CN110229819A - 一种链霉素适配体的Non-SELEX筛选方法 - Google Patents

一种链霉素适配体的Non-SELEX筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明为一种链霉素适配体的Non‑SELEX筛选方法。对链霉素与随机单链寡核苷酸文库混合孵育后的溶液进行毛细管电泳分离，利用单链寡核苷酸与链霉素结合后与游离单链寡核苷酸的质荷比差异可使二者分离。将电泳开始后的0‑17min作为收集时间窗口，可以有效收集与链霉素结合的单链寡核苷酸。将其作为次级文库再次筛选，经过仅4轮筛选即可得到对链霉素具有高亲和力适配体。

Description

一种链霉素适配体的Non-SELEX筛选方法
技术领域
本发明涉及生物分离技术领域，具体涉及一种用于小分子靶标链霉素适配体筛选的Non-SELEX方法。
背景技术
适配体是筛选自人工合成随机寡核苷酸文库的单链脱氧核糖核酸(ssDNA)序列或核糖核酸序列，这些序列通过碱基互补配对作用可形成二级甚至三级结构。这些高级结构使得它们能够识别并结合到特定的靶物质上，并且能够识别靶物质仅仅一个羟基或甲基的结构差异，甚至能够区分手性对映体。适配体对靶物质的优异识别性能使其在生物、医学、分析检测(包括食品安全检测)等领域展现了广阔的应用前景。
随机寡核苷酸文库中约含有1015个长度为20-220nt的序列，从数量如此庞大的文库中将某个或某几个对特定靶物质具有高特异性和高亲和性的序列筛选出来并非易事。目前，适配体的筛选方法主要是以指数富集配体系统进化(SELEX)方法为基础的各种方法，包括磁珠法、琼脂糖珠法、Cell-SELEX、微孔板法、CE-SELEX等。CE-SELEX将毛细管电泳高效分离的特点与SELEX相结合，利用ssDNA与靶标结合后形成的复合物与游离ssDNA的质荷比差异使后者与前者分离，收集复合物进行PCR扩增、纯化后用于下一轮筛选，直至获得适配体。Non-SELEX在CE-SELEX的基础上，将上一轮收集得到的ssDNA作为次级文库直接进入下一轮筛选，直至最后一轮才对收集得到的ssDNA进行PCR扩增和纯化，然后进行测序，省却中间轮次间的PCR扩增和纯化过程，此方法大大简化了筛选过程。然而，此方法和CE-SELEX目前都是应用于大分子靶物质，例如蛋白质的适配体的筛选，主要原因是大分子靶与ssDNA结合后的复合物与游离ssDNA的质荷比差异较大，易于分离。对于小分子靶物质来说，与ssDNA结合后的复合物与游离ssDNA的质荷比差异很小，其复合物的获得十分困难，尚无用于小分子靶物质适配体筛选的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于小分子物质链霉素适配体筛选的Non-SELEX方法，为高效筛选小分子物质的适配体提供一条可行途径。
具体步骤如下：
1、一种链霉素适配体的Non-SELEX筛选方法，其特征在于：所述的适配体筛选按如下步骤进行：
(1)将5μL浓度20g/L的小分子靶标链霉素与45μL浓度100μmol/L的变性处理后随机ssDNA文库室温混合孵育30min，形成由靶标-ssDNA复合物、游离ssDNA和游离靶标组成的混合物溶液。
(2)将混合物溶液注入毛细管柱进行毛细管电泳分离，从电泳开始到游离ssDNA电泳峰前沿之间的时间段被用作收集时间窗口，收集其间从毛细管中流出的溶液。此过程重复10次，合并该10次过程中收集到的电泳流出溶液作为次级文库，至此第1轮筛选结束。
(3)取45μL变性处理后的次级文库与5μL浓度20g/L的链霉素室温混合孵育30min，重复步骤(2)，完成第2轮筛选。第3轮以后筛选步骤同第2轮。
(4)对第4轮筛选后获得的收集溶液进行对称PCR，对PCR扩增产物进行凝胶电泳纯化，纯化后产物进行高通量测序。
(5)从测序结果中将出现频率由高至低排列在前7位的序列选出并进行合成。
(6)对合成的各序列测定解离常数，从中选出解离常数最小的序列，此即最后确定的链霉素适配体。
所述随机ssDNA文库是指由两端各22个核苷酸构成的固定引物序列和中间40个核苷酸构成的随机序列组成的寡核苷酸库(5'-TAG GGA ATT CGT CGA CGG ATC C-N40-CTGCAG GTC GAC GCA TGC GCC G-3')；所述变性处理是指先将文库95℃加热10min，再立即冰浴10min。
所述毛细管电泳分离按如下电泳条件进行：熔融石英毛细管，长度60cm，有效长度50cm，内径100μm；运行缓冲液为80mmol/L的硼酸盐缓冲液，pH9.24；分离电压+20kV；温度25℃；进样压力0.1379 MPa，进样时间10s；检测波长190nm。所述收集时间窗口是指电泳开始后的0-17min。
所述对称PCR按如下扩增条件进行：
(1)浓度5μmol/L的上游引物5'-TAG GGA ATT CGT CGA CGG AT加入量2μL，浓度5μmol/L的下游引物CGG CGC ATG CGT CGA CCT G-3'加入量2μL，第4轮收集溶液加入量2μL，Mix25μL，用去离子水定容至50μL。
(2)预变性温度95℃，持续时间5min；变性温度95℃，持续时间30s；退火温度60℃，持续时间30s；延伸温度72℃，持续时间30s；循环35次；继续延伸温度72℃，持续时间5min。
所述凝胶电泳纯化按如下条件进行：
(1)琼脂糖凝胶中PCR扩增产物引入量100-200μL，分离电压80 V，分离时间60min。
(2)切84bp处条带，用胶回收试剂盒进行回收。
所述测定解离常数按如下步骤进行：对合成的序列进行变性处理，将400μL链霉素-磁珠复合物分别与浓度为50、100、200、400、800、1000nmol/L的各变性处理后序列室温孵育60min；磁分离后用结合缓冲液将磁珠冲洗3次；然后向磁珠中加入50μL洗脱缓冲液，80℃洗脱10min，重复洗脱2次；合并2次洗脱后的上清液，测定其中ssDNA的浓度。对测定值按方程y＝Bmax×x/(Kd+x)进行非线性拟合，其中y为测得值，x为孵育前各溶液配制浓度，Kd为解离常数。
有益效果
现有包括链霉素在内的小分子靶物质适配体的筛选都是基于SELEX的筛选方法，例如磁珠法。需要将靶物质固定在磁珠上，经过至少9轮以上的筛选，才能得到适配体，需要约1个月的筛选时间。CE-SELEX和Non-SELEX方法不需要将靶物质固定于特定载体上，靶物质-ssDNA复合物与游离ssDNA的分离直接在液相中进行，且适配体仅经2-4轮筛选，约1周时间即可完成适配体的筛选，但目前仅用于大分子靶物质适配体的筛选。本发明通过将毛细管电泳开始后的0-17min选为链霉素-ssDNA复合物的收集时间窗口，通过仅4轮Non-SELEX筛选，就成功得到了链霉素的适配体，为小分子靶物质适配体的筛选提供了有益的思路借鉴，为开发基于适配体的动物性食品中链霉素残留检测的高灵敏方法奠定了坚实的物质基础。这个收集时间窗口的确定是整个筛选过程得以顺利完成的关键，是经过大量实验以后才确定的链霉素-ssDNA复合物流出毛细管的时间段。
附图说明
图1为收集时间窗口。
图2为合成序列的非线性拟合曲线
具体实施方式
对随机ssDNA文库5'-TAG GGA ATT CGT CGA CGG ATC C-N40-CTG CAG GTC GACGCA TGC GCC G-3'于95℃加热10min，再立即冰浴10min。将5μL浓度20g/L的链霉素与45μL浓度100μmol/L的处理后随机文库室温混合孵育30min，将孵育溶液注入毛细管柱进行毛细管电泳分离，电泳条件如下：熔融石英毛细管，长度60cm，有效长度50cm，内径100μm；运行缓冲液为80mmol/L的硼酸盐缓冲液，pH9.24；分离电压+20kV；温度25℃；进样压力0.1379MPa，进样时间10s；检测波长190nm。收集电泳开始后0-17min内从毛细管中流出的溶液。此过程重复10次，合并该10次过程中收集到的电泳流出溶液作为次级文库，第1轮筛选结束。
对次级文库于95℃加热10min，再立即冰浴10min。量取45μL处理后的次级文库与5μL浓度20g/L的链霉素室温混合孵育30min，重复以上毛细管电泳过程，完成第2轮筛选。第3轮以后筛选步骤与第2轮相同。
对第4轮筛选后获得的收集溶液按如下条件进行对称PCR：浓度5μmol/L的上游引物5'-TAG GGA ATT CGT CGA CGG AT加入量5μL，浓度5μmol/L的下游引物CGG CGC ATG CGTCGA CCT G-3'加入量5μL，第4轮收集溶液加入量2μL，Mix加入量25μL，用去离子水定容至50μL。95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次；72℃继续延伸5min。
向琼脂糖凝胶中引入200μL的PCR扩增产物，在80 V分离电压下电泳分离60min。将凝胶上84bp处条带切下，用胶回收试剂盒进行回收，纯化后产物进行高通量测序。
从测序结果中选出测序出现频率位于前7位的序列，如表1所示。
表1
合成表1各序列，对其在95℃下加热10min，然后冰浴10min。将400μL链霉素-磁珠复合物分别与浓度为50、100、200、400、800、1000nmol/L的各变性处理后序列室温孵育60min。磁分离后用结合缓冲液将磁珠冲洗3次，然后向磁珠中加入50μL洗脱缓冲液，80℃洗脱10min，重复洗脱2次。合并2次洗脱后的上清液，测定其中ssDNA的浓度。对测定数值按方程y＝Bmax×x/(Kd+x)进行非线性拟合，得到如表2各解离常数Kd值，其中的NS2即是链霉素最终的适配体。
表2

Claims (6)

1.一种链霉素适配体的Non-SELEX筛选方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)将5μL浓度20g/L的小分子靶标链霉素与45μL浓度100μmol/L的变性处理后随机ssDNA文库室温混合孵育30min，形成由靶标-ssDNA复合物、游离ssDNA和游离靶标组成的混合物溶液；
(2)将混合物溶液注入毛细管柱进行毛细管电泳分离，从电泳开始到游离ssDNA电泳峰前沿之间的时间段被用作收集时间窗口，收集其间从毛细管中流出的溶液；此过程重复10次，合并该10次过程中收集到的电泳流出溶液作为次级文库，至此第1轮筛选结束；
(3)取45μL变性处理后的次级文库与5μL浓度20g/L的链霉素室温混合孵育30min，重复步骤(2)，完成第2轮筛选；第3轮以后筛选步骤同第2轮；
(4)对第4轮筛选后获得的收集溶液进行对称PCR，对PCR扩增产物进行凝胶电泳纯化，纯化后产物进行高通量测序；
(5)从测序结果中将出现频率由高至低排列在前7位的序列选出并进行合成；
(6)对合成的各序列测定解离常数，从中选出解离常数最小的序列，此即最后确定的链霉素适配体。
2.如权利要求1所述的一种链霉素适配体的Non-SELEX筛选方法，其特征在于，所述随机ssDNA文库是指由两端各22个核苷酸构成的固定引物序列和中间40个核苷酸构成的随机序列组成的寡核苷酸库(5'-TAG GGA ATT CGT CGA CGG ATC C-N40-CTG CAG GTC GAC GCATGC GCC G-3')；所述变性处理是指先将文库95℃加热10min，再立即冰浴10min。
3.如权利要求1所述的一种链霉素适配体的Non-SELEX筛选方法，其特征在于，所述毛细管电泳分离按如下电泳条件进行：熔融石英毛细管，长度60cm，有效长度50cm，内径100μm；运行缓冲液为80mmol/L的硼酸盐缓冲液，pH9.24；分离电压+20kV；温度25℃；进样压力0.1379MPa，进样时间10s；检测波长190nm；所述收集时间窗口是指电泳开始后的0-17min。
4.如权利要求1所述的一种链霉素适配体的Non-SELEX筛选方法，其特征在于，所述对称PCR按如下扩增条件进行：
(1)浓度5μmol/L的上游引物5'-TAG GGA ATT CGT CGA CGG AT加入量2μL，浓度5μmol/L的下游引物CGG CGC ATG CGT CGA CCT G-3'加入量2μL，第4轮收集溶液加入量2μL，Mix25μL，用去离子水定容至50μL；
(2)预变性温度95℃，持续时间5min；变性温度95℃，持续时间30s；退火温度60℃，持续时间30s；延伸温度72℃，持续时间30s；循环35次；继续延伸温度72℃，持续时间5min。
5.如权利要求1所述的一种链霉素适配体的Non-SELEX筛选方法，其特征在于，所述凝胶电泳纯化按如下条件进行：
(1)琼脂糖凝胶中PCR扩增产物引入量100-200μL，分离电压80V，分离时间60min；
(2)切84bp处条带，用胶回收试剂盒进行回收。
6.如权利要求1所述的一种链霉素适配体的Non-SELEX筛选方法，其特征在于，所述测定解离常数按如下步骤进行：对合成的序列进行变性处理，将400μL链霉素-磁珠复合物分别与浓度为50、100、200、400、800、1000nmol/L的各变性处理后序列室温孵育60min；磁分离后用结合缓冲液将磁珠冲洗3次；然后向磁珠中加入50μL洗脱缓冲液，80℃洗脱10min，重复洗脱2次；合并2次洗脱后的上清液，测定其中ssDNA的浓度；对测定值按方程y＝Bmax×x/(Kd+x)进行非线性拟合，其中y为测得值，x为孵育前各溶液配制浓度，Kd为解离常数。
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