5’- AGTCCTGGTATGAGAAGTGACG-3’，在基因组中的位置为3293-3314 bp。

检测猪Hokovirus的PCR方法，包括以下步骤：

（1）猪Hokovirus DNA的提取：取472.5 μl血清或100 mg的动物组织，加入1 ml PBS缓冲液进行充分研磨，-20℃反复冻融3次,8000 rpm离心10分钟，取上清液472.5 μl，加入10% SDS 25 μl，20 mg/ml蛋白酶K 2.5μl，混合均匀后置于37℃消化过夜或50℃水浴4小时，加入等量酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）抽提2次，取上清加2倍体积预冷的无水乙醇于-20℃ 1小时，12000 rpm离心10分钟。弃去上清，沉淀于干燥箱干燥后用20 μl超纯水溶解，即为检测用DNA模板。提取的DNA模板于-70℃保存备用；

（2）将上、下游引物与PCR混合液加入PCR反应管中，混合后加入待检样品DNA；

（3）将PCR管置于PCR扩增仪中进行循环；

（4）取PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳；

结果判定：有扩增产物约为540 bp条带，为阳性；无扩增产物约为540 bp为阴性。

步骤（2）所述的PCR混合物包括：采用25 μl的PCR反应体系，在0.2 ml PCR反应管中分别加入10×PCR缓冲液2.5 μl，dNTP（2.5 mM）1.0 μl，MgCl2（25 mM）1.5 μl，上、下游引物各0.5 μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.5 μl，DNA模板1 μl，用灭菌超纯水加至总体积，混匀。步骤（3）的扩增条件为：94℃,5分钟，进行预变性；然后94℃,1分钟，53℃,1分钟，72℃,1分钟共循环35次；最后72℃延伸10分钟。

本发明检测猪Hokovirus的PCR方法，阳性对照品为含有VP1/2基因的标准阳性质粒，由PCR扩增的540 bp产物连接到载体pMD18-T（大连宝生物工程有限公司）制备而成，浓度为1.68×1011 copies/μl。

有益效果

本发明根据GenBank中发表的有关猪Hokovirus的序列（登录号：GQ869539-GQ869543），经过序列比对分析，选取VP1/2基因中保守的片段设计并合成一对特异性引物，对猪Hokovirus进行PCR扩增，得到540 bp的特异性条带。

本研究建立的猪Hokovirus检测PCR方法对其他常见动物病原体（猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪博卡病毒、猪输血传播病毒、乙型脑炎病毒、猪Cnvirus）均无反应；敏感性试验表明，最小检出量为10⁴ copies。

Hokovirus感染猪的血清、粪便、肝脏、肺脏、扁桃体、淋巴结等DNA提取物用本发明建立的PCR方法检测，均扩增出大小约540 bp的DNA片段，适用于临床检测。

附图说明

图1：检测猪Hokovirus的PCR方法特异性试验电泳结果图，其中泳道1为猪Hokovirus；泳道2-9分别为：猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪博卡病毒、猪输血传播病毒、乙型脑炎病毒、猪Cnvirus；M表示DNA Marker (DL2000)。

图2：检测猪Hokovirus的PCR方法敏感性试验电泳结果图，其中泳道1为未稀释的含VP1/2基因的标准阳性质粒；泳道2-10为连续10倍稀释的模板；M表示DNA Marker (DL2000)。

具体实施方式

实施例1

临床采集的猪（江苏省苏州常熟市谢桥猪场）血清和肝脏，进行猪Hokovirus的检测，具体步骤如下：

（1）DNA的提取：取472.5 μl血清；并取100 mg肝脏，加入1 ml PBS缓冲液进行充分研磨，-20℃反复冻融3次,8000 rpm离心10分钟，取上清液472.5 μl，加入10% SDS 25 μl，20 mg/ml蛋白酶K 2.5μl，混合均匀后置于37℃消化过夜或50℃水浴4小时，加入等量酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）抽提2次，取上清，加2倍体积预冷的无水乙醇于-20℃ 1小时，12000 rpm离心10分钟。弃去上清，沉淀于干燥箱干燥后用20 μl超纯水溶解，即为检测用DNA模板。提取的DNA模板于-70℃保存备用；

（2）采用25 μl的PCR反应体系，在0.2 ml PCR反应管中分别加入10×PCR缓冲液2.5 μl，dNTP（2.5 mM）1.0 μl，MgCl2（25 mM）1.5 μl，上、下游引物各0.5 μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.5 μl，DNA模板1 μl，用灭菌超纯水加至总体积，混匀。

（3）PCR扩增条件为：94℃,5分钟，进行预变性；然后94℃,1分钟，53℃,1分钟，72℃,1分钟共循环35次；最后72℃延伸10分钟。

（4）取10 μl上述的PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳，结果血清和肝脏组织扩增产物均约为540 bp，结果大小相符，判为猪Hokovirus阳性。

实施例2

按实施例1方法，以猪Hokovirus阳性病料作为阳性对照，分别对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪博卡病毒、猪输血传播病毒、乙型脑炎病毒、猪Cnvirus进行检测，结果均未能扩增出任何条带，而猪Hokovirus阳性病料扩增出约540 bp大小的条带，见图1。其序列为SEQ ID NO. 3：GTTGGTCCTGGTAATCCTTTGGATAATGCTCCCGCTAAGGGACCAGTGGATGAAGCAGCGAAACACCACGATGAACGGTACGATGAAATGCTTCGCCATGGTGATTTGCCATACATCCATGGGAGAGGGGCTGATAGGTTGATGAATAAGGAGATAGAGAGGGCGGAGCAGGAGGGTAAAATTGATAACCCTGTGGATGCATTGGTGGGTAATGCAATCCGGGGTATCTGGGAGGCAAAGGAGACTCTTGGGGATATTGCAGATGTTCAATTATCACAGGTTTTACCGCCCGACCCGCCTACCAGCCAAGTGCTTCCGGGCTCTTCAGAAGACGCCCCCAGCCCGAAGAGACAGAGGGCTGGTACCCCTGATTCTGTTCCTACGCCTGGCAACCCATCCCCTGCGCCAATTGCTGATCCTGCTACAATCATGGCTGCGCCGGTAACGGGCGCCACCGGTGGGGGTATCAAAGTTAAAGCTCAATGGTTGGGGGGCACTCATTTCTCTGATAATACCATCGTCACTTCCCATACCAGGACT。

阳性对照品为含有VP1/2基因的标准阳性质粒，由PCR扩增的540 bp产物连接到载体pMD18-T（大连宝生物工程有限公司）制备而成，浓度为1.68×1011 copies/μl。

实施例3：敏感性试验

将含VP1/2基因的标准阳性质粒（10¹¹copies）用配置的TE（PH8.0）10倍递增稀释作为模板，每个稀释度各取2 μl作为模板，按实施例1方法进行检测，观察阳性条带，以出现阳性预期条带所用模板量的最高稀释度计算其敏感性，结果表明最小检出量为10⁴ copies，见图2。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种检测猪Hokovirus的PCR方法

<130> 说明书

<160> 3

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> 上游引物PHoVF

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 1

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<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> 下游引物PHoVR

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 2

agtcctggta tgagaagtga cg 22

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<211> 540

<212> DNA

<213> 猪Hokovirus

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<221> 扩增产物序列

<222> (1)..(540)

<223>

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gttggtcctg gtaatccttt ggataatgct cccgctaagg gaccagtgga tgaagcagcg 60

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accagccaag tgcttccggg ctcttcagaa gacgccccca gcccgaagag acagagggct 360

ggtacccctg attctgttcc tacgcctggc aacccatccc ctgcgccaat tgctgatcct 420

gctacaatca tggctgcgcc ggtaacgggc gccaccggtg ggggtatcaa agttaaagct 480

caatggttgg ggggcactca tttctctgat aataccatcg tcacttccca taccaggact 540

Claims

1. 检测猪Hokovirus的引物：其上、下游引物序列分别为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2。