CN107254541A - 用于扩增cfDNA样品中多个目标的NGS建库引物池及应用 - Google Patents

用于扩增cfDNA样品中多个目标的NGS建库引物池及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107254541A
CN107254541A CN201710657832.4A CN201710657832A CN107254541A CN 107254541 A CN107254541 A CN 107254541A CN 201710657832 A CN201710657832 A CN 201710657832A CN 107254541 A CN107254541 A CN 107254541A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
section
pond
universal
specific
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710657832.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107254541B (zh
Inventor
陈梦麟
黄凯铃
骆颖筠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Wande Gene Medical Technology Co Ltd
Original Assignee
Guangzhou Wande Gene Medical Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Wande Gene Medical Technology Co Ltd filed Critical Guangzhou Wande Gene Medical Technology Co Ltd
Priority to CN201710657832.4A priority Critical patent/CN107254541B/zh
Publication of CN107254541A publication Critical patent/CN107254541A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107254541B publication Critical patent/CN107254541B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了用于扩增cfDNA样品中多个目标的NGS建库引物池及应用，引物池中的引物由通用引物段和特异性引物段组成，通用引物段连接在特异性引物的5’端，至少一条引物的通用引物段和特异性引物段之间连接有调整引物Tm的(N)k序列，各引物的Tm值之间的差值不超过10℃。本发明引物池中的引物具有接近的Tm，非特异性扩增比较低，同时易于进一步扩增，可以方便地达到检测目标区域覆盖层数。本发明的方法，可以在同一体系中同时进行上千重PCR，打破了常规多重PCR一般不超过100重的限制。

Description

用于扩增cfDNA样品中多个目标的NGS建库引物池及应用
技术领域
本发明涉及一组用于多重PCR的引物池及其应用，特别涉及用于扩增样品中cfDNA多个目标的NGS建库引物池及其应用。
背景技术
WGS全基因组测序可获得整个基因组的突变、插入、缺失以及拷贝数目等结构变异。然而，由于全基因组数据量巨大，以30X进行测序为例，人类全基因组就会产生超过9OG的测序数据量。而肿瘤等相关的低突变频率，以及插入、缺失、拷贝数等测序，则需要至少5000X层次以上的覆盖度，全基因组测序会产生15T以上的测序数据量。特别是体液标本中肿瘤相关的游离DNA，或者孕妇外周血中源自胎儿的游离DNA含量极低，全基因组的测序量将超过200T。这样大规模的测序数据，显著增加测序的成本，对数据的分析工作造成极大的困难，进而制约测序的应用。因此，在不做任何信号扩增就进行NGS高通量测序，得到的绝大多数信息是正常细胞基因组的信息。在这么强大的背景噪音下，检测的特异性和敏感性就都成问题。不但如此，因为花费大量的人力和财力来做测序得到的99.99％都是无用的信息，相当于高通量地产生垃圾。为解决这个难题，针对高通量测序平台而建立的多重PCR目标区域的捕获与富集技术应运而生。
胎儿或者肿瘤游离DNA的目标区域捕获技术是指通过特定的技术手段，定向捕获目标区域的核酸短片段序列(例如游离DNA片段的长度中位值是165bp)，然后进行建库测序，以达到在对目标区域进行深度测序的目的，同时也使得测序成本与生物信息数据分析成本大大降低。
由于PCR反应很灵敏，PCR的效果很容易受到污染和脱靶效应的影响。我们在设计PCR实验时须得将引物设计、反应条件和酶的选择一一考虑周全。这一点在多重PCR中尤为明显，因为多重PCR需要在一个管中同时检测多个目标。制约多重PCR技术应用的主要因素包括：非特异扩增和引物二聚体的产生，PCR反应的热力学参数Tm选择，以及如何达到检测目标区域覆盖层数的均衡。将多重PCR的扩增产物应用于高通量测序时，这就带来一个更大的难题：高通量测序研究的疾病基因区域通常是很多而且是不连续的，一般研究区域量在上千个，典型的研究区域量有近6000个，在一些临床检测的应用案例上甚至多达两万个。而现在多重PCR技术都是比较广泛应用于长度较小的目标区域的捕获。超大规格的多重PCR技术非常难以实现。
因此，本领域中需要能有效降低非特异扩增和二聚体产生的应用于NGS建库的多重PCR技术出现，PCR引物池的反应温度Tm要求接近，以及检测目标区域的测序层数要求均匀。
发明内容
本发明的目的在于用于扩增cfDNA样品中多个目标的NGS建库引物池及基于其的试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
用于扩增cfDNA样品中多个目标的引物池，引物池中的引物由通用引物段和特异性引物段组成，通用引物段连接在特异性引物的5’端，至少一条引物的通用引物段和特异性引物段之间连接有调整引物Tm的(N)k 序列，各引物的Tm值之间的差值不超过10℃。
作为上述引物池的进一步改进，引物池中引物的结构通式为：
CAPl：通用引物+(N)k +特异性引物，k为1～15之间的整数；
CAP2：通用引物+特异性引物。
作为上述引物池的进一步改进，通用引物段的序列与目的基因不同源。
作为上述引物池的进一步改进，引物池中的引物的通用引物段为：
GSPL：CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO：1)
GSP2：GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO：2)。
作为上述引物池的进一步改进，特异性引物段的碱基个数24～35。
作为上述引物池的进一步改进，特异性引物段的解链温度为62～70℃。
作为上述引物池的进一步改进，特异性引物段的GC含量为50～60％。
作为上述引物池的进一步改进，引物的Tm值基于Santa Lucia热力学参数表的最邻近法计算得到。
一种用于扩增cfDNA样品的多重PCR试剂盒，其特征在于：多重PCR试剂盒使用的引物池如上所示。
一种多重PCR方法，包括使用上述的引物池进行多重PCR扩增。
本发明的有益效果是：
本发明引物池中的引物具有接近的Tm，非特异性扩增比较低，同时易于进一步扩增，可以方便地达到检测目标区域覆盖层数。本发明的方法，可以在同一体系中同时进行上千重PCR，打破了常规多重PCR一般不超过100重的限制。
附图说明
图1是不同引物多重PCR产物的凝胶电泳图；
图2是正常样本和三体样品中13/18/21号染色体的Z值分布情况图。
具体实施方式
用于扩增cfDNA样品中多个目标的引物池，引物池中的引物由通用引物段和特异性引物段组成，通用引物段连接在特异性引物的5’端，至少一条引物的通用引物段和特异性引物段之间连接有调整引物Tm的(N)k 序列，各引物的Tm值之间的差值不超过10℃。
(N)k 序列是不同长度的N碱基序列，用于调整整个引物池的Tm值，保证引物池的整体扩增效率，并提升高通量测序的目标区域覆盖度。对于每个引物池，都从k＝{1..15}之间进行测算，计算增加k个N碱基后的引物池Tm值波动范围以及引物二聚体情况，选择使整体引物池波动最小，同时使得引物二聚体能量最低的k值。引物二聚体能量值采用Breslauer等人提出的，以最接近的相邻核苷酸的动力学数值(自由能)来预测双链稳定性的方法，所有的计算都在25℃条件下进行。无二聚体产生，即在所述多重PCR体系中，同一反应体系内的所有引物两两之间不能形成稳定的二聚体，判定的标准为:Tm(与目标产物)减去Tm(二聚体)≥5℃。无发卡结构产生，即在所述多重PCR体系中任何引物自身都不形成稳定的发卡结构，判定的标准为:Tm(与目标产物)减去Tm(发卡结构)≥5℃，优选Tm(与目标产物)减去Tm(发卡结构)≥10℃。
作为上述引物池的进一步改进，引物池中引物的结构通式为：
CAPl：通用引物+(N)k +特异性引物，k为1～15之间的整数；
CAP2：通用引物+特异性引物。
为避免通用引物引起的非特异性扩增，作为上述引物池的进一步改进，通用引物段的序列与目的基因不同源。
作为上述引物池的进一步改进，引物池中的引物的通用引物段为：
GSPL：CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
GSP2：GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT。
作为上述引物池的进一步改进，特异性引物段的碱基个数24～35。
作为上述引物池的进一步改进，特异性引物段的解链温度为62～70℃。
作为上述引物池的进一步改进，特异性引物段的GC含量为50～60％。
作为上述引物池的进一步改进，引物的Tm值基于Santa Lucia热力学参数表的最邻近法计算得到。虽然Santa Lucia热力学参数表的最邻近法可以计算Tm,但其他方法计算的Tm值可以与之相对应，本领域技术人员可以经过简单的试验比较各种方法计算得到的Tm,从而对各种方法计算的Tm值作出适当选择。
一种用于扩增cfDNA样品的多重PCR试剂盒，其特征在于：多重PCR试剂盒使用的引物池如上所示。
一种多重PCR方法，包括使用上述的引物池进行多重PCR扩增。
引物的设计方式：
根据捕获DNA区域的不同，特异性引物设计方法如下：
1)引物的设计流程首先使用权威软件Primer3(MIT,Cambridge,MA)设计出预选引物组合m1；
2)通过UCSC Genome Browser对m1组合进行本种群的目标扩增区域预测，确认没有发生目标区域的脱靶，从而把m1组合优化为m2组合；
3)通过全基因组BLAST搜索来避免重复序列，通过结构预测来避免高度折叠区域，再通过配对测试来剔除可能的引物二聚体，把m2组合里面的不适合引物剔除，得到引物组合m3；
4)把m3引物组合根据Tm值跨度分为3-5份引物组，对于每个引物组，分别在引物5’端添加不同k长度的N碱基并添加通用引物段，进而把组间Tm值范围调整到9℃以内，把组内Tm值范围调整到5℃以内。
特别的，特异性序列的长度为24～35个碱基，解链温度为62～70℃。进一步的，平均解链温度在65℃以上，如65～70℃间，GC含量控制在50～60％。
多重PCR反应步骤包括如下三步:
1)预变性:95℃维持3.5min；第二步扩增:变性步骤在96-98℃下维持30s、梯度退火在在65℃下维持30s，延伸步骤在72℃下维持30s；
2)扩增根据模板的投入量扩增10-20个循环，退火时间根据扩增目标序列的个数而相应改变；
3)扩增在72℃下延伸5min，在本轮多重PCR反应中，采用梯度退火，退火温度为60～58℃，使每对引物均能与模板高效互补结合，提高扩增效率。
下面结合一个具体实施案例实验，进一步说明本发明的技术方案。
实施例1：利用孕妇外周血检测胎儿染色体非整倍性。用于验证本发明在NIPT(无创产前检测)领域的应用，可正确识别出选自21三体性、13三体性、18三体性以及X单体性的多个染色体非整倍性阳性样品。
一、血样采集与处理
1)对275个孕妇(孕周12周以上)静脉采血5ml外周血。
2)分离血浆：采血管离心1600g，10min。取上清血浆转移至EP管中。将上述EP管16000g离心，10min，枪头对着非白细胞沉淀处，吸取上清。立即进行下一步或者放于-80℃冰箱中保存。
3)使用Qiagen血浆DNA提取试剂盒提取血浆中的cfDNA。
二、区域富集
发明人对上述所提cfDNA按照具体实施方式进行多重PCR扩增，扩增人类基因组上16,000多个短片段用于测试本发明。NIPT无创产前胎儿游离DNA的目标区域富集方法，实验步骤按照具体实施方式的方法进行。
表1:无创产前(NIPT)选择的一万六千个短片段多重PCR扩增的染色体分布
三、大规模测序
使用Illumina测序仪进行测序，测序进行76个循环。整个测序过程按照制造商推荐的步骤进行。测序完成后，结果输出为FASTQ格式文件。
四、测序数据处理
将测序数据上传至无创产前胎儿染色体非整倍性分析平台进行分析。该平台采用大样本常用的z-值(z-score)算法，将reads与人类参考基因组进行比对，然后计算每个样品的每条染色体唯一比对序列数占人类染色体的百分比。z-值这个统计量反应的是当前数值距离平均数的相对标准距离，z-值的应用条件为大样本量以及数据符合正态分布，计算公式如下：
代号解释：
chrN z-score for test sample:所检测样本的z-值；
N：为指定的第N染色体；
％chrNsample：待测样品第N条染色体唯一比对序列数占人类染色体的百分比，通过高通量测序后软件分析获得；
mean％chrNreference：参照样品第N条染色体比例平均值；
S.D.％chrNreference：参照样品第N条染色体比例的标准偏差。
计算结果如图2所示。
根据该算法和正态分布规律，z-值＝3定为参考值分界点。z-值>3则判断为胎儿染色体非整倍体阳性。所有17个阳性样品的z-值均大于3，阳性检出率为100％。
五、选取三个孕妇血浆样品用于以下测试：
扩增产物Tm范围对测序结果的影响：
Tm(目标产物)-Tm(非目标产物)的差值越大，捕获效率和覆盖率越高，Tm(目标产物)-Tm(非目标产物)≥9℃才可达到良好的捕获效率和100×覆盖率。
增加特异性(N)k引物对扩增效率的影响
不同引物多重PCR扩增后的凝胶电泳图如图1所示，图中，
使用不含(N)k引物段扩增的样品A：A1；使用不含(N)k引物段扩增的样品B：B1使用不含(N)k引物段扩增的样品C：C1；使用含有(N)k引物段扩增的样品A：A2使用含有(N)k引物段扩增的样品B：B2；使用含有(N)k引物段扩增的样品C：C2；从图中可以看出，所建的高通量测序文库的目标条带更专一，浓度更高。
增加特异性(N)k引物对测序区域覆盖的影响：
扩增引物特点 10M reads下的目标区域覆盖度
使用不含(N)k引物段扩增的样品A：A1 86.24％
使用不含(N)k引物段扩增的样品B：B1 79.58％
使用不含(N)k引物段扩增的样品C：C1 88.50％
使用含有(N)k引物段扩增的样品A：A2 94.55％
使用含有(N)k引物段扩增的样品B：B2 93.13％
使用含有(N)k引物段扩增的样品C：C2 96.25％
表中的数据表明，含有(N)k引物段扩增的样品，所获得的目标区域覆盖度越大，也就是能够检测的目标DNA更全面。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州万德基因医学科技有限公司
<120> 用于扩增cfDNA样品中多个目标的NGS建库引物池及应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 1
ctttccctac acgacgctct tccgatct 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 2
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatct 28

Claims (10)

1.用于扩增cfDNA样品中多个目标的引物池，引物池中的引物由通用引物段和特异性引物段组成，通用引物段连接在特异性引物的5’端，至少一条引物的通用引物段和特异性引物段之间连接有调整引物Tm的(N)k 序列，各引物的Tm值之间的差值不超过10℃。
2.根据权利要求1所述的引物池，其特征在于：引物池中引物的结构通式为：
CAPl：通用引物+(N)k +特异性引物，k为1～15之间的整数；
CAP2：通用引物+特异性引物。
3.根据权利要求1或2所述的引物池，其特征在于：通用引物段的序列与目的基因不同源。
4.根据权利要求1或2所述的引物池，其特征在于：引物池中的引物的通用引物段为：
GSPL：CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
GSP2：GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT。
5.根据权利要求1所述的引物池，其特征在于：特异性引物段的碱基个数24～35。
6.根据权利要求1所述的引物池，其特征在于：特异性引物段的解链温度为62～70℃。
7.根据权利要求1所述的引物池，其特征在于：特异性引物段的GC含量为50～60％。
8.根据权利要求1所述的引物池，其特征在于：引物的Tm值基于Santa Lucia热力学参数表的最邻近法计算得到。
9.一种用于扩增cfDNA样品的多重PCR试剂盒，其特征在于：多重PCR试剂盒使用的引物池如权利要求1～7任一项所示。
10.一种多重PCR方法，包括使用权利要求1～7任一项所述的引物池进行多重PCR扩增。
CN201710657832.4A 2017-08-03 2017-08-03 用于扩增cfDNA样品中多个目标的NGS建库引物池及应用 Active CN107254541B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710657832.4A CN107254541B (zh) 2017-08-03 2017-08-03 用于扩增cfDNA样品中多个目标的NGS建库引物池及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710657832.4A CN107254541B (zh) 2017-08-03 2017-08-03 用于扩增cfDNA样品中多个目标的NGS建库引物池及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107254541A true CN107254541A (zh) 2017-10-17
CN107254541B CN107254541B (zh) 2020-05-08

Family

ID=60026567

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710657832.4A Active CN107254541B (zh) 2017-08-03 2017-08-03 用于扩增cfDNA样品中多个目标的NGS建库引物池及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107254541B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109706233A (zh) * 2018-12-28 2019-05-03 广州精科医学检验所有限公司 一种复杂长片段核酸序列的扩增技术
CN110144383A (zh) * 2019-05-08 2019-08-20 中国科学院植物研究所 利用多重pcr富集目标dna片段的方法
CN110144387A (zh) * 2019-05-08 2019-08-20 中国科学院植物研究所 一种多重pcr方法
CN110218811A (zh) * 2019-05-08 2019-09-10 中国科学院植物研究所 一种筛选水稻突变体的方法
CN111621599A (zh) * 2020-06-12 2020-09-04 武汉菲沙基因信息有限公司 一种基于新冠病毒的全基因组全长扩增的三代建库测序方法
CN112687337A (zh) * 2020-12-31 2021-04-20 广州市金圻睿生物科技有限责任公司 超多重引物设计方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4001433A1 (en) * 2020-11-20 2022-05-25 Université de Paris A method for determining the level of dna integrity

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003052372A (ja) * 2001-07-27 2003-02-25 Unitech Kk 簡易ｓｎｐ検出法（ｓｓｄ）
CN1496413A (zh) * 2003-05-09 2004-05-12 清华大学 用于多重pcr条件优化的方法和组分
CN102943109A (zh) * 2012-10-08 2013-02-27 上海翼和应用生物技术有限公司 一种基于串联多内对照的检测拷贝数变异的方法
CN105441580A (zh) * 2016-01-26 2016-03-30 绍兴华因生物科技有限公司 检测杂合性dmd基因缺失的方法及所用引物
CN105525009A (zh) * 2016-01-26 2016-04-27 绍兴华因生物科技有限公司 检测杂合性brca1/2基因缺失的方法及所用引物
CN105602939A (zh) * 2015-09-02 2016-05-25 序康医疗科技（苏州）有限公司 扩增dna的方法
CN105861724A (zh) * 2016-06-03 2016-08-17 人和未来生物科技（长沙）有限公司 一种kras基因超低频突变检测试剂盒
CN105925678A (zh) * 2016-05-06 2016-09-07 艾吉泰康生物科技(北京)有限公司 用于扩增样品中多个目标dna序列的引物组及其应用
CN105925675A (zh) * 2016-04-26 2016-09-07 序康医疗科技（苏州）有限公司 扩增dna的方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003052372A (ja) * 2001-07-27 2003-02-25 Unitech Kk 簡易ｓｎｐ検出法（ｓｓｄ）
CN1496413A (zh) * 2003-05-09 2004-05-12 清华大学 用于多重pcr条件优化的方法和组分
CN102943109A (zh) * 2012-10-08 2013-02-27 上海翼和应用生物技术有限公司 一种基于串联多内对照的检测拷贝数变异的方法
CN105602939A (zh) * 2015-09-02 2016-05-25 序康医疗科技（苏州）有限公司 扩增dna的方法
CN105441580A (zh) * 2016-01-26 2016-03-30 绍兴华因生物科技有限公司 检测杂合性dmd基因缺失的方法及所用引物
CN105525009A (zh) * 2016-01-26 2016-04-27 绍兴华因生物科技有限公司 检测杂合性brca1/2基因缺失的方法及所用引物
CN105925675A (zh) * 2016-04-26 2016-09-07 序康医疗科技（苏州）有限公司 扩增dna的方法
CN105925678A (zh) * 2016-05-06 2016-09-07 艾吉泰康生物科技(北京)有限公司 用于扩增样品中多个目标dna序列的引物组及其应用
CN105861724A (zh) * 2016-06-03 2016-08-17 人和未来生物科技（长沙）有限公司 一种kras基因超低频突变检测试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLACKET MJ ET,AL: "Universal primers for fluorescent labelling of PCR fragments--an efficient and cost-effective approach to genotyping by fluorescence.", 《MOL ECOL RESOUR. 》 *
王勤熙 等: "基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析平台的构建、优化及其应用", 《遗传》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109706233A (zh) * 2018-12-28 2019-05-03 广州精科医学检验所有限公司 一种复杂长片段核酸序列的扩增技术
CN110144383A (zh) * 2019-05-08 2019-08-20 中国科学院植物研究所 利用多重pcr富集目标dna片段的方法
CN110144387A (zh) * 2019-05-08 2019-08-20 中国科学院植物研究所 一种多重pcr方法
CN110218811A (zh) * 2019-05-08 2019-09-10 中国科学院植物研究所 一种筛选水稻突变体的方法
CN111621599A (zh) * 2020-06-12 2020-09-04 武汉菲沙基因信息有限公司 一种基于新冠病毒的全基因组全长扩增的三代建库测序方法
CN112687337A (zh) * 2020-12-31 2021-04-20 广州市金圻睿生物科技有限责任公司 超多重引物设计方法
CN112687337B (zh) * 2020-12-31 2023-08-08 广州市金圻睿生物科技有限责任公司 超多重引物设计方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN107254541B (zh) 2020-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107254541A (zh) 用于扩增cfDNA样品中多个目标的NGS建库引物池及应用
US11111541B2 (en) Diagnostic MiRNA markers for Parkinson&#39;s disease
CN105087789B (zh) 一种检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的方法
Morrissy et al. Next-generation tag sequencing for cancer gene expression profiling
JP2019517774A (ja) 核酸を濃縮及びキャプチャーするためのプローブと設計方法
CN103060924A (zh) 微量核酸样本的文库制备方法及其应用
CN106834530A (zh) 引物、试剂盒以及检测hbb基因序列的方法
US10407720B2 (en) Methods for full-length amplification of double-stranded linear nucleic acids of unknown sequences
KR102356073B1 (ko) 차세대서열결정법을 이용한 표적 단백질의 집단적 정량 방법과 그 용도
CN106520917A (zh) 一种基因的大片段缺失/重复检测的方法
KR20190116989A (ko) Hla 유전자를 위한 pcr 프라이머 세트, 및 이를 이용한 서열 분석 방법
CN108103168A (zh) 一种ffpe样本中dna质量的评估方法
CN103571822A (zh) 一种用于新一代测序分析的多重目的dna片段富集方法
KR20180041331A (ko) 분자결합핵산 선정과 표적분자 동정 방법 및 키드, 그리고 그들의 용도
CN103923987A (zh) 一种基于高通量测序检测13、18、21三体综合征的方法
CN104450872A (zh) 一种高通量多样本多靶点单碱基分辨率的甲基化水平检测方法
CN106591425A (zh) 基于连接反应的多重靶向检测核酸指标的方法
CN108103143A (zh) 一种目标区域多重pcr与快速文库构建的方法
CN105296466A (zh) 一种单细胞全基因组扩增方法
Andersson et al. Principles of digital sequencing using unique molecular identifiers
CN108060218A (zh) 核酸测序文库中预定范围的核酸片段的筛选方法
KR101746600B1 (ko) 복수의 miRNA의 정량적 동시 검출 방법
CN109722471A (zh) 改善文库滚环复制效率均一性的方法、文库构建方法及试剂盒
CN114144188B (zh) 放大及检测核糖核酸(rna)片段的方法
CN114317685B (zh) 用于检测mRNA可变剪切变异的试剂盒、建库方法和测序方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant