KR102356073B1 - 차세대서열결정법을 이용한 표적 단백질의 집단적 정량 방법과 그 용도 - Google Patents

차세대서열결정법을 이용한 표적 단백질의 집단적 정량 방법과 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 차세대서열결정법을 이용한 표적 단백질의 집단적 정량 방법을 개시한다. 본 발명의 방법은 (a) 분석 대상 시료에, 그 시료에 존재하는 표적 단백질 집단에 압타머 라이브러리를 처리하여, 각 표적 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 각 압타머 사이의 복합체를 형성시킴으로써, 표적 단백질과 압타머 사이의 복합체 집단을 형성시키는 단계와, (b) 상기 복합체 집단을 비결합 압타머로부터 분리하는 단계와, (c) 상기 복합체 집단의 각 압타머의 서열을 차세대서열분석 기술로 분석하여 그 복합체 집단의 각 압타머를 정량함으로써 상기 복합체 집단의 각 표적 단백질을 정량하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법은 분석 시료 중의 단백질들을 집단적으로 정량하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

차세대서열결정법을 이용한 표적 단백질의 집단적 정량 방법과 그 용도{Method for Quantitatively Analyzing Protein Population Using Next Generation Sequencing and Use Thereof}
본 발명은 차세대서열결정법을 이용한 표적 단백질의 집단적 정량 방법과 그 용도에 관한 것이다.
시료를 구성하는 다중의 단백질을 분석하는 기술, 시료에　포함된 단백질들의 정량 및 양적인 상태를 종합화한 정보, 즉 단백질의 프로파일(profile)을 생산하는 기술과 표적분자를 동정하는 기술은 물리학, 생화학 및 생물정보학의 발달로 널리 개발되었으나, 기존 방법이나 기기의 사용 및 유지비, 용이성, 정확도, 민감도, 검사시간 및 과정의 자동화 등에 대한 문제로 효율적인 새로운 방법 및 기기에 대한 필요성이 매우 높다.
최근에, 2-D 겔 전기영동 및 질량 분석 검정이 개발되었으며 소량 포함된 혈장 성분들의 측정을 가능하게 하였다. 그러나 고농도로 존재하는 단백질의 혈장/혈청을 제거하는 노동집약적 예비분류 프로토콜의 수행이 요구된다(Anderson, Proteomics (3005); Anderson and Anderson, Electrophoresis (1991); Gygi and Aebersold, Curr Opin Chem Biol (3000); Liotta, et al., JAMA (3001); Yates, Trends Genet (3000); and Adkin, et al., Mol Cell Proteomics (3002) 참조). 또한, 이런 검정들은 시간 소비적이고, 이들 방법을 수행하기 위해 필수 장비들을 구입하고 유지하는데 비용이 많이 든다.
생체시료의 프로테옴, 예를 들어 혈장 프로테옴이 질병 진단 및 치료적 모니터링을 위해 편리한 표본으로서 매우 유망하지만, 기존 검정 및 기술이 감도 제한, 시간 및 효율 제한, 및 관련된 과도할 수 있는 비용을 포함하는 여러 결점을 갖는다. 또한, 기존 검정 및 기술은 바이오마커를 위해 원료로서 생체시료을 충분히 이용하지 못한다. 예를 들어, 전기영동 및 질량분석 모두는 단백질 크기 및 전하에 기초하여 혈장 단백질을 분리하지만, 단백질의 기타 물성에 기초한 검정 및 기술이 결여되어 있다. 시료의 프로테오믹 프로파일을 수득하고 이용하는 방법에 대한 요구가 당업계에 있고, 상기-언급된 기존 기술의 단점들을 극복하기 위해 노력하고 있다.
압타머(aptamer)는 표적 단백질들에 대해 높은 특이적 결합성을 가지는, 표적 화합물 또는 단백질에　대한 특이적 단일가닥핵산인 리간드이다. 압타머의 제조방법으로는, "SELEX"(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)" 방법이 널리 사용되고 있다. SELEX(셀렉스) 방법은 표적분자에 높은 특이적 결합성을 가진 핵산 단백질의 생체외 전개에 관한 방법으로, 1990. 6. 11 출원의 미국특허 출원 제07/536,428호(현재 포기), 미국특허 제5,475,096호(발명의 명칭: "Nucleic Acid Ligands") 및 미국특허 제5,270,163호(발명의 명칭: "Nucleic Acid Ligands") 등에 기재되어 있다.
SELEX 방법은, 핵산이 다양한 2 차원 및 3 차원 구조를 형성하기에 충분한 능력과, 실질적으로 임의의 화학적 화합물(단량체 또는 중합체 상관없이)에　대해 리간드로서 작용(즉, 특이적 결합 쌍을 형성)하기에 충분한, 단량체 내에서 이용 가능한 화학적 다기능성(chemical versatility)을 보유한다는 것을 바탕으로 한다. 임의의 크기 또는 조성을 갖는 단백질이 표적분자로 이용될 수 있다. 압타머는 매우 유용한 리간드로 많이 연구되고 있으나, 압타머의 일반적인 선별방법은 기지 단백질 혹은 물질을 대상으로 실시되는 한계가 있다.
본 발명자는 미지단백질 또는 기지단백질을 포함하는 복합시료를 대상으로 단백질에 결합하는 단일가닥핵산(분자결합핵산)을 선발하고 분자결합핵산에 결합하는 표적분자를 정량하는 방법 등을 제안하였다. 즉, 단백체에 대한 프로파일을 생산하는 Reverse-SELEX(대한민국 특허등록 제10-0670799호 참조), 분자결합핵산기반 바이오칩 (대한민국 특허등록 제10-0464225 참조), 분자결합핵산기반 바이오칩을 이용한 생물학적 의미 분석 기술(대한민국 특허등록 제10-0924048호 참조)을 수행함에 있어서, 단일가닥핵산을 이용하여 프로테오믹 프로파일을 생산하는 방법 및 생체시료를　구성하는　다중의　단백질에 결합한 분자결합핵산의 선정하는　방법 등을 제시하였다.
본 발명은 차세대서열분석 기술(Next Generation Sequencing, NGS)을 이용하여 시료 중의 단백질을 집단적으로 정량하는 방법 등을 개시한다.
본 발명의 목적은 분석 대상 시료 중의 표적 단백질의 집단적 정량 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 2개 이상의 분석 대상 시료 중의 표적 단백질을 집단적으로 정량하고 비교함에 의해 바이오마커 후보 단백질을 선별할 수 있는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 분석 대상 시료 중의 표적 단백질과 표적 핵산의 동시 분석 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
일 측면에 있어서, 본 발명은, (a) 분석 대상 시료에, 그 시료에 존재하는 표적 단백질 집단에 압타머 라이브러리를 처리하여, 각 표적 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 각 압타머 사이의 복합체를 형성시킴으로써, 표적 단백질과 압타머 사이의 복합체 집단을 형성시키는 단계와, (b) 상기 복합체 집단을 비결합 압타머로부터 분리하는 단계와, (c) 상기 복합체 집단의 각 압타머의 서열을 차세대서열분석 기술(Next Generation Sequencing, NGS)로 분석하여 그 복합체 집단의 각 압타머를 정량함으로써 상기 복합체 집단의 각 표적 단백질을 정량하는 단계를 포함하는, 분석 대상 시료 중의 표적 단백질 집단적 정량 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 압타머 라이브러리는, (i) 무작위 서열을 가져 다양한 단백질들에 대한 잠재적 결합 능력을 가진 압타머 풀을 제작하고, (ii) 이 압타머 풀을 상기 (a) 단계에서와 동일한 분석 대상 시료의 표적 단백질 집단과 반응시켜 각 압타머와 각 표적 단백질 사이에 특이적 결합을 유도하여 복합체 집단을 형성시키고, (iii) 비결합한 압타머를 제외시켜 그 복합체 집단을 분리하고, (iv) 그 복합체 집단의 압타머를 증폭하여 얻어질 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 압타머 라이브러리는 이를 구성하는 각 압타머가 공통적으로 5'영역과 3'영역이 기지의 서열을 가진 보존영역을 가지고, 그 중간 영역은 임의의 무작위 서열을 가진 가변영역을 가질 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 분석 대상 시료는 그 시료 중에 많은 양으로 존재하는 단백질을 제거한 가공시료일 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 (c) 단계는 상기 복합체 집단의 압타머로부터 이중가닥 DNA 집단을 제조하고 그 이중가닥 DNA 집단을 차세대서열분석 기술로 분석하여 수행될 수 있다. 여기서 상기 압타머 라이브러리는 이를 구성하는 각 압타머가 공통적으로 5'영역과 3'영역이 기지의 서열을 가진 보존영역을 가지고, 그 중간 영역은 임의의 무작위 서열을 가진 가변영역을 가짐으로써, 상기 이중가닥 DNA 집단의 제조는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 1 세트로 수행될 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 상기 압타머 라이브러리가 처리되기 전의 분석 대상 시료에, 그 시료에는 존재하지 않는 2종 이상의 외부 표준단백질을 정량하여 서로 다른 정량값(즉 농도)으로 첨가하고, 상기 (a) 단계의 압타머 라이브러리는 그 외부 표준단백질에 대한 압타머를 추가로 포함하는 압타머 라이브러리를 사용함으로써, 상기 (c) 단계에서의 표적 단백질의 정량은 상기 외부 표준단백질에 대한 압타머의 정량 결과를 표적 단백질에 대한 압타머의 정량 결과와 함께 얻고, 그 외부 표준단백질의 압타머 정량 결과를 표적 단백질의 압타머의 정량 결과와 비교하여 이루어질 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 압타머는 DNA 단일가닥핵산 또는 RNA 단일가닥핵산일 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 표적 단백질 집단은 미지의 단백질 집단, 기지의 단백질 집단 또는 미지의 단백질과 기지의 단백질의 혼합된 집단일 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 표적 단백질 집단 중의 특정 단백질이 미지의 단백질일 경우 압타머 라이브러리에 포함되어 있는 상기 미지의 단백질에 대한 특이적인 압타머를 이용하여 그 미지의 단백질을 분리하고 동정하는 단계가 추가로 포함될 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 (c) 단계의 정량은 각 압타머에 대한 동일한 서열을 가진 리드(read)를 계수함과 함께, 차세대서열분석 기술의 에러율이 반영되어 상기 리드와 동일한 서열로 간주할 수 있는 서열을 계수하고, 이를 상기 리드에 대한 계수값과 합산하여 그 합산값으로 표적 단백질을 정량하여 이루어질 수 있다. 이러한 리드 등의 계수는 상기 압타머 라이브러리를 구성하는 각 압타머의 서열을 분석하여 얻어진 각 압타머에 대한 기지의 서열을 참조서열로 사용하여, 이 참조서열과 상기 복합체 집단의 각 압타머의 서열의 분석 결과와 비교하여 이루어질 수 있다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 (a) 분석 대상 시료에, 그 시료에 존재하는 표적 단백질 집단에 특이적인 압타머 라이브러리를 처리하여, 각 표적 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 각 압타머 사이의 복합체를 형성시킴으로써, 표적 단백질과 압타머 사이의 복합체 집단을 형성시키는 단계와, (b) 상기 복합체 집단을 비결합 압타머로부터 분리하는 단계와, (c) 상기 복합체 집단의 각 압타머의 서열을 분석하여 그 복합체 집단의 각 압타머를 정량함으로써 상기 복합체 집단의 각 표적 단백질을 정량하는 단계를 포함하되, (i) 상기 (a) 내지 (c) 단계를 상기 분석 대상 시료와는 다른 분석 대상 시료에 대해서 동일하게 수행하는 단계와, (ii) 상기 2가지 분석 대상 시료 사이에 상기 (c) 단계를 통하여 얻어진 각 표적 단백질의 정량 결과를 비교하여 정량 결과의 차이가 있는 하나 이상의 표적 단백질을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 바이오마커로서 후보 단백질의 선별 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 압타머 라이브러리는 상기 2가지 분석 대상 시료에 대해서 동일한 압타머 라이브러리가 사용될 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 압타머 라이브러리는 상기 2가지 분석 대상 시료에 대해서 동일한 압타머 라이브러리가 사용되되, 그 압타머 라이브러리는 (i) 무작위 서열을 가져 다양한 단백질들에 대한 잠재적 결합 능력을 가진 압타머 풀을 제작하고, (ii) 이 압타머 풀을 상기 2가지 분석 대상 시료 중 어느 한 가지 시료의 표적 단백질 집단과 반응시켜 각 압타머와 각 표적 단백질 사이에 특이적 결합을 유도하여 복합체 집단을 형성시키고, (iii) 비결합한 압타머를 제외시켜 그 복합체 집단을 분리하고, (iv) 그 복합체 집단의 압타머를 증폭하여 얻어질 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 압타머 라이브러리는 이를 구성하는 각 압타머가 공통적으로 5'영역과 3'영역이 기지의 서열을 가진 보존영역을 가지고, 그 중간 영역은 임의의 무작위 서열을 가진 가변영역을 가질 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 2가지 분석 대상 시료는 그 각 시료 중에 많은 양으로 존재하는 단백질을 제거한 가공시료일 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 (c) 단계는 상기 복합체 집단의 압타머로부터 이중가닥 DNA 집단을 제조하고 그 이중가닥 DNA 집단을 차세대서열분석 기술로 분석하여 수행될 수 있다. 여기서 상기 압타머 라이브러리는 이를 구성하는 각 압타머가 공통적으로 5'영역과 3'영역이 기지의 서열을 가진 보존영역을 가지고, 그 중간 영역은 임의의 무작위 서열을 가진 가변영역을 가짐으로써, 상기 이중가닥 DNA 집단의 제조는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 1 세트로 수행될 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 상기 압타머 라이브러리가 처리되기 전의 분석 대상 시료에, 그 시료에는 존재하지 않는 2종 이상의 외부 표준단백질을 정량하여 서로 다른 정량값으로 첨가하고, 상기 (a) 단계의 압타머 라이브러리는 그 외부 표준단백질에 대한 압타머를 추가로 포함하는 압타머 라이브러리를 사용함으로써, 상기 (c) 단계에서 상기 외부 표준단백질에 대한 압타머의 정량 결과를 표적 단백질에 대한 압타머의 정량 결과와 함께 얻고, 그 외부 표준단백질의 압타머 정량 결과를 표적 단백질의 압타머의 정량 결과와 비교하여 표적 단백질을 정량하고, 상기 (i) 단계에서도 상기 압타머 라이브러리가 처리되기 전의 상기 다른 분석 대상 시료에, 그 시료에는 존재하지 않는 2종 이상의 외부 표준단백질을 정량하여 서로 다른 정량값으로 첨가하고, 상기 압타머 라이브러리는 그 외부 표준단백질에 대한 압타머를 추가로 포함하는 압타머 라이브러리를 사용함으로써, 상기 외부 표준단백질에 대한 압타머의 정량 결과를 표적 단백질에 대한 압타머의 정량 결과와 함께 얻고, 그 외부 표준단백질의 압타머 정량 결과를 표적 단백질의 압타머의 정량 결과와 비교하여 표적 단백질을 정량하며, 상기 (ii) 단계는 상기 2가지 분석 대상 시료의 표적 단백질 정량 결과를 비교하여 이루어질 수 있으며, 여기서 상기 2가지 분석 대상 시료에 첨가되는 상기 외부 표준단백질은 서로 동일한 단백질인 것이 바람직하다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 압타머는 DNA 단일가닥핵산 또는 RNA 단일가닥핵산인 것이 바람직하다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 표적 단백질 집단은 미지의 단백질 집단, 기지의 단백질 집단 또는 미지의 단백질과 기지의 단백질의 혼합된 집단일 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 표적 단백질 집단 중의 특정 단백질이 미지의 단백질일 경우, 압타머 라이브러리에 포함되어 있는 상기 미지의 단백질에 대한 특이적인 압타머를 이용하여 그 미지의 단백질을 분리하고 동정하는 단계가 추가로 포함될 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 (c) 단계의 정량과 (i) 단계의 정량은 각 압타머에 대한 동일한 서열을 가진 리드(read)를 계수함과 함께 차세대서열분석 기술의 에러율이 반영되어 상기 리드와 동일한 서열로 간주할 수 있는 서열을 계수하고, 이를 상기 리드의 계수값과 합산하여 그 합산값으로 표적 단백질을 정량하여 이루어질 수 있다. 여기서도 이미 서열이 결정된 참조서열을 리드 등의 계수에 사용할 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 (a) 2가지 분석 대상 시료인 시험시료와 비교시료 각각에, 이들 시료 중 어느 하나 시료의 표적 단백질 집단에 특이적인 압타머 라이브러리를 처리하여, 각 시료에 대해서 각 시료의 표적 단백질 집단의 각 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 각 압타머 사이의 복합체를 형성시킴으로써, 표적 단백질과 압타머 사이의 복합체 집단을 형성시키고, 각 시료에 대해서 그 복합체 집단만을 비결합 압타머로부터 분리한 후, 각 시료에 대해서 그 분리한 복합체 집단의 압타머를 이중가닥 DNA 집단으로 전환시키는 단계, (b) 상기 시험시료와 비교시료 각 시료에서 얻어진 이중가닥 DNA 집단 사이에서 공통적으로 존재하는 이중가닥 DNA를, 시험시료에서 얻어진 이중가닥 DNA 집단으로부터 제거하는 단계, 및 (c) 상기 공통적으로 존재하는 이중가닥 DNA가 제거된 시험시료의 나머지 이중가닥 DNA을 차세대서열분석 기술로 분석하여 그 집단 중 각 이중가닥 DNA 서열을 분석함과 함께 각 이중가닥 DNA의 양(abundance)을 얻는 단계를 포함하는 바이오마커로서 후보 단백질의 선별 방법을 제공한다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 (c) 단계는 나머지 이중가닥 DNA를 증폭하고 그 증폭물을 차세대서열분석 기술로 분석함으로써 이루어질 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 (b) 단계는 SSH(Suppression subtractive hybridization) 방법 또는 DSN(duplex-specific nuclease) 방법으로 수행될 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 (a) (i) 분석 대상 시료에서 표적 단백질 집단이 포함된 단백질 시료를 획득하고, 그 획득한 단백질 시료와, 그 단백질 시료 중의 표적 단백질 집단에 특이적인 압타머 라이브러리를 처리하여, 각 표적 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 각 압타머 사이의 복합체를 형성시킴으로써, 표적 단백질과 압타머 사이의 복합체 집단을 형성시키고, 그 복합체 집단만을 비결합 압타머로부터 분리한 후, 그 분리한 복합체 집단의 압타머를 이중가닥 DNA로 전환시키는 단계, (ii) 상기 분석 대상 시료와 동일한 분석 대상 시료에서 표적 핵산이 포함된 핵산 시료를 얻고 그 핵산 시료 중의 표적 핵산을 이중가닥 DNA 단편으로 전환시키는 단계, (b) 상기 압타머로부터 유래한 이중가닥 DNA와 상기 표적 핵산으로부터 유래한 이중가닥 DNA 단편을 혼합하는 단계, 및 (c) 이 혼합물의 각 이중가닥 DNA의 서열을 차세대서열분석 기술로 분석하여 각 이중가닥 DNA 서열 정보를 얻음과 함께 각 이중가닥 DNA의 양(abundance)을 결정하는 단계를 포함함으로써, 표적 단백질과 정량 및 표적 핵산의 서열분석과 정량을 동시 수행할 있는 것을 특징으로 하는 분석 대상 시료 중의 표적 핵산과 표적 단백질의 동시분석 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 표적 핵산은 gDNA, RNA 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 gDNA는 서열 결실, 서열 삽입, 단일염기다형성(SNP) 및 메틸화 시토신 중 하나 이상을 가진 gDNA일 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 RNA는 mRNA, pre-mRNA, ncRNA(noncoding RNA) 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 표적 단백질은 기지의 단백질 또는 미지의 단백질이고, 상기 표적 핵산도 기지의 핵산 또는 미지의 핵산일 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 압타머의 이중가닥 DNA나 핵산의 이중가닥 DNA 단편으로부터 시퀀싱 라이브러리(Sequencing library)를 제조하고, 상기 (b) 단계는 상기 시퀀싱 라이브러리를 혼합함으로써 이루어질 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 상기 압타머 라이브러리가 처리되기 전의 분석 대상 시료에, 그 시료에는 존재하지 않는 2종 이상의 외부 표준단백질을 정량하여 서로 다른 정량값으로 첨가하고, 상기 (a) 단계의 압타머 라이브러리는 그 외부 표준단백질에 대한 압타머를 추가로 포함하는 압타머 라이브러리를 사용함으로써, 상기 (c) 단계의 표적 단백질의 정량은 상기 외부 표준단백질에 대한 압타머의 정량 결과를 표적 단백질에 대한 압타머의 정량 결과와 함께 얻고, 그 외부 표준단백질의 압타머 정량 결과를 표적 단백질의 압타머의 정량 결과와 비교하여 이루어질 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 상기 핵산 시료를 얻기 전의 분석 대상 시료에, 그 시료에는 존재하지 않는 2종 이상의 외부 표준핵산을 정량하여 서로 다른 정량값으로 첨가하고, 상기 (c) 단계의 표적 핵산의 정량은 상기 외부 표준핵산에 대한 정량 결과를 표적 핵산에 대한 정량 결과와 함께 얻고, 그 외부 표준핵산의 정량 결과를 표적 핵산의 정량 결과와 비교하여 이루어질 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 표적핵산은 특히 pre mRNA 또는 mRNA일 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 압타머 라이브러리는, (i) 무작위 서열을 가져 다양한 단백질들에 대한 잠재적 결합 능력을 가진 압타머 풀을 제작하고, (ii) 이 압타머 풀을 상기 (a) 단계에서와 동일한 분석 대상 시료의 표적 단백질 집단과 반응시켜 각 압타머와 각 표적 단백질 사이에 특이적 결합을 유도하여 복합체 집단을 형성시키고, (iii) 비결합한 압타머를 제외시켜 그 복합체 집단을 분리하고, (iv) 그 복합체 집단의 압타머를 증폭하여 얻어질 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 압타머 라이브러리는 이를 구성하는 각 압타머가 공통적으로 5'영역과 3'영역이 기지의 서열을 가진 보존영역을 가지고, 그 중간 영역은 임의의 무작위 서열을 가진 가변영역을 가질 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 분석 대상 시료는 그 시료 중에 많은 양으로 존재하는 단백질을 제거한 가공시료일 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 핵산 시료는 rRNA가 제거된 핵산 시료일 수 ㅇ있.
또 상기 방법에 있어서, 상기 압타머 라이브러리는 이를 구성하는 각 압타머가 공통적으로 5'영역과 3'영역이 기지의 서열을 가진 보존영역을 가지고, 그 중간 영역은 임의의 무작위 서열을 가진 가변영역을 가짐으로써, 상기 이중가닥 DNA 집단의 제조는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 1 세트로 수행될 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 압타머는 DNA 단일가닥핵산 또는 RNA 단일가닥핵산일 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 표적 단백질은 미지의 단백질, 기지의 단백질 또는 미지의 단백질과 기지의 단백질의 혼합물이다.이다.이다. 바람직하게는, 상기 표적 단백질 집단 중의 특정 단백질이 미지의 단백질일 경우 압타머 라이브러리에 포함되어 있는 상기 미지의 단백질에 대한 특이적인 압타머를 이용하여 그 미지의 단백질을 분리하고 동정하는 단계가 추가로 포함될 수 있다.
또 상기 방법에 있어서, 상기 (c) 단계의 표적 단백질 또는 표적 핵산의 정량은 각 압타머로부터 비롯된 각 이중가닥 핵산 또는 각 표적 핵산으로부터 비롯된 각 이중가닥 핵산 단편에 대한 동일한 서열을 가진 리드(read)를 계수함과 함께, 차세대서열분석 기술의 에러율이 반영되어 상기 리드와 동일한 서열로 간주할 수 있는 서열을 계수하고, 이를 상기 리드에 대한 계수값과 합산하여 그 합산값으로 표적 단백질 또는 표적 핵산을 정량하여 이루어질 수 있다. 이러한 리드 등의 계수는 상기 압타머로부터 비롯된 각 이중가닥 핵산 서열 또는 상기 표적 핵산으로부터 비롯된 각 이중가닥 핵산 단편의 서열을 분석하여 얻어진 각 기지의 서열을 참조서열로 사용하여, 이 참조서열과 상기 압타머로부터 비롯된 각 이중가닥 핵산 서열 분석 결과 또는 상기 표적 핵산으로부터 비롯된 각 이중가닥 핵산 단편의 서열 분석 결과를 비교하여 이루어질 수 있다.
본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 일 측면에 있어서, 분석 대상 시료 중의 표적 단백질의 집단적 정량 방법에 관한 것이다.
본 발명의 표적 단백질의 집단적 정량 방법은, (a) 분석 대상 시료에, 그 시료에 존재하는 표적 단백질 집단에 압타머 라이브러리를 처리하여, 각 표적 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 각 압타머 사이의 복합체를 형성시킴으로써, 표적 단백질과 압타머 사이의 복합체 집단을 형성시키는 단계와, (b) 상기 복합체 집단을 비결합 압타머로부터 분리하는 단계와, (c) 상기 복합체 집단의 각 압타머의 서열을 분석하여 그 복합체 집단의 각 압타머를 정량함으로써 상기 복합체 집단의 각 표적 단백질을 정량하는 단계를 포함하여 이루어진다.
본 발명의 방법은 압타머 라이브러리를 분석 대상 시료 중의 표적 단백질 집단에 반응시켜 각 표적 단백질과 이에 특이적인 각 압타머 사이의 복합체를 형성시킴으로써 전체적으로 표적 단백질 집단과 이에 특이적인 압타머 라이브러리 집단 사이에 복합체 집단을 형성시키고 그 복합체 집단의 각 압타머를 이중가닥 DNA로 전환시켜 이 각 압타머에 대한 이중가닥 DNA를 차세대서열분석 기술로 서열결정하여 표적 단백질을 집단적으로 정량하기 위한 방법이다.
2000년대 초반에 완성된 인간 게놈 프로젝트(Human Genome Project)의 영향으로 저비용, 고속, 대용량으로 핵산 서열 분석 기술이 요구되었고, 2007년 전후로 일루미나(Ilumina)사(기기명: Genome Analyzer HiSeq® 시리즈)와 로슈(Roche)사(기기명: 454® 시리즈), 라이프테크놀로지사(기기명: SOLiD® 시리즈)에서 NGS 기술을 이용한 제품들을 시장에 출시하기 시작하였다. 이 NGS 기술은 게놈 DNA를 단편화하여 얻은 DNA 라이브러리를 기판 또는 에멀전(비드) 상에서 각각의 단편들로 공간적으로 분리하고 PCR로 증폭하여 각 단편들의 클론들을 형성시킨 다음 수십만개 내지 수십억개의 클론들에 대해서 대량병렬 방식으로 동시에 서열결정 반응을 수행하여 각 클론들의 서열들을 동시에 읽어내는 방식이다. 이 서열결정 반응은 각 클론의 단일 DNA 단편을 주형으로 하여 PCR(polymerase chain reaction)로 모노뉴클레오티드를 하나씩 붙이면서 그때 나오는 시그널을 물리화학적으로 검출하는 방법이다. 각 단편들에 대해 얻어진 서열 정보인 리드(Read)들은 이미 분석되어 얻어진 참조서열(Reference sequece)과 비교되고 생물정보학적 기법으로 정렬, 조합되어 전체 지놈 서열을 구성하게 된다(NATuRe Genetics, 2010, 11:31-46; Trends in Genetics, 2008, 24(3):133-141; Genomics, 2008, 92:255-264). 이들 문헌을 포함한 본 명세서에서 인용된 모든 문헌은 본 명세서의 일부로 간주된다.
본 발명의 방법에 이러한 NGS를 적용하여 복합체를 이루는 압타머의 서열을 결정할 경우, 동일 서열의 리드(Read) 또는 동일 서열로 간주할 수 있는 리드의 갯수가 계수화되고, 이 리드의 갯수는 시료 중에 그 압타머가 특이적으로 반응하는 표적 단백질의 존재량(abundance)을 반영하는 것이 되므로, 결국 표적 단백질에 대한 정량이 가능하게 된다.
그러나 NGS는 서열결정 반응을 위한 PCR시에 중합효소가 야기하는 오차, 시그널을 물리화학적으로 검출하는 과정에서의 오차 등으로 인하여 시퀀싱 오차율이 0.1 내지 2% 정도에 달하는데, 이 에러율(Error frequency)이 로슈사의 454 GS Junior는 1%(10-2), 일루미나(Ilumina)사의 HiSeq는 0.1%(10-3), 라이프테크놀로지사의 SoLiD는 2%(2×10-2)로 알려져 있다(Fox et al., Next Generat Sequenc & Applic 2014, 1:1).
따라서 이러한 NGS의 에러율을 고려할 때, 동일 서열은 아니지만 동일 서열로 간주할 수 있는 리드 서열은 동일 압타머로 보아야 그 압타머가 특이적으로 결합하는 표적 단백질에 대한 정량의 정확도를 높일 수 있다.
본 발명의 방법에서는, 이를 위해서(즉 동일 서열로 간주할 수 있는 리드 서열을 동일 압타머로 보아 그 압타머의 표적 단백질에 대한 정량을 보다 정확히 하기 위해서), 압타머 라이브러리로, 5'영역과 3'영역이 기지의 서열을 가진 보존영역으로 구성되고 그 중간 영역은 임의의 서로 다른 무작위 서열을 가진 가변영역으로 구성된 압타머들의 라이브러리를 사용함으로써, NGS 기기의 에러율을 고려, 보존영역 서열에서 2% 이하의 서열 불일치를 허용하여 보존영역과 2% 이하로 불일치한 리드 서열(이는 보존영역과 완전히 동일한 서열을 포함함)을 유효 리드로 하여 나머지 리드를 제외시키고, 이러한 유효 리드의 가변영역에서 2% 이하의 불일치한 서열을 가지는 유효 리드를 동일 리드로 간주하여(즉 동일 압타머로 간주하여) 표적 단백질의 정량에 사용하였다. 이렇게 NGS 에러율을 고려함으로써 압타머의 서열 결정에 의한 표적 단백질 정량의 정확성을 높일 수 있는데, 이러한 에러율을 고려한 유효 리드의 결정 기준은 본 발명 방법에 적용되는 NGS 기술(또는 기기)의 에러율을 고려하여 적절하게 조정될 수 있다.
본 명세서에서, "리드(read)"는 NGS로 분석되는 각 이중가닥 단편의 서열이다. 각 이중가닥 단편은 압타머로부터 분리되고, 이 압타머는 표적 단백질에 대한 정량 정보를 지니고 있으므로, 동일 서열 또는 동일서열로 간주할 있는 서열을 가지는 리드를 계수한 결과로 표적 단백질에 대한 정량 정보를 얻을 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 분석 대상 시료는 검출하고자 하는 표적 단백질을 포함하거나 포함하고 있을 것으로 의심되어 검출의 필요성을 가지는 혼합물 또는 용액 형태의 임의의 시료일 수 있다. 시료는 인체 또는 동물로부터 얻어진 생체시료뿐만 아니라 그러한 생체시료를 가공하여 표적 단백질의 농도를 높인 가공시료일 수 있고, 나아가 표적 단백질이 포함되어 있거나 있을 것으로 여겨지는 물, 식품, 산업폐수 등, 환경오염인자, 독성인자 등의 검사가 필요한 시료일 수도 있다. 이러한 시료는 적정 희석제, 완충용액을 포함할 수 있다.
또 본 발명의 방법에서, 분석 대상 시료는 바람직하게는 인체 또는 동물로부터 얻어진 생체시료 또는 그 가공시료일 수 있다. 생체시료는 혈액, 소변, 침, 정액, 양수, 림프액, 객담, 조직, 활액, 세포, 세포 추출물 등 검출하고자 하는 표적 단백질을 포함하거나 포함하고 있을 것으로 의심되어 검출의 필요성을 가지는 인체 또는 동물로부터 얻어진 것일 수 있다. 가공시료는 예컨대 혈장, 혈청, 생체시료에 단백질 추출 키트를 적용하여 단백질 농도를 높인 시료, 조직 추출물, 조직에서 얻어진 세포, 세포 용해물, 세포 배양물 등일 수 있다. 또 가공시료는 생체시료에서 그 생체시료 중에 많은 양으로 존재하고 표적 단백질로서의 유용성(예컨대 특정 질병에 대한 바이오마커로 사용될 가능성 등)이 떨어지는 단백질을 제거한 가공시료일 수 있다. 예컨대 혈액 시료에는 매우 적은 수의 특정 몇몇 단백질들이 그 시료 중 단백질 양의 99.9%를 차지하고 있으며, 이렇게 많은 양으로 존재하는 단백질들은 통상 표적 단백질로서의 유용성이 낮다(Mol. Cell. Prot. (2006) 5(10):1727-1744). 생체시료 중에 많은 양으로 존재하는 단백질을 제거한 가공시료를 사용할 경우, 유용성이 높은 표적 단백질의 검출 민감성을 향상시킬 수 있다. 이렇게 많은 양으로 존재하는 단백질들로서는, 예컨대 인간을 포함한 포유동물의 혈액시료의 경우 알부민, IgG, IgA, 트랜스페린(Transferrin), 피브리노겐 등을 들 수 있다. 이들 많은 양으로 존재하는 단백질들은 당업계 공지된 적절한 방법(예컨대 면역-친화성 제거 방법(immuno-affinity depletion))을 사용하거나 시판되고 있는 적절한 키트(Agilent Technologies 사의 Multiple Affinity Removal System 등)를 사용하여 제거될 수 있다.
본 발명의 방법에서 상기 (a) 단계의 압타머 라이브러리는 아래의 실시예에와 같이 (i) 서로 다른 다양한 서열(즉 무작위 서열)을 가져 다양한 단백질들에 대한 잠재적 결합 능력을 가진 압타머 풀을 제작하고, (ii) 이 압타머 풀을 상기 (a) 단계에서와 동일한 분석 대상 시료의 표적 단백질 집단과 반응시켜 각 압타머와 각 표적 단백질 사이에 특이적 결합을 유도하여 복합체 집단을 형성시키고, (iii) 비결합한 압타머를 제외시켜 그 복합체 집단을 분리하고, (iv) 그 복합체 집단의 압타머를 증폭하여 얻어질 수 있다.
상기 압타머 라이브러리의 제작 과정에서, 상기 (i) 단계의 서로 다른 다양한 서열을 가진 압타머 풀은, 일반적으로 단일가닥의 RNA 또는 DAN 올리고뉴클레오티드 핵산 풀을 의미하는데, 이 올리고뉴클레오티는 일반적으로 전술한 바와 같이, 기지의 서열로 이루어진 5' 말단 보존영역과 3' 말단 보존영역, 그리고 그 사이에 무작위 서열로 이루어진 가변영역을 포함하여 구성된다. 이 기지의 서열로 이루어진 보존영역에는 정방향/역방향 프라이머가 결합하는 서열, RNA 폴리머나아제의 프로모터 서열, 클로닝 등의 조작을 위한 제한효소 인식 서열 등이 포함될 수 있다. 상기 무작위 서열로 이루어진 가변영역은 통상 40~60개의 뉴클레오티드로 이루어지기 때문에 5' 말단 영역과 3' 말단 영역을 포함한 올리고뉴클레오티드 전체의 길이는 통상 60~120개의 뉴클레오티드의 길이가 된다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 합성은 당업계에 주지되어 있으며, 그러한 방법으로서 고체상 올리고뉴클레오티드 합성 기술, 트리에스테르 합성 방법 등의 용액상 합성 기술 등을 들 수 있다. 구체적인 것은 문헌[Nucl. Acid Res. 14:5399-5467, 1986] 문헌[Tet. Lett. 27:5575-5578, 1986], 문헌[Nucl. Acid Res. 4:2557, 1977], 문헌[Lett., 28:2449, 1978] 등을 참조할 수 있다. 또한 시중에 나와있는 자동화된 DNA 합성 장치를 이용할 수도 있으며, 이러한 장치를 이용할 경우 1014-1016개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 충분히 다양한 압타머를 포함하는 압타머 풀을 얻을 수 있다. 또한 압타머 풀로서 RNA 풀을 사용할 경우 DNA 풀을 T3, T4, T7 등의 RNA 폴리머라제로 전사시켜 RNA 풀을 얻어 사용할 수 있다.
또 상기 압타머 라이브러리의 제작에서, 상기 (iii) 단계의 복합체 집단의 분리를 위하여 상기 비결합한 압타머를 제거는 당업계에 공지된 적절한 방법을 적용함으로써, 예컨대 적절한 세척 버퍼로 세척 단계를 1회 이상 수행함으로써 가능하다. 이렇게 비결합 압타머를 제거하고 복합체 집단을 '선택'적으로 분리한 후에는 그 복합체 집단의 압타머만을 '증폭'시킴으로써 압타머 라이브러리를 제작할 수 있게 된다. 이러한 선택과 증폭을 1회만 수행하여 얻어진 압타머 라이브러리를 본 발명의 방법의 상기 (a) 단계에 그대로 사용할 수 있으나, 상기 선택과 증폭 과정을 2회 이상 반복함으로써, 즉 상기 복합체 집단의 압타머만을 증폭시켜 얻어진 압타머 라이브러리를, 다시 분석 대상 시료의 표적 단백질 집단과 반응시켜 다시 복합체 집단을 형성시키고 복합체 집단을 분리 그 복합체의 압타머만을 다시 증폭시키는 과정을 2회 이상 반복함으로써, 분석 대상 시료의 표적 단백질 집단에 대한 특이적 결합 능력이 높아진 압타머 라이브러리를 사용할 수도 있다. 그러나 압타머 라이브러리는 분석 대상 시료의 표적 단백질들을 다양하게 반영하여 보다 다양한 표적 단백질들을 집단적으로 검출, 분석할 수 있는 것이 바람직하므로, 상기 선택과 증폭 과정을 반복하는 대신, 1회의 선택과 증폭 과정으로 압타머 라이브러리를 제작하되, 다양한 세척 버퍼를 사용하여 세척 단계를 2회 이상 수행하여 압타머 라이브러리를 제작하는 것이 바람직하다. 세척용액은 당업계에 널리 이용되는 것을 구입하여 이용하거나 적절히 조제하여 사용할 수 있는데, 이러한 세척용액으로서는 일반적으로 계면활성제 및/또는 염이 포함된다. 계면활성제로서는 SDS, Tween 20, Tween 30, Tween 40, Tween 60, Tween 80, Triton X-405, Triton X-100, Tetronic 908, Cholesterol PEG 900, Polyoxyethylene Ether W-1, Span 20, Span 40, Span 85, 이들의 혼합물이 사용될 수 있으며, 염은 리튬, 나트륨, 칼륨 및 암모늄의 아세트산염, 젖산염, 구연산염, 인산염, 질산염, 황산염, 염화물염, 이의 혼합물(SSC, SSPE 등)이 사용될 수 있다. 특히 세척용액은 TBST 용액(10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20), PBST 용액(PBS, pH 7.0, 0.05% Tween 20), Tween 20, Tween 30 등이 포함된 SSPE 용액(0.2M phosphate buffer, 2.98M NaCl, 20mM EDTA, pH7.4) 등을 사용할 수 있으며, 1~600 mM EDTA 용액 등도 사용할 수 있다.
또 본 발명의 방법에서, "표적 단백질 집단"은 2종 이상의 서로 다른 단백질의 집합체를 의미하는데, 전술한 바와 같이와 분석 대상 시료에 대해 압타머 풀을 처리하여 복합체 전체를 분리하고 그 복합체의 압타머를 증폭하여 얻은 압타머 풀을 압타머 라이브러리로 사용할 경우, 상당수의 표적 단백질이 집단적으로 검출될 될 수 있다. 따라서 표적 단백질 집단은 적어도 500 종 이상의 단백질로 구성된 단백질 집단의 의미로 이해될 수 있으며, 바람직하게는 1000종 이상, 더 바람직하게는 1500 종 이상, 더욱 바람직하게는 2000종 이상 단백질로 구성된 단백질 집단으로 이해될 수 있다. 상기 압타머 풀의 각 압타머는 필요에 따라서는 본 발명의 방법을 적용하거나 기존 공지의 BAC library 구축을 통한 클로닝에 의한 서열 결정 방법(Genome Res. 2001 Mar; 11(3):483-496)을 적용하여 그 서열이 미리 결정되어 있는 압타머일 수도 있다.
또 본 발명의 방법에서, 상기 (a) 단계의 "표적 단백질 집단에 특이적인 압타머 라이브러리"는, 그 표적 단백질 집단에 특이적으로 결합함으로써 표적 단백질을 집단적으로 검출할 수 있는 압타머의 집합체를 의미한다. 따라서 표적 단백질 집단의 크기가 예컨대 1000종의 표적 단백질로 구성되어 있다면, 압타머 라이브러리도 적어도 1000종 이상의 압타머로 구성되게 될 것이다. 여기서 '적어도 1000종 이상의 압타머로 구성될 것'이라고 한 것은, 어떠한 특정 표적 단백질에 압타머 풀을 반응시키면 어느 1 종의 특정 압타머만이 상기 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 것이 아니라 2종 이상의 특정 압타머가 상기 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 경우도 발생할 수 있기 때문이다. 일반적으로는 압타머 라이브러리는 이를 구성하는 압타머의 종류가 표적 단백질 집단을 구성하는 표적 단백질의 종류보다 많을 것이다.
본 발명의 방법에서, 압타머는 항체와 마찬가지로 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 리간드를 의미하므로, 표적 단백질과 특이적으로 결합할 수 있다면 압타머는 부분적 또는 완전한 이중가닥 DNA 또는 이중가닥 RNA 압타머일 수도 있다. 그럼에도 압타머는 특이적 결합력이 높은 단일가닥 DNA 압타머 또는 단일가닥 RNA 압타머가 바람직하며, 특히 단일가닥 RNA 압타머가 바람직하다. 단일가닥 압타머는 화학적·물리적·효소적 분해에 저항성을 갖도록 하기 위해서 염기 위치에서 화학적으로 변형된(수식된) 압타머일 수 있다. 본 발명의 아래의 실시예에서 2'F-CTP와 2'F-UTP를 사용하여 모든 C 및 U가 fC(2'-F가 수식된 C) 및 fU(2'-F가 수식된 U)인 RNA 풀을 제조하여 압타머 라이브러리의 제조에 사용하였다.
본 발명의 방법에서, 상기 (a) 단계의 분석 대상 시료의 표적 단백질 집단과 압타머 라이브러리를 반응시켜 그 단백질 집단을 구성하는 각 표적 단백질과 압타머 라이브러리를 구성하는 각 압타머 사이에 특이적 결합을 통한 복합체 집단을 형성시킨 다음에는, 본 발명의 방법 (b) 단계에 해당하는 그 복합체 집단을 비결합 압타머와 분리할 필요가 있다. 이러한 복합체 집단의 비결합 압타머로부터의 분리는 당업계에 공지된 임의의 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예컨대 분석 대상 시료를, 단백질에 대한 높은 결합 친화성을 가지는 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)이 있는 반응용액(이러한 반응용액은 예컨대 60 mM TrisCl (pH 7.4), 5 mM KCl, 100mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.1% NaN3의 조성으로 이루어질 수 있다)에 처리하여 반응시켜 분석 대상 시료의 표적 단백질들을 니트로셀룰로오스 막에 부착시키고, 여기에 특이적인 압타머 라이브러리를 처리하여 복합체의 형성을 유도한 후에 적절한 세척버퍼로 세척하여 미결합하거나 비특이적으로 결합한 압타머를 제거하여 복합체만이 결합되어 있는 니트로셀룰로오스 막을 회수함으로써 복합체 집단만의 분리가 가능하다. 또한 예컨대 이러한 복합체 집단만의 분리에 니트로셀룰로오스 필터와 나일론 멤브레인 구조체를 이용할 수도 있다. 구체적으로 압타머 라이브러리가 있는 반응용액에 시료를 첨가하여 반응시킨 후 그 반응혼합용액을 나이트로셀룰로스 필터와 나일론 멤브레인으로 이루어진 구조체에 처리하여 적절한 압력을 가하면, 압타머와 단백질 복합체는 나이트로셀룰로스 필터상에 있고, 미결합한 단일가닥핵산은 나일론 상에 존재한다. 상기 나이트로셀룰로스 필터를 회수하여, 적절한 세척버퍼로 세척하여 미결합하거나　비특이적으로　결합한 압타머를 제거하여 복합체 집단을 확보할　수　있다. 여기서 세척 버퍼와 이를 이용한 세척 단계와 관련해서는 상기 압타머 라이브러리의 제조와 관련하여 설명한 바를 참조할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 (b) 단계를 통해 복합체 집단을 분리한 후에는 그 복합체 집단의 각 압타머 서열을 NGS 기술로 분석하여 그 복합체 집단의 각 압타머를 정량함으로써 상기 복합체 집단의 각 표적 단백질을 정량하는 상기 (c) 단계를 수행하게 되는데, 이러한 NGS 기술의 적용을 통한 서열분석을 위해서 복합체의 압타머를 이중가닥 형태의 DAN 단편으로 전환시킬 필요가 있는데, 이는 당업계에 공지된 기술을 적용하여 용이하게 수행할 수 있다. 예컨대 압타머가 RNA 단일가닥 압타머인 경우는 그 단일가닥 RNA에 역전사하여 cDNA를 제조하고 그 cDNA에 일방향 PCR(One-way PCR)를 1회 수행하여 이루어질 수 있다. NGS 기술의 적용을 통한 서열분석을 위해서 시료의 양을 적절한 양으로 늘릴 필요가 있을 경우나 시료 중 미량으로 존재하는 표적 단백질을 검출할 경우 등에는 그 cDNA 등을 대상으로 PCR를 수회 또는 수십회 반복 수행하여 시료의 양을 늘릴 수 있다. 만일 PCR를 수회 또는 수십회 반복함으로써 시료의 양을 늘려 이를 NGS 기술의 적용을 위한 시퀀싱 라이브러리로 사용할 경우 PCR의 횟수만큼 이에 비례하여 리드의 수는 증가할 것인데, 이러한 PCR의 횟수는 리드의 수를 통한 표적 단백질의 정량에 고려될 수 있다.
이러한 PCR의 수행은, 본 발명의 압타머 라이브러리가 공통적으로 5'영역과 3'영역이 기지의 서열을 가진 보존역역으로 구성되고 그 중간 영역이 임의의 서로 다른 무작위 서열을 가진 가변영역으로 구성된 압타머들의 집합체일 경우 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 1 세트를 가지고 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 (a) 단계의 상기 압타머 라이브러리가 처리되기 전의 분석 대상 시료에, 그 시료에는 존재하지 않는 2종 이상의 외부 표준단백질을 정량하여 서로 다른 정량값(즉 농도)으로 첨가하고, 상기 (a) 단계의 압타머 라이브러리는 그 외부 표준단백질에 대한 압타머를 추가로 포함하는 압타머 라이브러리를 사용함으로써, 상기 (c) 단계에서 상기 외부 표준단백질에 대한 압타머의 정량 결과를 표적 단백질에 대한 압타머의 정량 결과와 함께 얻고, 그 외부 표준단백질의 압타머 정량 결과를 표적 단백질의 압타머의 정량 결과와 비교하여 표적 단백질에 대한 정량값을 산정하는 것이 가능하다. 상기 외부 표준단백질이 2종 이상이 서로 다른 정량값(농도)으로 시료에 첨가될 경우 그 외부 표준단백질의 농도와 그에 대한 정량값인 리드 갯수 사이의 상관 관계를 보여주는 표준곡선을 작성하고, 표적 단백질에 대한 리드 갯수를 이 표준곡선에 대입하면 표적 단백질에 대한 농도의 산정이 가능해진다. 외부 표준단백질은 수종에서 수백종까지 각기 서로 다른 정량값으로 사용될 수 있으며, 그럴 경우 표적 단백질에 대해 정량값 산정이 보다 정확한 값으로 추정될 수 있다. 외부 표준단백질은 특히 분석 대상 시료에 존재하지 않은 뿐만 아니라, 이에 특이적으로 결합하는 압타머가 분석 대상 시료 중의 표적 단백질에는 결합하지 않도록 그 외부 표준단백질의 유사체(analog)도 그 분석 대상 시료에 존재하지 않는 것이 바람직하다. 이러한 외부 표준단백질의 적절한 선택은 현재 유전체 서열 분석이 완료된 생물종에 대한 유전정보와 분석 대상 시료가 얻어진 생물종에 대한 유전정보를 비교함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명의 아래의 실시예에서는 인간 유래 심근경색 환자의 혈청 등을 분석 대상 시료로 하고 여기에는 그 유사체까지 존재할 가능성이 없는 애기장대 유래 식물 단백질 5종을 각각 0.01 pg/ml, 1.0 pg/ml, 100.00 pg/ml, 10.0 ng/ml 및 1.0 ug/ml의 정량값(농도)으로 분석 대상 시료에 첨가하여 사용하였다. 이러한 외부 표준단백질의 사용은 시료 준비(예컨대 표적 단백질의 추출 등) 등에서의 차이(variation) 등에 대한 정도관리(quality control)까지 가능하게 한다.
본 명세서에서, "정량"은 상대적 정량과 절대적 정량을 포함하는 의미이다. 상대적 정량은 예컨대 모든 정량값의 전체 평균에 대한 각 정량값의 비(ratio)를 의미하거나 특정 정량값에 대한 각 정량값의 비(ratio)를 의미하며, 절대적 정량은 상기 외부 표준단백질이나 하기 외부 표준핵산을 이용하는 경우에서처럼 정량값과 농도 사이의 표준곡선을 이용하여 농도를 산정한 결과를 의미한다.
본 발명의 방법에서, 표적 단백질 집단은 미지의 단백질 집단, 기지의 단백질 집단 또는 이들의 혼합물 집단일 수 있다.
또 본 발명의 방법에서, 표적 단백질 집단 중의 특정 단백질이 미지의 단백질일 경우 그 단백질에 대한 특이적인 압타머(이는 압타머 라이브러리에 포함되어 있음)를 이용하여 그 단백질을 분리하고 당업계에 공지된 방법(예컨대 MALDI-TOF 등)을 이용하여 그 단백질의 아미노산 서열을 결정함으로써 그 단백질을 동정하는 단계가 추가로 포함될 수 있다. 이러한 표적 단백질의 동정은 유용한 질병 특이적 바이오마커의 후보 등을 제공할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 각 압타머로부터 얻어진 리드를 계수할 때 전술한 바와 같이, 동일한 서열과 NGS 에러율을 고려한 '동일한 서열로 간주할 수 있는 서열'을 가진 리드를 동일 압타머에 대한 리드로 계수할 수 있지만, 압타머 라이브러리의 각 압타머에 대해 이미 결정된 서열을 참조서열로 사용하여 리드를 계수할 수도 있다. 이때 각 압타머에 대한 참조서열은 바람직하게는 전술한 바의 본 발명의 방법을 통하여 분석 대상 생체 시료와 동일한 시료에 대해 이미 얻어진 서열로부터 이루어질 수 있다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 2가지의 분석 대상 시료에 대해 전술한 바의 방법을 적용하여, 각 시료로부터 얻어진 정량 결과를 비교함으로써, 바이오마커로서 후보 단백질의 선별 방법에 관한 것이다. 여기서 2가지의 분석 대상 시료는 서로 사이에 비교의 유용성을 가지는 시료로서, 예컨대 환자(또는 환자군)의 시료와 정상인(또는 정상인군)의 시료이다.
본 발명의 방법에서, 바이오마커는 일차적으로는 사람을 비롯한 포유동물의 질병에 정보를 제공하는 바이오마커이다. 그러한 바이오마커는 시료 중의 존재 여부 및/또는 존재량은 건강한 개체과 질병을 가진 개체 사이에 차이가 있어 건강한 개체와 질병을 가진 개체를 구분하는 것을 가능하게 한다. 또 본 발명에서, 바이오마커는 이차적으로는 그 존재 여부 및/또는 존재량이 2가지의 분석 대상 시료에서 차이를 가져 그 분석 대상이 된 2가지의 시료(또는 그 시료가 유래한 생물종이나 생물 개체 등)를 구분할 수 있게 해줌으로써, 약물 처방의 적합성 여부 판단(예컨대 항암제 동반진단 등), 약물 순응도, 약물 처리에 대한 In vitro 상에서의 세포 반응 여부나 정도, 생물종의 분류나 동정 등 인간에게 유용한 정보를 제공할 수 있는 임의의 모든 바이오마커이다.
본 발명에서 "바이오마커 후보"는 바이오마커로 사용될 가능성을 가진 바이오마커로서, 바이오마커 발굴을 위한 추후 연구에 사용될 수 있는 후보를 의미한다. 이러한 바이오마커 후보는 그러한 추후 연구에서 유용성이 검증될 경우 실제 바이오마커로 전환되어 사용될 수 있다. 예컨대 특정 질병에 대한 바이오마커 후보는, 그 질병을 가진 환자군과 정상인군을 대상으로 한 임상연구에 사용될 수 있으며, 그러한 임상연구를 통하여 통계적 유의성을 가져 유용성이 검증된 경우 바이오마커로 전환되어 실제 그러한 질병 진단을 위한 바이오마커로 사용될 수 있다.
본 발명의 바이오마커로서 후보 단백질의 선별 방법은 구체적으로, (a) 분석 대상 시료에, 그 시료에 존재하는 표적 단백질 집단에 특이적인 압타머 라이브러리를 처리하여, 각 표적 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 각 압타머 사이의 복합체를 형성시킴으로써, 표적 단백질과 압타머 사이의 복합체 집단을 형성시키는 단계와, (b) 상기 복합체 집단을 비결합 압타머로부터 분리하는 단계와, (c) 상기 복합체 집단의 각 압타머의 서열을 분석하여 그 복합체 집단의 각 압타머를 정량함으로써 상기 복합체 집단의 각 표적 단백질을 정량하는 단계를 포함하되, 상기 (a) 내지 (c) 단계를 상기 분석 대상 시료와는 다른 분석 대상 시료에 대해서 동일하게 수행하는 단계와 상기 2가지 분석 대상 시료 사이에 상기 (c) 단계를 통하여 얻어진 각 표적 단백질 정량 결과를 비교하여 정량 결과의 차이가 있는 하나 이상의 표적 단백질을 결정하는 단계를 추가로 포함하여 이루어진다.
본 발명의 방법에서 상기 (a) 단계의 압타머 라이브러리는 2가지 분석 대상 시료에 대해 동일한 압타머 라이브러리가 사용되는 것이 바람직하다. 여기서 동일한 압타머 라이브러리는 동일한 압타머의 조성과 농도를 갖는 압타머 라이브러리를 말한다. 동일한 압타머 라이브러리가 사용될 때, 각 표적 단백질에 대한 압타머가 동일하기 때문에(즉 동일한 서열을 가진 압타머이기 때문에) 표적 단백질과 그에 대한 압타머 사이에 결합력이 동일하여 결합력에 따른 정량 결과의 차이가 발생하지 않으므로 결국 이렇게 얻어진 정량 결과는 바이오마커 후보의 선별에 보다 유용하게 사용될 수 있다.
또 본 발명의 방법에서도, 상기 본 발명의 표적 단백질의 집단적 정량 방법에서와 마찬가지로 2가지의 분석 대상 시료 모두에 존재하지 않는 서로 다른 정량값(즉 농도)을 갖는 2종 이상의 외부 표준단백질을 2가지 분석 대상 시료 각각에 첨가하고 이들 외부 표준단백질에 대한 정량 결과를 표적 단백질의 정량에 이용할 수도 있다. 이와 관련하여 더 구체적인 것은 상기 본 발명의 표적 단백질의 집단적 정량 방법과 관련하여 설명한 바를 참조할 수 있다.
또 본 발명의 방법에서도, 표적 단백질이 미지의 단백질일 경우 이 단백질에 특이적인 압타머로 이를 분리하고 동정하는 단계가 추가될 수 있다. 이와 관련해서도 더 구체적인 것은 상기 본 발명의 표적 단백질의 집단적 정량 방법과 관련하여 설명한 바를 참조할 수 있다.
기타 본 발명의 바이오마커 후보 단백질의 선별 방법에 대해 구체적으로 설명되지 않은 기술적 사항들에 대해서는 상기 본 발명의 표적 단백질의 집단적 정량 방법과 관련하여 설명한 바가 그대로 유효하며 그 해당 부분을 참조할 수 있다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 방법을 약간 변형하여 보다 용이하게 바이오마커 후보 단백질을 선별할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 이러한 방법은 분석 대상 2가지 시료 사이에 공통적으로 존재하는 단백질들에 대한 압타머로부터 역전사와 PCR 또는 PCR를 수행하여 얻은 이중가닥 DNA를, 어느 한 가지 시료에서 얻어진 이중가닥 DNA로부터 제거하고, 그 나머지 단백질들에 대한 이중가닥 DNA만을 검출하는 방법이다.
분석 대상 2가지 시료에서 공통적으로 존재하는 단백질은 바이오마커 후보 단백질로서 유용성이 낮다. 즉 바이오마커로서 사용될 가능성이 낮다. 따라서 본 발명의 방법은 이들 공통적으로 존재하는 단백질에 대해서는 검출이 되지 않도록 한 것이다.
구체적으로 본 발명의 방법은, (a) 2가지 분석 대상 시료 각각에서 표적 단백질 집단이 포함된 단백질 시료를 획득하고, 그 획득한 단백질 시료와, 그 단백질 시료 중의 표적 단백질 집단에 특이적인 압타머 라이브러리를 처리하여, 각 표적 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 각 압타머 사이의 복합체를 형성시킴으로써, 표적 단백질과 압타머 사이의 복합체 집단을 형성시키고, 그 복합체 집단만을 비결합 압타머로부터 분리한 후, 그 분리한 복합체 집단의 압타머를 이중가닥 DNA 집단으로 전환시키는 단계, (b) 2가지 분석 대상 시료 각각에서 얻어진 이중가닥 DNA 집단에서 공통적으로 존재하는 이중가닥 DNA를, 그 중 한 가지 시료에서 얻어진 이중가닥 DNA 집단으로부터 제거하는 단계, (c) 그 한 가지 시료의 나머지 이중가닥 DNA 집단만을 NGS 기술로 분석하여 각 이중가닥 DNA 서열을 분석함과 함께 각 이중가닥 DNA의 양(abundance)을 얻는 단계를 포함하여 구성된다.
각 시료에서 비롯된 이중가닥 DNA 집단에서 공통적으로 존재하는 이중가닥 DNA는 각 시료에서 공통적으로 존재하는 단백질에 대한 이중가닥 DNA이다. 이러한 공통적 이중가닥 DNA가 제거될 경우 나머지 이중가닥 DNA는 그 시료에 특이한(즉 그 시료에만 존재하는) 이중가닥 DNA가 되며, 이는 그 시료에 특이한 단백질에 대한 정보를 반영하고 있다. 이 단백질들은 그 자체가 바로 바이오마커 후보 단백질이 될 수 있다. 여기서 2가지 분석 대상 시료 중, 공통적 이중가닥 DNA가 제거되어 분석되는 시료는 그 2가지 시료 중 상대적으로 보다 유용한 시료인 것이 바람직하다. 예컨대 본 발명의 방법이 질병 바이오마커 후보 단백질을 선별할 목적이라면, 그 시료는 환자(또는 환자군)으로부터 유래한 시료이며, 정상인(또는 정상인군)으로부터 유래한 시료는 나머지 시료이다. 청구범위를 포함한 본 명세서에서 편의상 NGS 기술로 분석되는 시료를 시험시료라 하고 나머지 분석되지 않는 시료를 비교시료라 한다.
본 발명의 방법에서, 2가지 분석 대상 시료 각각에서 얻어진 이중가닥 DNA 집단에서 공통적으로 존재하는 이중가닥 DNA를, 시험시료에서 얻어진 이중가닥 DNA 집단으로부터 제거하는 단계는, 예컨대 SSH(Suppression subtractive hybridization) 방법을 적용하여 이루어질 수 있다. 이 SSH 방법은 LUDA DIATCHENKO 등에 의하여 문헌[Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Jun 11; 93(12): 6025-6030]에서 제안된 방법으로, 시험시료의 이중가닥 DNA를 테스터(Tester) 1과 데스터 2로 나누고 각각에 특이적 아탑터를 부가하고 비교시료의 이중가닥 DNA를 드라이버(Driver)로 하여 시험시료와 비교시료 사이에 공통적으로 존재하는 이중가닥 DNA를 혼성시켜 이 혼성화된 이중가닥 DNA는 지수적으로 증폭(exponential amplication)되지 못하도록 하고 시험시료에 있는 DNA만 지수적으로 증폭되록 한 것이다. 그렇게 되면 시험시료에 특이한 이중가닥 DNA 중심으로 증폭된 결과물을 얻을 수 있다. 상기 LUDA DIATCHENKO 등의 문헌도 본 명세서의 다른 문헌과 마찬가지로 본 명세서의 일부로서 간주되며, SSH 방법의 보다 구체적인 개념과 프로세스는 상기 문헌의 FIG. 1이나 본 명세서의 첨부 도면, 실시에 등을 참조할 수 있다.
또 본 발명의 방법에서, 이러한 공통적 이중가닥 DNA 제거 단계는 또한 DSN(duplex-specific nuclease)을 이용한 방법으로 수행될 수도 있다. 이 방법은 Bogdanova EA 등이 문헌[Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 3 e37]을 통하여 제안한 방법으로, 시험시료의 이중가닥 DNA와 비교시료의 이중가닥 DNA를 혼성시켜 DSN으로 제거하고 나머지 이중가닥 DNA만을 지수적으로 증폭하는 방법이다. DSN을 이용한 방법과 관련하여서도 구체적인 것은 상기 문헌과 본 명세서의 첨부 도면, 실시예 등을 참조할 수 있다.
이렇게 공통적 이중가닥 DNA 제거되고 시험시료의 나머지 이중가닥 DNA만을 증폭하여 그 증폭물을 NGS 기술로 서열을 결정하고 정량할 경우, 이중가닥 DNA의 정량값이 높을록 이에 비례하여 시험시료에만 그 이중가닥 DNA에 상응하는 단백질이 많은 양으로 존재하는 것이므로, 유용한 바이오마커 후보가 정량값이 높은 순서에 따라 얻어질 수 있다.
기타 본 발명의 이러한 방법에 대해서 구체적으로 설명되지 않은 기술적 사항들의 경우 상기 본 발명의 표적 단백질의 집단적 정량 방법과 관련하여 설명한 바나 상기 본 발명의 바이오마커 후보 단백질의 선별 방법과 관련하여 설명한 바가 유효하며 그 해당 부분을 참조할 수 있다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 NGS를 이용하여 표적 핵산과 표적 단백질을 동시분석하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 NGS를 이용한 분석 대상 시료 중의 표적 핵산과 표적 단백질의 동시분석 방법은, (a) (i) 분석 대상 시료에서 표적 단백질 집단이 포함된 단백질 시료를 획득하고, 그 획득한 단백질 시료와, 그 단백질 시료 중의 표적 단백질 집단에 특이적인 압타머 라이브러리를 처리하여, 각 표적 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 각 압타머 사이의 복합체를 형성시킴으로써, 표적 단백질과 압타머 사이의 복합체 집단을 형성시키고, 그 복합체 집단만을 비결합 압타머로부터 분리한 후, 그 분리한 복합체 집단의 압타머를 이중가닥 DNA로 전환시키는 단계, (ii) 상기 분석 대상 시료와 동일한 분석 대상 시료에서 표적 핵산이 포함된 핵산 시료를 얻고 그 핵산 시료 중의 표적 핵산을 이중가닥 DNA 단편으로 전환시키는 단계, (b) 상기 압타머로부터 유래한 이중가닥 DNA와 상기 표적 핵산으로부터 유래한 이중가닥 DNA 단편을 혼합하는 단계, 및 (c) 이 혼합물의 각 이중가닥 DNA의 서열을 NGS 기술로 분석하여 각 이중가닥 DNA 서열 정보를 얻음과 함께 각 이중가닥 DNA의 양(abundance)을 결정하는 단계를 포함하여 구성된다.
본 발명의 동시분석 방법은, 핵산의 서열 분석과 동일 서열을 가진 핵산에 대한 정량을 가능하게 하는 NGS 기술을 적용하여, 시료 중의 표적 단백질과 표적 핵산을 동시분석하기 위한 것으로, 이를 위하여 시료 중의 표적 단백질에 대한 압타머를 NGS 기술이 적용될 수 있는 이중가닥 DNA로 전환시키고 또 시료 중의 핵산을 이중가닥 핵산 단편으로 전환시켜, 이들을 혼합하고, NGS 기술을 적용, 시료 중의 단백질과 핵산을 동시분석하는 방법이다. NGS를 적용하여 동시분석을 수행하면, 특정 분석 대상 시료 중의 표적 단백질과 표적 핵산에 대한 정량 정보가 동시에 얻어지며, 이와 함께 표적 단백질에 특이적인 압타머에 대한 서열과 표적 핵산에 대한 서열이 얻어질 수 있다.
본 발명의 동시분석 방법에서, 분석 대상 시료는 검출하고자 하는 표적 단백질과 표적 핵산을 포함하거나 포함하고 있을 것으로 의심되어 검출의 필요성을 가지는 임의의 혼합물 또는 용액일 수 있다. 바람직하게는 생체 시료이다. 기타 분석 대상 시료와 관련해서는 상기 본 발명의 표적 단백질의 집단적 정량 방법과 관련하여 설명한 바가 그대로 유효하며, 그 관련 내용을 참조할 수 있다.
또 본 발명의 동시분석 방법에서 상기 (a)의 (i) 단계의 그 복합체 집단만을 비결합 압타머로부터 분리하기까지의 과정에 대해서는 상기 본 발명의 표적 단백질의 집단적 정량 방법과 관련하여 설명한 바가 그대로 유효하며, 마찬가지로 그 관련 내용을 참조할 수 있다.
또 본 발명의 동시분석 방법에서, 상기 (a)의 (i) 단계의 복합체 집단의 압타머를 이중가닥 DNA로 전환시키는 단계는 복합체 집단의 압타머에 대해서, 그 압타머가 RNA 단일가닥핵산 압타머일 경우 역전사하여 단일가닥 cDNA를 얻고 이에 대해서 일방향(one-way) PCR를 1회 수행하여 이루어질 수 있다. 압타머가 DNA 단일가닥 핵산일 경우 바로 일방향(one-way) PCR를 1회 수행하여 이루어질 수 있다. 또한 NGS 기술의 적용을 통한 서열분석을 위해서 시료의 양을 적절한 양으로 늘릴 필요가 있을 때 등에는 cDNA 등을 대상으로 PCR를 수회 또는 수십회 반복 수행하여 시료의 양을 늘릴 수도 있다. 이러한 역전사 및/또는 PCR의 수행은 복합체 집단으로부터 압타머 집단을 해리시켜 그 압타머 집단에 대해서 이루어질 수 있으나, 역전사와 PCR 과정에서 가열 과정이 있어 복합체 집단으로부터 압타머 집단이 해리되므로 상기와 같이 별도의 해리 과정을 거치지 않더라도 무방하다. 이때 PCR 수행은, 상기 본 발명의 표적 단백질의 집단적 정량방법과 관련하여 설명한 바와 같이, 정방향 및 역방향 프라이머 결합 부위가 기지 서열의 보존영역으로 구성되어 있을 경우 1 세트의 프라이머를 가지고 이루어질 수 있다. 압타머로부터 유래한 이중가닥 DNA는 이미 NGS 기술의 적용에 적합한 크기의 단편이므로 이를 단편화시킬 단계가 특별히 요구되지는 않는다.
본 발명의 동시분석 방법에서, 표적 핵산은 gDNA 및/또는 RNA를 포함한다. gDNA라면 결실, 삽입, 단일염기다형성(SNP), 메틸화 등의 후성유전학적 변화를 갖는 gDNA를 포함한다. 만일 메틸화 gDNA를 분석하고자 할 경우 당업계에 공지된 방법(예컨대 비설파이트(bisulfite) 처리)에 따라 적절히 전처리되어 NGS 분석에 사용될 수 있다. NGS 기술을 적용한 DNA 메틸화 분석에 대해서 더 구체적인 것은 문헌[Cancer Res. 67 (2007) 8511-8518], 문헌[Cancer Metastasis Rev (2011) 30:199-210], 문헌[Biology (Basel). 2016 Mar; 5(1):3], 문헌[J Vis Exp. 2015; (96): 52488] 등을 참조할 수 있으며, 삽입, 결실, SNP 등에 대한 NGS 분석에 대해서는 문헌[Cancer Genet. 2013 Dec; 206(12): 432-440], 문헌[Front Bioeng Biotechnol. 2015; 3: 92], 문헌[PLoS One, 2014 9: e104652], 문헌[Nature Reviews Genetics, 2011, 12:443-451] 등을 참조할 수 있다. gDNA는 페놀-클로로포름 추출 방법(phenol-chloroform extraction method) 등 당업계에 공지된 방법(Molecular Ecology Notes (2003) 3, 317-320; J Forensic Sci, May 2009, 54(3):599-607)이나 시판되는 키트(예컨대 DNAzol™ Reagent, PureLink™ Genomic DNA Mini Kit 등)를 사용하여 분리한 후, 초음파 분해(sonication) 등을 통하여 랜덤(random)하게 일정 범위의 길이(통상 1kb 이하)로 단편화시켜 NGS 기술을 적용, 그 서열을 분석할 수 있다.
표적 핵산이 RNA이라면, 단백질을 암호화하는 mRNA, 스플라이싱 이전의 pre-mRNA, 스플라이싱(splicing)에 관여하는 snRNA(small nuclear RNA), rRNA의 수식(modification)에 관여하는 snoRNA(small nucleolar RNA), 전사 후 단계에서의 유전자 발현 조절에 관여하는 miRNA(micro RNA)나 piRNA(piwi-interesting) 등을 포함한다. 이들 RNA도 당업계에 공지된 방법(J Mol Diagn. 2008 May; 10(3): 203-211; PREPARATIVE BIOCHEMISTRY & BIOTECHNOLOGY Vol. 34, No. 3, pp. 209-214, 2004)이나 시판되는 키트(TRIZOL™ Reagent, RNeasy™ FFPE Kit, PureLink™ FFPE RNA Isolation Kit, RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit 등)를 사용하여 총 RNA나 분석하고자 RNA(예컨대 mRNA)를 분리하고 그 RNA를 이중가닥 cDNA로 전환시켜 NGS 기술을 적용, 그 서열을 분석, 정량할 수 있다. 바람직하게는 생체시료의 총 RNA을 분리하고 그 총 RNA를 NGS 기술 적용을 위한 시료로 사용하고자 할 때, rRNA가 총 RNA의 대부분(통상 95%)을 차지하므로, 이를 당업계에 공지된 방법이나 적절한 시판 키트(RiboMinus™, RiboZero™ 등) 등을 사용하여 제거함으로써 총 RNA에서 나머지 상대적으로 소량 존재하는 RNA, 예컨대 mRNA, pre-mRNA, snRNA나 miRNA 등의 ncRNA(noncoding RNA)에 대해 NGS 기술을 적용하여 보다 용이하게 그 서열의 분석과 정량을 수행할 수 있다. 만일 표적 핵산으로 mRNA만을 분석하고자 할 경우 mRNA가 polyA를 가지므로 자성비드 등 지지체에 고정된 polyT 올리고를 사용하여 mRNA만을 분리하여 NGS 분석을 수행할 수 있으며, 표적 핵산으로 miRNA 등의 small RNA만을 분석하고자 할 경우 겔 전기영동(Gel electrophoresis)을 이용한 크기 선별법(Size selection)을 적용하여 miRNA만을 분리하여 NGS 기술로 분석을 수행할 수 있다. mRNA나 pre-mRNA 등 길이가 큰 RNA의 경우 cDNA 합성 전후에 NGS 기술의 적용을 위해 적절한 크기로 단편화시키는 것이 바람직할 수 있으며, 상대적으로 소량 존재하는 RNA의 경우 그 cDNA를 증폭하여 그 증폭물을 NGS 기술로 분석하는 것이 바람직할 수도 있다.
또 표적 핵산은 미지의 서열을 갖는 gDNA 상의 임의의 유전자이거나 미지의 서열을 갖는 mRNA 등의 임의의 RNA일 수 있으며, 또 기지의 서열을 갖는 특정 유전자나 RAN 또는 그 유전자나 RNA로부터 얻어진 증폭물일 수도 있다. 이처럼 표적 핵산은 그 서열분석 및/또는 정량이 요구되는 시료 중의 임의의 핵산일 수 있다.
또 본 발명의 동시분석 방법에서, 상기 (a) 단계의 압타머의 이중가닥 DNA나 핵산의 이중가닥 DNA 단편에 대해, 아탑터의 부가 등을 통해 각각 시퀀싱 라이브러리(Sequencing library)를 제조한 후 그 시퀀싱 라이브러리를 혼합하고 그 시퀀싱 라이브러리 혼합물에 대해, NGS 기기를 적용하여 분석을 수행할 수도 있다. 이와 관련하여 일루미나(Ilumina)사의 NGS 기기에 대해 예로 들어 설명하면, 시퀀싱 라이브러리는 DNA 단편은 말단 수선(End Repair)과 아데노신 접합(dA-Tailing) 그리고 아답터(adapter)의 부가 등에 의해 제조된다. 이러한 시퀀싱 라이브러리는 DNA 단편 라이브러리를 NGS 기기로 서열분석을 수행할 수 있는 상태로 전환시키기 위한 것으로, 상기에서 일루미나(Ilumina)사의 NGS 기기를 예로 들어 설명하였지만, 각 NGS 기기에 따라 해당 제조사의 프로토콜에 따라 이중가닥 DNA 단편을 시퀀싱 라이브러리로 전환, 제조할 수 있다.
또 본 발명의 동시분석 방법에서, 상기 (a) 단계의 각 시료 즉 압타머의 이중가닥 DNA와 핵산의 이중가닥 DNA 단편에 대해 그 혼합 전에 이들이 유래한 시료를 구분할 수 있는 바코드(barcode)를 상기 이중가닥 DNA에 아탑터의 부가와 함께 부가할 수 있다. 이러한 바코드는 gDAN와 RAN를 표적 단백질과 동시분석할 경우에는 이들 핵산 시료를 구분하기 위해서도 각 시료로부터 얻어진 이중가닥 DNA 단편에 도입될 수 있으며, RNA를 분석할 경우에는 각 RNA 시료(예컨대 miRNA 등의 small RNA 시료 와 mRNA 시료)를 구분하기 위해서 각 시료로부터 얻어진 이중가닥 DNA 단편에 도입될 수도 있다. 이러한 바코드는 짧은 길이(통상 6-bp)의 DNA로 시료를 구분할 수 있도록 각 시료마다 특유의 서열을 가지도록 제작된다. NGS 기술을 통한 다중 시료의 서열분석에 이러한 바코드를 이용한 시료의 구분은 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Mol. Ecol. 19, 2455-473 (2010)], 문헌], 문헌[Biology 2012, 1(3), 895-905] 등을 참조할 수 있다.
또 본 발명의 동시분석 방법에서, 상기 본 발명의 표적 단백질의 집단적 정량 방법에서처럼, 상기 (a) 단계의 단백질 시료와 핵산 시료로 나눠지기 전의 상기 분석 대상 시료에 그 시료 중에는 그 유사체(analog)도 존재하지 않는 2종 이상 외부 표준단백질을 서로 다른 정량값으로 첨가하고 그 외부 표준단백질에 특이적 압타머를 상기 압타머 라이브러리에 포함시켜 그 외부 표준단백질에 대한 검출 결과를 표적 단백질의 정량에 이용할 수 있다. 이와 관련하여 더 구체적인 것은 상기 본 발명의 표적 단백질의 집단적 정량 방법에서 설명한 바를 그대로 참조할 수 있다.
또 본 발명의 동시분석 방법에서, 표적 단백질의 정량을 위하여 상기 2종 이상의 외부 표준단백질을 사용하는 것과 마찬가지로, 핵산 정량을 위하여, 상기 (a) 단계의 분석 대상 시료에 그 시료에는 시료에는 존재하지 않는 2종 이상의 외부 표준핵산을 서로 정량값으로 첨가할 수도 있다. 이 경우도 외부 표준핵산의 정량값은 표적 핵산의 정량에 유용하게 이용될 수 있다. 이러한 외부 표준핵산은 정량하고자 하는 표적 핵산을 고려하여 그 표적 핵산에 상응하게 적절한 크기로 제작될 수 있는데, 예컨대 표적 핵산이 mRNA이고 그 크기가 lkb일 경우, 800b 내지 1200b로 제작될 수 있다, 또한 외부 표준핵산은 동류의 핵산 즉 표적 핵산이 mRNA이면 poly A가 3' 말단에 접합된 RNA로 제작될 수 있다. 이러한 외부 표준핵산의 적절한 선택도 상기 외부 표준단백질에서와 같이 현재 유전체 서열 분석이 완료된 생물종에 대한 유전정보와 분석 대상 시료가 얻어진 생물종에 대한 유전정보를 비교함으로써 이루어질 수 있다. 이러한 외부 표준핵산도 외부 표준단백질과 마찬가지로 시료 준비 등에서의 차이(variation) 등에 대한 정도관리(quality control)를 위하여 사용될 수 있다. 이러한 외부 표준핵산도 2종 이상이라면 특별한 제한없이 수종 내지 수백종까지 서로 다른 정량값으로 사용될 수 있다.
또 본 발명의 동시분석 방법에서도, 상기 본 발명의 표적 단백질의 집단적 정량방법에서처럼 각 표적 단백질의 압타머 및 각 표적 핵산에 대응하는 이미 서열이 결정된 참조서열을 상기 (c) 단계의 정량과 서열 결정 등에 이용할 수 있으며, 또 표적 단백질이 미지의 단백질일 경우는 그에 대한 압타머를 이용하여 분리, 동정하는 단계가 추가로 포함될 수 있다.
기타 본 발명의 동시분석 방법에 대해 구체적으로 설명되지 않은 기술적 사항들에 대해서는 상기 본 발명의 표적 단백질의 집단적 정량 방법과 관련하여 설명한 바가 그대로 유효하며 그 해당 부분을 참조할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 NGS 기술을 이용하여 분석 대상 시료의 표적 단백질을 집단적으로 정량하는 방법 등을 제공할 수 있다.
도 1은 인단 혈청 단백질 시료에서 많은 양으로 존재하는 단백질을 제거한 후의 전기영동 결과이다.
도 2 및 도 3은 각각 분자결합핵산 일차 라이브러리에 대해 SSH를 수행하여 2차 라이브러리의 제조 과정의 모식도와 그 전체적인 흐름도이다.
도 4는 분자결합핵산 일차 라이브러리에 대해 DSN를 이용하여 2차 라이브러리의 제조하는 과정의 전체적인 흐름도이다.
도 5는 DSN를 이용하여 얻은 2차 라이브러리의 감산화 정도를 전기영동하여 평가한 결과이다.
도 6은 분자결합핵산 일차 라이브러리를 구성하는 분자결합핵산의 염기서열 및 출현빈도를 계산하여 각각 분석시료(S) 및 비교시료(C)에 대해서 나타낸 결과이다.
도 7은 분자결합핵산 2차 라이브러리의 1,149개 분자결합핵산들로 분석시료인 심근경색환자 혈청과 비교시료인 불안정성 협심증 환자의 혈청을 분석하여 얻은 100개의 분자결합핵산의 분포를 나타낸 그래프 결과이다.
도 8은 분자결합핵산 2차 라이브러리의 1,149개 분자결합핵산들로 분석시료인 심근경색환자 혈청과 비교시료인 불안정성 협심증 환자의 혈청을 분석하여 얻은 100개의 분자결합핵산들 이용하여 시료를 클러스터링한 결과도이다.
도 9는 분석시료인 심근경색환자혈청과 비교시료인 불안정성 협심증환자 혈청에 대해 생물학적 의미 분석에 기여하는 특정 분자결합핵산에 대해 전기영동 방법으로 분석한 결과(a)와 이 전기영동 밴드의 밀도를 나타낸 그래프(b)이다.
도 10은 항암물질 처리 세포와 비처리 세포의 단백질에 결합하는 정도를 분석하여 선정된 분자결합핵산을 형광물질로 표지하여 항암물질 처리 세포와 비처리 세포를 관찰한 결과이다.
도 11은 선정된 간암세포주 특이 분자결합핵산의 간암세포주(Hep3B)에 대한 특이적 결합을 확인한 결과이다.
도 12는 Hep3B 분자결합핵산-siRNA cdk2 complex을 간암세포주에 다양한 방법으로 처리한 후 cdk2 mRNA를 분석한 결과이다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하는 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
<실시예 1> 단일가닥핵산 라이브러리 제조
<실시예 1-1> 단일가닥핵산 라이브러리의 올리고뉴클레오티드 및 프라이머
표적 단백질 집단을 포함하는 생체시료(분석시료 및 비교시료)와 반응시킬 단일가닥핵산　라이브러리　제조를　위하여, 아래 <일반식 I> 구조의 올리고뉴클레오티드들(무작위 단일가닥핵산들)을 제조하였다(한국,　바이오니아).
먼저 상기 <일반식 I> 구조의 단일가닥핵산 라이브러리를 구성하는 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드를 5'보존영역-가변영역-3'보존영역으로 구성되어 있다.
<일반식 I> 올리고뉴클레오티드 구조:
5'-GGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCCN50 CATAACCCAGAGGTCGATGGATCCCCCC-3'
상기에서 밑줄 친 염기서열은 단일가닥핵산 라이브러리의 기지의 서열로 이루어진 고정된 부위인 보존영역이며, 가변영역인 50개 염기의 N50은 각 위치에 A, G, T, C 등의 염기들이 같은 농도로 존재한다.
상기 <일반식 I>의 올리고뉴클레오타이드를 주형으로 하여 PCR 방법을 수행하여 이중가닥 DNA 라이브러리를 제조하였다. 이때 사용되는 프라이머는 하기의 DS 정방향 프라이머(서열번호 1) 및 DS 역방향 프라이머(서열번호 2) 이다.
DS 정방향 프라이머:
5'-GGGGCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGG- 3' (서열번호 1)
DS 역방향 프라이머:
5'-GGGGCATCGACCTCTGGGTTATG-3' (서열번호 2)
상기 DS 정방향 프라이머(서열번호 1)는 상기 <일반식 I> 구조의 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 밑줄친 서열과 상보결합을 할 수 있다. 또한, 서열번호 1의 밑줄로 표시된 부분은 박테리오파지 T7의 RNA 폴리머라아제를 위한 T7 프로모터 서열이다.
PCR에 이용되는 상기 DS 역방향 프라이머(서열번호 2)는 상기 <일반식 I> 구조의 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 밑줄 친 부분의 서열과 상보결합을 할 수 있다.
PCR (Polymerase Chain Reaction)을 수행은 상기 <일반식 I> 구조의 단일가닥핵산 라이브러리를 주형으로 상기 DS 정방향 프라이머(서열번호 1) 및 상기 DS 역방향프라이머(서열번호 2)를 사용하여 이루어졌다.
구체적으로, 1,000 pmole의 단일가닥핵산 라이브러리, 2,600 pmole DS 프라이머 쌍(DS 정방향 프라이머, DS 역방향 프라이머)을 60mM KCl, 10mM Tris-Cl (pH 8.3), 3mM MgCl2, 0.5mM dNTP(dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP) 및 0.1U Taq DNA Polymerase (Perkin-Elmer, Foster City Calif.)를 혼합하여 PCR을 수행한 후, QIAquick-spin PCR 정제 칼럼(QIAGEN Inc., Chatsworth Calif.)으로 정제하였다. 이렇게 하여　T7 프로모터가　있는　이중가닥핵산　DNA를　제조하였다．
해당 PCR 산물은 T7 프로모터를 포함하는 이중가닥 DNA이며, 그것의 일반 구조식은 아래의 <일반식 Ⅱ>와 같다.
<일반식 Ⅱ> PCR산물:
5'-GGGGGCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCCN50 CATAACCCAGAGGTCGATCCCC-3'
아래에서 기술되는 RT-PCR를 위한 프라이머는 "RS 정방향 프라이머(서열번호 3)" 및 "RS 역방향 프라이머(서열번호 4)"이며 이들의 염기서열은 아래와 같다.
RS 정방향 프라이머:
5'-CGGAAGCGTGCTGGGCC-3' (서열번호 3)
RS 역방향 프라이머:
5'-TCGACCTCTGGGTTATG-3' (서열번호 4)
<실시예 1-2> 단일가닥핵산 RNA 라이브러리의 제조
본　실시예에서는　생체시료(분석시료 및 비교시료)와 반응할 RNA 단일가닥핵산　라이브러리를 제조하였다. 이 RNA 단일가닥 핵산 라이브러리는　변형된　뉴클레오티드인 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA 라이브러리이며, <실시예 1-1>에서 제조된 ＜일반식　Ⅱ> 구조의　PCR 산물을 이용하여　2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA 단일가닥핵산들을, DuraScribe T7 Transcription Kit (EPICENTRE, USA)로 생체외 전사를 수행하여 합성하고 정제하여 제조하였다.
구체적으로 300 pmoles 상기 제조된 이중가닥 DNA, 50mM Tris-Cl (pH 8.0), 12mM MgCl2, 5mM DTT, 1mM spermidine, 0.002% Triton X-100, 4% PEG 8000, 5U T7 RNA Polymerase 그리고 1mM (ATP, GTP) 및 3mM (2'F-CTP, 2'F-UTP)를 혼합하여 37℃에서 6 ~ 12시간 동안 반응시킨 후, Bio-Spin 6 크로마토그래피 칼럼(Bio-Rad Laboratories, Hercules Calif.)으로 정제한 후, UV 스펙트로미터를 이용하여 정제된 핵산의 양 및 그 순도를 분석하였다.
<실시예 1-3> 정도관리 및 측정용 외부 표준물질의 제조
외부 표준단백질은 아래 [표 1]에서 같이 미시간주립대학교의 플랜트지놈믹스(Plant Genomics of Michigan State University, http://genomics.msu.edu/plant_specific/)에서 확보한 인간에서는 그 유사체(analog)도 존재하지 않는 A, B, C, D 및 E 등 5개 종류의 식물(애기장대) 특이 단백질을 대장균 발현시스템을 사용하여 제조하여 사용하였다.
식물특이단백질
종류 Locus 내 용 Accession number
A At1g65390.1 defense/immunity protein GO:0003793
B At5g39310.1 cell elongation GO:0009826
C At4g15910.1 Drought-Induced Protein (Di21) GO:0009414
D At1g12860.1 Bhlh Protein GO:0003677
E At4g02540.1 Chloroplast Thylakoid Lumen Protein GO:0009543
<실시예 2> 분자결합핵산 일차 라이브러리 제조
<실시예 2-1> 분자결합핵산 일차 라이브러리 제조
분자결합핵산　일차 라이브러리를　제조하기 위하여,　단백질 집단을 포함하는 생체시료인 혈청을 시료로　사용하였고, 심근경색 환자의 혈청을 분석시료, 불안정성 협심증 환자의 혈청을 비교시료로 사용하였다.
유용한 표적 단백질의 검출 민감성을 높이기 위하여 제조사에서 제공하는 방법에 따라 MARC 칼럼(Agilent Technologies Inc. USA)을 이용하여 환자의 혈청에 과량으로 존재하는 단백질을 제거한 것을 실제 실험에 시료로 사용하였다. 이들 과량 존재하는 단백질을 제거한 분석시료와 대조시료의 전기영동 결과는 [도 1]에 나타내었다.
분자결합핵산 일차 라이브러리의 제조를 위해서, 먼저 상기 분석시료(심근경색 환자의 혈청에서 과량 존재하는 단백질을 제거한 시료임)의 단백질 집단에 특이적인 RNA 단일가닥핵산 풀을 제조하고, 다음 이 특이적인 RNA 단일가닥핵산 풀을, 과량 존재하는 단백질이 제거된 분석시료와 대조시료에 반응시켜 각 시료에 대한 분자결합핵산 일차 라이브러리를 제조하였고, 이 일차 라이브러리를 이용하여 NGS 적용을 위한 시퀀싱 라이브러리를 제조하였다.
시료에 특이적인 단일가닥핵산 풀의 제조는, 먼저 상기 <실시예 1>에서 합성된 RNA 단일가닥핵산 라이브러리를 심근경색 환자의 혈청에서 과량 존재하는 단백질을 제거한 분석시료와 반응시켜 단백질과 RNA 단일가닥핵산의 복합체를 형성시키고 동일한 세척버퍼로 세척 과정을 반복함으로써 미결합 또는 비특이적 RNA 단일가닥핵산을 제거하였다. 다음 복합체 풀을 분리하고, 복합체에서 RNA 단일가닥핵산을 해리시켜 얻어진 RNA 단일가닥핵산 풀을 상기 <실시예 1>의 RS 정방향 프라이머와 RS 역방향 프라이머를 이용하여 RT-PCR(Reverse transcription－PCR)로　증폭하고, 그 증폭물에 대해 상기 실시예 1과 같은 방법으로 생체외 전사를 수행하여 RNA 단일가닥핵산 풀을 얻었다.
이 RNA 단일가닥핵산 풀의 제조 과정을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
먼저 상기 <실시예 1-2>에서 제조된 300pmol RNA　라이브러리의 1014 염기서열/㎖의 농도 용액 300㎕을 첨가한 반응용액(50mM HEPES, pH 7.5, 125mM NaCl, 5mM KCl, 5mM NgCl2, 1mM EDTA, 0.05% TWEEN-30)을 80℃에서 10분간 가열한 후, 얼음에 10분간 방치하였다.
상기 사용한 단일가닥핵산의 5배의 효모 tRNA(yeast tRNA, Life Technologies사)와 0.2% BSA(bovine serum albumin, Merck사)을 상기 반응용액에 첨가하여 비특이 반응 차단완충용액을 제조하였다.
혈청단백질을 NC(Nitrocellulose membrane) 막 조각(0.3 × 0.3 mm2)에 고정시키기 전에, 상기 RNA　라이브러리가 첨가된 반응용액에 100mM DTT 60㎕를 첨가하였으며, 상기 비특이 반응 차단완충용액에 100mM DTT, 10% BSA 400㎕를 첨가하였다.
1.5㎖ 결합 반응 튜브에서 반응용액 (50mM HEPES, pH 7.5, 125mM NaCl, 5mM KCl, 5mM NgCl2, 1mM EDTA, 0.05% TWEEN-30) 60㎕와 제조된 혈청단백질 600㎍를 혼합하였다. 탭핑(tapping) 후 quick-spin하여 NC 막이 완전히 반응용액에 잠기도록 해주었다. 100rpm에서 40분간 교반기를 이용하여 혼합하였다.
NC 막을 상온에서 10분 건조시킨 후 새로운 1.5㎖ 튜브에 넣었다. 상기 비특이반응 차단완충용액 300㎕ 첨가하고 100rpm에서 40분간 교반기를 이용하여 혼합하여 준 후 NC 막을 새로운 1.5㎖ 튜브로 옮겼다. 500㎕의 반응용액을 첨가하고 100rpm에서 10분간 교반기를 이용하여 혼합하여 준 후 NC 막을 새로운 1.5㎖ 튜브로 옮겼다. 다시 500㎕의 반응용액 첨가하고 100rpm에서 10분간 교반기를 이용하여 혼합하여 준 후 NC 막을 새로운 1.5㎖ 튜브로 옮겼다. 이후 비결합 혈청단백질을 제거하기 위한 세척 단계는 반응용액을 이용하여 수행하였다.
여기에 상기 RNA 단일가닥핵산 풀이 첨가된 반응용액(100ng/㎕) 5㎕와 결합완충용액 195㎕를 첨가하여 300 rpm에서 40분간 교반기를 이용하여 혼합한 후 NC 막을 새로운 1.5㎖ 튜브로 옮겼다. 반응용액 500㎕를 첨가하여 100rpm에서 10분간 교반기를 이용하여 혼합하여 준 후 NC 막을 새로운 1.5㎖ 튜브로 옮겼다. 다시 반응용액 500㎕를 첨가하여 100rpm에서 10분간 교반기를 이용하여 혼합하여 준 후, NC막을 새로운 1.5㎖ 튜브로 옮겼다.
NC 막을 Whatman filter paper 위에 놓고 상온에서 10분간 건조하였다. 건조된 NC 막을 새로운 1.5㎖ 튜브에 넣고, DEPC 멸균 정제수 50㎕를 첨가하였다. 95℃ heat block에서 10분간 두어 RNA를 용리하였다. 탭핑(tapping)하여 막에 붙은 RNA를 용리하고 quick-spin한 후, 얼음에 두었다. 다음 PCR 튜브에 옮기고, 36℃에서 다음 과정인 상기 <실시예 1>의 RS 정방향 프라이머와 RS 정방향 프라이머를 사용하여 역전사 반응과 PCR 반응을 수행하고 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 생체외 전사를 수행하여 RNA 단일가닥핵산 풀을 제조하였다. 상기에서 인간혈청시료 단백질과 결합하는 분자결합핵산 일차 라이브러리의 준비는 인간혈청시료의 단백질과 RNA 라이브러리를 반응시키고 다양한 세척버퍼(0 내지 1×의 반응용액, 0 내지 5% Tween-30 또는 0 내지 600mM의 EDTA 용액)로 세척하는 과정을 반복한 일회만의 선택과정을 통하여 수행하였다.
분자결합핵산 일차 단일가닥핵산 라이브러리의 제조는, 상기와 같이 얻어진 RNA 단일가닥핵산 풀을, 상기 방법과 같이 상기 각 분석시료와 비교시료에 각각 반응시켜 미결합 또는 비특이 RNA 단일가닥핵산을 제거하여 단백질과의 복합체 풀을 분리하고 그 복합체 풀에서 RNA 단일가닥핵산을 해리시켜 이루어졌다. 이때 세척 과정은 1회만을 수행하였다.
다음 상기 분자결합핵산 RNA 단일가닥핵산에 대해 역전사를 수행하여 cDNA를 제조하고 이 cDNA에 대해서 일방향 PCR(One-way PCR)를 1회 수행하여 이중가닥 DNA 단편을 얻고, 이에 대해서 후술하는 바와 같이 NGS 분석을 수행하였다.
<실시예 2-2> 외부 표준단백질을 포함한 시료에 대한 분자결합핵산 일차 라이브러리 제조
상기 실시예 1의 외부 표준단백질을 분석시료 또는 대조시료의 표적 단백질의 정량에 이용하기 위해서, 먼저 <실시예 1>에서 합성된 RNA 단일가닥핵산 라이브러리를 사용하여, 표준 SELEX 방법(Ellington, A.D. and J.W. Szostak. 1990. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature 346: 818-822; Gold, L., P.Allen, J. Binkley, D. Brown, D. Schneider, S.R. Eddy, C. Tuerk, L. Green, S. Macdougal, and D. Tasset. 1993. RNA: the shape of things to come, pp. 497-510. In: R.F. Gestelend and J.F. Atkins (eds.). The RNA World, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)을 이용하여 각 외부 표준단백질에 대해 특이적으로 결합하는 RNA 단일가닥핵산을 확보하였고, 기존 공지의 BAC library 구축을 통한 클로닝에 의한 서열 결정 방법(Genome Res. 2001 Mar; 11(3):483-496)을 적용하여 그 서열을 미리 결정하였다.
상기 <실시예 1>에서 제조된 외부 표준단백질 5종에 대해서, A는 0.01pg/ml, B는 1.0pg/ml, C는 100.0pg/ml, D는 10.0ng/ml, E는 1.0ug/ml의 농도로 분석시료와 비교시료에 각각 첨가하여 본 실시예의 분석 대상 시료로 사용하였다. 또 이 시료와 반응시킬 RNA 단일가닥핵산 풀에도 각 외부 표준단백질에 대해 특이적으로 결합하는 RNA 단일가닥핵산을 첨가하여, 시료와 반응할 RNA 단일가닥핵산 풀을 제조였다. 다음은 상기 5종의 외부 표준단백질이 각기 다른 농도로 첨가된 각 시료와 상기 외부 표준단백질에 대한 RNA 단일가닥핵산이 첨가된 RNA 단일가닥핵산 풀을 반응시켜 상기 <실시예 2-1>과 동일한 방법으로 분자결합핵산 일차 라이브러리를 제조하고, 이에 대해서 역전사와 일방향 PCR를 1회 수행하여, 그 결과물에 후술하는 바와 같이 NGS 분석을 수행하였다.
<실시예 3> 분자결합 헥산 이차 라이브러리의 제조
<실시예 3-1> SSH을 이용한 분자결합핵산 이차 라이브러리 제조
SSH 분자결합핵산 2차 라이브러리의 제조는 [도 2] 및 [도 3]에 제시된 단계에 따라 수행하였다.
상기 <실시예 2>에서 제조된 분석시료의 단백질에 대한 분자결합핵산 일차 RNA 라이브러리외 비교시료의 단백질에 대한 분자결합핵산 일차 RNA 라이브러리를 주형으로 RT-PCR를 수행하였으며 DNA 풀을 제조하였다. 상기 RT-PCR은 표준방법에 따라 수행하였다.
구체적으로, 역전사(Reverse transcription)의 수행을 위하여, PCR 튜브에 일차 라이브러리를 포함하는 반응액 36㎕를 옮겨주고, 5x 역전사 완충용액을 10㎕, RS 역방향 프라이머 (25pmol/㎕) 용액 1㎕를 첨가하여 혼합하였다. 상기의 혼합액을 PCR 장치를 이용하여 65℃에서 5분 반응후, 25℃로 10분간 반응시켰다. DEPC 멸균 정제수 1.5㎕, 30mM dNTP 1㎕, AMV RTase (10u/㎕ BEAMS, Cat. No.4001L) 0.5㎕를 포함한 혼합액을 제조하였으며 반응이 끝난 PCR 튜브에 3㎕ 첨가하여 최종 부피가 60㎕가 되게 하였다. 상기 PCR 튜브는 PCR 장치를 이용하여 37℃에서 40분, 95℃에서 5분간 반응시켰다.
이어서 PCR 반응을 다음과 같이 수행하였다. 생성물 cDNA를 증폭하기 위한 PCR 증폭 반응은 먼저 RT 반응물 60㎕에 10x PCR 완충용액 10㎕, 30mM dNTP 1㎕, DS 정방향 프라이머 (25pmol/㎕) 1㎕ , DS 역방향 프라이머 (25pmol/㎕) 1㎕, Taq ploymerase (5u/㎕) 0.5㎕, 3차 멸균 정제수 36.5㎕를 첨가하여 최종 부피가 100㎕가 되도록 PCR 혼합액을 제조하였다. PCR 기계를 이용하여 95℃에서 5분간 예비 변성, 95℃에서 40초간 변성, 55℃에서 40초간 결합, 72℃에서 40초간 신장의 과정을 25 회 반복한 후 72℃ 에서 5분간 최종 신장의 반응을 수행한다.
PCR 생성물을 1.5㎖ 튜브로 옮기고 100㎕ D.W.를 첨가하여 부피를 300㎕로 증가시키고 동부피의 phenol:chloroform:isoamylalcohol을 300㎕ 첨가하였다. Vortex로 혼합한 후, 13,000rpm에서 1분간 원심분리하고 상층액을 새로운 1.5㎖ 튜브에 옮겼다. 2배 부피의 100% 에탄올과 0.1배 부피의 3M Sodium Acetate(pH 5.2)를 첨가하여 혼합한 후, -30℃ 에 최소 60분간 또는 80℃에 최소 10분간 보관하였다. 보관한 튜브를 4℃, 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 70% 에탄올을 600㎕를 첨가해 준 후, 4℃, 13,000rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거했다.
상기 튜브를 건조 시킨 후, 3차 멸균 정제수 40㎕를 첨가하여 용해시켰다. 2.5% agarose gel에 5㎕를 loading하고 60bp ladder DNA marker 3㎕를 로딩한 후 100bp 밴드를 기준으로 Alphaimager program(BIO-RAD 사, 미국)으로 정량하였다.
이렇게 준비된 분석시료 단백질에 결합하는 분자결합핵산 일차 라이브러리의 PCR 산물 "예비테스터"로 사용하고, 이 예비테스터로부터 SSH에 사용할 테스터를 제조하고, 또 비교시료 단백질에 결합하는 분자결합핵산 일차 라이브러리의 PCR한 산물을 드라이버로 사용하였다.
예비테스터로부터의 테스터1 및 테스터2는 표준방법으로 PCR을 수행하여 제조하였다. 이때 테스터1의 제조에는 새로이 디자인한 아댑터1과 RS 정방향 프라이머(서열번호 5에서 밑줄친 부분)로 이루어진 SSH 정방향 프라이머(SSH 정방향 프라이머_테스터1, 서열번호 5)와 RS 역방향 프라이머를 사용하였고, 데스터2의 제조에는 RS 정방향 프라이머와, 아탭터2와 RS 역방향 프라이머(밑줄친 부분)로 이루어진 SSH 역방향 프라이머(SSH 역방향 프라이머_테스터2, 서열번호 6)를 사용하였다.
SSH 정방향 프라이머_테스터1:
5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTCGGAAGCGTGCTGCC-3' (서열번호 5)
SSH 역방향 프라이머_테스터2:
5'-CAGCGTGGTCGCGGCCGAGGTTCGACCTCTGGGTTATG-3'(서열번호 6)
1.5㎕인 30ng 테스터1, 1.5㎕인 600ng 드라이버 PCR 산물, 1.0㎕ 4x 혼성화용액(300m MHEPES pH 7.5, 2M NaCl, 0.8m MEDTA)을 혼합하여 반응부피 4.0㎕ 로 60℃에서 1차 혼성화를 12시간정도 수행하였고, 1.5㎕인 30ng 테스터 2(서열번호 6), 1.5㎕인 600ng 드라이버 PCR 산물, 1.0㎕ 4× 혼성화용액을 혼합하여 반응부피 4.0㎕로 95℃에서 5분간 처리한 후, 60℃에서 1차 혼성화를 12시간 정도 수행하였다. 편의상 전자는 "테스터1 혼성용액", 후자는 "테스터2 혼성용액"이다.
테스터2 혼성용액을 드라이버 혼성용액에 조심스럽게 넣어 혼합하고 이 혼성용액(테스터2 혼성용액와 드라이버 혼성용액의 혼합 혼성용액)을 다시 테스터1 혼성용액에 넣어 피펫으로 잘 혼합한 후, 60℃에서 12시간동안 2차 혼성화를 실시하였다. 드라이버 용액은 1.0㎕인 130㎍ 드라이버, 1.0㎕ 4x 혼성화용액, 2 ㎕ 물을 혼합한 후, 소량의 mineral oil를 첨가하여 PCR 장치를 이용하여 98℃에 90초간 처리하여 제조하였다. 2차 혼성화반응이 종결된 용액에 Taq polymerase를 첨가하여 75℃에서 5분간 신장(extension) 반응을 수행하여 2차 혼성화 산물의 이중가닥 핵산의 5' 끝과 3' 끝의 cohesive end에 염기를 추가하여 blunt end로 전환시켰다.
신장반응이 종결된 용액에 대해 아래와 같이 디자인된 "아댑터 1 프라이머"(서열번호 7) 와 "아댑터 2 프라이머"(서열번호 8)를 사용하여 표준방법에 따라 PCR를 수행하였다.
아댑터 1 프라이머:
5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3' (서열번호 7)
아댑터 2 프라이머:
5'-CAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3' (서열번호 8)
이렇게 얻어진 PCR 산물에 대해 "RS 정방향 프라이머"(서열번호 3)와 "RS 역방향 프라이머"(서열번호 4)를 이용하여 표준방법으로 Nested PCR을 수행하였다.
상기 PCR 증폭 산물에 대해서 NGS 분석을 수행하였다.
<실시예 3-2> DSN을 이용한 분자결합핵산 2차 라이브러리의 제조
[도 4]에서 확인되는 단계에 따라 DSN(Duplex-Specific Nuclease)을 이용하여 감산화를 통해 분자결합핵산 2차 라이브러리를 제조하였다.
이 DSN을 이용한 분자결합핵산 2차 라이브러리의 제조를 위해서, <실시예 2>에서 제조된 분석시료 단백질에 대한 분자결합핵산 RNA 라이브러리의 RT-PCR 산물을 테스터로 사용하고, 비교시료 단백질에 대한 RNA 분자결합핵산 라이브러리의 RT-PCR 산물을 드라이버로 사용하였다.
데스터로부터 상기 SSH 정방향 프라이머_테스터1와 상기 SSH 역방향 프라이머_테스터2를 프라이머로 하여 PCR를 수행한 후 상기 SSH 정방향 프라이머_테스터1을 사용하여 PCR 수행하여 데스터 이중가닥 DAN를 얻었다. 드라이버에 대해서는 RS 정방향 프라이머와 RS 역방향 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 이중가닥 DNA를 얻었다.
이렇게 제조된 이중가닥 DNA에 대해서 혼성화시킨 후 DSN를 처리하였다. 구체적으로 이중가닥 DNA 100ng/㎕를 제조하여 1.5㎕씩 나누어 PCR 튜브에 넣은 후, 추가적으로 1㎕의 4x 혼성화용액 및 1.5㎕의 증류수를 넣고 미네랄 오일(mineral oil)을 오버레이 하였다. 98℃에서 3분간 가열한 후 60℃씩에서 4시간 동안 혼성화하였다. 혼성화를 종결한 후, 60℃ 예열된 5㎕의 2x DSN 버퍼(100mM Tris HCl pH 8.0, 10mM MgCl2, 2mM dithiothreitol)를 혼합 반응물에 첨가하였다. 이어서 0.25 Kunitz units의 DSN 효소(Wako 사, 일본)를 첨가하여 반응시켰다. 30분간 반응시킨 후, 10 ㎕의 5mM EDTA를 첨가하여 반응을 종결시켰다.
이러한 반응 결과물에 대해서 60㎕에 10x PCR 완충용액 10㎕, 30mM dNTP 1㎕, SSH 정방향 프라이머 _테스터1 (25pmol/㎕) 1㎕, SSH 역방향 프라이머_테스터2 (25pmol/ul) 1㎕, Taq ploymerase (5u/㎕) 0.5㎕, 3차 멸균 정제수 36.5㎕를 첨가하여 최종 부피가 100㎕가 되도록 PCR 혼합액을 제조하였다. PCR 기계를 이용하여 95℃ 에서 5 분간 예비변성, 95℃ 에서 40 초간 변성, 55℃ 에서 40초간 결합, 72℃ 에서 40초간 신장의 과정을 25 회 반복, 72℃ 에서 5분간 최종 신장의 반응을 수행하였다. 이어서 1㎕의 Exonuclease I을 처리하여 40분간 반응시켜 남아있는 단일가닥핵산을 제거하였다.
이렇게 얻어진 증폭물에 대해서 "RS 정방향 프라이머"(서열번호 3)와 "RS 역방향 프라이머"(서열번호 4)를 이용하여 표준방법으로 Nested PCR을 수행하였다.
상기 PCR 증폭 산물에 대해서 NGS 분석을 수행하였다.
<실시예 3-4> 감산화의 평가
분자결합핵산 일차 라이브러리의 감산화된 정도의 평가를 위하여 혈청 시료를 NC막에 처리하여 고정시킨 후, 감산화된 DSN을 이용한 분자결합핵산 2차 라이브러리를 처리하여 반응시켰다. 혈청단백질에 결합한 분자결합핵산을 상기의 NC막으로부터 분리하여 이를 주형으로 RT-PCR을 수행하고 전기영동하여 그 결과를 확인하였다.
본 실시예에서는 분석시료로 심근경색 환자의 혈청을 사용하였으며 비교 시료로 불안정성 협심증 환자의 혈청을 사용하였다. 감산화를 실시하여 얻은 분자결합핵산 라이브러리를 평가한 결과는 [도 5]와 같다. 분석시료는 강한 밴드가 형성되었으며 비교시료는 약한 밴드가 형성이 되어, 비교시료에 의해 분석시료가 감산화 되었음을 확인할 수 있다.
<실시예 4> 분자결합핵산 라이브러리의 염기서열 결정 및 출현빈도 결정
상기에서 실시예에서　제조된　분자결합핵산 일차　라이브러리의 RT-PCR 산물인 이중가닥 DNA 풀과 분자결합핵산　이차　라이브러리의 RT-PCR 산물인 이중가닥 DNA 풀에 대해 NGS(Next Generation Sequencing) 기술을 적용하여 그 분자결합핵산들의 염기서열과 그　출현 빈도를 결정하였다.
NGS 분석은 상기 DNA　풀을 대상으로　HiSeq 3000(Illumina 사)를　사용하여　실시하였다.
상기 실시예에서 제조된　DNA 풀과 TruSeq DNA sample preparation kit v. 2 (Illumina 사)를 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 제조하였다. 구체적으로 제조사의 프로토콜에 따라 136ng의　DNA의 말단 부위 수리(end repair), 아데노신의　추가, 어댑터 부가를 수행하고 PCR을 수행 하였다. 아데노신 염기 추가 단계를 제외하고 각 단계마다 TruSeq 키트에　포함된　Agencourt AMPure XP beads(Beckman-Coulter사, 미국)로 세척하였다. 다음 제조사의 프로토콜에 따라 키트에 포함된 PCR 프라이머를사용하여　15　cycles의　PCR을　수행하여　시퀀싱　라이브러리를　제조하였다.
상기 PCR 산물인　시퀀싱　라이브러리는 Qubit　fluorometer(Invitrogen 사)로 정량하였다. HiSeq 3000의 cBOT cluster station에 한 시료당　3ng PCR 산물을　5pM의 농도로 flowcell에서　혼성화하였다. cBOT에서 브리지 증폭(bridge amplification)을 분자결합핵산 라이브러리 단일 DNA 당 28번 증폭하여 클러스터를　형성시켰다. 각 클러스터는 선형화시킨 후 시퀀싱 프라이머와 혼성화하였다. 본　flowcell을　HiSeq 3000에　로딩하였으며　73 single read bases과　더불어 7 multiplexed bases를　염기서열 분석할　수　있는　HiSeq 3000의　Single Read 80 Base Pair Recipe를 사용하여 분석을 수행하였다. Illumina Real Time Analysis (RTA)로　이미지 생성 및 분석을　실시하여 실시간으로 base-call files과　품질 점수를 확인하였다.
순방향 및 역방향 가닥의 시퀸싱이 종료된 후, 제조사(Illumina 사) Casava 소프트웨어를 이용하여 품질분석을 수행하였으며 추가적으로 자체 개발한 소프트웨어(AptaCDSS, 바이오이즈),　분석시스템를 사용하여 다운 스트림 분석을 수행하였다.
품질분석의 매칭(Matching) 단계는, 단일가닥핵산 라이브러리를 구성하는 올리고뉴클레오타이드의 <일반식 I> 구조에서 5' 보존영역(17 bp), 가변영역(50 bp) 및 3' 보존영역(17 bp)를 포함하는 서열의 74 염기쌍(bp)의 패턴을 기준으로 비교 분석하였다. 필터링(Filtering) 단계는 상기 패턴과 일치하지 않는 임의의 서열을 제외하는 단계이다. 패턴 매칭 동안 각 보존영역에서 하나의 불일치는 허용하였다. 보존영역 서열은 다운 스트림 분석을 위해 50 bp의 가변영역 서열만 남기고, 필터링 후에 제외하였다. 역방향 보충 태그는 순방향 서열 태그와 결합하였다. 분자결합핵산 카운트 라운드 리드를 계수하는 과정은 round enrichment analysis로 수행하였다. 이러한 품질분석 및 카운트 라운드 결과를 이용하여 상기 라이브러리를 구성하는 특정한 분자결합핵산의 염기서열을 결정하고 출현빈도를 결정하였다.
서열 분석은 각 분자결합핵산의 DNA 풀 당 15,000,000 내지 18,000,000개의 단일 DNA에 대해서 이루어졌다.
분석시료(S)에서 준비된 분자결합핵산 일차 라이브러리와 비교시료(C)에서 준비된 분자결합핵산 일차 라이브러리 각각을 구성하는 5,395개의 분자결합핵산에 대한 염기서열과 출현빈도의 비율을 비교하여 서로 상이함을 확인하였다[도 6].
SSH 공정으로 제작된 분자결합핵산 이차 라이브러리를 구성하는 분자결합핵산 염기서열 분석은 상기 분자결합핵산 일차 라이브러리에서 결정된 분자결합핵산 염기서열로 구축된 참조 염기서열(reference sequences)과 EBI 웹 사이트 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)의 Omega Cluster로 클러스터링 분석하였다.
이러한 분석시료 및 비교시료를 비교 분석을 통하여, 분석시료를 대표할 수 있는 분자결합핵산으로 총 1,149개를 결정하였다.
<실시예 4-2>　분자결합핵산의　생물학적　의미　결정
심근경색 환자의 혈청(10례)을 분석시료로, 불안정협심증 환자의 혈청(21례)을 비교시료로 분석하였다[표 2]. 상기 실시예에서 결정된 1,149개의　분자결합핵산의　염기서열로　참조서열을　구축하였다. 시료를 1,149개의 분자결합핵산 라이브러리에 반응시킨 후 형성된 단백질-분자결합핵산 복합체 풀에서 분리된 분자결합핵산 풀의 RT-PCR 산물인 이중가닥 DNA를　핵산시료로　하여　시퀀싱　라이브러리를　제조하였다. 그 후 NGS로 리드를　생산하고　상기 참조서열과 비교하여 분자결합핵산의 출현빈도를 분석하였다. 생물학적　의미결정　시스템을 이용한,　1,149개의 분자결합핵산 출현빈도로 심금경색환자와 불안정협심증을 통계적인 방법으로 구분할 수 있는 분자결합핵산의 분포는 [도 7]과 같다.
상기 분석시료(10례)와 비교시료(10례) 각각에 대해 분석한 결과를 이용하여 분석시료와 비교시료에 대한 db를 구축하였으며 두 그룹을 잘 구분할 수 있는 분자결합핵산들을 One-way ANOVA 기법으로 결정한 후, 결정된 분자결합핵산의 출현빈도를 4*[(출현빈도-최소)/(최대-최소)]-2로 전환하여 표현한 결과는 [도 7]과 같다.
선정된 분자결합핵산의 출현빈도로 계층 클러스터링한 결과는 [도 8]과 같다. [도 8]에 도시된 바와 같이 심근경색 환자의 혈청과 불안정협심증 환자의 혈청은 각각 독립된 클러스터를 형성하고 있어, 인간 혈청단백질에 결합하는 분자결합핵산 출현빈도로 환자들의 구분할 수 있음을 알 수 있다.
심혈관질환자의 임상정보
심근경색 불안정협증
성별
남성 10 21
여성 0 1
나이
50-49 1 0
60-59 5 9
60-69 4 11
70-79 0 1
합계 10 21
상기 결과와 같이, 생체시료를 구성하는 다중의 단백질, 결합하는 분자결합핵산 및 NGS 기술을 이용하여 특정한 생체시료에서 단백질의 프로파일을 탐색 및 분석하여 분석시료인 심근경색 환자 혈청단백질에 특이적으로 결합하고 생물학적 의미를 지닌 분자결합핵산들을 선정할 수 있다. 이 중에 일련번호 768(분자결합핵산에 대해 자체 부여한 번호임) 분자결합핵산에 대한, 분석시료인 심근경색 환자의 혈청과 비교시료인 불안정협심증 환자의 혈청에 대한 결합정도를 평가한 결과, 심근경색환자의 혈청에만 특이적으로 반응함을 알 수 있었다[도 9].
<실시예 4-4> 기타 분자결합핵산 선정 및 용도 탐색
<4-4-1> 항암제　반응　단백질에 대한　분자결합핵산
분자결합핵산 선정
약물 반응성 모니터링을 할 수 있는 분자결합핵산 및 단백질을 조사하기 위해서 항암물질 독소루비신(doxorubin)을 처리한 세포와 비처리 세포의 총단백질을 생체시료로 준비하였다. 대상 암세포주는 간암세포주 Hep3B 시료이며, 최종농도 5ug/mL가 되도록 독소루비신을 간암세포주 배양액에 처리하였다. 처리 후 4시간 후에 독소루비신이 세포내로 흡수되는 것을 확인하였다.
독소루비신을 처리한 후 6시간 배양한 세포(분석시료) 및 비처리구 세포(비교시료)를 수확하여 총 단백질을 분리하였다. <실시예 1>에서 제조된 단일가닥핵산 라이브러리를 이용하여 각 세포주에 결합하는 분자결합핵산 일차 라이브러리 제조하였다. 상기 제조된 라이브러리를 상기 <실시예 3>에서와 같이 SSH을 하여 제조된 분석시료 간암세포주 SSH 분자결합핵산 라이브러리를 선별, 확보하였다.
분자결합핵산의 결합능 확인
상기 선별, 확보된 분자결합핵산 풀과 암세포주 Hep3B 분석시료와 비교시료를 반응시켜 분석시료 결합 분자결합핵산 풀 및 비교시료 결합 분자결합핵산 풀을 제조하여 NGS 기법으로 서열을 결정하고 단백질 프로파일을 생산하였다.
상기 분석시료 및 비교시료를 대상으로 생산되고 축적된 단백질 프로파일들을 ANOVA 검증을 하여 분석시료에 특이적으로 결합하는 분자결합핵산들을 선정하여 세포수준에서 결합능을 관찰하였다. 상기 선정된 분자결합핵산을 로다민(Rhodamine) 염색시약으로 표지하여 처리구 세포와 비처리구 세포를 염색하여 형광현미경으로 관찰한 결과 [도 10]과 같이 처리구 세포에 특이적으로 분자결합핵산이 결합하는 것을 확인하였다.
<4-4-2> 간암세포주 특이 분자결합핵산
분자결합핵산 선정
<실시예 1>에서 제조된 단일가닥핵산 라이브러리를 간암세포주 Hep3B 및 GIBCO Hepatocyte 시료에 처리하여 각 세포주에 결합하는 분자결합핵산 일차 라이브러리 제조하였다. 상기 제조된 라이브러리를 SSH을 하여 제조된 간암세포주 SSH 분자결합핵산 라이브러리를 선별, 확보하였다.
상기 선별된 분자결합핵산 풀과 암세포주 Hep3B 분석시료 및 GIBCO Hepatocyte 비교시료를 반응시켜 간암세포주 Hep3B 결합 분자결합핵산 풀 및 GIBCO Hepatocyte 결합 분자결합핵산 풀을 제조하여 NGS 기법으로 세포표면 프로파일을 생산하였다.
분자결합핵산의 결합능 확인
암세포주 Hep3B 분석시료 및 GIBCO Hepatocyte 비교시료를 대상으로 생산 및 축적된 세포표면 프로파일들을 ANOVA 검증을 하여 간암세포주 Hep3B에 특이적으로 결합하는 분자결합핵산들을 선정하였으며 세포수준에서 결합능을 관찰하였다[도　11]. 선정된 분자결합핵산들과 간암세포주 Hep3B 및 GIBCO Hepatocyte의 결합능을 특정 분자결합핵산을 상기 세포들에 결합시킨 후, 결합된 분자결합핵산들을 증폭하여 전기영동하여 확인한 결과 간암 세포주와 특이적으로 결합하는 핵산임을 확인하였다.
상기 선정된 분자결합핵산을 로다민(Rhodamine) 염색시약으로 표지하여 간암 세포주 Hep3B 및 GIBCO Hepatocyte를 염색하여 광학현미경으로 관찰한 결과, [도 11]에 나타난 바와 같이 간암세포주 Hep3B에 특이적으로 결합하고 GIBCO Hepatocytes에는 거의 결합 하지 못 함을 확인할 수 있었다.
분자결합핵산의 활용
다음으로, 암세포에서 많이 발현하여 종양유전자로 알려진 cdk2 유전자의 기능을 저해하는 cdk2 siRNA를 제작하였다. 간암세포주 특이 분자결합핵산에 결합시켜 간암세포주에 특이적으로 작용하는 복합체를 개발하였으며 그 기능을 확인하였다.
Hep3B 분자결합핵산-cdk 2 siRNA complex를 제작하여 transfection 방법 혹은 direct treatment로 세포에 도입하였다. 100 nM 또는 260nM의 농도로 Hep3B 분자결합핵산-cdk 2 siRNA complex를 처리하거나, 비교를 위하여 cdk 2 siRNA만을 처리하였다. 간암세포주 Hep3B를 이용하였으며 3일 동안 처리한 후 각 시료에서 총 RNA를 분리하여 cdk2 mRNA의 발현을 비교분석하였다. 해당 결과는 [도 12]에 나타내었다.
[도 12]의 첫번째 레인은 Hep3B 분자결합핵산-cdk 2 siRNA complex를 100nM로 처리한 결과이며 두번째 레인은 260nM로 처리한 결과이다. 세번째 레인은 100 nM cdk 2 siRNA 처리 결과이며 네번째 레인은 무처리군이다.
Transfection한 경우는 무처리군에 비해 Hep3B 분자결합핵산-cdk 2 siRNA complex 및 cdk 2 siRNA 모두에서 cdk2 mRNA의 양이 감소하였다. 그러나 direct treatment한 경우는 무처리군 및 siRNA 처리구와 비교하여 상대적으로 Hep3B 분자결합핵산cdk 2 siRNA complex 처리구에서 cdk2 mRNA의 양이 감소됨을 확인할 수 있다. 이 결과로 Hep3B 분자결합핵산-cdk 2 siRNA complex의 경우 complex에 있는 분석적 분자결합핵산이 간암세포주 Hep3B에 있는 단백질에 결합하여 세포 속으로 이동하여 siRNA로 작용하여 cdk2 mRNA의 양을 감소시켰음을 알 수 있다.
<실시예 5> 분자결합핵산에 결합하는 단백질 분리 및 동정
질환군별로 구성된 분자결합핵산의 데이터베이스를 비교분석하여 생물학적 의미 분석에 기여할 수 있는 유용한 스폿을 결정하였으며 이에 상응하는 분자결합핵산을 제조하였다. 이를 분자결합핵산을 이용하여 이 분자결합핵산이 특이적으로 결합하는 단백질을 분리하여 동정하였다.
구체적으로, 선정된 분자결합핵산(NABM)의 한쪽에 바이오틴(biotin)을 부착시키고 스트렙타비딘(streptavidin)과 반응시켰으며, 혈청시료와 반응시켜 혈청단백질-분자결합핵산 복합체를 얻었고, 이를 바이오틴이 고착된 지지체를 시용하여 시료에서 해당 복합체를 분리하였다. 다음 전기영동하여 형성되는 밴드를 분리하여 혈청단백질을 동정하였다. MALDI-TOF-TOF로, 분리된 단일가닥핵산에 결합하는 단백질의 아미노산서열을 결정하였다. 분자결합핵산과 이 분리, 동정된 단백질의 해리상수(Kd)가 30 × 10-9 미만인 것으로 나타났다 .
<실시예 7> 생체시료의　분석-핵산과 단백질의 동시분석
NGS(next generation sequencing)는 칩(Chip)기반 그리고 PCR 기반 페어드엔드(paired end) 방법으로, 전장 유전체를 조각내고 상기 조각을 혼성화(hybridization)하여 초고속으로 시퀀싱하는 기술이다. NGS를 이용하여 유전체에 대한 많은 정보를 생산할 수 있다.
NGS 기술을 이용하여, 인구집단의 2~5%에서 나타나는 대립유전자 유전형질 정보인 염기다형성(SNP: single nucleotide polymorphism)과 염기다형성의 결과로 Wild type 아미노산이 변형된 형태인 돌연변이(amino acid mutation)를 신속하게 분석할 수 있다. WGS(whole genome sequencing)는 차세대염기서열결정법(NGS)에 의한 전장 유전체 시퀀싱을 10×, 30×, 50× 등 여러 배수로 인간게놈을 읽는 방법이고 WES(whole exome sequencing)는 위의 WGS 중에서 단백질 생성에 관여하는 유전자 부위만 염기서열 결정을 하는 방법이며, TS(Target sequencing)는 위의 WGS중에서 표적분자 생성에 관여하는 유전자부위만 시퀸싱을 하는 기술이다. 따라서, WGS > WES > TS의 순으로 데이터 크기가 생성된다. 그러나 작은 부위를 분석대상으로 하는 경우 다수의 샘플을 시퀀싱할 수 있다는 장점이 있다. METseq은 유전자의 DNA methylation 측정을 위한 시퀀싱 기술이고, RNAseq은 유전자의 발현, 즉 DNA transcriptome을 위한 시퀀싱 기술이다. SV(structural variation)는 변이중에서 insertion, inversion, translocation 등에 의하여 생기는 염색체의　큰 단위(DNA segment)에서 생기는 변이로 이에 대한 정보도 NGS로 생산할 수 있다.
NGS 기술을 이용하여 단백질 및 핵산 정보를 동시에 생산하는 과정은 다음과 같다.
참조서열 구축
먼저, 분석하고자하는　핵산들의　염기서열과　분석하고자하는　단백질들의 압타머를　포함하는　분자결합핵산의　염기서열로　참조서열을　구축해야 한다. 본 실시예에서는 1,149개의 분자결합핵산의 염기서열과 분석하고자 하는 하기 핵산의 염기서열로 참조서열을 구축하였다.
<실시예 7-1> 단백질　분석
생체시료를 나누어 단백질 분석을 위한 시료를 준비하였다. 준비된 단백질 시료와　RNA　분자결합핵산　풀을　접촉시키고　형성된　단백질－분자결합핵산　복합체　풀을　분리하였다.　구체적으로 단백질 시료를　NC 디스크에　부착하고　압타머를　포함하는　분자결합핵산 풀과　반응 용액 내에서 접촉시켰으며　형성된　단백질－분자결합핵산　복합체　풀을　세척용액으로　세척하였다. 상기 과정을 통하여　미결합하거나　비특이적　결합　분자결합핵산을 제거하고　디스크를　분리하였다. 디스크에 부착된 다중 단백질과 결합하는 분자결합핵산 풀에서　확보한 RNA인　분자결합핵산을　대상으로　역전사 및　PCR를　수행하여　DNA　풀을　얻었다. 확보된　DNA 풀 136ng 이용하여 TruSeq DNA sample preparation kit v. 2(Illumina 사)로 end repair, 아데노신의　추가, 어댑터 부가 및 PCR을 수행하였다. 아데노신 염기 추가를 제외하고　각 단계마다 TruSeq 키트에　포함된　Agencourt AMPure XP beads(Beckman-Coulter)로 세척하였다. 제조사의 프로코톨에 따라 키트에 포함된 PCR 프라이머를　사용하여　15 회의 PCR을　하여 시퀀싱 라이브러리를 제작하였다.
<실시예 7-2> DNA 분석
핵산 정보를 분석하기 위하여, 표적유전자를 증폭하는 과정에서 올리고뉴클레오타이드의 특별한 디자인이 요구된다. 상기 올리고뉴클레오티드는 많은 표적들을 동시에 증폭하기 위한 목적을 지니며, 타겟-특이적 서열(타겟 혼성화 뉴클레오타이드 서열) 및 5'-플랭킹 어셈블리 스페이서　서열(오버래핑 서열)이 사용될 수 있다.
특정 온도에서 어닐링할 수 있는 최적의 길이를 가진 mTAS(multiple target loci assembly sequencing) 올리고뉴클레오타이드를 제작하기 위해, 본 발명자들은 컴퓨터 프로그램인 PrimerPlex2.75 software (PREMIER Biosoft, 미국)를 이용하였다. 올리고뉴클레오타이드 프로브는 타겟-특이적 서열(타겟 혼성화 뉴클레오타이드 서열) 및 5'-플랭킹 어셈블리 스페이서　서열(오버래핑 서열)로부터 제작되었다. 프로브들은 약 25 bp의 길이이며 Tm 60℃에서 어닐링될 수 있다.
각 타겟 게놈 유전자 위치(genomic locus)를 위해, SNP 위치를 포함하는 7 bp의 갭(gap)이 존재하도록(즉,　SNP 위치의 좌측, 3 bp; SNP 위치, 1 bp; 및 SNP 위치의 우측, 3 bp) 디자인하였다. 디자인의 용이성을 더하기 위하여 갭의 간격은 0-3bp로 조절되었다. 비록 어셈블리 스페이서 서열은 임의적으로 제조되었으나, 어셈블리 서열상에 존재하는 어닐링 부위는 올리고뉴클레오타이드 간의 중첩 부위(overlapping regions)에　대한 온도값(temperature value)을 계산하기 위해 가장 가까운 인접 방법(nearest neighbor methods; BMC Genomics. 2016; 17: 486. )에　기반하여 결정되었다.
생체시료에서 공지된 방법을 이용하여 핵산시료를 분리·준비하였다. 인간 혈청시료로부터 QIAamp DNA 추출 키트(Qiagen, 독일)를 이용하여 DNA(gDNA)를 추출하였다.
구체적으로, gDNA의 분리를 위해 혈청시료를 1.5㎖ 마이크로 원심분리튜브에 넣어 프로테아제(protease) K 30㎕　및 완충용액 180㎕와 혼합하였고, 1시간 동안 56℃에서 반응시켰다. 이와 같이 얻어진 반응액을 QIAamp 스핀 컬럼(spin column)을 이용하여 정제한 후, 완충 용액으로 2회 세척하였다. 그 다음, 70℃에서 예열한 완충용액　60㎕로 용해하여 gDNA를 추출하였으며 -30℃에 보관하였다. 추출한 각 gDNA는 Qubit　dsDNA HS Assay Kit와 Qubit 2.0(Life Technologies 사, 미국)를 사용하여 정량하였다.
-30℃에 보관되어 있는 gDNA 10 ng을 사용하여 17개의 표적유전자의 패널 프라이머를 이용하여 NGS 수행을 위한 라이브러리를 제작하였다. 해당 패널 프라이머를 아래의 [표 3]에 개시하였다.
NGS를 위한 라이브러리는 Ion AmpliSeq Library Kit 2.0(Life technologies사)를 사용하여 제작하였다.
구체적으로, 시료에서 추출한 DNA에서 표적유전자의 돌연변이 발생부위만을 얻어내기 위하여 상기 패널 프라이머풀을 이용하여 증폭하였다. 5X HiFi 마스터믹스 4㎕와 패널 프라이머풀 10㎕, DNA 10ng을 혼합하고,　총 반응액이 30㎕가 되도록 멸균 증류수로 보정하여 혼합 반응액을 준비하였다. 준비된 혼합 반응액을 PCR 기기에서 99℃에서 2분, 99℃에서 15초, 60℃에서 4분의 과정을 21회 반복하여 증폭하였다. 얻어진 증폭산물에 2㎕의 Fupa 시약(Thermo Fisher Scientific 사, 미국; 부분적인 절단 및 인산화를 위하여 사용됨)을 첨가하여 60℃에서 10분, 55℃에서 10분, 60℃에서 30분간 반응시켜서 증폭산물 양 말단을　부분적으로 절단하였다. 부분적으로 절단된 증폭산물에 Ion P1 adapter 2㎕, Ion Xpress Barcode 2㎕를 첨가하여 22℃에서 40분, 72℃에서 10분간 반응시켰으며 시퀀싱 어댑터와 시료를 구분할 수 있는 바코드를 증폭산물에　결합시켰다. 시퀀싱 어댑터와 바코드가 결합된 증폭산물에 45㎕의 AMPure XP 용액을 첨가하여 세척하고　Agilent DNA 1000 chip을 이용하여 정량화하여　시퀀싱 라이브러리를 제작하였다.
<실시예 7-3> RNA 분석
혈청시료를 1.5ml씩 샘플링하여 상온에서 10,000g로 5분간 원심분리하여 세포를 회수하였다. 그 후 RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen사)를 이용하여 회수된 세포의 전체 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA의 농도와 질(quality)은　NanoDropTM　1000 spectrophotometer(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)를 이용하여 260nm와 280nm에서 측정하였다.
샘플의 RNA　핵산시료로부터 제조된 cDNA 라이브러리의 서열을 대량 동시 기술을 이용하여 분석하였다. 예를 들어 mRNA-Seq Sample preparation Kit(Illumina사)와 같은 제품을 이용하였으며 제조사의 프로토콜에 따라 또는 약간 변형 사용하여 cDNA 라이브러리를 합성하였다. 혈장 cDNA의 말단-보수 단계에서는 5배 희석된 클레노브(Klenow) DNA 중합효소를 사용하였다. 말단 보수되고 아데닐화된 생성을 정제하기 위하여 PCR 정제 키트 QIAquick MinElute Kit(Qiagen사, 미국)를 사용하였다. 10배 희석된 쌍 지은 말단 어댑터(adapter)를 혈장 cDNA 샘플과 결합시켰으며, 어댑터가　결합된 생성물을 정제하기 위하여 AMPure XP 비드(Agencourt사, 미국)를 사용하여 2회 정제과정을 수행하였다. 이후　Agilent DNA 1000 chip을 이용하여 정량화하였으며　시퀀싱 라이브러리를 제작하였다.
<실시예 7-4> miRNA 분석
인간혈청시료에서　소형 리보핵산(small RNA) 서열분석(sequencing)으로 전체 유전체 마이크로RNA(genome-wide miRNA)를 분석, 비교하였다. mirVAna miRNA isolation kit(Ambion　사, Austin, TX)를 사용하여 혈청시료로부터 소형 리보핵산이 풍부한　총　RNA를 추출하였으며, Illumina library preparation protocol(Illumina 사, San Diego,　CA, USA)를 이용하여 miRNA 라이브러리를 준비하였다. 각각의 라이브러리는 Illumina 어댑터(adaptor; 6-염기 바코드(base barcode)로　색인화하였다. 소형 리보핵산(small RNA) 라이브러리는 6% TBE 유레아 폴리아크릴아마이드 겔(TBE urea　polyacrylamide gel)을 이용하여 크기별로 나누었으며(size fractionation), 150 내지 160 염기 쌍(base pair) 부분(fraction)은 겔로부터 절개하여 얻고 정제하였다. 정제된 miRNA 라이브러리는 Agilent DNA 1000 chip을 이용하여 정량하였으며 시퀀싱 라이브러리를 제작하였다.
상기　분획된　생체시료에서　분리한　핵산　시료와　상기　분리한　단백질－분자결합핵산　복합체　풀을 혼합하여 시퀀싱　라이브러리를　제작할 수도 있으나, 본 실시예에서는 각기 따로 제작한 시퀀싱 라이브러리를 혼합하여 염기서열을 결정하였다. 상기　제작된　시퀀싱　라이브러리를　구성하는　핵산의　염기서열을　상기　참조서열과　비교분석하여　출현빈도를　결정하였다.
NGS용 시퀀싱 라이브러리가 시퀀싱에 사용될 수 있는가를 확인하기 위하여 Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent 사,　미국) 기기와 High Sensitivity chip을 이용하여 제작된 라이브러리의 길이와 양을 측정하였고, 길이는 100 내지 400bp, 양은 100 pmol/ul 이상인 조건에 만족하는 라이브러리를 시퀀싱에 사용하였다. 또한 High　Sensitivity chip을 이용하여 라이브러리 정도관리를　하였다.
상기에서 나타낸 바와 같이, 각 시료별로 혼합되고 해당 시료의 바코드 서열이 부착된 PCR 산물을 Qubit　fluorometer(Invitrogen 사)로 정량하였다. HiSeq 3000의 cBOT cluster station에 한 시료당 3ng PCR 산물을　5pM의 농도로 flowcell에서　혼성화하였다. cBOT를 이용한 브리지 증폭(bridge amplification)으로 단일 DNA 단백질당 28회 증폭하여 클러스터를　형성하였다. 각 클러스터를 선형화하였으며 시퀀싱 프라이머와 혼성화하였다. 해당　flowcell를　 HiSeq 3000에　로딩하였다.　본　flowcell은　73 single read bases와　더불어 7　multiplexed bases를　염기서열 분석할　수　있는　HiSeq 3000의　Single Read 80 Base Pair Recipe로　분석하였다. Illumina Real Time Analysis (RTA）를 이용하여 이미지 생성 및 분석을 수행하였으며 실시간으로 base-call file과　품질 점수를 확인하였다.
순방향 및 역방향 가닥의 시퀸싱이 종료된 후 Illumina사의 Casava 소프트웨어를 이용하여 품질 분석을 하였으며, 추가적으로 내부에서 개발한 소프트웨어　분석시스템과　참조서열를 사용하여 다운 스트림 분석을 수행하였다.
상기　결정된　시퀀싱　라이브러리를　구성하는　핵산의　출현빈도는 표적분자인 핵산 및 단백질의 정보를 반영하고 있어 생물학적　의미결정　시스템으로　상기　분석결과를 이용하여　생체시료의　생물학적　의미를　결정할　수 있다. 상기 생물학적 의미결정 시스템의 생물학적 의미는 상기 시료 또는 시료를 채취한 사람의 생리적인 변화를 의미하고, 상기　임상검사　값에　상응하여　예방, 진단, 치료, 완화와 처치 등의　건강관리를 목적으로 의사 결정(Decision Making)을 하는 과정에　필요한　정보를　말한다.
표적유전자 및 프라이머
정방향primer 역방향Primer 표적유전자
TCCTCATGTACTGGTCCCTCAT GGTGCACTGTAATAATCCAGACTGT KRAS
CATACGCAGCCTGTACCCA GTGGATGCAGAAGGCAGACAG RET
TGTCCTCTTCTCCTTCATCGTCT AGGAGTAGCTGACCGGGAA RET
CCATCTCCTCAGCTGAGATGAC GGACCCTCACCAGGATCTTG RET
CCTATTATGACTTGTCACAATGTCACCA TAGACGGGACTCGAGTGATGATT BRAF
CACAGCAGGGTCTTCTCTGTTT CCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTCC EGFR
TGTCAAGATCACAGATTTTGGGCT ATGTGTTAAACAATACAGCTAGTGGGAA EGFR
GGTGACCCTTGTCTCTGTGTTC AGGGACCTTACCTTATACACCGT EGFR
GGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCT GGAAATATACAGCTTGCAAGGACTCT EGFR
cttACCAGCTTGTTCATGTCTGGA AGAGGACTTCGCTGAATTGACC MET
GCAGCGCGTTGACTTATTCATG CACAGCTACTCTCAGAAAGCACT MET
AACTGAGCTTGTTGGAATAAGGATGTTAT CCATTTTGGTTTAATGTATGCTCCACAATC MET
CCCATCCAGTGTCTCCAGAAGT CAAGTGACACTGGTTGTAAATATGCATTT MET
GTTATGACAGGATTTGCACACATAGTT CCCAAGCCATTCAATGGGATCT MET
CCCTTCTCTTCACAGATCACGA CAGACAGATCTGTTGAGTCCATGT MET
GCTTGGGCTGCAGACATTTC GCCAGCTGTTAGAGATTCCTACC MET
TGGTCCTGCACCAGTAATATGC ATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGA KRAS
CCATCCACAAAATGGATCCAGACA GCTCTGATAGGAAAATGAGATCTACTGTTT BRAF
AGGAAATTCCCACTTAGGAACCATTG AGCAAACTCAGTTGAAATGGTTTGG MET
GTTCAGTGTGTCAAACAGTATTCTTGAATG GTTGGATGAATTTCATAGACAATGGGATC MET
ACAAGCATCTTCAGTTACCGTGAA AAAACTGCAATTCCTCTTGACTATTCTACA MET
GCTATGGATGTTGCCAAGCTGT TAACATGAAAAAGGCTTTGGTTTTCAGG MET
GCAACAGCTGAATCTGCAACTC ATTTTCATTGCCCATTGAGATCATCAC MET
CTGTGTTTAAGCCTTTTGAAAAGCCA CCAAGTACAACAATTGTATTCACATAGCT MET
CATAATTAAATGTTACGCAGTGCTAACCA GCAAACCACAAAAGTATACTCCATGGT MET
CAGTCAAACCCTCAGGACAAGA CCCTCGGTCAGAAATTGGGAAA MET
TCTCAGGAATCACTGACATAGGAGAAG CGAATGAAATTTCGAAGATCTCCATGTTT MET
GCTGGTGGTCCTACCATACATG TTTTTAAAGACTCAGAGCAGGCCTATT MET
GAGGCCAGATGAAATACTTCCTTCA AAAATCAGCAACCTTGACTGTGAATTTT MET
TGTCCTTTCTGTAGGCTGGATGA GGTGGTAAACTTTTGAGTTTGCAGA MET
GTGAAGTGGATGGCTTTGGAAAG AAACTGGAATTGGTGGTGTTGAATTTTT MET
CGTCTCCTGGAGATGGATACTCT CTGTGGAGGAACTTTTCAAGCTG FGFR1
GCAGTTACTGGGCTTGTCCAT GAGGCGGAGAAGCTCTAACAC FGFR1
GCATGGACAGGTCCAGGTAC GGAAGACCTGGACCGCATC FGFR1
CCTTACCTGGTTGGAGGTCAA GGAGACGTCCCTGACCTTACA FGFR1
GAGTTCTTTGCTCCACTTGGGA CCACACTCTGCACCGCTAG FGFR1
GCACCTTACCTTGTTCAGGCAA TGGAGTATCCATGGAGATGTGGA FGFR1
AGGAATGCCTTCAAAAAGTTGGGA TCCAGTGCATCCATGAACTCTG FGFR1
GTGATGGCCGAACCAGAAGAAC CATGTGCCTCTGCCATTGTTG FGFR1
GAGAGAGGCCTTGGGACTGATA TCAGAAATGGAGATGATGAAGATGATCG FGFR1
AGCAGGTTGATGATATTCTTATGCTTCC CCACTCCCTTAGCCTTTATCCTG FGFR1
TTAAACCCAATGCCCAGACCCAAA CCCTTCTTCTTCCCATAGATGCTCT FGFR1
TCTCCTCTGAAGAGGAGtcatcatc GGTGTCCGTGTTCATCTGGAAC FGFR1
GGCAGAAAGAGGACTCCTCAGT CGACTGCCTGTGAAGTGGATG FGFR1
TGTAGATCCGGTCAAATAATGCCTC GGTTTCATCTGAGAAGCAAGGAGT FGFR1
GCATTAGAGGCCCAGAGAGAGA TCATCGTCTACAAGATGAAGAGTGGTA FGFR1
GCTGTGGAAGTCACTCTTCTTGG CTAACACCCTGTTCGCACTGA FGFR1
TTGGAATGGGACAAGATTTTCTTTGC CGAAAGACTGGTCTTAGGCAAAC FGFR1
AGGACAGAAGCATCACTTACACTTC CAACTTATGCCACTCTCTGTTTCC FGFR1
AAATGAAAAGCATGTAATCAGGACTTCCTA ACACTGCGCTGGTTGAAAAATG FGFR1
TGTGGTCAGGTTTGAATTCTTTGC GCCGTAGCTCCATATTGGACATC FGFR1
CATGCAATTTCTTTTCCATCTTTTCTGG CTCACAGGTGTTGGGCAGAT FGFR1
CTTTGTCATTTACAAGTACTTTGCAAACAC TCCCTAAAGCTGGAGTCCCAAATA ROS1
TTCTAGTAATTTGGGAATGCCTGGTT cgcctcTGAATATTTCTTTAATGTTGTCTT ROS1
GCCTAGGTGCTCCATAATGATGG AGTCTGGCATAGAAGATTAAAGAATCAAAA ROS1
ACCAATCATGATGCCGGAGAAAG ACCTGGTGTGGTTGTCAATACC ALK
TCACCGAATGAGGGTGATGTTTT GCAGAGCCCTGAGTACAAGC ALK
GGTTGTAGTCGGTCATGATGGT TGGCCTGTGTAGTGCTTCAAG ALK
ccacttcacctagccAGAATTTTTC CTGACAGGCGATCTTGAACATCA EML4
AGATGATAGTATTTCTGCTGCAAGTACTTC CACATGATCTTCAGAGATTGCAAGAC EML4
CAAGAAGATGAAATCACTGTGCTAAAGG CAGCTTCAACTTTCAAAGAAAATATTGCAA EML4
CTCTGTCGGTCCGCTGAAT GCTGTGTGCGGAAGGAAAAA EML4
GTTCTAGTTCAGTCTTCTTCATTGTACCTT CGGAAGAAGGTAAACATTAGCTCTACAG EML4
TCTGTTAAGATATGGTTATCGAGGAAAGGA CAACCATTTCACACAGTCTGTATGG EML4
AGAGAACTCAGCGACACTACCT TCTGAGCTTTCCACAAGAAATCACTT EML4
GCTTCCAAATAGAAGTACAGGTAAGCT CTGAGCACATGTCAAGAGCAAATC EML4
TCTTGCCACACATCCCTTCAAA GCCAGTGTGAGGAGTTTCTGTG EML4
ATGGTATTTCTTTCTTAGAATGTTAGCCCTATC AAATTTACCTTTATTTCTGCTCCTTTTGCTTT EML4
GAGCATATGCTTACTGTATGGGACT GCTTTTGCGACTTACGAATAGATAGTTCTA EML4
TTTTTCATTTGTTTAAATGTGTATTGTTCCATG GGAGAAGGTGATGCTCGAATTTG EML4
gaggaaTCTCATTCTAATGATCAAAGTCCA CCATTCCCTAGCTCTGTACTTGG EML4
TGTCAGTTACATGTCTTTGATACTCAGAA GGGTGTTGAAGGTATTTTCGACAATTTAT EML4
CTTGGGAAAATTCAGATGATAGCCGTA CCAGACATACATAACTGTACATGCAAACAT EML4
CCATAGGGAGACTTTCTCATGTACTC TAGCATTTAAACATCCCACCACTTCA EML4
CCCTCCTTCCAAATGGACTTAATTTTAAA TGCACCACTTCCATTGGTTATACAG EML4
CCTCGAGCAGTTATTCCCATGTC AGACAATTCTGCAATGTTAGTTTTTCCC EML4
aacttttacagtttcttgaggtgattttaatgg TTTCAATTAGCAAAAATTAAACTAAGAAGGGCA EML4
ACAAAGGTATTCTGTTGTTTCATGTTTCC CAATGTCTCTAGGTACAGAAGGCAT EML4
GTTCTACTGAAGTTTTCTTCCAAATAGACACT CTCCAGTTAATAACATCCCATTTCTCATCT EML4
GGCAGTGTGTTCACACTTTGTC GTGGGACAAAATACCTGAGTTTAGAGTATT EML4
GACTAAAACTTTGAAGTAGTCATTTTTGTCTT GAATGAACATGGTAATTGGCCGA EML4
TGTCTTGTGTTTCAACAGAAGGAGAATAT GCTGTCATGGTAGAGAAGGATACG EML4
CCTGAGAAGCTCAAACTGGAGT cctggccTGATGTTTCCTTTTTAATTTTT EML4
gcacaccagcgttatgacaaag TGTGTGGATAGAAACTAGATCTCTGGTT EML4
GGTGGTTTGTTCTGGATGCAGA CAATTGCAGTGAAGTGCTGTGAAT EML4
AGTGGATAGGATTCATTCATTAATTGCCA TACAGCCAGGAAGGTACCATCT EML4
ATTTCTCTAGTCAACACTGACCTATTTTATTCT TCCCAATAATTTTACAACTTGTTCTACTTCACT EML4
GTAGCAGTAATTGAATTGATACTTGAAGGAGA CGCTCCAGGTCCAGAAGAAAATATG EML4
GCAAATACCATAATTACATGCGGTAAATCT GCCATGACAACTTGATGCTTATTAAACAAT EML4
TTTTTAAATGGCATTAGTTCTGTGTGCT GCTCAAAAGTGCCAAGTCCAATA EML4
TCTGTTACTCTATCCACACTGCAGAT ACTTCATGGCCACATAAACACAAAAC EML4
AACAGTATTGGCTAGCTGTTGAACT ATACTTACAGTACAATATTTCATAGTCTCCCGA EML4
CCCAGACAACAAGTATATAATGTCTAACTC CCCTGACAGACACATCTTAGCatatatata EML4
CAAGCACTATGATTATACTTCCTGTTTCT ACAAACCACTTCTTTACATCAGGTGT EML4
TTAATAAGCATCAAGTTGTCATGGCAAAAA GGCTCTACAGTAGTTTTGCTCCATA EML4
AGACTCAGGTGGAGTCATGCTTA CCTGGTCTAAGAGATGGGACTGA EML4
ATTTCTGAAACAGGCATGTCAAGAATG CCAGTTGATATCAGGTGACTGTCATTG EML4
AGCCATGTCACCAATGTCAGTTTTA GGCTTTGGTTAGAGTAGTATCCGCTA EML4
AGTTATCTTTGCCTCAGAATGAGACTG GTGGGAGAACTGCTTATTCTACTTTCC EML4
GCCCTTAAATGAGACAGCTGAAGA GCTTATCTCGTTGCATGGCTCTT EML4
GAGACCTTGGTGAGCCTCTTTATG ACATGCAGCTGAAGGAAAAGAGTT EML4
CAGCTATAAATGCAGGCTTCGAGTA GTTCCTCGTAAAATAAAGTTTCGTGATGT EML4
GGAAAGGCAGATCAATTTTTAGTAGGC ACCCTGAAAATGAAAGACACTCATTGTTAT EML4
GCTAATTTTTCTGCATCCCTGTGTT GGGATACTGAAACAGATGGACTTTACAAA EML4
GTGATAGCTGTTGCCGATGACT GAGTATCATGGAGAGGAATCAGTAACCTAT EML4
CTTTTGATGACATTGCATACATTCGAAAGA CAGTTATCTTTTCAGTTCAATGCATGCT PIK3CA
ATCCGCAAATGACTTGCTATTATTGATG CCCAGGATTCTTACAGAAAACAAGTG NRAS
GGGTGAGGCAGTCTTTACTCAC GCCGTTGTACACTCATCTTCCTAG ALK
CCTCACCTCTATGGTGGGATCA GCTCGCCAATTAACCCTGATTACT NRAS
CAGGTCTCTCCGGAGCAAA GCCAAGTCCCTGTGTACGA HER2
AGAACCTCTCAACATTGTCAGTTTTCT GCTCTGAGTAGAACCATTGCTCA MET
TTGGCACAACAACTGCAGCAAA CCAGAACATTGTTCGCTGCATTG ALK
GTCTCTCGGAGGAAGGACTTGA CAGACTCAGCTCAGTTAATTTTGGTTAC ALK
CAGCTGGTGACACAGCTTATG CTCCGGAGAGACCTGCAAAGAG HER2
TATGCAGATTGCCAAGGTATGCA AATGGGAAGCACCCATGTAGAC HER2
GGGTGTCTCTCTGTGGCTTTAC ACTCTGTAGGCTGCAGTTCTCA ALK
GCCAATGAAGGTGCCATCATTC CTCAGGCATCCCAGGCACAT AKT1
ATTTTACAGAGTAACAGACTAGCTAGAGACA AAAGAAAAAGAAACAGAGAATCTCCATTTTAGC PIK3CA
GAAATTTAACAGGGTGTTGTTGTGCA CTGTTCATCTGACAGCTGGGAAT DDR2
GCTGGAGGAGCTAGAGCTTGAT GCTTGTGGGAGACCTTGAACAC MEK1
TGGGTGGTCAGCTGCAAC CATGCTTCAATTAAAGACACACCTTCTTTAA ALK
GCTCTGAACCTTTCCATCATACTTAGAAAT ccagactaacaTGACTCTGCCCTATATAAT ALK
AAAGAAGGTGTGTCTTTAATTGAAGCAT gggtctaatcccatctccagtct ALK
TCAtgttagtctggttcctccaaga gggttatacttgcaacacagtct ALK
agggaaggctgggtgaacc actgactttggctccagaacc ALK
ggagcctaaggaagtttcagcaag cactgctgtgattgcactgaag ALK
ggttctggagccaaagtcagtc aactataggaaacacaactgaccaagatc ALK
caatcacagcagtggatttgagg aggcggaattagagcacagatc ALK
GAAGAGCCACATCAtgaaaagatctct agttaccatccctgcctacaga ALK
ggacctctttggactgcagttt ggtagagctctttaggatttttcaaaacca ALK
ggttgtcaatgaaatgaattcaccaacata ACAGAATCTACCCACTGAATCACAATTT ALK
AAACTCCATGGAAGCCAGAACA ttcattcgatcctcaggtaacccta ALK
tggaccgaccgtgatcagat ATCTGCCGGTAGAAGGGAGAT ALK
CCTTTGAGGGATGGCACCATAT GAGACATGCCCAGGACAGATG ALK
CCTTTCCCTCTGCCCTTTTCAA AGAGAGATAGGAAAATCGGTTTCTGAGTAT ALK
GGCTCACAGGCTGAACAGAAAT ACTTCTAGCTCCCACATGCTTC ALK
CATTACATAGGGTGGGAGCCAAA TGTGTATCCTCCTGGCTGATCA ALK
GCTTTCACCATCGTGATGGACA AAACGGAAGCTCCCAACCTT ALK
CTGATCAGCCAGGAGGATACAC CCAAGGTGTCACTTCGTTATGC ALK
CCCACCCAATTCCAGGGACTA GGCTTTCTCCGGCATCATGAT ALK
TGCTTTTCTAACTCTCTTTGACTGCA GATTGTGGCACAGAGATTCTGATACTT MET
CACAGCCTGAGACACTATTCAGTC ACTCTCGCTGATCCTCTCTGT ALK
ATGTATTTAACCATGCAGATCCTCAGTTT ATCTTGTTCTGTTTGTGGAAGAACTCT PTEN
GGATGAGCTACCTGGAGGATGT CCATCTGCATGGTACTCTGTCT HER2
TCTTTGTCTTCGTTTATAAGCACTGTCA GTGTTCTTGCATAAAAACACTTCAAATG ROS1
TGAAACTTGTTTCTGGTATCCAAAAATCAT CTGGCTTGCAAAAATCCAGTAGTAG ROS1
TTCCTTTAGGAAATGTTAACAGTGCATTTG GATTAAAAATGGTGTAGTATGATTTGTGTACTT ROS1
ACTTACCAAAGGTCAGTGGGATTG CTCTGTGTGCTTAGGTAGAGCTG ROS1
CTGTGACCACACCTGTCATGTA AAGAAGGCAAGACCCTTAAAGGAG RET
AGCTCTACCTAAGCACACAGAGTAATA GTGGTTTGTTgctctctgcaaaaa ROS1
GGCCCAATGTGTGGATAGAAC CAGGACAACTTCTCTACATAGCCA RET
GTGTGGATAGAACTTTGGTGGGA GAAGTGTCCAGGACAACTTCTCT RET
GGGTGGCTATGTAGAGAAGTTGT CTACATGACAGGTGTGGTCACA RET
CGAAGTACTGAGTCCAAGCCAT GACAAGTTCCAATGTGCAGAGAAC RET
CTTCTGCACTGAAATCTTTCTACAGAATATATT gaatctagataccttgccggtgaag ROS1
cgactagaagcaactccgttca gctcactgctcttccttctctct ROS1
tagattcgctcatcaaaattgactagaagg gcacagttctttggaaaagcaatttc ROS1
gggaaattgcttttccaaagaactg cccagggagttcagtaagcttag ROS1
atcaaaagcaaggtgtttttgcttt ATAATGCCAACTATTTAGTATCCAAAGACTGAG ROS1
AAAAACTAATTAAATCCAGGTAAAAAGCCAT TCGTTTATGGGTGATTTTGACAAATAAGTTTT ROS1
GCCATATATAAGTACACAAATCATACTACACCA GTTTGTTTTGGTTTATTTTGACTCGTTTATGG ROS1
TCACCCATAAACGAGTCAAAATAAACCA CAATGATAAACACTCTTGTACTCTGCaaaa ROS1
CTGCACATTGGAACTTGTCCATG TTCTCCTAGAGTTTTTCCAAGAACCAAG RET
GTGGGAATTCCCTCGGAAGAA TGCCTGGCAGGTACCTTTC RET
AGTCACTGTCCCTGTGACCAT ACGTAGGGCTATATAATACCAGAAAACTCA RET
GCATAGGGACACGTTTCTGTCAT AGGCTGTGCTCATTACACCAG RET
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CCAGTGCCAGCTGGTGTAA GTGGGAAGGCCTGAGAACAC RET
GGGCAGTAAATGGCAGTACC TCGGCACCACTGGGTACAG RET
TCACATCCAGGTTATATTCCTCAGTAGAAA gtaagcttcgttccaatactttttctacat ROS1
TTTAGGACCAAGAAATCTCAGTCTTTGG GTTTCCTCTACACAACTGAAACTACCT ROS1
CTCAGTCTTTGGATACTAAATAGTTGGCA tcctcatgccatagtttgccag ROS1
GTCCCAACCATGTCAAAATTACAGAC CCATGGGCTAGACACCACT HER2
atttgctcttccatgacaggctta caagtatctcctgatggatgaatgga BIM
ccagtgtgtgtatatcacatacttcattta agcaattccacttccaagtatatatccaaaaa BIM
AAAGTTAATGTACCGAGGTAAGTTTTCAGT CTGTAGAATGTCCAGAGAAAATTATGGACT BIM
GAAAGGACTTAGCCAGATGTGAGTTT CAAAGTCAAGAGAACCACTTATCAACTCA BIM
GTCTTAGTTCATGCCTGAAGACCA TGACTTCTTTGTGGAAAATGTATTTTGCAA BIM
ATTCTTTACTCAACCCTATCCATGAAGTTC CTGGCTAAGGCGAACCTCTTTAT BIM
CATTTCTAAATACCATCCAGCTCTGTCT CATGTGTAGCTGCTGGGATG BIM
GCACACCTGTGAGGTGGTG CTGAAATGAGTTCACGAGCAGTAGTA BIM
GGGCTGGAAGTTTTATTATTGCTGT CCTGTTAACTCATTTAGTAAGCAAGGATGT BIM
GTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGT TGAGGTTCAGAGCCATGGAC EGFR
CATGCGAAGCCACACTGACGT CTTTGTGTTCCCGGACATAGTCCA EGFR
TCATCACGCAGCTCATGCCCTT GTGAGGATCCTGGCTCCTTATCTC EGFR
gctggtACTTTGAGCCTTCACAG CACCAGCCATCACGTATGCTTC HER2
TCTCCCATACCCTCTCAGCGTA CAGCCATAGGGCATAAGCTGTG HER2

상기 [표 3]의 프라이머는 정방향, 역방향 각각 187개로 서열번호는 상기 표 3에 기재된 순서대로 서열번호 9 내지 서열번호 서열번호 383으로 지정되어 있다.
삭제

Claims (46)

  1. (a) 분석 대상 시료에, 그 시료에 존재하는 표적 단백질 집단에 특이적인 압타머 라이브러리를 처리하여, 각 표적 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 각 압타머 사이의 복합체를 형성시킴으로써, 표적 단백질과 압타머 사이의 복합체 집단을 형성시키는 단계와,
    (b) 상기 복합체 집단을 비결합 압타머로부터 분리하는 단계와,
    (c) 상기 복합체 집단의 각 압타머의 서열을 차세대서열분석 기술로 분석하여 그 복합체 집단의 각 압타머를 정량함으로써, 상기 복합체 집단의 각 표적 단백질에 대한 각 압타머 정량값의 집단적 분포인, 표적 단백질 집단에 대한 압타머 프로파일을 생성하는 단계를 포함하되,
    상기 압타머 라이브러리는,
    (i) 무작위 서열을 가져 다양한 단백질들에 대한 잠재적 결합 능력을 가진 압타머 풀을 제작하고, (ii) 이 압타머 풀을 상기 (a) 단계에서와 동일한 분석 대상 시료의 표적 단백질 집단과 반응시켜 각 압타머와 각 표적 단백질 사이에 특이적 결합을 유도하여 복합체 집단을 형성시키고, (iii) 비결합한 압타머를 제외시켜 그 복합체 집단을 분리하고, (iv) 그 복합체 집단의 압타머를 증폭하여 얻어진 것을 특징으로 하는,
    분석 대상 시료 중의 표적 단백질 집단에 대한 압타머 프로파일을 생성하는방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 압타머 라이브러리는 이를 구성하는 각 압타머가 공통적으로 5'영역과 3'영역이 기지의 서열을 가진 보존영역을 가지고, 그 중간 영역은 임의의 무작위 서열을 가진 가변영역을 가진 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 분석 대상 시료는 그 시료 중에 많은 양으로 존재하는 단백질을 제거한 가공시료인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 압타머 정량은 상기 복합체 집단의 각 압타머로부터 이중가닥 DNA 집단을 제조하고 그 이중가닥 DNA 집단을 차세대서열분석 기술로 분석하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 압타머 라이브러리는 이를 구성하는 각 압타머가 공통적으로 5'영역과 3'영역이 기지의 서열을 가진 보존영역을 가지고, 그 중간 영역은 임의의 무작위 서열을 가진 가변영역을 가짐으로써,
    상기 이중가닥 DNA 집단의 제조는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 1 세트로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 상기 압타머 라이브러리가 처리되기 전의 분석 대상 시료에, 그 시료에는 존재하지 않는 2종 이상의 외부 표준단백질을 정량하여 서로 다른 정량값으로 첨가하고, 상기 (a) 단계의 압타머 라이브러리는 그 외부 표준단백질에 대한 압타머를 추가로 포함하는 압타머 라이브러리를 사용함으로써, 상기 (c) 단계의 압타머 라이브러리에는 상기 외부 표준단백질에 대한 압타머의 정량값이 표적 단백질에 대한 압타머의 정량값과 함께 포함되는 것을 특징으로 하는 방법
  8. 제1항에 있어서,
    상기 압타머는 DNA 단일가닥핵산 또는 RNA 단일가닥핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 표적 단백질 집단은 미지의 단백질 집단, 기지의 단백질 집단 또는 미지의 단백질과 기지의 단백질의 혼합된 집단인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 각 압타머 정량은 각 압타머에 대한 동일한 서열을 가진 리드(read)를 계수함과 함께, 차세대서열분석 기술의 에러율이 반영되어 상기 리드와 동일한 서열로 간주할 수 있는 서열을 계수하고, 이를 상기 리드에 대한 계수값과 합산하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 각 압타머 정량은 상기 압타머 라이브러리를 구성하는 각 압타머의 서열을 분석하여 얻어진 각 압타머에 대한 기지의 서열을 참조서열로 사용하여, 이 참조서열과 상기 복합체 집단의 각 압타머의 서열의 분석 결과와 비교하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. (a) 분석 대상 시료에, 그 시료에 존재하는 표적 단백질 집단에 특이적인 압타머 라이브러리를 처리하여, 각 표적 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 각 압타머 사이의 복합체를 형성시킴으로써, 표적 단백질과 압타머 사이의 복합체 집단을 형성시키는 단계와,
    (b) 상기 복합체 집단을 비결합 압타머로부터 분리하는 단계와,
    (c) 상기 복합체 집단의 각 압타머의 서열을 차세대서열분석 기술로 분석하여 그 복합체 집단의 각 압타머를 정량함으로써 상기 복합체 집단의 각 표적 단백질에 대한 각 압타머 정량값의 집단적 분포인, 표적 단백질 집단에 대한 압타머 프로파일을 생성하는 단계와,
    (d) 상기 (a) 내지 (c) 단계를 상기 분석 대상 시료와는 다른 분석 대상 시료에 대해서 동일하게 수행하는 단계와
    (e) 상기 2가지 분석 대상 시료 사이에 상기 (c) 단계 및 상기 (d) 단계를 통하여 얻어진 각 압타머 프로파일을 비교하여 압타머 정량값의 차이가 있는 하나 이상의 압타머를 결정함으로써 상기 2가지 분석 대상 시료를 구분하는 단계를 포함하고,
    상기 압타머 라이브러리는 상기 2가지 분석 대상 시료에 대해서 동일한 압타머 라이브러리가 사용되되,
    그 압타머 라이브러리는 (i) 무작위 서열을 가져 다양한 단백질들에 대한 잠재적 결합 능력을 가진 압타머 풀을 제작하고, (ii) 이 압타머 풀을 상기 2가지 분석 대상 시료 중 어느 한 가지 시료의 표적 단백질 집단과 반응시켜 각 압타머와 각 표적 단백질 사이에 특이적 결합을 유도하여 복합체 집단을 형성시키고, (iii) 비결합한 압타머를 제외시켜 그 복합체 집단을 분리하고, (iv) 그 복합체 집단의 압타머를 증폭하여 얻어진 것을 특징으로 하는,
    2가지 분석 대상 시료의 구별 방법.
  14. 삭제
  15. 제13항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 상기 압타머 라이브러리가 처리되기 전의 분석 대상 시료에, 그 시료에는 존재하지 않는 2종 이상의 외부 표준단백질을 정량하여 서로 다른 정량값으로 첨가하고, 상기 (a) 단계의 압타머 라이브러리는 그 외부 표준단백질에 대한 압타머를 추가로 포함하는 압타머 라이브러리를 사용함으로써, 상기 (c) 단계에서 상기 외부 표준단백질에 대한 압타머의 정량 결과를 표적 단백질에 대한 압타머의 정량 결과와 함께 얻고, 그 외부 표준단백질의 압타머 정량 결과를 표적 단백질의 압타머의 정량 결과와 비교하여 표적 단백질을 정량하고,
    상기 (d) 단계에서도 상기 압타머 라이브러리가 처리되기 전의 상기 다른 분석 대상 시료에, 그 시료에는 존재하지 않는 2종 이상의 외부 표준단백질을 정량하여 서로 다른 정량값으로 첨가하고, 상기 압타머 라이브러리는 그 외부 표준단백질에 대한 압타머를 추가로 포함하는 압타머 라이브러리를 사용함으로써, 상기 외부 표준단백질에 대한 압타머의 정량 결과를 표적 단백질에 대한 압타머의 정량 결과와 함께 얻고, 그 외부 표준단백질의 압타머 정량 결과를 표적 단백질의 압타머의 정량 결과와 비교하여 표적 단백질을 정량하며,
    상기 (e) 단계는 상기 2가지 분석 대상 시료의 표적 단백질 정량 결과를 비교하여 이루어지되,
    상기 2가지 분석 대상 시료에 첨가되는 상기 외부 표준단백질은 서로 동일한 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.

  16. 제13항에 있어서,
    상기 압타머 라이브러리는 이를 구성하는 각 압타머가 공통적으로 5'영역과 3'영역이 기지의 서열을 가진 보존영역을 가지고, 그 중간 영역은 임의의 무작위 서열을 가진 가변영역을 가진 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 2가지 분석 대상 시료는 그 각 시료 중에 많은 양으로 존재하는 단백질을 제거한 가공시료인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제13항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 압타머 정량과 (d) 단계의 압타머 정량은 상기 복합체 집단의 각 압타머로부터 이중가닥 DNA 집단을 제조하고 그 이중가닥 DNA 집단을 차세대서열분석 기술로 분석하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 압타머 라이브러리는 이를 구성하는 각 압타머가 공통적으로 5'영역과 3'영역이 기지의 서열을 가진 보존영역을 가지고, 그 중간 영역은 임의의 무작위 서열을 가진 가변영역을 가짐으로써,
    상기 이중가닥 DNA 집단의 제조는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 1 세트로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 삭제
  21. 제13항에 있어서,
    상기 압타머는 DNA 단일가닥핵산 또는 RNA 단일가닥핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제13항에 있어서,
    상기 표적 단백질 집단은 미지의 단백질 집단, 기지의 단백질 집단 또는 미지의 단백질과 기지의 단백질의 혼합된 집단인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 삭제
  24. 제13항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 압타머 정량과 (d) 단계의 압타머 정량은 각 압타머에 대한 동일한 서열을 가진 리드(read)를 계수함과 함께 차세대서열분석 기술의 에러율이 반영되어 상기 리드와 동일한 서열로 간주할 수 있는 서열을 계수하고, 이를 상기 리드의 계수값과 합산하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
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  31. 삭제
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