CN102081093A - 一种丙型肝炎病毒及其表面抗原的试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丙型肝炎病毒及其表面抗原的试剂盒及检测方法。包括抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗体，酶标孔板，生物素标记单链DNA适配子ZE18，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素及其显色底物。将抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗体包被酶标孔板，加入丙型肝炎病毒或待检血清或血液样品以及对照样品，经洗涤六次，结合在板上的丙型肝炎病毒或包膜抗原E2再用生物素标记的适配子ZE18捕获，加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，加入底物显色，显色终止后，在酶标仪的吸收波长上测其OD值。本试剂盒检测速度快，操作方便安全，省时效率高，有效地对丙型肝炎病毒进行检测。试剂盒价格低廉，检测灵敏度和精确度很高，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于感染性疾病检测技术领域。具体涉及到一种丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的试剂盒，同时还涉及一种丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2试剂盒的检测方法，它适用于丙型肝炎病毒及其丙型肝炎病毒抗原的检测。
背景技术
丙型肝炎是一种主要经血液传播的疾病，丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC)，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。丙型肝炎呈全球性流行，是欧美及日本等国家终末期肝病的最主要原因。据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3％，估计约1.7亿人感染了HCV，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例。丙型肝炎目前尚无有效疫苗，也没有有效的治愈方法。因此，控制丙型肝炎只能从传染源和传播途径入手，早期准确诊断和发现HCV感染者就是防控丙型肝炎传染源、阻断传播途径最为有效的手段。所以，世界各国都不遗余力的研究丙型肝炎的诊断新技术。
自从1989年建立了丙肝病毒抗-HCV检测方法以来，丙型肝炎的检测技术就处于不断发展中。到目前为止，丙型肝炎检测技术主要有抗-HCV检测、HCV-RNA核酸扩增检测、和HCV核心抗原的检测。目前用于临床HCV感染检测的主要指标仅为抗HCV和HCV-RNA，但两者在丙肝诊断中均存在一定的局限性，如对于免疫功能不正常、或“窗口期”的HCV感染者，则不能检出抗-HCV，有一定的漏检率；HCV RNA其操作复杂，而且仪器特殊、检测费用昂贵，在一般实验室不易开展。作为HCV感染的检测手段，HCV表面抗原检测丙型肝炎病毒的感染具有十分重要的意义。
发明内容
发明的目的是在于提供了一种丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的试剂盒，该试剂可以检测丙型肝炎病毒的感染，检测速度快，操作方便安全，省时效率高，而且价格低廉，检测灵敏度和精确度都很高，应用前景广阔。
发明的另一个目的是在于提供了一种丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的试剂盒检测丙型肝炎病毒的方法，该试剂盒优于HCV抗体检测法，本方法可以检测窗口期，即病毒感染的早期或潜伏期，有利于早期对病人的防治；另外在成本和操作上也优于HCV-RNA核酸扩增检测法，比HCV-RNA核酸扩增检测法成本低，操作更简便，检测灵敏度和精确度高。本发明试剂盒对丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2检测的方法是利用一种能特异性结丙型肝炎病毒表面包膜抗原E2的单链DNA适配子作为探针，采用丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2多克隆抗体包被孔板，生物素标记的该DNA适配子作为探针，类似夹心ELISA法，用于检测血清或体液中丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：
一种丙型肝炎病毒及其丙型肝炎病毒包膜抗原E2的试剂盒，它包括：抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗体，酶标板(购自海门市三和新华玻璃实验仪器厂)，生物素标记核酸适配子ZE18，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(购自北京博奥生物技术有限公司)及其显色底物3’，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)(购自深圳达科为生物技术有限公司)。
所述的抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗体(或抗血清)的制备：将丙型肝炎病毒包膜抗原E2的真核表达载体pcDNA3.1A-E2(来源于Vaccine，2007，25：1544-1551)，肌肉多点注射入家兔，每隔一周后注射一次，每次免疫注射100～200微克质粒DNA，注射三次，用基因电导入仪(购自宁波新芝生物科技有限公司)在注射部位电极导入DNA，第三次注射后2周，再用丙型肝炎病毒包膜抗原E2重组蛋自(来源于Vaccine，2007，25：1544-1551)加强免疫，免疫注射2次，每次免疫注射100微克蛋白，两周后心脏取血，1000rpm离心分离血清，即为丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗体(或抗血清)。保存于-80℃。
所述的核酸适配子ZE18为本发明者通过SELEX筛选技术，通过筛选到的能特异性结合丙型肝炎病毒包膜抗原E2的单链DNA适配子，命名为ZE18(具体步骤见：发明专利申请号：200810197315.4，发明人：章晓联，陈芳)。
所述的生物素标记核酸适配子ZE18：将ZE18序列送公司合成，公司合成生物素标记ZE18的5’端(命名为：bio-ZE18)。并用无菌双蒸水稀释为400nM的浓度，-20℃保存。新型生物素标记的DNA适配子具有SEQIDNO.1，所示的核苷酸序列；
一种丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的试剂盒检测丙型肝炎病毒的方法，
检测步骤是：
1、将1∶200兔抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清(效价为1∶12800，PBS稀释)包被酶标板(如96孔)，4度过夜。
2、含有5/10000吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBS溶液：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，加去离子水溶解，定容至1000ml，调pH至7.4，15磅灭菌20min，置4℃保存)，洗涤六遍。
3、1％(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)(PBS溶解)封闭96孔板，100μl/孔，37度封闭1小时。
4、加入待检样品、包括HCV病毒(来源于Cell Mol Immunol.2009，6(4)：235-44)、HCV病毒阳性血清、或对照样品，100μl/孔，37度孵育1小时。
5、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍。
6、加入bio-ZE18(400nM/孔，PBS稀释)，37度孵育1小时。
7、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍。
8、加入加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-streptoavidin)(1∶1000，PBS稀释)，100μl/孔，37度孵育1小时。
9、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍。
10、加入底物显色剂(TMB)(TMB干粉10mg，溶于5ml无水乙醇中(2mg/ml)。pH5.0显色液10ml中，加入2mg/ml TMB 0.5ml，再加入2μl 30％H2O2，临用前配制)显色2min，用2M浓硫酸中止显色。本发明中所用的底物显色剂配方包括：A底物是：TMB 20mg(固体)，先用无水乙醇10ml溶解，充分振荡(试剂瓶要干净，干燥)，加双蒸水定容到100ml，此即是A底物；B底物是：取1水柠檬酸2.1g，无水Na2HPO4 2.82g，0.75％的过氧化氢0.64ml，双蒸水定容至100ml(无须调pH值，应在4.5-5.0范围)，此即是B底物。使用时，A底物与B底物各取5ml混匀。
11、1小时内在Themo scientific Multskan mk3多功能酶标仪450nM下检测吸光度。检测结果是丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒E2抗原或HCV感染阳性病人及其丙型肝炎病毒E2抗原阳性病人的OD450值均大于设定的临界值(cutoff值)，而阴性样品或正常健康人的OD450值均小于临界值(cutoff值)，cutoff值＝0.1×阳性对照的平均OD450值+阴性对照的平均OD450值。说明本试剂盒的检测结果能有效的鉴别出丙型肝炎病毒、或HCV感染感染患者与正常健康人或非丙型肝炎病毒感染感染患者的不同。
本发明的优点是：核酸适配子体外容易合成，且能特异性与丙型肝炎病毒包膜抗原结合，而不与其他病毒等病原体结合，同时对于丙型肝炎病人阳性的血清，都能表现出高于临界值(cutoff值)的OD值，而对于阴性的，OD值都在临界值(cutoff值)以下，说明核酸适配子检测有较高的灵敏性。因此，对于核酸适配子在丙型肝炎病人的早期诊断方面，在临床上有很大的应用前景。
附图说明
图1本试剂盒检测HCV、HCVE2抗原特异性的鉴定
丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2、以及与HCV阳性病人血清的结合OD值明显高于对健康正常人血清的OD值，有显著差别，*p＜0.05，有很高的特异性。
图2本发明试剂盒检测HCV、以及不同病人特异性的鉴定
本发明试剂盒分别检测丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2、以及乙或丙肝阳性病人血清、结核(TB)阳性病人血清等，检测结果是：丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2、以及与丙肝(HCV)阳性病人血清的结合OD值明显高于对其他病人血清的OD值，有显著差别，*p＜0.05。说明本法能有效的鉴别出丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2、以及丙肝(HCV)阳性病人与其他病人间的不同。图中HBV patients：代表HBV阳性病人血清；TB patients：代表结核TB阳性病人血清；HCV patients：代表HCV阳性病人血清；Healthy donors：代表健康正常人血清。
具体实施方式
实施例1：本试剂盒检测HCV病人特异性的鉴定
本试剂盒检测丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2、以及154份HCV阳性病人血清和135份健康正常人血清。
对象 丙型肝炎病毒：来源于Cell Mol Immunol.2009，6(4)：235-44；丙型肝炎病毒包膜抗原E2：来源于Vaccine，2007，25：1544-1551；HCV感染者：2007-03/2008-08在武汉大学中南医院、武汉市传染病医院等临床诊断明确为丙型肝炎病毒(HCV)感染的患者，并排除其他肝炎病毒和HIV病毒感染，平均年龄44(8～80)岁。部分患者使用干扰素进行抗病毒治疗；非HCV感染者：同期在武汉大学中南医院就医、临床已排除HCV感染的患者，平均年龄35(8～79)岁。
一种丙型肝炎病毒及其丙型肝炎病毒包膜抗原E2的试剂盒，它包括：抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗体，酶标板(购自海门市三和新华玻璃实验仪器厂)，生物素标记核酸适配子ZE18，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(购自北京博奥生物技术有限公司)及其显色底物TMB(购自深圳达科为生物技术有限公司)。
生物素标记核酸适配子ZE18：将ZE18序列送公司合成，合成生物素标记ZE18的5’端(命名为：bio-ZE18)。并用无菌双蒸水稀释为400nM的浓度，-20℃保存。
一种丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的试剂盒检测丙型肝炎病毒的方法，
其检测步骤如下：
1、将1∶200兔抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清(效价为1∶12800，PBS稀释)包被96孔ELISA板，4度过夜。
2、含有5/10000吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBS溶液：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，加去离子水溶解，定容至1000ml，调pH至7.4，15磅灭菌20min，置4℃保存)，洗涤六遍。
3、1％(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)(1mg/mLPBS溶解)封闭96孔板，100μl/孔，37度封闭1小时。
4、加入待检样品，100μl/孔，37度孵育1小时。
2.5.含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍。
6、加入bio-ZE18(400nM/孔，PBS稀释)，37度孵育1小时。
7、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍.
8、加入加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-streptoavidin)(1∶1000，PBS稀释)，100μl/孔，37度孵育1小时。
9、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍.
10、加入底物显色剂(TMB)(TMB干粉10mg，溶于5ml无水乙醇中(2mg/ml)。pH5.0显色液10ml中，加入2mg/ml TMB 0.5ml，再加入2μl 30％H2O2，临用前配制)显色2min，用2M浓硫酸中止显色。
11、1小时内在Themo scientific Multskan mk3多功能酶标仪450nM下检测吸光度。检测结果是丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2以及HCV感染阳性病人及其丙型肝炎病毒E2抗原阳性病人的OD450值均大于设定的临界值(cutoff值)，而正常健康人及阴性样品的OD450值均小于临界值(cutoff值)，cutoff值＝0.1×阳性对照的平均OD450值+阴性对照的平均OD450值。说明本试剂盒的检测结果能有效的鉴别出丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原、以及丙型肝炎病毒感染感染患者与正常健康人或非丙型肝炎病毒感染感染患者的不同。结果见图1。
实施例2：本发明试剂盒检测丙型肝炎病毒、以及不同病人特异性的鉴定分别检测丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2、以及乙肝或丙肝阳性病人血清、结核阳性病人血清。
对象丙型肝炎病毒：来源于Cell Mol Immunol.2009，6(4)：235-44；丙型肝炎病毒包膜抗原E2：来源于Vaccine，2007，25：1544-1551；HCV感染者：2007-03/2008-08在武汉大学中南医院、武汉市传染病医院等临床诊断明确为丙型肝炎病毒(HCV)感染的患者，并排除其他肝炎病毒和HIV病毒感染，平均年龄44(8～80)岁。部分患者使用干扰素进行抗病毒治疗；结核病人样本：来源于武汉市医疗救治中心住院病人确诊为仅结核阳性病人；乙肝病人：来源于武汉大学中南医院，明确为乙型肝炎病毒(HBV)感染的患者，并排除其他肝炎病毒和HIV病毒感染，平均年龄44(8～80)岁；非HCV感染者：同期在武汉大学中南医院就医、临床已排除HCV，HBV，HIV感染的患者，平均年龄35(8～79)岁。
一种丙型肝炎病毒包膜抗原E2的试剂盒，它包括：抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗体，酶标板(购自海门市三和新华玻璃实验仪器厂)，生物素标记核酸适配子ZE18，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(购自北京博奥生物技术有限公司)及其显色底物TMB(购自深圳达科为生物技术有限公司)。
生物素标记核酸适配子ZE18的制备：将ZE18序列送公司合成，合成生物素标记ZE18的5’端(命名为：bio-ZE18)。并用无菌双蒸水稀释为400nM的浓度，-20℃保存。
一种丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的试剂盒检测丙型肝炎病毒的方法，
其检测步骤如下：
1.将1∶200兔抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清(效价为1∶12800，PBS稀释)包被96孔ELISA板，4度过夜；
2.含有5/10000吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBS溶液：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO41.44g，KH2PO4 0.24g，加去离子水溶解，定容至1000ml，调pH至3.4.15磅灭菌20min，置4℃保存)，洗涤六遍；
3.1％(g/mL)牛血清白蛋白(BSA)(PBS溶解)封闭96孔板，100μl/孔，37度封闭1小时；
4.加入待检样品，100μl/孔，37度孵育1小时；
5.含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍；
6.加入bio-ZE18(400nM/孔，PBS稀释)，37度孵育1小时；
7.含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍；
8.加入加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-streptoavidin)(1∶1000，PBS稀释)，100μl/孔，37度孵育1小时；
9.5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍.
10.加入底物显色剂，显色2分钟，用2M浓硫酸中止显色。
本发明中所用的底物TMB显色剂配方包括：A底物是：TMB 20mg(固体)，先用无水乙醇10ml溶解，充分振荡(试剂瓶要干净，干燥)，加双蒸水定容到100ml，此即是A底物；B底物是：取1水柠檬酸2.1g，无水Na2HPO4 2.82g，0.75％的过氧化氢0.64ml，双蒸水定容至100ml(无须调pH值，应在4.5-5.0范围)，此即是B底物。使用时，A底物与B底物各取5ml混匀。
11.1小时内在Themo scientific Multskan mk3多功能酶标仪450nM下检测吸光度。检测结果是丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2以及丙型肝炎病毒感染阳性病人及其丙型肝炎病毒E2抗原阳性病人的OD450值均大于设定的临界值(cutoff值)，而正常健康人及阴性样品、结核阳性病人，乙肝病人的OD450值均小于临界值(cutoff值)，cutoff值＝0.1×阳性对照的平均OD450值+阴性对照的平均OD450值。说明本试剂盒的检测结果能有效的鉴别出丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原、以及丙型肝炎病毒感染感染患者与乙肝病毒感染患者、结核病人等的不同。结果见图2。
实施例3：
本发明试剂盒与HCV-RNA、HCV-Ab检测相比较：
对象丙型肝炎病毒；HCV感染者：2007-03/2008-08在武汉大学中南医院、武汉市传染病医院等临床诊断明确为丙型肝炎病毒(HCV)感染的患者，并排除其他肝炎病毒和HIV病毒感染，平均年龄44(8～80)岁。部分患者使用干扰素进行抗病毒治疗。②非HCV感染者：同期在武汉大学中南医院就医、临床已排除HCV感染的患者，平均年龄35(8～79)岁。
HCV-RNA检测：FQ2PCR方法，采用Roche公司LightCycler荧光定量PCR扩增仪及数据处理软件。检测试剂为中山大学达安基因股份有限公司提供的丙型肝炎病毒(HCV)Taqman探针法核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒。
抗-HCV检测：采用上海科华生物技术工程有限公司提供的酶联免疫法原理(ELISA)抗-HCV检测试剂盒(主要组分：HCV核心抗原和非结构区抗原包被的微孔板和酶标记特异性抗人IgG)；在意大利SEAC公司生产的Alisei全自动酶免分析系统上检测，相关参数按试剂说明书设置。
本试剂盒检测：将抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清包被ELISA板后，洗后，加入不同病人血清和健康正常人血请对照，经反复洗涤，未结合的病毒被洗去，结合在板上的HCV再用生物素标记的适配子捕获，再经反复洗涤后，加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，最后加入底物显色，显色终止后，在酶标仪450nm的吸收波长上测其OD值。检测结果：本试剂盒检测的OD值高低与病毒含量呈正相关性；本试剂盒与HCV-RNA、HCV-Ab检测结果相比较呈正相关性。以上检测结果见表一。
麦一本发明试剂盒与HCV-RNA检测方法、HCV-Ab抗体检测相比较
实施例4：
本发明试剂盒与与HCV-RNA检测的HCV-RNA载量的相关性：
对象：2007-03/2008-08在武汉大学中南医院、武汉市传染病医院等临床诊断明确为丙型肝炎病毒(HCV)感染的患者，并排除其他肝炎病毒和HIV病毒感染，平均年龄44(8～80)岁。部分患者使用干扰素进行抗病毒治疗。
HCV-RNA检测：FQ2PCR方法，采用Roche公司LightCycler荧光定量PCR扩增仪及数据处理软件。检测试剂为中山大学达安基因股份有限公司提供的丙型肝炎病毒(HCV)Taqman探针法核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒。
本发明试剂盒的检测：同法抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清包被ELISA板后，洗后，加入不同待检血清，经反复洗涤，未结合的病毒被洗去，结合在板上的HCV再用生物素标记的适配子捕获，再经反复洗涤后，加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，最后加入底物显色，显色终止后，在酶标仪450nm的吸收波长上测其OD值。结果见表二：HCV阳性血清中HCV-RNA载量与本试剂盒的OD450值高低呈正相关性。
表二本试剂盒与与HCV-RNA检测的HCV-RNA载量的相关性比较
实施例5：
本发明试剂盒与HCV-RNA检测的比较
对象：2007-03/2008-08在武汉大学中南医院、武汉市传染病医院等临床诊断明确为丙型肝炎病毒(HCV)感染的患者119例，并排除其他肝炎病毒和HIV病毒感染，平均年龄44(8～80)岁。部分患者使用干扰素进行抗病毒治疗。
HCV-RNA检测FQ2PCR方法，采用Roche公司LightCycler荧光定量PCR扩增仪及数据处理软件。检测试剂为中山大学达安基因股份有限公司提供的丙型肝炎病毒(HCV)Taqman探针法核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒。
本发明试剂盒的检测：抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清包被ELISA板后，洗后，加入不同待检血清，经反复洗涤，未结合的病毒被洗去，结合在板上的HCV再用生物素标记的适配子捕获，再经反复洗涤后，加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，最后加入底物显色，显色终止后，在酶标仪450nm的吸收波长上测其OD值。结果见表二：HCV阳性血清中HCV-RNA载量与本试剂盒的OD450值高低呈正相关性。
本剂盒检测中设定cutoff值为0.08。OD450＞0.08为阳性(+)；OD450＜0.08为阴性(-)。
表三本发明试剂盒与与HCV-RNA检测的HCV-RNA检测的比较
实施例6：
本发明试剂盒的稳定性的鉴定：
将抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清包被ELISA板后，洗后，放置4度或室温下不同天数，再加入HCV病毒、或HCV病毒阳性血清，经洗涤六次，未结合的病毒被洗去，结合在板上的HCV再用生物素标记的适配子捕获，再经反复洗涤后，加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，最后加入底物显色，显色终止后，在酶标仪450nm的吸收波长上测其OD值。检测的结果表明本试剂盒在室温下可放置9天以上，4度放置12天以上结果均很稳定。结果见表四。
表四本发明试剂盒检测的稳定性
| 4℃12天n＝8 | 25°6天n＝8 | 25℃9天n＝8 | 25℃11天n＝8 | |
| HCV病毒或HCV阳性病人血清OD450 | 0.165±0.01 | 0.12±0.02 | 0.12±0.01 | 0.11±0.02 |
| 阴性对照或正常人血清OD450 | 0.075±0.02 | 0.075±0.01 | 0.05±0.01 | 0.05±0.01 |
SEQUENCE LISTING
<110>武汉大学
<120>一种丙型肝炎病毒及其表面抗原的试剂盒及检测方法
<130>一种丙型肝炎病毒及其表面抗原的试剂盒及检测方法
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
gaatgaggaa taatctagct ccttcgctga 30
Claims (3)
1.一种丙型肝炎病毒及其表面抗原的试剂盒，其特征在于：试剂盒包括：抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗体；酶标板；生物素标记核酸适配子ZE18；辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素及其显色底物3’，3’，5，5’-四甲基联苯胺；
所述的抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗体的制备：将丙型肝炎病毒包膜抗原E2的真核表达载体pcDNA3.1A-E2，肌肉多点注射入家兔，每隔一周后注射一次，每次免疫注射200g质粒DNA，注射三次，用基因电导入仪在注射部位电极导入DNA，第三次注射后2周，再用丙型肝炎病毒包膜抗原E2重组蛋白加强免疫，免疫注射2次，每次免疫注射100μg蛋白，两周后心脏取血，1000rpm离心分离血清，为丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗体，保存于-80℃；
所述的生物素标记核酸适配子ZE18：将ZE18序列合成，合成生物素标记ZE18的5’端为：bio-ZE18，用无菌双蒸水稀释为400nM的浓度，-20℃保存。
2.权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒及其丙型肝炎病毒包膜抗原E2的试剂盒检测丙型肝炎病毒的方法，其步骤是：
A、将1∶200兔抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清包被酶标板，4度过夜；
B、含有5/10000吐温-20的磷酸盐缓冲液，PBS溶液：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，加去离子水溶解，定容至1000ml，调pH至7.4，15磅灭菌20min，置4℃保存，洗涤六遍；
C、1％g/ml牛血清白蛋白，PBS溶解，封闭96孔板，100μl/孔，37度封闭1小时；
D、加入待检样品：包括HCV病毒HCV病毒阳性血清、或对照样品，100μl/孔，37度孵育1小时；
E、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍；
F、加入bio-ZE18，400nM/孔，PBS稀释，37度孵育1小时；
G、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍；
H、加入加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，1∶1000，PBS稀释，100μl/孔，37度孵育1小时；
J、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍；
K、加入底物显色剂，显色2分钟，用2M浓硫酸中止显色；
L、1小时内在多功能酶标仪450nM下检测吸光度；
所述的底物显色剂配方包括：A底物是：TMB 20mg，先用无水乙醇10ml溶解，充分振荡，加双蒸水定容到100ml；B底物是：取1水柠檬酸2.1g，无水Na2HPO42.82g，0.75％的过氧化氢0.64ml，双蒸水定容至100ml，使用时，A底物与B底物各取5ml混匀。
3.权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒及其表面抗原的试剂盒，其特征在于：所述的生物素标记核酸适配子ZE18，其序列为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。
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