JP6976567B2 - Ｄｎａメチル化解析のための試料調製方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ＤＮＡメチル化解析法の改良に関する。詳細には、本発明は、バイサルファイトを用いるＤＮＡメチル化解析において、バイサルファイト処理後のＰＣＲ増幅可能なＤＮＡ試料の収量を増加させる方法に関する。
ＤＮＡのメチル化は、エピジェネティック機構の１つであり、胚発生、細胞分化、表現型の差異、様々な疾病などと深く関わっている。現在、ＤＮＡのメチル化解析のための様々な方法が開発され、使用されている。最近では、目的にかなったｉＰＳ細胞の選別にもＤＮＡのメチル化解析が利用されている。
ＤＮＡのメチル化解析方法のなかで、特定ゲノム領域のＤＮＡのメチル化解析法としてはバイサルファイト処理を用いる方法が多用されている。バイサルファイトは、ＤＮＡ中の非メチル化シトシンをウラシルに変換するが、メチル化シトシンは他の塩基に変換されない。このことを利用して、バイサルファイト処理されたＤＮＡをＰＣＲ増幅後、シークエンス解析を行うことによって、ＤＮＡのメチル化の状態を知ることができる。
バイサルファイトを用いるＤＮＡのメチル化解析方法の１つとして、ＲＲＢＳ（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）法がある。ＲＲＢＳ法は、ＤＮＡのメチル化を１塩基レベルで調べることができる方法であり、シークエンス量を減らすことができ、しかも全ゲノム解析法と同様のカバー率を得ることができる方法である。近年、ＢＢＲＳ法を用いてシングルセルＤＮＡのメチル化解析を行う試みがなされている（非特許文献１、２参照）。シングルセル由来のＤＮＡなどの微量試料のＤＮＡメチル化解析を行う際に、バイサルファイト処理が過酷な条件で行われるためにＤＮＡ試料が断片化し、次工程であるＰＣＲ増幅のための十分な量のＤＮＡが供給されないという問題がある。
H. Guo et al. Genome Research, 23, 2126-2135 (2013)
H. Guo et al. Nature Protocols, 10(5), 645-659 (2015)
本発明が解決すべき課題は、バイサルファイト処理後のＰＣＲ増幅可能なＤＮＡ試料の収量を増加させるための有効かつ簡単な方法を開発することであった。
本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、バイサルファイト処理後のＤＮＡ試料を１本鎖ＤＮＡリガーゼで処理する工程を含むレスキューを行うことにより、バイサルファイト処理後のＰＣＲ増幅可能なＤＮＡ試料の収量を増加させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は下記のものに関する。
（１）バイサルファイト処理を用いるＤＮＡメチル化解析のための方法であって、バイサルファイト処理後のＤＮＡ試料を１本鎖ＤＮＡリガーゼで処理することにより、バイサルファイト処理後のＰＣＲ増幅可能なＤＮＡ試料の収量を増加させることを特徴とする方法。
（２）バイサルファイト処理を用いるＤＮＡメチル化解析がＲＲＢＳ（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）法によるものである（１）記載の方法。
（３）１本鎖ＤＮＡリガーゼでの処理の前に、バイサルファイト処理後のＤＮＡ試料を下記工程：
（ａ）ＤＮＡ５’−，３’−ホスファターゼまたはＤＮＡ３’−ホスファターゼでの処理、および
（ｂ）ＤＮＡ５’−キナーゼでの処理
に付すことを特徴とする（１）または（２）記載の方法。
（４）バイサルファイト処理後のＤＮＡ試料が担体に固定化されている、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）工程（ｂ）がＡＴＰの存在下において行われる、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、１本鎖ＤＮＡリガーゼを含むキット。
（７）さらにＤＮＡ５’−，３’−ホスファターゼまたはＤＮＡ３’−ホスファターゼおよびＤＮＡ５’キナーゼを含む（６）記載のキット。
（１）バイサルファイト処理を用いるＤＮＡメチル化解析のための方法であって、バイサルファイト処理後のＤＮＡ試料を１本鎖ＤＮＡリガーゼで処理することにより、バイサルファイト処理後のＰＣＲ増幅可能なＤＮＡ試料の収量を増加させることを特徴とする方法。
（２）バイサルファイト処理を用いるＤＮＡメチル化解析がＲＲＢＳ（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）法によるものである（１）記載の方法。
（３）１本鎖ＤＮＡリガーゼでの処理の前に、バイサルファイト処理後のＤＮＡ試料を下記工程：
（ａ）ＤＮＡ５’−，３’−ホスファターゼまたはＤＮＡ３’−ホスファターゼでの処理、および
（ｂ）ＤＮＡ５’−キナーゼでの処理
に付すことを特徴とする（１）または（２）記載の方法。
（４）バイサルファイト処理後のＤＮＡ試料が担体に固定化されている、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）工程（ｂ）がＡＴＰの存在下において行われる、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、１本鎖ＤＮＡリガーゼを含むキット。
（７）さらにＤＮＡ５’−，３’−ホスファターゼまたはＤＮＡ３’−ホスファターゼおよびＤＮＡ５’キナーゼを含む（６）記載のキット。
本発明によれば、１本鎖ＤＮＡリガーゼを用いる簡単な方法により、バイサルファイト処理後のＰＣＲ増幅可能なＤＮＡ試料の収量を増加させることができ、その後のＰＣＲ工程およびシークエンス工程に十分な量のＤＮＡ試料を供給することができる。したがって、本発明を用いれば、シングルセル由来のＤＮＡなどの微量なＤＮＡ試料のメチル化解析が可能となる。
本発明は、１の態様において、バイサルファイト処理を用いるＤＮＡメチル化解析のための方法であって、バイサルファイト処理後のＤＮＡ試料を１本鎖ＤＮＡリガーゼで処理することにより、バイサルファイト処理後のＰＣＲ増幅可能なＤＮＡ試料の収量を増加させることを特徴とする方法に関する。
バイサルファイト処理を用いるＤＮＡのメチル化解析は広く用いられている。バイサルファイトは、ＤＮＡ中の非メチル化シトシンをウラシルに変換するが、メチル化シトシンは他の塩基に変換されない。このことを利用して、バイサルファイト処理されたＤＮＡをＰＣＲ増幅後、シークエンス解析を行うことによって、ＤＮＡのメチル化の状態を知ることができる。しかし、バイサルファイト自体反応性に富む物質であり、処理条件も高温であるために、バイサルファイト処理を行うとＤＮＡ試料が断片化し、次工程であるＰＣＲ増幅のために十分な量のＤＮＡが供給されないという問題がある。
本発明は、かかるＤＮＡ試料の損失を抑制するために、バイサルファイト処理後のＤＮＡ試料を１本鎖ＤＮＡリガーゼ処理に付すことによりレスキューを行い、次工程であるＰＣＲ増幅のために十分な量のＤＮＡを供給するものである。このようなレスキューは、従来のバイサルファイト処理を用いるＤＮＡのメチル化解析においては行われていなかった。
現在よく用いられているバイサルファイト処理を用いるＤＮＡのメチル化解析法の例としては、ＲＲＢＳ法および全ゲノムバイサルファイトシークエンシング（ＷＧＢＳ）法などが挙げられる。本発明は、バイサルファイトを用いるいずれのＤＮＡのメチル化解析法においても実施可能であるが、ＲＲＢＳ法において実施することが好ましい。以下において、ＲＲＢＳ法に関連して本発明を説明する。
一般に、ＲＲＢＳ法は以下の工程を含む（H. Guo et al. Nature Protocols, 10(5), 645-659 (2015)等を参照のこと）：
制限酵素によるＤＮＡ試料の消化
エンドリペアおよびｄＡテイリング
アダプターライゲーション
バイサルファイト処理
ＰＣＲ増幅
シークエンシング
制限酵素によるＤＮＡ試料の消化
エンドリペアおよびｄＡテイリング
アダプターライゲーション
バイサルファイト処理
ＰＣＲ増幅
シークエンシング
本発明においては、バイサルファイト処理とＰＣＲ増幅との間に、１本鎖ＤＮＡリガーゼを用いて断片化したＤＮＡ試料を連結することにより、ＤＮＡ試料のレスキューを行う。ここで用いられる１本鎖ＤＮＡリガーゼは、１本鎖ＤＮＡを連結する活性を有するものであればいずれの酵素であってもよく、市販もされている。本発明に使用する１本鎖ＤＮＡリガーゼの例としてはEpicentre社のCircLigaseTMssDNA Ligase、和光純薬工業株式会社のSingle Strand DNA Ligase, thermostable, recombinant, Solutionなどが挙げられるが、これらに限定されない。１本鎖ＤＮＡリガーゼの好ましい反応条件は酵素の種類により異なるが、それらは当業者に公知であるか、あるいは当業者が容易に定めうるものである。
一般に、１本鎖ＤＮＡリガーゼは、ポリヌクレオチドの３’末端の水酸基と、５’末端のリン酸基を結合する反応を触媒する。したがって、バイサルファイト処理後の断片化したＤＮＡ試料の３’末端を水酸基とし、５’末端にリン酸基を付加することが、１本鎖ＤＮＡリガーゼによる連結反応の効率化および連結されたＤＮＡの収量増加につながる。
そのためには、１本鎖ＤＮＡリガーゼでの連結反応の前に、ＤＮＡ５’−，３’−ホスファターゼまたはＤＮＡ３’−ホスファターゼでの処理、およびＤＮＡ５’−キナーゼでの処理を行うことが好ましい。
本発明に使用するＤＮＡ５’−，３’−ホスファターゼは、ＤＮＡの５’末端および３’末端のリン酸基を加水分解して水酸基を生じさせる活性を有するものであればいずれのものであってもよく、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社の製品番号ＥＦ０６５４などが挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡ５’−，３’−ホスファターゼの好ましい反応条件は酵素の種類により異なるが、それらは当業者に公知であるか、あるいは当業者が容易に定めうるものである。
本発明に使用するＤＮＡ３’−ホスファターゼは、ＤＮＡの３’末端のリン酸基を加水分解して水酸基を生じさせる活性を有するものであればいずれのものであってもよい。ＤＮＡ３’−ホスファターゼの好ましい反応条件は酵素の種類により異なるが、それらは当業者に公知であるか、あるいは当業者が容易に定めうるものである。また、ポリヌクレオチドキナーゼ ３’−ホスファターゼ（ＰＮＫＰ）を用いてもよい。ＰＮＫＰは３’ホスファターゼ活性と５’−キナーゼ活性を有する酵素である。いくつかのＰＮＫＰがＱＩＡＧＥＮ社などから市販されている。
本発明に使用する５’−キナーゼは、ＤＮＡの５’末端にリン酸基を付加する活性を有するものであればいずれのものであってもよく、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡ５’−キナーゼの好ましい反応条件は酵素の種類により異なるが、それらは当業者に公知であるか、あるいは当業者が容易に定めうるものである。また、ＡＴＰの存在下においてキナーゼ反応を行うことにより、ＤＮＡ試料の収量をさらに増加させることができる。ＡＴＰの量は特に限定されず、当業者が適宜定めうるものである。ＡＴＰの量の例として、キナーゼ反応系中、終濃度として約１ｍＭ〜数ｍＭとすることが挙げられるが、これに限定されない。
ＤＮＡ５’−，３’−ホスファターゼを用いる場合には、ＤＮＡ５’−キナーゼを作用させる前に、ＤＮＡ５’−，３’−ホスファターゼを作用させ、バイサルファイト処理により生じた断片化ＤＮＡ試料の５’末端および３’末端の両方のリン酸基を加水分解して、各末端に水酸基を生じさせる。次いで、ＤＮＡ５’−キナーゼを作用させ、断片化ＤＮＡ試料の５’末端にリン酸基を付加する。その後、１本鎖ＤＮＡリガーゼを作用させて、断片化したＤＮＡ試料を連結してレスキューする。
ＤＮＡ５’−，３’−ホスファターゼのかわりにＤＮＡ３’ホスファターゼを用いる場合は、（ｉ）ＤＮＡ３’ホスファターゼでの処理とＤＮＡ５’−キナーゼでの処理を同時に行ってもよく、（ｉｉ）先にＤＮＡ５’−キナーゼで処理し、その後ＤＮＡ３’ホスファターゼで処理してもよい。例えばＮＥＢ社のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて（ｉ）の処理を行ってもよい。ただし、（ｉ）、（ｉｉ）のような処理を行う場合は、ＤＮＡ３’−ホスファターゼは、ＤＮＡの５’末端のリン酸基を加水分解する活性が無視できる程度であるか、あるいはそのような活性を有していないことが必要である。
１本鎖ＤＮＡリガーゼによる連結反応を効率よく行って、レスキューされるＤＮＡ試料の収量を増加させるために、ＤＮＡ試料を固定化担体に結合させることが好ましい。ＤＮＡ試料を固定化した担体を集めることにより、ＤＮＡ試料が濃縮、精製されてレスキュー効率が上昇し、より多くのＤＮＡ試料を回収できる。ＤＮＡ試料の固定化は、バイサルファイト処理の前、後いずれに行ってもよいが、バイサルファイト処理の後で行うほうが好ましい。その理由として、バイサルファイト処理中の反応時に固定化担体が反応を妨げる可能性があること、およびバイサルファイト処理後の精製はカラムを使用するため、固定化担体がカラムを通過できないことが挙げられる。
ＤＮＡ試料の固定化のために、担体との結合を可能にする物質または官能基をアダプターに結合または導入することができる。かかる物質または官能基を予め結合または導入したアダプターをＤＮＡ試料に連結してもよく、アダプターをＤＮＡ試料に連結した後かかる物質または官能基を結合または導入してもよい。バイサルファイト処理前に固定化を行う場合は、担体に固定化されたＤＮＡ試料をバイサルファイト処理する。バイサルファイト処理後に固定化を行う場合は、アダプターを付したＤＮＡ試料をバイサルファイト処理し、その後、担体に固定化する。
アダプターの設計は当業者に公知であり、ＰＣＲ増幅に用いるプライマーの塩基配列やシークエンサーなどの条件に応じて行うことができる。メチル化解析用の市販キットの構成成分として含まれているアダプターを使用してもよい。
ＤＮＡ試料を固定化するためにアダプターに結合させる物質、およびアダプターに導入する官能基は当業者に公知であり、それらの結合方法、導入方法、および担体への固定化方法も当業者に公知である。例えば、アダプターの末端にビオチンを付加し、担体にアビジンを結合させておいて、ビオチン−アビジン結合を利用して固定化を行うことができる。上例の場合、担体としてはアビジンを結合した磁性ビーズが適当である。担体との結合を可能にする物質や官能基、固定化担体ならびに固定化方法は上記のものに限定されないことはいうまでもない。
本発明は、さらなる態様において、バイサルファイトを用いるＤＮＡメチル化解析において、バイサルファイト処理後のＰＣＲ増幅可能なＤＮＡ試料の収量を増加させる方法であって、バイサルファイト処理後のＤＮＡ試料を１本鎖ＤＮＡリガーゼで処理することを特徴とする方法を実施するためのキットに関するものである。したがって、本発明のキットは、１本鎖ＤＮＡリガーゼを含む。
本発明のキットは、さらにＤＮＡ５’−，３’−ホスファターゼまたはＤＮＡ３’−ホスファターゼ、およびＤＮＡ５’−キナーゼを含んでいてもよい。１本鎖ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡ５’−，３’−ホスファターゼ、ＤＮＡ３’−ホスファターゼ、およびＤＮＡ５’−キナーゼについては上で説明したとおりである。
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
ＲＲＢＳ法によりヒトゲノムＤＮＡのメチル化を解析するにあたり、バイサルファイト処理後に本発明のレスキュー反応を行って、回収されるＤＮＡ試料の収量の増加を調べた。
１．実験手順
試料として、Promega 製品番号 G3041-1のヒトゲノムＤＮＡ３ｎｇを用いた。実験手順は以下の７つの工程を含んでいた：１）ＭｓｐＩでの消化、２）エンドリペア／ｄＡテイリング反応、３）アダプターライゲーション、４）バイサルファイト処理、５）レスキュー反応、６）第１ラウンドＰＣＲエンリッチメント、および７）第２ラウンドＰＣＲエンリッチメント。
試料として、Promega 製品番号 G3041-1のヒトゲノムＤＮＡ３ｎｇを用いた。実験手順は以下の７つの工程を含んでいた：１）ＭｓｐＩでの消化、２）エンドリペア／ｄＡテイリング反応、３）アダプターライゲーション、４）バイサルファイト処理、５）レスキュー反応、６）第１ラウンドＰＣＲエンリッチメント、および７）第２ラウンドＰＣＲエンリッチメント。
１）ＭｓｐＩでの消化
ヒトゲノムＤＮＡ ３ｎｇを、９ユニットのＭｓｐＩ、１ｘＴａｎｇｏバッファー（Guo H et al, Nature Protocols, vol.10 (5), 645-659参照）、ヌクレアーゼフリーの水の混合物中で３７℃にて３時間反応させ、次いで、８０℃で２０分間酵素を失活させた。
ヒトゲノムＤＮＡ ３ｎｇを、９ユニットのＭｓｐＩ、１ｘＴａｎｇｏバッファー（Guo H et al, Nature Protocols, vol.10 (5), 645-659参照）、ヌクレアーゼフリーの水の混合物中で３７℃にて３時間反応させ、次いで、８０℃で２０分間酵素を失活させた。
２）エンドリペア／ｄＡ−テイリング ５ユニットのクレノウフラグメントｅｘｏ−（上記Guoらの文献参照）、１ｘＴａｎｇｏバッファー、４０μＭ ｄＡＴＰ、４μＭ ｄＣＴＰ、４μＭ ｄＧＴＰを加え、３７℃で４０分反応させ、７５℃で１５分間酵素失活させた。
３）アダプターライゲーション
アダプターライゲーションにおいて、３０ＷｅｉｓｓユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（上記Guoらの文献参照）、１ｘＴａｎｇｏバッファー、１ｍＭ ＡＴＰ、アダプター、ヌクレアーゼフリーの水を加え、１６℃で３０分反応させ、引き続き４℃で一晩反応した後に、６５℃で２０分間酵素失活を行った。試料の正確な量を計測し、３０μＬになるようヌクレアーゼフリーの水で調整後、６μＬ（試料Ｉ）、１２μＬ（試料ＩＩ、ＩＩＩ）、１２μＬ（試料ＩＶ、Ｖ）に分注し、試料Ｉは−８０℃で保存した。
アダプターライゲーションにおいて、３０ＷｅｉｓｓユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（上記Guoらの文献参照）、１ｘＴａｎｇｏバッファー、１ｍＭ ＡＴＰ、アダプター、ヌクレアーゼフリーの水を加え、１６℃で３０分反応させ、引き続き４℃で一晩反応した後に、６５℃で２０分間酵素失活を行った。試料の正確な量を計測し、３０μＬになるようヌクレアーゼフリーの水で調整後、６μＬ（試料Ｉ）、１２μＬ（試料ＩＩ、ＩＩＩ）、１２μＬ（試料ＩＶ、Ｖ）に分注し、試料Ｉは−８０℃で保存した。
アダプターとして、以下の配列の片側ビオチン化バーコード入りアダプターのセットを設計し、使用した。
5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGATCTTT-3' （配列番号：１）
（５’−ビオチン化、Ｃは５−メチル−ｄＣ）
5'-AAGATCACTCTGCGTTGATACCACTGCTT-3' （配列番号：２）
（５’−リン酸化、３’−ビオチン化、Ｃは５−メチル−ｄＣ）
5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGATCTTT-3' （配列番号：１）
（５’−ビオチン化、Ｃは５−メチル−ｄＣ）
5'-AAGATCACTCTGCGTTGATACCACTGCTT-3' （配列番号：２）
（５’−リン酸化、３’−ビオチン化、Ｃは５−メチル−ｄＣ）
４）バイサルファイト処理
１２μＬの試料（試料ＩＶ、Ｖ）をバイサルファイト処理に付した。試料にフクレアーゼ不含水を加え、２５μＬに調整した。ＣＴコンバージョンバッファーを１２５μＬ加え、よく混合した。バイサルファイト処理を９８℃で１０分、６４℃で２時間、その後４℃で行った。処理済みＤＮＡをＭｅｔｈｙｌｃｏｄｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号ＭＥＣＯＶ−５０）を用い、バインディングバッファーに１μｌのｔＲＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）を加え遠心した。最後の溶出は５０℃でプレヒートした２５μＬのエリューションバッファーを使用した。量を測り取り、２等分した（改めて試料ＩＶ、Ｖと命名）。
１２μＬの試料（試料ＩＶ、Ｖ）をバイサルファイト処理に付した。試料にフクレアーゼ不含水を加え、２５μＬに調整した。ＣＴコンバージョンバッファーを１２５μＬ加え、よく混合した。バイサルファイト処理を９８℃で１０分、６４℃で２時間、その後４℃で行った。処理済みＤＮＡをＭｅｔｈｙｌｃｏｄｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号ＭＥＣＯＶ−５０）を用い、バインディングバッファーに１μｌのｔＲＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）を加え遠心した。最後の溶出は５０℃でプレヒートした２５μＬのエリューションバッファーを使用した。量を測り取り、２等分した（改めて試料ＩＶ、Ｖと命名）。
５）レスキュー反応
レスキュー反応は４つの工程５−１）、５−２）、５−３）、５−４）を含んでいた。
レスキュー反応は４つの工程５−１）、５−２）、５−３）、５−４）を含んでいた。
５−１）ビーズへの固定化
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号１１２０５Ｄ）１０μＬをＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製品番号００３０ １０８．０５１）に入れ、ビーズを捕捉し、２ｘＢＷＴバッファー（1０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄後、１０μＬの２ｘＢＷＴバッファーに懸濁した。試料Ｖ（約１０μＬ）を加えて混合し、室温で１５分インキュベートした。ビーズを捕捉した後、１ｘＢＷＴバッファー（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄後、ＥＢＴバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で１回洗浄した。
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号１１２０５Ｄ）１０μＬをＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製品番号００３０ １０８．０５１）に入れ、ビーズを捕捉し、２ｘＢＷＴバッファー（1０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄後、１０μＬの２ｘＢＷＴバッファーに懸濁した。試料Ｖ（約１０μＬ）を加えて混合し、室温で１５分インキュベートした。ビーズを捕捉した後、１ｘＢＷＴバッファー（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄後、ＥＢＴバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で１回洗浄した。
５−２）ホスファターゼ反応
１ｘバッファー、ヌクレアーゼフリーの水を用いてホスファターゼミクスチャーを作成した。５−１）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、ホスファターゼミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブ移した。ＦａｓｔＡＰ Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号ＥＦ０６５４）１μＬを加え、３７℃で１０分反応させ、７５℃で５分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。
１ｘバッファー、ヌクレアーゼフリーの水を用いてホスファターゼミクスチャーを作成した。５−１）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、ホスファターゼミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブ移した。ＦａｓｔＡＰ Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号ＥＦ０６５４）１μＬを加え、３７℃で１０分反応させ、７５℃で５分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。
５−３）キナーゼ反応
１ｘバッファー、ヌクレアーゼフリーの水を用いてキナーゼミクスチャーを作成した。５−２）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、キナーゼミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブへ移した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＴａＫａＲａ製品番号２０２１Ａ）１μＬを加え、３７℃で３０分反応させ、７０℃で５分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。
１ｘバッファー、ヌクレアーゼフリーの水を用いてキナーゼミクスチャーを作成した。５−２）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、キナーゼミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブへ移した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＴａＫａＲａ製品番号２０２１Ａ）１μＬを加え、３７℃で３０分反応させ、７０℃で５分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。
５−４）１本鎖ＤＮＡリガーゼ反応
１ｘバッファー、ヌクレアーゼフリーの水を用いて１本鎖ＤＮＡリガーゼミクスチャーを作成した。５−３）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、１本鎖ＤＮＡミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブへ移した。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ １本鎖ＤＮＡリガーゼ（ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ製品番号ＣＬ９０２５Ｋ）１μＬを加え、６０℃で２時間反応させ、８０℃で１０分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。最後はＭｅｔｈｙｌｃｏｄｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｋｉｔのエリューションバッファー１０μＬに懸濁した。この試料を以下の核酸増幅に付した。
１ｘバッファー、ヌクレアーゼフリーの水を用いて１本鎖ＤＮＡリガーゼミクスチャーを作成した。５−３）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、１本鎖ＤＮＡミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブへ移した。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ １本鎖ＤＮＡリガーゼ（ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ製品番号ＣＬ９０２５Ｋ）１μＬを加え、６０℃で２時間反応させ、８０℃で１０分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。最後はＭｅｔｈｙｌｃｏｄｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｋｉｔのエリューションバッファー１０μＬに懸濁した。この試料を以下の核酸増幅に付した。
６）第１ラウンドＰＣＲエンリッチメント
レスキュー反応をしていない試料ＩおよびＩＶをＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズ１０μＬに固定化した。試料Ｉは、ヌクレアーゼフリーの水で１０μＬに調整してから混合した。
下記のようにＰＣＲミクスチャーを作成した。１ｘＰＣＲ Ｐｆｕ Ｃｘバッファー（Guoらの上記文献参照）、１ユニットのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｃｘ ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Guoらの上記文献参照）、各２００μＭ ｄＮＴＰミクスチャー、３００ｎＭ プライマー（5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'）（配列番号：３）、ヌクレアーゼ不含の水、およびビーズ付着試料。
その後ＰＣＲ反応を次のように行った。９５℃で２分→９５℃で２０秒を２２サイクル、６０℃で３０秒、７２℃で１分→７２℃で５分→４℃。ＰＣＲ反応終了後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズを捕捉し、上清を回収し、１：１ ＡＭＰｕｒｅビーズ（Guoらの上記文献参照）でＰＣＲ産物を２回精製した。
レスキュー反応をしていない試料ＩおよびＩＶをＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズ１０μＬに固定化した。試料Ｉは、ヌクレアーゼフリーの水で１０μＬに調整してから混合した。
下記のようにＰＣＲミクスチャーを作成した。１ｘＰＣＲ Ｐｆｕ Ｃｘバッファー（Guoらの上記文献参照）、１ユニットのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｃｘ ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Guoらの上記文献参照）、各２００μＭ ｄＮＴＰミクスチャー、３００ｎＭ プライマー（5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'）（配列番号：３）、ヌクレアーゼ不含の水、およびビーズ付着試料。
その後ＰＣＲ反応を次のように行った。９５℃で２分→９５℃で２０秒を２２サイクル、６０℃で３０秒、７２℃で１分→７２℃で５分→４℃。ＰＣＲ反応終了後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズを捕捉し、上清を回収し、１：１ ＡＭＰｕｒｅビーズ（Guoらの上記文献参照）でＰＣＲ産物を２回精製した。
７）第２ラウンドＰＣＲエンリッチメント
下記のようにＰＣＲミクスチャーを作成した。１ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ ｗｉｔｈ ＨＦ ｂｕｆｆｅｒ（Guoらの上記文献参照）、５００ｎＭ プライマー（上記配列）、および試料。
その後ＰＣＲ反応を次のように行った。９８℃で２ｍｉｎ→９８℃で１０秒を２２サイクル、６０℃で３０秒、７２℃で１分→７２℃で５分→４℃。ＰＣＲ反応終了後、１：１ ＡＭＰｕｒｅビーズでＰＣＲ産物を１回精製し、２５μＬのヌクレアーゼフリーの水で溶出し、回収した。
収率を確認するために、回収した試料１μＬ、Ｑｕｂｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ Ｑｕｂｉｔ（登録商標） ２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）１μＬ、Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００）１５μＬを２．０％ Ｅ−ｇｅｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号Ｇ５２１８０２）で泳動しチェックした。
下記のようにＰＣＲミクスチャーを作成した。１ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ ｗｉｔｈ ＨＦ ｂｕｆｆｅｒ（Guoらの上記文献参照）、５００ｎＭ プライマー（上記配列）、および試料。
その後ＰＣＲ反応を次のように行った。９８℃で２ｍｉｎ→９８℃で１０秒を２２サイクル、６０℃で３０秒、７２℃で１分→７２℃で５分→４℃。ＰＣＲ反応終了後、１：１ ＡＭＰｕｒｅビーズでＰＣＲ産物を１回精製し、２５μＬのヌクレアーゼフリーの水で溶出し、回収した。
収率を確認するために、回収した試料１μＬ、Ｑｕｂｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ Ｑｕｂｉｔ（登録商標） ２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）１μＬ、Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００）１５μＬを２．０％ Ｅ−ｇｅｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号Ｇ５２１８０２）で泳動しチェックした。
２．実験結果
ヒトゲノムＤＮＡを試料として用いた実験結果を以下に示す。
表１に試料とその処理の関係を示す。
BS: バイサルファイト処理の有無（上記プロトコル４-１）
Purify 1: Bisulfite conversion kit付属のカラムを使用し精製の有無（上記プロトコル４-１）
rescue: １本鎖ＤＮＡリガーゼを用いるレスキュー
Purify 2: Ｍ２８０ストレプトアビジンビーズを使用し精製の有無（上記プロトコル５）
ヒトゲノムＤＮＡを試料として用いた実験結果を以下に示す。
表１に試料とその処理の関係を示す。
Purify 1: Bisulfite conversion kit付属のカラムを使用し精製の有無（上記プロトコル４-１）
rescue: １本鎖ＤＮＡリガーゼを用いるレスキュー
Purify 2: Ｍ２８０ストレプトアビジンビーズを使用し精製の有無（上記プロトコル５）
ＰＣＲ産物測定結果（上記プロトコル７）を表２および図１に示す。２．０％ Ｅ−ｇｅｌでの電気泳動の結果を図２に示す（中央のレーンが試料Ｉ、右から２つめのレーンが試料ＩＶ、一番右のレーンが試料Ｖ）。
試料ＩＶと試料Ｖの比較により、本発明のレスキュー反応によって２．３倍程度の収量増加が認められた。
試料ＩＶと試料Ｖの比較により、本発明のレスキュー反応によって２．３倍程度の収量増加が認められた。
メチル化解析のマルチプレックス化に対応させるため、上記プロトコル３に記載のアダプターとは異なるアダプターを設計し、同様にレスキュー反応を行ったところ、同様の収量増加が認められた。
以下の実施例は、ＲＲＢＳ法によりヒトゲノムＤＮＡのメチル化を解析するにあたり、バイサルファイト処理後に本発明のレスキュー反応を行って、回収されるＤＮＡ試料の収量の増加を調べた際の実験手順および結果を示す。
１．実験手順
試料として、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７細胞株を用いた。２０１Ｂ７細胞株をフィーダー細胞上で培養後細胞を回収し、抗ＳＳＥＡ−４抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びＰＩ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した細胞懸濁液をＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用しシングルセルモードで抗ＳＳＥＡ−４抗体陽性、ＰＩ陰性の細胞を９６ウェルＰＣＲプレートに３００細胞ずつソーティングした。実験手順は以下の７つの工程を含んでいた：１）ＭｓｐＩでの消化、２）エンドリペア／ｄＡテイリング反応、３）アダプターライゲーション、４）バイサルファイト処理、５）レスキュー反応、６）第１ラウンドＰＣＲエンリッチメント、および７）第２ラウンドＰＣＲエンリッチメント。今回の追加データでは８）ゲル切り出し、精製後のサンプルをシークエンス及び精製後のサンプルをテンプレートとし、ヒト特異的遺伝子プライマーにより定量的ＰＣＲを行った。
試料として、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７細胞株を用いた。２０１Ｂ７細胞株をフィーダー細胞上で培養後細胞を回収し、抗ＳＳＥＡ−４抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びＰＩ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した細胞懸濁液をＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用しシングルセルモードで抗ＳＳＥＡ−４抗体陽性、ＰＩ陰性の細胞を９６ウェルＰＣＲプレートに３００細胞ずつソーティングした。実験手順は以下の７つの工程を含んでいた：１）ＭｓｐＩでの消化、２）エンドリペア／ｄＡテイリング反応、３）アダプターライゲーション、４）バイサルファイト処理、５）レスキュー反応、６）第１ラウンドＰＣＲエンリッチメント、および７）第２ラウンドＰＣＲエンリッチメント。今回の追加データでは８）ゲル切り出し、精製後のサンプルをシークエンス及び精製後のサンプルをテンプレートとし、ヒト特異的遺伝子プライマーにより定量的ＰＣＲを行った。
１）ＭｓｐＩでの消化
ヒトゲノムＤＮＡ ３ｎｇを、９ユニットのＭｓｐＩ、１ｘＴａｎｇｏバッファー（Guo H et al, Nature Protocols, vol.10 (5), 645-659参照）、ヌクレアーゼフリーの水の混合物中で３７℃にて３時間反応させ、次いで、８０℃で２０分間酵素を失活させた。
ヒトゲノムＤＮＡ ３ｎｇを、９ユニットのＭｓｐＩ、１ｘＴａｎｇｏバッファー（Guo H et al, Nature Protocols, vol.10 (5), 645-659参照）、ヌクレアーゼフリーの水の混合物中で３７℃にて３時間反応させ、次いで、８０℃で２０分間酵素を失活させた。
２）エンドリペア／ｄＡ−テイリング
５ユニットのクレノウフラグメントｅｘｏ−（上記Guoらの文献参照）、１ｘＴａｎｇｏバッファー、４０μＭ ｄＡＴＰ、４μＭ ｄＣＴＰ、４μＭ ｄＧＴＰを加え、３７℃で４０分反応させ、７５℃で１５分間酵素失活させた。
５ユニットのクレノウフラグメントｅｘｏ−（上記Guoらの文献参照）、１ｘＴａｎｇｏバッファー、４０μＭ ｄＡＴＰ、４μＭ ｄＣＴＰ、４μＭ ｄＧＴＰを加え、３７℃で４０分反応させ、７５℃で１５分間酵素失活させた。
３）アダプターライゲーション
アダプターライゲーションにおいて、３０ＷｅｉｓｓユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（上記Guoらの文献参照）、１ｘＴａｎｇｏバッファー、１ｍＭ ＡＴＰ、アダプター、ヌクレアーゼフリーの水を加え、１６℃で３０分反応させ、引き続き４℃で一晩反応した後に、６５℃で２０分間酵素失活を行った。試料の正確な量を計測し、30uLになるようヌクレアーゼフリーの水で調整後、１０ｕＬ（試料Ｉ（表１でｃｏｎｔｒｏｌ、図３でＢＳ（−）と表記））、２０ｕＬ（試料ＩＩ、ＩＩＩ）に分注し、試料Ｉは−８０℃で保存した。
アダプターライゲーションにおいて、３０ＷｅｉｓｓユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（上記Guoらの文献参照）、１ｘＴａｎｇｏバッファー、１ｍＭ ＡＴＰ、アダプター、ヌクレアーゼフリーの水を加え、１６℃で３０分反応させ、引き続き４℃で一晩反応した後に、６５℃で２０分間酵素失活を行った。試料の正確な量を計測し、30uLになるようヌクレアーゼフリーの水で調整後、１０ｕＬ（試料Ｉ（表１でｃｏｎｔｒｏｌ、図３でＢＳ（−）と表記））、２０ｕＬ（試料ＩＩ、ＩＩＩ）に分注し、試料Ｉは−８０℃で保存した。
アダプターとして、以下の配列の両側ビオチン化バーコード入りＹ字アダプターを使用した。Ｙ字アダプターは５’末端がビオチン化されたユニバーサルアダプターと３’末端がビオチン化されたインデックスアダプターをアニーリングさせ作成した。
ユニバーサルアダプターの配列は下記の通りである。
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’（配列番号：４）（５‘-ビオチン化、Ｃは５−メチル−ｄＣ、３’末端側ＣＴ間をホスホロチオネート化）
インデックスアダプターの配列は下記の通りである
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：５）（５’−リン酸化、Ｃは５−メチル−ｄＣ、３’−ビオチン化）
ユニバーサルアダプターの配列は下記の通りである。
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’（配列番号：４）（５‘-ビオチン化、Ｃは５−メチル−ｄＣ、３’末端側ＣＴ間をホスホロチオネート化）
インデックスアダプターの配列は下記の通りである
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：５）（５’−リン酸化、Ｃは５−メチル−ｄＣ、３’−ビオチン化）
４）バイサルファイト処理
２０ｕＬの試料（試料ＩＩ、ＩＩＩ）をバイサルファイト処理に付した。試料にヌクレアーゼ不含水を加え、２５ｕＬに調整した。ＣＴコンバージョンバッファーを１２５μＬ加え、よく混合した。バイサルファイト処理を９８℃で１０分、６４℃で２時間、その後４℃で行った。処理済みＤＮＡをＭｅｔｈｙｌｃｏｄｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号ＭＥＣＯＶ−５０）を用い、バインディングバッファーに１μｌのｔＲＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）を加え遠心した。最後の溶出は５０℃でプレヒートした２５μＬのエリューションバッファーを使用した。量を測り取り、２等分した（改めて試料ＩＩ（表３でＢＳ（＋）／ｒｅｓｃｕｅ（−）、図３でＢＳ（＋） Ｒｅｓ（−））、試料ＩＩＩ（表３でＢＳ（＋）／ｒｅｓｃｕｅ（＋）、図３でＢＳ（＋） Ｒｅｓ（＋））と命名）。
２０ｕＬの試料（試料ＩＩ、ＩＩＩ）をバイサルファイト処理に付した。試料にヌクレアーゼ不含水を加え、２５ｕＬに調整した。ＣＴコンバージョンバッファーを１２５μＬ加え、よく混合した。バイサルファイト処理を９８℃で１０分、６４℃で２時間、その後４℃で行った。処理済みＤＮＡをＭｅｔｈｙｌｃｏｄｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号ＭＥＣＯＶ−５０）を用い、バインディングバッファーに１μｌのｔＲＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）を加え遠心した。最後の溶出は５０℃でプレヒートした２５μＬのエリューションバッファーを使用した。量を測り取り、２等分した（改めて試料ＩＩ（表３でＢＳ（＋）／ｒｅｓｃｕｅ（−）、図３でＢＳ（＋） Ｒｅｓ（−））、試料ＩＩＩ（表３でＢＳ（＋）／ｒｅｓｃｕｅ（＋）、図３でＢＳ（＋） Ｒｅｓ（＋））と命名）。
５）レスキュー反応
レスキュー反応は４つの工程５−１）、５−２）、５−３）、５−４）を含んでいた。
レスキュー反応は４つの工程５−１）、５−２）、５−３）、５−４）を含んでいた。
５−１）ビーズへの固定化
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号１１２０５Ｄ）１０μＬをＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製品番号００３０ １０８．０５１）に入れ、ビーズを捕捉し、２ｘＢＷＴバッファー（1０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄後、１０μＬの２ｘＢＷＴバッファーに懸濁した。試料Ｖ（約１０μＬ）を加えて混合し、室温で１５分インキュベートした。ビーズを捕捉した後、１ｘＢＷＴバッファー（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄後、ＥＢＴバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で１回洗浄した。
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号１１２０５Ｄ）１０μＬをＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製品番号００３０ １０８．０５１）に入れ、ビーズを捕捉し、２ｘＢＷＴバッファー（1０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄後、１０μＬの２ｘＢＷＴバッファーに懸濁した。試料Ｖ（約１０μＬ）を加えて混合し、室温で１５分インキュベートした。ビーズを捕捉した後、１ｘＢＷＴバッファー（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄後、ＥＢＴバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で１回洗浄した。
５−２）ホスファターゼ反応
１ｘバッファー、ヌクレアーゼフリーの水を用いてホスファターゼミクスチャーを作成した。５−１）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、ホスファターゼミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブ移した。ＦａｓｔＡＰ Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号ＥＦ０６５４）１μＬを加え、３７℃で１０分反応させ、７５℃で５分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。
１ｘバッファー、ヌクレアーゼフリーの水を用いてホスファターゼミクスチャーを作成した。５−１）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、ホスファターゼミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブ移した。ＦａｓｔＡＰ Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号ＥＦ０６５４）１μＬを加え、３７℃で１０分反応させ、７５℃で５分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。
５−３）キナーゼ反応
１ｘバッファー、ヌクレアーゼフリーの水を用いてキナーゼミクスチャーを作成した。５−２）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、キナーゼミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブへ移した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＴａＫａＲａ製品番号２０２１Ａ）１μＬを加え、３７℃で３０分反応させ、７０℃で５分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。
１ｘバッファー、ヌクレアーゼフリーの水を用いてキナーゼミクスチャーを作成した。５−２）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、キナーゼミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブへ移した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＴａＫａＲａ製品番号２０２１Ａ）１μＬを加え、３７℃で３０分反応させ、７０℃で５分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。
５−４）１本鎖ＤＮＡリガーゼ反応
１ｘバッファー、１．３ｎＭ ユニバーサルアダプター、ヌクレアーゼフリーの水を用いて１本鎖ＤＮＡリガーゼミクスチャーを作成した。５−３）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、１本鎖ＤＮＡミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブへ移した。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ １本鎖ＤＮＡリガーゼ（ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ製品番号ＣＬ９０２５Ｋ）１μＬを加え、６０℃で２時間反応させ、８０℃で１０分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。最後はＭｅｔｈｙｌｃｏｄｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｋｉｔのエリューションバッファー１０μＬに懸濁した。この試料を以下の核酸増幅に付した。
１ｘバッファー、１．３ｎＭ ユニバーサルアダプター、ヌクレアーゼフリーの水を用いて１本鎖ＤＮＡリガーゼミクスチャーを作成した。５−３）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、１本鎖ＤＮＡミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブへ移した。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ １本鎖ＤＮＡリガーゼ（ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ製品番号ＣＬ９０２５Ｋ）１μＬを加え、６０℃で２時間反応させ、８０℃で１０分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。最後はＭｅｔｈｙｌｃｏｄｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｋｉｔのエリューションバッファー１０μＬに懸濁した。この試料を以下の核酸増幅に付した。
６）第１ラウンドＰＣＲエンリッチメント
レスキュー反応をしていない試料ＩおよびＩＩをＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズ１０μＬに固定化した。試料Ｉは、ヌクレアーゼフリーの水で１０μＬに調整してから混合した。
下記のようにＰＣＲミクスチャーを作成した。１ｘＰＣＲ Ｐｆｕ Ｃｘバッファー、１ユニットのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｃｘ ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ、各２００ｕＭ ｄＮＴＰミクスチャー、３００ｎＭ プライマー（Guoらの文献参照）、ヌクレアーゼ不含の水、およびビーズ付着試料。
その後ＰＣＲ反応を次のように行った。９５℃で２分→９５℃で２０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分のセットを２２サイクル→７２℃で５分→４℃。ＰＣＲ反応終了後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズを捕捉し、上清を回収し、１：１ ＡＭＰｕｒｅビーズ（Ｇｕｏらの上記文献参照）でＰＣＲ産物を２回精製した。
レスキュー反応をしていない試料ＩおよびＩＩをＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズ１０μＬに固定化した。試料Ｉは、ヌクレアーゼフリーの水で１０μＬに調整してから混合した。
下記のようにＰＣＲミクスチャーを作成した。１ｘＰＣＲ Ｐｆｕ Ｃｘバッファー、１ユニットのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｃｘ ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ、各２００ｕＭ ｄＮＴＰミクスチャー、３００ｎＭ プライマー（Guoらの文献参照）、ヌクレアーゼ不含の水、およびビーズ付着試料。
その後ＰＣＲ反応を次のように行った。９５℃で２分→９５℃で２０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分のセットを２２サイクル→７２℃で５分→４℃。ＰＣＲ反応終了後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズを捕捉し、上清を回収し、１：１ ＡＭＰｕｒｅビーズ（Ｇｕｏらの上記文献参照）でＰＣＲ産物を２回精製した。
７）第２ラウンドＰＣＲエンリッチメント
下記のようにＰＣＲミクスチャーを作成した。１ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ ｗｉｔｈ ＨＦ ｂｕｆｆｅｒ （Ｇｕｏらの文献参照）、５００ｎＭ プライマー（Guoらの文献参照）、および試料。
その後ＰＣＲ反応を次のように行った。９８℃で２分→９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分のセットを２２サイクル→７２℃で５分→４℃。ＰＣＲ反応終了後、１：１ ＡＭＰｕｒｅビーズでＰＣＲ産物を１回精製し、２５ｕＬのヌクレアーゼフリーの水で溶出し、回収した。
収率を確認するために、回収した試料１μＬ、Ｑｕｂｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ Ｑｕｂｉｔ（登録商標） ２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）１μＬ、Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００）１５μＬを２．０％ Ｅ−ｇｅｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号Ｇ５２１８０２）で泳動しチェックした。
下記のようにＰＣＲミクスチャーを作成した。１ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ ｗｉｔｈ ＨＦ ｂｕｆｆｅｒ （Ｇｕｏらの文献参照）、５００ｎＭ プライマー（Guoらの文献参照）、および試料。
その後ＰＣＲ反応を次のように行った。９８℃で２分→９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分のセットを２２サイクル→７２℃で５分→４℃。ＰＣＲ反応終了後、１：１ ＡＭＰｕｒｅビーズでＰＣＲ産物を１回精製し、２５ｕＬのヌクレアーゼフリーの水で溶出し、回収した。
収率を確認するために、回収した試料１μＬ、Ｑｕｂｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ Ｑｕｂｉｔ（登録商標） ２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）１μＬ、Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００）１５μＬを２．０％ Ｅ−ｇｅｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号Ｇ５２１８０２）で泳動しチェックした。
８）ゲル切り出し（２５０−７００ｂｐ）、精製後のサンプルをテンプレートとし、ヒト特異的遺伝子プライマーにより定量的ＰＣＲを行った。
使用したプライマー配列は下記の通りである。
5’-TAGCAATAATCCCCATCCTCCATATAT-3’（配列番号：６）
5’-ACTTGTCCAATGATGGTAAAAGG-3’（配列番号：７）
使用したプライマー配列は下記の通りである。
5’-TAGCAATAATCCCCATCCTCCATATAT-3’（配列番号：６）
5’-ACTTGTCCAATGATGGTAAAAGG-3’（配列番号：７）
２．実験結果
１）下記の表３、および図３はヒトｉＰＳ細胞株（２０１Ｂ７株）を使用し、得られた結果である。今回はヒト配列を特異的に増幅していることを確認するためヒトミトコンドリア遺伝子プライマーを用いて確認を行った（配列番号：３、配列番号：４）。
レスキュー有りではレスキュー無しサンプルと比較し４．１倍の収量増加が見られた。
１）下記の表３、および図３はヒトｉＰＳ細胞株（２０１Ｂ７株）を使用し、得られた結果である。今回はヒト配列を特異的に増幅していることを確認するためヒトミトコンドリア遺伝子プライマーを用いて確認を行った（配列番号：３、配列番号：４）。
レスキュー有りではレスキュー無しサンプルと比較し４．１倍の収量増加が見られた。
１．実験手順
試料として、ヒトＥＳ細胞株であるＷＡ０９細胞株を用いた。ＷＡ０９細胞株をフィーダー細胞上で培養後細胞を回収し、抗ＳＳＥＡ−４抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びＰＩ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した細胞懸濁液をＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用しシングルセルモードで抗ＳＳＥＡ−４抗体陽性、ＰＩ陰性の細胞を９６ウェルＰＣＲプレートに１細胞ずつソーティングした。実験手順は以下の７つの工程を含んでいた：１）ＭｓｐＩでの消化、２）エンドリペア／ｄＡテイリング反応、３）アダプターライゲーション、４）バイサルファイト処理、５）レスキュー反応、６）第１ラウンドＰＣＲエンリッチメント、および７）第２ラウンドＰＣＲエンリッチメント。今回の追加データでは８）ゲル切り出し、精製後のサンプルをシークエンス及び精製後のサンプルをテンプレートとし、ヒト特異的遺伝子プライマーにより定量的ＰＣＲを行った。
試料として、ヒトＥＳ細胞株であるＷＡ０９細胞株を用いた。ＷＡ０９細胞株をフィーダー細胞上で培養後細胞を回収し、抗ＳＳＥＡ−４抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びＰＩ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した細胞懸濁液をＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用しシングルセルモードで抗ＳＳＥＡ−４抗体陽性、ＰＩ陰性の細胞を９６ウェルＰＣＲプレートに１細胞ずつソーティングした。実験手順は以下の７つの工程を含んでいた：１）ＭｓｐＩでの消化、２）エンドリペア／ｄＡテイリング反応、３）アダプターライゲーション、４）バイサルファイト処理、５）レスキュー反応、６）第１ラウンドＰＣＲエンリッチメント、および７）第２ラウンドＰＣＲエンリッチメント。今回の追加データでは８）ゲル切り出し、精製後のサンプルをシークエンス及び精製後のサンプルをテンプレートとし、ヒト特異的遺伝子プライマーにより定量的ＰＣＲを行った。
１）ＭｓｐＩでの消化
ヒトゲノムＤＮＡ ３ｎｇを、９ユニットのＭｓｐＩ、１ｘＴａｎｇｏバッファー（Guo H et al, Nature Protocols, vol.10 (5), 645-659参照）、ヌクレアーゼフリーの水の混合物中で３７℃にて３時間反応させ、次いで、８０℃で２０分間酵素を失活させた。
ヒトゲノムＤＮＡ ３ｎｇを、９ユニットのＭｓｐＩ、１ｘＴａｎｇｏバッファー（Guo H et al, Nature Protocols, vol.10 (5), 645-659参照）、ヌクレアーゼフリーの水の混合物中で３７℃にて３時間反応させ、次いで、８０℃で２０分間酵素を失活させた。
２）エンドリペア／ｄＡ−テイリング
５ユニットのクレノウフラグメントｅｘｏ−（上記Guoらの文献参照）、１ｘＴａｎｇｏバッファー、４０μＭ ｄＡＴＰ、４μＭ ｄＣＴＰ、４μＭ ｄＧＴＰを加え、３７℃で４０分反応させ、７５℃で１５分間酵素失活させた。
５ユニットのクレノウフラグメントｅｘｏ−（上記Guoらの文献参照）、１ｘＴａｎｇｏバッファー、４０μＭ ｄＡＴＰ、４μＭ ｄＣＴＰ、４μＭ ｄＧＴＰを加え、３７℃で４０分反応させ、７５℃で１５分間酵素失活させた。
３）アダプターライゲーション
各ウェルに１２種類の片側ビオチン化バーコード入りアダプターをそれぞれ付加した。アダプターライゲーションにおいて、３０ＷｅｉｓｓユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、１ｘＴａｎｇｏバッファー、１ｍＭ ＡＴＰ、１２種類のアダプター、ヌクレアーゼフリーの水を加え、１６℃で３０分反応させ、引き続き４℃で一晩反応した後に、６５℃で２０分間酵素失活を行った。試料の正確な量を計測し、２５μＬになるようヌクレアーゼフリーの水で調整した。
各ウェルに１２種類の片側ビオチン化バーコード入りアダプターをそれぞれ付加した。アダプターライゲーションにおいて、３０ＷｅｉｓｓユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、１ｘＴａｎｇｏバッファー、１ｍＭ ＡＴＰ、１２種類のアダプター、ヌクレアーゼフリーの水を加え、１６℃で３０分反応させ、引き続き４℃で一晩反応した後に、６５℃で２０分間酵素失活を行った。試料の正確な量を計測し、２５μＬになるようヌクレアーゼフリーの水で調整した。
アダプターとして、以下の配列の両側ビオチン化バーコード入りＹ字アダプターを使用した。Ｙ字アダプターは５’末端がビオチン化されたユニバーサルアダプターと３’末端がビオチン化されたインデックスアダプターをアニーリングさせ作成した。
ユニバーサルアダプターの配列は下記の通りである。
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’ （配列番号：４）（５‘−ビオチン化、Ｃは５−メチル−ｄＣ、３’末端側ＣＴ間をホスホロチオネート化）
インデックスアダプターの配列は下記の１２通りである（５’−リン酸化、Ｃは５−メチル−ｄＣ、３’−ビオチン化）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：８）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGATGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：９）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTAGGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：１０）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGACCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：１１）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACAGTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：１２）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCCAATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：１３）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCAGATCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：１４）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACTTGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：１５）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGATCAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：１６）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTAGCTTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：１７）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGGCTACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：１８）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTTGTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：１９）
ユニバーサルアダプターの配列は下記の通りである。
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’ （配列番号：４）（５‘−ビオチン化、Ｃは５−メチル−ｄＣ、３’末端側ＣＴ間をホスホロチオネート化）
インデックスアダプターの配列は下記の１２通りである（５’−リン酸化、Ｃは５−メチル−ｄＣ、３’−ビオチン化）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：８）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGATGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：９）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTTAGGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：１０）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGACCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：１１）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACAGTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：１２）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGCCAATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：１３）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCAGATCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：１４）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACTTGAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：１５）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGATCAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：１６）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTAGCTTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：１７）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGGCTACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：１８）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCTTGTAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：１９）
４）バイサルファイト処理
１ウェルあたり２５μＬの試料をバイサルファイト処理に付した。ＣＴコンバージョンバッファーを１２５μＬ加え、よく混合した。バイサルファイト処理を９８℃で１０分、６４℃で２時間、その後４℃で行った。処理済みＤＮＡをＭｅｔｈｙｌｃｏｄｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号ＭＥＣＯＶ−５０）を用い、バインディングバッファーに１μｌのｔＲＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）を加え遠心した。最後の溶出は５０℃でプレヒートした２５μＬのエリューションバッファーを使用した。１２ウェル分を１本のチューブにまとめ量を測り取り、３００ｕＬにＴＥ Ｂｕｆｆｅｒで量を合わせたのちに２等分した（改めて試料Ｉ（表４でＢＳ（＋）／ｒｅｓｃｕｅ（−）、図４でＢＳ（＋） Ｒｅｓ（−））、試料ＩＩ（表４でＢＳ（＋）／ｒｅｓｃｕｅ（＋）、図４でＢＳ（＋） Ｒｅｓ（＋））と命名）。
１ウェルあたり２５μＬの試料をバイサルファイト処理に付した。ＣＴコンバージョンバッファーを１２５μＬ加え、よく混合した。バイサルファイト処理を９８℃で１０分、６４℃で２時間、その後４℃で行った。処理済みＤＮＡをＭｅｔｈｙｌｃｏｄｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号ＭＥＣＯＶ−５０）を用い、バインディングバッファーに１μｌのｔＲＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）を加え遠心した。最後の溶出は５０℃でプレヒートした２５μＬのエリューションバッファーを使用した。１２ウェル分を１本のチューブにまとめ量を測り取り、３００ｕＬにＴＥ Ｂｕｆｆｅｒで量を合わせたのちに２等分した（改めて試料Ｉ（表４でＢＳ（＋）／ｒｅｓｃｕｅ（−）、図４でＢＳ（＋） Ｒｅｓ（−））、試料ＩＩ（表４でＢＳ（＋）／ｒｅｓｃｕｅ（＋）、図４でＢＳ（＋） Ｒｅｓ（＋））と命名）。
５）レスキュー反応
レスキュー反応は４つの工程５−１）、５−２）、５−３）、５−４）を含んでいた。
レスキュー反応は４つの工程５−１）、５−２）、５−３）、５−４）を含んでいた。
５−１）ビーズへの固定化
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号１１２０５Ｄ）１０μＬをＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製品番号００３０ １０８．０５１）に入れ、ビーズを捕捉し、２ｘＢＷＴバッファー（1０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄後、１０μＬの２ｘＢＷＴバッファーに懸濁した。試料Ｖ（約１０μＬ）を加えて混合し、室温で１５分インキュベートした。ビーズを捕捉した後、１ｘＢＷＴバッファー（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄後、ＥＢＴバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で１回洗浄した。
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号１１２０５Ｄ）１０μＬをＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製品番号００３０ １０８．０５１）に入れ、ビーズを捕捉し、２ｘＢＷＴバッファー（1０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄後、１０μＬの２ｘＢＷＴバッファーに懸濁した。試料Ｖ（約１０μＬ）を加えて混合し、室温で１５分インキュベートした。ビーズを捕捉した後、１ｘＢＷＴバッファー（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄後、ＥＢＴバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で１回洗浄した。
５−２）ホスファターゼ反応
１ｘバッファー、ヌクレアーゼフリーの水を用いてホスファターゼミクスチャーを作成した。５−１）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、ホスファターゼミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブ移した。ＦａｓｔＡＰ Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号ＥＦ０６５４）１μＬを加え、３７℃で１０分反応させ、７５℃で５分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。
１ｘバッファー、ヌクレアーゼフリーの水を用いてホスファターゼミクスチャーを作成した。５−１）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、ホスファターゼミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブ移した。ＦａｓｔＡＰ Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号ＥＦ０６５４）１μＬを加え、３７℃で１０分反応させ、７５℃で５分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。
５−３）キナーゼ反応
１ｘバッファー、ヌクレアーゼフリーの水を用いてキナーゼミクスチャーを作成した。５−２）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、キナーゼミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブへ移した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＴａＫａＲａ製品番号２０２１Ａ）１μＬを加え、３７℃で３０分反応させ、７０℃で５分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。
１ｘバッファー、ヌクレアーゼフリーの水を用いてキナーゼミクスチャーを作成した。５−２）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、キナーゼミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブへ移した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＴａＫａＲａ製品番号２０２１Ａ）１μＬを加え、３７℃で３０分反応させ、７０℃で５分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。
５−４）１本鎖ＤＮＡリガーゼ反応
１ｘバッファー、１．３ｎＭ ユニバーサルアダプター、ヌクレアーゼフリーの水を用いて１本鎖ＤＮＡリガーゼミクスチャーを作成した。５−３）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、１本鎖ＤＮＡミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブへ移した。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ １本鎖ＤＮＡリガーゼ（ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ製品番号ＣＬ９０２５Ｋ）１μＬを加え、６０℃で２時間反応させ、８０℃で１０分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。最後はＭｅｔｈｙｌｃｏｄｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｋｉｔのエリューションバッファー１０μＬに懸濁した。この試料を以下の核酸増幅に付した。
１ｘバッファー、１．３ｎＭ ユニバーサルアダプター、ヌクレアーゼフリーの水を用いて１本鎖ＤＮＡリガーゼミクスチャーを作成した。５−３）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、１本鎖ＤＮＡミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブへ移した。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ １本鎖ＤＮＡリガーゼ（ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ製品番号ＣＬ９０２５Ｋ）１μＬを加え、６０℃で２時間反応させ、８０℃で１０分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。最後はＭｅｔｈｙｌｃｏｄｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｋｉｔのエリューションバッファー１０μＬに懸濁した。この試料を以下の核酸増幅に付した。
６）第１ラウンドＰＣＲエンリッチメント
レスキュー反応をしていない試料ＩをＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズ１０μＬに固定化した。試料Ｉは、ヌクレアーゼフリーの水で１０μＬに調整してから混合した。
下記のようにＰＣＲミクスチャーを作成した。１ｘＰＣＲ Ｐｆｕ Ｃｘバッファー、１ユニットのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｃｘ ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ、各２００ｕＭ ｄＮＴＰミクスチャー、３００ｎＭ プライマー（Ｇｕｏらの文献参照）、ヌクレアーゼ不含の水、およびビーズ付着試料。
その後ＰＣＲ反応を次のように行った。９５℃で２分→９５℃で２０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分のセットを２２サイクル→７２℃で５分→４℃。ＰＣＲ反応終了後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズを捕捉し、上清を回収し、１：１ ＡＭＰｕｒｅビーズ（Ｇｕｏらの上記文献参照）でＰＣＲ産物を２回精製した。
レスキュー反応をしていない試料ＩをＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズ１０μＬに固定化した。試料Ｉは、ヌクレアーゼフリーの水で１０μＬに調整してから混合した。
下記のようにＰＣＲミクスチャーを作成した。１ｘＰＣＲ Ｐｆｕ Ｃｘバッファー、１ユニットのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｃｘ ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ、各２００ｕＭ ｄＮＴＰミクスチャー、３００ｎＭ プライマー（Ｇｕｏらの文献参照）、ヌクレアーゼ不含の水、およびビーズ付着試料。
その後ＰＣＲ反応を次のように行った。９５℃で２分→９５℃で２０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分のセットを２２サイクル→７２℃で５分→４℃。ＰＣＲ反応終了後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズを捕捉し、上清を回収し、１：１ ＡＭＰｕｒｅビーズ（Ｇｕｏらの上記文献参照）でＰＣＲ産物を２回精製した。
７）第２ラウンドＰＣＲエンリッチメント
下記のようにＰＣＲミクスチャーを作成した。１ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ ｗｉｔｈ ＨＦ ｂｕｆｆｅｒ （Ｇｕｏらの文献参照）、５００ｎＭ プライマー（Ｇｕｏらの文献参照）、および試料。
その後ＰＣＲ反応を次のように行った。９８℃で２分→９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分のセットを２６サイクル→７２℃で５分→４℃。ＰＣＲ反応終了後、１：１ ＡＭＰｕｒｅビーズでＰＣＲ産物を１回精製し、２５ｕＬのヌクレアーゼフリーの水で溶出し、回収した。
収率を確認するために、回収した試料１μＬ、Ｑｕｂｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ Ｑｕｂｉｔ（登録商標） ２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）１μＬ、Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００）１５μＬを２．０％ Ｅ−ｇｅｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号Ｇ５２１８０２）で泳動しチェックした。
下記のようにＰＣＲミクスチャーを作成した。１ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ ｗｉｔｈ ＨＦ ｂｕｆｆｅｒ （Ｇｕｏらの文献参照）、５００ｎＭ プライマー（Ｇｕｏらの文献参照）、および試料。
その後ＰＣＲ反応を次のように行った。９８℃で２分→９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分のセットを２６サイクル→７２℃で５分→４℃。ＰＣＲ反応終了後、１：１ ＡＭＰｕｒｅビーズでＰＣＲ産物を１回精製し、２５ｕＬのヌクレアーゼフリーの水で溶出し、回収した。
収率を確認するために、回収した試料１μＬ、Ｑｕｂｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ Ｑｕｂｉｔ（登録商標） ２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）１μＬ、Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００）１５μＬを２．０％ Ｅ−ｇｅｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号Ｇ５２１８０２）で泳動しチェックした。
８）ゲル切り出し（２５０−７００ｂｐ）、精製後のサンプルをテンプレートとし、ヒト特異的遺伝子プライマーにより定量的ＰＣＲを行った。
使用したプライマー配列は下記の通りである。
5’-TAGCAATAATCCCCATCCTCCATATAT-3’（配列番号：６）
5’-ACTTGTCCAATGATGGTAAAAGG-3’（配列番号：７）
使用したプライマー配列は下記の通りである。
5’-TAGCAATAATCCCCATCCTCCATATAT-3’（配列番号：６）
5’-ACTTGTCCAATGATGGTAAAAGG-3’（配列番号：７）
２．実験結果
ヒトＥＳ細胞株１２シングルセルでの収量結果を図４および表４に示す。
レスキュー有りではレスキュー無しサンプルと比較し４．８倍の収量増加が見られた。
ヒトＥＳ細胞株１２シングルセルでの収量結果を図４および表４に示す。
レスキュー有りではレスキュー無しサンプルと比較し４．８倍の収量増加が見られた。
上記のごとく、にヒトＥＳ細胞株（ＷＡ０９株）１２シングルセルを使用し得られたサンプルについて、次世代シークエンサー（イルミナ社ＨｉＳｅｑ２５００）を使用し、取得した遺伝子配列を解析した。
１．実験手順
ＨｉＳｅｑ２５００には６ｐＭのインストール濃度でランを行った。
配列を取得後、下記の流れでデータ処理を行い、図示を行った（図５）。
Ｂｉｓｍａｒｋソフトウェアのｂｉｓｍａｒｋコマンドを用いてシークエンスデータをＥｎｓｅｍｂｌデータベースからダウンロードしたヒトの参照ゲノム配列（ＧＲＣｈ３８ ｒｅｌｅａｓｅ ８５，Ｎによるマスク済み）にマッピングした後（Ｇｕｏらの方法参照）、さらにｂｉｓｍａｒｋ＿ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ＿ｅｘｔｒａｃｔｏｒコマンドを用いて参照ゲノム配列上におけるＣｐＧサイトの位置情報を取得し、図示を行った。ｂｉｓｍａｒｋとｂｉｓｍａｒｋ＿ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ＿ｅｘｔｒａｃｔｏｒの実行時のコマンドとオプションは下記の通りである。Ｂｉｓｍａｒｋソフトウェアの実行にはＢｏｗｔｉｅ２ソフトウェアとＳＡＭｔｏｏｌｓソフトウェアがインストールされている必要がある。
１．実験手順
ＨｉＳｅｑ２５００には６ｐＭのインストール濃度でランを行った。
配列を取得後、下記の流れでデータ処理を行い、図示を行った（図５）。
Ｂｉｓｍａｒｋソフトウェアのｂｉｓｍａｒｋコマンドを用いてシークエンスデータをＥｎｓｅｍｂｌデータベースからダウンロードしたヒトの参照ゲノム配列（ＧＲＣｈ３８ ｒｅｌｅａｓｅ ８５，Ｎによるマスク済み）にマッピングした後（Ｇｕｏらの方法参照）、さらにｂｉｓｍａｒｋ＿ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ＿ｅｘｔｒａｃｔｏｒコマンドを用いて参照ゲノム配列上におけるＣｐＧサイトの位置情報を取得し、図示を行った。ｂｉｓｍａｒｋとｂｉｓｍａｒｋ＿ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ＿ｅｘｔｒａｃｔｏｒの実行時のコマンドとオプションは下記の通りである。Ｂｉｓｍａｒｋソフトウェアの実行にはＢｏｗｔｉｅ２ソフトウェアとＳＡＭｔｏｏｌｓソフトウェアがインストールされている必要がある。
$ bismark --path_to_bowtie <Bowtie2へのパス> --samtools_path <SAMtoolsへのパス> --quiet --non_directional -o <出力ディレクトリ> --temp_dir <一時出力ディレクトリ> <参照ゲノム配列のインデックス> <入力FASTQファイル>
$ bismark_methylation_extractor -s --bedGraph --counts --buffer_size 10G --samtools_path <SAMtoolsへのパス> -o <出力ディレクトリ> <入力BAMファイル>
$ bismark_methylation_extractor -s --bedGraph --counts --buffer_size 10G --samtools_path <SAMtoolsへのパス> -o <出力ディレクトリ> <入力BAMファイル>
ローレンツ曲線の描画とジニ係数計算のためのプログラムはＲ言語を用いて実装した（図６）。
２．実験結果
図５において、色の濃い部分（原図では赤色）は各染色体において取得できたＣｐＧサイトの部位を示している。
レスキューを行うことにより、取得できるＣｐＧサイトの数が約１．６倍に増加した（レスキュー無：１５，１８１ ＣｐＧｓ、レスキュー有：２４，４１３ ＣｐＧｓ）。また、レスキュー有のサンプルでは各染色体間でより偏りなく情報が得られることが確認された。ジニ係数が小さい値ほどデータの偏りがないことを示す（レスキュー無：０．２２、レスキュー有：０．１６）。
図５において、色の濃い部分（原図では赤色）は各染色体において取得できたＣｐＧサイトの部位を示している。
レスキューを行うことにより、取得できるＣｐＧサイトの数が約１．６倍に増加した（レスキュー無：１５，１８１ ＣｐＧｓ、レスキュー有：２４，４１３ ＣｐＧｓ）。また、レスキュー有のサンプルでは各染色体間でより偏りなく情報が得られることが確認された。ジニ係数が小さい値ほどデータの偏りがないことを示す（レスキュー無：０．２２、レスキュー有：０．１６）。
１．実験手順
試料として、Ｐｒｏｍｅｇａ製品番号 Ｇ３０４１−１のヒトゲノムＤＮＡ ６００ ｐｇを用いた。実験手順は以下の７つの工程を含んでいた：１）ＭｓｐＩでの消化、２）エンドリペア／ｄＡテイリング反応、３）アダプターライゲーション、４）バイサルファイト処理、５）レスキュー反応、６）第１ラウンドＰＣＲエンリッチメント、および７）第２ラウンドＰＣＲエンリッチメント。８）ゲル切り出し、精製後のサンプルをシークエンス及び精製後のサンプルをテンプレートとし、ヒト特異的遺伝子プライマーにより定量的ＰＣＲを行った。
試料として、Ｐｒｏｍｅｇａ製品番号 Ｇ３０４１−１のヒトゲノムＤＮＡ ６００ ｐｇを用いた。実験手順は以下の７つの工程を含んでいた：１）ＭｓｐＩでの消化、２）エンドリペア／ｄＡテイリング反応、３）アダプターライゲーション、４）バイサルファイト処理、５）レスキュー反応、６）第１ラウンドＰＣＲエンリッチメント、および７）第２ラウンドＰＣＲエンリッチメント。８）ゲル切り出し、精製後のサンプルをシークエンス及び精製後のサンプルをテンプレートとし、ヒト特異的遺伝子プライマーにより定量的ＰＣＲを行った。
１）ＭｓｐＩでの消化
ヒトゲノムＤＮＡ ３ｎｇを、９ユニットのＭｓｐＩ、１ｘＴａｎｇｏバッファー（Guo H et al, Nature Protocols, vol.10 (5), 645-659参照）、ヌクレアーゼフリーの水の混合物中で３７℃にて３時間反応させ、次いで、８０℃で２０分間酵素を失活させた。
ヒトゲノムＤＮＡ ３ｎｇを、９ユニットのＭｓｐＩ、１ｘＴａｎｇｏバッファー（Guo H et al, Nature Protocols, vol.10 (5), 645-659参照）、ヌクレアーゼフリーの水の混合物中で３７℃にて３時間反応させ、次いで、８０℃で２０分間酵素を失活させた。
２）エンドリペア／ｄＡ−テイリング
５ユニットのクレノウフラグメントｅｘｏ−（上記Guoらの文献参照）、１ｘＴａｎｇｏバッファー、４０μＭ ｄＡＴＰ、４μＭ ｄＣＴＰ、４μＭ ｄＧＴＰを加え、３７℃で４０分反応させ、７５℃で１５分間酵素失活させた。
５ユニットのクレノウフラグメントｅｘｏ−（上記Guoらの文献参照）、１ｘＴａｎｇｏバッファー、４０μＭ ｄＡＴＰ、４μＭ ｄＣＴＰ、４μＭ ｄＧＴＰを加え、３７℃で４０分反応させ、７５℃で１５分間酵素失活させた。
３）アダプターライゲーション
アダプターライゲーションにおいて、３０ＷｅｉｓｓユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（上記Guoらの文献参照）、１ｘＴａｎｇｏバッファー、１ｍＭ ＡＴＰ、アダプター、ヌクレアーゼフリーの水を加え、１６℃で３０分反応させ、引き続き４℃で一晩反応した後に、６５℃で２０分間酵素失活を行った。試料の正確な量を計測し、２４μＬになるようヌクレアーゼフリーの水で調整後、６μＬ（試料Ｉ（図７でＢＳ（−）と表記））、１８μＬ（試料ＩＩ（図７でＢＳ（＋）Ｒｅｓ （−）と表記）、試料ＩＩＩ （図７でＢＳ（＋）Ｒｅｓ（＋）と表記）、試料ＩＶ（図７でＢＳ（＋）Ｒｅｓ（ＡＴＰ）と表記））に分注し、試料Ｉは−８０℃で保存した。
アダプターライゲーションにおいて、３０ＷｅｉｓｓユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（上記Guoらの文献参照）、１ｘＴａｎｇｏバッファー、１ｍＭ ＡＴＰ、アダプター、ヌクレアーゼフリーの水を加え、１６℃で３０分反応させ、引き続き４℃で一晩反応した後に、６５℃で２０分間酵素失活を行った。試料の正確な量を計測し、２４μＬになるようヌクレアーゼフリーの水で調整後、６μＬ（試料Ｉ（図７でＢＳ（−）と表記））、１８μＬ（試料ＩＩ（図７でＢＳ（＋）Ｒｅｓ （−）と表記）、試料ＩＩＩ （図７でＢＳ（＋）Ｒｅｓ（＋）と表記）、試料ＩＶ（図７でＢＳ（＋）Ｒｅｓ（ＡＴＰ）と表記））に分注し、試料Ｉは−８０℃で保存した。
アダプターとして、以下の配列の両側ビオチン化バーコード入りＹ字アダプターを使用した。Ｙ字アダプターは５’末端がビオチン化されたユニバーサルアダプターと３’末端がビオチン化されたインデックスアダプターをアニーリングさせ作成した。
ユニバーサルアダプターの配列は下記の通りである。
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’ （配列番号：４）（５‘−ビオチン化、Ｃは５−メチル−ｄＣ、３’末端側ＣＴ間をホスホロチオエート化）
インデックスアダプターの配列は下記の通りである（５’−リン酸化、Ｃは５−メチル−ｄＣ、３’−ビオチン化）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：５）
ユニバーサルアダプターの配列は下記の通りである。
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’ （配列番号：４）（５‘−ビオチン化、Ｃは５−メチル−ｄＣ、３’末端側ＣＴ間をホスホロチオエート化）
インデックスアダプターの配列は下記の通りである（５’−リン酸化、Ｃは５−メチル−ｄＣ、３’−ビオチン化）
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’（配列番号：５）
１８μＬの試料（試料ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ）をバイサルファイト処理に付した。試料にヌクレアーゼ不含水を加え、２５μＬに調整した。ＣＴコンバージョンバッファーを１２５μＬ加え、よく混合した。バイサルファイト処理を９８℃で１０分、６４℃で２時間、その後４℃で行った。処理済みＤＮＡをＭｅｔｈｙｌｃｏｄｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号ＭＥＣＯＶ−５０）を用い、バインディングバッファーに１μｌのｔＲＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）を加え遠心した。最後の溶出は５０℃でプレヒートした２５μＬのエリューションバッファーを使用した。量を測り取り、３等分した（改めて試料ＩＩ（図７でＢＳ（＋）Ｒｅｓ （−））、試料ＩＩＩ（図７でＢＳ（＋）Ｒｅｓ（＋））、試料ＩＶ（図７でＢＳ（＋） Ｒｅｓ（ＡＴＰ））と命名）。
５）レスキュー反応
レスキュー反応は４つの工程５−１）、５−２）、５−３）、５−４）を含んでいた。
レスキュー反応は４つの工程５−１）、５−２）、５−３）、５−４）を含んでいた。
５−１）ビーズへの固定化
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号１１２０５Ｄ）１０μＬをＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製品番号００３０ １０８．０５１）に入れ、ビーズを捕捉し、２ｘＢＷＴバッファー（1０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄後、１０μＬの２ｘＢＷＴバッファーに懸濁した。試料Ｖ（約１０μＬ）を加えて混合し、室温で１５分インキュベートした。ビーズを捕捉した後、１ｘＢＷＴバッファー（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄後、ＥＢＴバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で１回洗浄した。
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号１１２０５Ｄ）１０μＬをＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製品番号００３０ １０８．０５１）に入れ、ビーズを捕捉し、２ｘＢＷＴバッファー（1０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄後、１０μＬの２ｘＢＷＴバッファーに懸濁した。試料Ｖ（約１０μＬ）を加えて混合し、室温で１５分インキュベートした。ビーズを捕捉した後、１ｘＢＷＴバッファー（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄後、ＥＢＴバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で１回洗浄した。
５−２）ホスファターゼ反応
１ｘバッファー、ヌクレアーゼフリーの水を用いてホスファターゼミクスチャーを作成した。５−１）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、ホスファターゼミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブ移した。ＦａｓｔＡＰ Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号ＥＦ０６５４）１μＬを加え、３７℃で１０分反応させ、７５℃で５分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。
１ｘバッファー、ヌクレアーゼフリーの水を用いてホスファターゼミクスチャーを作成した。５−１）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、ホスファターゼミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブ移した。ＦａｓｔＡＰ Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号ＥＦ０６５４）１μＬを加え、３７℃で１０分反応させ、７５℃で５分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。
５−３）キナーゼ反応
１ｘバッファー、ヌクレアーゼフリーの水を用いてキナーゼミクスチャーを作成した。キナーゼミクスチャーには終濃度１ｍＭのＡＴＰを添加した。５−２）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、キナーゼミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブへ移した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＴａＫａＲａ製品番号２０２１Ａ）１μＬを加え、３７℃で３０分反応させ、７０℃で５分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。
１ｘバッファー、ヌクレアーゼフリーの水を用いてキナーゼミクスチャーを作成した。キナーゼミクスチャーには終濃度１ｍＭのＡＴＰを添加した。５−２）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、キナーゼミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブへ移した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＴａＫａＲａ製品番号２０２１Ａ）１μＬを加え、３７℃で３０分反応させ、７０℃で５分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。
５−４）１本鎖ＤＮＡリガーゼ反応
１ｘバッファー、１．３ｎＭ ユニバーサルアダプター、ヌクレアーゼフリーの水を用いて１本鎖ＤＮＡリガーゼミクスチャーを作成した。５−３）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、１本鎖ＤＮＡミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブへ移した。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ １本鎖ＤＮＡリガーゼ（ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ製品番号ＣＬ９０２５Ｋ）１μＬを加え、６０℃で２時間反応させ、８０℃で１０分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。最後はＭｅｔｈｙｌｃｏｄｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｋｉｔのエリューションバッファー１０μＬに懸濁した。この試料を以下の核酸増幅に付した。
１ｘバッファー、１．３ｎＭ ユニバーサルアダプター、ヌクレアーゼフリーの水を用いて１本鎖ＤＮＡリガーゼミクスチャーを作成した。５−３）のビーズを捕捉し、上清を取り除いた後、１本鎖ＤＮＡミクスチャーに懸濁し、ＰＣＲチューブへ移した。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ １本鎖ＤＮＡリガーゼ（ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ製品番号ＣＬ９０２５Ｋ）１μＬを加え、６０℃で２時間反応させ、８０℃で１０分間酵素失活させた。反応後、ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、ビーズを捕捉し、ＥＢＴバッファーで２回洗浄した。最後はＭｅｔｈｙｌｃｏｄｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｋｉｔのエリューションバッファー１０μＬに懸濁した。この試料を以下の核酸増幅に付した。
６）第１ラウンドＰＣＲエンリッチメント
レスキュー反応をしていない試料ＩおよびＩＩをＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズ１０μＬに固定化した。試料Ｉは、ヌクレアーゼフリーの水で１０μＬに調整してから混合した。
下記のようにＰＣＲミクスチャーを作成した。１ｘＰＣＲ Ｐｆｕ Ｃｘバッファー、１ユニットのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｃｘ ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ、各２００ｕＭ ｄＮＴＰミクスチャー、３００ｎＭ プライマー（Guoらの文献参照）、ヌクレアーゼ不含の水、およびビーズ付着試料。
その後ＰＣＲ反応を次のように行った。９５℃で２分→９５℃で２０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分のセットを２２サイクル→７２℃で５分→４℃。ＰＣＲ反応終了後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズを捕捉し、上清を回収し、１：１ ＡＭＰｕｒｅビーズ（Guoらの上記文献参照）でＰＣＲ産物を２回精製した。
レスキュー反応をしていない試料ＩおよびＩＩをＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズ１０μＬに固定化した。試料Ｉは、ヌクレアーゼフリーの水で１０μＬに調整してから混合した。
下記のようにＰＣＲミクスチャーを作成した。１ｘＰＣＲ Ｐｆｕ Ｃｘバッファー、１ユニットのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｃｘ ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ、各２００ｕＭ ｄＮＴＰミクスチャー、３００ｎＭ プライマー（Guoらの文献参照）、ヌクレアーゼ不含の水、およびビーズ付着試料。
その後ＰＣＲ反応を次のように行った。９５℃で２分→９５℃で２０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分のセットを２２サイクル→７２℃で５分→４℃。ＰＣＲ反応終了後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２８０ ストレプトアビジンビーズを捕捉し、上清を回収し、１：１ ＡＭＰｕｒｅビーズ（Guoらの上記文献参照）でＰＣＲ産物を２回精製した。
７）第２ラウンドＰＣＲエンリッチメント
下記のようにＰＣＲミクスチャーを作成した。１ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ ｗｉｔｈ ＨＦ ｂｕｆｆｅｒ （Ｇｕｏらの文献参照）、５００ｎＭ プライマー（Ｇｕｏらの文献参照）、および試料。
その後ＰＣＲ反応を次のように行った。９８℃で２分→９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分のセットを２２サイクル→７２℃で５分→４℃。ＰＣＲ反応終了後、１：１ ＡＭＰｕｒｅビーズでＰＣＲ産物を１回精製し、２５ｕＬのヌクレアーゼフリーの水で溶出し、回収した。
収率を確認するために、回収した試料１μＬ、Ｑｕｂｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ Ｑｕｂｉｔ（登録商標） ２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）１μＬ、Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００）１５μＬを２．０％ Ｅ−ｇｅｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号Ｇ５２１８０２）で泳動しチェックした。
下記のようにＰＣＲミクスチャーを作成した。１ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ ｗｉｔｈ ＨＦ ｂｕｆｆｅｒ （Ｇｕｏらの文献参照）、５００ｎＭ プライマー（Ｇｕｏらの文献参照）、および試料。
その後ＰＣＲ反応を次のように行った。９８℃で２分→９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分のセットを２２サイクル→７２℃で５分→４℃。ＰＣＲ反応終了後、１：１ ＡＭＰｕｒｅビーズでＰＣＲ産物を１回精製し、２５ｕＬのヌクレアーゼフリーの水で溶出し、回収した。
収率を確認するために、回収した試料１μＬ、Ｑｕｂｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ Ｑｕｂｉｔ（登録商標） ２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）１μＬ、Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００）１５μＬを２．０％ Ｅ−ｇｅｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製品番号Ｇ５２１８０２）で泳動しチェックした。
８）ゲル切り出し（２５０−７００ｂｐ）、精製後のサンプルをテンプレートとし、ヒト特異的遺伝子プライマー（Ａｌｕ３プライマー配列）により定量的ＰＣＲを行った。
使用したプライマー配列は下記の通りである。
5’-TGGAAGACCAGTAGGATGATTG-3’ （配列番号：２０）
5’-GTCTTACCATGTATCTCTGTGC-3’ （配列番号：２１）
使用したプライマー配列は下記の通りである。
5’-TGGAAGACCAGTAGGATGATTG-3’ （配列番号：２０）
5’-GTCTTACCATGTATCTCTGTGC-3’ （配列番号：２１）
２．実験結果
図７からわかるように、ＡＴＰ存在下でキナーゼ反応を行うことにより、ＤＮＡ収量がさらに約２．５倍に増加した。
図７からわかるように、ＡＴＰ存在下でキナーゼ反応を行うことにより、ＤＮＡ収量がさらに約２．５倍に増加した。
本発明のレスキュー方法を用いることにより、バイサルファイト処理後のＰＣＲ増幅可能なＤＮＡ試料の収量を増加させることができる。したがって、シングルセル由来の試料など微量試料のＤＮＡメチル化解析が確実かつ容易となる。
本発明によれば、シングルセル由来のＤＮＡなどの微量なＤＮＡ試料のメチル化解析が可能となる。したがって、本発明は医学、薬学、生物学、遺伝学、農学等の分野において利用価値が高い。
配列番号：１は、実施例で用いたアダプターの塩基配列である。５’末端はビオチン化され、シトシンは５−メチル−ｄＣである。
配列番号：２は、実施例で用いたアダプターの塩基配列である。３’末端はビオチン化され、シトシンは５−メチル−ｄＣである。
配列番号：３は、実施例で用いたＰＣＲ増幅用プライマーの塩基配列である。
配列番号：４は、実施例で用いたユニバーサルアダプターの塩基配列である。５’末端はビオチン化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端側ＣＴ間はホスホロチオエート化されている。
配列番号：５は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：６は、実施例で用いた定量的ＰＣＲ用プライマーの塩基配列である。
配列番号：７は、実施例で用いた定量的ＰＣＲ用プライマーの塩基配列である。
配列番号：８は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：９は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：１０は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：１１は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：１２は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：１３は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：１４は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：１５は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：１６は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：１７は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：１８は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：１９は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：２０は、実施例で用いた定量的ＰＣＲ用プライマーの塩基配列である。
配列番号：２１は、実施例で用いた定量的ＰＣＲ用プライマーの塩基配列である。
配列番号：２は、実施例で用いたアダプターの塩基配列である。３’末端はビオチン化され、シトシンは５−メチル−ｄＣである。
配列番号：３は、実施例で用いたＰＣＲ増幅用プライマーの塩基配列である。
配列番号：４は、実施例で用いたユニバーサルアダプターの塩基配列である。５’末端はビオチン化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端側ＣＴ間はホスホロチオエート化されている。
配列番号：５は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：６は、実施例で用いた定量的ＰＣＲ用プライマーの塩基配列である。
配列番号：７は、実施例で用いた定量的ＰＣＲ用プライマーの塩基配列である。
配列番号：８は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：９は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：１０は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：１１は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：１２は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：１３は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：１４は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：１５は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：１６は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：１７は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：１８は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：１９は、実施例で用いたインデックスアダプターの塩基配列である。５’末端はリン酸化され、シトシンは５−メチル−ｄＣであり、３’末端はビオチン化されている。
配列番号：２０は、実施例で用いた定量的ＰＣＲ用プライマーの塩基配列である。
配列番号：２１は、実施例で用いた定量的ＰＣＲ用プライマーの塩基配列である。
Claims (5)
- バイサルファイト処理を用いるＤＮＡメチル化解析のための方法であって、バイサルファイト処理後のＤＮＡ試料を１本鎖ＤＮＡリガーゼで処理することにより、バイサルファイト処理後のＰＣＲ増幅可能なＤＮＡ試料の収量を増加させることを特徴とする方法であって、
該１本鎖ＤＮＡリガーゼがCircLigaseTM ssDNA LigaseまたはCircLigaseTM II ssDNA Ligaseであり、
該１本鎖ＤＮＡリガーゼでの処理の前に、バイサルファイト処理後のＤＮＡ試料を下記工程：
（ａ）ＤＮＡ５’−，３’−ホスファターゼまたはＤＮＡ３’−ホスファターゼでの処理、および
（ｂ）ＤＮＡ５’−キナーゼでの処理
に付すことを含む、
方法。 - バイサルファイト処理を用いるＤＮＡメチル化解析がＲＲＢＳ（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）法によるものである請求項１記載の方法。
- バイサルファイト処理後のＤＮＡ試料が担体に固定化されている、請求項１または２記載の方法。
- 工程（ｂ）がＡＴＰの存在下において行われる、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
- 請求項１〜４のいずれか１項記載の方法を実施するためのキットであって、１本鎖ＤＮＡリガーゼを含み、さらにＤＮＡ５’−，３’−ホスファターゼまたはＤＮＡ３’−ホスファターゼ、およびＤＮＡ５’−キナーゼを含むキットであって、該１本鎖ＤＮＡリガーゼがCircLigaseTM ssDNA LigaseまたはCircLigaseTM II ssDNA Ligaseである、キット。
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