CN110904112B

CN110904112B - 一种白喉毒素的核酸适配体dt03及其应用

Info

Publication number: CN110904112B
Application number: CN201911273734.6A
Authority: CN
Inventors: 吴冬
Original assignee: Fuzhou Changle Baoaidong Medical Technology Co ltd
Current assignee: Fuzhou Changle Baoaidong Medical Technology Co ltd
Priority date: 2019-12-12
Filing date: 2019-12-12
Publication date: 2024-04-02
Anticipated expiration: 2039-12-12
Also published as: CN110904112A

Abstract

本发明涉及一种白喉毒素的核酸适配体DT03及其应用，该核酸适配体DT03的序列为：5'‑GTCGCATGGAAGGAGCGACGGGGTCGGACGCCTGTGCGCCCTCCAACGAACGGGATCCTCCGGGACCGGCGGTCCAAGT‑3'。本发明的白喉毒素核酸适配体DT03能高亲和力、高特异性地与白喉毒素结合，同时作为拮抗剂能有效中和白喉毒素的毒性作用，缓解白喉毒素中毒的临床症状。

Description

一种白喉毒素的核酸适配体DT03及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与白喉毒素特异性结合的高亲和力核酸适配体DT03及其应用。

背景技术

白喉是一种潜在的致命疾病，由白喉棒状杆菌感染及其分泌的强效白喉毒素(DT)引起。白喉棒状杆菌是一种革兰氏阳性细菌，白喉的病原体。白喉毒素的毒性作用主要是介导二磷酸腺苷核糖基化从而抑制延伸因子2(EF-2)，通过形成致病性咽假膜和使局部气道水肿，导致呼吸道等毒素生产部位的组织坏死。血源性白喉毒素播散还可引起颅神经功能障碍、周围神经病变和心脏毒性，这是50-75％白喉病例死亡的原因。

虽然白喉类毒素疫苗的广泛接种已大大降低了白喉病例的发病率，但白喉的威胁还没有消失，白喉仍在部分国家和地区流行。最近在海地、尼日利亚、南非、印度尼西亚、老挝、孟加拉国、也门和印度尼西亚还发生了白喉的周期性暴发，病死率可高达10％。国际旅行和易感人群迁移也加剧了白喉成为全球疾病的风险。为此，我国国家质量监督检验检疫总局就多次发布公告提醒“防范多国白喉疫情传入中国”。因此，对于白喉感染的发生和治疗，我国不应掉以轻心，应做好充分准备。

治疗白喉，最有效的方法是及时注射白喉抗毒素(DAT)以中和白喉毒素并防止进一步的组织损伤，结合抗生素治疗以消除白喉杆菌并停止毒素的产生，可大大降低白喉的发病率和死亡率。目前DAT主要是马源白喉毒素抗体，由于有严重过敏反应的风险，并存在发生血清疾病和某些人畜共患病的危险，许多制造商已经停止生产，全球DAT的供应极为有限。因此，为了应对潜在的白喉发病风险和有效治疗白喉患者，亟需更加安全、高效的可拮抗白喉毒素毒性作用的拮抗剂。

适配体又被称为“合成抗体”、“化学抗体”，其化学本质是一条单链寡核酸分子(ssDNA或RNA)折叠成特定三维结构与靶物质高亲和力和高特异性结合。适配体的获得是通过指数富集配体的系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment，SELEX)的体外筛选过程。核酸适配体具有高亲和力、高特异性、可体外合成、可通过修饰改变其功能及药代动力学特性、无免疫原性、经济等特点。基于上述优势开发的核酸适配体药物可特异性阻断靶标的生物功能，例如作为毒素的中和拮抗剂、细胞因子的抑制剂、阻断转录因子的肿瘤治疗药物等。因此，筛选出高特异性、高亲和力结合白喉毒素的核酸适配体作为其毒性作用的拮抗剂具有重要的科研和临床价值。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种具有高特异性和高亲和力的白喉毒素的核酸适配体DT03；本发明的另一目的在于提供所述核酸适配体DT03在制备样品中白喉毒素的分离富集试剂中、在制备白喉毒素检测试剂或试剂盒中以及在制备中和或拮抗白喉毒素药物中等多方面的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：一种白喉毒素的核酸适配体DT03，它的序列如下所示：

5'-GTCGCATGGAAGGAGCGACGGGGTCGGACGCCTGTGCGCCCTCCAACGAACGGGATCCTCCGGGACCGGCGGTCCAAGT-3'(SEQ ID NO:1)。

所述的白喉毒素的核酸适配体DT03是基于核酸适配体的体外SELEX筛选技术获得，其中利用羧基磁珠作为固相介质，以白喉毒素为靶标，通过白喉毒素磁珠从ssDNA文库中筛选得到与白喉毒素特异性结合的核酸适配体，命名为核酸适配体DT03。

本发明所述的白喉毒素的核酸适配体DT03，在其5’端或3’端可进行荧光基团、氨基、生物素、地高辛或聚乙二醇等化学修饰。

所述的白喉毒素的核酸适配体DT03具有拮抗白喉毒素毒性的作用，可作为一种潜在的白喉毒素的中和拮抗剂。所述的白喉毒素的核酸适配体DT03在制备中和或拮抗白喉毒素药物中的应用。

所述的白喉毒素的核酸适配体DT03在制备样品中白喉毒素的分离富集试剂中的应用。

所述的白喉毒素的核酸适配体DT03在制备白喉毒素检测试剂或试剂盒中的应用。

所述的白喉毒素的核酸适配体DT03还可运用于白喉毒素为效应分子的靶向治疗中。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：

1.本发明的核酸适配体DT03无毒性，分子量小，渗透性好，易于合成与标记。

2.本发明的核酸适配体DT03的合成成本较抗体制备的成本低，且周期短，重现性好。

3.本发明的核酸适配体DT03能高亲和力、高特异性地与白喉毒素结合，解离常数为272.8pM(95％IC：117.8-1249pM)，且它不与其他对照蛋白结合。

4.本发明的核酸适配体DT03在白喉棒状杆菌感染的诊断和治疗，白喉毒素介导的靶向治疗等领域方面具有广阔的应用前景和重要的科学、社会价值，特别是它具有拮抗白喉毒素毒性的作用，可作为潜在的白喉毒素的中和拮抗剂。

附图说明

图1为核酸适配体DT03二级结构的生物信息学模拟图。

图2为荧光结合率实验分析核酸适配体DT03的特异性图。在图2中，横坐标为分析的蛋白，纵坐标为荧光结合率。

图3为荧光结合率实验分析核酸适配体DT03结合白喉毒素的解离常数绘制曲线。解离常数(Kd)为272.8pM(95％IC：117.8-1249pM)。在图3中，横坐标为DNA浓度(pM)，纵坐标为荧光结合率。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：

一种白喉毒素的核酸适配体DT03，它的序列如下：

所述的白喉毒素的核酸适配体DT03，在25℃，100mM Na⁺，1mM Mg²⁺的条件下，其空间结构如下：

所述的白喉毒素的核酸适配体DT03，对所述核酸适配体DT03的5’端或3’端进行包括但不限于荧光基团、氨基、生物素、地高辛、聚乙二醇等化学修饰。

所述的白喉毒素的核酸适配体DT03，对所述核酸适配体DT03做截短或延长或部分碱基替换的结构改造所得到的产物进行包括但不限于荧光基团、氨基、生物素、地高辛、聚乙二醇等化学修饰。

所述的白喉毒素的核酸适配体DT03是基于核酸适配体的体外SELEX筛选技术获得，利用羧基磁珠作为固相介质，以白喉毒素为靶标，通过白喉毒素磁珠从ssDNA文库中筛选得到与白喉毒素特异性结合的核酸适配体。

所述的白喉毒素的核酸适配体DT03的筛选方法，它包括以下步骤：

(1)筛选文库的准备：准备以下序列所示的随机ssDNA文库：

5’-GTCGCATGGAAGGAGCGACGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGGGACCGGCGGTCCAAGT-3’；

(2)将白喉毒素与羧基磁珠偶联制备白喉毒素磁珠；

(3)将ssDNA文库进行热激活处理；

(4)将经步骤(3)后的ssDNA文库与步骤(2)所得的白喉毒素磁珠进行孵育；

(5)磁性分离经步骤(4)后的白喉毒素磁珠，洗去白喉毒素磁珠表面未结合、弱结合及非特异性结合的ssDNA；加热白喉毒素磁珠，收集与白喉毒素磁珠特异性结合的ssDNA，即ssDNA富集文库；

(6)PCR扩增：将步骤(5)所得的ssDNA富集文库进行PCR扩增，其中PCR扩增所用的引物为：

引物DTup：5’-FAM-GTCGCATGGAAGGAGCGACG-3’

引物DTdown：5’-Biotin-ACTTGGACCGCCGGTCCCG-3’；

(7)PCR产物的纯化：利用小片段DNA纯化试剂盒对PCR产物进行纯化；将纯化后的dsDNA与链霉亲和素磁珠进行孵育，结合dsDNA的链霉亲和素磁珠经洗涤、dsDNA解链后，用磁力架分离，收集上清；上清经乙醇沉淀后获得用于下一轮筛选的次级ssDNA文库；

(8)循环筛选：将步骤(7)所得的FAM标记的次级ssDNA文库，作为下一轮筛选的次级文库，并重复步骤(3)～(7)的筛选过程。

实施例一：核酸适配体DT03的筛选

(1)筛选文库的准备：设计ssDNA随机文库,其序列为：5’-GTCGCATGGAAGGAGCGACGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGGGACCGGCGGTCCAAGT-3’，其中包括两端的固定序列区域(5’端20个核苷酸、3’端19个核苷酸)和中间的随机序列区域(40个随机序列核苷酸)，并委托生工生物工程股份有限公司合成。

(2)白喉毒素与羧基磁珠偶联：所述白喉毒素来源于白喉棒状杆菌NCTC10648株，纯度>98％，购自英国The Native Antigen Company公司，所述羧基磁珠及其偶联试剂购自美国Bangs Laboratories公司。白喉毒素与磁珠偶联操作参照制造商提供的说明书。通过BCA法蛋白浓度测定耦联前后白喉毒素溶液中蛋白浓度的变化，经计算磁珠的耦联效率为83％；将白喉毒素磁珠分散于PBS缓冲液中，4℃保存。

(3)取1nmol的ssDNA随机文库溶于500μL选择缓冲液(50mM Tris-HCl，100mMNaCl，1mM MgCl₂，5mM KCl，pH 7.4)，然后经热激活处理。其中，热激活处理的方法为：95℃变性5min后，立即置于冰水浴中冰浴10min，随后置于室温10min。

(4)将经步骤(3)后的ssDNA文库与步骤(2)所得的白喉毒素磁珠(白喉毒素载量为20ng)以及酵母tRNA(摩尔量为ssDNA文库的5倍)在室温孵育1h。

(5)磁性分离经步骤(4)后的白喉毒素磁珠，用含0.2％BSA的选择缓冲液洗去白喉毒素磁珠表面未结合、弱结合及非特异性结合的ssDNA；然后将白喉毒素磁珠用200μLddH₂O重悬，100℃热水浴5min后，置于磁力架1-2min，收集上清，获得与白喉毒素磁珠特异性结合的ssDNA，即ssDNA富集文库。

(6)PCR扩增：将步骤(5)所得的ssDNA富集文库加入到1mL PCRmix中；漩涡振荡混匀后，按每管50μL分装进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性5min后；94℃变性30S，63℃退火30S，72℃延伸30S，15-25个循环。

其中1mL PCRmix中含有：10×PCR缓冲液100μL；pfu酶3μL；dNTP 20μL；引物DTup：5’-FAM-GTCGCATGGAAGGAGCGACG-3’和引物DTdown：5’-Biotin-ACTTGGACCGCCGGTCCCG-3’各3μL；所述引物DTup和引物DTdown均委托生工生物工程股份有限公司合成。

(7)PCR产物的纯化：两端分别标有生物素和荧光基团FAM的PCR产物，使用小片段纯化试剂盒纯化(所述的小片段纯化试剂盒购自生工生物工程股份有限公司)，将纯化后的dsDNA与链霉亲和素磁珠(购自Invitrogen-Dynal公司)在37℃孵育20min，用洗涤缓冲液(5mM Tris-HCl，pH 7.5，1M NaCl，500μM EDTA)洗涤结合dsDNA的链霉亲和素磁珠三次后，用50μL NaOH溶液(0.1M)在37℃孵育30min使dsDNA解链；用磁力架分离，收集上清，上清经乙醇沉淀获得FAM标记的次级ssDNA文库，并溶解于选择缓冲液中，作为下一轮筛选的次级文库。

(8)筛选过程共进行12轮。从第二轮开始，次级文库的用量均为30pmol。

实施例二：核酸适配体DT03序列的获得和分析：

(1)经过12轮筛选后，收集富集的ssDNA文库，并委托北京信诺佰世医学检验所有限公司利用高通量测序技术对文库序列进行分析，分析过程为：PCR扩增富集文库，并加上测序接头和Index部分；通过凝胶电泳选择纯化文库；利用Nanodrop one测量DNA的浓度和纯度进行质控分析；利用Illumina NovaSeq^TM6000平台，以单链文库为模板进行桥式PCR扩增、测序引物退火、边合成边测序；并对测序结果进行比对和富集分析。

(2)根据核酸适配体在文库中的富集程度，选取富集程度高的ssDNA作为候选核酸适配体，其中核酸适配体DT03在富集文库中占比5.1％，它的序列如SEQ ID NO:1所示。

(3)利用UNAFold网络平台分析在25℃，100mM Na⁺，1mM Mg²⁺的条件下，核酸适配体DT03序列的二级结构。分析出核酸适配体DT03序列的二级结构示意图如图1所示。

实施例三：核酸适配体DT03的特异性分析：

(1)体外化学合成FAM标记的核酸适配体DT03，并将其溶于选择缓冲液。

(2)参照实施例一中步骤(2)，将BSA(购自Sigma公司)、百日咳毒素(PTX，购自英国The Native Antigen Company公司)、金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB，购自美国ToxinTechnology公司)分别与羧基磁珠耦联制备BSA磁珠、PTX磁珠、SEB磁珠。

(3)取200μL步骤(1)所得的核酸适配体DT03溶液分别与步骤(2)制得的BSA磁珠、PTX磁珠、SEB磁珠及白喉毒素磁珠混合，在暗盒中室温孵育1h，设空白磁珠为空白对照。

(4)用0.1％PBST洗涤经步骤(3)的上述磁珠3遍，与上述磁珠结合的核酸适配体，用200μL选择缓冲液100℃煮沸5min洗脱。

(5)利用荧光定量仪分别测定初始溶液和洗脱液的荧光强度，计算荧光结合率＝(初始荧光强度-洗脱荧光强度)/初始荧光强度×100％，用计算值初步代表核酸适配体DT03与靶分子的结合率。

如图2所示，核酸适配体DT03与白喉毒素的结合率均显著高于其与BSA、PTX、SEB的结合率，表明核酸适配体DT03与白喉毒素的结合具有较好的特异性。

实施例四：核酸适配体DT03的亲和力分析

(1)取不同浓度的FAM标记核酸适配体DT03溶液分别与白喉毒素磁珠混合，在暗盒中室温孵育1h。

(2)参照实施例三中的步骤(4)和步骤(5)，实验获得并计算不同浓度核酸适配体DT03溶液与白喉毒素磁珠的荧光结合率。

(3)利用荧光结合率的计算值，绘制核酸适配体DT03结合白喉毒素的饱和结合曲线，通过非线性回归分析计算核酸适配体DT03结合白喉毒素的解离常数。

如图3所示，本发明获得了核酸适配体DT03的饱和结合曲线，经计算核酸适配体DT03的解离常数为272.8pM(95％IC：117.8-1249pM)，表明核酸适配体DT03与白喉毒素结合的结合能力强，解离常数在皮摩尔级别。

实施例五：核酸适配体DT03拮抗白喉毒素毒性作用的研究

(1)确定白喉毒素试验剂量：白喉毒素试验剂量的确定，按照美国国立卫生研究院推荐的标准方法，主要方法如下：购买体重250g左右的豚鼠(购买自第900医院动物中心)，在其适应试验环境1d后，按照白喉毒素剂量分组，每组5只，将1IU的白喉抗毒素(DAT)与不同剂量的白喉毒素(DT)混合制备混合物(命名为DAT-DT)，并于室温下孵育至少1h。将DAT-DT于0d每只动物皮下注射，体积为3.0mL。观察豚鼠的身体状况和死亡率，以96h内豚鼠全部死亡的白喉毒素剂量作为试验剂量。经观察，选取最低致死剂量≈4fL(4.0156fL)为试验剂量。

(2)核酸适配体DT03拮抗白喉毒素毒性作用的研究方法：

A、聚乙二醇化适配体DT03的制备：委托生工生物工程股份有限公司合成5’端有氨基修饰、3’端有dT修饰的核酸适配体DT03；然后用40-kDa的聚乙二醇(PEG)对该修饰后的核酸适配体DT03进行聚乙二醇化处理，获得聚乙二醇化核酸适配体DT03(PEG-DT03)，聚乙二醇化过程委托北京键凯科技股份有限公司完成，PEG-DT03经HPLC纯合，备用。

B、核酸适配体DT03的动物模型实验：购买体重250g左右的豚鼠(购买自第900医院动物中心)，在其适应试验环境1d后，按照白喉抗毒素和核酸适配体的剂量分组，每组5只，将不同剂量的聚乙二醇化核酸适配体DT03(PEG-DT03)、白喉抗毒素(DAT)分别与4fL白喉毒素(DT)混合制备混合物(分别命名为PEG-DT03-DT和DAT-DT)，并于室温下孵育至少1h。将PEG-DT03-DT和DAT-DT分别于0d每只动物皮下注射，体积为3.0mL。观察豚鼠的身体状况和死亡率，将观察时间从标准的96h延长至30d，以便对剂量效应进行更大的鉴别，并对毒素暴露后30d出现的毒素诱导的终末器官损伤的迹象进行评估。每天观察动物是否有白喉毒素中毒的迹象，每周测量动物的体重，作为整体健康状况的衡量标准。建立临床症状的数字评分系统：无症状＝0；邋遢的毛皮＝1；昏睡＝2；脱水＝3；拖着一条或两条后腿＝4；垂死的＝5；死亡＝6。濒临死亡的动物或体重较基线下降20％的动物被实施安乐死。

(3)核酸适配体DT03拮抗白喉毒素毒性作用的研究结果：如表1所示，在接受DAT-DT注射动物模型中，所有接受DAT剂量≤1.25IU的豚鼠都死亡，且DAT剂量越低，豚鼠死亡的越早；所有接受DAT剂量≥1.75IU的豚鼠均存活。在接受DAT剂量为1.5IU-1.6IU的豚鼠的生存率可变。在接受PEG-DT03-DT注射动物模型中，所有接受PEG-DT03剂量≤48μg的豚鼠都死亡，且剂量越低，豚鼠死亡的越早；所有接受PEG-DT03剂量≥80μg的豚鼠均存活。在接受PEG-DT03剂量为48-80μg(64μg)时，部分豚鼠死亡，提示核酸适配体DT03与白喉抗毒素的作用相似。此外，观察受试豚鼠的临床症状发现，接受PEG-DT03剂量≥100μg时，所有豚鼠临床表现分数均≤3，说明核酸适配体DT03可作为拮抗剂能有效中和白喉毒素的毒性作用，并可缓解白喉毒素中毒的临床症状。

表1核酸适配体DT03和白喉抗毒素对白喉毒素致死豚鼠模型的保护作用

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干改变、改进和润饰，这些改变、改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 福州市长乐区宝爱冬医学技术有限公司

<120> 一种白喉毒素的核酸适配体DT03及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

gtcgcatgga aggagcgacg gggtcggacg cctgtgcgcc ctccaacgaa cgggatcctc 60

cgggaccggc ggtccaagt 79

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

gtcgcatgga aggagcgacg 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

acttggaccg ccggtcccg 19

Claims

1.一种白喉毒素的核酸适配体DT03，其特征在于：

它的序列如SEQ ID NO：1所示；且在25℃，100mM Na⁺，1mM Mg²⁺的条件下，它的空间结构如下：

2.根据权利要求1所述的白喉毒素的核酸适配体DT03，其特征在于：对所述核酸适配体DT03的5’端或3’端进行荧光基团、氨基、生物素、地高辛或聚乙二醇化学修饰。

3.如权利要求1所述的白喉毒素的核酸适配体DT03在制备样品中白喉毒素的分离富集试剂中的应用。

4.如权利要求1所述的白喉毒素的核酸适配体DT03在制备白喉毒素检测试剂或试剂盒中的应用。

5.如权利要求1所述的白喉毒素的核酸适配体DT03在制备中和或拮抗白喉毒素药物中的应用。