CN103941010A - 一种测定介体昆虫带毒率的免疫荧光检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可大批量、快速测定介体昆虫带毒率的免疫荧光检测方法，通过对田间采集到的介体昆虫进行分类、解剖、固定、渗透、配制抗体标记液、抗体孵育、制片和观察，统计携带病毒的昆虫数，从而计算出介体昆虫的带毒率。本方法检测成本低、耗时仅4小时、检测结果直观准确，灵敏度高，可用于大批量检测田间介体昆虫的带毒率。

Description

一种测定介体昆虫带毒率的免疫荧光检测方法
技术领域
本发明属于农业病害检测领域，具体涉及一种大批量、快速测定介体昆虫带毒率的免疫荧光检测方法。
背景技术
水稻是我国的第一大粮食作物，然而，近年来由水稻病毒引起的水稻病害在我国南方稻区大面积发生，已成为水稻生产上最严重的病毒病害，严重威胁到我国的粮食生产。
目前主要存在的水稻病毒有南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black streaked dwarf virus, SRBSDV）、水稻黑条矮缩病毒（Rice black streaked dwarf virus, RBSDV）、水稻矮缩病毒（Rice dwarf virus, RDV）、水稻齿叶矮缩病毒（Rice ragged stunt virus, RRSV）、水稻瘤矮病毒（Rice gall dwarf virus, RGDV）和水稻条纹病毒（Rice stripe virus, RSV），这些侵染水稻的病毒均由介体昆虫如叶蝉和飞虱以持久增殖型方式传播。介体昆虫在感染病毒的水稻病株上取食后，病毒通过介体昆虫的口针进入消化道系统，并在昆虫体内增殖扩散，最后扩散到唾液腺，在昆虫取食时随唾液传到健康水稻。有的病毒还可以经卵传播给子代昆虫，子代昆虫又可以继续传播病毒，危害水稻。
正是由于介体昆虫的长距离或短距离迁飞特性，导致了水稻病毒在水稻种植区的扩散和大面积发生。然而目前还没有防治病毒病的有效药物，水稻一经感染病毒即无药可治，因此对田间介体昆虫的防治及带毒情况监测至关重要。由于水稻生长季节，田间分布着大量的介体昆虫，对不同地区不同时间段昆虫带毒率的检测是一项繁重的任务，且需要能尽快获得检测结果，及时指导农业生产。已有的病毒检测方法有两大类，一类是基于PCR技术的RT-PCR和荧光定量PCR技术；另一类是基于蛋白免疫反应的ELISA检测技术和斑点杂交检测技术。这些技术虽然都可用于田间介体昆虫带毒情况的检测，但均存在着一些不足，如检测成本高，技术要求高，检测耗时，不适合大批量样品检测等。因此在田间介体昆虫带毒率检测方面急需建立一种可大批量测定且直观快速的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测技术，可用于介体昆虫带毒率的大批量、快速检测。本发明可降低检测成本、缩短检测时间、提高检测灵敏度，可对田间采集到的大批量介体昆虫的带毒率进行检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种测定介体昆虫带毒率的免疫荧光检测方法，是通过对田间采集到的介体昆虫进行分类、解剖、固定、渗透、配制抗体标记液、抗体孵育、制片和观察，统计携带病毒的昆虫数，从而计算出介体昆虫的带毒率。
具体方法包括以下步骤：
1）昆虫分类：将田间收集到的介体昆虫按不同类别分类；
2）解剖：将活体昆虫装入玻璃试管，放在冰上使昆虫低温麻醉，麻醉后将昆虫取出，放在体视镜下用解剖镊解剖出昆虫的消化道器官；
3）固定：将获得的昆虫消化道器官放入装有200μl固定液的0.5 ml离心管中，静置60-90 min； 
4）渗透：固定后的消化道器官于pH值为7.2的0.01 mol/L PBS溶液中清洗两次，再放入200 μl渗透液中处理10-30 min；
5）配制抗体标记液：将荧光抗体与抗体稀释液按1:100混合于0.5 ml离心管中制得抗体标记液，并用锡箔纸包裹避光；每100头介体昆虫需50 μl抗体标记液；
6）抗体孵育：用pH值为7.2的0.01 mol/L PBS溶液清洗消化道器官两次，将清洗后的消化道器官放入荧光抗体标记液中，于37℃恒温孵育45-60 min；
7）制片：孵育结束后，再次用pH值为7.2的0.01mol/L PBS溶液清洗消化道器官两次；向洁净的载玻片上加入一滴抗衰减液，将清洗后的消化道器官摆放在抗衰减液中，盖上盖玻片；
8）观察：在荧光显微镜下观察并统计携带病毒的昆虫数，计算出介体昆虫带毒率。
步骤2）中解剖得到的消化道器官包括前憩室、食道、中肠和后肠。
步骤3）所述固定液为含质量分数为4%多聚甲醛的0.01 mol/L PBS缓冲液。
步骤4）所述渗透液是将0.2 ml TritonX-100溶液加入到10 mL 0.01 mol/L PBS缓冲液，充分搅拌混匀制得。
步骤5）中的荧光抗体是将不同病毒的抗体分别与不同激发光波长的荧光素交联制得；
所述抗体稀释液为含质量分数为3% BSA的0.01 mol/L PBS缓冲液；
每组抗体标记液中含有1种或1种以上不同病毒的抗体，根据不同的荧光信号能同时鉴定介体昆虫体内所携带的不同病毒。
步骤7）中的抗衰碱液是将甘油与0.01mol/L PBS缓冲液按体积比9:1混合后充分搅拌制得。
本发明的显著优点在于：
1）耗时短：采用本发明的检测方法对介体昆虫带毒率进行测定，从介体昆虫解剖到荧光显微镜观察结果，约需4 h，大大缩短了检测时间；
2）成本低：所用试剂除荧光素外均为实验室常规试剂，且用量极少，每个抗体的制作成本约5000元，所制备的抗体约5 ml，而每100头介体昆虫的检测只需使用1μl抗体，因此制备一次抗体可检测50万头介体昆虫样品，针对每个样品进行检测的试剂成本不足0.2元；
3）可大批量检测：解剖50头介体昆虫约需30 min，每个技术人员每小时可解剖约100头介体昆虫，检测过程中大多数时间用于样品的静置孵育，因此可同时进行2-3批样品的检测，因此每个技术人员一个工作日可检测300头以上介体昆虫的样品；
4）结果直观准确：介体昆虫消化道经荧光抗体标记后，在荧光显微镜下可直观地观察到病毒在消化道内的分布，即使昆虫带毒后两天也可检测到荧光信号。
附图说明
图1为本发明实施例中白背飞虱若虫的解剖过程。
图2为本发明实施例中白背飞虱成虫的解剖过程。
图3为本发明实施例中白背飞虱的消化道示意图。
图4为以免疫荧光标记技术标记的南方水稻黑条矮缩病毒在介体昆虫中肠内的定位，其中，图A为绿色荧光标记的SRBSDV-P9-1蛋白；图B为红色荧光标记的SRBSDV-P7-1蛋白。
具体实施方式
1. 试剂配制
1）0.01mol/L PBS：称取8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4，溶于800 ml蒸馏水中，用HCl调节pH值至7.2，再加蒸馏水定容至1L即可。
2）固定液：称取4 g多聚甲醛溶于100 ml 0.01 mol/L PBS缓冲液中，50℃-60℃加热搅拌溶解，贮存于4℃。
3）渗透液：吸取0.2 mL 的TritonX-100溶液加入到10 mL 0.01 mol/L PBS缓冲液，充分搅拌溶解即可，贮存于4℃。
4）抗体稀释液：称量0.3g BSA置于15 ml离心管中，加入10mL的0.01 mol/L PBS缓冲液，充分搅拌溶解，贮存于4℃。
5）抗衰减液：量取90 ml 甘油与10mL的0.01 mol/L PBS缓冲液混合，充分搅拌，贮存于4℃。
6）荧光抗体：针对南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV），首先将病毒编码特定蛋白（如SRBSDV-P7-1蛋白和SRBSDV-P9-1蛋白）的多克隆抗体或单克隆抗体的IgG分别于0.1 mol/L的碳酸氢钠溶液中透析8h；然后将透析后的IgG分别收集到离心管中，每100 μl SRBSDV-P7-1蛋白的IgG加入50 μl溶于DMF的rhodamine进行标记，每100 μl SRBSDV-P9-1蛋白的IgG加入50 μl溶于DMF的荧光素FITC进行标记；分别室温震荡孵育1h，然后用0.01 mol/L PBS缓冲液透析除去游离的荧光素，再将两种标记过的病毒抗体按体积比1：1混合制得荧光抗体，将荧光抗体分装并保存于-20℃。
2. 实验方法
2.1 昆虫分类：先将田间收集到的介体昆虫按不同类别分类，取50头白背飞虱进行实验；
2.2 解剖：
1）若虫的解剖：将白背飞虱若虫装入20mm直径的玻璃试管中，冰上冰冻5min，冻晕的若虫放在体视镜的载物台上（如图1 A）；双手各取一把镊子，分别夹住昆虫的头和胸，然后缓缓向两边拉，当头与胸部分离后停止，此时消化道连接着头和胸部（如图1 B）；用一把镊子夹住昆虫尾部轻轻挤压，使昆虫体内物质从胸部断裂处挤出，另一把镊子夹住头向一边缓慢拉，消化道与头部连接被拉出，即解剖得到若虫的消化道器官（如图1 C）；
2）成虫的解剖：将白背飞虱成虫装入20mm直径的玻璃试管中，冰上冰冻5min，冻晕的成虫放在体视镜的载物台上（如图2 A）；双手各取一把镊子，分别夹住昆虫的头和胸，然后快速向两边拉，使头与胸部断裂而分离（如图2 B）；再用镊子将胸部和腹部分开，此时昆虫的消化道主要在腹部（如图2 C）；用一把镊子夹住昆虫的尾部末端，另一把镊子轻轻夹住腹部，然后同时缓慢向两边拉，昆虫的消化道连同尾部被拉出，即解剖得到成虫的消化道器官（如图2 D）；
解剖所得消化道器官包括前憩室、食道、中肠和后肠（如图3）；
2.3 固定：将获得的介体昆虫消化道器官放入装有200μl固定液的0.5 ml离心管中，静置90 min； 
2.4 渗透：固定后的消化道器官于pH值为7.2的0.01 mol/L PBS溶液中清洗两次，再放入200 μl渗透液中处理30 min；
2.5 配制抗体标记液：将荧光抗体与抗体稀释液按1:100混合于0.5 ml离心管中制得抗体标记液，并用锡箔纸包裹避光；每100头介体昆虫需50 μl抗体标记液；
2.6 抗体孵育：用pH值为7.2的0.01 mol/L PBS溶液清洗消化道器官两次，将清洗后的消化道器官放入荧光抗体标记液中，于37℃恒温孵育60 min；
2.7 制片：孵育结束后，再次用pH值为7.2的0.01mol/L PBS溶液清洗消化道器官两次；向洁净的载玻片上加入一滴抗衰减液，将清洗后的消化道器官摆放在抗衰减液中，盖上盖玻片；
2.8 观察：在荧光显微镜下观察并统计携带病毒的昆虫数，计算出介体昆虫带毒率。
2.9 计算方法：介体昆虫带毒率的计算公式如下：
带毒率（%）=（带毒虫数/总检测虫数）×100。
3. 实验结果
本实施例通过对50头白背飞虱的带毒率进行检测，结果表明其中12头白背飞虱的消化道器官中可检测到荧光信号，带毒率为24%；如图4所示，图A显示绿色荧光的部分表明存在SRBSDV-P9-1蛋白，图B显示红色荧光的部分表明存在SRBSDV-P7-1蛋白，因此根据荧光信号还可确定病毒蛋白在中肠的分布。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (7)

1. 一种测定介体昆虫带毒率的免疫荧光检测方法，其特征在于：通过对田间采集到的介体昆虫进行分类、解剖、固定、渗透、配制抗体标记液、抗体孵育、制片和观察，统计携带病毒的昆虫数，从而计算出介体昆虫的带毒率。
2. 根据权利要求1所述的测定介体昆虫带毒率的免疫荧光检测方法，其特征在于：具体方法包括以下步骤：
1）昆虫分类：将田间收集到的介体昆虫按不同类别分类；
2）解剖：将活体昆虫装入玻璃试管，放在冰上使昆虫低温麻醉，麻醉后将昆虫取出，放在体视镜下用解剖镊解剖出昆虫的消化道器官；
3）固定：将获得的昆虫消化道器官放入装有200μl固定液的0.5 ml离心管中，静置60-90 min； 
4）渗透：固定后的消化道器官于pH值为7.2的0.01 mol/L PBS溶液中清洗两次，再放入200 μl渗透液中处理10-30 min；
5）配制抗体标记液：将荧光抗体与抗体稀释液按1:100混合于0.5 ml离心管中制得抗体标记液，并用锡箔纸包裹避光；每100头介体昆虫需50 μl抗体标记液；
6）抗体孵育：用pH值为7.2的0.01 mol/L PBS溶液清洗消化道器官两次，将清洗后的消化道器官放入荧光抗体标记液中，于37℃恒温孵育45-60 min；
7）制片：孵育结束后，再次用pH值为7.2的0.01mol/L PBS溶液清洗消化道器官两次；向洁净的载玻片上加入一滴抗衰减液，将清洗后的消化道器官摆放在抗衰减液中，盖上盖玻片；
8）观察：在荧光显微镜下观察并统计携带病毒的昆虫数，计算出介体昆虫带毒率。
3. 根据权利要求2所述的测定介体昆虫带毒率的免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤2）中解剖得到的消化道器官包括前憩室、食道、中肠和后肠。
4. 根据权利要求2所述的测定介体昆虫带毒率的免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤3）所述固定液为含质量分数为4%多聚甲醛的0.01 mol/L PBS缓冲液。
5. 根据权利要求2所述的测定介体昆虫带毒率的免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤4）所述渗透液是将0.2 ml TritonX-100溶液加入到10 mL 0.01 mol/L PBS缓冲液，充分搅拌混匀制得。
6. 根据权利要求2所述的测定介体昆虫带毒率的免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤5）中的荧光抗体是将不同病毒的抗体分别与不同激发光波长的荧光素交联制得；
所述抗体稀释液为含质量分数为3% BSA的0.01 mol/L PBS缓冲液；
每组抗体标记液中含有1种或1种以上不同病毒的抗体，根据不同的荧光信号能同时鉴定介体昆虫体内所携带的不同病毒。
7. 根据权利要求2所述的测定介体昆虫带毒率的免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤7）中的抗衰碱液是将甘油与0.01mol/L PBS缓冲液按体积比9:1混合后充分搅拌制得。
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