CN102732505A - 一种多步连环选择的血清核酸适配子体外筛选方法 - Google Patents

Abstract

一种多步连环选择的血清核酸适配子体外筛选方法，属生物医学检测分析技术领域，其特征是通过以混合血清为筛选靶标消除个体差异，先以正常血清反筛去除文库中能与非特异性血清成分结合的核酸序列，再以混合血清正筛继而克隆测序分离核酸适配子，通过对核酸适配子的结构模拟分析、特异性分析、亲和力分析和应用价值分析，优选出应用价值大的核酸适配子。本发明克服了血清中大量非特异性成分的干扰，可以直接以血清为靶标高通量筛选出血清中疾病特异性成分的核酸适配子，既高效又经济，可为建立基于核酸适配子的分析技术并系统性探索疾病的发生发展规律和获取临床诊疗相关的生物信息奠定基础，具有良好的应用价值。

Description

一种多步连环选择的血清核酸适配子体外筛选方法

技术领域

本项发明属生物医学检测分析技术领域，具体涉及一种将多步连环选择应用于核酸适配子筛选和鉴定过程中的高效率血清核酸适配子体外筛选新技术。

背景技术

核酸适配子是一种生物分子的人工单链核酸配体，通过SELEX（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）技术从随机单链寡核苷酸文库中筛选获得。

核酸适配子筛选所用文库为人工构建，其中的单链寡核苷酸片段的两端为固定序列，中间为随机序列。固定序列为PCR引物提供结合部位，便于SELEX筛选过程中进行PCR扩增，制备下一轮筛选的文库。随机序列使文库中核酸序列的多样性极为丰富，当随机区长度为25个核苷酸，文库中核酸多样性理论上能达到10¹⁵（4²⁵=1.126¹⁵）。单链寡核苷酸的一个独特表现是容易形成各种形状的二级结构和三级结构，如发夹、口袋、假结、凸环、G-四聚体（G-quartet）等，它们通过分子构象上的“锁钥”关系与靶分子适配，加上氢键、范德华力的作用，与靶分子形成稳定的复合物。多样性达10¹⁵的巨大库容所拥有的丰富的寡核苷酸分子构象，可为自然界几乎所有种类的分子找到匹配的核酸适配子。

核酸适配子的功能与抗体类似，但与抗体相比具有许多优点：①高特异性和高亲和性：能够分辨出靶分子结构上细微的差别，亲和力甚至强于天然配体；②靶标广泛：从有机小分子、生物大分子到病毒颗粒、完整细胞等均可作为筛选靶标；③稳定性好：可长期保存，通过人工合成制备而无批间差异，可在常温下运输；④改建和修饰容易：可在核酸适配子的特定部位进行精确的标记、修饰或核苷酸替换；⑤应用优势：无免疫原性，可在体内反复使用；分子小，方便于体内影像诊断和治疗。目前核酸适配子的筛选与应用研究已涉及医学的各个领域，包括基础研究、临床诊断、疾病治疗和药物研发等。

SELEX技术是一种组合化学新技术，它利用化学合成的大容量单链随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，从中筛选出能与靶分子特异结合的寡核苷酸，并借助PCR扩增技术，使之指数富集，最终获得高亲和力、高特异性的核酸适配子。SELEX技术自1990年问世以来受到了广泛关注，从技术本身到研究应用领域都得到了迅速发展。除了经典的SELEX筛选外，在结合其它方法的基础上衍生出多种SELEX筛选方法，例如以荧光磁珠为介质衍生的荧光磁珠SELEX技术，以毛细管电泳为分离手段的毛细管电泳SELEX技术。此外，为适应某些特殊需求产生了切换SELEX、表达盒SELEX、基因组SELEX、消减SELEX、仿进化SELEX等。

用于SELEX筛选的靶标远比抗体制备的靶标丰富，包括无机分子、生物小分子、生物大分子、病原微生物、真核细胞等。目前，通过SELEX技术已筛选出各种不同类型靶分子的核酸适配子，包括与基因调控有关的核酸结合蛋白（如噬菌体T4 DNA 聚合酶、HIV-1 Rev蛋白、核糖体蛋白S1），非核酸结合蛋白（如凝血酶、各种细胞因子、辅因子、缓激肽、IgE抗体），小分子有机物（如ATP、茶碱、氨基酸、维生素），甚至金属离子、多糖、有机染料，以及完整的细胞、病毒、孢子等。

然而，尽管核酸适配子的筛选技术不断发展，筛选用的靶标也不断多样化，但以血清为靶标筛选核酸适配子至今尚未见报道。其原因可能是血清成分过于复杂，其中正常组分（如白蛋白）占绝大部分，而与疾病相关的特异性物质（如肿瘤标志物）丰度很低，因此以血清为靶标进行核酸适配子筛选理论上难以获得理想的筛选效果，筛选出的核酸适配子也难以鉴定，故是一个鲜有人探索的难题。然而，血清中含有已知和未知的各种疾病标志物，蕴藏着极为丰富的疾病发生、发展、诊断、治疗、预后相关的信息。由于取材容易、对患者的创伤小，血清也是目前最为常用且十分理想的临床标本。因此，建立可行、实用的以血清为靶标的核酸适配子筛选技术，有效筛选疾病标志物相关的特异性核酸适配子，建立基于核酸适配子的血清标本检测和分析技术，对于探索疾病的发生、发展规律和获取疾病的临床诊疗相关信息，都具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的：创建一种血清核酸适配子体外筛选技术，不受血清个体差异和非特异性组分的影响，能高效率、高通量筛选出疾病特异的血清核酸适配子群，为建立基于核酸适配子的血清特性系统性分析技术奠定基础。

本发明采用的技术方案：通过以混合血清为筛选靶标，消除个体差异；通过先以阴性混合血清进行反筛去除文库中与非特异性血清成分结合的核酸序列并留下和富集不与非特异性血清成分结合的核酸序列，再以阳性混合血清正筛更有效地获取特异性血清成分的核酸适配子；通过核酸适配子文库PCR产物直接克隆测序分离单个核酸适配子；通过结构分析选择代表性核酸适配子做后续鉴定，减少无意义工作；通过与阳性和阴性混合血清结合情况的对比分析选出高特异性的代表性适子；通过测定与阳性混合血清结合反应的解离常数选出高亲和力的高特异性代表性核酸适配子；通过与阳性和阴性单个临床血清标本结合情况的测定选出具有应用价值的特异性强、亲和力大的核酸适配子。最终建立起将多步连环选择贯穿于筛选和鉴定全过程的高效率血清核酸适配子体外筛选新技术。

本发明的方法包括以下步骤。

a. 制备混合血清作为筛选靶标：收集一组患有被研究疾病的患者的血清标本，等量混合制备成阳性混合血清；同时收集一组不患有被研究疾病的受试者的血清标本，等量混合制备成阴性混合血清。将混合血清用作核酸适配子筛选的靶标。

b. 核酸文库及引物的设计与合成：设计单链随机寡核苷酸文库和引物序列，人工合成。使用前用结合缓冲液分别配制成文库和引物溶液。

c. 用阴性混合血清进行反向筛选：将步骤a制备的阴性混合血清与步骤b制备的文库（原始文库）孵育，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并切胶回收游离核酸，以游离核酸为模板进行PCR扩增并回收和纯化单链寡核苷酸，重复若干轮上述孵育-回收-制备，当凝胶电泳显示结合核酸条带明显减弱、游离核酸条带明显增强时，停止筛选，定量后作为下一轮筛选的亚文库；重复若干轮上述孵育-回收-制备，当凝胶电泳显示结合核酸条带明显减弱、游离核酸条带明显增强时，停止筛选。

d. 用阳性混合血清正向筛选：将步骤a制备的阳性混合血清与步骤c最后一轮反向筛选后制备的亚文库（二级文库）孵育，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并切胶回收结合核酸，以结合核酸为模板进行PCR扩增，回收和纯化单链寡核苷酸，定量后作为下一轮筛选的亚文库；重复若干轮上述孵育-回收-制备，并逐轮增加核酸与血清的量比，当凝胶电泳显示结合核酸条带明显、游离核酸条带明显减弱趋于消失时，停止筛选。

e. 克隆测序分离单个核酸适配子：以步骤d最后一轮正向筛选后制备的亚文库（核酸适配子文库）为模板进行PCR扩增，对扩增产物直接进行克隆分离和核酸测序；将测序结果与所设计文库的序列进行比对，将两端固定序列区与文库相同、中间随机序列区长度与文库相同的核酸序列确定为核酸适配子。

f. 单个核酸适配子的结构分析：对步骤e确定的核酸适配子的核苷酸序列进行二级结构的计算机模拟分析，按序列同源性进行聚类分析和家族划分，对同一家族核酸适配子通过同源性比对找出主要基序。根据二级结构模拟分析及同源性分析结果选出代表性核酸适配子。

g. 核酸适配子的特异性分析：将步骤f选出的代表性核酸适配子分别与阴性混合血清和阳性混合血清孵育，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及核酸染色，观察游离核酸适配子带的强弱，采集图像并用凝胶分析软件测定游离核酸适配子带的灰度值，计算阴性混合血清与阳性混合血清的游离核酸适配子带的灰度比值，选出特异性强的核酸适配子（灰度比值越大，核酸适配子的特异性越强）。

h. 核酸适配子的亲和力分析：将步骤g选出的特异性强的代表性核酸适配子配成梯度浓度，与阳性混合血清孵育后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和核酸染色，采集图像并测定各梯度点结合核酸适配子带的灰度值，计算解离常数Kd，选出亲和力大的核酸适配子（Kd值越小，亲和力越大）。

i. 核酸适配子应用价值分析：将步骤h选出的特异性强、亲和力大的核酸适配子分别与单个阳性血清标本和阴性血清标本孵育，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和核酸染色，测定各标本的游离核酸适配子带的灰度值，计算各标本与核酸适配子对照（以结合缓冲液代替血清标本进行实验）的灰度比值，统计分析两类标本之间的灰度比值差异以及核酸适配子对阳性和阴性标本的判别能力。选出应用价值大的核酸适配子（鉴别两类标本的能力越强，核酸适配子的应用价值越大）供后续研究应用。

其中上述步骤中所述的血清标本为抽取患者空腹状态下的外周静脉血标本，凝固后常规离心分离血清，-80℃保存备用。取20例左右患有所研究疾病的患者的血清等量混合制成阳性混合血清。取20例左右不患有所研究疾病的患者或正常人的血清等量混合制成阴性混合血清。

其中上述步骤中所述的单链随机寡核苷酸文库是指用于SELEX筛选的人工设计并化学合成的文库。文库中的寡核苷酸为单链，两端为固定序列（为PCR扩增时提供引物结合部位），中间为随机序列（使单链寡核苷酸链能形成各种不同的分子构象）。上游引物与文库的5’端固定序列相同，下游引物与文库的3’端固定序列互补。结合缓冲液的成分为20 mM Hepes-Na，120mM NaCl，5mM KCl，1mM CaCl₂，1 mM MgCl₂。

其中上述步骤中所述的聚丙烯酰胺凝胶及核酸染色具体如下：血清与文库（或核酸适配子）孵育后观察核酸与血清的结合情况、目的条带的灰度测定和切胶回收使用含10%甘油的10%~12%中性聚丙烯酰胺凝胶；不对称PCR扩增产物切胶回收使用含7M尿素的8%变性聚丙烯酰胺凝胶；核酸染色采用硝酸银染色（观察时）或核酸荧光染料GelRed染色（观察或切胶回收时）。

其中上述步骤中所述的从凝胶中回收核酸采用冷冻压榨法，或采用电洗脱法；纯化核酸采用酚-氯仿抽提后使用市售核酸沉淀剂共沉淀法。

其中上述步骤中所述的核酸PCR扩增具体如下：亚文库制备使用不对称PCR扩增后尿素变性胶回收单链寡核酸，或使用对称PCR扩增后变性双链产物再选择回收单链寡核苷酸；亚文库的核酸定量采用荧光定量PCR法；核酸适配子克隆测序所用的核酸采用常规对称PCR扩增。

其中上述步骤中所述的核酸适配子二级结构摸拟分析采用RNA structure 4.6软件或具有类似功能的软件完成，核酸适配子同源性的家族聚类分析、各家族的主要基序寻找采用Clustal X软件或具有类似功能的软件完成。

其中上述步骤中所述的灰度测定是凝胶电泳和核酸染色完成后，借助紫外透射仪及其紫外滤光配件用数码相机拍摄图像，或通过电泳凝胶分析系统采集图像，再通过电泳凝胶分析软件测定目的条带的灰度值。

其中上述步骤中所述的核酸适配子与阳性混合血清结合的解离常数（Kd）分析使用Graphpad prism 5软件或具有类似功能的软件完成。

其中上述步骤中所述的核酸适配子对照是以结合缓冲液代替血清进行实验，每块凝胶设一个核酸适配子对照。各标本的游离核酸适配子带的灰度值分别除以同一块凝胶的核酸适配子对照的灰度值，即得到各标本的游离核酸适配子带的灰度比值。

其中上述步骤中所述的核酸适配子对阳性标本和阴性标本的鉴别能力采用受试者工作特征（ROC）曲线进行分析，观察曲线下面积（AUC），并确定最佳界值后计算鉴别的敏感度、特异度和准确度。

本发明的有益效果：本发明方法有效解决了以血清为靶标的核酸适配子筛选技术问题，能高效率筛选出疾病特异性的血清核酸适配子。

目前筛选单一靶分子（如纯化的某种蛋白质）或单一靶标（如均一的某种细胞）的核酸适配子目前并不存在技术问题，而血清是成分十分复杂的液态系统，其中含有大量非特异性成分，而与疾病相关的特异性生物标志物含量很低，要以血清为靶标筛选出这些低丰度的疾病特异性标志物的核酸适配子，必须解决血清中大量非特异性组分对筛选的干扰这个技术难题。本发明方法通过新颖的技术思路和设计方案，从筛选、鉴定直到应用价值验证，多步骤连环选择，形成一个严谨而高效的筛选系统，最终达到克服血清大量非特异性成分的干扰而有效筛选出特异性的核酸适配子的目的。

血清中含有各种已知和未知的疾病相关的生物标志物，是探讨疾病的发生、发展、诊断、治疗和/或预后的重要靶分子。本发明方法直接以血清为靶标进行筛选，高通量筛选出各种标志物的核酸适配子，为建立基于核酸适配子的血清分析技术进而系统性探索疾病的发生发展规律和获取临床诊疗相关信息奠定了良好的基础。

本发明方法可用于各种疾病血清中特异性成分（标志物）的核酸适配子筛选，特别是肿瘤新的生物标志物的研究和应用，实用价值大，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明方法的技术流程图。

图2为切胶回收的核酸不对称PCR扩增后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色的结果。泳道1~4为扩增产物进行12%中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可见扩增产物中的单链DNA（红色smear）和双链DNA（深色条带）混在一起。泳道M为20bp DNA marker。

图3为与图2对应的扩增产物进行含7M尿素的8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色的结果。可见单链DNA（红色条带）和双链DNA（深色条带）已很好地分开，便于切胶回收；泳道M为20bp DNA marker。

图4~图6为克隆分离出的阳性血清核酸适配子之一。其中：图4为该核酸适配子的核酸预序图，图5为该核酸适配子的核酸序列，图6为该核酸适配子的二级结构模拟图。

图7~图9为克隆分离出的核酸适配子进行序列同源性分析后几个不同家族的保守序列。其中，图7为第一家族中以T/GGGT为保守序列的核酸适配子；图8为第二家族中以GT-TGT为保守序列的核酸适配子；图9为第三家族中以T(C/T)GG为保守序列的核酸适配子。

图10、图11为核酸适配子与阳性混合血清结合的特异性分析结果。其中，图10为将梯度浓度的核酸适配子分别与阳性和阴性混合血清孵育，然后进行12%中性聚丙烯酰胺凝胶电泳和GelRed染色，第1、3、5、7、9泳道对应的核酸适配子量为2、3、4、5、6pmol，与之孵育的血清均为2μl阳性混合血清，第2、4、6、8、10泳道对应的核酸适配子量为2、3、4、5、6pmol，与之孵育的血清均为2μl阴性混合血清；图11为图10中相同核酸适配子量点的阴性与阳性混合血清的游离核酸适配子带的灰度比值。

图12、图13为核酸适配子与阳性混合血清结合的亲和力测定结果。其中，图12为将梯度核酸适配子量与阳性混合血清孵育后进行中性聚丙烯酰胺凝胶电泳及GelRed染色，泳道1~8分别对应1、2、3、4、5、6、7、8pmol的核酸适配子量（浓度0.083~0.667μM），阳性混合血清2μl；图13为测定各泳道结合带的灰度值并计算其构成比，Graphpad prism 5软件作图计算核酸适配子与阳性混合血清结合的解离常数（Kd）。

图14、图15为核酸适配子与临床血清标本结合程度分析。核酸适配子与血清孵育后进行12%中性聚丙烯酰胺凝胶电泳及GelRed染色。其中，图14中泳道1~8为不同肝癌血清标本，AP为核酸适配子对照；图15中泳道1~7为不同正常血清标本，AP为核酸适配子对照。从图14、15中可见核酸适配子与肝癌血清标本的结合带明显强于正常血清标本，而游离带则明显弱于正常血清标本。

具体实施方式

以下通过肝癌血清核酸适配子筛选的具体实施例，对本发明的方法作进一步说明。

1．靶血清收集与处理。

收集20例手术及病理确诊的原发性肝癌患者术前外周血非抗凝标本，每例2ml左右，性别、年龄不限。同时收集20例正常体检人员的外周血非抗凝标本，性别、年龄不限，B超肝脏未见异常，乙肝表面抗原、HCV抗体、AFP均为阴性，肝肾功能正常。血标本常规离心，分离血清，分装后置-80^oC冰箱保存备用。使用前将所收集的20例肝癌血清各取50μl混匀，瞬间离心，制备成肝癌混合血清，50μl/管分装，-20℃冰箱保存备用。以同样的方法制备并保存正常混合血清。

2．文库与引物的设计与合成。

自行设计文库，两端固定序列19nt，中间随机序列为40nt，具体序列如下：5′-ACC GAC CGT GCT GGA CTC T (N40) AGT ATG AGC GAG CGT TGC G-3′。上游引物与文库的5′端固定序列相同，下游引物与文库的3′端固定序列互补，具体序列如下：5′-ACC GAC CGT GCT GGA CTC T-3′, 5′-CGC AAC GCT CGC TCA TAC T-3′。文库与引物均由上海Sangon公司合成，合成量为2 OD。

3．以正常混合血清为靶标的反向筛选。

将正常混合血清与合成的随机单链寡核苷酸文库孵育，切胶回收不与血清结合的游离核酸，不对称PCR扩增制备亚文库，用于下一轮筛选。具体步骤如下。

（1）文库与正常混合血清孵育。

1)     将200μl结合缓冲液加入2OD合成文库，震荡混匀，瞬间离心。

2)     将文库溶液置99℃变性5min，冰浴5min。

3)     加入600μl正常混合血清，90μl甘油。

4)     37℃水浴60min，期间不时摇动。

（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳。

1)     配制含10%甘油的12%中性聚丙烯酰胺凝胶溶液。

2)     装配垂直电泳胶模，灌胶，室温下放置60min以上，凝固后备用。

3)     将胶板装配于垂直电泳槽中，加入预冷0.5íTBE，预电泳10min。

4)     将上述文库与正常血清孵育后的反应液上样电泳，200V，40min。

（3）GelRed凝胶染色。

1)     取46ml ddH₂O于平皿中。

2)     加入1.25M氯化钠溶液4ml，再加入GelRed染料15μl，混匀。

3)     电泳结束后取下凝胶片，放入染液中染色20min。

4)     紫外灯下观看结果，拍照存档。

（4）切胶回收游离单链寡核苷酸（ssDNA）。

1)     用手术刀片切下游离ssDNA条带（40bp~100bp）。

2)     将胶条移至5ml规格的一次性注射器内，捣碎凝胶条并加压由注射器针头挤出，1.5ml EP管收集。

3)     加1×TE缓冲液（ pH8.0）400μl，置于-20℃ 30min后，立即48℃水浴30min。

4)     重复上一步骤2次。

5)     将上清移至新的EP管中。

6)     12000r/min 4℃离心5min，将上清转移到另一离心管。

（5）酚/氯仿抽提纯化ssDNA。

1)     在上一步骤得到的上清液中加入等体积Tris饱和酚，充分混匀后，12000 r/min 4℃离心10min。

2)     小心吸取上层液体至新的EP管。

3)     加入等体积氯仿，振荡，充分混匀后，12000 r/min 4℃离心10min。

4)     小心吸取上层液体至新的EP管。

（6）核酸共沉淀剂沉淀ssDNA。

1)     在上一步骤得到的溶液中加入1/10体积3M NaAc溶液，混匀。

2)     加入DNAmate溶液，混匀（当溶液体积小于400μl时，DNAmate用量均为4μl，大于400μl时，按每100μl增加1μl的比例增加DNAmate用量）。

3)     加入2.5倍体积-20℃预冷的无水乙醇，充分混匀。

4)     12000 r/min 4℃离心15min。

5)     弃上清，沉淀用-20℃预冷的70%乙醇清洗一次，室温下干燥。

6)     用60μl TE Buffer溶解沉淀，作为不对称PCR扩增的模板。

（7）不对称PCR扩增回收的ssDNA。

1)     设25管平行管，反应体系50μl，包括如下成分：

2íPCRMIX       25μl

上游引物         1.5μl(0.75μM)

下游引物         1.5μl(0.0375μM)

ssDNA模板       2μl

ddH₂O            20μl。

2)     PCR扩增条件：94℃3min，94℃45s，68℃90s，20个循环，最后72℃延伸7min。

（6）不对称PCR产物银染色鉴定。

1)     配制12%中性聚丙烯酰胺凝胶溶液。

2)     装配垂直电泳凝胶模板，灌胶，室温下放置60min以上，凝固后备用。

3)     将胶板装配于电泳槽中，加入1íTBE缓冲液。

4)     将5μl PCR产物与1μl 上样缓冲液混匀上样。

5)     200V电泳，当溴酚蓝泳动至凝胶底端即停止电泳。

6)     小心取下凝胶片，标记好左右，置于100ml 银染固定液中，10~15min。

7)     ddH₂O冲洗2次，10s/次。

8)     加入0.2%硝酸银溶液100ml，染色10min。

9)     ddH₂O冲洗3次，10s/次。

10) 加100ml DNA银染显色液，直至出现清晰的DNA条带。

11) 判读结果，当在dsDNA条带上下见到smear，即为ssDNA。

12) 扫描图像，保存于电脑。

（7）尿素变性胶电泳回收ssDNA。

1)     配制含7M尿素的8%聚丙烯酰胺凝胶溶液。

2)     装配垂直电泳胶模板，灌胶，室温下放置60min以上待凝固。

3)     将胶板装配于电泳槽中，加入1íTBE缓冲液。

4)     将5μl PCR产物与1μl上样缓冲液混匀，上样，200V电泳40min。

5)     小心取下凝胶片，GelRed核酸染料染色10~30min。

6)     紫外灯下观察，ssDNA条带泳动速度慢于dsDNA。

7)     用手术刀片切下ssDNA条带，挤压、反复冻融法回收ssDNA（步骤同前）。

8)     酚-氯仿纯化ssDNA（步骤同前）。

9)     核酸共沉淀剂沉淀ssDNA（步骤同前）。

（8）实时荧光定量PCR定量回收纯化的ssDNA 。

将回收的ssDNA溶液作为模板，进行荧光定量PCR扩增。

1)     反应体系20μl，包括如下成分：

2íEvagreen PCR MIX   10μl

上游引物              1μl(10 μM)

下游引物              1μl(10 μM)

ssDNA模板            2μl

ddH₂O                 6μl。

2)     PCR扩增条件：94℃3min；94℃45s，68℃90s，20个循环；最后72℃ 7min。

3)     同时以倍比稀释的原始文库溶液（含单链寡核苷酸10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹个拷贝）为模板进行荧光定量PCR扩增制备标准曲线。

4)     将ssDNA拷贝数浓度换算成摩尔浓度，计算回收的ssDNA总量，作为亚文库，用于下一轮筛选。

经3轮筛选后在电泳凝胶上见结合带明显减弱，游离带明显增强，反筛结束。

4．以肝癌混合血清进行正向筛选。

将肝癌混合血清与上述3轮消减SELEX后的亚文库进行孵育，切胶回收与血清结合的核酸，不对称PCR扩增，切胶回收纯化后用作下一轮筛选的文库。具体步骤如下。

（1）肝癌混合血清与上述亚文库孵育：将亚文库液99℃热变性5min，冰浴5min，按预定比例加入肝癌混合血清（核酸/血清比从2pmol∶1μl开始，两者比例随筛选轮次增加而逐步增加），37℃孵育30~60min（孵育时间随筛选轮次增加而逐步缩短），期间不时摇动。

（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳：步骤同前述正常混合血清反向筛选。

（3）GelRed凝胶染色：步骤同前述正常混合血清反向筛选。

（4）切胶回收结合ssDNA：切取核酸与血清的结合条带，步骤同前述正常混合血清反向筛选。

（5）酚-氯仿抽提纯化ssDNA：步骤同前述正常混合血清反向筛选。

（6）核酸共沉淀剂沉淀ssDNA：步骤同前述正常混合血清反向筛选。

（7）不对称PCR扩增回收的ssDNA：步骤同前述正常混合血清反向筛选。

（8）不对称PCR扩增产物银染色鉴定：步骤同前述正常混合血清反向筛选。

（9）7M尿素变性胶电泳回收ssDNA条带：步骤同前述正常混合血清反向筛选。

（10）回收纯化ssDNA实时荧光定量PCR定量：步骤同前述正常混合血清反向筛选。

以肝癌混合血清进行正向SELEX筛选过程中，随着筛选轮次的增加，文库与肝癌混合血清的结合不断增多，表明能与肝癌血清结合的核酸不断被富集，至第9轮时，文库与血清的结合已非常明显，故而终止筛选。

5．克隆法分离单个核酸适配子

以第9轮筛选后制备的亚文库为模板进行PCR扩增，获得dsDNA，送上海Sangon公司克隆分离单个核酸适配子，并测定核酸序列。

（1）亚文库的对称PCR扩增。

1)   设平行管10管，反应体系50μl，包括如下成分：

2íPCRMIX          25μl

上游引物            1.5μl(0.75μM)

下游引物            1.5μl(0.75μM)

核酸适配子文库模板  2μl

ddH₂O              20μl。

2)   PCR扩增条件：94℃3min，94℃45s，68℃90s，8个循环，最后72℃延伸7min。

（2）12%中性胶鉴定PCR产物。

1)   配制12%中性聚丙烯酰胺凝胶溶液。

2)   装配垂直电泳胶模板，灌胶，室温下放置60min以上待凝固。

3)   将胶板装配于泳槽中，加入1íTBE缓冲液。

4)   将5μl的PCR产物与1μl上样缓冲液混匀，上样，200V电泳，当溴酚蓝泳至凝胶底端时结束电泳。

5)   取下胶片GelRed染色，紫外灯下观察结果。

（3）克隆测序。

将PCR产物送上海Sangon公司，回收目的片段，克隆测序。

前后共分离出200多条核酸序列，经与文库序列比对，去除序列重复者，成功分离到182个肝癌血清核酸适配子。

6．核酸适配子的二级结构模拟分析。

（1）将核酸适配子的测序图谱用Chromas软件打开，导出意义序列到文本文件并保存。

（2）打开RNA structure 4.6软件，点击file，在下拉菜单中点击“new sequence”，出现一个分析新序列的对话框，将（1）中保存的序列粘贴到对话框中的sequence栏中。

（3）点击“Fold as DNA”，出现“the sequence has been edited. Save changes?”，点击“Yes”。

（4）将文件保存到文件夹中，出现对话框，点击“Start”，出现对话框，点击“draw structures”，出现软件模拟的核酸适配子的二级结构和折叠所需最低能量。

（5）将核酸适配子二级结构复制、保存。

二级结构分析显示所分离出的核酸适配子有丰富的二级结构，包括发夹、假结、凸环、口袋、棒形和球拍形等多种构象，二级结果折叠所需的最低能量从-19.6到-7.3不等。

7．核酸适配子的同源性分析。

（1）将所有核酸适配子序列整理成FASTA格式保存为txt文档。

（2）打开Clustal X软件，点击“file”，在下拉菜单中点击“load sequences”，选取（1）中保存的文档，此时文档中多条序列会导入到主界面上。

（3）打开Clustal X软件，点击“tree”，在下拉菜单中点击“draw tree”，系统会自动构建进化树。

（4）根据进化树亲缘关系将核酸适配子划分家族。

（5）将同一家族的核酸适配子整理成FASTA格式，按照（2）方法导入软件中，点击“Alignment”，在下拉菜单中点击“Do complete alignment”。

（5）序列会根据软件提供的参数进行全序列比对，比对结果会出现在主界面上，保守序列用*标记，同时软件会自动保存与txt相同文件名的比对结果到txt所在的文件夹中。

经同源性分析，全部核酸适配子可聚类成3个大家族。第一家族中以GGT为主流基序，同时还有TGA和GATG等基序，第二个家族主要是C(G/A)GT、GCAGT等，第3家族只有一个基序T(C/T)GG。从不同家族中选出15个代表性核酸适配子进行后续分析。

8．核酸适配子与肝癌血清结合的特异性分析。

采用中性聚丙烯酰胺凝胶电泳及灰度测定方法分析15个代表性核酸适配子与肝癌血清结合的特异性。具体步骤如下。

（1）配制12%中性聚丙烯酰胺凝胶溶液，装配垂直电泳胶模，灌胶，室温下放置60min以上待凝固，使用前200V预电泳10min。

（2）按下表配制核酸适配子的梯度混合液、变性及与血清孵育。

 

（3）上样，200V电泳40min。

（4）电泳结束后取下凝胶片，GelRed染色15min。

（5）紫外灯下观察，拍照保存结果。

（6）Quantity One软件分析游离核酸适配子带灰度值，计算正常混合血清与肝癌混合血清的灰度比值，评价核酸适配子与肝癌混合血清结合的特异性。

结果发现15个代表性核酸适配子各梯度点的正常混合血清的游离带灰度值均大于肝癌血清，两者各梯度点的平均灰度比值为2.32±0.41（1.95~3.38）；各核酸适配子的5个梯度点中最大比值点的平均灰度比值为3.57±1.15（2.3~6.61），证实这些核酸适配子与肝癌混合血清均存在特异性结合。

9．核酸适配子与肝癌混合血清结合的亲和力分析。

对特异性较好的10代表性核酸适配子进一步分析其与肝癌混合血清结合的亲和力。配胶、试样处理、电泳、染色、图像采集同上述特异性分析，Quantity One软件分析结合带灰度值，用Graphpad prism 5软件作图计算核酸适配子与肝癌混合血清结合的Kd值。

结果显示10个代表性核酸适配子的亲和力281.5±225.9（43.6~638.8）nM，表明核酸适配子与肝癌混合血清结合有较高的亲和力。

10．核酸适配子的应用价值分析。

采用中性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析其中2个代表性核酸适配子与17例肝癌血清标本和17例正常人血清结合的特异性。具体步骤如下。

（1）配制12%聚丙烯酰胺凝胶溶液，装配垂直电泳胶模，灌胶，室温下放置60min以上，凝固后装配到垂直电泳槽中，灌注0.5′TBE电泳液，充分冲洗加样孔，200V预电泳10min备用。

（2）配制核酸适配子混合液。

1)     将适量的核酸适配子（特异性分析中比值最大的量）加入到EP管中。

2)     加入终浓度为10%甘油。

3)     加入结合缓冲液至总体积13μl。

4)     震荡混匀，瞬间离心。

5)     99℃加热变性5min，立即置冰浴5min。

（3）加入肝癌或正常血清标本2μl，混匀，点动离心。核酸适配子对照管以2μl结合缓冲液代替血清标本。

（4）置37℃水浴中孵育30min。

（5）取出上述反应物，点动离心，全部吸取上样，200V电泳40min。

（6）取下凝胶片，GelRed染液中染色15min。

（7）紫外灯下观察，拍照保存结果。

（8）测定各泳道游离核酸适配子带的灰度值，并计算各标本与核酸适配子对照的灰度比值。

结果显示，所分析的2个代表性核酸适配子均能与肝癌血清标本特异性结合。核酸适配子1的肝癌组和正常对照组的平均灰度比值分别为0.58±0.08和0.77±0.08（P＝0.000）。核酸适配子2的肝癌组和正常对照组的平均灰度比值分别为0.59±0.17和0.84±0.09（P＝0.000）。

两个核酸适配子对肝癌血清标本和正常对照血清标本均有良好的鉴别能力。核酸适配子1的AUC为0.969，以灰度比值0.69为界，诊断肝癌的敏感度为94.1%，特异度为94.1%，准确度为94.1%。核酸适配子2的AUC为0.945，以灰度比值0.73为界，诊断肝癌的敏感度为94.1%，特异度为88.2%，准确度为91.2%。

Claims (2)

1.一种多步连环选择的血清核酸适配子体外筛选方法，其特征是包括以下步骤：

a. 收集一组患有被研究疾病的患者的血清标本，等量混合制备成阳性混合血清；同时收集一组不患有被研究疾病的受试者的血清标本，等量混合制备成阴性混合血清；

b. 设计单链随机寡核苷酸文库和引物序列，人工合成，用结合缓冲液分别配制成文库和引物溶液；

c. 将阴性混合血清与步骤b制备的文库溶液孵育，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并切胶回收游离核酸，以游离核酸为模板进行PCR扩增并回收和纯化单链寡核苷酸，定量后作为下一轮筛选的亚文库；重复若干轮上述孵育-回收-制备，当凝胶电泳显示结合核酸条带明显减弱、游离核酸条带明显增强时，停止筛选；

d. 将阳性混合血清与步骤c最后一轮筛选后制备的亚文库孵育，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并切胶回收结合核酸，以结合核酸为模板进行PCR扩增，回收和纯化单链寡核苷酸，定量后作为下一轮筛选的亚文库；重复若干轮上述孵育-回收-制备，并逐轮增加核酸与血清的量比，当凝胶电泳显示结合核酸条带明显、游离核酸条带明显减弱趋于消失时，停止筛选；

e. 以步骤d最后一轮筛选后制备的亚文库为模板进行PCR扩增，对扩增产物直接进行克隆分离和核酸测序；将测序结果与所设计文库的序列进行比对，将两端固定序列区与文库相同、中间随机序列区长度与文库相同的核酸序列确定为核酸适配子；

f. 对步骤e确定的核酸适配子的核苷酸序列进行二级结构的计算机模拟分析，按序列同源性进行聚类分析和家族划分，对同一家族核酸适配子通过同源性比对找出主要基序，选出代表性核酸适配子；

g. 将步骤f选出的代表性核酸适配子分别与阴性混合血清和阳性混合血清孵育，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及核酸染色，观察游离核酸适配子带的强弱，采集图像并用凝胶分析软件测定游离核酸适配子带的灰度值，计算阴性混合血清与阳性混合血清的游离核酸适配子带的灰度比值，选出特异性强的核酸适配子；

h. 将步骤g选出的特异性强的代表性核酸适配子配成梯度浓度，与阳性混合血清孵育后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和核酸染色，采集图像并测定各梯度点结合核酸适配子带的灰度值，计算解离常数Kd，选出亲和力高的核酸适配子；

i. 将步骤h选出的核酸适配子分别与单个阳性血清标本和阴性血清标本孵育，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和核酸染色，测定各标本的游离核酸适配子带的灰度值，计算各标本与核酸适配子对照的灰度比值，统计分析两类标本之间的灰度比值差异以及核酸适配子对阳性和阴性标本的判别能力，选出应用价值大的核酸适配子。

2.利用权利要求1项中所述的任一步骤建立的血清核酸适配子筛选技术。

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