CN101429563B - 花生矮化病毒荧光定量rt-pcr检测试剂及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了花生矮化病毒荧光定量RT-PCR检测试剂及制备方法和应用，系选择花生矮化病毒特异且各株系之间比较保守的CP编码基因片段为靶目标序列，经过精心设计并合成，包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为76bp，引物和探针序列为：引物：PSV TF：5′-cagatgccatccctcga-3′，PSV TR：5′-ccaacgaagtgtacgtgtacc-3′，探针：5′-FAM-catccaacctttgtttctag-MGB-3′；本发明克服了常规RT-PCR费时、易污染以及扩增后需电泳检测等缺点，可对样品中的PSV进行快速准确的定性与定量检测，具有简单、易操作、结果直观、敏感性高、重复性好等优点。

Description

花生矮化病毒荧光定量RT-PCR检测试剂及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及检测花生矮化病毒的生物制剂，具体涉及花生矮化病毒荧光定量RT-PCR检测试剂及制备方法和应用。

背景技术

花生矮化病毒(Peanut stunt virus，PSV)属于黄瓜花叶病毒属，病毒粒体球形，直径约30nm。该病毒寄主范围较广，自然条件下可侵染花生、菜豆、大豆、烟草、苜蓿、三叶草、刺槐等作物，能够引起叶片褪绿，并发展成绿色与浅绿相间的花叶，新长出的叶片通常展开时是黄色的，但可以转变成正常绿色，叶片变窄小，叶缘有时出现波状扭曲；病株结荚少而小，有时畸形或开裂。花生矮化病毒主要靠蚜虫以非持久性方式在田间传播，也可通过蚜虫与汁液传播。目前，该病毒主要分布于美国、加拿大以及中欧等国，为我国对外公布的检疫性有害生物。

花生矮化病毒的检测方法主要包括生物学鉴定、血清学检测和逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)技术等。生物学鉴定方法耗工费时，需要隔离温室，检测周期较长；血清学方法常用的是双抗体夹心酶联检测技术，适用于多样本的初筛，具有操作简单的优点，但其检测灵敏度较低，且常常由于抗体制备的质量问题而出现非特异性反应。RT-PCR是用于检测病毒核酸的技术方法，具有较好的敏感性和特异性，但需要进行DNA电泳等PCR后处理，接触有毒试剂溴化乙锭，易发生交叉污染而造成假阳性结果。

荧光定量RT-PCR(Real-time fluorescent RT-PCR)是近几年发展起来的RT-PCR技术与荧光检测相结合的方法，其原理是使用能特异标记核苷酸序列的荧光物质，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR过程，具有检测周期短、特异性与灵敏度高以及无需PCR后处理等优点。以TaqMan水解探针为例，探针一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团，通常状态下，荧光基团与淬灭基团发生荧光共振能量转移现象，荧光基团的荧光被淬灭基团吸收。当PCR进入退火阶段时，荧光探针特异的结合在两条引物之间，在延伸阶段被聚合酶的5′端外切酶活性切开。荧光基团与淬灭基团分离，仪器检测出荧光。由于荧光信号伴随着PCR模板的扩增而增长，因此可以根据荧光信号是否增长来确定模板是否扩增。荧光PCR仪在反应过程中连续的检测荧光信号的变化，当荧光信号增强到某一阈值时，此时的循环次数(Ct)就被记录下来。该Ct值与反应体系中起始模板量的对数值有严格的线性关系。因此，除了可定性确定反应体系中是否含有目标RNA之外，还可以对反应体系中的模板RNA进行相对定量。

普通TaqMan探针的Tm值为65～72℃，片段长度为25～40nt，由于其高特异性的特点，如果探针与目标基因序列没有完全匹配，则会发生检测效率低甚至没有荧光信号的产生等问题。因此，在针对株系变异较大的病毒进行荧光RT-PCR检测时，由于难以设计长片段的完全匹配合适的荧光探针，就必须采用TaqMan MGB(Minor Groove Binder)探针技术。TaqMan MGB探针由于3′端具有MGB分子，提高了探针的Tm值，从而使探针长度缩短，以满足整个荧光RT-PCR的反应条件。

因此，研究建立特异、敏感、可对低含量PSV病毒侵染、隐性感染或持续带毒寄主进行荧光定量RT-PCR检测的方法，在检疫、诊断、分子流行病学研究等方面具有重要的实际应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种对花生矮化病毒具有特异性高、敏感性强，定量和快速检测的荧光定量RT-PCR检测试剂。

本发明还提供了该检测试剂的制备方法和应用。

本发明系选择花生矮化病毒的CP(外壳蛋白)编码基因的保守片段为靶目标，应用primer Express 3.0软件，设计合成引物和探针；将设计的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验，得到最合适的引物和探针。

本发明所述的花生矮化病毒荧光定量RT-PCR检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为76bp，引物和探针序列为：

引物：PSV TF：5′-cagatgccatccctcga-3′

      PSV TR：5′-ccaacgaagtgtacgtgtacc-3′

探针：5′-FAM-catccaacctttgtttctag-MGB-3′

本发明所述的花生矮化病毒荧光定量RT-PCR检测试剂的制备方法由下述步骤组成：

一、选择花生矮化病毒CP编码基因的保守片段为靶目标，该保守片段的扩增目标核苷酸序列为：

cagatgccat ccctcgatca tccaaccttt gtttctagca agaagtgtcg 50

tcctgggtac acgtacactt cgttgg                           76

二、应用primer Express 3.0软件，设计合成引物和探针；

三、引物和探针的合成采用β-乙腈磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；

四、探针合成同时进行两端荧光标记，探针5′端标记的荧光报告基团为FAM，3′端标记的是不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子；荧光报告基团FAM也可以用TET、VIC、JOE等发光基团代替；

五、将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，初步确定候选引物和探针；

六、经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量实际样品的检测应用评估，得到扩增效率和特异性好的所述的引物和探针。

本发明的花生矮化病毒荧光定量RT-PCR检测试剂是将RT-PCR技术与荧光检测相结合，构建并筛选出上述扩增效率和特异性好的一对引物和一条探针，克服了常规RT-PCR费时、易污染以及扩增后需电泳检测等缺点，可对样品中的PSV进行快速准确的定性与定量检测，具有简单、易操作、结果直观、敏感性高、重复性好等优点。具体优点如下：

1、本发明与常规RT-PCR的检测试剂相比，具有特异、敏感的优点；可对样品中低含量的PSV病毒、隐性感染或持续带毒寄主进行准确检测，是一种非常适合PSV检测的方法。

2、本发明与常规RT-PCR的检测试剂相比，具有适用范围广，使用安全的优点；可对果实、叶片、种子、媒介昆虫等多种样品中的PSV进行快速检测，适用范围广；本发明克服了常规RT-PCR的产物须电泳检测、接触有毒试剂的缺点，降低了生物安全隐患，提高了使用安全性。

3、本发明与常规RT-PCR的检测试剂相比，具有检测量大和快速检测的优点；可同时进行大量样品检测，具有高通量性，可减少RNA、cDNA或PCR产物污染的风险；常规RT-PCR的检测时间一般6小时以上，本发明无需扩增后的电泳分析，样品检测时间在4小时之内。

4、与常规RT-PCR相比，荧光定量RT-PCR作出一个定量的、客观的估计，判断出阳性、阴性和可疑结果，Ct值为40.0可确定为阳性和阴性的临界值。更重要的是荧光定量RT-PCR特别适用于保存时间长而无法进行分离病毒的大批量样品的快速检测。

5、本试剂所组成的试剂盒可在收到样品后4小时之内作出定性、定量检测结果。该荧光定量RT-PCR试剂盒是一种检测实际样品中PSV的特异、敏感和稳定的方法。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

1、设计引物和探针

本发明选择PSV外壳蛋白编码基因的保守片段为靶目标，通过GenBank中报道的PSV各株系的CP编码基因序列进行同源性分析比较，选定PSV特征基因的保守片段(76bp)，应用primer Express3.0软件，设计引物和探针。引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成探针，合成同时进行两端荧光标记，探针5′端标记的荧光报告基团是FAM，3′端标记的是不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，确定扩增效率和特异性最好的一对引物和一条探针，扩增目标片段长度为76bp。

2、RNA提取

取100μL体积的研磨匀浆样品上清液，加入700μL Trizol试剂，室温振荡充分混匀5min，加入200μL氯仿，充分颠倒混匀15sec，12000r/min(4℃)离心10min，小心吸取上清，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min，12000r/min(4℃)离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤一次，干燥后溶于20μL经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的双蒸水中。

3、PSV荧光定量RT-PCR扩增

PSV荧光定量RT-PCR采用25μL体积反应液，在ABI7000型荧光定量PCR仪中，按下列反应参数进行：42℃反转录5min，95℃预变性10sec；95℃变性5sec，60℃延伸31sec，扩增40个循环。

引物和探针的浓度进行精确筛选，以获得最低的Ct值和较高的荧光强度增加值(ΔRn)。每次检测时，设立阳性对照和阴性对照：阳性对照采用感染PSV的花生叶片，经Trizol试剂方法提取得到的含有PSV核酸的总RNA；阴性对照采用健康花生叶片，经Trizol试剂方法提取得到的植物组织总RNA。每个样品检测做3管平行试验，在阴性对照为阴性、阳性对照为阳性时，整个试验有效，可进一步判断结果。每个样品须作多个备份，以进行稳定性、重复性试验。

4、PSV荧光定量RT-PCR的特异性和敏感性试验

采用同属的CMV、TAV以及PStV、CRSV、MCMV、BPMV和健康花生叶片提取液等样本进行特异性比较检测。对感染PSV的叶片样品，采用Trizol试剂方法提取得到含有PSV核酸的总RNA，进行10倍系列稀释，用常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测，比较它们的敏感性，常规RT-PCR采用的引物与荧光定量RT-PCR的引物一致。

5、PSV荧光定量RT-PCR的稳定性和重复性试验

在评估荧光定量RT-PCR检测PSV方法中的组内和组间试验的重现性、稳定性时，用阳性样品和阴性样品，在同样反应条件下，反复进行荧光定量RT-PCR检测，每次试验的每个样品做6个平行的反应管，重复12次。

6、PSV定量用标准品的制备、标准曲线的建立以及样品中病毒RNA含量的计算

参照吴云峰主编《植物病毒学原理与方法》(西安地图出版社，1999年，第八章)采用密度梯度分离方法得到纯化的PSV病毒，经过Trizol试剂方法得到病毒的纯RNA，用分光光度计测定其OD₂₆₀值来进行RNA模板定量，OD₂₆₀值为1相当于40μg/mL单链RNA。采用DEPC处理水，把提取得到的病毒纯RNA稀释定量到100ng/μL。对该RNA标准品进行10倍系列稀释，得到10^-1～10^-6倍稀释的RNA模板用于荧光定量RT-PCR扩增，以模板浓度的对数值为X轴，Ct值为Y轴作回归曲线并得出回归方程。根据结果换算，可从未知样品的Ct值得出其含有PSV病毒的RNA含量。

7、引物和探针及其浓度的筛选

选择引物、探针、模板的最佳浓度配比，获得荧光定量RT-PCR反应的最低Ct值和最高ΔRn，提高扩增效率和敏感性。应用不同RNA模板浓度的标准阳性样品，对设计的引物与探针，选用50nM、100nM、200nM、300nM、400nM和500nM的使用终浓度，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度。

8、对样品的检测

对表现矮化、褪绿等症状的花生叶片样品以及CMV、TAV、PStV、CRSV、MCMV、BPMV和健康花生提取液等样本进行荧光定量RT-PCR检测，结果表明，阳性样品均具有典型的扩增曲线，Ct值小于35.0，阴性对照及阴性样品均无典型扩增曲线，也无Ct值。三个平行试验的结果稳定一致。证明荧光定量RT-PCR检测PSV的特异性强、敏感度高和重复性好。

9、PSV荧光定量RT-PCR标准化试剂和检测程序

9.1标准化试剂盒组份(25μL反应×100次)：

溶液I(Trizol)	35mL×2瓶
		溶液II(2×一步RT-PCR缓冲液，含引物和探针)	1.25mL
溶液III(Taq DNA聚合酶，5U/μL)	50μL

溶液IV(RNA酶抑制剂和逆转录酶混合液)	50μL
		溶液V(DEPC处理水)	1.25mL×2支
溶液VI(阳性对照，含有PSV阳性RNA)	50μL
		溶液VII(阴性对照，不含有PSV阳性RNA)	50μL
溶液VIII(定量用标准品，100ng/μL)	25μL

按照优化的反应条件配制。

9.2操作方法

9.2.1总RNA提取

(1)取0.1～10克组织样品，按1∶10(克∶mL)加入蒸馏水，充分研磨匀浆，2000r/min，4℃，离心10min。

(2)取100μL上清液加入700μL溶液I，充分振荡混匀，室温静置5min，彻底裂解。

(3)加200μL氯仿，小心盖上帽盖，用力快速振荡15sec。12000r/min，4℃，离心10min。

(4)小心吸取上层水相，转移至一新的1.5mL管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min。12000r/min，4℃，离心10min，弃上清液。

(5)沉淀用70％乙醇洗涤一次，晾干后，溶于20μL经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的双蒸水中。可直接用于反转录或-70℃保存备用。

9.2.2反应组份配制

(1)取一支200μL光学PCR反应管，反应总体积为25μL，向反应管中加入下列反应物：

(2)定量

按需要对标准品进行稀释后制作标准曲线，至少7个稀释度。

(3)设立对照

阳性对照和阴性对照各设2管。

9.2.3扩增

在ABI7000型荧光定量PCR仪中，按下列反应参数进行：42℃反转录5min，95℃预变性10sec；95℃变性5sec，60℃延伸31sec，扩增40个循环。

9.2.4结果分析和判定

(1)结果分析条件设定

阈值线设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。

(2)质控标准

——阴性对照无Ct值，并且无典型扩增曲线。

——阳性对照的Ct值应小于35.0，并出现典型的扩增曲线，2个阳性对照扩增曲线基本重合，特别是在荧光临界值(Ct值)附近。否则，此次实验视为无效。

——定量用的标准品扩增曲线：出现典型的扩增曲线，指数区较明显，7个点具良好的线性范围，平台区汇于一起，相关系数在0.99以上。

(3)结果描述及判定

——阴性

无Ct值或无扩增曲线，表示样品中无花生矮化病毒。

——阳性

Ct值应小于等于35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在花生矮化病毒。

——有效原则

Ct值在35.0～40.0的样本建议重做。重做结果无Ct值或无典型扩增曲线判为阴性，否则判为阳性。

——定量：根据标准曲线作出定量。

                            序列表

<110>宁波检验检疫科学技术研究院

<120>花生矮化病毒荧光定量RT-PCR检测试剂及制备方法和应用

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据外壳蛋白的编码基因设计的用于检测PSV特异性荧光探针序列

<400>1

5′-catccaacct ttgtttctag-3′20

<210>2

<211>17

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据外壳蛋白的编码基因设计的用于检测PSV的特异性引物序列

<400>2

5′-cagatgccat ccctcga-3′17

<210>3

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据外壳蛋白的编码基因设计的用于检测PSV的特异性引物序列

<400>3

5′-ccaacgaagt gtacgtgtac c-3 21

<210>4

<211>64

<212>RNA

<213>花生矮化病毒(PSV)

<400>4

cagatgccat ccctcgatca tccaaccttt gtttctagca agaagtgtcg 50

tcctgggtac acgtacactt cgttgg                           76

Claims (2)

1.花生矮化病毒荧光定量RT-PCR检测试剂，其特征在于包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为76bp，引物和探针序列为：

引物：PSV TF：5′-cagatgccatccctcga-3′

PSV TR：5′-ccaacgaagtgtacgtgtacc-3′

探针：5′-FAM-catccaacctttgtttctag-MGB-3′。

2.权利要求1所述的花生矮化病毒荧光定量RT-PCR检测试剂在制备PSV荧光定量RT-PCR标准化试剂盒中的应用。