CN114807150B - 靶向和拮抗hmgb1分子的核酸适体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于靶向和拮抗HMGB1分子的核酸适体，属于生物技术领域。本发明核酸适体能高效结合HMGB1，且核酸适体具有良好的亲和力、低免疫原性、分子量小、合成成本低、易于保存、方便进行修饰和取代等优点，在HMGB1的核酸类拮抗剂以及检测等领域有重要的应用价值。此外，本发明核酸适体可用于制备治疗急性肺炎等炎症的药物，在实验中发现本发明核酸适体能有效减少急性炎症小鼠血液中IL‑6和TNF‑α显著性地下调，表明核酸适体ZH‑1a在炎症疾病中可抑制炎症相关因子的释放。

Description

靶向和拮抗HMGB1分子的核酸适体

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于靶向和拮抗HMGB1分子的核酸适体以及HMGB1核酸适体拮抗剂的开发和应用。

背景技术

高迁移率族蛋白B1（high mobility group box-I protein，HMGB1）是一种普遍存在的高度保守的染色质结合蛋白，广泛存在于所有哺乳动物的有核细胞和血小板中。HMGB1蛋白是一种多功能蛋白分子，在细胞的不同位置具有多种不同的生物学功能可调控多种信号通路。HMGB1的调控和检测在多种疾病中显示出重要的作用，但是HMGB1拮抗剂的开发却十分缓慢，主要开发了HMGB1的蛋白抗体。

近年来，被称为化学抗体的核酸适体（aptamer）在疾病诊断及治疗领域已显示出广阔的应用前景。核酸适体的出现，突破了传统意义上关于核酸只是遗传信息存储和转运载体的认识，表明利用其结构的多样性可实现类似抗体的分子配体或分子探针的功能。核酸适体是通过模拟自然进化过程的人工筛选技术—指数富集配体系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）筛选得到能与靶分子特异结合的DNA或RNA单链。核酸适体作为一种识别分子，可作用于蛋白质、金属离子、小分子化合物、细胞等靶标，主要借助于氢键、范德华力、疏水作用等分子间作用力形成特殊的三维结构，从而特异地识别靶标物质并影响其生物活性。核酸适体具有免疫原性低、生物毒性小、易于合成和标记等特点，其在基础、临床、药物开发中的研究不断增多，越来越多的针对生命系统中重要分子的适体被筛选出来。

过度免疫是HMGB1分子在体内促进炎症发展的主要原因，因此发展低免疫原性的HMGB1拮抗剂尤为重要。核酸适体具有与抗体相似的与靶标特异性结合的能力，但相较于抗体，显现出极低的免疫原性。此外，HMGB1作为一种可分泌蛋白，具有较小的空间结构，使适体介导的阻断成为可能。因此利用核酸适体靶向抑制胞外HMGB1的活动，是一种非常有潜力的抑制炎症发生的策略，也是一类新的HMGB1核酸类拮抗剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有较好的亲和力、低免疫原性、分子量小、能够体外化学合成、序列稳定、便于保存、方便标记、易于修饰的核酸适体，能够特异性识别HMGB1，作为HMGB1的拮抗剂。

为达到上述发明目的，采用如下技术方案：

一种用于检测和拮抗HMGB1分子的核酸适体，序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示：

SEQIDNO.1：

AAGGAGCAGCGTGGAGGATAAAAACAAGGTCGGGGGGCATGATTATGTTTAGGGTGTGTCGTCGTGGT；

SEQIDNO.2：

GGAGCAGCGTGGAGGATAAAAACAAGGTCGGGGGGCATGATTATGTTTAGGGTGTGTCGTCG。

本发明核酸适体中，SEQIDNO.2是SEQIDNO.1的优化序列，为了确定核酸适体结合的必要片段及降低合成成本，对序列的进行删减优化，从而得到结合最优、稳定性最好的核酸适体。本发明核酸适体对HMGB1具有高亲和力与高特异性，能够较好地结合HMGB1蛋白；本发明核酸适体作为一种化学抗体，可以用于调控和检测HMGB1，并具有良好的亲和力、低免疫原性、分子量小、合成成本低、易于保存、方便进行修饰和取代等优点，在HMGB1的核酸类拮抗剂以及检测等领域将有重要的应用价值；本发明核酸适体在LPS引起的全身性炎症的动物模型中可抑制炎症相关因子的释放，可有效缓解炎症症状，可作为急性肺损伤尤其新型冠状病毒肺炎的候选药物。

本发明还公开了制备上述核酸适体的方法，本发明利用Protein-SELEX技术，对随机合成的ssDNA序列进行筛选，以人重组蛋白HMGB1为对象，筛选出对HMGB1具有高亲和力与高特异性的核酸适体。具体包括如下步骤：

1、构建筛选文库；

2、蛋白与磁珠偶联；

3、蛋白筛选；

4、筛选进程监测；

5、核酸适体候选链的挑选和初步验证。

优选地，构建筛选文库为ssDNA文库，全长为70nt，由两端固定的20nt长度的引物片段和中间30nt的随机片段构成。

更优选地，靶向HMGB1筛选文库序列为：

SEQIDNO.3：AAGGAGCAGCGTGGAGGATA(N)₃₀TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT。

更优选地，构建文库所使用的引物为：

正向引物：SEQIDNO.4：AAGGAGCAGCGTGGAGGATA；

反向引物：SEQIDNO.5：ACCACGACGACACACCCTAA。

更优选地，正向引物5’修饰FITC荧光基团，与初始文库的5’端固定序列相同；反向引物5’端以Biotin标记，序列与初始文库的3’端固定序列反向互补。正向引物5’修饰FITC荧光基团方便通过流式细胞术监测筛选进程，反向引物5’端以Biotin标记有助于在PCR后通过链霉亲和素-生物素相互作用分离有义链和反义链。

优选地，蛋白与磁珠偶联的具体操作如下：

取磁珠，用超纯水清洗，向其中加入羧基活化剂混匀，然后室温摇床孵育10-30min，活化后将上清充分吸出，并迅速使用超纯水洗涤一次。然后加入HMGB1或BSA蛋白稀释液，室温摇床孵育40-70min。

更优选地，取羧基磁珠（MB），用超纯水清洗，向其中加入羧基活化剂EDC和NHS混匀，然后室温摇床孵育20min，活化后将上清充分吸出，并迅速使用200µL 超纯水洗涤一次。然后加入HMGB1或BSA蛋白稀释液，室温摇床孵育60min。

优选地，蛋白筛选的具体操作如下：

文库离心后加入超纯水进行溶解，然后置于80-95℃金属浴进行变性；3-8min后取出，迅速放置于冰上5-15min；然后向文库中加入适量结合缓冲液，并将文库加入到MB-HMGB1中,轻轻混匀；摇床孵育30-60min，洗脱后，利用高温将结合在MB-HMGB1上的序列分离下来；利用PCR扩增，之后进行单链制备；将文库加入到MB-BSA中，轻轻混匀，4℃摇床孵育30min；将不与MB-BSA结合的序列收集投入到下一轮筛选中。

更优选地，蛋白筛选的具体操作如下：

文库离心后加入超纯水进行溶解，然后置于95℃金属浴进行变性；5min后取出，迅速放置于冰上10min；然后向文库中加入适量结合缓冲液，并将文库加入到MB-HMGB1中,轻轻混匀；4℃摇床孵育50min，洗脱后，利用高温将结合在MB-HMGB1上的序列分离下来；利用PCR扩增，之后进行单链制备；加文库加入到MB-BSA中，轻轻混匀，4℃摇床孵育30min；将不与MB-BSA结合的序列收集投入到下一轮筛选中。

优选地，共进行8轮的蛋白筛选。

优选地，筛选进程监测利用Q-PCR实验，检测文库富集程度。

优选地，筛选进程监测的具体操作如下：

取八联管QPCR管，每孔加入一定量QPCR mix，将待测富集文库加入到QPCR mix中，留1管空白QPCR mix加入筛选缓冲液作为阴性对照，盖好管盖后将样品瞬时离心混匀，开始荧光定量PCR检测。

优选地，核酸适体候选链的挑选和初步验证的具体操作如下：

将第8轮ssDNA富集文库进行高通量测序。基于其序列的重复性，二级结构和同源家族分析，将测序的结果进行分组；并从不同的组别中分别选择出代表性的序列；通过表面等离子共振技术进行或者流式细胞仪进行分析，验证挑选序列与靶蛋白HMGB1的结合情况。

本发明还公开了一种用于检测和拮抗HMGB1分子的核酸适体，其特征在于，所述核酸适体还包括：

（1）SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示序列的互补序列；

（2）由SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.1所示序列的互补序列和SEQIDNO.2所示序列的互补序列转录得到的RNA序列。

本发明还公开了一种用于调控和检测HMGB1水平的核酸适体，包括对上述的核酸适体进行修饰得到的序列。

优选地，修饰包括以下修饰方法的至少一种：

（1）磷酸化；

（2）甲基化；

（3）氨基化；

（4）巯基化；

（5）同位素化；

（6）氟化；

（7）用硫取代氧；

（8）用硒取代氧。

本发明还公开了一种用于检测和拮抗HMGB1分子的核酸适体，包括对上述的核酸适体进行改造得到的序列。

优选地，改造包括以下改造方法的至少一种：

（1）在核酸适体上连接荧光标记物；

（2）在核酸适体上连接放射性物质；

（3）在核酸适体上连接治疗性物质；

（4）在核酸适体上连接生物素；

（5）在核酸适体上连接地高辛；

（6）在核酸适体上连接纳米发光材料；

（7）在核酸适体上连接小肽；

（8）在核酸适体上连接siRNA。

本发明还公开了一种用于检测和拮抗HMGB1分子的核酸适体衍生物，其特征在于，所述衍生物包括以下至少一种：

（1）上述核酸适体骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架序列；

（2）上述核酸适体改造成的肽核酸序列。

本发明还公开了上述核酸适体或核酸适体的衍生物的用途，包括以下至少一种：

（1）在制备特异性识别HMGB1的试剂中的用途；

（2）在制备定性或定量检测HMGB1的试剂中的用途；

（3）在制备HMGB1拮抗剂中的用途；

（4）在制备HMGB1成像剂中的用途；

（5）在制备治疗或辅助治疗急性肺炎药物中的用途；

（6）在偶联药物中的用途；

（7）作为药物载体的用途。

本发明还公开了一种药物成分，包括上述核酸适体或上述的核酸适体的衍生物。

本发明还公开了上述药物成分的用途，包括以下至少一种：

（1）在制备治疗或辅助治疗炎症的药物中的用途；

（2）在制备治疗或辅助治疗肿瘤的药物中的用途；

（3）在制备调控或辅助调控HMGB1功能的药物中的用途。

本发明还公开了一种包含核酸适体的试剂，核酸适体包括上述核酸适体或上述核酸适体的衍生物；所述试剂包括以下至少一种：

（1）靶向识别HMGB1的试剂；

（2）可以定性或定量检测HMGB1的试剂；

（3）可以中和HMGB1功能的分子；

（4）可以抑制HMGB1功能的抑制剂；

（5）可以抑制HMGB1功能的拮抗剂；

（6）可以结合HMGB1的成像剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明核酸适体能高效结合HMGB1，且核酸适体具有良好的亲和力、低免疫原性、分子量小、合成成本低、易于保存、方便进行修饰和取代等优点，在HMGB1的核酸类拮抗剂以及检测等领域有重要的应用价值。此外，本发明核酸适体可用于治疗炎症疾病，可作为急性肺损伤尤其新型冠状病毒肺炎的候选药物；在实验中发现本发明核酸适体能有效减少急性炎症小鼠血液中IL-6和TNF-α显著性地下调，表明核酸适体ZH-1a在急性炎症中可抑制炎症相关因子的释放。

附图说明

图1为蛋白筛选流程图；

图2为蛋白筛选过程中核酸适体文库的流式细胞检测结果；

图3为ZH-1在细胞的蛋白裂解液中特异性识别HMGB1蛋白的检测结果；

图4为ZH-1截短序列与HMGB1的结合能力的测定结果；

图5为核酸适体与HMGB1结合力测定结果；

图6为核酸适体ZH-1a抑制炎症因子的检测结果。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是本公开的一些方面相一致的方法的例子。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

核酸适体的制备

1、构建筛选文库

本研究中所用的ssDNA文库，全长为70nt，由两端固定的20nt长度的引物片段和中间30nt的随机片段构成；正向引物5’修饰FITC荧光基团，与初始文库的5’端固定序列相同；反向引物5’端以Biotin标记，序列与初始文库的3’端固定序列反向互补；

靶向HMGB1筛选文库序列为：

SEQIDNO.3：AAGGAGCAGCGTGGAGGATA(N)₃₀TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT。

构建文库所使用的引物为：

正向引物：SEQIDNO.4：AAGGAGCAGCGTGGAGGATA；

反向引物：SEQIDNO.5：ACCACGACGACACACCCTAA。

2、蛋白与磁珠偶联

取羧基磁珠（MB），用超纯水清洗，向其中加入羧基活化剂EDC和 NHS混匀，然后室温摇床孵育20min，活化后将上清充分吸出，并迅速使用200µL超纯水洗涤一次；然后加入HMGB1或BSA蛋白稀释液，室温摇床孵育60min。

3、蛋白筛选

文库离心后加入超纯水进行溶解，然后置于95℃金属浴进行变性；5min后取出，迅速放置于冰上10min；然后向文库中加入适量结合缓冲液，并将文库加入到MB-HMGB1中,轻轻混匀；4℃摇床孵育50min，洗脱后，利用高温将结合在MB-HMGB1上的序列分离下来；利用PCR扩增，之后进行单链制备；加文库加入到MB-BSA中，轻轻混匀，4℃摇床孵育30min；将不与MB-BSA结合的序列收集投入到下一轮筛选中；如此反复，进行8轮的蛋白筛选。

4、筛选进程监测

利用Q-PCR实验，检测文库富集程度。取八联管QPCR管，每孔加入一定量QPCR mix，将待测富集文库加入到QPCR mix中，留1管空白QPCR mix加入2µL筛选缓冲液作为阴性对照，盖好管盖后将样品瞬时离心混匀，开始荧光定量PCR检测。

5、核酸适体候选链的挑选和初步验证

为了获得与HMGB1蛋白结合的ssDNA，将第8轮ssDNA富集文库送至公司（上海生工）进行高通量测序，测序结果如图2中c所示。基于其序列的重复性，二级结构和同源家族分析，将测序的结果进行分组；并从不同的组别中分别选择出代表性的序列，通过表面等离子共振技术进行或者流式细胞仪进行分析，验证挑选序列与靶蛋白HMGB1的结合情况；筛选过程如图1所示，检测结果如图2中a、b、d所示；

通过SELEX技术，以HMGB1为靶蛋白，以BSA为对照蛋白，经过8轮蛋白筛选，并利用高通量测序、SPR技术成功获得特异性识别HMGB1蛋白的核酸适体ZH-1（SEQIDNO.1）、ZH-2、ZH-3、ZH-4、ZH-5；

对比图2中的A和B可知，相比于BSA-MB，HMGB1-MB中富集池1（Enrichmnet pool 1）较富集池2（Enrichmnet pool 2）的偏移值有明显增加，说明每轮富集中与HMGB1亲和能力逐渐增加，进一步说明本发明所使用的方法行之有效。由图2中d可知，ZH-1的偏移值最大，因此与HMGB1的亲和性最好，因此选择ZH-1进行后续实验。

实施例2

核酸适体与HMGB1蛋白结合的验证

提取SKOV3细胞的蛋白，并等分成6份，将生物素标记的对照序列和候选链分别加入到蛋白中，混匀，4℃孵育45min，再向其中加入50μl链霉亲和素修饰的磁珠，混匀后，4℃继续孵育1h，孵育完成后，去上清，用于洗涤3次，而后向管中加入2×蛋白上样缓冲液，混匀，100摄氏度变性10min，将蛋白分离下来，最后取上清上样，使用SDS-PAGE进行电泳，电泳完成后，将胶进行考马斯亮蓝染色，以辨别差异条带。

检测结果如图3所示，根据测试结果可以看出，核酸适体ZH-1可以特异性识别和结合细胞蛋白裂解液中HMGB1蛋白。

实施例3

核酸适体ZH-1序列的优化

通过序列截短策略，将ZH-1截短为6个优化后的序列，并对6个序列使用WesternBlot进行亲和力测定，内参为tublin；检测结果如图4所示，由图4可知ZH-1a（SEQIDNO.2）的亲和能力最强，因此确定ZH-1a为最优核酸适体，进行后续实验。

实施例4

核酸适体与HMGB1结合力和结合位点的检测

通过表面等离子共振（SPR）检测核酸适体ZH-1、ZH-1a与HMGB1蛋白的亲和力和特异性。将核酸适体用DPBS缓冲液分别稀释成0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、400 nM浓度，然后使用表面等离子共振仪（GE Healthcare，型号：Biacore T200）依次进样检测；亲和力检测数据见图5，图5数据说明核酸适体ZH-1可以与HMGB1很好的结合，并且截断后的核酸适体ZH-1a的KD值为10.7 nM，说明ZH-1a较ZH-1有更强的亲和力。

实施例5

核酸适体ZH-1a治疗炎症疾病能力的检测

将10mg/kg的LPS通过腹腔注射至BALB/C小鼠体内，建立小鼠炎症模型；

将小鼠随机分组：对照序列组和核酸适体组；小鼠注射LPS 1 h后按组别进行处理，均采用微静脉注射给药，分别治疗4小时或8小时后，采集各组的血液样本，分析利用ELISA实验检测小鼠血液中的炎症因子的释放和差异；

检测结果如图6所示，展示核酸适体组、对照序列组结果；由图可知、给予核酸适体ZH-1a治疗后，急性炎症小鼠血液中IL-6和TNF-α显著性地下调，表明核酸适体ZH-1a在LPS引起的全身炎症中可抑制炎症相关因子的释放。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院基础医学与肿瘤研究所（筹）

<120> 靶向和拮抗HMGB1分子的核酸适体

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaggagcagc gtggaggata aaaacaaggt cggggggcat gattatgttt agggtgtgtc 60

gtcgtggt 68

<210> 2

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggagcagcgt ggaggataaa aacaaggtcg gggggcatga ttatgtttag ggtgtgtcgt 60

cg 62

<210> 3

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaggagcagc gtggaggata nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ttagggtgtg 60

tcgtcgtggt 70

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaggagcagc gtggaggata 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

accacgacga cacaccctaa 20

Claims (9)

1.一种用于靶向和拮抗HMGB1分子的核酸适体，序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：

SEQ ID NO.1：

AAGGAGCAGCGTGGAGGATAAAAACAAGGTCGGGGGGCATGATTATGTTTAGGGTGTGTCGTCGTGGT;

SEQ ID NO.2：

GGAGCAGCGTGGAGGATAAAAACAAGGTCGGGGGGCATGATTATGTTTAGGGTGTGTCGTCG。

2.一种用于靶向和拮抗HMGB1分子的核酸适体，其特征在于，所述核酸适体包括以下至少一种：

（1）对权利要求1中所述的核酸适体进行修饰得到的序列；

（2）对权利要求1中所述的核酸适体进行偶联改造得到的序列。

3.根据权利要求2所述的核酸适体，其特征在于，所述修饰包括以下修饰方法的至少一种：

（1）磷酸化；

（2）甲基化；

（3）氨基化；

（4）巯基化；

（5）同位素化；

（6）氟化；

（7）用硫取代氧；

（8）用硒取代氧。

4.根据权利要求2所述的核酸适体，其特征在于，所述偶联改造包括以下改造方法的至少一种：

（1）在核酸适体上连接荧光标记物；

（2）在核酸适体上连接放射性物质；

（3）在核酸适体上连接治疗性物质；

（4）在核酸适体上连接生物素；

（5）在核酸适体上连接地高辛；

（6）在核酸适体上连接纳米发光材料；

（7）在核酸适体上连接小肽；

（8）在核酸适体上连接siRNA。

5.一种靶向和拮抗HMGB1分子的核酸适体衍生物，其特征在于，所述衍生物包括以下至少一种：

（1）由权利要求1中所述核酸适体骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架序列；

（2）由权利要求1中所述的核酸适体修饰成的肽核酸序列。

6.权利要求1或2所述核酸适体或权利要求5中所述的核酸适体的衍生物的用途，包括以下至少一种：

（1）在制备特异性识别HMGB1的试剂中的用途；

（2）在制备定性或定量检测HMGB1的试剂中的用途；

（3）在制备HMGB1拮抗剂中的用途；

（4）在制备HMGB1成像剂中的用途；

（5）在制备治疗或辅助治疗炎症的药物中的用途；

（6）在制药中的用途，包括：

偶联药物的用途；

作为药物载体的用途。

7.一种药物成分，其特征在于，包括权利要求1或2所述核酸适体或权利要求6中所述的核酸适体的衍生物。

8.权利要求7所述的药物成分的用途，包括以下至少一种：

（1）在制备治疗或辅助治疗炎症的药物中的用途；

（2）在制备辅助治疗肿瘤的药物中的用途；

（3）在制备调控或辅助调控HMGB1功能的药物中的用途。

9.一种包含核酸适体的试剂，其特征在于，所述核酸适体包括权利要求1-3中任一项所述核酸适体或权利要求5中所述的核酸适体的衍生物；所述试剂包括以下至少一种：

（1）靶向识别HMGB1的试剂；

（2）可以定性或定量检测HMGB1的试剂；

（3）可以中和HMGB1功能的分子；

（4）可以抑制HMGB1功能的抑制剂；

（5）可以抑制HMGB1功能的拮抗剂；

（6）可以结合HMGB1的成像剂。

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