KR20110007723A - 압타머 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생체시료에 결합하는 압타머를 제조함에 있어서, 분석시료에 결합하는 압타머 라이브러리와 분석시료에 비교되는 비교시료에 결합하는 압타머 라이브러리를 제조하여 정상화 및 감산화 함으로써, 비교시료에 대비하여 분석시료의 분석에 보다 효율적인 압타머를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 압타머 제조방법은, (A) 출발 올리고뉴클레오티드 라이브러리를 제조하는 단계; (B) 상기 출발 올리고뉴클레오티드 라이브러리로부터, 분석대상이 되는 생물학적인 분석시료에 결합하는 압타머 라이브러리와, 상기 분석시료에 비교되는 생물학적인 비교시료에 결합하는 압타머 라이브러리를 각각 제조하는 단계; (C) 상기 압타머 라이브러리들을 정상화 및 감산화하는 단계; 및 (D) 상기 정상화 및 감산화 된 압타머를 취득하는 단계; 를 포함한다.

Description

압타머 제조방법{Method of Preparing Aptamer}
본 발명은 압타머의 제조방법에 관한 것이며, 보다 상세하게는 생체시료에 결합하는 압타머를 제조함에 있어서, 분석시료에 결합하는 압타머 라이브러리와 분석시료에 비교되는 비교시료에 결합하는 압타머 라이브러리를 제조하여 정상화 및 감산화 함으로써, 비교시료에 대비하여 분석시료의 분석에 보다 효율적인 압타머를 제조하는 방법에 관한 것이다.
압타머는 표적 분자들에 대해 높은 특이적 결합성을 가지는, 표적 화합물 또는 분자의 특이적 리간드이다.
압타머의 제조방법으로는, "SELEX™"(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)" 방법이 널리 사용되고 있다. SELEX 방법은 표적 분자에 높은 특이적 결합성을 가진 핵산 분자의 생체외 전개에 관한 방법으로, 1990. 6. 11 출원의 미국특허 출원 제07/536,428호(현재 포기), 미국특허 제5,475,096호(발명의 명칭: "Nucleic Acid Ligands") 및 미국특허 제5,270,163호(발명의 명칭: "Nucleic Acid Ligands") 등에 기재되어 있다.
SELEX 방법은, 핵산이 다양한 2 차원 및 3 차원 구조를 형성하기에 충분한 능력과, 실질적으로 임의의 화학적 화합물과 함께(단량체 또는 중합체 상관없이) 리간드로서 작용(즉, 특이적 결합 쌍을 형성)하기에 충분한, 단량체 내에서 이용 가능한 화학적 다기능성(chemical versatility)을 보유한다는 것을 바탕으로 한다. 임의의 크기 또는 조성을 갖는 분자가 표적으로 이용될 수 있다.
압타머는 고전적인 왓슨-클릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성 이외의 상호작용을 통하여 분자에 대해 고도의 특이적 결합 친화도를 보이는 핵산 분자이다. 압타머는 선택된 표적에 특이적으로 결합하여 표적의 활성을 조정할 수 있는 것으로서, 예를 들면 압타머 결합을 통해 표적의 작용 능력을 차단할 수 있다. 무작위 서열 올리고뉴클레오티드의 풀(pool)로부터 생체외 선별 과정에 의해, 성장 인자, 전사 인자, 효소, 면역글로불린 및 수용체 등을 포함한 단백질에 대응하는 압타머가 생성된 바 있다.
전형적인 압타머는 크기가 10∼15 kDa(30∼45 뉴클레오티드)으로서, 나노 몰 이하의 친화도로 그 표적에 결합하며, 밀접하게 관련된 표적들에 대해 차별성을 나타낸다(일례로, 압타머는 통상적으로 동일한 유전자군에 속하는 다른 단백질에 결합하지 않는다).
일련의 구조학적 연구 결과, 압타머는 항체-항원 복합체에서 친화도와 높은 선택적 결합을 부여하는 동일한 유형의 결합 상호작용(예를 들면, 수소 결합, 정전기적 상보성, 소수성 접촉, 입체적 배제(steric exclusion))을 이용할 수 있는 것으로 나타났다. 압타머는 높은 선택성 및 친화도, 생물학적 효능 및 우수한 약동학적 특성을 포함하여, 치료제 및 진단제로서 사용하기에 바람직한 다수의 특징들을 가지고 있다. 또한, 압타머는 항체 및 기타 생물학적 단백질을 능가하는, 다음에 예시한 바와 같은 특이적인 경쟁적 이점이 있다.
(1). 속도 및 제어
압타머는 치료학적 리드를 포함하여, 초기의 신속한 리드를 가능하게 하는 생체외 방법에 의해 생산된다. 생체외 선별은 압타머의 선택성 및 친화도를 엄격하게 제어할 수 있으며, 독성 및 비-면역원성 표적 양자 모두에 대한 리드를 비롯하여 리드의 발생을 가능하게 한다.
(2). 독성 및 면역원성
압타머 군은 치료학적으로 허용 가능한 독성을 나타내며, 면역원성은 결여된 것으로 입증되었다. 랫 또는 우드척(woodchucks)에게 다량의 압타머(90 일간 1 일 10 mg/kg씩)를 투여하면, 어떠한 임상적, 세포적 또는 생화학적 측정에 의해서도 독성이 전혀 목격되지 않는다. 대다수의 모노클로날 항체 효능은 항체 자체에 대한 면역 반응에 의하여 엄격하게 제한될 수 있는 반면에, 압타머는 MHC(Major Histocompatibility Complex)를 통해 T-세포에 의해 제시될 수 없고, 면역반응이 일반적으로 핵산 단편은 인지하지 못하도록 적응되어 있기 때문에, 압타머에 대하여 항체를 유도하는 것은 극도로 어려운 것으로 보인다.
(3). 투여
최근에 승인된 항체 치료제 대부분은 정맥내 주입(통상적으로 2∼4 시간에 걸침)에 의해 투여되는 반면에, 압타머는 피하 주사에 의해 투여할 수 있다(원숭이 연구 결과, 피하 투여에 의한 앱타머의 생체적합성은 > 80 % 이었다(참조 : Tucker 외 다수, J. Chromatography B. 732: 203-212, 1999)). 이러한 차이는 일차적으로 용해도가 비교적 낮고 대부분의 치료용 mAb 에 필요한 용적이 크다는 사실에 기인한다. 압타머는 용해도가 양호하고(> 150 ㎎/㎖) 분자량이 비교적 낮기 때문에(압타머 : 10∼50 kDa ; 항체 : 150 kDa), 0.5 ㎖ 미만의 용량으로 매주 주사에 의해 투여할 수 있다. 또한, 소형의 압타머는 항체 또는 항체 단편의 경우 침투가 불가능한, 형태적 협착 부위로의 침투도 가능하다는 점도, 압타머에 의한 치료법 또는 예방법의 또 다른 이점으로 제시된다.
(4). 확장성(scalability) 및 비용
압타머는 화학적으로 합성되므로, 결과적으로 대량 생산 요구에 부합하도록 필요에 따라 용이하게 확장 가능하다. 현재는 확장 생산시의 난점들이 몇몇 생물학적 물질의 이용가능성을 제한하고 대규모 단백질 생산 플랜트에 막대한 자본금이 드는 상황이지만, 단일의 대규모 올리고뉴클레오티드 합성기는 매년 100㎏씩 증량 생산할 수 있어 비교적 적절한 초기 투자를 필요로 한다.
(5) 안정성
압타머는 화학적으로 견고하다. 압타머는 본질적으로 열과 변성제 같은 인자로의 노출 후에 활성을 재획득되므로, 동결 건조된 분말의 형태로 실온에서 장기간동안(1 년 이상) 보관 가능하다.
본 발명의 목적은, 분석을 요하는 생물학적 시료(분석시료)에 특이적으로 결 합하는 압타머(라이브러리)를 제조하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 목적은, 분석을 요하는 생물학적 분석시료에 특이적으로 결합하는 압타머를 제조함에 있어서, 해당 분석시료에 대한 분석 효율을 향상시킬 수 있는 압타머 제조방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 목적은, 분석을 요하는 생물학적 분석시료에 결합하는 압타머 라이브러리(이에 상응하는 DNA를 "압타머테스터: aptamer tester"라고 함)와 분석시료와 구분되는 생물학적인 비교시료에 결합하는 압타머 라이브러리(이에 상응하는 DNA를 "압타머드라이버: aptamer driver"라고 함)에 대해, "정상화 및 감산화 과정을 적용함으로써, 목적하는 분석시료에 대한 분석 효율이 향상된, 압타머 제조방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명에 따라 압정상화-감산화 된 압타머의 제조방법이 제공된다.
본 발명에 따른 압타머 제조방법은: (A) 출발 올리고뉴클레오티드 라이브러리를 제조하는 단계; (B) 상기 출발 올리고뉴클레오티드 라이브러리로부터, 분석대상이 되는 생물학적인 분석시료에 결합하는 압타머 라이브러리와, 상기 분석시료에 비교되는 생물학적인 비교시료에 결합하는 압타머 라이브러리를 각각 제조하는 단계; (C) 상기 압타머 라이브러리들을 정상화 및 감산화하는 단계; 및 (D) 상기 정상화 및 감산화 된 압타머를 취득하는 단계; 를 포함하며, 이로써 상기 비교시료에 대비하여 상기 분석시료의 분석에 보다 효율적인 압타머를 제조할 수 있다.
본 발명에 적용되는 상기 정상화-감산화 단계에서, 정상화 방법은, Soares et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:9228-9232; Tanaka et al., 1996, Genomics, 35:231-235; 및 Zhulidov et al., 2004, Nucleic Acids Res. 32:37-, 등에 보고되어 있고, 상기 감산화 방법은 Sagerstrom et al., 1997, Annu. Rev. Biochem., 66:751-83; Diatchenko et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 6025-6030; 및 Bonaldo et al., 1996, Genome Reseach, 6:791-806 등에 보고되었다.
본 발명에 적용할 수 있는 상기 정상화-감산화(Suppression PCR based method(Diatchenko et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 6025-6030 참조)는, (a) 상기 분석시료에 결합하는 상기 압타머 라이브러리로부터 압타머테스터 를 제조하는 단계; (b) 상기 비교시료에 결합하는 상기 압타머 라이브러리로부터 압타머드라이버를 제조하는 단계; (c) 상기 압타머테스터와 상기 압타머드라이버를 반응시켜 얻어지는 테스터/드라이버 이중가닥과 비-결합된 단일가닥의 상기 압타머드라이버를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 제거하는 단계; 를 포함한다.
본 발명의 압타머 제조방법에 있어서, 바람직하게, 상기 출발올리고뉴클레오티드 라이브러리의 올리고뉴클레오티드는 PCR 반응에 의해 증폭 가능한 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다.
바람직하게, 상기 압타머테스터의 제조는, 상기 분석시료에 결합하는 상기 압타머 라이브러리를 구성하는 압타머들의 5' 말단에 있는 고정위치에 결합하는 염기서열에 부가적인 염기서열이 있는 프라이머와, 상기 분석시료에 결합하는 상기 압타머 라이브러리를 구성하는 압타머들의 3'말단에 있는 고정위치에 결합하는 프 라이머로 압타머테스터1를 제조하는 단계; 및 상기 분석시료에 결합하는 상기 압타머 라이브러리를 구성하는 압타머들의 5'말단에 있는 고정위치에 결합하는 프라이머와, 상기 분석시료에 결합하는 상기 압타머 라이브러리를 구성하는 압타머들의 3' 말단에 있는 고정위치에 결합하는 염기서열에 부가적인 염기서열이 있는 프라이머로 압타머테스터2를 제조하는 단계; 를 포함한다.
바람직하게, 상기 압타머드라이버의 제조는, 상기 비교시료 결합의 상기 압타머 라이브러리를 구성하는 압타머들의 양단에 있는 고정위치에 각각 프라이머를 결합하고 PCR 하여 제조한다.
바람직하게, 상기 압타머테스터와 상기 압타머드라이버의 반응은, 2회의 용액 혼성화로 실행한다.
바람직하게, 상기 압타머테스터는 2개의 상기 압타머테스터 혼성화 용액을 제조하고, 각각의 상기 압타머테스터 혼성화 용액에 상기 압타머드라이버 혼성화 용액을 혼합하여 1차 혼성화를 실행한다.
바람직하게, 미네랄 오일이 포함된 상기 압타머드라이버 혼성화 용액을 DNA의 이중가닥 분리 온도로 가열한 후, 상기 1차 혼성화한 2개의 상기 압타머테스터 혼성화 용액 중에 하나를 상기 압타머드라이버 혼성화 용액에 첨가하고, 이어서 나머지 하나의 1차 혼성화한 상기 압타머테스터 혼성화 용액을 첨가하여 2차 혼성화를 실행한다.
바람직하게, 상기 2차 혼성화가 종료된 후에, 형성된 코헨시브(cohensive) 말단인 이중가닥 DNA의 양쪽 말단을 블런트(blunt) 말단으로 전환시켜 네스 트(nest) PCR을 할 수 있는 DNA를 제조한다. 바람직하게 제조된 상기 DNA는 RNA 중합효소 결합위치 및 제한효소 인식부위가 있는 DNA이다.
바람직하게, 상기 정상화 단계는, (a) 상기 압타머 라이브러리를 이용하여 이중가닥 압타머 DNA를 제조하는 단계; (b) 상기 이중가닥 압타머 DNA을 용액혼성화 하는 단계; 및 (c) 효소를 이용하여 상기 이중가닥 압타머 DNA를 제거하는 단계; 및 (d) 남아있는 단일가닥 압타머 DNA를 증폭하는 단계; 를 포함한다.
바람직하게, 상기 감산화 단계, (a) 상기 분석시료에 결합하는 상기 압타머 라이브러리로부터 단일가닥 압타머테스터 를 제조하는 단계; (b) 상기 반응시료에 결합하는 상기 압타머 라이브러리로부터 압타머드라이버 DNA를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 압타머테스터와 상기 압타머드라이버를 반응시켜 얻어지는 테스터/드라이버 이중가닥 및 비-결합된 단일가닥의 상기 압타머드라이버를 효소를 이용하여 제거하고, 남아있는 상기 단일가닥 압타머테스터를 증폭하는 단계; 를 포함한다.
본 발명의 압타머 제조방법은, 생물학의 실험방법 중에 cDNA 라이브러리에 대해 수행하는 "정상화(Normalization)" 및 "감산화(Subtraction)" 방법을 응용하여 생물학적인 생체시료에 결합하는 압타머 라이브러리를 비교분석하여 분석시료의 분석에 보다 효율적인 압타머를 획득하는 방법을 제시하는 것이다.
본 발명에서 정상화는 cDNA 라이브러리에서 과다 발현된 전사체의 수를 감소시키고 드물게 표현된 전사체의 수를 증가시키는 과정이며, 감산화는 두 개의 cDNA 라이브러리 중 특정 라이브러리에만 존재하는 전사체의 종류만 증가시키는 과정이다.
즉, 본 발명에 따른 압타머 제조방법은, 분석 대상이 되는 분석시료(생체시료)에 결합하는 압타머를 바로 제조하는 것이 아니라. 분석 대상이 되는 분석시료에 결합하는 압타머와는 별도로, 분석시료와는 다른 생체시료(비교시료)에 결합하는 압타머를 제조하고, 제조된 양 압타머에 생물학적인 방법인 정상화와 감산화 과정을 적용하여 분석시료와 비교시료에서 차이를 보이는 분석시료에만 결합하는 압타머를 선정함으로써, 압타머에 의한 분석시료의 분석 효율을 향상시키는 한편, 최종적으로 선정된 압타머에 결합하는 생물학적 분석시료의 특성을 규명하는 것에 사용할 수 있도록 하는 것이다.
본 발명에 따라 제조된 압타머는, 생물학적인 성질의 양적 차이에 대한 정보를 제공할 수 있는지를 확인하는 근거가 되며, 따라서 본 발명은 ˝정량상의 차별적 스크리닝 기술"에 해당된다.
또한, 본 발명에 따른 압타머 제조방법은, 단백체 연구-진단 도구를 고안하기 위해, 신규의 타깃 또는 치료 산물을 식별하기 위해, 그리고 압타머 라이브러리를 구성하고 혈청, 세포 및 조직 등의 시료에 대한 압타머 라이브러리를 비교 분석하며 압타머를 선정하기 위한 방법 등에 적용될 수 있다.
본 발명에서 정상화-감산화 된 압타머들을 제조하는 방법은, 무작위 서열을 포함하는 단일 가닥형 올리고뉴클레오티드의 거대한 라이브러리 또는 풀로부터 출발한다.
본 발명에서 생물학적으로 의미가 있는 시료(분석시료)에 대한 정상화-감산화 압타머를 제조하기 위한 출발 올리고뉴클레오티드 라이브러리를 구성하는 이상 적인 올리고뉴클레오티드는 도1과 같으며, 다음 요소들을 포함한다.
(a) 고정서열(fixed sequence)과 보존서열(conserved sequence)이 양쪽에 있는 올리고뉴클레오티드.
(b) 양쪽의 고정서열(fixed sequence)과 보존서열(conserved sequence)의 사이에 다양성이 있는 임의의 염기서열이 최소 15개 이상에서 100개 이하로 존재하는 올리고뉴클레오티드.
상기 출발 올리고뉴클레오티드 라이브러리는 DNA 합성기 상에서 자동화된 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다. 무작위 서열을 합성하기 위해서는, 모두 4종의 뉴클레오티드 혼합물을 합성 과정중의 각 뉴클레오티드 부가 단계에 첨가하여, 뉴클레오티드가 무작위로 혼입될 수 있도록 한다.
상기 올리고뉴클레오티드는 변형 또는 비변형된 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 하이브리드일 수 있다.
상기 무작위 올리고뉴클레오티드는 전부 무작위 서열이거나 부분적으로 무작위한 서열부분을 포함할 수도 있다. 예를 들어 풀은 100% 무작위하거나 부분적으로 부작위한 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 부분적으로 무작위한 서열은 각각의 부가 단계에서 4가지 뉴클레오티드를 상이한 몰 비로 첨가함으로써 제조할 수 있다.
바람직하게, 상기 출발 올리고뉴클레오티드는 무작위한 서열 내에 적어도 하나의 상기 고정서열과 상기 보존서열이 혼입된 무작위하거나 부분적으로 무작위한 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
바람직하게, 상기 출발 올리고뉴클레오티드는 5'-3' 단부에 적어도 하나의 고정서열과 보존서열을 함유하는 무작위하거나 부분적으로 무작위한 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 고정서열-보존서열은 올리고뉴클레오티드 풀의 모든 분자가 공통으로 가지는 서열을 포함할 수 있다.
상기 고정서열은 사전선별용으로 혼입된 풀에 존재하는 올리고뉴클레오티드에 공통된 서열로서, 예를 들어 이하에 설명되어 있는 CpG 모티프, PCR 프라이머에 대한 하이브리드화 부위, RNA 중합효소(예, T3, T4, T7 및 SP6)에 대한 프로모터 서열, 제한 부위 또는 단일중합체 서열, 예를 들어 폴리 A 또는 폴리 T 트랙, 촉매 중심부, 친화성 컬럼에 선별 결합하는 부위 및 관심 올리고뉴클레오티드의 클로닝-서열결정을 촉진하는 기타 서열 등이 있다.
상기 보존서열이란, 상기 고정서열 이외에 동일한 표적에 결합하는 다수의 압타머가 공유하는 서열을 말한다.
바람직하게, 상기 출발 올리고뉴클레오티드는 효율적인 증폭에 필요한 무작위 서열부분과 고정서열을 포함한다. 통상적으로, 상기 출발 올리고뉴클레오티드는 30∼50 개의 무작위 뉴클레오티드로 이루어진 내부 영역의 측면에 존재하는 고정된 5' 및 3' 말단 서열을 가진다.
무작위 뉴클레오티드는 화학적 합성 및 무작위 절단된 세포내 핵산의 크기별 선별을 포함한 다수의 방법으로 생산할 수 있다. 핵산 내 서열 변이는 또한 선별/증폭 과정을 반복 실시하기 이전 또는 도중에 돌연 변이 유발법으로 도입하거나 또는 증가시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 무작위 서열부분은 임의의 길이를 가질 수 있으며, 리보뉴클레오티드-데옥시리보뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 또한 변형 또는 비-천연 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다(참고: 미국특허 제5,958,691호; 미국특허 제5,660,985호; 미국특허 제5,958,691호 ; 미국특허 제5,698,687호 ; 미국특허 제5,817,635호 ; 미국특허 제5,672,695호 및 PCT 공보 제 WO92/07065호).
무작위 올리고뉴클레오티드는 해당 업계에 널리 공지된 고상 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 이용하여 포스포디에스테르-결합 뉴클레오티드로부터 합성할 수 있다(참조: Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14:5399-5467 (1986) 및 Froehler et al., Tet. Lett. 27:5575-5578 (1986)).
무작위 올리고뉴클레오티드는 트리에스테르 합성 방법과 같은 용액 상 방법을 이용하여 합성할 수도 있다(참조: Sood et al., Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977) 및 Hirose 외 다수, Tet. Lett., 28:2449 (1978)).
자동화된 DNA 합성 장비를 사용하여 수행한 통상의 합성 결과, 1014 ~ 1016 개(대부분의 셀렉스 실험에 사용하기에 충분한 수)의 개별 분자들이 생산된다. 서열 디자인에 있어서 무작위 서열의 충분히 거대한 영역은 각각의 합성 분자가 독특한 서열을 나타낼 가능성을 높여준다.
도1에 도시된 바와 같이, 출발 올리고뉴클레오티드는 "고정서열-보존서열-임의의 염기서열 부분-고정서열-보존서열"로 구성되어 진다. 이런 구조는 DNA 압타머 및 RNA 압타머를 생물학적인 방법으로 제조하는데 필수적인 역할을 하며, 본 발명에 사용한 RNA 압타머의 경우, 출발 올리고뉴클레오티드의 5' 끝에 있는 고정서열 은 RNA 압타머의 생체외 전사에 필요한 RNA polymerase의 결합 위치를 제공하는 프라이머의 결합 위치, 상기 압타머테스터 및 상기 압타머드라이버 합성시 PCR용 프라이머 결합 위치, 정상화-감산화에 요구되는 다양한 프라이머의 결합 위치 등을 제공하는 역할을 한다.
DNA 압타머는 출발 올리고뉴클레오티드 라이브러리를 주형으로 하여 One way-PCR에 의해 단일가닥 핵산 풀을 제조함으로서 얻는다.
RNA 압타머는, 도2에 도시된 바와 같이, 출발 올리고뉴클레오티드 라이브러리를 대상으로 하여 PCR를 수행하여 T7 프로모터가 있는 이중가닥 핵산을 제조한 후, 생체외 전사하여 RNA 풀을 제조함으로써 얻는다.
생물학적인 시료에 결합하는 압타머 라이브러리는 생물학적인 시료의 다양성을 있는 그대로 반영하여야 한다. SELEX은 선택과 증폭을 반복적으로 수행하여 특정한 분자에 특이적으로 강력하게 결합하는 단일가닥핵산을 선정하는 과정인바, 본 발명에서는 SELEX의 이런 단점을 극복하기 위해 한정된 선택과 증폭만을 수행하는 대신 세척단계를 다양화하여 생물학적인 분석시료에 포함된 생체분자들의 다양성을 잘 반영하는 압타머 라이브러리를 제공한다.
본 발명에 따른 압타머 제조방법에서, 상기 압타머테스터와 상기 압타머드라이버를 제조하는 단계에서는, 분석시료에 대해 제조된 DNA풀 혹은 RNA 풀을 처리하여 분석시료에 결합하는 압타머 라이브러리를 제작한다. 제작된 압타머라이브러리를 PCR방법으로 이중가닥 DNA 풀로 전환하여 압타머테스터를 제조하고, 압타머드라이버는 비교시료에 대해 압타머테스터를 제조하는 방법과 동일한 방법으로 제조한 다.
본 발명에 따른 압타머 제조방법에서, 정상화 및 감산화를 위해서, 도1의 고정서열-보존서열은 아래의 실시예와 같이 디자인되고, 프라이머를 필요로 한다.
상기 압타머테스터와 상기 업타머드라이버를 이용한 정상화-감산화는 도3과 같이 수행할 수 있다(Sagerstrom et al., Annu. Rev. Biochem., 1997, 66:751-83).
감산화의 기본적인 개념은 "차별적으로 존재하여 관심이 있는 염기서열을 포함하는 핵산풀(테스터)과 관심이 있는 염기서열이 없을 것으로 생각되는 핵산풀(드라이버)을 압타머테스터보다 압타머드라이버의 양을 과량으로 하여 혼성화하는 방법"이다.
압타머테스터와 압타머드라이버 DNA 군집은 양 DNA 군집에 공동적으로 있는 DNA만이 이중가닥을 형성하도록 혼성화 반응을 시킬 수 있다. 혼성화 반응이 종료된 후, 테스터-드라이버의 이중가닥핵산, 비결합한 드라이버 단일가닥핵산은 제거되고, 남아있는 핵산은 압타머테스터에만 존재하는 염기서열인 단일가닥핵산 풀을 제조하기 위해 사용된다.
본 발명은, 라이브러리에 있는 DNA를 정상화하는 것뿐만이 아니라 다른 라이브러리에 공통적으로 존재하는 DNAs를 제거하는 것(감산화 하는 것)이므로, 본 발명에 따른 방법은 정상화-감산화 된 상보성 DNAs의 제조에 효율적이다.
본 발명은 선택적인 압타머를 확보하여 그 특징을 규명하고 이에 결합하는 생체분자를 규명하는 것인바, 압타머에 결합하는 생체분자를 분리, 동정하는 방법은 도6과 같다. 정상화-감산화된 압타머를 이용하여 특이적으로 결합하는 생체분자 를 분리하고 이 복합체를 PADE-SDS 젤에서 전기영동을 하여 단백질밴드를 확인한다. 확인된 단백질밴드를 절단하여 단백질을 추출한 후, MALTI-TOF-TOF로 단백질을 동정하는 단계를 통해, 본 발명에 따라 제조된 압타머에 특이적으로 결합하는 분자를 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 압타머 제조방법은, 생물공학, 의학, 생물학 그리고 생화학의 분야에 응용된다. 본 발명의 응용은 인간 건강 상태, 동물 및 식물 관리에 최종적인 목적이 있다. 구체적으로, 본 발명은 치료 수단과 진단 목적의 분자를 식별하기 위한 두 개 이상의 생물학적인 생체시료(예, 분석시료와 비교시료) 각각에 결합하는 압타머 라이브러리를 비교분석하여 선택적인 압타머를 개발하고 이에 결합하는 분자를 이용하여 생물학적인 시료를 식별함으로써 가능하다.
본 발명의 압타머 제조방법은, 비교되는 두 개 이상의 특징적 생리학적 상태, 특히 발병조직 또는 기관과 그것의 생리적인 환경을 반영하는 세포 및 단백질체에 대한 압타머 라이브러리를 비교분석하여 분석에 보다 효율적인 압타머를 제조하는 벙법이며, 제조된 압타머는 생체시료(분석시료 및 비교시료)들 간의 정성 차이를 증명하고, 생체시료에 포함된 생체분자를 분리ㅇ동정하기 위한 방법에 사용된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 방법은, 병리 조건과 건강한 상태의 생체시료에 결합하는 압타머 및 이에 결합하는 분자를 비교ㅇ분석하여 비교하기를 원하는 두 가지 이상의 생리학의 상태를 분석할 수 있는 근거를 제공한다. 따라서 본 발명에 의하면, 새로운 치료 표적이나 진단 도구의 발견에 유용하게 사용될 가능성을 가진 다.
본 발명은, 단지 선택과 증폭을 반복적으로 수행하여 특정한 분자에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산을 선정하는 SELEX 방법에 비하여 분석시료에 포함된 생체분자들의 다양성을 보다 잘 반영함으로써 비교시료에 대비하여 분석시료의 분석에 보다 효율적인 압타머를 획득할 수 있는 효과가 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하는 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 아니한다.
실시예1. 출발 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 제조
생체시료(생물학적인 분석시료 및 비교시료)와 반응시킬 단일가닥의 RNA 라이브러리(무작위 단일가닥핵산들)를 제조하기 위해, 먼저 출발 올리고뉴클레오티드 및 프라이머를 디자인하여 제조하였으며, 사용된 프라이머는 아래 염기서열의 "SEL-FW 프라이머(서열번호1)" 및 "SEL-RE 프라이머(서열번호2)"이다.
도1에 도시된 바와 같이, 아래와 같은 무작위의 염기서열을 가진 단일가닥의 DNA 올리고뉴클레오티드를 상기 SEL-FW 프라이머 및 상기 SEL-RE 프라이머로 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 통해 이중가닥의 DNA를 제조하였다.
5'-CGGAAGCGTGCTGGGCC N40 CATAACCCAGAGGTCGA-3'
(여기에서 밑줄 친 염기배열은 올리고뉴클레오티드 라이브러리의 고정된 부위이며, 40개 염기의 N40은 각 위치에 A, G, T, C등의 염기들이 같은 농도로 존재함을 의미한다.)
SEL-FW 프라이머(서열번호1):
5'-GGGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGG- 3'
SEL-RE 프라이머(서열번호2):
5'-GGGGGGATCCATCGACCTCTGGGTTATG-3'
PCR에 이용되는 상기 SEL-FW 프라이머는 상기 무작위의 염기서열을 가진 단일가닥의 DNA 올리고뉴클레오티드의 밑줄친 염기들의 5'말단과 염기결합을 할 수 있고 박테리오파지 T7의 RNA 폴리머아제를 위한 프로모터 염기서열을 포함한다.
PCR에 이용되는 상기 SEL-RE 프라이머는 무작위의 염기서열을 가진 단일가닥의 DNA 올리고뉴클레오티드의 밑줄 친 염기들의 3'말단과 염기결합을 할 수 있다.
그리고 SEL-FW와 SEL-RE 프라이머는 이후의 클로닝을 위해 각각 EcoRI과 BamHI등의 제한효소 절단 염기서열을 함유하고 있다.
실시예2. RNA 라이브러리 제조
생체시료(생물학적인 분석시료 및 비교시료)와 반응할 무작위 단일가닥핵산 들은 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA 압타머 라이브러리인바, 실시예1에서 제조된 출발 올리고뉴클레오티드 라이브러리 전사체 및 프라이머들을 이용하여 PCR 및 생체외 전사 방법으로 제조하였다.
PCR은 1,000 pmoles 출발 올리고뉴클레오티드 라이브러리, 2,500 pmoles PCR의 프라이머 쌍(SEL-FW 프라이머, SEL-RE 프라이머)을 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.3), 3 mM MgCl2, 0.5 mM dNTP(dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP), 0.1 U Taq DNA Polymerase (Perkin-Elmer, Foster City Calif.)에서 PCR를 수행한 후, QIAquick-spin PCR 정제 칼럼(QIAGEN Inc., Chatsworth Calif.)으로 정제하였다.
2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 무작위 RNA 단일가닥핵산들은 Durascribe T7 Transcription Kit (EPICENTRE, USA)로 생체외 전사를 수행하여 합성하고 정제하여 제조하였다. 200 pmoles 이중가닥 DNA 전사체, 40 mM Tris-Cl (pH 8.0), 12 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM spermidine, 0.002% Triton X-100, 4% PEG 8000, 5 U T7 RNA Polymerase 그리고 1 mM ATP, GTP 및 3 mM 2'F-CTP, 2'F-UTP를 37℃에서 6 ~ 12시간 반응시킨 후, Bio-Spin 6 크로마토그래피 칼럼(Bio-Rad Laboratories, Hercules Calif.)으로 정제한 후, UV 스펙트로미터를 이용하여 정제된 핵산의 양 및 그 순수도를 검색하였다.
실시예3. 생체시료에 결합하는 압타머 라이브러리 제조
생체시료로서 혈청을 사용하였고, 심근경색 환자의 혈청을 분석시료, 불안정 성 협심증 환자의 혈청을 비교시료로 하였다.
환자의 혈청을 MARC 칼럼(Agilent Technologies Inc. USA)을 이용하여 과량으로 존재하는 단백질을 제거한 혈청단백질을 제조사에서 제공하는 방법에 따라 제조하였다.
상기에서 합성된 무작위 단일가닥핵산들의 1015 염기서열/1㎖의 농도용액을 200 pmol/200㎕의 농도로 선택버퍼(50 mM Tris·Cl (pH 7.4), 5 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.1% NaN3)에서 80℃에서 10분간 가열한 후, 얼음에 10분간 방치하였다. 사용한 단일가닥핵산의 5배의 효모 tRNA(yeast tRNA, Life Technologies사) 및 0.2% BSA(bovine serum albumin, Merck사)을 첨가하여 반응용액을 제조하였다.
혈청단백질을 Nitrocellulose membrane (NC 막) 조각(0.3x0.3 mm2)에 고정시키기 전에, 반응시 사용할 선택버퍼에 100mM DTT 60ul 첨가와 비특이반응 차단완충용액에 100mM DTT, 10% BSA 300ul를 첨가하였다.
결합 반응 튜브에 결합 완충 용액 50㎕와 제조된 혈청단백질 500㎍를 혼합해서 제조하였다. 태핑 후 quick-spin하여 NC 막이 완전히 결합 완충 용액에 잠기도록 해주었다. 100 rpm에서 30 분간 교반기를 이용하여 혼합하였다.
NC 막을 상온에서 10분 건조시켜 새로운 1.5ml 튜브에 넣었다. 비특이반응 차단완충용액 200 ㎕ 첨가하고 100 rpm에서 30 분간 교반기를 이용하여 혼합하여 준 후 NC 막을 새로운 1.5ml 튜브로 옮겼다. 400 ㎕의 세척완충용액 첨가하고 100 rpm에서 10 분간 교반기를 이용하여 혼합하여 준 후 NC 막을 새로운 1.5ml 튜브로 옮겼다. 400 ㎕의 세척완충용액 첨가하고 100 rpm에서 10 분간 교반기를 이용하여 혼합하여 준 후 NC 막을 새로운 1.5ml 튜브로 옮겼다.
제조된 RNA 단일가닥핵산 풀(100ng/ul) 5 ㎕와 결합완충용액 195 ㎕를 첨가하여 200 rpm에서 30 분간 교반기를 이용하여 혼합하여 준 후 NC membrane을 새로운 1.5ml 튜브로 옮겼다.
세척완충용액 400 ㎕를 첨가하여 100 rpm에서 10 분간 교반기를 이용하여 혼합하여 준 후 NC membrane을 새로운 1.5ml 튜브로 옮겼다. 세척완충용액 400㎕를 첨가하여 100rpm에서 10분간 교반기를 이용하여 혼합하여 준 후, NC막을 새로운 1.5ml 튜브로 옮겼다.
NC막을 Whatman filter paper 위에 놓고 상온에서 10분간 건조하였다. 건조된 NC membrane을 새로운 1.5ml 튜브에 넣고, DEPC 멸균 정제수 40㎕를 첨가하였다. 95ㅀC heat block에서 10분간 두어 RNA를 용리한다. 탭핑하여 막에 붙은 RNA를 용리하고 quick-spin한 후, 얼음에 둔다. PCR 튜브에 36㎕를 옮기고 다음 과정인 RT에 이용하였다.
인간혈청시료(생체분자)와 결합하는 생체분자결합 단일가닥핵산(RNA 압타머) 의 선정은, 일차적으로 인간혈청시료에 결합력을 보이는 단일가닥핵산들을 대상으로 하며, 반응 후 다양한 세척버퍼로 세척 과정을 반복하여 일회만의 선택과정으로 인간혈청단백질(생체분자)-단일가닥핵산 복합체들을 확보하였다.
생체분자-단일가닥핵산 복합체들의 세척버퍼는 0 내지 1 x 세렉스버퍼, 0 내 지 5% Tween-20 또는 0 내지 500 mM EDTA 용액을 사용하였다. 이때, 상기의 선택과 증폭과정을 다수회 반복하여 생체분자결합 단일가닥핵산들을 제작할 수도 있다.
생물학적인 생체시료에 결합하는 압타머 라이브러리는 생체시료에 포함된 생체분자의 다양성을 있는 그대로 반영하여야 하는 것이 이상적임으로, 한정된 선택과 증폭만을 수행하는 대신 세척단계를 다양화하여 생물학적인 시료의 다양성을 잘 반영하는 압타머 라이브러리를 제작하였다.
실시예4. 정상화 및 감산화(Suppression PCR based method)
도3 및 도4d 도시된 바와 같이, 실시예3에서 분리된 생체분자-단일가닥핵산의 복합체를 대상으로 RT-PCR을 수행하여 혈청단백질에 결합하는 RNA(생체분자결합 단일가닥핵산)를 지시하는 DNA 풀을 증폭 제작하였다. RT-PCR에 사용되는 프라이머쌍을 새로이 디자인하였고, 그 염기서열은 아래의 "RNA capture FW 프라이머(서열번호3)" 와 "RNA capture RE 프라이머(서열번호4)"와 같다.
RNA capture FW 프라이머(서열번호3): 5'-TCGACCTCTGGGTTATG-3'
RNA capture RE 프라이머(서열번호4): 5'-CGGAAGCGTGCTGGGCC-3'
RT-PCR은 표준방법에 따라 수행하였는데, 먼저 역전사(Reverse transcription)는 PCR 튜브에 반응액 36 ㎕를 옮겨주고, 5x 역전사완충용액을 10 ㎕, RNA capture RE 프라이머 (25pmol/ul) 용액 1㎕를 첨가하여 혼합하였다. 상기의 혼합액을 PCR 기계를 이용하여 65 ℃에서 5 분 반응 후, 25 ℃로 10분간 반응시켰다. 상기의 반응이 끝난 후, DEPC 멸균 정제수 1.5ul, 20mM dNTP 1ul, AMV RTase (10u/ul, BEAMS, Cat. No.3001L) 0.5ul를 포함한 혼합액을 제조하였다. 제조한 혼합액을 반응이 끝난 PCR 튜브에 3ul 첨가하여 최종 부피가 50ul가 되게 하였다. 상기의 PCR 튜브는 PCR 기계를 이용하여 37 ℃에서 30 분간 반응시킨 후, 95 ℃에서 5분간 반응하였다.
이어서 PCR 반응을 다음과 같이 수행하였다. 생성물 cDNA를 증폭하는 PCR 증폭 반응은 먼저 RT 반응물 50ul에 10x PCR 완충용액 10㎕, 20mM dNTP 1 ㎕, RNA capture FW 프라이머 (25pmol/ul) 1 ㎕, RNA capture RE 프라이머 (25pmol/ul) 1ul, Taq ploymerase (5u/ul) 0.5ul, 3차 멸균 정제수 36.5ul를 첨가하여 최종 부피가 100ul가 되도록 PCR 혼합액을 제조하였다. PCR 기계를 이용하여 95 ℃에서 5 분간 예비 변성, 95 ℃에서 30 초간 변성, 55 ℃에서 30초간 결합, 72 ℃에서 30초간 신장의 과정을 25 회 반복, 72 ℃에서 5분간 최종 신장의 반응을 수행한다.
PCR 생성물을 1.5ml 튜브로 옮기고 100ul D.W.를 첨가하여 부피를 200ul로 증가시키고 동부피의 phenol:chloroform:isoamylalcohol 200ul 첨가하였다. Vortex로 혼합한 후, 13,000 rpm에서 1 분간 원심분리하고 상층액을 새로운 1.5ml 튜브에 옮겼다. 2 배 부피의 100 % 에탄올과 0.1배 부피의 3 M Sodium Acetate(pH 5.2)를 첨가하여 혼합한 후, -20 ℃에 최소 60 분간 또는 -80℃에 최소 10 분간 보관하였다. 보관한 튜브를 4℃, 13,000 rpm에서 10 분간 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 70 % 에탄올을 500 ㎕를 첨가해 준 후, 4℃, 13,000 rpm에서 5 분간 원심분리한 후 상층액을 제거했다.
상기 e-튜브를 건조 시킨 후, 3차 멸균 정제수 30 ㎕를 첨가하여 용해시켜 주었다. 2.5% agarose gel에 5ul를 loading하고 50bp ladder DNA marker 3ul를 로딩한 100bp 밴드를 기준으로 Alphaimager program으로 정량하였다.
상기의 실시로 준비된 분석시료 혈청에 결합하는 압타머 라이브러리에 대한 PCR한 산물을 "압타머테스터"로, 그리고 비교시료 혈청에 결합하는 압타머 라이브러리에 대한 PCR한 산물을 "압타머드라이버"를 명명하였다.
이때 정상화 및 감산화에 사용할 "압타머테스터"를 압타머테스터1과 압타머테스터2로 분할하였다.
압타머테스터1 및 압타머테스터2는, 표준방법으로 PCR를 수행하여 제조하였으며, 이때 압타머테스터1의 경우 새로이 디자인한 아래의 프라이머 "Subapaptor 1-RNA capture FW 프라이머(서열번호5)"와 상기 "RNA capture RE 프라이머"를 사용하였고, 압타머테스터2는 상기 "RNA capture FW 프라이머"와 새로이 디자인한 아래의 프라이머 "Subapaptor 2-RNA capture RE 프라이머(서열번호6)"를 사용하였다.
Subapaptor 1-RNA capture FW 프라이머(서열번호5):
5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTCGGAAGCGTGCTGGG-3'
Subapaptor 2-RNA capture RE 프라이머(서열번호6):
5'-CAGCGTGGTCGCGGCCGAGGTTCGACCTCTGGGTTATG-3'
1.5 ul , 20ng 압타머테스터1, 1.5 ul 600ng 압타머드라이버 PCR 산물, 1.0 ul 4x 혼성화용액(200mMHEPES pH 7.5, 2MNaCl, 0.8mMEDTA)을 혼합하여 반응부피 4.ul로 60도에서 1차 혼성화를 12시간정도 수행하였고; 1.5 ul , 20ng 압타머테스 터 2, 1.5 ul 600ng 압타머드라이버 PCR 산물, 1.0 ul 4x 혼성화용액을 혼합하여 반응부피 4.ul로 95도에서 5분간처리한 후, 60도에서 1차 혼성화를 12시간정도 수행하였다. 전자는 "압타머테스터1 혼성용액", 후자는 "압타머테스터2 혼성용액"이다.
압타머드라이버 용액은 1.0 ul, 120ug 압타머드라이버, 1.0 ul 4ㅧ혼성화용액, 2ul 물을 혼합한 후, 소량의 mineral oil를 위에 첨가하여 PCR 기계를 이용하여 98도에 90초간 처리하여 제조하였다.
압타머테스터2 혼성용액을 압타머드라이버 혼성용액에 조심스럽게 넣어 혼합하고 이 혼성용액(압타머테스터2 혼성용액와 압타머드라이버 혼성용액의 혼합 혼성용액)을 다시 압타머테스터1 혼성용액에 넣어 피펫으로 잘 혼합한 후, 60도에서 12 시간동안 2차 혼성화를 실시하였다. 2차 혼성화반응이 종결된 용액에 Taq polymerase를 첨가하여 75도에서 5분간 신장(extension) 반응을 수행하여 2차 혼성화 산물의 이중가닥 핵산의 5' 끝과 3'끝의 cohensive end에 염기를 추가하여 blunt end로 전환시켰다.
신장반응이 종결된 용액에 대해 아래와 같이 디자인된 "Subapaptor 1 프라이머"(서열번호7)와 "Subapaptor 2 프라이머(서열번호8)"를 사용하여 PCR를 수행하였다.
Subapaptor 1 프라이머(서열번호7):
5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'
Subapaptor 2 프라이머(서열번호8):
5'-CAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'
PCR 산물에 대해 상기 "RNA capture FW 프라이머"와 상기 "RNA capture RE 프라이머"로 표준방법으로 Nested PCR를 수행하였다. 확보된 PCR 산물인 DNA를 Eco RI과 Bam HI으로 절단하여 pUC19 플라스미드에 클로닝하여 클론을 확보하는 과정으로, 정상화-감산화된 압타머 라이브러리의 제작을 완료하였다. 이들 압타머들의 염기서열은 표준방법으로 플라스미드를 분리하여 수행하였다.
실시예5. Duplex-Specific Nuclease(DSN) 을 이용한 정상화
도5에 도시된 바와 같이, 생체시료에 결합하는 압타머 라이브러리의 정상화를 위해, 실시예4에서 압타머테스터 및 압타머드라이버를 제조하는 방법으로 이중가닥 압타머 DNA를 제조하였다. 제조된 이중가닥 압타머 DNA를 ~100ng/ul 농도 제조하여 1.5ul씩 나누어 PCR 튜브에 넣은 후, 추가적으로 1ul의 4x혼성화용액 및 1.5ul의 증류수를 넣고 미네랄 오일(mineral oil)을 오버레이 하였다. 98도에서 3분간 가열한 후 60도씩에서4시간 동안 혼성화하였다. 혼성화를 종결한 후, 60도 예열된 5ul의 2x DSN 버퍼(100 mM Tris HCl pH 8.0, 10 mM MgCl2, 2 mM dithiothreitol)를 혼합 반응물에 첨가하였다. 이어서 0.25 Kunitz units의 DSN 효소(Wako 사, 일본)를 첨가하여 반응시켰다. 20분간 반응시킨 후, 10ul의 5mM EDTA를 첨가하여 반응을 종결시켰다.
이와 같이 정상화가 이루어진 압타머라이브러리를 PCR 방법으로 증폭하였다. 생성물 cDNA를 증폭하는 PCR 증폭 반응은 먼저 RT 반응물 50ul에 10x PCR 완충용액 10㎕, 20mM dNTP 1 ㎕, RNA capture FW 프라이머 (25pmol/ul) 1 ㎕, RNA capture RE 프라이머 (25pmol/ul) 1ul, Taq ploymerase (5u/ul) 0.5ul, 3차 멸균 정제수 36.5ul를 첨가하여 최종 부피가 100ul가 되도록 PCR 혼합액을 제조하였다.
PCR 기계를 이용하여 95 ℃에서 5 분간 예비 변성, 95 ℃에서 30 초간 변성, 55 ℃에서 30초간 결합, 72 ℃에서 30초간 신장의 과정을 25 회 반복, 72 ℃에서 5분간 최종 신장의 반응을 수행한다.
실시예 6. Duplex-Specific Nuclease(DSN)을 이용한 감산화
도5에 도시된 바와 같이, 정상화된 압타머테스터와 정상화된 압타머드라이버를 이용하여 감산화를 수행하였다. 먼저 정상화된 압타머테스터를 대상으로 One-way PCR를 수행하여 단일가닥 압타머테스터를 제조하였다. One-way PCR 증폭 반응은 먼저 압타머테스터 용액 50ul에 10x PCR 완충용액 10㎕, 20mM dNTP 1 ㎕, Subadaptor 1-RNA capture FW 프라이머 (25pmol/ul) 1 ㎕, RNA capture RE 프라이머 (0.25pmol/ul) 1ul, Taq ploymerase (5u/ul) 0.5ul, 3차 멸균 정제수 36.5ul를 첨가하여 최종 부피가 100ul가 되도록 PCR 혼합액을 제조하였다. PCR 기계를 이용하여 95 ℃에서 5 분간 예비 변성, 95 ℃에서 30 초간 변성, 55 ℃에서 30초간 결합, 72 ℃에서 30초간 신장의 과정을 25 회 반복, 72 ℃에서 5분간 최종 신장의 반응을 수행한다.
1㎕의 단일가닥 압타머테스터(1 ng), 2㎕의 제조된 과량의 이중가닥 압타머 드라이버(200 ng), 및 1㎕의 4x 혼성화용액을 E-튜브에 첨가한 후, 98도에서 2분간 가열한 후, 60도에서 12시간 동안 용액혼성화를 수행하였다. 혼성화가 종결된 후, 5 ㎕의 60도에서 예열된 2xDSN 버퍼를 E-튜브에 첨가하여 60도에서 10분간 처리하였다. 이 반응용액에 1㎕의 DSN을 처리하여 60도에서 30분간 반응시켜 이중가닥 DNA를 제거하였다. 반응을 종결시킨 후, 페놀 추출을 하고 에탄올 침전을 수행한 후 증류수에 녹였다. 감산화된 단일가닥 압타머테스터의 증폭은 Subadaptor 1-RNA capture FW 프라이머 (25pmol/ul) 1 ㎕, RNA capture RE 프라이머 (25pmol/ul) 1ul로 표준방법 PCR로 수행하였다. 이어서 1㎕의 Exonuclease I을 처리하여 30분간 반응시켜 남아있는 단일가닥핵산을 제거하였다.
증폭된 압타머테스터 DNA를 pUC19에 클로닝하여 정상화 및 감산화된 압타머 라이브러리를 제작하였다.
실시예 7. 정상화 및 감산화의 평가
압타머 풀의 정상화 및 감산화된 정도의 평가는 혈청을 NC막에 처리하여 고정시킨 후, 정상화 및 감산화된 압타머 풀을 처리하여 반응시킨 후, 혈청단백질에 결합한 압타머를 상기의 NC 막으로부터 분리하여 RT-PCR를 수행하고 전기영동하여 그 결과를 확인하는 방법으로 수행하였다.
본 실시례에서는 분석시료로 심근경색 환자의 혈청을 사용하고 비교시료로 불안정성 협심증 환자의 혈청을 사용하여 정상화-감산화를 실시하여 얻은 압타머풀을 이용하여 평가한 결과는 도7과 같다. 분석시료와는 강한 밴드가 형성이 되고 비 교시료에는 약한 밴드가 형성이 되어 비교시료에 의해 분석시료가 정상화-감산화 되었음을 확인할 수 있다.
실시예8. 압타머에 결합하는 단백질 분리 및 동정
심근경색환자의 혈청(분석시료)을 불안정성 협심증 환자의 혈청(비교시료)으로 정상화-감산화하여 확보한 정상화-감산화된 압타머 풀을 클로닝한 후 플라스미드를 분리하고 염기서열을 결정하여 아래 6개의 압타머(서열번호9 내지 서열번호14)를 선정하였다.
일련번호066(서열번호9): UACAGACUAGCCCUGCAAAAACAAGCCAGCUCGAUGUACA
일련번호070(서열번호10): CCCCCGAUACUUGUUUUCUAUACACUCCUGACUACAAUGG
일련번호290(서열번호11): CGCACCCUUACAGUAAUUGCGUCAUCAAACCCCCCUUCAC
일련번호300(서열번호12): ACUAGACAAGUUCACACACUAUCCAGCGCUACUUUAUUAA
일련번호455(서열번호13): AGUCGAAAGCGAGACCACCGACCCCAAAAGAGUUUCAAUUA
일련번호683(서열번호14): UAAAUAAACGGGUAAAGUGGGCGGAAUAAUACAAACCAUA
이 중에 일련번호290 압타머(서열번호11)에 해당하는 부위를 PCR로 증폭한 후, 생체외 전사를 실시하여 압타머를 제조하였다. 분석시료인 심근경색 환자의 혈청와 비교시료인 불안정협심증 환자의 혈청에 대한 일련번호290 압타머의 결합정도를 평가한 결과, 심근경색환자의 혈청에만 특이적으로 반응함을 알 수 있었다(도8 참조).
선정된 압타머 한쪽에 바이오틴(biotin)을 부착시키고 스트렙타비 딘(streptavidin)과 반응시킨 후, 혈청시료와 반응시켜 복합체를 분리한 다음 전기 영동하여 형성되는 밴드를 분리하여 생체분자를 동정하는 과정의 순서에 대한 흐름도는 도6이다. 선정된 단일가닥핵산에 결합하는 단백질을 분리하여 MALDI-TOF-TOF 기기로 단백질의 아미노산서열을 결정할 수 있다.
도1은 출발 올리고뉴클레오티드의 구조도,
도2는 출발 올리고뉴클레오티드 라이브러리로부터 시료결합 압타머 라이브러리 제조의 개략도,
도3은 정상화-감산화 단계에서의 2회 용액혼성화의 개략도,
도4는 정상화-감산화된 압타머 클로닝의 개략도,
도5는 Duplex-Specific Nuclease(DSN)을 이용한 감산화의 개략도,
도6은 선정된 정상화-감산화 된 압타머에 결합하는 단백질의 분리 및 동정의 개략도,
도7은 분석시료인 심근경색환자 혈청와 비교시료인 불안정성 협심증환자 혈청을 이용하여 정상화-감산화 된 압타머 풀로 분석시료 및 비교시료에 대한 정상화-감산화된 정도를 평가한 사진도면,
도8의 a는 분석시료인 심근경색환자혈청과 비교시료인 불안정성 협심증환자 혈청을 이용하여 정상화-감산화된 압타머(일련번호290)로 분석시료 및 비교시료에 대한 정상화-감산화 된 정도를 전기영동하여 평가한 결과의 사진도면이고, 도8의 b는 도8의 a에서 형성된 밴드의 밀도를 구하여 비교한 그래프 도면.
<110> KIM, Sung-chun <120> Method of Preparing Aptamer <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 gggggaattc taatacgact cactataggg agagcggaag cgtgctggg 49 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 ggggggatcc atcgacctct gggttatg 28 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 tcgacctctg ggttatg 17 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 cggaagcgtg ctgggcc 17 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 tcgagcggcc gcccgggcag gtcggaagcg tgctggg 37 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 cagcgtggtc gcggccgagg ttcgacctct gggttatg 38 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 tcgagcggcc gcccgggcag gt 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 cagcgtggtc gcggccgagg t 21 <210> 9 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA specifically binding to serum protein of myocardial infarction patient <400> 9 uacagacuag cccugcaaaa acaagccagc ucgauguaca 40 <210> 10 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA specifically binding to serum protein of myocardial infarction patient <400> 10 cccccgauac uuguuuucua uacacuccug acuacaaugg 40 <210> 11 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA specifically binding to serum protein of myocardial infarction patient <400> 11 cgcacccuua caguaauugc gucaucaaac cccccuucac 40 <210> 12 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA specifically binding to serum protein of myocardial infarction patient <400> 12 acuagacaag uucacacacu auccagcgcu acuuuauuaa 40 <210> 13 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA specifically binding to serum protein of myocardial infarction patient <400> 13 agucgaaagc gagaccaccg accccaaaag aguuucaauu a 41 <210> 14 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA specifically binding to serum protein of myocardial infarction patient <400> 14 uaaauaaacg gguaaagugg gcggaauaau acaaaccaua 40

Claims (12)

  1. (A) 출발 올리고뉴클레오티드 라이브러리를 제조하는 단계;
    (B) 상기 출발 올리고뉴클레오티드 라이브러리로부터, 분석대상이 되는 생물학적인 분석시료에 결합하는 압타머 라이브러리와, 상기 분석시료에 비교되는 생물학적인 비교시료에 결합하는 압타머 라이브러리를 각각 제조하는 단계;
    (C) 상기 압타머 라이브러리들을 정상화 및 감산화하는 단계; 및
    (D) 상기 정상화 및 감산화 된 압타머를 취득하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 비교시료에 대비하여 상기 분석시료의 분석에 보다 효율적인 압타머 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 정상화 및 감산화 단계는,
    (a) 상기 분석시료에 결합하는 상기 압타머 라이브러리로부터 압타머테스터 를 제조하는 단계;
    (b) 상기 비교시료에 결합하는 상기 압타머 라이브러리로부터 압타머드라이버를 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 압타머테스터와 상기 압타머드라이버를 반응시켜 얻어지는 테스터/드라이버 이중가닥과 비-결합된 단일가닥의 상기 압타머드라이버를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 제거하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 압타머 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 출발올리고뉴클레오티드 라이브러리의 올리고뉴클레오티드는 PCR 반응에 의해 증폭 가능한 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 압타머 제조방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 압타머테스터의 제조는,
    상기 분석시료에 결합하는 상기 압타머 라이브러리를 구성하는 압타머들의 5' 말단에 있는 고정위치에 결합하는 염기서열에 부가적인 염기서열이 있는 프라이머와, 상기 분석시료에 결합하는 상기 압타머 라이브러리를 구성하는 압타머들의 3'말단에 있는 고정위치에 결합하는 프라이머로 압타머테스터1를 제조하는 단계; 및
    및 상기 분석시료에 결합하는 상기 압타머 라이브러리를 구성하는 압타머들의 5'말단에 있는 고정위치에 결합하는 프라이머와, 상기 분석시료에 결합하는 상기 압타머 라이브러리를 구성하는 압타머들의 3' 말단에 있는 고정위치에 결합하는 염기서열에 부가적인 염기서열이 있는 프라이머로 압타머테스터2를 제조하는 단계; 를포함하는 것을 특징으로 하는, 압타머 제조방법.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 압타머드라이버의 제조는, 상기 비교시료 결합의 상기 압타머 라이브러리를 구성하는 압타머들의 양단에 있는 고정위치에 각각 프라이머를 결합하고 PCR 하여 제조하는 것을 특징으로 하는, 압타머 제조방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 압타머테스터와 상기 압타머드라이버의 반응은, 2회의 용액 혼성화로 실행하는 것을 특징으로 하는 압타머 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 압타머테스터는 2개의 상기 압타머테스터 혼성화 용액을 제조하고, 각각의 상기 압타머테스터 혼성화 용액에 상기 압타머드라이버 혼성화 용액을 혼합하여 1차 혼성화를 실행하는 것을 특징으로 하는, 압타머 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 미네랄 오일이 포함된 상기 압타머드라이버 혼성화 용액을 DNA의 이중가닥 분리 온도로 가열한 후, 1차 혼성화한 2개의 상기 압타머테스터 혼성화 용액 중에 하나를 상기 압타머드라이버 혼성화 용액에 첨가하고, 이어서 나머지 하나의 1차 혼성화한 상기 압타머테스터 혼성화 용액을 첨가하여 2차 혼성화를 실행하는 것을 특징으로 하는, 압타머 제조방법
  9. 제8항에 있어서, 상기 2차 혼성화가 종료된 후에, 형성된 코헨시브(cohensive) 말단인 이중가닥 DNA의 양쪽 말단을 블런트(blunt) 말단으로 전환시켜 네스트(nest) PCR을 할 수 있는 DNA를 제조하는 것을 특징으로 하는, 압타머 제 조방법.
  10. 제9항에 있어서, 제조된 상기 DNA는 RNA 중합효소 결합위치 및 제한효소 인식부위가 있는 DNA인 것을 특징으로 하는, 압타머 제조방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 정상화 단계는,
    (a) 상기 압타머 라이브러리를 이용하여 이중가닥 압타머 DNA를 제조하는 단계; (b) 상기 이중가닥 압타머 DNA을 용액혼성화 하는 단계; (c) 효소를 이용하여 상기 이중가닥 압타머 DNA를 제거하는 단계; 및 (d) 남아있는 단일가닥 압타머 DNA를 증폭하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 압타머 제조방법
  12. 제1항에 있어서, 상기 감산화 단계는,
    (a) 상기 분석시료에 결합하는 상기 압타머 라이브러리로부터 단일가닥 압타머테스터 를 제조하는 단계; (b) 상기 반응시료에 결합하는 상기 압타머 라이브러리로부터 압타머드라이버 DNA를 제조하는 단계; (c) 상기 압타머테스터와 상기 압타머드라이버를 반응시켜 얻어지는 테스터/드라이버 이중가닥 및 비-결합된 단일가닥의 상기 압타머드라이버를 효소를 이용하여 제거하고, 남아있는 상기 단일가닥 압타머테스터를 증폭하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 압타머 제조방법
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