PT2256134E - Fragmento fc de igg para um veículo de fármaco e método para a preparação do mesmo - Google Patents

Fragmento fc de igg para um veículo de fármaco e método para a preparação do mesmo Download PDF

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PT2256134E
PT2256134E PT100091297T PT10009129T PT2256134E PT 2256134 E PT2256134 E PT 2256134E PT 100091297 T PT100091297 T PT 100091297T PT 10009129 T PT10009129 T PT 10009129T PT 2256134 E PT2256134 E PT 2256134E
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fragment
cys
gly
protein
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Se Chang Kwon
Gwan Sun Lee
Sung Youb Jung
Jin Sun Kim
Geun Hee Yang
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Hanmi Science Co Ltd
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Description

1
DESCRIÇÃO "FRAGMENTO FC DE IGG PARA UM VEÍCULO DE FÁRMACO E MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DO MESMO"
Campo técnico A presente invenção refere-se a um fragmento Fc de IgG útil como um veiculo de fármaco polipeptideo, e mais particularmente, a fragmentos Fc de IgG2 e Fc de IgG4, combinações e híbridos dos mesmos.
Arte antecedente
No passado, um grande número de farmacologistas e químicos fez esforços para alterar quimicamente e/ou modificar a atividade in vivo de moléculas fisiologicamente ativas existentes naturalmente. Estes esforços centraram-se principalmente no aumento ou prolongamento de certa atividade in vivo, na redução da toxicidade, na eliminação ou redução de efeitos secundários ou na modificação de atividades fisiológicas específicas das substâncias fisiologicamente ativas. Quando uma substância fisiologicamente ativa é modificada quimicamente, ela perde algumas ou a maioria das suas atividades fisiológicas em muitos casos. No entanto, em alguns casos, a modificação poderia resultar num aumento ou alteração na atividade fisiológica. A este respeito, muitos estudos têm-se centrado na modificação química capaz de atingir a atividade fisiológica desejada e a maioria desses estudos envolveram a ligação covalente de uma substância fisiologicamente ativa (fármaco) a um veículo fisiologicamente aceitável.
Por exemplo, a Publicação da patente internacional N.° WO 01/93911 emprega um polímero com uma pluralidade de frações ácidas como um veículo de fármaco. A Publicação da patente internacional N.° WO 03/00778 revela um grupo aniónico que contém copolímeros em bloco anfifílicos que, 2 quando utilizados como um veiculo de fármaco para um fármaco catiónico, melhoram a estabilidade do fármaco. A Patente Europeia N.° 0 681 481 descreve um método de melhorar as propriedades de fármacos básicos utilizando ciclodextrina e ácidos como veículos. Por outro lado, os fármacos hidrofóbicos têm baixa estabilidade in vivo principalmente devido à sua baixa solubilidade aquosa. Para melhorar a baixa solubilidade aquosa dos fármacos hidrofóbicos, a Publicação da patente internacional N.° WO 04/064731 emprega um lípido como um veículo. No entanto, até à data, não foi reportada a utilização de um fragmento Fc de imunoglobulina como um veículo de fármaco.
Tipicamente, uma vez que os polipeptídeos são relativamente facilmente desnaturados devido à sua baixa estabilidade, degradados por enzimas proteolíticas no sangue e facilmente eliminados através do rim ou fígado, os medicamentos proteicos, incluindo polipeptídeos como componentes farmaceuticamente eficazes, precisam de ser administrados com frequência aos pacientes para manter as concentrações e títulos no sangue em niveis desejados. No entanto, esta administração frequente de medicamentos proteicos, especialmente através de injeção causa dor aos pacientes. Para resolver estes problemas, têm sido feitos múltiplos esforços para melhorar a estabilidade no soro de fármacos proteicos e para manter os fármacos no sangue em níveis elevados durante um período prolongado de tempo, maximizando, assim, a eficácia farmacêutica dos fármacos. Composições farmacêuticas com atividade prolongada precisam, portanto, de aumentar a estabilidade dos fármacos proteicos e manter os títulos em níveis suficientemente elevados sem despoletar respostas imunes nos pacientes.
Para estabilizar proteínas e prevenir a degradação enzimática e eliminação pelos rins, foi utilizado convencionalmente um polímero com elevada solubilidade, tal como polietilenoglicol (doravante, referido simplesmente 3 como "PEG"), para modificar quimicamente a superfície de um fármaco proteico. Ao ligar-se a regiões específicas ou variadas de uma proteína alvo, o PEG estabiliza a proteína e previne a hidrólise sem causar efeitos secundários sérios (Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139, 1991). No entanto, apesar da sua capacidade para potenciar a estabilidade da proteína, esta ligação do PEG tem problemas, tais como reduzir grandemente os títulos dos números de proteínas fisiologicamente "ativas". Além disso, o rendimento diminui com o aumento do peso molecular de PEG devido à reatividade reduzida com as proteínas.
Recentemente, foram sugeridos conjugados de polímero-fármaco proteico. Por exemplo, conforme descrito na Patente U.S. N.° 5 738 846, um conjugado pode ser preparado ligando um fármaco proteico idêntico a ambas as extremidades do PEG para melhorar a atividade do fármaco proteico. Além disso, conforme descrito na Publicação de patente internacional N.° WO 92/16221, dois fármacos proteicos diferentes podem ser ligados a ambas extremidades do PEG para providenciar um conjugado com duas atividades diferentes. Os métodos anteriores não foram, no entanto, muito bem sucedidos e suster a atividade dos fármacos proteicos.
Por outro lado, Kinstler et al. reportaram que uma proteína de fusão preparada pela ligação do fator estimulante de colónia de granulócitos (G-CSF) à albumina humana mostrou uma estabilidade melhorada (Kinstler et al., Pharmaceutical Research 12(12): 1883-1888, 1995). Nesta publicação, no entanto, uma vez que o fármaco modificado, com uma estrutura G-CSF-PEG-albumina, só mostrou um aumento de aproximadamente quatro vezes no tempo de residência no corpo e um ligeiro aumento da meia-vida no soro em comparação com a administração única do G-CSF nativo, não foi industrializado como uma formulação de longa ação eficaz para fármacos proteicos.
Um método alternativo para melhorar a estabilidade in 4 vivo de proteínas fisiologicamente ativas é ligando um gene de proteína fisiologicamente ativa a um gene gue codifica uma proteína com elevada estabilidade no soro por tecnologia de recombinação genética e cultivando as células transfetadas com o gene recombinante para produzir uma proteína de fusão. Por exemplo, uma proteína de fusão pode ser preparada conjugando albumina, uma proteína conhecida por ser a mais eficaz em potenciar a estabilidade proteica, ou o seu fragmento, uma proteína fisiologicamente ativa de interesse por recombinação genética (Publicação de patente internacional N.°s WO 93/15199 e WO 93/15200, Publicação de patente Europeia N.° 413 622) . Uma proteína de fusão de interferão-alfa e albumina, desenvolvida pela Human Genome Science Company e comercializada sob o nome ' Albuf eron™' , aumentou a meia-vida de 5 horas para 93 horas em macacos, mas sabia-se que era problemática porque diminuía a atividade in vivo para menos de 5% do interferão-alfa não modificado (Osborn et al., J. Phar. Exp. Ther. 303(2): 540-548, 2002). Não houve nenhum relatório de boa tecnologia que aumente tanto a duração da ação in vivo e a estabilidade dos fármacos proteicos, enquanto mantém a atividade fisiológica in vivo dos fármacos.
Por outro lado, as imunoglobulinas e os seus fragmentos foram empregues para aumentar a estabilidade dos fármacos proteicos. Por exemplo, a Patente U.S. N.° 5 045 312 revela um método de aumentar a atividade da hormona de crescimento comparada com uma hormona de crescimento não modificada conjugando a hormona de crescimento humana com albumina do soro ou imunoglobulina de rato utilizando um agente de reticulação. Além disso, foram feitas outras tentativas para fundir um fármaco proteico a um fragmento Fc de imunoglobulina. Por exemplo, o interferão (Publicação em aberto da Patente Coreana N.° 2003-9464) e recetor de interleucina-4, recetor de interleucina-7 ou recetor de eritropoietina (EPO) (Registo da Patente Coreana N.° 5 249572) foram expressos previamente em mamíferos numa forma fundida com um fragmento Fc de imunoglobulina. A Publicação de patente internacional N.° WO 01/03737 descreve uma proteína de fusão que compreende uma citocina ou fator de crescimento ligado a um fragmento Fc de imunoglobulina através de uma ligação peptídica. Além disso, a Patente U.S. N.° 5 116 964 revela proteínas fundidas com a extremidade amino ou carboxilo-terminal de um fragmento Fc de imunoglobulina por recombinação genética. A Patente U.S. N.° 5 349 053 revela uma proteína de fusão que compreende IL-2 fundida com um fragmento Fc de imunoglobulina através de uma ligação peptídica.
Outros exemplos de proteínas de fusão Fc preparadas por recombinação genética incluem uma proteína de fusão de interferão-beta, ou seu derivado, e um fragmento Fc de imunoglobulina (Publicação de patente internacional N.° WO 00/23472) e uma proteína de fusão de recetor de IL-5 e um fragmento Fc de imunoglobulina (Patente U.S. N.° 5,712,121). O documento WO 01/81415 revela polipeptídeos PTH terapêuticos ligados por um ligante peptídico (proteína de fusão) a um fragmento Fc e descreve também a utilização de ligantes de polímero não peptídico, tais como PEG para ligar um fragmento Fc a um fármaco. No entanto, técnicas para melhorar a duração da ação para fármacos polipeptídicos fisiologicamente ativos utilizando um fragmento Fc de imunoglobulina centram-se, maioritariamente, na utilização do fragmento Fc de imunoglobulina apenas como um parceiro de fusão e, até à data, a técnica de utilizar um fragmento Fc de imunoglobulina como um veículo não foi reportada. Técnicas que envolvem a modificação de resíduos de aminoácido de um fragmento Fc de imunoglobulina também são conhecidas. Por exemplo, a Patente U.S. N.° 5 605 690 revela uma proteína de fusão Fc TNFR-IgGl que é preparada por recombinação genética utilizando um fragmento Fc de 6
IgGl com alterações de aminoácidos na região de ligação do complemento ou na região de ligação do recetor.
No entanto, tais proteínas de fusão Fc produzidas por recombinação genética apresentam as seguintes desvantagens: a fusão proteica ocorre apenas numa região específica de um fragmento Fc de imunoglobulina, que está uma extremidade amino ou carboxilo-terminal; só formas homodiméricas e não monoméricas são produzidas e uma fusão poderia ocorrer apenas entre as proteínas glicosiladas ou entre as proteínas aglicosiladas e é impossível fazer uma proteína de fusão composta de uma proteína glicosilada e uma proteína aglicosilada. Além disso, uma nova sequência de aminoácidos criada pela fusão pode despoletar resposta imunes e uma região ligante pode tornar-se suscetível a degradação proteolítica.
Para resolver estes problemas, os inventores da presente applicação conduziram uma pesquisa e chegaram à conclusão que quando um fragmento Fc de IgG, mais particularmente um fragmento Fc de IgG4 ou de IgG2, é ligado a uma fármaco polipeptídico pode melhorar a duração in vivo do fármaco e minimizar a redução da atividade in vi vo.
Revelação da invenção É, assim, um objeto da presente invenção providenciar um fragmento G de imunoglobulina que é útil como um veículo polipeptídico de fármaco. É ainda outro objeto da presente invenção providenciar uma composição farmacêutica que compreende um fragmento G de imunoglobulina.
Breve descrição dos desenhos
Os objetos, caracteristicas e anteriores e outros e outras vantagens da presente invenção serão entendidos mais claramente da seguinte descrição detalhada tida em conjunto com os desenhos anexos, nos quais: A FIGURA 1 mostra os resultados de Western blotting de 7 fragmentos Fc de imunoglobulinas expressos em E. coli em condições não reduzidas;
As FIGURAS 2 e 3 mostram os resultados de SDS-PAGE dos fragmentos Fc de imunoglobulina em condições não reduzidas e reduzidas utilizando um gel de critério de 15% (Bio-Rad); A FIGURA 4 mostra os resultados de cromatografia de um fragmento Fc de imunoglobulina obtido por clivagem de uma imunoglobulina com papaína; A FIGURA 5 mostra os resultados de SDS-PAGE de um fragmento Fc de imunoglobulina purificado (M: marcador de tamanho molecular, via 1: IgG, via 2: Fc); A FIGURA 6 mostra os resultados de SDS-PAGE de conjugados IFNa-PEG-Fc (A) , 17Ser-G-CSF-PEG-Fc (B) e EPO-PEG-Fc (C) , que são geados por uma reação de união (M: marcador de tamanho molecular, via 1: Fc, via 2: proteína fisiologicamente ativa, via 3: conjugado proteína fisiologicamente ativa-PEG-Fc); A FIGURA 7 mostra os resultados de cromatografia por exclusão de tamanho de um conjugado IFNa-PEG-F c que é purificado depois de uma reação de união; A FIGURA 8 mostra os resultados de espectrometria de massa MALDI-TOF de um conjugado EPO-PEG-Fc;
As FIGURAS 9a e 9b mostram os resultados de espectrometria de massa MALDI-TOF e análise SDS-PAGE, respetivamente, de um Fc de imunoglobulina nativa e um Fc de imunoglobulina desglicosilado (Fc DG) ; A FIGURA 10 mostra os resultados de espectrometria de massa MALDI-TOF de um conjugado IFNa-PEG-Fc e de um conjugado IFNa-PEG-DG Fc;
As FIGURAS 11a a 11c mostram os resultados de HPLC de fase reversa de conjugados derivados de IFNa-PEG-Fc, IFNa-PEG-DG Fc e IFNa-PEG-Fc AG recombinante; A FIGURA 12 é um gráfico que mostra os resultados da análise farmacocinética de uma IFNa nativa, um complexo IFNa-40K PEG, um conjugado IFNa-PEG-albumina e um conjugado IFNa-PEG-Fc; A FIGURA 13 é um gráfico que mostra os resultados da análise farmacocinética de um EPO nativa, um EPO altamente glicosilado, um conjugado EPO-PEG-Fc e um conjugado EPO-PEG-Fc AG; A FIGURA 14 é um gráfico que mostra os resultados da análise farmacocinética de conjugados IFNa-PEG-Fc, IFNa-PEG-DG Fc e IFNa-PEG-Fc AG recombinante; A FIGURA 15 é um gráfico que mostra a farmacocinética de um Fab', de um complexo Fab'-S-40K PEG, um conjugado Fab'-N-PEG-N-Fc e um conjugado Fab'-S-PEG-N-Fc; A FIGURA 16 é um gráfico que mostra as atividades in vivo de Fab', um compelxo Fab'-S-40K PEG, um conjugado Fab'-N-PEG-N-Fc e um conjugado Fab'-S-PEG-N-Fc; A FIGURA 17 é um gráfico que mostra os resultados da comparação de subclasses de IgG humana para afinidade de ligação ao complemento Clq; e A FIGURA 18 é um gráfico que mostra os resultados da comparação de um Fc glicosilado, um Fc DG enzimaticamente desglicosilado e um conjugado interferão-PEG-veículo onde o veículo é Fc AG produzido por E. coli para afinidade de ligação ao complemento Clq.
Melhor forma de realizar a invenção
Num aspeto, a presente invenção refere-se à utilização de um fragmento Fc da imunoglobulina G útil como um veículo polipeptídico de fármaco e mais preferencialmente fragmentos Fc de IgG2 e de IgG4. 0 termo "veiculo", conforme utilizado aqui, refere-se a uma substância ligada a um fármaco, que tipicamente aumenta, diminui ou elimina a atividade fisiológica do fármaco por ligação ao fármaco. No entanto, em relação aos objetos da presente invenção, um veículo é empregue na presente invenção para minimizar uma diminuição na atividade fisiológica de um fármaco de interesse, ligado ao veículo, enquanto aumenta a estabilidade in vivo do 9 fármaco.
Um grande número de substâncias, tais como lípidos e polímeros, foi estudado para determinar a sua adequadibilidade como veículo de fármacos. No entanto, técnicas que empregam o fragmento Fc de imunoglobulina como um veículo de fármaco são desconhecidas. Ou seja, a presente invenção caracteriza-se por providenciar particularmente um fragmento Fc de IgG entre várias substâncias disponíveis como veículos para melhorar a duração da ação in vivo de um fármaco ao qual o veículo é conjugado e minimizar uma diminuição na atividade in vivo do fármaco e, mais preferencialmente, e fragmentos Fc de IgG4 e de IgG2. 0 termo "imunoglobulina G (doravante, utilizado alternadamente com "IgG")", conforme utilizado aqui, significa, coletivamente, proteínas que participam na imunidade protetora do corpo atuando seletivamente contra antígenos e podem ser derivadas de humanos e animais. As imunoglobulinas apresentam a seguinte estrutura geral. As imunoglobulinas são compostas por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas. As cadeias leve e pesada compreendem regiões constant e variável. Existem cinco tipos diferentes de cadeias pesadas com base nas diferenças nas sequências de aminoácidos das suas regiões constantes: gama (y), mu (μ), alfa (a), delta (δ) e epsilon (ε) , e as cadeias pesadas incluem as seguintes subclasses: gama 1 (vl), gama 2 (y2), gama 3 (y3), gama 4 (y4), alfa 1 (ai) e alfa 2 (oí2) . Além disso, existem dois tipos diferentes de cadeias leves com base nas diferenças nas sequências de aminoácidos das suas regiões constantes: tipos kapa (k) e lambda (λ) (Coleman et al., Fundamental Immunology, 2a edição, 1989, 55-73) . De acordo com as características das regiões constantes das cadeias pesadas, as imunoglobulinas são classificadas em cinco isotipos: IgG, IgA, IgD, IgE e IgM. A IgG é dividida nas subclasses 10
IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4.
Além disso, as imunoglobulinas são conhecidas por gerar vários fragmentos estruturalmente diferentes, gue incluem Fab, F (ab'), F (ab') 2, Fv, scFv, Fd e Fc. Entre os fragmentos de imunoglobulina, o Fab contém as regiões variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada, a região constante da cadeia leve e a primeira região constante (CH1) da cadeia pesada e tem um único local de ligação ao antigeno. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab em termos de apresentarem a região dobradiça contendo um ou mais resíduos de cisteína no terminal C (terminal carboxilo) do domínio CH1 da cadeia pesada. Os fragmentos F (ab')2 são produzidos como um par dos fragmentos Fab' por ligação dissulfido formado entre os resíduos de cisteína das regiões dobradiça dos fragmentos Fab'. Fv é o fragmento de anticorpo mínimo que contém apenas a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve. Os fragmentos scFv (Fv de cadeia única) compreendem a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve que estão ligadas uma à outra por um ligante peptídico e estão, assim, presentes numa cadeia polipeptídica única. Os fragmentos Fd compreendem apenas a região variável e domínio CH1 da cadeia pesada.
Entre os vários tipos conhecidos de imunoglobulinas e dos seus fragmentos funcionais e estruturais, conforme descrito anteriormente, a presente invenção caracteriza-se por providenciar um fragmento Fc de IgG útil como um veiculo de fármaco e, mais preferencialmente, fragmento Fc de IgG4 e de IgG2. O termo "fragmento Fc da imunoglobulina G (doravante, utilizado alternadamente com "fragmento Fc de IgG" ou "fragmento Fc da presente invenção")", conforme utilizado aqui, refere-se a uma proteína que contém a região constante da cadeia pesada 2 (CH2) e a região constante da cadeia pesada 3 (Ch3) de uma imunoglobulina G e não as 11 regiões variáveis das cadeias leve e pesada, a região constante da cadeia pesada 1 (CH1) e a região constante da cadeia leve 1 (CL1) da imunoglobulina G. Pode, ainda, incluir a região dobradiça na região constante da cadeia pesada. Além disso, o fragmento Fc de IgG da presente invenção pode conter uma porção ou todo a região constante da cadeia pesada 1 (CH1) e/ou a região constante da cadeia leve 1 (CL1), exceto para as regiões variáveis das cadeias leve e pesada. Além disso, desde que tenha uma função fisiológica substancialmente semelhante à, ou melhor que a, proteína nativa, o fragmento Fc de IgG pode ser um fragmento com uma deleção numa porção relativmente longa das sequências de aminoácidos de CH2 e/ou CH3. 0 fragmento Fc da presente invenção inclui sequências de aminoácidos nativas e derivados de sequências das mesmas (mutantes). Um derivado da sequência de aminoácidos é uma sequência que é diferente da sequência de aminoácidos nativa devido a uma deleção, uma inserção, uma substituição não conservadora ou conservadora ou combinações das mesmas de um ou mais resíduos de aminoácido. Por exemplo, num Fc de IgG, resíduos de aminoácido conhecidos por serem importantes na ligação, nas posições 214 a 238, 297 a 299, 318 a 322 ou 327 a 331, podem ser utilizados como um alvo adequado para modificação. Além disso, outros vários derivados são possíveis, incluindo um no qual uma região capaz de formar uma ligação dissulfido é apagado ou certos resíduos de aminoácido são eliminados na extremidade N-terminal da forma Fc nativa ou um resíduo de metionina é adicionado ao mesmo. Além disso, para remover as funções efetoras, pode ocorrer uma deleção no local de ligação ao complemento, tal como um local de ligação ao Clq e um local ADCC. Técnicas para preparar tais derivados de sequências do fragmento Fc de imunoglobulina são reveladas na Publicação de patente internacional N.°s WO 97/34631 e WO 96/32478 . 12
As alterações de aminoácidos em proteínas e péptidos, que não alteram geralmente a atividade das proteínas ou péptidos são conhecidos na arte (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque, 1979) . As alterações que ocorrem mais vulgarmente são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly, em ambas as direções.
Além disso, o fragmento Fc, se desejado, pode ser modificado por fosforilação, sulfação, acrilação, glicosilação, metilação, farnesilação, acetilação, amidação e afins.
Os derivados de Fc mencionados anteriormente são derivados que têm uma atividade biológica idêntica à do fragmento Fc da presente invenção ou estabilidade estrutural melhorada, por exemplo, contra o calor, pH ou afins.
Além disso, estes fragmentos Fc podem ser obtidos de formas nativas isoladas de humanos e de outros animais, incluindo vacas, cabras, porcos, ratinhos, coelhos, hamsters, ratos e cobaias, ou podem ser recombinantes ou derivados das mesmas, obtidos a partir de células animais transformadas ou microorganismos. Aqui, eles podem ser obtidos a partir de uma imunoglobulina nativa isolando imunoglobulinas completas de organismos humanos ou animais e tratando-os com uma enzima proteolítica. A papaína digere a imunoglobulina nativa em fragmentos Fab e Fc e o tratamento com pepsina resulta na podução de fragmentos pF'c e F (ab') 2. Estes fragmentos podem ser sujeitos, por exemplo, a cromatografia por exclusão de tamanho para isolar Fc ou pF'c. Preferencialmente, um fragmento Fc derivado de humano é um fragmento Fc de IgG recombinante que é obtido de um microorganismo. Ou seja, são preferidos fragmentos Fc IgG2 e de IgG4 recombinantes derivados de humanos obtidos de um microorganismo. 13
Além disso, o fragmento Fc da presente invenção pode estar na forma de ter cadeias de açúcar nativas, cadeias de açúcar aumentadas comparadas com uma forma nativa ou cadeias de açúcar diminuídas comparadas com a forma nativa, ou podem estar numa forma desglicosilada. 0 aumento, diminuição ou remoção de cadeias de açúcar do fragmento Fc pode ser conseguido por métodos comuns na arte, tais como um método químico, um método enzimático e um método de engenharia genética utilizando um microorganismo. A remoção de cadeias de açúcar de um fragmento Fc resulta num declínio abrupto da afinidade de ligação à parte Clq do primeiro componente do complemento Cl e a uma diminuição ou perda de citotoxicidade mediada pela célula dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC), não induzindo, assim, respostas imunes in vivo desnecessárias. A este respeito, um fragmento Fc de imunoglobulina numa forma desglicosilada ou aglicosilada pode ser mais adequado para o objeto da presente invenção como um veículo de fármaco.
Conforme aparente na FIGURA 18, um Fc glicosilado tem uma atividade CDC mais forte do que um Fc aglicosilado e, portanto, tem um elevado risco de induzir respostas imunes. Assim, com os objetos da presente invenção, é preferido um fragmento Fc desglicosilado ou aglicosilado. Mais preferido são fragmentos Fc de IgG2 e de IgG4 aglicosilados, combinações e híbridos dos mesmos.
Conforme utilizado aqui, o termo "desglicosilação" refere-se a que frações de açúcar são removidas enzimaticamente de um fragmento Fc e o termo "aglicosilação" significa que um fragmento Fc é produzido numa forma não glicosilada por um procarionte, preferencialmente E. coli.
Por outro lado, o termo "combinação", conforme utilizado aqui, significa que polipeptídeos que codificam fragmentos Fc de imunoglobulinas de cadeia simples da mesma 14 origem estão ligados a um polipeptídeo de cadeia simples de uma origem diferente para formar um dimero ou multimero. Ou seja, um dimero ou multimero podem ser formados a partir de dois ou mais fragmentos seleccionados do grupo gue consiste nos fragmentos Fc de IgGl, Fc de IgG2, Fc de IgG3 e Fc de IgG4. 0 termo "híbrido", conforme utilizado aqui, significa que as sequências que codificam dois ou mais fragmentod Fc de imunoglobulina de origem diferente estão presentes num fragmento Fc de imunoglobulina de cadeia simples. Na presente invenção, são possíveis vários tipos de híbridos. Ou seja, híbridos domínios podem ser compostos por um a quatro domínios selecionados do grupo que consiste em CHI, CH2, CH3 e CH4 de Fc de IgGl, Fc de IgG2, Fc de IgG3 e Fc de IgG4, e pode incluir a região dobradiça.
Por outro lado, conforme mostrado nos desenhos em anexo à presente invenção, as FIGURAS 17 e 18, entre as várias subclasses de IgG, IgG4 tem a afinidade de ligação mais baixa ao complemento Clq. A diminuição na afinidade de ligação ao complemento resulta numa diminuição de, ou remoção, citotoxicidade mediada pela célula dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e, portanto, respostas imunes desnecessárias não são induzidas in vivo. Fragmentos Fc de IgG2 e de IgG4 têm uma afinidade de ligação ao Clq mais fraca do que a IgGl e o fragmento Fc de IgG4 tem a atividade mais fraca. Assim, uma vez que, para ser utilizado como um veículo de fármaco, o fragmento Fc ligado a um fármaco tem, preferencialmente, atividades de função efetora mais fracas, tais como ADCC e CDC, em relação aos objetos da presente invenção, são preferidos os fragmentos Fc de IgG2 e Fc de IgG4, mais preferido é o fragmento Fc de IgG4 e mais preferido são os fragmentos Fc com sequências de aminoácidos de SEQ. ID N.°s 8, 10 e 23. A presente invenção descreve um gene que codifica um 15 fragmento Fc de IgG, preferencialmente genes que codificam fragmentos Fc de IgG2 e Fc de IgG4, e mais preferencialmente, genes que codificam as sequências de aminoácidos de SEQ. ID N.°s 8, 10 e 23. Tal gene que codifica o Fc da presente invenção inclui uma sequência nucleotidica nativa e derivados de sequência da mesma. Um derivado da sequência nucleotidica significa ter uma sequência diferente por uma deleção, uma inserção, uma substituição conservadora ou não conservadora num ou mais resíduos nucleotídicos de uma sequência nucleotidica nativa ou combinações da mesma.
Na presente invenção, um gene que codifica um fragmento Fc com sequência de aminoácidos de SEQ. ID N.° 8 é preferencialmente um gene com a sequência nucleotidica de SEQ. ID N.° 4. Um gene que codifica um fragmento Fc com a sequência de aminoácidos de SEQ. ID N.° 10 é preferencialmente um gene com a sequência nucleotidica de SEQ. ID N.° 9. Um gene que codifica um fragmento Fc com a sequência de aminoácidos de SEQ. ID N.° 23 é preferencialmente um gene com a sequência nucleotidica de SEQ. ID N.° 22. As sequências nucleotídicas que codificam os fragmentos Fc da presente invenção podem ser alteradas por uma substituição, uma deleção ou uma inserção de uma ou mais bases ou combinações das mesmas. As sequências nucleotídicas podem ser naturalmente isoladas ou sintetizadas artificialmente ou podem ser preparadas por um método de recombinação genética.
As sequências nucleotídicas que codificam os fragmentos Fc da presente invenção são providenciadas por vetores que as expressam. A presente invenção descreve um vetor recombinante que compreende um fragmento Fc de IgG. O termo "vetor", conforme utilizado aqui, significa um veículo para introduzir uma molécula de ADN numa célula hospedeira para expressar um anticorpo ou um fragmento de 16 anticorpo. 0 vetor útil na presente invenção inclui vetores plasmídeos, vetores cosmideos, vetores bacteriófagos e vetores virais, tais como vetores adenovirus, vetores retrovirus e vetores associados a adenovirus. 0 vetor plasmideio é preferido. Em relação aos objetos da presente invenção, um vetor de expressão pode incluir elementos reguladores da expressão, tais como um promotor, um codão de iniciação, um codão de terminação, um sinal de poliadenilação e um potenciador e uma sequência sinal para alvo à membrana ou secreção. 0 termo "sequência sinal", conforme utilizado aqui, refere-se a uma sequência de aminoácidos especifica que permite o transporte e secreção de uma proteína para o exterior do citosol. Vários tipos destas sequências sinais são conhecidos na arte, mas, uma vez que a presente invenção utiliza, preferencialmente, E. coli como uma célula hospedeira, a sequência sinal da presente invenção é preferencialmente uma sequência sinal derivada de E. coli, que uma proteína secretora da E. coli possui. Exemplos de sequências sinais derivadas de E. coli incluem fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp, enterotoxina II termoestável, LamB, PhoE, PelB, OmpA e proteína de ligação à maltose. A mais preferida é a enterotoxina II termoestável.
Por outro lado, os codões de iniciação e de terminação são geralmente considerados uma porção de uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína alvo imunogénica, precisam de ser funcionais num indivíduo a quem foi administrada uma construção genética e têm de estar enquadrados com a sequência codificante. Os promotores podem ser geralmente constitutivos ou induzíveis. Exemplos não limitantes de promotores disponíveis em células procariontes incluem promotores lac, tac, T3 e T7. Exemplos não limitantes de promotores disponíveis em células eucariontes incluem promotor de vírus 40 de símio (SV40), promotor de vírus de tumor mamário de ratinho (MMTV), 17 promotor de vírus da imunodeficiência humana (HIV), tal como o promotor da repetição de terminal longo do VIH (LTR), promotor do vírus da leucemia murina, promotor do citomegalovírus (CMV), promotor do vírus epstein barr (EBV), promotor do vírus do sarcoma de Rous (RSV), bem como promotores de genes humanos, tais como β-actina humana, hemoglobina humana, creatina do músculo humana e metalotioneína humana. Além disso, vetores de expressão incluem um marcador selecionável que permite a seleção de células hospedeiras que contêm o vetor e vetores de expressão replicáveis incluem uma origem de replicação. Os genes que codificam produtos que conferem resistência a antibióticos ou fármacos são utilizados como marcadores selecionáveis gerais. 0 gene da β-latamase (resistência à ampicilina) e gene Tet (resistência à tetraciclina) podem ser utilizados em células procariontes e genes resistentes à neomicina (G418 ou Geneticina), gpt (ácido micofenólico), ampicialina e higromicina podem ser utilizados em células eucariontes. 0 gene marcador da dihidrofolato redutase pode ser selecionado por metotrexato numa variedade de hospedeiros. Os genes que codificam produtos de genes de marcadores auxotróficos de hospedeiros, por exemplo, LEU2, URA3 e HIS3, são utilizados com frequência como marcadores selecionáveis em leveduras. Além disso, estão disponíveis vetores de vírus (por exemplo, vaculovírus) ou de fagos e vetores que são capazes de integrar no genoma de células hospedeiras, tais como vetores de retrovírus.
Para preparar um fragmento Fc de IgG que coincide com os objetos da presente invenção, foi utilizado um vetor que transporta um gene que codifica as sequências de aminoácidos de SEQ. ID N.°s 8, 10 ou 23. Na presente invenção, utilizando pT14SlSH-4T20V22Q (Patente Coreana N.° 38061) como um vetor de partida, os dois vetores seguintes são construídos: pSTIIdCG2Fc que transporta um gene designado como SEQ. ID N.° 22 que codifica a sequência de 18 aminoácidos de SEQ. ID N.° 23 e pSTIIdCG4Fc que transporta um gene designado como SEQ. ID N.° 4 que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ. ID N.° 8. Além disso, realizando PCR utilizando o plasmideo pSTIIdCG4Fc, é obtido um gene designado como SEQ. ID N.° 9 que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ. ID N.° 10, tendo o gene uma deleção na região dobradiça necessária para a formação de dimero a partir de um gene amplificado por PCR e um vetor pSTIIG4Mo que transporta o gene é depois construído. A presente invenção descreve um transformante transformado com o vetor recombinante.
Uma vez que os níveis de expressão e modificação das proteínas variam dependendo das células hospedeiras, a célula hospedeira mais adequada pode ser selecionada de acordo com o uso pretendido. Células hospedeiras disponíveis incluem, mas não se limitam a, células procariontes tais como Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Pseudomonas, Proteus mirabilis ou Staphylococcus. Além disso, úteis como células hospedeiras são células eucariontes inferiores tais como fungos (por exemplo, Aspergillus) e leveduras (por exemplo, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces, Neurospora crassa), células de insetos, células de plantas e células derivadas de eucariontes superiores, incluindo mamíferos. No entanto, uma vez que o fragmento Fc de imunoglobulina está vantajosamente numa forma aglicosilada em relação aos objetos da presente invenção, as células hospedeiras procariontes são preferidas e, em particular, E. coli é mais preferida.
Na presente invenção, "transformação" e/ou "transfeção" em células hospedeiras inclui quaisquer métodos pelos quais os ácidos nucleicos podem ser introduzidos em organismos, células, tecidos ou orgãos e, conforme conhecido na arte, podem ser realizados selecionando técnicas convencionais adequadas de acordo com 19 as células hospedeiras. Estes métodos incluem, mas não se limitam a, eletroporação, fusão de protoplasta, precipitação com fosfato de cálcio (CaP04) , precipitação com cloreto de cálcio (CaCl2) e agitação com fibra de carbido de silicone, transformação mediada por Agrobacterium e transformação mediada por inibição/disseção, PEG, sulfato de dextrano e lipofetamina. Por exemplo, o tratamento com cálcio utilizado cloreto de cálcio ou eletroporação é geralmente utilizado em células procariontes (Sambrook et ai., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nova Iorque: Cold Spring Harbor Laboratory Press)). A transfeção utilizando Agrobacterium tumefaciens é utilizada para transformação de células de plantas específicas (Shaw et al., 1983, Gene, 23:315; Publicação de patente internacional N.° WO 89/05859) . Para células de mamíferos sem paredes celulares, pode ser utilizada precipitação com fosfato de cálcio (Graham et al, 1978, Virology, 52:456-457). Os métodos e características gerais de transformação em células hospedeiras de mamíferos são descritos na Patente U.S. N.° 4 399 216. A transformação em leveduras é realizada tipicamente de acordo com os métodos descritos por Van Solingen et al., J. Bact., 1977, 130:946, e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 1979, 76:3829.
Os vetores de expressão de acordo com a presente invenção são transformados em células hospedeiras e os transformantes resultantes da presente invenção são designados como HM10932 (transformante introduzido por pSTIIdCG4Fc), HM10933 (transformante introduzido por pSTIIG4Mo) e HM10936 (transformante introduzido por pSTIIdCG2Fc). A presente invenção descreve um método de preparar um fragmento de imunoglobulina que compreende cultivar um transformante transformado com um vetor capaz de expressar um fragmento Fc de IgG, e preferencialmente fragmento Fc de 20
IgG2 ou fragmento Fc de IgG4, ou uma combinação dos mesmos ou um híbrido dos mesmos em condições adequadas.
No método de preparar o fragmento de imunoglobulina, o cultivo do tranformante pode ser realizado utilizando meios adequados em condições de cultivo adequadas, que são conhecidas na arte. Este processo de cultivo pode ser facilmente ajustado de acordo com estirpes selecionadas por aqueles habilitados na arte. 0 fragmento de imunoglobulina da presente invenção, obtido cultivando o transformante, pode ser utilizado numa forma não purificada ou pode ser utilizado depois de ser purificado com purezas elevadas utilizando vários métodos gerais, por exemplo, diálise, precipitação de sal e cromatografia. Entre eles, a cromatografia é o mais vulgarmente utilizado. Uma vez que nenhuma regra é aplicável a nenhum caso na seleção do tipo e sequência de colunas utilizadas, a cromatografia pode ser selecionada de acordo com as propriedades e método de cultivo de proteínas alvo de anticorpos, por exemplo, de cromatografia de intercâmbio de iões, cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia por afinidade e cromatografia de coluna por afinidade pela proteína A. Em modalidades preferidas da presente invenção, o fragmento da imunoglobulina é purificado utilizando uma coluna por afinidade pela proteína A, uma coluna FF de sefarose SP e afins.
Quando o fragmento Fc assim obtido está na forma livre, pode ser convertido numa forma de sal por um método conhecido por si ou por um método modificado. Por oposição, quando é obtido na forma de um sal, o sal pode ser convertido na forma livre ou noutro sal por um método conhecido por si ou por um método modificado. Além disso, o fragmento Fc, conforme produzido por um transformante, pode ser tratado antes ou depois de purificação com uma enzima modificadora de proteínas apropriada para modificação arbitrária ou remoção parcial de polipeptídeo. Exemplos de 21 enzimas modificadoras de proteínas úteis na presente invenção incluem tripsina, quimiotripsina, arginina endopeptidase, quinase proteica e glicosidase. 0 fragmento Fc da presente invenção, preparado conforme descrito anteriormente, atua como um veículo de fármaco e forma um conjugado com um fármaco. 0 termo "conjugado fármaco" ou "conjugado", conforme utilizado aqui, significa que um ou mais fármacos estão ligados com um ou mais fragmentos Fc de imunoglobulina. 0 termo "fármaco", conforme utilizado aqui, refere-se a uma substância polipeptídica que exibe atividade terapêutica quando administrada a humanos ou animais.
Os termos "polipeptídeo fisiologicamente ativo", "proteína fisiologicamente ativa", "polipeptídeo ativo" "fármaco polipeptídico" e "fármaco proteico", conforme utilizados aqui, são intercambiáveis nos seus significados e caracterizam-se por estarem numa forma fisiologicamente ativa que exibe várias funções fisiológicas in vivo. 0 fármaco polipeptídico tem a desvantagem de ser incapaz de suster uma ação fisiológica durante um período de tempo longo devido à sua propriedade de ser facilmente desnaturado ou degradado por enzimas proteolíticas presentes no corpo. No entanto, quando o fármaco polipeptídico é conjugado com o fragmento Fc de imunoglobulina da presente invenção para formar um conjugado, o fármaco aumentou a estabilidade estrutural e a meia-vida de degradação. Além disso, o polipeptídeo conjugado com o fragmento Fc tem uma diminuição muito inferior na atividade fisiológica do que qualquer outras formulações de fármaco polipeptídico conhecidas. Por isso, comparado com a biodisponibilidade in vivo de fármacos polipeptídicos convencionais, o conjugado do polipeptídeo e o fragmento Fc, de acordo com a presente invenção, caracteriza-se por ter uma biodisponibilidade in vivo marcadamente superior. Isto é também claramente descrito 22 pelas modalidades da presente invenção. Ou seja, quando ligado ao fragmento Fc da presente invenção, IFNa, G-CSF, hGH e outros fármacos proteicos exibiram um aumento de cerca de duas a seis vezes na biodisponibilidade in vivo quando comparados com as suas formas convencionais conjugadas com PEG isolado ou ambos PEG e albumina (Quadros 8, 9 e 10) .
Por outro lado, a ligação de uma proteína e o fragmento Fc da presente invenção caracteriza-se por não ser uma fusão por um método de recombinação convencional. Uma forma de fusão do fragmento Fc de imunoglobulina e um polipeptídeo ativo utilizado como um fármaco por um método de recombinação é obtida de tal forma que o polipeptídeo é ligado ao N-terminal ou C-terminal do fragmento Fc e é, assim, expresso e dobrado como um único polipeptídeo de uma sequência nucleotídica que codifica a forma de fusão.
Isto origina um declínio abrupto na atividade da proteína de fusão resultante, porque a atividade de uma proteína como uma substância fisiologicamente funcional é determinada pela conformação da proteína. Assim, quando um fármaco polipeptídico é fundido com Fc por um método de recombinação, não há efeito em relação à biodisponibilidade in vivo mesmo quando a proteína de fusão tem uma estabilidade estrutural aumentada. Além disso, uma vez que tal proteína de fusão está, com frequência, mal dobrada e é, assim, expressa como corpos de inclusão, o método de fusão não é económico na produção de proteínas e no rendimento de isolamento. Além disso, quando a forma ativa de um polipeptídeo está numa forma glicosilada, o polipeptídeo deveria ser expresso em células eucariontes. Neste caso, o Fc também é glicosilado e esta glicosilação pode causar respostas imunes in vivo inadequadas.
Ou seja, apenas a presente invenção torna possível a produção de um conjugado de um polipeptídeo ativo glicosilado e de um fragmento Fc de imunoglobulina 23 aglicosilado e supera todos os problemas mencionados anteriormente, incluindo melhorar o rendimento da produção de proteínas, porque os dois componentes do complexo são preparados individualmente e isolados pelos melhores sistemas.
Exemplos não limitantes de fármaco proteicos capazes de serem conjugados com o fragmento Fc de imunoglobulina da presente invenção incluem hormona do crescimento humana, hormona libertadora da hormona do crescimento, péptido libertador da hormona do crescimento, interferões e recetores de interferão (por exemplo, interferão-α, -β e -Y, recetor de interferão tipo I solúvel em água, etc.), fator estimulante de colónia de granulócitos (G-CSF), fator estimulante de colónia de macrófagos-granulócitos (GM-CSF), péptidos tipo glucagon (por exemplo, GLP-1, etc.), recetor unido à proteína G, interleucinas (por exemplo, recetor de IL-1, recetor de IL-4, etc.), enzimas (por exemplo, glucocerebrosidase, iduronato-2-sulfatase, alfa-galactosidase-A, agalsidase alfa e beta, alfa-L-iduroni-dase, butirilcolinesterase, quitinase, glutamato decarboxilase, imiglucerase, lipase, uricase, acetilhidrolase do fator ativador de plaquetas, endopeptidase neutral, mieloperoxidase, etc.), proteínas de ligação da interleucina e citocina (por exemplo, IL-18bp, proteína de ligação do TNF, etc.), fator de ativação de macrófagos, peptide de macrófagos, fator de célula B, fator de célula T, proteína A, inibidor de alergia, glicoproteinas de necrose celular, imunotoxina, linfotoxina, fator de necrose tumoral, supressores tumorais, fator de crescimento de metástases, antitripsina alfa-1, albumina, alfa-lactalbumina, apolipoproteína-E, eritropoietina, eritropoietina altamente glicosilada, angiopoietinas, hemoglobina, trombina, péptido ativador do recetor da trombina, trombomodulina, fator VII, fator Vila, fator VIII, fator IX, fator XIII, fator ativador do 24 plasminogénio, péptido de ligação da fibrina, uroquinase, estreptoquinase, hirudina, proteína C, proteína reativa C, inibidor da renina, inibidor da colagenase, superóxido dismutase, leptina, fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de crescimento epitelial, fator de crescimento epidérmico, angiostatina, angiotensina, fator de crescimento ósseo, proteína estimulante óssea, calcitonina, insulina, atriopeptina, fator indutor da cartilagem, elcatonina, fator ativador do tecido conetivo, inibidor da via do fator do tecido, hormona estimuladora do folículo, hormona luteinizante, hormona libertadora da hormona luteinizante, fatores de crescimento de nervos (por exemplo, fator de crescimento do nervo, fator neurotrófico ciliar, fator-1 da axogénese, péptido natriurético do cérebro, fator neurotrófico derivado da glia, netrina, fator inibidor do neurófilo, fator neurotrófico, neuturina, etc.)/· hormona paratiróide, relaxina, secretina, somatomedina, fator de crescimento tipo insulina, hormona adrenocortical, glucagon, colecistoquinina, polipeptídeo pancreático, péptido libertador da gastrina, fator libertador da corticotropina, hormona estimuladora da tiróide, autotaxina, lactoferrina, miostatina, recetores (por exemplo, TNFR(P75), TNFR(P55), recetor de IL-1, recetor de VEGF, recetor do fator ativador das células B, etc.), antagonistas de recetor (por exemplo, ILl-Ra etc.), antígenos da superfície celular (por exemplo, CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69, etc.), anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpo (por exemplo, scFv, Fab, Fab' , F(ab')2 e Fd) , e antígenos de vacinas derivados de vírus. Um fragmento de anticorpo pode ser Fab, Fab', F (ab') 2, Fd ou scFv, que é capaz de se ligar a um antígeno específico e, preferencialmente, Fab'.
Em particular, preferido como polipeptídeos fisiologicamente ativos são aqueles que precisam de dosagem 25 frequente depois da administração ao corpo para terapêutica ou prevenção de doenças, que incluem hormona do crescimento humana, interferões (interferão-α, -β, -γ, etc.), fator estimulante de colónia de granulócitos, eritropoietina (EPO) e fragmentos de anticorpo. Além disso, certos derivados estão incluídos no âmbito dos polipeptídeos fisiologicamente ativos da presente invenção desde que tenham função, estrutura, atividade ou estabilidade substancialmente idêntica a, ou melhorada, comparada com as formas nativas dos polipeptídeos fisiologicamente ativos. Na presente invenção, o fármaco polipeptídico mais preferido é o interferão-alfa. 0 ligante é um ligante não peptídico. Este ligante é poli (etilenoglicol) (PEG) . 0 conjugado da presente invenção, fragmento Fc-fármaco ou fragmento Fc-ligante-fármaco, é feito a várias razões molares. Ou seja, o número do fragmento Fc e/ou ligante ligado a um único fármaco polipeptídico não é limitado. No entanto, preferencialmente, no conjugado fármaco da presente invenção, o fármaco e o fragmento Fc são conjugados um com o outro a uma razão molar de 1:1 a 10:1, e, preferencialmente, 1:1 a 2:1.
Além disso, o fragmento Fc da presente invenção, um ligante PEG e um certo fármaco podem ser ligados uns com os outros num certo local do fármaco. Por outro lado, o fragmento Fc da presente invenção e um fármaco polipeptídico podem ser ligados um com o outro num N-terminal ou C-terminal e, preferencialmente, num grupo livre e uma ligação covalente entre o fragmento Fc e o fármaco é facilmente formada especialmente numa extremidade amino terminal, um grupo amino do resíduo de lisina, um grupo amino do resíduo de histidina ou um resíduo de cisterna livre.
Por outro lado, a ligação do fragmento Fc da presente invenção, um ligante PEG e um certo fármaco podem ser 26 feitos numa determinada direção. Ou seja, o ligante pode ser ligado ao N-terminal, ao C-terminal ou a um grupo livre do fragmento Fc de imunoglobulina e também pode ser ligado ao N N-terminal, ao C-terminal ou a um grupo livre do fármaco proteico. Quando o ligante é um ligante peptídico, a ligação pode ocorrer num certo local de ligação.
Além disso, o conjugado da presente invenção pode ser preparado utilizando qualguer um de um número de agentes de união conhecidos na arte. Exemplos não limitantes dos agentes de união incluem 1,1-bis (diazoacetil)-2-feniletano, glutaradeido, ésteres N-hidroxissucinimida tais como ésteres com ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres incluindo ésteres dissucinimidilo tais como 3,3'-ditiobis (sucinimidilpropionato) e maleimidas bifuncionais tais como bis-N-maleimido-1,8-octano.
Por outro lado, o conjugado do novo fragmento Fc da presente invenção e um fármaco podem oferecer um número variado de composições farmacêuticas. 0 termo "administração", conforme utilizado aqui, significa introdução de uma quantidade pré-determinada de uma substância num paciente através de um dado método adequado. 0 conjugado da presente invenção pode ser administrado através de qualquer uma das vias comuns, desde que seja capaz de atingir um tecido desejado. Uma variedade de modos de administração é contemplada, incluindo a via intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica, oral, tópica, intranasal, intrapulmonar e intra-retal, mas a presente invenção não está limitada a estes modos de administração exemplificados. No entanto, uma vez que os péptidos são digeridos após a administração oral, os ingredientes ativos de uma composição para administração oral deveriam ser revestidos ou formulados para proteção contra degradação no estômago. Preferencialmente, a presente composição pode ser administrada numa forma injetável. Além disso, a composição 27 farmacêutica da presente invenção pode ser administrada utilizando um determinado aparelho capaz de transportar os ingredientes ativos até à célula alvo.
Uma composição farmacêutica compreendendo o conjugado, de acordo com a presente invenção, pode incluir um veiculo farmaceuticamente aceitável. Para a administração oral, o veiculo farmaceuticamente aceitável pode incluir ligantes, lubrificantes, desintegrantes, excipientes, solubilizadores, agentes dispersantes, estabilizadores, agentes de suspensão, agentes corantes e perfumes. Para preparações injetáveis, o veiculo farmaceuticamente aceitável pode incluir agentes tamponantes, agentes conservantes, analgésicos, solubilizadores, agentes isotónicos e estabilizadores. Para preparações para administração tópica, o veiculo farmaceuticamente aceitável pode incluir bases, excipientes, lubrificantes e agentes conservantes. A composição farmacêutica da presente invenção pode ser formulada numa variedade de formas de dosagem em combinação com os veículos farmaceuticamente aceitáveis mencionados previamente. Por exemplo, para a administração oral, a composição farmacêutica pode ser formulada em compromidos, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes ou hóstias. Para preparações injetáveis, uma composição farmacêutica pode ser formulada numa forma de dosagem unitária, tal como um recipiente multidose ou uma ampola como uma forma de dosagem de dose única. A composição farmacêutica também pode ser formulada em soluções, suspensões, comprimidos, cápsulas e preparações de longa ação. celulose
Por outro lado, exemplos de veículos, exipientes e diluentes adequados para as formulações farmacêuticas incluem lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, amido, goma de acácia, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, celulose, metilcelulose, celulose microcristalina, 28 polivinilpirrolidona, água, metilhidroxibenzoato, propilhidroxibenzoato, talco, estearato de magnésio e óleos minerais. Além disso, as formulações farmacêuticas também podem incluir preenchidores, agentes anti-coagulantes, lubrificantes, humificadores, perfumes, emulsionantes e antisséticos.
Uma dosagem substancial de um fármaco em combinação com o fragmento Fc da presente invenção como um veiculo pode ser determinada por vários fatores relacionados incluindo os tipos de doenças a serem tratadas, vias de administração, a idade e sexo do paciente, peso e severidade da doença, bem como pelos tipos de fármaco como um componente ativo. Uma vez gue a composição farmacêutica da presente invenção tem uma duração da ação in vivo muito longa, tem a vantagem de reduzir grandemente a frequência da administração dos fármacos farmacêuticos.
Um melhor entendimento da presente invenção pode ser obtido através dos exemplos seguintes que são apresentados para ilustrar, mas não são para serem interpretados como limitantes da presente invenção.
EXEMPLOS
Preparação de fragmentos Fc de imunoglobulina EXEMPLO 1: Construção de vetor de expressão de Fc da imunoglobulina humana IgG4 < 1 — 1 > Construção de vetor de expressão de Fc de IgG4 dimérico
Para clonar um gene que codifica a região Fc da imunoglobulina humana IgG4, foi realizada RT-PCR utilizando ARN isolado de células sanguíneas humanas como um molde, como se segue. Em primeiro lugar, o ARN total foi isolado de cerca de 6 ml de sangue utilizando um kit de sangue Qiamp RN A (Qiagen) e a amplificação génica foi realizada utilizando o ARN total como um molde e um kit de uma-Etapa RT-PCR (Qiagen). Para obter uma sequência génica desejada, foi utilizado um par de iniciadores representados pelas 29 SEQ. ID N.°s 1 e 2. A SEQ. ID N.° 1 é uma sequência nucleotídica que começa do 10° resíduo, serina, de 12 resíduos de aminoácido da região dobradiça da IgG4 (Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro: SEQ. ID N.° 3) . A SEQ. ID N.° 2 foi desenhada para ter um local de reconhecimento BamHI contendo um codão de terminação. O gene amplificado utilizando o conjunto de iniciadores foi identificado por ter a sequência nucleotídica representada pela SEQ. ID N.° 4 e conter uma extremidade amino terminal, começando com a sequência Ser-Cys-Pro da região dobradiça de uma sequência génica de Fc de IgG4 de comprimento compelto e domínios CH2 e CH3. Para clonar o fragmento de gene de Fc da IgG4 amplificado num vetor de expressão contendo uma sequência sinal de E. coli, foi utilizado um vetor de expressão pT14SlSH-4T20V22Q (Patente Coreana N.° 38061), previamente desenvolvido pelos presentes inventores, como um vetor de partida. Este vetor de expressão contém um derivado da sequência sinal de enterotoxina de E. coli termoestável com a sequência nucleotídica representada pela SEQ. ID N.° 5. Para facilitar a clonagem, um local de reconhecimento StuI foi inserido numa extremidade do derivado da sequência sinal de enterotoxina de E. coli termoestável do plasmídeo pT14S15H-4T20V22Q através de mutagénese de sítio dirigido utilizando um par de iniciadores representados pelas SEQ. ID N.°s 6 e 7 para induzir a mutagénese para introduzir o local StuI numa sequência nucleotídica que codifica o último resíduo de aminoácido da sequência sinal. Esta inserção do local StuI foi identificada como bem sucedida por sequenciação de ADN. O plasmídeo pT14SlSH-4T20V22Q resultante contendo um local StuI foi designado como "pmSTII". O plasmídeo pmSTII foi tratado com StuI e BamHI e sujeito e eletroforese em gel de agarose e foi purificado um grande fragmento (4,7 kb) que continha o derivado da sequência sinal de enterotoxina de E. coli termoestável. Depois, o fragmento 30 de gene de Fc da IgG4 amplificado foi digerido com BamHI e ligado com o vetor de expressão linearizado, providenciando, assim, um plasmídeo pSTIIdCG4Fc. Este vetor expressa uma proteína que tem a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 8 e está presente numa forma dimérica por ligações dissulfido entre resíduos de cisteína na região dobradiça. O vetor de expressão final foi transformado em BL21 (DE3) de E. coli e o transf ormante resultante foi designado como "BL21/pSTIIdCG4Fc (HM10932)", que foi depositado no Centro de Cultivos de Microorganismos Coreano (KCCM) a 15 de setembro de 2004 e atribuído o número de acessão KCCM-10597. <l-2> Construção de vetor de expressão de Fc de IgG4 monomérico
Para clonar um fragmento Fc de IgG4 a ser expresso numa forma monomérica, foi realizada PCR utilizando um par de iniciadores representados pelas SEQ. ID N.°s 9 e 2 e o plasmídeo pSTIIdCG4Fc preparado na secção <1-1> anterior como um molde. Para permitir que um gene amplificado seja expresso numa forma monomérica, a PCR foi desenhada para que um produto de PCR tenha uma deleção na região dobradiça necessária para a formação de dímero da sequência Fc de IgG4, e, assim, apenas os domínios CH2 e CH3 do Fc da IgG4 foram amplificados. O produto da PCR foi clonado num vetor de expressão, pmSTII, de acordo com o mesmo procedimento que na secção <1-1> anterior, providenciando, assim, um plasmídeo pSTIIG4Mo. Este vetor de expressão foi transformado em BL21 (DE3) de E. coli e o transf ormante resultante foi designado "BL21/pSTIIG4Mo (HM10933)", que foi depositado no Centro de Cultivos de Microorganismos Coreano (KCCM) a 15 de setembro de 2004 e atribuído o número de acessão KCCM-10598. Uma proteína expressa pelo vetor de expressão tem a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 10 e é expressa a partir do domínio CH2 e está presente numa forma monomérica porque não tem região 31 dobradiça. EXEMPLO 2: Construção de vetor de expressão de Fc da imunoglobulina humana IgGl <2-l> Construção de vetor de expressão Fc de IgGl dimérico
Para clonar um gene gue codifica a região Fc da IgGl humana, foi realizada RT-PCR de acordo com o mesmo método gue na secção <1-1> do Exemplo 1 utilizando ARN isolado de células sanguíneas humanas como um molde utilizando um kit de RT-PCR de uma etapa (Qiagen). Para obter uma sequência génica desejada, foi utilizado um par de iniciadores representados pelas SEQ. ID N.°s 11 e 12. A SEQ. ID N.° 11 é uma sequência nucleotidica que começa do 13° resíduo, prolina, de 15 resíduos de aminoácido da região dobradiça (Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro: SEQ. ID N.° 13).
Verificou-se que o gene amplificado utilizando o par de iniciadores representados pelas SEQ. ID N.°s 11 e 12 contém uma extremidade amino terminal que começa com a sequência Pro-Cys-Pro da região dobradiça e os domínios CH2 e CH3, entre uma sequência génica de Fc da IgGl de comprimento completo e tem a sequência nucleotidica da SEQ. ID N.0 14 .
Para clonar o gene de Fc da IgGl amplificado num vetor de expressão contendo uma sequência sinal de E. coli, foi utilizado o vetor pmSTII anteriormente mencionado. De acordo com um procedimento de clonagem semelhante ao da secção <1-1> do Exemplo 1, o plasmídeo pmSTII foi tratado com StuI e BamHI e sujeito a eletroforese em gel de agarose e foi purificado um grande fragmento (4,7 kb), que continha o derivado da sequência sinal da enterotoxina da E. coli termoestável. Depois, o gene de Fc da IgGl amplificado foi digerido com BamHI e ligado com o vetor de expressão linearizado, providenciando, assim o pSTIIdCGlFc. Este vetor expressa numa célula hospedeira uma proteína que tem a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 15 e está 32 presente numa forma dimérica por ligações dissulfido entre resíduos de cisteína na região dobradiça. 0 vetor de expressão final foi transformado em BL21 (DE3) de E. coli e o transformante resultante foi designado "BL21/pSTIIdCGlFc (HM10927)" que foi depositado no Centro de Cultivos de Microorganismos Coreano (KCCM) a 15 de setembro de 2004 e
atribuído o número de acessão KCCM-10588. <2-2> Construção de vetor de expressão de Fc da IgGl monomérico Para preparar um fragmento Fc de IgGl para ser expresso numa forma monomérica, foi realizada PCR utilizando um par de iniciadores representados pelas SEQ. ID N. °s 16 e 12 e o plasmídeo pSTIIdCGlFc preparado na secção <2-l> do Exemplo 2 como um molde. O produto da PCR foi clonado num vetor de expressão, pmSTII, de acordo com o mesmo procedimento que na secção <2-l> do Exemplo 2, providenciando, assim, um plasmídeo pSTIIGIMo contendo a sequência nucleotídica representada pela SEQ. ID N.° 17. Este vetor de expressão foi transformado em BL21 (DE3) de E. coli e o transformante resultante foi designado "BL21/pSTIIGIMo (HM10930) " que foi depositado no Centro de Cultivos de Microorganismos Coreano (KCCM) a 15 de setembro de 2004 e atribuído o número de acessão KCCM-10595. Uma proteína expressa pelo vetor de expressão é expressa a partir do domínio CH2 e apresenta-se numa forma monomérica porque foi apagada da região dobradiça contendo resíduos de cisteína que permitem a formação de dímero e tem a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 18. EXEMPLO 3: Construção do vetor de expressão de Fc da imunoglobulina humana IgG2
Para clonar um gene que codifica a região Fc da IgG2 humana, foi realiada RT-PCR de acordo com o mesmo método que na secção <1-1> do Exemplo 1 utilizando ARN isolado de células sanguíneas humanas como um molde utilizando um kit de RT-PCR de uma etapa (Qiagen) . Para obter uma sequência 33 génica desejada, foi utilizado um par de iniciadores representados pelas SEQ. ID N.°s 19 e 20. A SEQ. ID N.° 19 é uma sequência nucleotidica que começa do 10° resíduo, prolina, de 12 resíduos de aminoácido da região dobradiça (Glu Arg Lys Cys Cys Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro: SEQ. ID N.° 21). O gene amplificado utilizando o par de iniciadores representados pelas SEQ. ID N.°s 19 e 20 foi identificado como contendo uma extremidade amino terminal, que começa com a sequência Pro-Cys-Pro da região dobradiça de uma sequência génica de Fc da IgG2 de comprimento completo e os domínios CH2 e CH3 e tem a sequência nucleotidica da SEQ. ID N.° 22. Para clonar o fragmento do gene de Fc da IgG2 amplificado num vetor de expressão contendo uma sequência sinal de E. coli, foi utilizado o vetor pmSTII previamente mencionado. De acordo com um procedimento de clonagem semelhante ao da secção <1-1> do Exemplo 1, o plasmídeo pmSTII foi tratado com StuI e BamHI e sujeito a eletroforese com gel de agarose e foi purificado um grande fragmento (4,7 kb) que continha o derivado da sequência sinal da enterotoxina de E. coli termoestável. Depois, o fragmento do gene de Fc da IgGl amplificado foi digerido com BamHI e ligado com o fragmento do vetor de expressão linearizado, providenciando, assim, pSTIIdCG2Fc. Este vetor expressa numa célula hospedeira uma proteína que tem a sequência de aminoácidos da SEQ. ID N.° 23 e está presente numa forma dimérica por ligações dissulfido entre resíduos de cisteína na região dobradiça. O vetor de expressão final foi transformado em BL21 (DE3) de E. coli e o transformante resultante foi designado BL21/pSTIIdCG2Fc (HM10936). EXEMPLO 4: Expressão e purificação de Fc da imunoglobulina <4-l> Avaliação da expressão de Fc da imunoglobulina
Os transformantes bacterianos preparados nos Exemplos 1, 2 e 3 foram inoculados individualmente num fermentador (Marubishi Company) e permitidos fermentar e foram avaliados para determinar se expressam fragmentos Fc de 34 imunoglobulina.
Em primeiro lugar, cada transformante foi crescido em 100 ml de meio LB com agitação durante a noite e inoculado no fermentador para cultivo a grande escala. O fermentador foi mantido a 30°C ou 35°C. Para prevenir a conversão de um ambiente aeróbio para anaeróbio, as culturas foram arejadas com ar 20-vvm e agitadas a 500 rpm. Para compensar a insuficiência de nutrientes para o crescimento bacteriano durante a fermentação, as culturas foram suplementadas com glicose e extratos de levedura de acordo com os estados fermentados das bactérias. Quando as culturas atingiram um valor OD60o de 80-100, um indutor, IPTG, foi adicionado às culturas numa quantidade de 20 mM para 4 mM para induzir a expressão proteica. As culturas foram, ainda, cultivadas durante 40 a 45 horas até que o valor OD a 600 nm aumentasse de 100 para 120. A expressão de Fc da imunoglobulina nos transformantes de E. coli e os locais expressos, foram examinados a solubilidade em água e formação de dimero do Fc da Ig expresso como se segue. Para determinar se um produto expresso é segregado para o fluido de fermentação ou o espaço periplasmático de E. coli pela sequência sinal fundida ao vetor de expressão, o fluido de fermentação foi centrifugado para obter um fluido de fermentação livre de células e recolher células. O fluido de fermentação livre de células e uma solução de espaço periplasmático obtida por choque osmótico das células recolhidas foram sujeitos a análise por Western blot. Como resultado, foi detetada uma quantidade muito pequena de Fc de imunoglobulina. Para investigar a expressão intracelular de Fc da Ig, as células foram lisadas utilizando um ultrasonicador (Misonix Company). O lisado celular resultante foi centrifugado para separar as substâncias solúveis em água das substâncias insolúveis em água e as substâncias solúveis em água foram sujeitas a análise por Western blot, como se segue. As 35 substâncias solúveis em água foram misturadas com um tampão de amostra proteico que não continha um agente redutor, tal como DTT ou β-mercaptoetanol, e foram separadas num gel SDS-PAGE 15% (Gel Criterion, Bio-Rad). Depois, as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose edetetadas com um anticorpo Fc anti-humano conjugado com HRP (Sigma). Conforme mostrado na FIGURA 1, o Fc da imunoglobulina foi sobre-expresso numa forma solúvel em água e localizado no citosol de E. coli. Além disso, os produtos, expressos por transformantes transformados com vetores de expressão que expressam o Fc de Ig com uma porção da região dobradiça, foram expressos como dímeros. Na FIGURA 1, as vias 1, 2 e 3 mostram produtos expressos em HM10927, HM10932 e HM10936, respetivamente e a via 4 mostra o Fc gerado pelo tratamento com papaína das imunoglobulinas produzidas em células animais, que mostrou um tamanho ligeiramente maior devido às suas frações de açúcar o gel de SDS-PAGE do que as produzidas em E. coli. <4-2> Análise da sequência N-terminal
Os fragmentos Fc da Ig dimérica solúveis em água, que foram localizados no citosol de E. coli conforme demonstrado na secção <4-l> anterior, foram desenhados para serem traduzidos numa forma fundida com uma sequência sinal. Assim, para determinar se os fragmentos Fc da Ig estão localizados no citosol de E. coli numa forma fundida com a sequência sinal quando não segregada sem o processamento da sequência sinal, foram determinadas as sequências de aminoácidos no N-terminal dos fragmentos Fc da Ig pelo Instituto de Investigação de Ciência Básica, Seoul, Coreia. As amostras utilizadas na análise das sequências de aminoácidos do N-terminal foram preparadas como se segue.
Em primeiro lugar, uma membrana PVDF (Bio-Rad) foi imersa em methaol durante cerca de 2-3 segundos para ser ativada e foi suficientemente molhada com um tampão 36 bloqueador (170 mM glicina, 25 mM Tris-HCl (pH 8,0), 20% metanol). As amostras de proteína separadas num gel de SDS-PAGE não reduzido, preparado na secção <4-l> anterior, foram hibridizadas com uma membrana PVDF durante cerca de uma hora utilizando um kit de hibridização (Unidade de Transferência semi-seca Hoefer, Amersham). As proteínas transferidas para a membrana PVDF foram coradas com um corante proteico, azul de Coomassie R-250 (Amnesco), durante 3-4 segundos e lavadas com uma solução descolorante (água: ácido acético: metanol = 5: 1: 4) . Depois, as regiões contendo proteínas da membrane foram cortadas com tesouras e sujeitas a análise de sequência no N-terminal.
Como resultado, verificou-se que a proteína Fc da IgGl tinha uma sequência N-terminal de Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Glu-Leu-Leu-Gly-Gly, a proteína Fc da IgG4 tinha uma sequência N-terminal de Ser-Cys-Pro-Ala-Pro-Glu-Phe-Leu-Gly-Gly e a proteina Fc da IgG2 tinha uma sequência N-terminal de Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Pro-Val-Ala-Gly-Pro. Conforme aparente destes resultados, verficou-se que os fragmentos Fc expressos pelos transformantes de E. coli da presente invenção têm uma sequência N-terminal precisa. Estes resultados indicam que, quando expressos numa forma fundida com uma sequência sinal, os fragmentos Fc não são segregados para uma membrana extracelular ou espaço periplasmático, são processados com precisão na sequência sinal mesmo no momento da sobre-expressão e estão presentes numa forma solúvel em água no citosol. <4-3> Purificação de Fc da imunoglobulina O Fc da imunoglobulina foi purificado utilizando uma coluna de afinidade pela proteína A conhecida por ter uma forte afinidade por imunoglobulinas, como se segue.
As células de E. coli recolhidas centrifugando fluídos de fermentação foram lisadas por um microfluizador (Microfludics) para originar lisados celulares. Os lisados celulares foram sujeitos a cromatografia de coluna de duas 37 37 Vetores de expressão Transformantes Níveis de expressão proteico depois da purificação da proteína A (mg/1) pSTIIdCGlFc HM10927 400 pSTIIGIMo HM10930 500 pSTIIdCG4Fc HM10932 400 pSTIIG4Mo HM10933 600 pSTIIdCG2Fc HM10936 100 etapas para purificar fragmentos Fc de imunoglobulina recombinantes presentes no citosol. 5 ml de uma coluna de afinidade pela proteína A (Pharmacia) foram equilibrados com PBS e os lisados celulares foram carregados para a coluna a uma taxa de fluxo de 5 ml/min. As proteínas não ligadas foram lavadas com PBS e as proteínas ligadas foram eluidas com 100 mM citrato (pH 3,0). As frações recolhidas foram dessalinizadas utilizando uma coluna de dessalinização HiPrep 26/10 (Pharmacia) com 10 mM tampão Tris (pH 8,0). Depois, foi realizada cromatografia de coluna de troca de aniões secundária utilizando 50 ml de uma coluna Q HP 26/10 (Pharmacia) . As frações de Fc da imunoglobulina recombinantes purificadas primárias foram carregadas na coluna Q-Sefarose HP 26/10 e a coluna foi eluída com um gradiente linear de 0-0,2 M NaCl em 10 mM tampão Tris (pH 8,0), providenciando, assim, frações altamente puras. Depois de ser parcialmente purificado utilizando a coluna de afinidade pela proteína A, os níveis de expressão dos fragmentos Fc da Ig recombinantes foram determinados como se segue._
Uma vez que as proteínas Fc da imunoglobulina assim obtidas estão presents numa forma dimérica ou monomérica da cadeia pesada, elas têm diferentes padrões de migração em SDS-PAGE reduzida e SDS-PAGE não reduzida. Os resultados da análise SDS-PAGE, realizada para determinar purezas de proteína depois dos produtos expressos terem sido 38 purificados, são dados nas FIGURAS 2 e 3.
As FIGURAS 2 e 3 mostram os resultados da análise SDS-PAGE dos fragmentos Fc de imunoglobulina purificados num forma dimérica ou monomérica em condições reduzidas e não reduzidas utilizando um gel criterion (Bio-Rad), em que os fragmentos Fc foram avaliados em relação à migração diferencial em géis reduzidos versus não reduzidos. Na FIGURA 2, a região A mostra proteínas separadas num gel SDS-PAGE não reduzido e a região B mostra proteínas num gel SDS-PAGE reduzido. A via M indica um marcador proteico convencional de baixo alcance pré-corado (Bio-Rad) e as vias 1 a 4 indicam amostras proteicas para Fc da imunoglobulina produzidas por transformantes de E. coli, HM10927, HM10928 (depositados no no Centro de Cultivos de Microorganismos Coreano (KCCM) a 15 de setembro de 2004 e atribuído o número de acessão KCCM-10589) , HM10929 (deposited no KCCM a 15 de setembro de 2004 e atribuído o número de acessão KCCM-10594) e HM10932, respetivamente. Conforme mostrado na FIGURA 2, na SDS-PAGE reduzida, os fragmentos Fc da Ig estavam presentes numa forma monomérica porque as ligações dissulfido formadas entre resíduos de cisteína da região dobradiça foram reduzidas e foram, portanto, migradas a distância de monómero. Por oposição, na SDS-PAGE não reduzida, os fragmentos Fc da Ig estavam presentes numa forma dimérica por ligações dissulfido e, assim, apresentavam uma distância de migração de cerca de 42 kDa.
Na FIGURA 3, a região A mostra proteínas separadas num gel SDS-PAGE não reduzido e a região B mostra proteínas num gel SDS-PAGE reduzido. A via M indica o marcador proteico convencional e as vias 1 e 2 indicam amostras de proteínas para Fc da imunoglobulina produzidas por transformantes de E. coli, HM10930 e HM10933, respetivamente. Conforme mostrado na FIGURA 3, as proteínas não mostraram uma grande diferença na migração nos géis reduzidos versus não 39 reduzidos e apenas exibiram uma migração ligeiramente diferente devido à redução das ligações dissulfido intramoleculares.
Preparação do conjugado de Fc de imunoglobulina e fármaco EXEMPLO 5: Preparação I do conjugado IFNa-PEG-fragmento Fc de imunoglobulina <Etapa 1> Preparação do fragmento Fc de imunoglobulina utilizando imunoglobulina
Um fragmento Fc de imunoglobulina foi preparado como se segue. 200 mg de imunoglobulina G (IgG) com 150 kDa (Green Cross, Coreia) dissolvidos em 10 mM tampão fosfato foi tratado com 2 mg de uma enzima proteolítica, papaina (Sigma) a 37°C durante 2 horas com agitação suave. Depois da reação enzimátca, o fragmento Fc de imunoglobulina regenerado assim foi sujeito a cromatografia para purificação utilizando uma coluna Superdex sequencialmente, uma coluna de proteina A e uma coluna de troca de catiões. Com detalhe, a solução da reação foi carregada para uma coluna Superdex 200 (Pharmacia) equilibrada com 10 mM tampão de fosfato de sódio (PBS, pH 7,3) e a coluna foi eluida com o mesmo tampão a uma taxa de fluxo de 1 ml/min. Moléculas de imunoglobulina não reagidas (IgG) e F(ab')2, com um peso molecular relativamente elevado em comparação com o fragmento Fc de imunoglobulina, foram removidas utilizando as suas propriedades de serem eluidas antes do que o fragmento Fc da Ig. Os fragmentos Fab com um peso molecular semelhante ao do fragmento Fc da Ig foram eliminados por cromatografia de coluna pela proteina A (FIGURA 4). As frações resultantes contendo o fragmento Fc da Ig eluidas da coluna Superdex 200 foram carregadas a uma taxa de fluxo de 5 ml/min numa coluna de proteina A (Pharmacia) equilibrada com 20 mM tampão fosfato (pH 7,0) e a coluna foi lavada com o mesmo tampão para remover proteínas não ligadas à coluna. Depois, a coluna da proteína A foi eluida com 100 mM tampão de citrato de sódio 40 (ρΗ 3,0) para obter um fragmento Fc de imunoglobulina altamente puro. As frações Fc recolhidas da coluna de proteína A foram finalmente purificadas utilizando uma coluna de troca de catiões (polyCAT, PolyLC Company), em que esta coluna carregada com as frações Fc foi eluída com um gradiente linear de 0,15-0,4 M NaCl em 10 mM tampão acetato (pH 4,5), providenciando, assim, frações Fc altamente puras. As frações Fc altamente puras foram analisadas por SDS-PAGE 12% (via 2 na Figura 5).
<Etapa 2> Preparação do complexo IFNa-PEG
Polietilenoglicol com 3,4 kDa com um grupo reativo aldeído e mambas as extremidades, ALD-PEG-ALD (Shearwater) foi misturado com interferão alfa-2b humano (hIFNa-2b, MW: 20 kDa) dissolvido em 100 mM tampão fosfato numa quantidade de 5 mg/ml a uma razão molar IFNa: PEG de 1:1, 1:2.5, 1:5, 1:10 e 1:20. A esta mistura, foi adicionada um agente redutor, cianoborohidrido de sódio (NaCNBH3, Sigma) a uma concentração final de 20 mM e foi permitida reagir a 4°C durante 3 horas com agitação suave para permitir que PEG s ligue à extremidade amino terminal do interferão alfa. Para obter um complexo 1:1 de PEG e interferão alfa, a mistura da reação foi sujeita a cromatografia por exclusão de tamanho utilizando uma coluna SuperdexR (Pharmacia). O complexo IFNa-PEG foi eluído da coluna utilizando 10 mM tampão de fosfato de potássio (pH 6,0) como um tampão de eluição e interferão alfa não ligado a PEG, PEG não reagido e subprodutos dímeros onde PEG foi ligado a duas moléculas de interferão alfa foram removidas. O complexo IFNa-PEG purificado foi concentrado para 5 mg/ml. Através desta experiência, verificou-se que a razão molar de reação ótima de IFNa para PEG, providenciando a reatividade mais alta e gerando a quantidade mais pequena de subprodutos tais como dímeros, foi de 1:2.5 a 1:5. <Etapa 3> Preparação do conjugado IFNa-PEG-Fc
Para ligar o complexo IFNa-PEG purificado na etapa 2 41 anterior ao N terminal de um fragmento Fc de imunoglobulina, o fragmento Fc de imunoglobulina (cerca de 53 kDa) preparado na etapa 1 anterior foi dissolvido em 10 mM tampão fosfato e misturado com o complexo IFNa-PEG a uma razão molar do complexo IFNa-PEG: Fc de 1:1, 1:2, 1:4 e 1:8. Depois da concentração de tampão fosfato da solução de reação foi ajustada para 100 mM, foi adicionado um agente redutor, NaCNBH3, à solução de reação a uma concentração final de 20 mM e foi permitida reagir a 4°C durante 20 horas com agitação suave. Através desta experiência, verificou-se que a razão molar de reação ótima do complexo IFNa-PEG para Fc, providenciando a reatividade mais elevada e gerando o mínimo de subprodutos tais como dímeros, é de 1:2. <Etapa 4> Isolamento e purificação do conjugado IFNa-PEG-Fc Depois da reação da etapa 3 anterior, a mistura da reação foi sujeita a cromatografia por exclusão de tamanho Superdex de modo a eliminar substâncias não reagidas e subprodutos e purificar o conjugado proteico IFNa-PEG-Fc produzidos. Depois da mistura da reação ser concentrada e carregada numa coluna Superdex, 10 mM de tampão fosfato (pH 7,3) foi passado através da coluna a uma taxa de fluxo de 2,5 ml/min para remover Fc não ligadi e substâncias não reagidas, seguid de eluição de coluna para recolher frações do conjugado proteico IFNa-PEG-Fc. Uma vez que as frações do conjugado proteico IFNa-PEG-Fc recolhidas continham uma pequena quantidade de impurezas, Fc não reagido e dímeros de interferão alfa, foi realizada cromatografia de troca de catiões para remover as impurezas. As frações do conjugado proteico IFNa-PEG-Fc foram carregadas para uma coluna PolyCAT LP (PolyLC) equilibrada com 10 mM acetato de sódio (pH 4,5) e a coluna foi eluída com um gradiente linear de 0-0,5 M NaCl em 10 mM tampão de acetato de sódio (pH 4,5) utilizando 1 M NaCl. Finalmente, o conjugado IFNa-PEG-proteín Fc foi purificado utilizando uma coluna de troca de 42 aniões. As frações do conjugado proteico IFNa-PEG-Fc foram carregadas numa coluna PolyWAX LP (PolyLC) equilibrada com 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) e a coluna foi depois eluida com um gradiente linear de 0-0,3 M NaCl em 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) utilizando 1 M NaCl, isolando, assim, o conjugado proteico IFNa-PEG-Fc numa forma altamente pura.
EXEMPLO 6: Preparação II de conjugado proteico IFNa-PEG-Fc <Etapa 1> Preparação de complexo Fc-PEG
Polietilenoglicol com 3,4 kDa com um grupo reativo aldeído em ambas extremidades, foi misturado ALD-PEG-ALD (Shearwater) com o fragmento Fc de imunoglobulina preparado na etapa 1 do Exemplo 5 as razões molares Fc: PEG de 1:1, 1: 2.5, 1:5, 1:10 e 1:20, em que o fragmento Fc da Ig foi dissolvido em 100 mM tampão fosfato numa quantidade de 15 mg/ml. A esta mistura, foi adicionado um agente redutor, NaCNBH3 (Sigma) a uma concentração final de 20 mM e foi permitido reagir a 4°C durante 3 horas com agitação suave. Para obter um complexo 1:1 de PEG e Fc, a mistura de reação foi sujeita a cromatografia por exclusão de tamanho utilizando uma coluna SuperdexR (Pharmacia). O complexo Fc-PEG foi eluído a partir da coluna utilizando 10 mM tampão fosfato de potássio (pH 6,0) como um tampão de eluição e foram removidos fragmentos Fc de imunoglobulina não ligado a PEG, PEG não reagido e subprodutos dímeros onde PEG foi ligado a duas moléculas de fragmento Fc de imunoglobulina. O complexo Fc-PEG purificado foi concentrado a cerca de 15 mg/ml. Através desta experiência, verificou-se que a razão molar de reação ótima de Fc para PEG, providenciando a reatividade mais elevada e gerando o mínimo de subprodutos tais como dímeros, é de 1:3 a 1:10. <Etapa 2> Formação e purificação de conjugado do complexo Fc-PEG e interferão alfa
Para ligar o complexo Fc-PEG purificado na etapa 1 anterior ao N-terminal de IFNa, o complexo Fc-PEG foi misturado com IFNa dissolvido em 10 mM tampão fosfato a 43 razões molares do complexo Fc-PEG: IFNa de 1:1, 1:1.5, 1:3 e 1: 6. Depois da concentração do tampão fosfato da solução da reação ser ajustada para 100 mM, foi adicionado um agente redutor, NaCNBH3, à solução de reação a uma concentração final de 20 mM e foi permitida reagir a 4°C durante 20 horas com agitação suave. Depois da reação estar concluída, as substâncias não reagidas e subprodutos foram removidos de acordo com o mesmo método de purificação que na etapa 4 do Exemplo 5, isolando, assim, o conjugado proteína Fc-PEG-IFNa numa forma altamente pura. EXEMPLO 7: Preparação de conjugado hGH-PEG-Fc
Um conjugado hGH-PEG-Fc foi preparado e purificado de acordo com o mesmo método que no Exemplo 5, exceto que o fármaco sem ser o interferão alfa, foi utilizado a hormona do crescimento humana (hGH, MW: 22 kDa) e uma razão molar hGH:PEG de 1:5. EXEMPLO 8: Preparação de conjugado (G-CSF)-PEG-Fc
Um conjugado (G-CSF)-PEG-Fc foi preparado e purificado de acordo com o mesmo método que no Exemplo 5, exceto que o fármaco sem ser o interferão alfa, foi utilizado o fator estimulante de colónia de granulócitos humano (G-CSF) e uma razão molar G-CSF: PEG de 1:5.
Por outro lado, um conjugado proteico 17S-G-CSF-PEG-Fc foi preparado e purificado de acordo com o mesmo método conforme descrito anteriormente utilizando um derivado de G-CSF, 17S-G-CSF, com uma substituição de serina no 17° resíduo de aminoácido da G-CSF nativa. EXEMPLO 9: Preparação de conjugado EPO-PEG-Fc
Um conjugado EPO-PEG-Fc foi preparado e purificado de acordo com o mesmo método que no Exemplo 5, exceto que fármaco sem ser o interferão alfa, foi utilizado a eritropoietina humana (EPO) e uma razão molar EPO: PEG de 1:5. EXEMPLO 10: Preparação de conjugado proteico utilizando PEG com grupo reativo diferente 44
Um conjugado proteico IFNa-PEG-Fc foi preparado utilizando PEG com um grupo reativo propionato de sucinimidilo (SPA) em ambas extremidades, como se segue. Polietilenoglicol com 3,4 kDa, SPA-PEG-SPA (Shearwater), foi misturado com 10 mg de interferão alfa dissolvido em 100 mM tampão fosfato a razões molares IFNa:PEG de 1:1, 1:2.5, 1:5, 1:10 e 1:20. A mistura foi depois permitida reagir à temperatura ambiente com agitação suave durante 2 horas. Para obter um complexo 1:1 de PEG e interferão alfa (complexo IFNa-PEG), onde PEG foi ligado seletivamente ao grupo amino de um resíduo de lisina do interferão alfa, a mistura da reação foi sujeita a cromatografia por exclusão de tamanho Superdex. O complexo IFNa-PEG foi eluido da coluna utilizando 10 mM tampão fosfato de potássio (pH 6,0) como um tampão de eluição e foram removidos interferão alfa não ligado a PEG, PEG não reagido e subprodutos dímeros nos quais duas moléculas de interferão alfa foram ligados a ambas extremidades de PEG. Para ligar o complexo IFNa-PEG ao grupo amino de um resíduo de lisina de Fc da imunoglobulina, o complexo IFNa-PEG purificado foi concentrado a cerca de 5 mg/ml e um conjugado IFNa-PEG-Fc foi preparado e purificado de acordo com os mesmos métodos que nas etapas 3 e 4 do Exemplo 5. Através desta experiência, verificou-se que a razão molar de reação ótima de IFNa para PEG, providenciando a reatividade mais elevada e gerando o mínimo de subprodutos tais como dímeros, é de 1:2.5 a 1:5.
Por outro lado, outro conjugado IFNa-PEG-Fc foi preparado de acordo com os mesmos métodos conforme descrito anteriormente utilizando PEG com um grupo reativo N-hidroxisucinimidilo (NHS) em ambas extremidades, NHS-PEG-NHS (Shearwater) ou PEG com um grupo reativo aldeído butilo em ambas extremidades, BUA-PEG-BUA (Shearwater). EXEMPLO 11; Preparação de conjugado proteico utilizando PEG com peso molecular diferente 45
Um complexo IFNa-lOK PEG foi preparado utilizando polietilenoglicol com 10 kDa com um grupo reativo aldeído em ambas extremidades, ALD-PEG-ALD (Shearwater). Este complexo foi preparado e purificado de acordo com o mesmo método que na etapa 2 do Exemplo 5. Através desta experiência, verificou-se que a razão molar de reação ótima de IFNa para 10-kDa PEG, providenciando a reatividade mais elevada e gerando o mínimo de subprodutos tais como dimeros, é de 1:2.5 a 1:5. 0 complexo IFNa-lOK PEG purificado foi concentrado para cerca de 5 mg/ml e utilizando este concentrado, um conjugado IFNa-lOK PEG-Fc foi preparado e purificado de acordo com os mesmos métodos que nas etapas 3 e 4 do Exemplo 5. EXEMPLO 12: Preparação de conjugado Fab'-S-PEG-N-Fc (grupo -SH) <Etapa 1> Expressão e purificação de Fab'
Um transformante de E. coli, BL21/poDLHF (número de acessão: KCCM-10511), expressando fator-alfa de necrose anti-tumoral Fab' foi crescido em 100 ml de meio LB durante a noite com agitação e foi inoculado num fermentador de 5 L (Marubishi) e cultivado a 30 °C e 500 rpm e a uma taxa de fluxo de ar de 20 vvm. Para compensar a insuficiência de nutrientes para crescimento bacteriano durante a fermentação, as culturas foram suplementadas com glicose e extratos de levedura de acordo com os estados fermentados das bactérias. Quando as culturas atingiram um valor OD6oo de 80-100, um indutor, IPTG, foi adicionado às culturas para induzir a expressão proteica. As culturas foram, ainda, cultivadas durante 40 a 45 horas até o valor OD a 600 nm aumentar de 120 para 140. O fluído de fermentação assim obtido foi centrifugado a 20,000 xg durante 30 min. O sobrenadante foi recolhido e a pellet descartada. O sobrenadante foi sujeito à seguinte cromatografia em coluna de três etapas para purificar o fator-alfa de necrose anti-tumoral Fab'. O sobrenadante foi carregado 46 para uma coluna de proteína G HiTrap (5 ml, Pharmacia) equilibrado com 20 mM tampão fosfato (pH 7,0) e uma coluna foi eluida com 100 mM glicina (pH 3,0) . As frações Fab' recolhidas foram depois carregadas para uma coluna Superdex 200 (Pharmacia) equilibrada com 10 mM tampão fosfato de sódio (PBS, pH 7,3) e esta coluna foi eluida com o mesmo tampão. Finalmente, as segundas frações Fab' foram carregadas para uma coluna polyCAT 21x250 (PolyLC) e esta coluna foi eluida com um gradiente de NaCl linear de 0,15-0,4 M em 10 mM tampão de acetato (pH 4,5), providenciando, assim, frações altamente puras de fator-alfa de necrose anti-tumoral Fab'.
<Etapa 2> Preparação e purificação do complexo Fc-PEG
Para ligar um ligante PEG ao N-terminal de um Fc da imunoglobulina, o Fc da imunoglobulina preparado de acordo com o mesmo método que na etapa 1 do Exemplo 5 foi dissolvido em 100 mM tampão fosfato (pH 6,0) a uma concentração de 5 mg/ml e foi misturado com NHS-PEG-MAL (3,4 kDa, Shearwater) a uma razão molar Fc: PEG de 1:10, seguido de incubação a 4°C durante 12 horas com agitação suave.
Depois da reação estar concluída, o tampão da reação foi trocado por 20 mM tampão fosfato de sódio (pH 6,0) para remover NHS-PEG-MAL não ligado. Depois, a mistura da reação foi carregada para uma coluna polyCAT (PolyLC). A coluna foi eluida com um gradiente linear de NaCl de 0,15-0,5 M em 20 mM tampão fosfato de sódio (pH 6,0). Durante esta eluição, o complexo Fc da imunoglobulina-PEG foi eluído antes do que o Fc da imunoglobulina não reagido e o Fc da Ig não reagido foi eluído posteriormente, eliminando, assim, as moléculas de Fc da Ig não reagidas. <Etapa 3> Preparação e purificação de conjugado Fab'-S-PEG-N-Fc (grupo -SH)
Para ligar o complexo Fc da imunoglobulina-PEG ao grupo cisteína do Fab', o Fab' purificado na etapa 1 47 anterior foi dissolvido em 100 mM tampão fosfato de sódio (pH 7,3) a uma concentração de 2 mg/ml e foi misturado com 0 complexo Fc da imunoglobulina-PEG preparado na etapa 2 anterior a uma razão molar Fab': complexode 1:5. A mistura da reação foi concentrada para uma concentração proteica final de 50 mg/ml e incubada a 4°C durante 24 horas com agitação suave.
Depois da reação estar concluída, a mistura da reação foi carregada para uma coluna Superdex 200 (Pharmacia), equilibrada com 10 mM tampão fosfato de sódio (pH 7,3) e a coluna foi eluida com o mesmo tampão a uma taxa de fluxo de 1 ml/min. O conjugado Fab'-S-PEG-N-Fc unido foi eluido relativamente antes devido ao seu elevado peso molecular e o complexo Fc da imunoglobulina-PEG não reagido e Fab' foram eluidos posteriormente, eliminando, assim, as moléculas não reagidas. Paa eliminar completamente o Fc da imunoglobulina-PEG não reagido, as frações recolhidas do conjugado Fab'-S-PEG-N-Fc foram carregadas de novo para uma coluna polyCAT 21x250 (PolyLC) e esta coluna foi eluida com um gradiente linear de NaCl de 0,15-0,5 M em 20 mM tampão fosfato de sódio (pH 6,0), providenciando, assim, conjugado Fab'-S-PEG-N-Fc puro compreendendo o complexo Fc-PEG ligado a um grupo -SH próximo do C-terminal do Fab'. EXEMPLO 13: Preparação de conjugado Fab'-N-PEG-N-Fc (N-terminal) <Etapa 1> Preparação e purificação de complexo Fab'-PEG (N-terminal) 40 mg do Fab' purificado na etapa 1 do Exemplo 12 foi dissolvido em 100 mM tampão fosfato de sódio (pH 6,0) a uma concentração de 5 mg/ml e foi misturado com butilo ALD-PEG-butilo ALD (3,4 kDa, Nektar) a uma razão molar Fab': PEG de 1:5. Um agente redutor, NaCNBH3, foi adicionado a uma mistura da reação a uma concentração final de 20 mM e a mistura da reação foi depois permitida reagir a 4°C durante 2 horas com agitação suave. 48
Depois da reação estar concluída, o tampão de reação foi trocado por 20 mM tampão fosfato de sódio (pH 6,0) . Depois, a mistura da reação foi carregada para uma coluna polyCAT (PolyLC). A coluna foi eluída com um gradiente linear de NaCl de 0,15-0,4 M em 20 mM tampão de acetato (pH 4,5). Durante esta eluição de coluna, o complexo Fab'-PEG compreendendo o ligante PEG alinhado com o N-terminal do Fab' foi eluído antes do que o não reagido. Fab' e o Fab' não reagido foi eluído posteriormente eliminando, assim, as moléculas de Fab' não reagidas. <Etapa 2> Preparação e purificação de conjugado Fab'-N-PEG-N-Fc
Para ligar o complexo Fab'-PEG purificado na etapa 1 anterior ao N-terminal de um Fc da imunoglobulina, o complexo Fab'-PEG foi dissolvido em 100 mM tampão fosfato de sódio (pH 6,0) a uma concentração de 10 mg/ml e foi misturado com o Fc da imunoglobulina dissolvido no mesmo tampão a uma razão molar do complexo Fab'-PEG: Fc de 1:5. Após a mistura da reação foi concentrada a uma concentração proteica final de 50 mg/ml, foi adicionado um agente redutor, NaCNBH3, a uma mistura da reação a uma concentração final de 20 mM e a mistura da reação foi depois reagida a 4°C durante 24 horas com agitação suave.
Depois da reação estar concluída, a mistura da reação foi carregada numa coluna Superdex 200 (Pharmacia) equilibrada com 10 mM tampão fosfato de sódio (pH 7,3) e a coluna foi eluída com o mesmo tampão a uma taxa de fluxo de 1 ml/min. O conjugado Fab'-N-PEG-N-Fc unido foi eluído relativamente antes devido ao seu elevado peso molecular e Fc da imunoglobulina não reagido e complexo Fab'-PEG foram eluidos posteriormente, eliminando, assim, as moléculas não reagidas. Para eliminar completamente moléculas de Fc da imunoglobulina não reagidas, as frações recolhidas do conjugado Fab'-N-PEG-N-Fc foram depois carregadas numa coluna polyCAT 21x250 (PolyLC) e esta coluna foi eluída com 49 um gradiente linear de NaCl de 0,15-0,5 M em 20 mM tampão fosfato de sódio (pH 6,0), providenciando, assim, um conjugado Fab'-N-PEG-N-Fc puro compreendendo o complexo Fc da imunoglobulina-PEG ligado ao N-terminal do Fab'. EXEMPLO 14: Preparação e purificação de Fc da imunoglobulina desglicosilado 200 mg de um Fc da imunoglobulina preparado de acordo com o mesmo método que no Exemplo 5 foi dissolvido em 100 mM tampão fosfato (pH 7,5) a uma concentração de 2 mg/ml e foi misturado com 300 U/mg de uma desglicosilase, PNGase F (NEB) . A mistura da reação foi permitida reagir a 37°C durante 24 horas com agitação suave. Depois, para purificar o Fc da imunoglobulina desglicosilado, a mistura da reação foi carregada numa coluna SP Sefarose FF (Pharmacia) e a coluna foi eluida com um gradiente linear de NaCl de 0, ΙΟ, 6 M em 10 mM tampão de acetato (pH 4,5) utilizando 1 M NaCl. 0 Fc da imunoglobulina nativo foi eluído antes e o Fc da imunoglobulina desglicosilado (DG Fc) foi eluído posteriormente. EXEMPLO 15: Preparação de conjugado IFNa-PEG-DG Fc
Para ligar o Fc da imunoglobulina desglicosilado preparado no Exemplo 14 ao complexo IFNa-PEG purificado na etapa 2 do Exemplo 5, o complexo IFNa-PEG foi misturado com o Fc DG dissolvido em 10 mM tampão fosfato a razões molares do complexo IFNa-PEG: Fc DG de 1:1, 1:2, 1:4 e 1:8. Depois da concentração do tampão fosfato da solução de reação ser ajustada para 100 mM, foi adicionado um agente redutor, NaCNBH3, à solução de reação a uma concentração final de 20 mM e foi permitida reagir a 4°C durante 20 horas com agitação suave. Através desta experiência, verificou-se que a razão molar de reação ótima do complexo IFNa-PEG para Fc DG, providenciando a reatividade mais elevada e gerando o mínimo de subprodutos tais como dímeros, é de 1:2.
Depois da reação de união, a mistura da reação foi sujeita a cromatografia por exclusão de tamanho utilizando 50 uma coluna SuperdexR (Pharmacia) para eliminar substâncias não reagidas e subprodutos e purificar o conjugado proteico IFNa-PEG-DG Fc. Depois da mistura da reação ser carregada para a coluna, foi passado um tampão fosfato (pH 7,3) através da coluna a uma taxa de fluxo de 2,5 ml/min para remover Fc DG não ligado e substâncias não reagidas, seguido de eluição da coluna para recolher as frações do conjugado proteico IFNa-PEG-DG Fc. Uma vez que as frações do conjugado proteico IFNa-PEG-DG Fc recolhidas continham uma pequena quantidade de impurezas, Fc DG não reagidas e complexo IFNa-PEG, foi realizada cromatografia de troca de catiões para remover as impurezas. As frações do conjugado proteico IFNa-PEG-DG Fc foram carregadas numa coluna PolyCAT LP (PolyLC) equilibrada com 10 mM acetato de sódio (pH 4,5) e a coluna foi eluida com um gradiente linear de 0-0,6 M NaCl em 10 mM tampão de acetato de sódio (pH 4,5) utilizando 1 M NaCl. Finalmente, o conjugado proteico IFNa-PEG-DG Fc foi purificado utilizando uma coluna de troca de aniões. As frações do conjugado proteico IFNa-PEG-Fc foram carregadas numa coluna PolyWAX LP (PolyLC) equilibrada com 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) e a coluna foi depois eluida com um gradiente linear de 0-0,3 M NaCl em 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) utilizando 1 M NaCl, isolando, assim, o conjugado proteico IFNa-PEG-DG Fc numa forma altamente pura. EXEMPLO 16: Preparação de conjugado do complexo IFNa-PEG e derivado de Fc AG recombinante
De acordo com os mesmos métodos que nos Exemplos 5 e 15, o complexo IFNa-PEG foi ligado ao N terminal do IgG4 delta-Cys como um derivado de Fc AG preparado no Exemplo 1. Depois da reação de união, substâncias não reagidas e subprodutos foram removidos da mistura da reação e o então produzido conjugado proteico IFNa-PEG-AG Fc (I) foi primariamente purificado utilizando 50 ml de uma coluna Q HP 26/10 (Pharmacia) e ainda purificado por um ensaio cromatográfico liquido de alta pressão utilizando uma 51 coluna polyCAT 21,5x250 (polyLC), purificando, assim o conjugado a um grau elevado. A solução de reação de união foi dessalinizada utilizando uma coluna de dessalinização HiPrep 26/10 (Pharmacia) com 10 mM tampão Tris (pH 8,0). Depois, a solução da reação foi carregada em 50 ml de uma coluna Q HP 26/10 (Pharmacia) a uma taxa de fluxo de 8 ml/min e esta coluna foi eluida com um gradiente linear de NaCl de 0-0,2 M para obter as frações desejadas. As frações recolhidas foram depois carregadas para uma coluna polyCAT 21,5x250 equilibrada com 10 mM tampão de acetato (pH 5,2) a uma taxa de fluxo de 15 ml/min e esta coluna foi eluida com um gradiente linear de NaCl de 0,1-0,3 M, providenciando, assim, frações altamente puras. De acordo com o mesmo método conforme descrito anteriormente, outro conjugado proteico IFNa-PEG-AG Fc (II) foi preparado utilizando outro derivado de AG Fc preparado no Exemplo 12, monómero IgG4. EXEMPLO 17: Preparação de conjugado derivado de EPO-PEG-Fc AG recombinante
De acordo com o mesmo método que no Exemplo 16, um conjugado derivado de EPO-PEG-Fc AG recombinante foi preparado ligando um derivado de Fc AG, IgG4 delta-Cys, ao complexo EPO-PEG.
EXEMPLO COMPARATIVO 1: Preparação do complexo IFNa-40K PEG 5 mg de interferão alfa foi dissolvido em 100 mM tampão fosfato para obter um volume final de 5 ml e foi misturado com 40-kDa de metoxi-PEG-aldeído ativado (Shearwater) a uma razão molar IFNa: 40-kDa PEG de 1:4. A esta mistura, foi adicionado um agente redutor, NaCNBH3 a uma concentração final de 20 mM e foi permitida reagir a 4°C durante 18 horas com agitação suave. Para inativar PEG, que não reagiu com o IFNa, foi adicionada etanolamina à mistura da reação a uma concentração final de 50mM.
Uma coluna Sephadex G-25 (Pharmacia) foi utilizada para remover PEG não reagido e trocar o tampão por outro tampão. Em primeiro lugar, esta coluna foi equilibrada com 52 volumes de duas colunas (CV) de 10 mM tampão Tris-HCl (pH 7,5) e foi carregada com a mistura da reação. Os fluxos foram detetados medindo a absorvância a 260 nm utilizando um espectrofotómetro UV. Quando a coluna foi eluída com o mesmo tampão, o interferão alfa modificou adicionando PEG com um peso molecular superior ao seu N-terminal foi eluido antes e PEG não reagido foi reaido posteriormente, permitindo, assim, o isolamento de apenas o IFNoí-40K PEG. A seguinte cromatografia foi realizada para purificar ainda mais o complexo IFNoí-40K PEG das frações recolhidas. 3 ml de uma coluna PolyWAX LP (PolyLC) foram equilibrados com 10 mM Tris-HCl (pH 7,5). As frações recolhidas contendo o complexo IFNa-40K PEG foram carregadas para a coluna a uma taxa de fluxo de 1 ml/min e a coluna foi lavada com 15 ml do tampão de equilíbrio. Depois, a coluna foi eluída com um gradiente linear de NaCl de 0-100% utilizando 30 ml de 1 M NaCl, eluindo, assim, o interferão alfa conjugado com tri, di e mono-PEG, sequencialmente. Para purificar ainda mais o conjugado interferão alfa-mono-PEG, as frações recolhidas contendo o conjugado interferão alfa-mono-PEG foram sujeitas a cromatografia por exclusão de tamanho. As frações foram concentradas e carregadas para uma coluna Superdex 200 (Pharmacia) equilibrada com 10 mM tampão fosfato de sódio (pH 7,0) e a coluna foi eluída com o mesmo tampão a uma taxa de fluxo de 1 ml/min. As moléculas conjugadas de interferão alfa-tri e di-PEG foram removidas cm base nas suas propriedades de serem eluídas ates do que o conjugado interferão alfa-mono-PEG, isolando, assim, o conjugado interferão alfa-mono-PEG numa forma altamente pura.
De acordo com o mesmo método conforme descrito anteriormente, 40-kDa PEG foi conjugado ao N-terminal da hormona do crescimento humana, fator estimulante de colónia de granulócitos (G-CSF) e de um derivado de G-CSF, providenciando, assim os complexos derivados hGH-40K PEG, 53 G-CSF-40K PEG e 40K PEG-17S-G-CSF. EXEMPLO COMPARATIVO 2: Preparação de conjugado IFNa-PEG-albumina
Para ligar o complexo IFNa-PEG purificado na etapa 2 do Exemplo 1 ao N-terminal da albumina, o complexo IFNa-PEG foi misturado com albumina do soro humana (HSA, cerca de 67 kDa, Green Cross) dissolvida em 10 mM tampão fosfato a uma razão molar complexo IFNa-PEG: albumina de 1:1, 1:2, 1:4 e 1:8. Depois da concentração do tampão fosfato da solução de reação ser ajustada para 100 mM, foi adicionado um agente redutor, NaCNBH3, à solução de reação a uma concentração final de 20 mM e foi permitida reagir a 4°C durante 20 horas com agitação suave. Através desta experiência, verificou-se que a razão molar de reação ótima do complexo IFNa-PEG para albumina, providenciando a reatividade mais elevada e gerando o mínimo de subprodutos tais como dimeros, é de 1:2.
Depois da reação de união, a mistura da reação foi sujeita a cromatografia por exclusão de tamanho utilizando uma coluna SuperdexR (Pharmacia) para eliminar substâncias não reagidas e subprodutos e purificar o conjugado proteico IFNa-PEG-albumina produzido. Depois da mistura da reação ser concentrada e carregada para a coluna, 10 mM tampão de acetato de sódio passaram pela coluna a uma taxa de fluxo de 2,5 ml/min para remover albumina não ligada e substâncias não reagidas, seguido de eluição de coluna para purificar apenas o conjugado proteico IFNa-PEG-albumina. Uma vez que as frações do conjugado proteico IFNa-PEG-albumina recolhidas continham uma pequena quantidade de impurezas, a albumina não reagida e dimeros do interferão alfa, foi realizada cromatografia de troca de catiões para remover as impurezas. As frações do conjugado proteico IFNa-PEG-albumina foram carregadas para uma coluna SP5PW (Waters) equilibrada com 10 mM acetato de sódio (pH 4,5) e a coluna foi eluída com um gradiente linear de 0-0,5 M NaCl 54 em 10 mM tampão de acetato de sódio (pH 4,5) utilizando 1 M NaCl, isolando, assim, o conjugado proteico IFNa-PEG-albumina numa forma altamente pura.
De acordo com o mesmo método conforme descrito anteriormente, a albumina foi conjugada com a hormona do crescimento humana, G-CSF, e um derivado de G-CSF, providenciando, assim, conjugados hGH-PEG-albumina, G-CSF-PEG-albumina e 17S-G-CSF-PEG-albumina.
EXEMPLO COMPARATIVO 3: Preparação do complexo Fab'-S-40K PEG O residuo de cisteina livre do Fab' purificado na etapa 1 do Exemplo 8 foi ativado por incubação num tampão de ativação (20 mM acetato de sódio (pH 4,0), 0,2 mM DTT) durante 1 hr. Depois do tampão ser trocado por um tampão de modificação PEG, foi adicionado 50 mM fosfato de potássio (pH 6,5), maleimida-PEG (MW: 40 kDa, Shearwater) a uma razão molar Fab':40-kDa PEG de 1:10 e foi reagido para reagir a 4°C durante 24 horas com agitação suave.
Depois da reação estar concluída, a solução da reação foi carregada para uma coluna Superdex 200 (Pharmacia) eguilibrada com 10 mM tampão fosfato de sódio (pH 7,3) e a coluna foi eluída com o mesmo tampão a uma taxa de fluxo de 1 ml/min. O conjugado Fab' 40-kDa PEG (Fab'-40K PEG) foi eluído relativamente antes devido ao seu elevado peso molecular e o Fab' não reagido foi eluído posteriormente, eliminando, assim, o Fab' não reagido. Para eliminar completamente o Fab' não reagido, as frações recolhidas do complexo Fab'-40K PEG foram de novo carregadas para uma coluna polyCAT 21x250 (PolyLC) e esta coluna foi eluída com um gradiente linear de NaCl de 0,15-0,5 M em 20 mM tampão fosfato de sódio (pH 4,5), providenciando, assim, um complexo Fab'-S-40K PEG puro compreendendo 40-kDa PEG ligado a um grupo -SH do Fab' . EXEMPLO EXPERIMENTAL 1: Identificação e análise guantitativa dos conjugados proteicos 55 <1—1> Identificação dos conjugados proteicos
Os conjugados proteicos preparados nos Exemplos anteriores foram analisados por SDS-PAGE não reduzida utilizando um gel de gradiente 4-20% e um gel 12% e ELISA (R&D System). Como resultado da análise SDS-PAGE, conforme mostrado na FIGURA 6, uma reação de união de um polipeptideo fsiológico, um polímero não peptídico, PEG, e um fragmento Fc de imunoglobulina resultou na produção bem sucedida de um conjugado IFNoí-PEG-Fc (A) , um conjugado 17Ser-G-CSF-PEG-Fc (B) e de um conjugado EPO-PEG-Fc (C).
Além disso, o Fc DG preparado no Exemplo 10 foi analisado por SDS-PAGE 12% não reduzida. Conforme mostrado na FIGURA 9b, foi detetada uma banda de Fc DG numa posição que corresponde ao peso molecular do Fc nativo sem as frações de açúcar. <l-2> Análise quantitativa dos conjugados proteicos
Os conjugados proteicos preparados nos Exemplos anteriores foram quantificados por cromatografia por exclusão de tamanho utilizando uma coluna HiLoad 26/60 Superdex 75 (Pharmacia) e 10 mM tampão de fosfato de potássio (pH 6,0) como um tampão de eluição, em que uma área pico de cada conjugado proteico foi comparada com a de um grupo controlo. Padrões previamente analisados quantitativamente, IFNa, hGH, G-CSF, 17S-G-CSF, EPO e Fc, foram sujeitos individualmente a cromatografia por exclusão de tamanho e foi determinado um fator de conversão entre uma concentração e um pico. Uma quantidade pré-determinada de cada conjugado proteico foi sujeita à mesma cromatografia por exclusão de tamanho. Subtraindo uma área pico correspondente a um fragmento Fc de imunoglobulina da assim obtida área pico, foi determinado um valor quantitativo para uma proteína fisiologicamente ativa presente em cada conjugado proteico. A FIGURA 7 mostra o resultado da cromatografia por exclusão de tamanho do conjugado IFNa-PEG-Fc purificado, em que foi observado um 56 único pico. Este resultado indica que o conjugado proteico purificado não contém impurezas multiméricas tais como um dimero, um trimero ou um elevado número de monómeros.
Quando um polipeptídeo fisiologicamente ativo conjugado com Fc foi quantitativamente analisado utilizando um anticorpo especifico do polipeptídeo fisiologicamente ativo, o anticorpo foi prevenido de ligar-se ao polipeptídeo, resultando num valor inferior do que o valor real calculado por cromatografia. No caso do conjugado IFNa-PEG-Fc, uma ELISA resultou num valor de ELISA correspondente a cerca de 30% de um valor real. <l-3> Avaliação da pureza e massa dos conjugados proteicos
Os conjugados proteicos preparados nos Exemplos anteriores foram sujeitos a cromatografia por exclusão de tamanho e a absorvância foi medida a 280 nm. Como resultado, os conjugados IFNa-PEG-Fc, hGH-PEG-Fc, G-CSF-PEG-Fc e 17Ser-G-CSF-PEG-Fc exibiram um único pico a um tempo de retenção de uma substância com 70 a 80-kDa.
Por outro lado, foi realizada HPLC de fase reversa para determinar purezas dos conjugados proteicos preparados nos Exemplos 5, 15 e 16, IFNa-PEG-Fc, IFNa-PEG-DG Fc e derivado de Fc AG IFNa-PEG-recombinante. Foi utilizada uma coluna de fase reversa (coluna 259 VHP54, Vydac). A coluna foi eluída com um gradiente de acetonitrilo 40-100% com 0,5% TFA e as purezas foram analisadas medindo a absorvância a 280 nm. Como resultado, conforme mostrado na FIGURA 11, as amostras não continham interferão não ligado ou Fc da imunoglobulina e todos os conjugados proteicos, IFNa-PEG-Fc (A) , IFNa-PEG-DG Fc (B) e derivado de Fc AG IFNa-PEG-recombinante (C) , tinham uma pureza superior a 96%.
Para determinar os pesos moleculares precisos dos conjugados proteicos purificados, foi analisada a massa de cada conjugado utilizando um espectrofotómetro de massa de alto rendimento MALDI-TOF (Voyager DE-STR, Applied 57
Biosystems). Foi utilizado ácido sinapínico como uma matriz. 0,5 ml de cada amostra teste foram revestidos numa lamina de amostra e seca ao ar, misturados de novo com volume igual de uma solução de matriz e seca ao ar e introduzida numa fonte de iões. A deteção foi realizada de uma forma positiva utilizando um analisador de modo linear TOF. Os iões foram acelerados com uma fonte de extração por divisão operada com extração retardada (DE) utilizando um tempo de extração retardado de 750 nsec para 1500 nsec a uma voltagem de aceleração total de cerca de 2,5 kV.
Os pesos moleculares observados por espectrometria de massa MALDI-TOF para os conjugados proteicos Fc preparados nos Exemplos são dados no Quadro 1, a seguir. A FIGURA 8 mostra o resultado da espectrometria de massa MALDI-TOF do conjugado EPO-PEG-Fc e a FIGURA 10 mostra os resultados da espectrometria de massa MALDI-TOF dos conjugados IFNa-PEG-Fc e IFNa-PEG-DG Fc. Como resultado, verificou-se que o conjugado proteico EPO-PEG-Fc tinha uma pureza superior a 95% e um peso molecular muito próximo de peso molecular teórico. Além disso, verificou-se que o EPO une-se ao fragmento Fc de imunoglobulina a uma razão de 1:1. QUADRO 1
Peso molecular teórico (kDa) Peso molecular medido (kDa) IFNoí-PEG-F c (E.l) 75, 4 75, 9 hGH-PEG-Fc (E.3) 78,4 78, 6 G-CSF-PEG-Fc (E.4 ) 75, 3 75, 9 derivado de 1/S-G-CSF-PEG-Fc (E.4) 75, 0 75, 9 EPO-PEG-Fc (E.5) 91,4 91,0 58
Além disso, quando o Fc e DG Fc preparados no Exemplo 14 foram examinados pelos seus pesos moleculares por M espectrometria de massa ALDI-TOF, verificou-se que o DG Fc era 50 kDa, que é cerca de 3-kDa inferior ao Fc nativo (FIGURA 9a) . Uma vez que 3-kDa de peso molecular corresponde ao tamanho teórico das frações de açúcar, os resultados demonstram que as frações de açúcar foram completamente removidas. O Quadro 2, a seguir, mostra os resultados da espectrometria de massa MALDI-TOF do conjugado IFNa-PEG-DG Fc preparado no Exemplo 11 e os conjugados derivados de IFNa-PEG- Fc AG recombinante (I e II) preparados no Exemplo 16. Verificou-se que o conjugado IFNa-PEG-DG Fc era 3 kDa mais leve e o conjugado derivado de IFNa-PEG-Fc AG recombinante (I) era cerca de 3-4 kDa mais leve, do que o conjugado IFNa-PEG-Fc de 75,9 kDa. O conjugado derivado de IFNa-PEG-Fc AG recombinante (II) a unido a um monómero de Fc mostrou um peso molecular diminuído por 24,5 kDa correspondendo ao peso molecular do monómero de Fc. QUADRO 2
Peso molecular teórico (kDa) Peso molecular medido (kDa) IFNa-PEG-DG Fc (E.ll) 72,8 73, 0 conjugado derivado de IFNa-PEG-Fc AG recombinante (I) (E. 13) 72,3 72,2 conjugado derivado de IFNa-PEG-Fc AG recombinante (II) (E.13) 46, 8 4 6,6
EXEMPLO EXPERIMENTAL 2: Análise farmacocinética I
Formas nativas de proteínas fisiologicamente ativas (controlos) e os complexos proteicos preparados nos Exemplos e EXEMPLOS COMPARATIVOS, complexos -40K PEG, conjugados -PEG-albumina, conjugados -PEG-Fc, conjugados -PEG-DG Fc e conjugados derivados de -PEG-Fc AG recombinante 59 foram avaliados pela estabilidade no soro e parâmetros farmacocinéticos em ratos SD (cinco ratos por grupo). Os controlos, e os complexos -40K PEG, conjugados -PEG-albumina, conjugados -PEG-Fc, conjugados - PEG-DG Fc e conjugados derivados de -PEG-Fc AG recombinante (grupos teste) foram injetados individualmente por via subcutânea a uma dose de 100 mg/kg. Dpois da injeção subcutânea, foram colhidas amostras de sangue às 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 30, 48, 72 e 96 horas nos grupos controlo e nos grupos teste às 1, 6, 12, 24, 30, 48, 72, 96, 120, 240 e 288 horas. As amostras de sangue foram colhidas em tubos com um anti-coagulante, heparina e centrifugadas durante 5 min utilizando uma microcentrifuga de alta velocidade Eppendorf para remover as células sanguíneas. Os níveis proteicos no soro foram medidos por ELISA utilizando anticorpos específicos das proteínas fisiologicamente ativas.
Os resultados das análises farmacocinéticas das formas nativas de IFNa, hGH, G-CSF e EPO, e complexos -40K PEG dos mesmos, conjugados -PEG-albumina dos mesmos, conjugados -PEG-Fc dos mesmos e conjugados -PEG-DG Fc dos mesmos são dados nos Quadros 3 a 7, a seguir. Nos quadros seguintes, Tmax indica o tempo que demora a atingir a concentração máxima no soro do fármaco, T1/2 indica a meia-vida no soro de um fármaco e MRT (tempo de residência médio) indica o tempo médio que uma molécula do fármaco reside no corpo. QUADRO 3
Farmacocinética do interferão alfa IFNa Nativo IFNa-4 0K PEG (C.E. D IFNa- PEG- albumina (C.E.2) IFNoí- PEG-Fc (E.5) IFNa-PEG-DG Fc (E. 15) Derivado de IFNa-PEG-Fc AG recombinante (I) (E.16) Derivado de IFNa-PEG-Fc AG recombinante (II) (E.16) T rnax (horas) 1,0 30 12 30 48 24 24 Tl/2 (horas) 1,7 35, 8 17, 1 90,4 71,0 61,2 31,2 MRT (horas) 2,1 71,5 32,5 150,1 120,6 111, 0 58,8 60 QUADRO 4
Farmacocinética do fator de crescimento humano hGH Nativo hGH-40K PEG (C.E.l) hGH-PEG-albumina (C.E.2) hGH-PEG-Fc (E . 7) Tmax (horas) 1,0 12 12 12 Tl/2 (horas) 1,1 7,7 5, 9 11,8 MRT (horas) 2,1 18,2 13, 0 18,8 QUADRO 5
Farmacocinética do G-CSF G-CSF Nativo G-CSF-40K PEG (C.E.l) G-CSF-PEG- albumina (C.E.2) G-CSF-PEG-Fc (E.8) T max (horas) 2,0 12 12 12 Tl/2 (horas) 2,8 4,8 5,2 6, 9 MRT (horas) 5,2 24,5 25, 0 32, 6 QUADRO 6
Farmacocinética do derivado 17S-G-CSF Derivado de 17s-g-csf Nativo 17S-G-CSF-40K PEG (C.E.l) 17s-g-csf- PEG-albumin a (C.E.2) 17s-g-csf- PEG-Fc (E. 8) Tmax (horas) 2,0 24 24 24 Tl/2 (horas) 2, 9 4,3 6,4 7, 0 MRT (horas) 5, 8 24,4 25, 1 33,2 QUADRO 7
Farmacocinética do EPO EPO Nativo EPO altamente glicosilada EPO-PEG-Fc (E. 9) Derivado de EPO-PEG-Fc AG recombinante AG Fc (E.17) T -1 max (horas) 6, 0 12 30 48 61
Farmacocinética do EPO EPO Nativo EPO altamente glicosilada EPO-PEG-Fc (E.9) Derivado de EPO-PEG-Fc AG recombinante AG Fc (E.17) 11 /2 (horas) 9, 4 18,4 61,5 87, 9 MRT (horas) 21,7 26, 8 117, 6 141, 6
Conforme mostrado pelos dados do Quadro 13 e pelo gráfico farmacinético da FIGURA 12, o conjugado proteico IFNa-PEG-Fc tinha uma meia-vida no soro de 90,4 horas, que foi cerca de 50 vezes superior à da forma IFNa nativa e cerca de 2,5 vezs superior à de IFNa-40K PEG com uma meia-vida de 35,8 horas, preparado no EXEMPLO COMPARATIVO 1. Além disso, verificou-se que o conjugado proteico IFNa-PEG-Fc da presente invenção é superior em meia-vida no soro à IFNa-PEG-albumina, que tem uma meia-vida de 17,1 horas.
Por outro lado, conforme mostrado no quadro 3 e FIGURA 14, o conjugado IFNa-PEG-DG Fc tinha uma meia-vida no soro de 71,0 horas, que é quase a mesma do conjugado IFNa-PEG-Fc, o que indica que a desglicosilação de Fc não afeta grademente a estabilidade in vivo do conjugado IFNa-PEG-DG Fc. ALém disso, o conjugado preparado utilizando o derivado Fc AG recombinante produzido por um método recombinante verificou-se que tinha um efeito idêntico ao da Fc DG derivado da forma nativa. No entanto, a meia-vida no soro de um complex unido a um monómero de Fc foi cerca de metade da de um complexo unido com um dimero de Fc normal.
Conforme mostrado no quadro 4, a hormona do crescimento humana também mostrou uma meia-vida no soro estendida quando conjugada com o fragmento Fc de IgG de acordo com a presente invenção. Ou seja, comparado com a forma nativa (1,1 horas), o complexo hGH-40K PEG e o conjugado hGH-PEG-albumina têm meias-vidas ligeiramente aumentadas de 7,7 horas e 5.9 horas, respetivamente, ao 62 passo que o conjugado proteico hGH-PEG-Fc da presente invenção exibiu uma meia-vida no soro grandemente aumentada de 11,8 horas.
Conforme aparente dos dados farmacocinéticos de G-CSF e do seu derivado nos quadros 5 e 6, os conjugados G-CSF-PEG-Fc e 17S-G-CSF-PEG-Fc exibiram uma meia-vida no soro muito mais longa do que o complexo -40K PEG e conjugado -PEG-albumina. Verificou-se que o fragmento Fc de imunoglobulina no soro prolonga a duração da ação de proteinas fisiologicamente ativas nas formas nativas, bem como os seus derivados com alterações de certos resíduos de aminoácido em níveis semelhantes aos das formas nativas. Destes resultados, é facilmente previsível que o método da presente invenção venha a ter um efeito semelhante noutras proteínas e nos seus derivados.
Conforme mostrado no quadro 7 e FIGURA 13, a conjugação do EPO glicosilado nativo ao fragmento Fc também resultou num aumento da meia-vida no soro. Ou seja, EPO tinha uma meia-vida no soro de 9,4 horas na forma nativa e uma meia-vida no soro prolongada de 18,4 horas na Darbepoetina α (Aranesp, Amgen), que é altamente glicosilada para melhorar a estabilidade no soro. 0 conjugado EPO-PEG-Fc, que compreende EPO unido com o fragmento Fc de imunoglobulina de acordo com a presente invenção, exibiu uma meia-vida no soro marcadamente prolongada de 61,5 horas. Além disso, quando conjugado com o derivado de Fc aglicosilado recombinante derivado de E. coli (AG), a meia-vida de EPO aumentou para 87,9 horas, o que indica que a aglicosilação do fragmento Fc permite a preparação de um conjugado proteico que não afeta a estabilidade no soro da proteína sem funções de anticorpo.
Conforme aparente dos resultados anteriores, os conjugados proteicos ligados de forma covalente ao fragmento Fc de imunoglobulina através de um polímero não peptídico de acordo com a presente invenção exibiram meias- 63 vidas no soro aumentadas várias dezenas em relação à forma nativa. Além disso, quando o Fc da imunoglobulina foi aglicosilado por produção em E. coli ou desglicosilado por tratamento enzimático, o seu efeito de aumentar a meia-vida no soro do seu conjugado proteico foi mantido a um nivel semelhante.
Em particular, comparado com proteínas modificadas com 40-kDa PEG com a duração da ação mais longa entre moléculas PEG por aumentarem a duração da ação de proteínas no soro, os conjugados proteicos do Fc da imunoglobulina apresentaram estabilidade no soro muito superior. Além disso, comparado com conjugados proteicos unidos a albumina em vez de Fc da imunoglobulina, os conjugados proteicos da presente invenção exibiram estabilidade no soro excelente, o que indica que os conjugados proteicos da presente invenção são eficazes no desenvolvimento de formas de longa atuação de fármacos proteicos. Estes resultados, que os presentes conjugados proteicos têm efeitos excelentes na estibilidade no soro e MRT numa ampla gama de proteínas, incluindo derivados do fator estimulante de colónia por mutação pontual comparado com proteínas conjugadas com PEG ou albumina convencionais, indica que a estabilidade e os efeitos estendidos de duração dos presentes conjugados proteicos são aplicáveis a outros polipeptídeos fisiologicamente ativos.
Por outro lado, quando o conjugado proteico IFNa-lOK PEG-Fc (Exemplo 11) preparado utilizando um polímero não peptidico, 10-kDa PEG, foi avaliado pela sua meia-vida no soro de acordo com o mesmo método conforme descrito anteriormente, mostrou uma meia-vida no soro de 48,8 horas, que foi algo mais curta do que a meia-vida no soro (79,7 horas) de um conjugado proteico preparado utilizando 3,4-kDa PEG.
Além disso, as meias-vidas no soro dos conjugados proteicos diminuem com o aumento do peso molecular do 64 polímero não peptídico PEG. Estes resultados indicam que o principal fator que aumenta a estabilidade no soro e a duração dos conjugados proteicos é o fragmento Fc de imunoglobulina conjugado e não o polímero não peptídico.
Mesmo quando o grupo reativo de PEG foi trocado com um grupo reativo diferente do grupo aldeído, os conjugados proteicos com o PEG mostraram padrões semelhantes no peso molecular aparente e meia-vida no soro em relação aos unidos a PEG com um grupo reativo aldeído.
EXEMPLO EXPERIMENTAL 3: Análise farmacocinética II
Para determinar as meias-vidas no soro dos conjugados Fab'-S-PEG-N-Fc e Fab'-N-PEG-N-Fc preparados nos Exemplos 12 e 13 e o complexo Fab'-S-40K PEG preparado no EXEMPLO COMPARATIVO 3, foi realizada a análise farmacocinética do fármaco de acordo com o mesmo método que no Exemplo Experimental 2 utilizando Fab' como um controlo, os conjugados e o complexo. Os resultados são mostrados na FIGURA 15.
Conforme mostrado na FIGURA 15, os conjugados Fab'-S-PEG-N-Fc e Fab'-N-PEG-N-Fc exibiram uma meia-vida no soro prolongada duas ou três vezes superior comparada com o Fab' ou com o complexo Fab'-S-40K PEG. EXEMPLO EXPERIMENTAL 4: Avaliação de atividade intracelular dos conjugados proteicos <4-l> Comparação dos conjugados proteicos IFNa em relação à atividade intracelular
Para comparar a atividade intracelular dos conjugados proteicos IFNa, o IFNa-PEG-Fc (Exemplo 5) , IFNa-PEG-DG Fc (Exemplo 15), derivado de IFNa-PEG-Fc AG recombinante (Exemplo 16), IFNa-40K PEG (EXEMPLO COMPARATIVO 1) e IFNa-PEG-albumina (EXEMPLO COMPARATIVO 2) foram avaliados pela atividade antiviral por um bioensaio de cultivo celular utilizando células de rim bovino Madin Darby (MDBK) (ATCC CCL-22) infetadas com vírus da estomatite vesicular. Interferão alfa-2b não peguilado, disponível do Instituto 65
Nacional dos Padrões e Controlos Biológicos (NIBSC), foi utilizado como um material padrão. Células MDBK foram cultivadas em MEM (meio essencial mínimo, JBI) suplementado com 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina a 37°C sob condições de 5% C02. As amostras a serem analisadas e o material padrão foram diluídos com o meio de cultivo para concentrações pré-determinadas e aliquotas de 100 μΐ foram colocadas em cada poço de uma placa com 96 poços. As células cultivadas foram desanexadas, adicionadas à placa contend as amostras num volume de 100 μΐ, e cultivadas durante cerca de 1 hora a 37°C em condições de 5% C02. Depois, 50 μΐ de vírus da estomatite vesicular (VSV) de 5-73103 PFU foi adicionado a cada poço da placa e as células foram ainda cultivadas durante cerca de 16 a 20 horas a 37°C em condições de 5% C02. Um poço que não continha amostra ou material padrão, mas continha apenas o vírus foi utilizado como controlo negativo e um poço que continha apenas células foi utilizado como um controlo positivo.
Depois do meio de cultura ter sido removido, 100 μΐ de uma solução vermelha neutra foi adicionado à placa para corar as células viáveis, seguido de incubação durante 2 horas a 37°C em condições de 5% C02. Depois dos sobrenadantes seem removidos, 100 μΐ de um mistura 1:1 de 100% etanol e ácido acético 1% foram adicionados a cada poço da placa. Depois de mistura minuciosa para dissolver todos os cristais vermelhos neutros eluídos das células coradas, foi medida a absorvância a 540 nm. O controlo negativo foi utilizaod como um branco e os valores ED50 (doses que causam 50% da inibição do crescimento celular) foram calculados onde o crescimento celular do controlo positivo foi estabelecido a 100%. 66 QUADRO 8
Concentração (ng/ml) Atividade específica (IU/mg) Atividade relativa para IFNa nativo (%) IFNa Nativo 100 4,24E+08 100 IFNa-40K PEG 100 2,04E+07 4,8 IFNa-PEG- albumina 100 2,21E+07 5, 2 IFNa-PEG-Fc 100 1,19E+08 28, 1 IFNa-PEG-DG Fc 100 1,09E+08 25, 7 Derivado de IFNa-PEG-Fc AG recombinante 100 9,58E+07 22, 6
Conforme mostrado no quadro 8, o IFNa-40K PEG diminuiu em atividade para 4,8% do IFNa nativo. Especialmente, como o tamanho das frações PEG aumentou, um conjugado proteico tem estabilidade no soro melhorada mas diminui gradualmente a atividade.
Foi reportado que o interferão alfa tem atividades in vitro de 25% qando modificado com 12-kDa PEG e cerca de 7% quando modificado com 40-kDa PEG (P. Bailon et al., Bioconjugate Chem. 12: 195-202, 2001). Ou seja, uma vez que o conjugado proteico tem uma meia-vida mais longa mas que diminui drasticamente na atividade biológica à medida que o peso molecular das frações PEG aumenta, é preciso desenvolver um conjugado proteico com uma meia-vida no soro mais longa e uma atividade mais forte. Além disso, o conjugado IFNa-PEG-albumina exibiu uma atividade mais fraca de cerca de 5,2% comparada com o IFNa nativo. Por oposição, os conjugados IFNa-PEG-Fc e IFNa-PEG-DG Fc da presente invenção exibiram uma atividade relativa marcadamente melhorda de 28,1% e 25,7% comparada com o IFNa nativo. Além disso, a conjugação do IFNa com o derivado Fc AG recombinante resultou num aumento semelhante na atividade. Destes resultados, espera-se o interferão alfa conjugado com o fragmento Fc da imunoglobulina tenha uma meia-vida no soro marcadamente 67 aumentada e eficácia farmacêutica in vivo grandemente melhorada. <4-2> Comparação de conjugados proteicos da hormona do crescimento humana em relação à atividade intracelular
Para comparar a atividade intracelular dos conjugados proteicos da hormona do crescimento humana, o hGH-PEG-Fc, hGH-40K PEG e hGH-PEG-albumina foram comparados em relação à atividade intracelular.
As atividades intracelulares dos conjugados hGH foram medidas por um ensaio in vitro utilizando uma linha de células de linfoma de nódulos de rato, Nb2 (Coleção Europeia de Culturas de células (ECACC) #97041101), que desenvolve a mitogénese dependente da hormona do crescimento humana.
As células Nb2 foram cultivadas em meio de Fisher suplementado com 10% FBS (soro bovino fetal), 0,075% NaCC>3, 0,05 mM 2-mercaptoetanol e 2 mM glutamina e foram ainda cultivadas num meio semelhante que não continha 10% FBS durante 24 horas. Depois, as células cultivadas foram contadas e cerca de 23104 células foram aliquotadas para cada poço de uma placa com 96 poços. O hGH-PEG-Fc, o hGH-40K PEG, o hGH-PEG-albumina, um padrão disponível do Instituto Nacional de Padrões e Controlos Biológicos (NIBSC) como um controlo e a hormona do crescimento humana nativa (HM-hGH) foram diluídos e adicionados a cada poço a várias concentrações, seguido de incubação durante 48 horas a 37°C em condições de 5% C02. Depois disso, para medir a atividade de proliferação celular determinando o número de células em cada poço, foi adicionado a cada poço 25 μΐ de Reagente de Solução One Aquoso Cell Titer 96 (Promega) e as células foram cultivadas por mais 4 horas. A absorvância foi medida a 490 nm e foi calculado um título para cada amostra. Os resultados são mostrados no Quadro 9, a seguir. 68 QUADRO 9
Concentração (ng/ml) Atividade especifica* (U/mg) Atividade relativa para HM-hGH nativa (%) hGH Nativo 100 2,71E+06 100 hGH (padrão disponível de NIBSC) 100 2,58E+06 95, 2 hGH-4OK PEG 100 0,206E+06 7, 6 hGH-PEG- albumina 100 0,141E+06 5,2 hGH-PEG-Fc 100 0,76E+06 28,1 Atividade específ ica* = l/ED503106 (ED50: quantidade de proteína necessária para 50% do crescimento celular máximo
Conforme mostrado no quadro 9, também no caso da hormona do crescimento humana, a conjugação com 40-kDa PEG (hGH-40K PEG) resultou numa diminuição na atividade para cerca de 7,6% da forma nativa e o conjugado hGH-PEG-albumina exibiu uma atividade in vivo inferior que foi cerca de 5,2% a do hGH nativo. No entanto, o conjugado hGH-PEG-Fc da presente invenção aumentou marcadamente na atividade relativa para mais de 28% em comparação com o hGH nativo. Destes resultados, espera-se que a hormona do crescimento humana ligada com o fragmento Fc de imunoglobulina tnha uma meia-vida no soro marcadamente aumentada e uma eficácia farmacêutica in vivo grandemente melhorada. Além disso, pensa-se que a atividade aumentada dos conjugados proteicos de Fc da imunoglobulina da presente invenção seja devido à estabilidade no soro aumentada e afinidade de ligação preservada aos recetores devido ao Fc da imunoglobulina ou devido ao espaço formado pelo polímero não peptídico. Prevê-se que estes efeitos sejam aplicáveis aos conjugados proteicos de Fc da imunoglobulina unidos com outras proteínas fisiologicamente ativas. <4-3> Comparação dos conjugados proteicos G-CSF em relação 69 à atividade intracelular
Para comparar a atividade intracelular dos conjugados proteicos com um derivado de G-CSF, o G-CSF nativo (Filgrastim, Jeil Pharm. Co., Ltd.), derivado de 17Ser-G-CSF, 20K PEG-G-CSF (Neulasta) , 40K PEG-17S-G-CSF, 17Ser-G-CSF-PEG-albumina e 17S-G-CSF-PEG-Fc foram comparados pela atividade intracelular.
Em primeiro lugar, uma linha de células mielóides humanas, HL-60 (ATCC CCL-240, fêmea Caucasiana com 36 anos de idade/paciente de leucemia promielocítica) foi cultivada em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS. As células cultivadas foram suspensas a uma densidade de cerca de 2,23105 células/ml, e DMSO (dimetilsulfóxido, grau de cultura, Sigma) foi adicionado às mesmas para uma concentração final de l,25%(v/v). Depois, 90 μΐ da suspensão celular foi semeada para cada poço de uma placa com 96 poços (Corning/placa com 96 poços de baixa evaporação), providenciando, assim, uma densidade de cerca de 23104 células por poço e cultivadas numa incubadora a 37°C com 5% C02 durante cerca de 72 horas.
Cada amostra, cuja concentração em proteína foi determinada utilizando um kit de ELISA G-CSF (R&D systems), foi diluída com RPMI 1640 para uma concentração idêntica de 10 pg/ml e ainda diluída duas vezes com RPMI 1640 dezanove vezes. As diluições de duas vezes em série foram adicionadas individualmente a cada poço contendo HL células -60 a um volume de 10 μΐ, para que a concentração de cada amostra começasse a 1 pg/ml. Depois, as células foram cultivadas numa incubadora a 37°C durante 72 horas. A proliferação de células HL-60 foi testada utilizando Cell Titer 96™ (Cat. NO. G4100, Promega) e o número de células aumentado foi determinado medindo a absorvância a 670 nm. 70 QUADRO 10 ED50 (IU/mg) Atividade relativa (%) para G-CSF nativa G-CSF Nativa O cn 0 100 lvSer-G-CSF to CM O 115 G-CSF-20K PEG (Neulasta) O CM 1—1 25 1 'Ser-G-CSF-4 0K PEG O O \—1 <10, 0 lvSer-G-CSF-PEG- albumina 0 cn 1—1 23, 0 lvSer-G-CSF-PEG- Fc 0,58 51,7
Conforme mostrado no quadro 10, os conjugados proteicos de Fc da imunoglobulina unidos com um derivado de G-CSF com uma substituição de aminoácidos, 17Ser-G-CSF, também exibiram efeitos semelhantes aos conjugados proteicos unidos com G-CSF nativos. O 17Ser-G-CSF-PEG foi reportado previamente como tendo uma meia-vida no soro relativamente aumentada mas uma atividade diminuída comparada com 17Ser-G-CSF não peguilado (Publicação em aberto da Patente Coreana N.° 2004-83268). Especialmente, como o tamanho das frações PEG aumentou, um conjugado proteico tinha estabilidade no soro aumentada mas atividade gradualmente diminuída. O 17Ser-G-CSF-40K PEG mostrou uma atividade muito baixa inferior a cerca de 10% comparado com a forma nativa. Ou seja, uma vez que um conjugado proteico tem uma meia-vida no soro ampliada mas uma atividade drasticamente reduzida à medida que o peso molecular das frações de PEG aumenta, é preciso desenvolver um conjugado proteico com uma meia-vida no soro longa e atividade forte. O 17Ser-G-CSF-PEG-albumina também mostrou uma baixa atividade de cerca de 23% comparado com o G-CSF nativo. Por oposição, o 17Ser-G-CSF-PEG-Fc melhorou grandemente na atividade relativa para mais de 51% comparado com o G-CSF nativo. Destes resultads, espera-se que 17Ser-G-CSF ligado ao fragmento Fc de imunoglobulina tenha uma meia-vida no 71 soro marcadamente aumentada e uma eficácia farmacêutica in vivo grandemente melhorada. <4-4> Ensaio de neutralização de citotoxicidade para os conjugados Fab'
Foi realizado um ensaio de atividade in vivo utilizando os conjugados Fab'-S-PEG-N-Fc e Fab'-N-PEG-N-Fc preparados nos Exemplos 8 e 9 e o complexo Fab'-S-40K PEG preparado no EXEMPLO COMPARATIVO 3. Através de um ensaio de citotoxicidade baseado na medição da citotoxicidade mediada por TNFoí, os conjugados Fab' foram avaliados para determinar se neutralizam a apóptose induzida por TUFa numa linha de células de fibroblastos de ratinho, L929 (ATCC CRL-2148).
Os conjugados Fab'-S-PEG-N-Fc e Fab'-N-PEG-N-Fc e o complexo Fab'-S-40K PEG foram diluídos duas vezes em série e aliquotas de 100 μΐ foram colocadas em poços de uma placa com 96 poços. rhTNF-α (R&D systems) e actinomicina D (Sigma) utilizada como um inibidor da síntese de ARN foram adicionados a cada poço a concentrações finais de 10 ng/ml e 1 yg/ml, respetivamente, incubadas durante 30 min numa incubadora a 37 °C com 5% C02 e transferidas para uma microplaca para ensaio. Células L929 foram adicionadas a cada poço a uma densidade de 53104 células/50 μΐ meio e cultivadas durante 24 horas numa incubadora a 37 °C com 5% C02. Depois do meio de cultura ter sido removido, foi adicionado 50 μΐ de MTT (Sigma) dissolvido em PBS a uma concentração de 5 pg/ml a cada poço e as células foram cultivadas por mais cerca de 4 horas numa incubadora a 37°C com 5% C02. 150 μΐ de DMSO foi adicionado a cada poço e o grau de neutralização de citotoxicidade foi determinado medindo a absorvância a 540 nm. Como um controlo, foi utilizaod o Fab' purificado na etapa 1 do Exemplo 8.
Conforme mostrado na FIGURA 16, todos os conjugados proteicos utilizado neste teste tinham um título semelhante ao Fab'. Estes resultados indicam que, quando um conjugado 72 proteico é preparado ligando um Fc da imunoglobulina a um resíduo de cisteina livre próximo do N-terminal ou C-terminal de um Fab' através de PEG, o Fab' exibe uma meia-vida no soro marcadamente aumentada e uma atividade in vivo elevada. <4-5> Ensaio de citotoxicidade dependente do complemento (CDC)
Para determinar se os derivados preparados nos Exemplos e proteínas correspondents às regiões constantes das imunoglobulinas, expressas nos transformantes de E. coli e purificados, ligados a Clq humano, foi realizado um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) como se segue. Como grupos teste, foram utilizadas as regiões constantes das imunoglobulinas produzidas pelos transformantes HM10932 e HM10927 e os derivados preparados nos Exemplos anteriores. Como padrões, foram utilizados uma imunoglobulina glicosilada (IVIG-globulina S, Green Cross PBM) e vários anticorpos comercialmente disponíveis utilizados como anticorpos terapêuticos. As amostras teste e padrões foram preparadas em 10 mM tampão carbonato (pH 9,6) a uma concentração de 1 pg/ml. As amostras foram aliquotadas numa placa com 96 poços (Nunc) numa quantidade de 200 ng por poço e a placa foi revestida durante a noite a 4°C. Depois, cada poço foi lavado com PBS-T (137 mM NaCl, 2 mM KC1, 10 mM Na2HP04 2 mM KH2P04, 0,05% Tween 20) três vzes, bloqueado com 250 μΐ de um tampão bloqueador (1% albumina do soro bovina em PBS-T) à temperatura ambiente durante 1 hora e lavado de novo com o mesmo PBS-T três vezes. As amostras teste e padrões foram diluídas em PBS-T a uma concentração pré-determinada e adicionadas aos poços revetsidos com anticorpos e a placa foi incubada à temperatura ambiente durante 1 hora e lavada com PBS-T três vezes. Depois disso, 2 μ/ml Clq (R&D Systems) foi adicionado à placa e reagido à temperatura ambiente durante 2 horas e a placa foi lavada com PBS-T seis vezes. 200 μΐ 73 de uma diluição 1:1000 de um conjugado Clq anticorpo-peroxidase antihumano humano (Biogenesis, USA) no tampão bloqueador foi adicionado a cada poço e reagido à temperatura ambiente durante 1 hora. Depois de cada poço ter sido lavado com PBS-T três vezes, foram misturados volumes iguais de reagentes A e B de cor (cor A: peróxido estabilizado e cor B: cromogénio estabilizado; DY 999, R&D Systems) e 200 μΐ da mistura foram adicionados a cada poço, seguido de incubação durante 30 min. Depois, 50 μΐ de uma solução de terminação de reação, 2 M ácido sulfúrico, foi adicionado a cada poço. A placa foi lida utilizando um leitor de microplaca (Molecular Device). A absorvância das amostras teste e padrão foi medida a 450 nm e os resultados são dados nas FIGURAS 17 e 18, respetivamente.
Quando as subclasses de imunoglobulinas foram comparadas umas com a soutras para atividade do complemento nos seus fragmentos Fc de imunoglobulina, a afinidade de ligação mais elevada a Clq foi encontrada na imunoglobulina humana IgGl (Fitzgerald), a seguinte em IgG2 (Fitzgerald) e depois IgG4 (Fitzgerald) , o que indica que existe uma diferença entre subclasses na atividade do complemento. O IVIG utilizado neste teste, que é um conjunto de subclasses de IgG, exibiu uma afinidade de ligação ao Clq quase idêntica à IgGl purificada, porque a IgGl supera a maior parte do IVIG. Comparado com estes padrões, em relação a alterações na afinidade de ligação ao Clq por aglicosilação, o Fc de IgGl com a atividade de complemento mais forte diminuiu marcadamente quando aglicosilado. 0 Fc de IgG4, conhecido por não induzir a ativação do complemento, raramente tinha afinidade de ligação ao Clq, o que indica que o Fc de IgG4 é utilizado como veiculo recombinante excelente sem atividade de complemento (FIGURA 17) .
Para determinar se o veiculo mantém a sua propriedade de não ter afinidade de ligação ao Clq mesmo depois de ser conjugado com um péptido fisiologicamente ativo, conjugados IFN alfa-Fc foram preparados utilizando Fc glicosilado, Fc enzimaticamente deglicosilado e Fc aglicosilado recombinante como veículos de IFN alfa e foram avaliados pela sua afinidade de ligação ao Clq. Um conjugado Fc glicosilado unido ao IFN alfa (IFNa-PEG-Fc: Glicosilado IgGlFc) manteve uma elevada afinidade de ligação ao Clq. Por oposição, quando o interferão alfa foi unido a um Fc deglicosilado utilizando PNGase F e outras enzimas, o conjugado resultante (IFNa-PEG-DGFc: IgGlFc Desglicosilado) exibiu uma afinidade de ligação ao Clq marcadamente diminuída, que foi semelhante à do conjugado Fc aglicosilado derivado de E. coli. Além disso, quando a fração de IgGl do conjugado Fc aglicosilado de IgGl unido com interferão alfa (IFNa-PEG-AGFcGl: IgGlFc aglicosilado) foi trocada com a fração de IgG4, verificou-se que o conjugado interferão resultante (derivado de IFNa-PEG-FcG4 1: IgG4Fc aglicosilado) perdeu compeltamente a sua afinidade de ligação ao Clq. Quando a fração Fc de IgGl foi trocada com o monómero de Fc da IgG4, o conjugado resultante (derivado de IFNa-PEG-FcG4 2: IgG4Fc Aglicosilado). Estes resultados indicam que tais formas do fragmento Fc de IgG4 são úteis como veículos excelentes sem terem as funções efetoras de fragmentos de anticorpo (FIGURA 18).
Aplicabilidade Industrial
Conforme descrito aqui anteriormente, os fragmentos Fc de IgG da presente invenção aumentam as meias-vidas no soro dos fármacos e sustêm a atividade in vivo dos fármacos quando utilizados como veículos. Em particular, os fragmentos Fc de IgG presentes aumentam as meias-vidas no soro de fármacos polipeptídicos para níveis superiores a quaisquer proteínas convencionais modificadas e ultrapassam a desvantagem mais significativa das formulações de longa ação convencionais, títulos reduzidos, tendo, assim, um 75 tempo de circulação sanguínea e uma atividade in vivo superior à albumina, previamente conhecida como sendo a mais eficaz. Além disso, os presentes fragmentos Fc de IgG não apresentam qualquer risco de induzir respostas imunes. Devido a estas vantagens, os presentes fragmentos Fc de IgG são úteis para desenvolver os presentes fragmentos Fc de IgG de fármacos proteicos. Além disso, os presentes fragmentos Fc de IgG de fármacos proteicos de acordo com a presente invenção são capazes de reduzir a dor do paciente de injeções frequentes e manter as concentrações no soro de polipeptídeos ativos durante um período de tempo prolongado, providenciado, assim, de forma estável eficácia farmacêutica.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> HANMI PHARM. IND. CO. , LTD.
<120> FRAGMENTO Fc DE IgG PARA UM VEÍCULO DE FÁRMACO E
MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DO MESMO <150> KR 10-2003-0080299 <151> 13-11-2003 <160> 23 <170> Kopatentln 1.71 <210> 1 <211> 35
<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador 76 <4 Ο 0> 1 cgtcatgccc agcacctgag ttcctggggg gacca 35
<210> 2 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador <400> 2 gggggatcct catttaccca gagacaggga gaggctcttc tg 42
<210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 tO <210> 4 <211> 663 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 4 77 tcatgcccag cacctgagtt cctgggggga ccatcagtct tcctgttccc cccaaaaccc 60 aaggacactc tcatgatcto ccggacocct gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc 120 caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg tacgtggatg gegtggaggt gcataatgcc 180 aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 240 gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc 300 ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agagccacag 360 gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 420 ctggtcaaag gcttctaccc cagogacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 480 gagaacaacl acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 540 agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc atgctccgtg 600 atocatoara ctctgcacaa ccactacaoa cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa 660 tga 663 <210> 5 <211> 69
<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 atgãaaaaga caatcgcatt tcHcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaat 60 gcccaggco 69
<210> 6 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador <400> 6 tctattgcta caaatgccca ggccttccca accattccct tatcc 45 <210> 7 <211> 45 78
<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador <400> 7 agataacgat gtttacgggt ccggaagggt tggtaaggga atagg 45
<210> 8 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 79
Ser Cys Pro Ala Pro GIU Phe Leu Gly Gly Pro Ssr Vai Phe Leu Phe 1 5 10 15 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro GIU Vai 20 25 30 Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser Gin Glu Asp Pro Glu Vai Gln Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai Hls Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 50 Arg Glu GIU Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr 65 70 75 80 Vai Leu Hls Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai 05 90 95 Ser Asn Lys Gly 100 Leu Pro Ser Ser lie 105 Glu Lys Thr lie Ser 110 Lys Ala Lys Gly Gin 115 Pro Arg GlU Pro Gin 120 Vai Tyr Thr Leu Pro 125 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Lsu Thr Cys Leu Vai Lys Gly 130 135 140 Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 145 150 155 160 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser 165 170 175 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gln GlU 1Θ0 185 190 Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Mat Hls Glu Ala Leu Hls Asn Hls 195 200 205 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 220 <210> 9 <211> 654 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 9 80 gcacctgagl tcctgggggg accalcagtc ttcotgttcc ccccaaaacc caaggacact 60 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 120 cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 160 ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240 caggactggc tgaacggoaa ggagtacaag Igcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 300 tccatogaga aaaocatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 360 ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcclgacctg cctggtcaaa 420 ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca algggcagcc ggagaacaac 480 tacaagacca cgcctocogt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta 540 accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600 gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctctgggtaa atga 654
<210> 10 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 10 81
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai 20 25 30 Vai Vai Asp Vai Ser Gin Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 GO Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Vai. Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu Kl s 65 70 75 eo Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie Sar Lys Ala Lys Gly Gin 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met 115 120 125 Thr Ly3 Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro GlU Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Arg Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Vai 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215
<210> 11 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 11 cgccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gac 33
<210> 12 <211> 33 <212> ADN 82 <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 12 gggggatcct catttacccg gagacaggga gag 33 <210> 13 <211> 15
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thl Hls Thf Cys Pro Pro Cys Pro 15 10 15 <210> 14 <211> 660 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 14 83 ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 60 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggaogtgagc 120 cacgaagacc clgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt geataatgcc 180 aagaoaaagc cgcgggagga gcaglacaac agcacgtacc gtgtggtcag ogtcctcaco 240 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gaglacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 300 ctcccagccc ccatcgagaa aaccalctcc aaagccaaag ggcagcoccg agagccacag 360 gtglacacoc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga acoaggtcag cctgacctgc 420 ctootcaaac octtctatcc caocoacatc occgtggagt gggagagoaa tgggcagccg 460 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcett cttcctclac 540 agcaagctca ccglggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 600 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 660 660 <210> 15 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 4
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Lau Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe 1 5 10 15 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Vai 20 25 30 Thr Cys Vai Vai Vai Asp vai Ser* Hts Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe 35 40 45 Asn Tfp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai Hls Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr 65 70 75 80 Vai Leu Hls Gin Asp 85 Trp Leu Asn Gly Lys 90 Glu Tyr Lys Cys lt? Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr He Ser Lys Ala 100 105 110 Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 115 120 125 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly 130 135 140 Phe 145 Tyr Pro Ser Asp 1 te 150 Ala Vai Glu Trp Glu 155 Ser Asn Gly Gtn Pro 160 Qlli Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser 165 170 175 Ris Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 180 185 190 Gly Asn Vai Phe Ser Gys Ser Vai Met His G1U Ala Leu Hls Asn Hls 195 200 205 Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 16 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 16 cggcacctga actcctgggg ggaccg <210> 17 <211> 651 <212> ADN <213> Homo sapiens 85 <4 Ο 0> 17 gcacctgaao tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60 ctcalgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 160 ccgogggagg agcagtacaa cagoacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagco 300 cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggoagoccc gagagccaca ggtgtacacc 360 ctgcccccat cccgggatga gclgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420 ggcttcUtc ccagcgacat cgòcgtggag tgggagagca atgggcagoc ggagaacaac 480 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctccl tcttcotcta cagcaagctc 540 accgtggaca agagcaggtg geagcagggg aacgtcttct ôatgctcegt gatgcatgag 600 getctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 651
<210> 18 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 18 86
Ala Pro Gl{i Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys 15 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met I le Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai 20 25 30
Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45
Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60
Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His 65 70 - 75 80
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys 85 90 96
Ala Leu Pro Ala Pro I te Glu Lys Thr Me Ser Lys Ala Lys Gly Gin 100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 120 125
Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140
Ser Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Lau Asp Sar Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175
Tyr Ser Lys LeU Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai 160 185 190
Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin 195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215
<210> 19 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 19 cgccgtgccc agcacctccg gtggcggga 29
<210> 20 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial 87 <22 0> <223> iniciador <400> 20 gggggatcct catttacccg gagacaggga gag 33
<210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 31 u Arg Lys Cys Cys Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 22 <211> 657 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 88
Cys Cys Gly Thr Gly Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys Thr Cys 1 5 10 15 Cys Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Gly Ala Cys Cys Gly Thr Cys 20 25 30 Ala Gly Thr Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Thr Thr Cys Cys Cys Cys 35 40 45 Cys Cys Ala Ala Ala Ala Cys Cys Cys Ala Ala Gly Gly Aja Cys Ala 50 55 60 CS! Cys Cys Thr Cys Ala 70 Thr Gly Ala Thr Cys 75 Thr Cys Cys Cys Gly 80 61 y Ala Cys Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Gly Thr Cys Ala Cys Ala 85 90 95 Thr Gly Cys Gly too Thr Gly Gly Thr Gly 105 Gly Thr Gly Gly Ala 110 Cys Gly Ttir Gly Ala Gly Cys Cys Ala Cys Gly Ala Ala Gly Ala Cys Cys Cys 115 120 125 Thr Gly Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala Cys 130 135 140 Thr 145 Gly Gly Thr Ala Cys 150 Gly Thr Gly Gly Ala 155 Cys Gly Gly Cys Gly 160 Thr Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Thr Ala Ala Thr Gly Cys 1δ5 170 175 89
Cys Ala Ala Gly 180 Ala Cys Ala Ala Ala 185 Gly Cys Cys Gly Cys 180 Gly Gly Gly Ala Gly 195 Gly Ala Gly Cys Ala 200 Gly Thr Thr Thr Ala 205 Ala Cys Ala GIV Cys 210 Ala Cys Gly Thr Thr 215 Thr Cys Gly Thr Gly 220 Thr Gly Gly Thr Cys 225 Ala Gly Cys Gly Thr 230 Cys Cys Thr Cys Ala 235 Cys Cys Gly Thr Cys 240 Gly Thr Gly Cys Aia 245 Cys Cys Ala Gly Gly 250 Ala Cys Thr Gly Gly 255 Cys Thr Gly Ala Ala 260 Thr Gly Gly Cys Ala 265 Ala Cly Gly Ala Gly 270 Thr Ala Cys Ala Ala 275 Gly Thr Gly Cys Ala 280 Ala Gly Gly Thr Cys 285 Thr Cys Cys Ala Ala 290 Cys Ala Ala Ala Gly 295 Gly Cys Cys Thr Cys 300 Cys Cys Ala Gly Cys 305 Cys Cys Cys Cys Ala 310 Thr Cys Gly Ala Gly 315 Ala Ala Ala Ala Cys 320 Cys Ala Thr Cys Thr 325 Cys Cys Ala Ala Ala 330 Ala Cys Cys Ala Ala 335 Ala Gly Gly Gly Cys 340 Ala Gly Cys Cys Cys 345 Cys Gly Ala Gly Ala 350 Gly Cys Cys Ata Cys 355 Ala Gly Gly Thr Gly 360 Thr Ala Cys Ala Cys 365 Cys Cys Thr Gly Cys 370 Cys Cys Cys Cys Ala 375 Thr* Cys Cys Cys Gly 380 Gly Gly Ala Ala Gly 385 Ala Gly Ala Thr Gly 380 Ala Cys Cys Ala Ala 395 Gly Ala Ala Cys Cys 400 Ala Gly Gly Thr Cys 405 Ala Gly Cys Cys Thr 410 Gly Ala Cys Cys Thr 415 Gly Cys Cys Thr Gly 420 Cly Thr Cys Ala Ala 425 Ala Gly Gly Cys Thr 430 Thr Cys Thr Ala Thr 435 Cys Cys Cys Aia Gly 440 Cys Gly Ala Cys Ala 445 Thr Cys Gly Cys Cys 450 Gly Thr Gly Gly Ala 455 Gly Thr Gly Gly Gly 460 Ala Gly Ala Gly Cys 465 Ala Ala Thr Gly Gly 470 Gly Cys Ala Gly Cys 475 Cys Gly Gly Ala Gly 480 Ala Ala Cys Ala Ala 485 Cys Thr Ala Cys Ala 490 Ala Gly Ala Cys Cys 495 Ala Cys Gly Cys Cys 500 Thr Cys Cys Cys Ala 505 Thr Gly Cys Thr Gly 510 Gly Ala Cys Thr Cys 515 Cys Gly Ala Cys Gly 520 Gly Cys Thr Cys Cys 525 Thr Thr Cys Thr Thr 530 Cys Cys Thr Cys Thr 535 Ala Cys Ala Gly Cys 540 Ala Ata Gly Cys Thr 545 Cys Ala Cys Cys Gly 550 Thr Gly Gly Ala Cys 555 Ala Ala Gly Ala Gly 560 Cys Ala Gly Gly Thr 565 Gly Gly Cys Ala Gly 570 Cys Ala Gly Gly Gly 575 Gly 90
Ala Ala Cys Gly Thr Cys Thr Thr 580 Cys Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly 595 600 Thr Cys Thr Gly Cys Ala Cys Ala 610 615 Ala 625 Cys Gly Cys Ala Gly 630 Ala Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Cys Thr 645
Ala
Cys Thr Cys Ala Thf Gly Cys Thr 585 590
Cys Ala Thr Gly Ala Gly Gly Cys 605
Ala Cys Cys Ala Cys Thr Ala Cys 620
Gly Ala Gly Cys Cys Thr Cys Thr 635 640
Cys Gly Gly Gly Thr Ala Ala 650 655 <210> 23 <211> 219 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Vai Ala Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro 1 5 10 15 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Mel lie Ser Aro Thr Pro Glu Vai Thr 20 25 30 Cys Vai Vai Vai Asp Vai Sor Hls Glu Asp Pro GlU Vai Gin Phe Asn 35 40 45 Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai Hls Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 50 55 60 Glu Glu Gin Pha Asn Ser Thr Phe Arp Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai 65 70 75 80 Vai Hls Gin Asp Trp Lsu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser 85 90 95 Asn Lys Gly leu Pro Ala Pro 11 e Glu Lys Thr Me Ser Lys Thr Lys 100 105 110 Gly Gin Pro Aro Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 115 120 125 Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe 130 135 140 Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro GIJ 145 150 155 160 Asn Asn Tyr Lys Thr 165 Thr Pro Pro Mal Lsu 170 Asp Ser Asp Gly Ser 175 Phe Pha Lou Tyr Ser 180 Lys Leu Thr Vai Asp 185 Lys Ser Arg Trp Gin 190 Gin Gly Asn Vai Pha Ser Cys Ser Vai Met Hls Glu Ala Leu Hts Asn Hls Tyr 195 200 205 Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 91
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
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Claims (8)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um fragmento Fc como um veiculo de fármaco, em que o fragmento Fc é Fc de IgG, que está ligado covalentemente a um fármaco através de um polimero não peptidico, em que o polimero não peptidico é poli (etilenoglicol) (PEG) , em que o fármaco é um fármaco polipeptídico e o fragmento Fc não inclui um fragmento Fc com uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ. ID N.0 8 .
2. A utilização de acordo com o estabelecido na reivindicação 1, em que a IgG é IgG2 ou IgG4.
3. A utilização de acordo com o estabelecido na reivindicação 1, em que o fragmento Fc é aglicosilado.
4. A utilização de acordo com o estabelecido na reivindicação 4, em que o fragmento Fc é um fragmento Fc de IgG4 aglicosilado.
5. A utilização de acordo com o estabelecido na reivindicação 5, em que o fragmento Fc é um fragmento Fc de IgG4 aglicosilado derivado de humano.
6. A utilização de acordo com o estabelecido na reivindicação 1, em que o fragmento Fc tem uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ. ID N o 10 ou 23.
7. A utilização de acordo com O estabelecido na reivindicação 6, em que o fragmento Fc é codificado por um gene com uma sequência nucleotidica representada pela SEQ. ID N.0 9 ou 22.
8. A utilização de acordo com 0 estabelecido na reivindicação 1, em que o fragmento Fc está contido numa 2 composição farmacêutica.
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