CN101144107A

CN101144107A - 一种用于检测登革病毒核苷酸片段的引物和探针序列

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Publication number: CN101144107A
Application number: CNA2007100741865A
Authority: CN
Inventors: 吴新伟; 肖性龙; 张经纬; 王鸣; 蒋力云
Original assignee: GUANGZHOU DISEASE PREVENTION-CONTROL CENTER; SHENZHEN TAITAI GENETIC ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: GUANGZHOU DISEASE PREVENTION-CONTROL CENTER; SHENZHEN TAITAI GENETIC ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2007-05-08
Filing date: 2007-05-08
Publication date: 2008-03-19

Abstract

一种用于检测登革病毒核苷酸片段的引物和探针序列。引物序列包括：由上游引物denunpf序列为AAGGACTAGAGGTTAGAGGAGACCC和下游引物denunpr序列为CGTTCTGTGCCTGGAATGAT组成的引物对。探针denunpb序列为ACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCA。

Description

一种用于检测登革病毒核苷酸片段的引物和探针序列

技术领域

本发明涉及一种用于检测登革病毒核苷酸片段的引物和探针序列。

背景技术

登革病毒(dengue virus，DEN)是黄病毒属的单股正链RNA病毒，根据E蛋白的抗原性不同，分为I型、II型、III型和IV型四个血清型。登革病毒以埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介，引起登革热(classicaldengue fever，简称DF)和登革出血热/登革休克综合症(den-gue hemorrhagic fever/dengue shocksyndrome，简称DHF/DSS)。每年全世界热带与亚热带地区有1亿人感染登革病毒，其中以与我国接壤的东南亚地区流行最为严重(WHO.1998)。20世纪，登革热在世界各地发生过多次大流行，病例数百万计，在东南亚一直呈地方性流行。我国广东于1978年发生流行，并分离出第IV型登革病毒。此后，于1979、1980、1985年小流行中分离出I、II、III型病毒。近年来，我国南方频发登革热的流行，时有DHF/DSS的病例报告。DHF/DSS表现为高热，出血，休克，病死率较高，但其发生机制不明，多数学者认为DHF/DSS的发生受病毒本身的生物特性和病人的免疫因素两方面的影响。近年来，随着人口流动的增加，城市化的发展，DEN病毒型别的地域性分布被破坏，DF的流行区域扩大，DHF/DSS病例亦有增多的趋势。目前这一疾病已成为热带与亚热带地区的一个严重公共卫生问题。由于缺乏有效的疫苗，因而及时诊断疾病、及时处理疫情就变得十分重要，这就需要有一种既准确又快速的实验室检测方法来确定病原.这也是临床诊断与流行病学研究的一个必不可少的环节。

登革病毒的实验室诊断，国内外都已建立了一整套成熟的技术，传统的方法主要有血凝抑制试验、补体结合试验、中和试验等，这些方法都不同程度地存在着敏感性低、特异性差、操作繁琐、耗时等不足，尤其是难以准确分型。随着登革病毒单克隆抗体的研制成功，基于登革病毒型特异性单克隆抗体的分型鉴定方法，如间接免疫荧光技术(IFA)、酶联免疫吸附技术(ELISA)广泛应用于全球各个登革病毒检测实验室，登革病毒的准确分型问题得到解决，但所有这些技术，仍不可避免地存在着实验耗时的问题，因为这些方法都是建立在病毒分离培养的基础上，不适宜作为登革热的早期诊断。

随着分子生物学技术的发展，普通PCR方法已经广泛应用于临床诊断，但该技术需要对PCR产物进行后处理，极易导致PCR产物污染，同时有一定的非特异性扩增。而荧光PCR技术则是在普通PCR技术的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术。除了具有普通PCR的优点外，它还具有以下优点：(1)特异性更强，灵敏度更高。由于多使用了一条可与模板互补配对的荧光探针，提高了特异性，并且由自动化仪器收集荧光信号，避免了人工判断的主观性，又可进一步提高灵敏度。(2)全封闭反应，在线式实时监测荧光，无须PCR产物的后处理，避免污染，保证了结果的可靠性。(3)数据分析选在核酸扩增的对数期，摈弃普通PCR方法的受多因素干扰的终点分析法，使得定量更准确可靠。(4)可实现单管双检或多检，还可设计针对性内标，监控抽提效率及排除抑制剂干扰。(5)不接触有毒试剂，操作安全。(6)有利于规模化、自动化及联网管理。(7)适用范围更广，理论上可检测任何病毒的核酸。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测登革病毒核苷酸片段的引物和探针序列。

基于上述目的，本发明采用以下技术方案：

用于检测登革病毒核苷酸片段的引物和探针序列包括：由上游引物Denunpf序列为AAGGACTAAGGTTAGAGGAGACCC和下游引物Denunpr序列为CGCTCTGTGCCTGGATTGAT组成的引物对和探针Denunpb序列为ACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCA。

本发明的具体原理是利用一对靶核苷酸序列的特异性引物和一个特异性荧光探针，采用耐热DNA聚合酶(Taq酶)、四种核苷酸单体(dNTP)等成分，并应用PCR技术实现靶核苷酸序列的核酸片段扩增。所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，而在PCR扩增过程中，Taq酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片段上的荧光探针酶切降解，使荧光报告基团游离于反应体系中，脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，荧光报告基团的荧光信号就可以由仪器检测到，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而判定待测样本中靶核苷酸序列的存在。

附图说明

附图：利用引物对denunpf/denunpr和探针denunpb检测登革病毒阳性样品的荧光PCR扩增图。

具体实施方式

1.引物和探针设计：通过分别对所有已知的登革病毒基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段，设计多对引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右，引物间和引物内无互补序列。最优引物、探针序列组合如下：

上游引物Denunpf：AAGGACTAAGGTTAGAGGAGACCC

下游引物Denunpr：CGCTCTGTGCCTGGATTGAT

探针Denunpb：ACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCA

2.反应体系的建立和优化：利用灭活的登革病毒作为待检样品，用Trizol核酸抽提试剂的提取方法提取病毒基因组RNA，分别分装后储存于—20℃备用。

2.1引物浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将登革病毒的引物浓度分别从0.1μmol/L至1.6μmol/L作倍比连续稀释，通过试验结果的分析比较，确定最佳引物终浓度为0.4μmol/L。

2.2镁离子浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将MgCl₂的浓度从1mmol/L至10mmol/L以1mmol/L递增，经过多次重复实验选定5mmol/L为试剂盒反应体系中的镁离子浓度。

2.3反转录酶(AMV RnaseXL)用量的优化经过使用不同浓度反转录酶的试验结果比较，选定5U作为试剂盒反应体系中反转录酶的用量。

2.4 Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的优化通过比较Taq酶用量(以单位Unit计)的优化实验结果，选定5U作为试剂盒反应体系中Taq酶的用量。

2.5 dNTPs浓度的优化通过使用不同浓度的dNTPs进行检测，综合评估后选1mmol/L作为试剂盒反应体系中dNTPs的使用量。

2.6探针浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将登革病毒的探针浓度分别从0.1μmol/L至0.5μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳探针终浓度为0.2μmol/L。

利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的登革病毒实时荧光PCR反应体系为25μl体系，所需各组分及相应浓度见表1。

表1登革病毒实时荧光PCR反应中的各组分情况

组分	用量/终浓度
组分	用量/终浓度	10×Buffer	1×
25 mmol/L MgCl₂	5mmol/L	10×Buffer	1×
25 mmol/L MgCl₂	5mmol/L	dNTP Mixture	1mmol/L
RNase Inhibitor	40Unit	dNTP Mixture	1mmol/L
RNase Inhibitor	40Unit	引物	0.4μmol/L each
探针	0.2μmol/L	引物	0.4μmol/L each
探针	0.2μmol/L	模板	10μl
AMV RNaseXL	5Unit	模板	10μl
AMV RNaseXL	5Unit	Taq	5Unit

注：a.使用的仪器不同，应将反应参数作适当调整。

b.根据检测样本来源不同，应适当调整模板加量。

3.仪器检测通道的选择：在进行荧光PCR反应时，应对所用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。

4.PCR条件选择如下：

50℃ 30分钟，95℃2分钟，1个循环；95℃5秒， 60℃40秒， 40个循环。

5.检测步骤：

5.1选取引物和探针；

5.2制备待测模板，可采用TRIZOL核酸提取法提取各种来源样品中登革病毒的核酸；

5.3反应体系的建立：a、确定最佳引物浓度；b、确定镁离子浓度；c、确定反转录酶的用量；d、确定Taq酶用量；e、确定dNTPs浓度；f、确定探针浓度；

5.4选择仪器的检测通道；

5.5上机检测。

6.实施例

6.1待测模板的制备：用Trizol核酸抽提试剂的提取方法

6.1.1取待测样品600μl，12000转/分钟离心去除大分子杂质。将100μ1上清液加入1.5ml的离心管中，再向其中加入300μl的TrizoL组织抽提液，于振荡器上充分振荡。然后13000转/分钟离心15分钟，将上清移至1.5ml的离心管中；

6.1.2向上清液中加400μl的预冷异丙醇，在振荡器上充分振荡后；

6.1.3 13000转/分钟离心10分钟以便获得RNA沉淀；

6.1.4小心倒掉上清，加入600μ l75％乙醇，用手上下颠倒数次洗涤。(注意：不能剧烈振荡，防止RNA的断裂和RNA沉淀溶解后难以重新沉淀)；

6.1.5 13000转/分钟离心10分钟，缓慢吸弃上清，室温干燥约25分钟，待乙醇完全挥发后加25-40l无RNA酶的水溶解(充分弹动混匀，或用枪反复吹打)，-20℃储存备用。

6.2登革病毒实时荧光PCR反应的扩增条件

根据表1加样，将加好样的PCR管放在荧光PCR仪中，设置相应荧光收集条件后进行扩增，反应程序如下：

6.2.150℃30分钟进行RNA的反转录，95℃3分钟灭活反转录酶；

6.2.195℃15秒变性，55℃30秒退火，72℃1分钟延伸，如此重复5个循环进行预扩增；

6.2.3 95℃10秒变性，60℃40秒退火、延伸，如此重复40个循环进行目的片段的扩增检测，试验结果可以实时监测。

6.3登革病毒实时荧光PCR的检测结果

经检测，若待检培养液中含有登革病毒则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度可达到1000个拷贝/ml；若待检培养液中不含有登革病毒则无扩增信号，提示上述引物对和探针具有良好的灵敏度和特异性。

本发明的优点：

(1)本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可达1000个拷贝/ml，说明其具有良好的灵敏度。

(2)本发明提供的引物和探针对于不含有登革病毒的检测样本均无扩增信号，说明其具有良好的特异性。

(3)由于本发明分别对所有已知的登革病毒基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段进行引物和探针的设计，避免了假阴性结果的产生。

(4)由于本发明采用荧光PCR技术作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法如PCR—电泳等易于形成气溶胶污染而造成假阳性结果；由于对PCR产物进行实时监测，大大节省了监测时间，节约了人力物力。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳太太基因工程有限公司

<120> 一种用于检测登革病毒核苷酸片段的引物和探针序列

<130> 5

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaggactaag gttagaggag accc 24

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgctctgtgc ctggattgat 20

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acagcatatt gacgctggga gagacca 27

Claims

1.一种用于检测登革病毒核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括：由上游引物Denunpf序列为AAGGACTAAGGTTAGAGGAGACCC和下游引物Denunpr序列为CGCTCTGTGCCTGGATTGAT组成的引物对。

2.一种用于检测登革病毒核苷酸片段的探针序列，其特征在于所述的探针Denunpb序列为ACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCA。