JP2003505020A - ペプチドリガンドドメイン及び多量体化ドメインを含む融合ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、免疫グロブリン定常領域ドメイン又はロイシンジッパーのような多量体化ドメインと予定標的分子に結合するように機能するペプチドリガンドドメインを含む新規なハイブリッド分子を提供する。場合によってはハイブリッド分子は、酵素部分又は細胞障害部分のような更なる機能性部分を含む。好ましい実施態様では、ハイブリッド分子は薬物動態又は薬理特性を向上させている。更に本発明は、ハイブリッド分子の調査、診断及び治療的使用のために提供され、更にハイブリッド分子を含む医薬組成物のような組成物を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、予定標的分子と免疫グロブリン定常領域ドメイン又はロイシンジッ
パーパターンのような多量体化ドメインを結合するペプチドリガンドドメインを
含む新規な組成物に関する。場合によっては、ハイブリッド分子は、酵素部分又
は細胞障害部分のような更なる機能部分を含む。好ましい実施態様では、ハイブ
リッド分子は薬物動態又は薬理特性を改良している。更に、本発明は、ハイブリ
ッド分子の調査、診断又は治療用途を提供し、ハイブリッド分子を含む製薬組成
物のような組成物を包含する。

【０００２】 （関連した開示文献の説明） ファージディスプレイは、強制的及び非強制的なペプチドライブラリを調製す
る方法を提供する(Devlinら, (1990) Science 249:404-406; Cwirlaら, (1990)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; Lowman及びWells(1991) Methods:
Comp. to Methods Enzymol. 3:205-216; Lowman (1997) Ann. Rev. Biophys. Bi
omol. Struct. 26:401-424)。これらのライブラリは、予定標的分子を結合する
ペプチドリガンドを同定及び選択するのに使用することができる(上掲のLowman(
1997))；Clackson及びWells(1994)Trends Biotechnol. 12:173-184; 上掲のDevl
inら, (1990))。技術は、細胞標的に存在する(Arapら, (1998)Science 279:377-
380)；ＩＬ-１αの結合を阻害するヒトＩ型インターロイキン１(ＩＬ-１)レセプ
ターに結合する(Yanofskyら, (1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7381-738
6)；サイトカインエリスロポエチン(ＥＰＯ)に対するレセプターに結合及びそれ
をを活性化する(Wrightonら, (1996)Science 273:458-463)；ヒトトロンボポエ
チンレセプターに結合して、天然リガンドトロンボポエチン(ＴＰＯ)の結合と競
合する(Cwirlaら, (1996)Science, 276:1696-1699)、ペプチド修飾を同定するた
めに、又は天然タンパク質結合リガンドから親和性向上又は成熟したペプチドリ
ガンドを生成する(Lowmanら, (1991)Biochemistry 30:10832-10838)ために使用
される。

【０００３】 一価のファージディスプレイにより生成された構造的に構築されたペプチドラ
イブラリーを用いて、インシュリン様成長因子１結合タンパク質(ＩＧＦＢＰ)に
特異的に結合する１４アミノ酸ペプチドが単離された(Lowmanら, (1998)Biochem
istry, 37:8870-8878)。ペプチドはヘリックス構造を有し、インビボでＩＧＦＢ
Ｐに結合してインシュリン様成長因子-ａ(ＩＧＦ-１)活性を解放する(上掲のLow
manら(1998))。インビボでのファージ選択を利用して、ファージディスプレイは
、脳及び腎臓のような種々の器官に選択的局在化を媒介可能なペプチドを同定し
単離するために（Pasqualini及びRuoslohti (1996) Nature 380:364-366）、並
びにα_Ｖβ_３又はα_Ｖβ_５インテグリンを担持する特定の腫瘍タイプに帰着する
ペプチドを同定するために使用されている(Arapら, (1998) Science 279：377-3
80)。米国特許第5,627,263号には、α_５β_１インテグリンにより認識され、これ
と選択的に結合するペプチドが記載されている。親和性又は特異性が改善された
タンパク質の例には、ヒト成長ホルモン、Ｚｎフィンガー、プロテアーゼインヒ
ビター、ＡＮＰ、及び抗体が含まれる(Wells, J. 及びLowman H.(1992) Curr. O
pin. Struct. Biol. 2：597-604；Clackson, T.及びWells, J.(1994)Trends Bio
technol. 12：173-184；Lowmanら, (1991)Biochemistry 30(10)：832-838；Lowm
anら.及びWells J.(1993)J. Mol. Biol. 234：564-578；Dennis M.及びLazarus
R.(1994)J Biol. Chem. 269(22)：137-144)。

【０００４】 米国特許第5,336,603号には、免疫グロブリンのような血漿タンパク質と「ア
ドヘシン」の融合を記載している。アドヘシンは免疫グロブリン遺伝子スーパー
ファミリーのメンバー(Ｔ細胞抗原レセプターα、β、γ及びδ鎖のようなスー
パーファミリーの任意の高多形性メンバーを除く)に対して相同性のある細胞外
ドメインを有する細胞表面ポリペプチドとして同定される。その特許によると、
アドヘシン細胞外ドメイン、又はアドヘシン細胞外ドメインの免疫グロブリン様
ドメインは、その免疫グロブリン定常領域のＣ末端でＮ末端と融合されてもよい
。例えば、分子はそこで免疫アドヘシンと呼ばれる。特定の免疫アドヘシンは、
免疫グロブリン重鎖又は軽鎖定常ドメインのＮ末端にＣ末端を融合したＣＤ４の
少なくとも1の免疫グロブリン様又は可変(Ｖ)領域ドメインを含む融合タンパク
質含む。 米国特許第5,116,964号には、免疫グロブリンのような安定血漿タンパク質へ
の「リガンド結合パートナー」の融合を記載している。リガンド結合パートナー
は標的リガンド分子に特異的に結合する機能について知られるタンパク質として
記載される。リガンド結合パートナーは一般にレセプター、基質タンパク質、ホ
ルモン、細胞接着タンパク質、レクチン結合分子、成長因子、酵素及び栄養物質
のような分泌及び膜結合ポリペプチドとして天然に発見されている。リガンド結
合パートナーの不完全形態、例えば、膜貫通及びリガンド結合パートナーに結合
する膜の細胞質領域が欠失している、免疫グロブリン鎖に融合していることもま
た記載されている。

【０００５】 特に免疫アドヘシンは、説明され(Ashkenazi及びChamow(1997) Curr. Op. Imm
unol. 9:195-200; Chamow及びAshkenazi(1996) Trends Biotechnol. 14:52-60)
、ＣＤ４(Caponら, (1989) Nature 337:525-531; Trauneckerら, (1989) Nature
339:68-70; 及びByrnら, (1990) Nature344:667-670)；Ｌ-選択又はホーミング
レセプター(Watsonら, (1990) J. Cell. Biol. 110:2221-2229; 及びWatsonら,
(1991) Nature 349:164-167)；ＣＤ４４(Aruffoら, (1990) Cell 61:1303-1313
；ＣＤ２８及びＢ７(Linsleyら, (1991) J. Exp. Med. 173:721-730)；ＣＴＬＡ
-４(Lisleyら, J. Exp. Med. 174:561-569)；ＣＤ２２(Stamenkovicら, Cell 66
:1133-1144)；ＴＮＦレセプター(Ashkenaziら, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88:10535-10539; Lesslauerら, (1991) Eur. J. Immunol. 27:2883-2886;
及びPappelら, (1991)J. Exp. Med. 174:1483-1489)；ＮＰレセプター(Bennett
ら, (1991) J. Biol. Chem. 266:23060-23067；インターフェロンγレセプター(
Kurschnerら, (1992) J. Biol. Chem. 267:9354-9360；４−１ＢＢ(Chalupnyら,
(1992) PNAS USA 89:10306-10364)及びＩｇＥレセプターα(Ridgway及びGormen
, (1991) J. Cell. Biol. 155, Abstract No. 1448)を含む。 他には、大腸菌で安定したホモ五量体(Terskikhら, (1997) Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 94:166-3-1668)を発現する軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質(
Efimovら, (1994) FEBS Lett. 341:54-58; Tomshyら, (1996)EMBO J. 15:3507-3
514)のコイルドコイル構築ドメインとラクダＩｇＧ由来のセミリッジドヒンジ領
域により融合された短いペプチドリガンドが、記載されている。

【０００６】 （発明の概要） 本発明は、予定標的分子に結合するペプチドリガンドドメイン、及び免疫グロ
ブリン定常領域ドメイン又はロイシンジッパードメインのような多量体化ドメイ
ンを含む新規な組成物を提供する。場合によっては、ハイブリッド分子は、酵素
部分又は細胞障害部分のような更なる機能部分を含む。好ましい実施態様では、
ペプチドリガンドドメインを含むハイブリッド分子は、低用量製薬形態及び新規
の医薬組成物を提供する向上された薬物動態又は薬理特性を有する。ある実施態
様では、本発明は、ハイブリッド分子の治療用途を含む新規な組成物の使用方法
を提供する。 従って、本発明は、ペプチドリガンドドメインアミノ酸配列及び多量体化ドメ
イン配列を含むポリペプチドアミノ酸配列を提供する。ペプチドリガンドは、好
ましくは予定標的分子に結合する非自然発生アミノ酸配列である。好ましくは、
ペプチドリガンドは、約３〜約５０アミノ酸残基の間、好ましくは、約１０から
約４０アミノ酸残基の間、より好ましくは約２０から約３０アミノ酸残基の間の
非自然発生定常及び非定常アミノ酸配列である。

【０００７】 本発明によると、ペプチドリガンドドメイン配列は、場合によっては可動性の
ぺプチドリンカーにより、多量体化ドメインに結合される。多量体化ドメインは
好ましくは、免疫グロブリン配列、又は例えばロイシンジッパー配列である。本
発明のこの態様によると、免疫グロブリン配列は、好ましくは免疫グロブリンの
定常領域配列、特に免疫グロブリンの重鎖の定常領域である。本発明の好ましい
様態によれば、多量体化ドメインは、ホモ-及びヘテロ多量体組成物を提供する
ように、１又は複数のコンパニオン多量体化ドメインと対になる。本発明のこの
態様によれば、ホモ-及びヘテロ-多量体、特にホモ-及びヘテロ二量体が提供さ
れ、多量体化ドメインは、機能的免疫グロブリンＦｃドメインを提供するペアの
免疫グロブリン重鎖定常領域である。従って、ある態様によれば、本発明は、特
定の細胞タイプ、及び機能的免疫グロブリンＦｄドメインと結合してエフェクタ
ー機能をプロッセッシングする機能的免疫グロブリンＦｃドメインのような予定
標的分子に対するハイブリッド分子を標的にする機能の少なくとも１つのペプチ
ドリガンドドメイン配列を含むハイブリッド分子を提供する。

【０００８】 一実施態様では、本発明の組成物はポリペプチドであり、本発明は、本発明の
ポリペプチドをコードする単離された核酸、好ましくはＤＮＡを含む物質の組成
物を包含する。この態様によれば、本発明はさらに、ＤＮＡ分子、ＤＮＡ分子枝
を含んでなる発現ベクター、好ましくはプラスミド、に作用可能に結合する発現
コントロール配列を含み、ここでコントロール配列は、ベクター及びベクターを
形質移入した宿主細胞により認識される。好ましい態様によれば、核酸は、ペプ
チドリガンドドメイン配列及び免疫グロブリン定常領域ドメイン配列を含む。本
発明のこの態様における核酸分子は、ハイブリッド分子をコードし、ペプチドリ
ガンドドメイン配列をコードする核酸は免疫グロブリンドメイン配列に(ＤＮＡ
配列が隣接、及びリーディングフレームに在るという意味で)作用可能に結合さ
れる。場合によっては、ＤＮＡ配列は、任意のリンカードメインアミノ酸配列を
コードする核酸配列を通して結合されていてもよい。 本発明の組成物は、本発明の任意のアミノ酸配列をコードする核酸配列を単離
又は合成し、適した宿主の核酸配列を発現することのできる適した発現ベクター
に核酸配列をつなげ、発現ベクターを有する宿主を核酸配列がつながれた状態に
形質転換し、及び核酸配列の発現に適した条件下で宿主を培養する段階を含む方
法により調製されてもよく、ここでは核酸配列を選択することによりコードされ
るタンパク質は宿主に発現される。好ましくは、次いでポリペプチドは宿主細胞
培地から回収される。この方法において、核酸が適した分泌シグナルに作用可能
に連結するように、つなぐ段階は、更に適した発現ベクターに核酸をつなぐこと
が考えられ、ここではアミノ酸配列は宿主により分泌される。

【０００９】 本発明はさらに、ハイブリッド分子に結合する任意の機能性ドメインを提供す
る。任意の機能性ドメインは、酵素を結合する機能のようなハイブリッド分子に
対する更なる機能を提供する。例えば、更なる機能ドメインは、ハイブリッド分
子に共有的に結合し、プロドラッグをその更なる活性形態に変化させるようにプ
ロドラッグに作用することのできる酵素でありうる。本発明の任意の好ましい様
態による任意の機能性ドメインは、例えば共有結合によってハイブリッド分子に
結合する細胞障害剤であってもよい。好ましい細胞傷害剤は例えば、化学療法剤
、毒及び放射性同位体を含む。 本発明は更に、ここに記載される組成物の治療及び診断用途を範囲とする。従
って、本発明は製薬的に許容可能な賦形剤及び本発明のハイブリッド分子を含む
医薬組成物を含む。

【００１０】 （好ましい実施態様の詳細な説明） 定義 本発明の文脈における「ペプチドリガンド」なる用語は、特定の標的分子に結
合するように機能する非自然発生アミノ酸を指すことを意味する。本発明のペプ
チドリガンドは、一般的に束縛されている(つまり、例えばβターン又はβプリ
ーツシートを開始するアミノ酸の存在、又はジスルフィド結合したCys残基の存
在により環化したような構造のいくつかのエレメントを有している)か、又は束
縛されていない(例えば、線形)、約５０アミノ酸残基未満、好ましくは約４０ア
ミノ酸残基未満のアミノ酸配列である。約４０アミノ酸残基未満のペプチドリガ
ンドでは、好ましくは約１０〜約３０アミノ酸残基のペプチドリガンド、特に約
２０のアミノ酸残基のペプチドリガンドが好ましい。しかしながら、現在の開示
を読むと、当業者であれば、本発明のペプチドリガンドを区別するのは特定のペ
プチドリガンドの長さではなく、ＥｒｂＢ２に結合するその能力であることを認
識するであろう。よって、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３
、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４及び２
５アミノ酸残基のペプチドリガンドが、等しく有望な本発明のペプチドリガンド
である。 本発明のペプチドリガンドは、ペプチドリガンドがインビトロで、好ましくは
インビボで標的分子、例えば特定細胞型担持標的分子に「帰着する（homes）」
、「結合する」又は「標的とする」ならば、十分な親和性と特異性を持って標的
分子に結合するであろう(例えば、Pasqualini及びRuoslahti(1996) Nature, 380
：364-366、及びArapら,(1998) Science 279：377-380)における「帰着する」、
「帰着」及び「標的」という用語の使用を参照されたい)。一般的に、ペプチド
リガンドは、約１μＭ未満、好ましくは約１００ｎＭ未満、特に好ましくは約１
０ｎＭ未満の親和力で標的分子に結合する。しかしながら、標的分子に対して約
１ｎＭ未満、好ましくは約１ｐＭ〜１ｎＭの親和力を有するペプチドリガンドが
、等しく有望な本発明のペプチドリガンドである。一般に、前記のように特定の
標的分子に結合するペプチドリガンドは、ここに記載されるような多くの分野に
標準的な技術の任意のものにより単離し、同定することができる。

【００１１】 ペプチドリガンドは自然に生じた、また非自然的に生じたアミノ酸残基を含有
していてもよい上述したアミノ酸配列である。よって、特定のアミノ酸又はペプ
チドの構造を模倣した非アミノ酸化学構造を含みうる、いわゆる「ペプチド模倣
物」及び「ペプチド類似物」も本発明のペプチドリガンドとできる。このような
模倣物及び類似物は、類似の物理的特徴、例えば大きさ、電荷又はそれらの対の
ペプチドに見出されるような適切な空間的配向性で存在する疎水性を示すものと
して一般に特徴付けられる。ペプチドの模倣化合物の特定の例は、一又は複数の
アミノ酸のアミド結合が、例えば炭素-炭素結合又は当該技術でよく知られてい
る他の結合で置換された化合物である(例えば、Sawyer, Peptide Based Drug De
sign pp.378-422(ACS, Washington DC 1995)を参照のこと)。 従って、本発明における「アミノ酸」なる用語は最も広い意味に使用され、自
然に生じるＬα-アミノ酸又は残基を含むことを意味する。自然に生じるアミノ
酸に対して一般的に使用されている１文字及び３文字略号がここでも使用される
(Lehninger, A.L., Biochemistry, 第2版, pp.71-92,(1975) Worth Publishers,
New York)。この用語には、Ｄ-アミノ酸、並びに化学的に修飾されたアミノ酸
、例えばアミノ酸類似物、ノルロイシン等のタンパク質に通常導入されない自然
に生じるアミノ酸、及びアミノ酸に特徴的な当該分野において公知の特性を有す
る化学的に合成された化合物が含まれる。例えば、天然Ｐｈｅ又はＰｒｏと同じ
ペプチド化合物の配座制限を許容するフェニルアラニン又はプロリンの類似物又
は模倣物が、アミノ酸の定義に含まれる。このような類似物及び模倣物はここで
はアミノ酸の「機能的等価物」と称する。アミノ酸の他の例は、出典を明示して
ここに取り込まれるRoberts及びVellaccio(The Peptides：Analysis, Synthesis
, Biology)Eds. Gross及びMeiehofer, Vol.5 p341, Academic Press, Inc, N.Y.
1983に列挙されている。

【００１２】 例えば、標準的な固相合成法により合成されたペプチドリガンドは、遺伝子に
よりコードされるアミノ酸に限定されない。遺伝子コードによりコードされない
一般的に遭遇するアミノ酸には、例えば国際公開第９０／０１９４０号に記載さ
れているもの、例えばＧｌｕ及びＡｓｐについての２-アミノアジピン酸（Ａａ
ｄ）；Ｇｌｕ及びＡｓｐについての２-アミノピメリン酸（Ａｐｍ）；Ｍｅｔ、
Ｌｅｕ、及び他の脂肪族アミノ酸についての２-アミノブチル酸（Ａｂｕ）；Ｍ
ｅｔ、Ｌｅｕ、及び他の脂肪族アミノ酸についての２-アミノヘプタン酸（Ａｈ
ｅ）；Ｇｌｙについての２-アミノイソブチル酸（Ａｉｂ）；Ｖａｌ、及びＬｅ
ｕ及びＩｌｅについてのシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；Ａｒｇ及びＬｙｓ
についてのホモアルギニン（Ｈａｒ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓについての２
，３-ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及びＡｌａについての
Ｎ-エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及びＡｌａについてのＮ-エ
チルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ａｓｎ、及びＧｌｎについてのＮ-エチルアスパ
ラギン（ＥｔＡｓｎ）；Ｌｙｓについてのヒドロキシルリジン（Ｈｙｌ）；Ｌｙ
ｓについてのアロヒドロキシルリジン（ＡＨｙｌ）；Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、及びＴｈ
ｒについての３-(及び４)ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ）；Ｉｌｅ
、Ｌｅｕ、及びＶａｌについてのアロ-イソロイシン（ＡＩｌｅ）；Ｇｌｙ、Ｐ
ｒｏ、及びＡｌａについてのＮ-メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ、サルコシン）；
ＩｌｅについてのＮ-メチルイソロイシイン（ＭｅＩｌｅ）；Ｍｅｔ及び他の脂
肪族アミノ酸についてのノルロイシン（Ｎｌｅ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓに
ついてのオルニチン（Ｏｒｎ）；Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎについてのシトルリ
ン（Ｃｉｔ）及びメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；Ｐｈｅについてのメチル
フェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、トリメチルフェニルアラニン、ハロ（Ｆ、Ｃ
ｌ、Ｂｒ、及びＩ）フェニルアラニン、トリフルオロフェニルアラニンが含まれ
る。 本発明のペプチドリガンドは、非天然又は非天然的に生じたアミノ酸配列であ
る。非天然とは、特定のペプチドリガンドのアミノ酸配列が天然に見出されない
ことを意味する。つまり、非天然ペプチドリガンドのアミノ酸配列は、天然発生
タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列と一致しないか、または限られた
数のアミノ酸の付加、置換又は欠失に関する部位により天然発生アミノ酸配列と
異なるという意味では、天然発生アミノ酸配列「から誘導される」非天然発生ア
ミノ酸配列ではない。この多様なペプチドリガンドは、当業者によく知られてい
る種々の技術を使用して生成又は選択されうる。例えば、束縛されているか又は
束縛されていないペプチドライブラリーが無作為に作製され、当該分野で標準的
な技術を利用してファージにディスプレイする。例えば、Lowmanら, (1998) Bio
chemistry 37：8870-8878。

【００１３】 少なくとも３つの異なる種のペプチドリガンドが、特定の標的分子に結合する
機能に基づいて区別されうる。これらは、ここでは「中性」、「アゴニスト」及
び「アンタゴニスト」ペプチドリガンドと称される。一般に、中性ペプチドリガ
ンドは、上述したように特定の標的分子に結合するように機能する。中性ペプチ
ドリガンドは、標的分子を担持する特定の細胞型の、例えば細胞障害剤又は酵素
でのターゲティングが望まれる本発明の態様において好ましい。 「アゴニスト」ペプチドリガンドは、予定標的分子に結合するのに加えて、その
標的分子に直接的な影響を有する。アゴニストペプチドリガンドは、例えば特定
の細胞レセプターに結合し、レセプターに対する天然リガンドの結合に関連する
反応又は活性を開始しうる。他の例としては、アゴニストペプチドリガンドは、
特定の細胞標的分子と結合し、リン酸化のような活性化を開始しうる。対照的に
、「アンタゴニスト」ペプチドリガンドは、天然リガンドにより、結合により促
進される応答のような活性を減少又は抑制するように働き、限定するものではな
いが、ある実施態様では、天然又は天然に生じるリガンドと標的分子の結合を阻
害する。 したがって好ましい実施態様では、ペプチドリガンドは、大きさを制限され、
非天然発生アミノ酸配列に強制され、又は強制されず、場合によっては、特定の
標的分子への結合に関連する天然、アゴニスト又はアンタゴニスト活性のいずれ
かを有する。好ましいペプチドリガンドは、約５から約４０アミノ酸の間、より
好ましくは約１０から３０アミノ酸の間、さらに好ましくは約１５から２５アミ
ノ酸の間の非天然発生アミノ酸配列である。

【００１４】 好ましいペプチドリガンドの例は、例えばここで実施例の章に記載するもの、
並びに例えば： ｉ）脳及び腎臓のような様々な器官への選択的局在化を媒介することのできる
ペプチド(Pasqualini及びRuoslohti (1996) Nature 380:364-366)。しばしば、
これらのペプチドは脳に局在するペプチドに見られるSer-Arg-Leuモチーフのよ
うな優勢なアミノ酸モチーフを含む(上掲のPasqualini及びRouslahti(1996))。 ｉｉ）インテグリンのようなレセプターに関連して構造的に認識されるアミノ
酸配列を含有するペプチド。例えば、アミノ酸配列Arg-Gly-Asp(RGD)は、血小板
、内皮細胞白血球、リンパ球、単球、及び顆粒球で見られる様々なインテグリン
に結合することで知られるウィリブランド(Willibrand)因子及びトロンボスポン
ジンからの、フィブリノーゲン、フィブロネクチンのような細胞外マトリックス
タンパク質で見られる。ＲＧＤモチーフを含むペプチドは、ＲＧＤ認識インテグ
リンの活性の調節に使用することができる(Gurrathら, (1992) Eur. J. Biochem
. 210:911-921; Koivunenら, (1995) Bio/Technology 13:265-270; O’Neilら,
(1992) Proteins 14:509-515)。例えば、インビボファージ選択により同定され
るもののような腫瘍血管に特異的に存在することのできるペプチドは、ペプチド
構造に組み込まれたArg-Gly-Asp(RGD)モチーフを含み、α_ｖβ_３及びα_ｖβ_５イ
ンテグリンに特異的に結合する(Arapら, (1998) Science 279:377-380)。 ｉｉｉ）ペプチドライブラリのファージディスプレイは、例えばインシュリン
様成長因子結合タンパク質-１に結合することができ、インシュリン成長因子様
活性を生産できる高確定溶液形態を有する短いペプチドを産生している(Lowman
ら, (1998) Biochemistry 37:8870-8878)。 ｉｖ）場合によってはWrightonら, (1996) Science 273:458-463に記載される
赤血球増殖を促進するもの；又はＴＰＯ応答細胞の増殖を促進するCwirlaら, (1
997) Science 276:1696-1699に記載されるもののような完全なアゴニストペプチ
ドを含む、ＥＰＯのレセプターの様な細胞レセプターに結合して働くペプチドラ
イブラリのランダムファージディスプレイにより単離された小分子。 Ｖ）サイトカイン及びそのレセプター、例えばYanofskyら, (1996) Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 93:7381-7386に記載される高親和性型Ｉ ＩＬ-１レセプター
アンタゴニストの間の相互作用を阻害することのできるペプチド。

【００１５】 更なる例示的なペプチドエピトープは、Lowman (1997) Annu. Rev. Biophys B
iomol. Struct. 26:401-424の表１に挙げられ、そこでの開示を引用する文献に
記載され、参照によりここに取り込まれる。 本発明の中で使用される「標的分子」という用語は、タンパク質、ペプチド、
糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖、核酸等を含む。標的分
子は、例えば、これに限らないが、血清タンパク質を含む様々な血清因子、凝固
カスケードに包含される因子を含み、補体カスケード及びセリンプロテアーゼに
包含されるタンパク質のような細胞外分子を含む。本発明による標的分子はまた
、特定の細胞タイプで発現される細胞レセプター又は細胞分布(ＣＤ)抗原のよう
な細胞結合標的分子も含み、例えば： ｉ）様々なリンパ器官及び炎症を被った組織にあるリンパ球を同定しているも
ののような内皮細胞表面上の器官選択所在分子(Belivaqueら, (1989) Science,
243:1160-1165; Siegelmanら, (1989) Science 243:1165-1171; Cepekら (1994)
Nature 372:190-193及びRoseu及びBertozzi (1994) Curr. Opin. Cell Biol. 6
:663-673)。 ｉｉ）肺のような様々な器官に在る腫瘍応答性の内皮細胞マーカー(Johnsonら
, (1993) J. Cell. Biol. 121:1423-1432)。 ｉｉｉ）新生物前駆細胞又は新生物細胞の存在のマーカーとして働く腫瘍細胞
抗原又は「腫瘍抗原」。腫瘍抗原は２つの広いカテゴリー：腫瘍特異性抗原(Ｔ
ＳＡ)及び腫瘍結合抗原(ＴＡＡ)に分類される。例えばKlein, J., 1990, Immuno
logy, Blackwall Scientific Publication, Inc., Cambridge, MA, pp. 419-428
参照。

【００１６】 本発明の文脈中において使用されるところの「多量体化ドメイン」なる用語は
、直接又は「リンカードメイン」を介してペプチドリガンドが結合する分子の一
部を指すことを意味する。多量体化ドメインは、好ましい実施態様では、２又は
それ以上の多量体化ドメインの相互作用を容易にするアミノ酸ドメインである。
多量体化ドメインは２又はそれ以上の多量体化ドメインの間の相互作用を促進す
るが、本発明では、多量体化ドメインに結合するペプチドリガンドが多量体の一
部として存在している必要性はない。 本発明の好ましい態様では、多量体化ドメインは、２又はそれ以上の多量体化
ドメインの安定した相互作用を促進させるポリペプチドである。例えば、限定す
るものではないが、多量体化ドメインは免疫グロブリン配列、例えば免疫グロブ
リン定常領域、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、２又はそれ以上の
多量体化ドメイン間に分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを含有す
るポリペプチド、又は例えば米国特許第5,731,168号に記載されている「キャビ
ティ中突起（protuberance-into-cavity）」ドメインであってよい。前記特許で
は、突起は、第１ポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな
側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)で置換することにより形成される。突
起に対して同一又はより小さなサイズの相補的キャビティは、大きなアミノ酸側
鎖を小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することにより、第２
ポリペプチドの界面に任意につくり出される。

【００１７】 よって、好ましい態様では、多量体化ドメインは、モノマー性多量体ドメイン
からのダイマーと他の多量体の形成を促進させるか、これを可能にする分子の一
部を提供する。好ましくは、本発明のこの態様では、多量体化ドメインは免疫グ
ロブリンの定常領域ドメインである。免疫グロブリンの定常ドメインは、本発明
の化合物のインビボ循環半減期を改善し、場合によっては、当業者をして、以下
に記載する「エフェクター機能」を本発明の所定の態様に導入することを可能に
するという利点をもたらす。 本明細書と特許請求の範囲を通して、免疫グロブリン重鎖中の残基の番号付け
は、ここに出典を明示して取り込まれるKabat等, Sequences of Proteins of Im
munological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes
of Health, Bethesda, MD (1991)のＥＵインデックスのものである。「Kabatの
ＥＵインデックス」とはヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。 「抗体」(Ａｂ)と「免疫グロブリン」(Ｉｇ)は同じ構造的特徴を有する糖タン
パク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すものであるが、免疫
グロブリンは、抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。後者の種
類のポリペプチドは、例えばリンパ系により低レベルで、骨髄腫により増加した
レベルで産生される。

【００１８】 「抗体」及び「免疫グロブリン」は、通常は、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つ
の同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロテトラマー糖タン
パク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており
、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変
化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有して
いる。各重鎖は、カルボキシ(Ｃ)末端定常ドメインが続くアミノ(Ｎ)末端可変ド
メイン（ＶＨ）を有している。各軽鎖は可変Ｎ-末端ドメイン（ＶＬ）及びＣ-末
端定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメイン(ＣＬ)は重鎖の最初の定常ドメイン
（ＣＨ１）と整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している
。免疫グロブリンポリペプチド鎖のドメインの定義に従って、軽（Ｌ）鎖は２つ
のコンホメーション的に類似したドメインＶＬ及びＣＬを有し；重鎖は４つのド
メイン（ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有しており、これらの各々は１
つの鎖間ジスルフィド架橋を持つ。 重鎖の定常（Ｃ）ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異な
るクラスに分けることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ
、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがある。免疫グロブリンクラスはさらにサ
ブクラス(アイソタイプ)、例えばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、Ｉ
ｇＡ_１及びＩｇＡ_２に分割することができる。免疫グロブリンの異なるクラスに
対応する重鎖定常ドメインは、各々α、δ、ε、γ、及びμドメインである。任
意の脊椎動物種からの抗体の軽鎖には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づ
いて、カッパ(κ)又はラムダ(λ)と呼ばれる２つの区別される型の一つが割り当
てられる。配列の研究により、ＩｇＭのμ鎖は５つのドメインＶＨ、ＣＨμ１、
ＣＨμ２、ＣＨμ３、及びＣＨμ４を含むことが分かっている。ＩｇＥ（ε）の
重鎖も５つのドメインを含む。

【００１９】 異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元的立体配置はよ
く知られている。これらのうちＩｇＡ及びＩｇＭはポリマーであり、各サブユニ
ットは２つの軽鎖と２つの重鎖を含む。ＩｇＧ（γ）の重鎖はヒンジ領域として
知られるＣＨγ１及びＣＨγ２ドメイン間にある所定長さのポリペプチド鎖を含
む。ＩｇＡのα鎖はＯ-結合グリコシル化部位を含むヒンジ領域を有し、μ及び
ε鎖はγ及びα鎖のヒンジ領域に類似する配列は持たないが、それらは他のもの
が持たない第４の定常ドメインを含む。免疫グロブリン鎖のドメイン組成は次の
ように要約することができる。 軽鎖λ＝Ｖλ Ｃλ κ＝Ｖκ Ｃκ 重鎖 ＩｇＧ(γ)＝ＶＨ ＣＨγ１ ヒンジ ＣＨγ２ ＣＨγ３ ＩｇＭ(μ)＝ＶＨ ＣＨμ１ ＣＨμ２ ＣＨμ３ ＣＨμ４ ＩｇＡ(α)＝ＶＨ ＣＨα１ ヒンジ ＣＨα２ ＣＨα３ ＩｇＥ(ε)＝ＶＨ ＣＨε１ ＣＨε２ ＣＨε３ ＣＨε４ ＩｇＤ(δ)＝ＶＨ ＣＨδ１ ヒンジ ＣＨδ２ ＣＨδ３ ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」(「Ｃγ２」ドメインとも呼ばれる
)は通常約アミノ酸２３１から約アミノ酸３４０まで延びる。ＣＨ２ドメインは
、他のドメインと密接には対をなさないという点で独特である。むしろ、二つの
Ｎ-結合分岐炭水化物鎖が未変性の天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間
に挿入されている。 「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域における残基Ｃ-末端からＣＨ２ドメインま
での伸展(すなわち、ＩｇＧのおよそアミノ酸残基３４１からおよそアミノ酸残
基４４７まで）を含む。 「ヒンジ領域」はヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０の伸展として
一般に定義されている(Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985))。他のＩ
ｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ-Ｓ結合を形成する最初と最後のシ
ステイン残基を同じ位置に配することにより、ＩｇＧ１配列と整列させられうる
。

【００２０】 Ｆｃ領域の「低ヒンジ領域」は、通常は、Ｃ-末端からヒンジ領域、すなわち
Ｆｃ領域の２３３から２３９残基までの残基の伸展として定義されている。 抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片又は領域と呼ばれる２つの同一の抗原
結合断片を生成し、各々が単一の抗原結合部位と残りの「Ｆｃ」断片又は領域を
持つ（Ｆｉｇ．１）。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れ
ないが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常はＣｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０の
位置のアミノ酸残基からカルボキシル末端まで伸展すると定義される。免疫グロ
ブリンのＦｃ領域は、例えばＦｉｇ１に示すように、２つの定常ドメイン、ＣＨ
２及びＣＨ３を含む。「天然Ｆｃ領域配列」は天然に見出されるＦｃ領域のアミ
ノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然ヒトＦｃ領域配列をＦｉｇ２及び３
に示し、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域(非-Ａ及びＡアロタイプ)；ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領
域；ヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域；及びヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域、並びに自然に生じるそ
の変異体を含むが、それらに限定されるものではない。天然マウスＦｃ領域配列
をＦｉｇ２Ａに示す。 ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、さらに抗原を架橋させ得る
Ｆ(ａｂ')_２断片が得られる。またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の
第１定常ドメイン(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一
又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基
が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシ
ステイン残基が遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名で
ある。Ｆ(ａｂ')_２抗体フラグメントは、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'
断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合も知られている。

【００２１】 「機能的なＦｃ領域」は、天然のＦｃ領域の「エフェクター機能」を保持する
。例示的な「エフェクター機能」は、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞障害活性；Ｆ
ｃレセプター結合、抗体依存性細胞媒介細胞障害活性(ＡＤＣＣ)；貪食作用、細
胞表面レセプター（すなわち、Ｂ細胞レセプター；ＢＣＲ）の低減下を含む。こ
のようなエフェクターの機能は、一般に、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えばペプ
チドリガンド）に結合するのに必要とされており、当該技術で公知の様々なアッ
セイを用いることで評価される。 抗体Ｆｃ領域に媒介されるエフェクター機能は、２つのカテゴリー：(１)抗原
に対する抗体の結合の後に作用するエフェクター機能(これらの機能は、補体カ
スケード又はＦｃレセプター(ＦｃＲ)-支持細胞の特性を含む)；及び(２)独立し
て抗原結合の作用をするエフェクター機能(これらの機能は、循環での持続性及
び経細胞輸送により細胞バリアーを越えて移動する能力を与える)。Ward及びGhe
ite, (1995) Therapeutic Immunology 2:77-94。 親又は天然Ｆｃ領域に適当なアミノ酸修飾を導入することにより、（ａ）ヒト
エフェクター細胞の存在下で抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）をより効
果的に媒介する、及び／又は（ｂ）親ポリペプチドよりも、より強い親和性でＦ
ｃガンマレセプター（ＦｃγＲ）と結合するような、Ｆｃ領域の変異体を作製す
ることができる。そのようなＦｃ領域の変異体は、一般に、少なくとも１つのア
ミノ酸修飾をＦｃ領域に含むであろう。Ｆｃ領域の変異体は、２，３，４，５個
所等の置換を含み得る(1997年7月15日公開の米国特許第5,648,260号及び1997年4
月29日公開の米国特許第5,624,821号)。

【００２２】 いくつかの抗体のエフェクター機能は、抗体のＦｃ領域に結合するＦｃレセプ
ター（ＦｃＲｓ）によって媒介される。ＦｃＲｓは、免疫グロブリンアイソタイ
プに対する特異性により定義され；ＩｇＧ抗体に対するＦｃレセプターはＦｃγ
Ｒと、ＩｇＥに対してはＦｃεＲと、ＩｇＡに対してはＦｃαＲなどのように呼
ばれている。ＦｃγＲの３つのサブタイプは同定されており：ＦｃγＲＩ（ＣＤ
６４），ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）である。そ
れぞれのＦｃγＲサブクラスは、２または３つの遺伝子によってコードされてお
り、またＲＮＡスプライシングにより複数の転写産物が生じるため、ＦｃγＲア
イソフォームには広い多様性が存在する。これらの異なるＦｃＲサブタイプは異
なる型の細胞上で発現されている（Ravetch and Kinet, Annu.Rev.immunol. 9:4
57-492 (1991)）。例えばヒトにおいて、ＦｃγＲＩＩＩＢは好中球上にのみ見
出され、ＦｃγＲＩＩＩＡはマクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞（Ｎ
Ｋ細胞）、ある種のＴ細胞上に見出される。特に、ＦｃγＲＩＩＩＡは、ＡＤＣ
Ｃに関係する細胞型であるＮＫ細胞上に存在する唯一のＦｃγＲである。 ＦｃγＲに対するヒトおよびマウス抗体上の結合部位は、これまでに低ヒンジ
領域(２３３-２３８残基：Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological
Interest, 5th ED. Public health Service, National Institutes of Health,
Bethesda, MD. (1991) におけるようなＥＵインデックス番号付け）にマッピン
グされている。Woofら Molec. Immunol. 23:319-330(1986); Duncanら Nature 3
32:563 (1988); Canfield及びMorrison, J. Exp. Med. 173:1483-1491 (1991);
Canppelら, Proc.Natl.Acad.Sci USA 88:9036-9040 (1991)。

【００２３】 「Ｃ１ｑ」は免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合部位を含むポリペプチド
である。Ｃ１ｑは２つのセリンプロテアーゼＣ１ｒ及びＣ１ｓと共に、補体依存
性細胞障害(ＣＤＣ)経路の最初の成分である複合体Ｃ１を形成する。 「抗体依存性細胞媒介細胞障害」及び「ＡＤＣＣ」は、細胞が媒介する反応で
あって、ＦｃＲｓを発現する非特異的障害細胞（例えば、ナチュラルキラー（Ｎ
Ｋ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞上に結合した抗体を認識
して、続いて標的細胞の溶解を引き起こす反応を意味する。ＡＤＣＣを媒介する
主要な細胞である、ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球は
、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞における
ＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の
４６４頁の表３に要約されている。 ここで使用される場合、「サルベージレセプター結合リガンド」という用語は
、ＩｇＧ分子のインビボでの血清半減期を増加させる原因となるＩｇ分子(例え
ばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３又はＩｇＧ_４)のＦｃ領域のリガンドを意味す
る。 「治療」とは、治療的処置及び予防又は防止手段の両方を指す。治療の必要が
あるものには、既に羅患しているもの、並びに疾患が予防されるべきものが含ま
れる。 治療の目的とされる「哺乳動物」とは、ヒト、家庭又は農場用動物、及び動物
園、スポーツ又はペット用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む、哺乳
動物に分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは哺乳動物はヒトである。

【００２４】 「疾患」は本発明のペプチドリガンドを含有する組成物で治療することで恩恵
を得るあらゆる症状のことである。これには、問題の疾患に哺乳動物を罹患させ
る素因になる病理状態を含む、慢性及び急性の疾患又は病気が含まれる。 ここで治療される疾患の例は、これに限定されるものではないが、良性及び悪
性の腫瘍；白血病及びリンパ悪性腫瘍；ニューロン、神経膠、星状細胞、視床下
部及び他の腺、マクロファージ、上皮、ストローマ及び割腔の疾患；及び炎症、
血管形成及び免疫性疾患が含まれる。 「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長により特
徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を意味するか記述するものである
。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫
、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定な例には、扁平上皮細
胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌
、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、
唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な種類
の頭部及び頸部の癌が含まれる。

【００２５】 ここで使用されるように、「肺投与」という用語は、吸入により肺を通しての
本発明の製品の投与を意味する。ここで使用されるように、「吸入」という用語
は、肺胞への気体の吸気を意味する。特定の実施態様では、取り込みは、本発明
の製品をの自己投与により、又は、例えばレスピレータを使用する患者に対して
のレスピレータによる投与により生じうる。本発明の製品に関して使用される「
吸入」という用語は、「肺投与」と同義である。 ここで使用される場合、「非経口」なる用語は、腸以外によって、特に静脈内
(i.v.)、動脈内(i.a.)、腹膜内(i.p.)、筋肉内(i.m.)、心室内及び皮下(s.c.)経
路で本発明の化合物を導入することを意味する。 ここで使用されるように、「エアロゾル」という用語は、気体のサスペンショ
ンを意味する。特に、エアロゾルは、本発明の製品の粒子化及び気体へのそのサ
スペンションに関する。本発明によれば、エアロゾル製品は、エアロゾル化に適
した本発明の化合物、例えば吸入又は肺投与のための粒子化及び気体へのサスペ
ンションを含む製品である。

【００２６】 （発明の実施の方法） 本発明のハイブリッド分子は少なくとも２つの識別可能なドメインを含む。本
発明のそれぞれの分子は、ペプチドリガンドドメイン及び多量体化ドメインを含
む。本発明によれば、ペプチドリガンドドメインは、場合によっては適応性のあ
るアミノ酸リンカードメインによる、免疫Ｆｃ領域の様な多量体化ドメインに結
合される。 ペプチドリガンドの組み合わせ

【００２７】 Ａ．多量体化ドメイン 本発明のハイブリッド分子は適切な多量体化ドメインにペプチドリガンドを組
み合わせることにより構築される。ペプチドリガンドのタイプ及びその調製方法
によれば、ペプチドリガンドは多量体化ドメインの末端又はＣ-末端への末端又
はＣ-末端により加えられうる。例えば、組換え技術により本発明のハイブリッ
ド分子を調製する場合、場合によっては金貨ードメインによって、ペプチドリガ
ンドをコード化する核酸は多量体化ドメイン配列をコード化する核酸に作用可能
に結合される。典型的には、作成物は、ペプチドリガンドのＣ末端が多量体化ド
メインのＮ末端又はＣ末端、好ましくはＣ末端に結合されている融合タンパク質
をコードしている。しかし、ペプチドリガンドのＮ末端が多量体化ドメインのＮ
末端又はＣ末端に結合されている融合体もまた可能である。 好適な多量体化ドメインは免疫グロブリンの定常領域配列である。典型的には
、そのような融合体では、コードされたハイブリッド分子は免疫グロブリン重鎖
の定常領域の少なくとも機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保
持しているであろう。融合体はまた例えば定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端、又
は重鎖のＣＨ１の直ぐ近くのＮ末端又は軽鎖の対応する領域に対して生成される
。

【００２８】 免疫グロブリン定常ドメインへのペプチドリガンドの融合がなされる正確なア
ミノ酸部位は重要ではない；特定の部位はよく知られており、生物学的活性、分
泌又は結合特性を最適化するために選択することができる。この点に関して、当
業者は文献（米国特許第５１１６９６４号、同第５７１４１４７号及び同第５３
３６６０３号；Caponら、(1989) Nature 337:525-531; Trauneckerら, (1989) N
ature 339:68-70;及びByrnら, (1990) Nature 344:667-670; Watsonら, (1990)
J. Cell. Biol. 110:2221-2229; Watsonら, (1991) Nature 349:164-167; Aruff
oら, (1990) Cell 61:1303-1313; Linsleyら, (1991) J. Exp. Med. 173:721-73
0; Lisleyら, J. Exp. Med. 174:561-569; Stamenkovicら, Cell 66:1133-1144;
Ashkenaziら, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539; Lesslaie
rら, (1991) Eur. J. Immunol. 27:2883-2886; 及びPeppelら, (1991) J. Exp.
Med. 174:1483-1489; Mohlerら, (1993) J. Immunol. 151:1548-1561; Bennett
ら, (1991) J. Biol. Chem. 266:23060-23067; Kurschnerら, (1992) J. Biol.
Chem. 267:9354-9360; Chalupnyら, (1992) PNAS USA 89:10360-10364; Ridgway
及びGorman, (1991) J. Cell. Biol. 115, Abstract No. 1448）に記載された様
々なイムノアドヘシンの構築を参考にすることができる。

【００２９】 特定の側面では、免疫グロブリンタイプの多量体化ドメインは機能性Ｆｃドメ
インを有するダイマーのような多量体を提供するように選択される。好適な側面
では、多量体化ドメインは天然の免疫グロブリンＦｃ領域に伴うエフェクター機
能を有しているＦｃドメインを提供するように選択される。従って、ペプチドリ
ガンドは、特定の側面では、特定のエフェクター機能又は機能群に対して選択さ
れた機能性Ｆｃドメインを有する多量体を提供する免疫グロブリン重鎖定常ドメ
インに結合される。この場合、免疫グロブリン鎖−ペプチドリガンド配列をコー
ドするＤＮＡは典型的には第二のペプチドリガンド−免疫グロブリン重鎖融合タ
ンパク質をコードするＤＮＡと同時発現される。分泌の際、ハイブリッド重鎖は
二つのジスルフィド結合免疫グロブリン重鎖を有する免疫グロブリン様構造を提
供するように共有結合的に結合される。当業者であれば、エフェクター機能には
、例えばＣ１ｑ結合；補体依存性細胞毒素；Ｆｃレセプター結合；抗体依存細胞
性細胞毒素（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；及びサルベージレセプター結合
リガンドの導入による半減期の延長と細胞表面レセプター（例えばＢ細胞レセプ
ター；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションで、例えば1998年4月14日に発行され
た米国特許第5,739,277号にされたようなものが含まれることを認識するであろ
う。 好ましくは、Ｆｃ領域はヒトＦｃ領域、例えば天然配列ヒトＦｃ領域ヒトＩｇ
Ｇ１（Ａ及び非Ａアロタイプ）、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域で
ある。そのような配列は図２及び３に示されている。

【００３０】 また、親Ｆｃ領域に適当なアミノ酸配列の修飾を導入することにより、（ａ）
ヒトエフェクター細胞の存在下で抗体依存細胞性細胞毒素（ＡＤＣＣ）を媒介し
、及び／又は（ｂ）天然配列よりも良好な親和性でＦｃガンマレセプター（Ｆｃ
（Ｒ））に結合する変異体Ｆｃ領域をつくり出すことができる。そのようなＦｃ
領域変異体は一般にＦｃ領域に少なくとも一つのアミノ酸の修飾を含んでいる。 好適な実施態様では、ペプチドリガンド配列は免疫グロブリンＧ、ある実施態
様ではＩｇＧ１のＦｃ領域のＮ末端に融合している。ペプチドリガンド配列に重
鎖定常領域の全体を融合させることが可能である。しかし、より好ましくは、Ｉ
ｇＧのＦｃを化学的に定めるパパイン切断部位（すなわち、重鎖定常領域の最初
の残基を１１４であるとして、残基２１６）、又は他の免疫グロブリンの類似部
位の丁度上流のヒンジ領域で始まる配列が融合に使用される。特定の好適な実施
態様では、ペプチドリガンドアミノ酸配列はＩｇＧ重鎖の（ａ）ヒンジ領域（又
は他のリンカードメイン）及びＣＨ２及びＣＨ３又は（ｂ）ＣＨ１、ヒンジ、Ｃ
Ｈ２及びＣＨ３ドメインに融合している。

【００３１】 この実施態様の特定の側面では、ペプチドリガンドと多量体化ドメインを含む
ハイブリッド分子が多量体、例えばホモダイマー、又はヘテロダイマーあるいは
ヘテロテトラマーとしてでさえ構築される。ホモダイマーはペプチドリガンドと
多量体化ドメインを含む二つのモノマーの対合又は架橋から生じる。しかし、二
つの同一のモノマー対は必須ではない。本発明の特定の側面では、免疫グロブリ
ン定常ドメインのような多量体化ドメインとペプチドリガンドを含むここに記載
したハイブリッド分子は免疫グロブリンの一つのアームを含む対の他方の免疫グ
ロブリンと対合しうる。本発明の範囲に入る様々な例示的構築ハイブリッド分子
は以下に概略的に模式化される： （ａ）ＡＣＨ （ｂ）ＡＣＨ−ＡＣＨ （ｃ）ＡＣＨ−ＶＨＣＨ−ＶＬＣＬ （ｄ）ＡＣＨ−ＶＨＣＨ ここで、Ａはそれぞれ同一の又は異なるペプチドリガンドを表し； ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり； ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり； ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、及び ＣＨは免疫グロブリン重鎖定常ドメインである。 簡略にするために、上記の構造はキーとなる特徴のみを示している；上記構造
は以下に記載されるような多量体化ドメインとペプチドリガンドドメインの間に
任意のリンカードメインを示していない；上記構造は免疫グロブリンのジョイニ
ング、ヒンジ又は他のドメインを示していないし、ジスルフィド結合も示してい
ない。

【００３２】 免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のハイブリッド分子に必要とされていない
けれども、免疫グロブリン軽鎖はペプチドリガンド−免疫グロブリン重鎖融合ポ
リペプチドに共有結合的に結合するか、ペプチドリガンドに直接融合するかして
、存在しているかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードしてい
るＤＮＡは典型的にはペプチドリガンド−免疫グロブリン重鎖融合タンパク質と
同時発現される。分泌の際、ハイブリッド重鎖及び軽鎖は二つのジスルフィド結
合免疫グロブリン重鎖−軽鎖対を含む免疫グロブリン様構造を提供するように共
有結合的に結合する。 ここに記載されたハイブリッド分子は免疫グロブリンｃＤＮＡ配列に読み枠を
一致させてペプチドリガンド部分をコードするｃＤＮＡ配列を融合させることに
より最も簡便に構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合体もま
た使用できる（Aruffoら, (1990), Cell 61:1303-1313;及びStamenkovicら, (19
91), Cell 66:1133-1144）。後者のタイプの融合体は発現のためにＩｇ調節配列
の存在を必要とする。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡは、ハイブリダ
イゼーション又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって脾臓又は末梢血リ
ンパ球から取り出されたｃＤＮＡライブラリーから発表された配列に基づいて単
離できる。ハイブリッド分子のペプチドリガンドと免疫グロブリン部分をコード
しているｃＤＮＡは、選択された宿主細胞において効果的な発現をさせるプラス
ミドベクターにタンデムに挿入される。

【００３３】 あるいは、特にペプチドリガンドが例えば標準的な固相合成法によって合成さ
れる実施態様では、ペプチドリガンドは当業者によく知られた様々な手段の任意
のものによって多量体化ドメインに結合されうる。共有結合的接合が典型的には
最も簡便であるが、他の形態の接合も用途に応じて用いることができる。共有結
合的な接合の好適な形態の例には、多量体化ドメインのアミノ酸側鎖と活性化さ
れた化学基を持つ分子の反応により生じる結合が含まれ、様々な二官能性タンパ
ク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルチオール)プ
ロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性
誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベ
リン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビ
スアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-
ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジア
ミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二
活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用
して作製することができる。

【００３４】 Ｂ．リンカードメイン 本発明では、ペプチドリガンドドメインは、任意には、例えば他のペプチドリ
ガンドドメインに又は柔軟なペプチドリンカーを経由して多量体化ドメインに結
合される。本発明のハイブリッド分子のリンカー成分はハイブリッド分子の機能
に必ずしも関与しないが寄与しうる。従って、本発明では、リンカードメインは
、二以上のペプチドリガンドドメイン又はペプチドリガンドドメインと多量体化
ドメインの間に空間的ブリッジを提供する任意の分子群である。 リンカードメインは可変の長さ及び構造とできる。一般には、重要であるのは
、リンカードメインにより引き起こされる配向であり、その化学構造ではない。
リンカードメインは、好ましくは、配位ＥｒｂＢ２分子に対する空間的／立体配
置的制約を実質的に生じないで、ハイブリッド分子のペプチドリガンドドメイン
を結合させない。従って、リンカードメインの長さは、ハイブリッド分子の例え
ばペプチドリガンドと多量体化ドメインの二つの機能の性質に依存する。 当業者であれば、原子の様々な組み合わせが様々な結合間の既知の距離に基づ
いて可変長さの分子を提供することが分かるであろう（Morrison及びBoyd, Orga
nic Chemistry, 3版, Allyn及びBacon, Inc., Boston, MA (1977)）。例えば、
リンカードメインは可変長さのポリペプチドでありうる。ポリペプチドのアミノ
酸組成がリンカーの性質と長さを決定する。ポリペプチド鎖において、例えばリ
ンカードメインは、例えばここでの実施例の章に記載されるもののように１又は
複数のＧｌｙ及び又はＳｅｒ残基を含む。

【００３５】 Ｃ．二重特異性結合 本発明のある側面では、少なくとも一つのペプチドリガンドドメインを含む二又
は二重特異的組成物が考えられる。例えば、二重特異性抗体組成物はロイシンジ
ッパーを使用して生産されている（Kostelnyら, (1992) J.Immunol., 148(5):15
47-1553)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝
子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマ
ーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再び酸化して抗体ヘテロダ
イマーを形成する。この方法はまた抗体ヘテロダイマーの結合ドメインの代わり
にペプチドリガンドを使用するペプチドリガンドホモダイマー及びヘテロダイマ
ーの生産に対して使用することができる。

【００３６】 有用性 一般的にいうと、本発明のペプチドリガンド及びそれらの機能性誘導体を含む
含むハイブリッド分子は、例えばペプチドリガンドが使用されうるのと同等の用
途に使用できる。一般に、ペプチドリガンドドメインの機能は、その用途を決め
られている。例えば、ペプチドリガンドは、ハイブリッド分子並びに任意の更な
る機能部分、例えば標的分子を有する特定の細胞タイプに対する細胞障害部分を
標的としうる。しかし、本発明のこの態様による一実施例として、ペプチドリガ
ンドは実施例の章に記載されるようにＥｒｂＢ２に結合できる。この実施態様に
よれば、ハイブリッド分子は、インビボのＥｒｂＢ２保持細胞タイプが在るか又
は標的とする。ハイブリッド分子は、機能的Ｆｃドメインを有するホモ二量体と
して本発明のこの様態により使用されうる。ＥｒｂＢ２特異性ハイブリッド分子
はここで以下に記載されるもののような更なる機能性部分を含む。 更なる実施例としての、ペプチドリガンドは結合して特定の標的分子と関連す
る活性を抑制する。例えば、ペプチドリガンドは、因子Ｘの活性かのような因子
ＶＩＩ又は因子ＦＶＩＩａに関連する活性を明らかに減少させるように導く凝固
カスケードに含まれる因子ＶＩＩ又は因子ＦＶＩＩａの様なセリンプロテアーゼ
に結合しうる。 もちろん、本発明のいくつかのハイブリッド分子は他の用途よりも特定の用途
により適している場合がある。当業者であれば、ペプチドリガンド又はハイブリ
ッド分子の生物活性を決定する一又は複数の一般的な生物学的アッセイを使用す
ることによって与えられた用途にどの分子が適しているかを容易に確認できるで
あろう。

【００３７】 Ａ．エフェクター機能技術 その使用によれば、エフェクター機能に関する本発明のハイブリッド分子の多
量体化ドメインを修飾することが望ましい。技術者は、Ｆｃドメインと結合する
エフェクター機能を使用するために、又は欠落した又は減少したエフェクター機
能を有するＦｃドメインを選択又は設計するために適切な用途を決定できる。 特定の実施態様では腫瘍結合抗原を標的とするハイブリッド分子の効果は、例
えば腫瘍治療における機能的Ｆｃドメインの使用により促進されうる。例えば、
システイン残基を免疫グロブリンＦｃ領域に導入して、この領域における鎖間ジ
スルフィド結合の形成を可能にする。このようにして産生されたホモ又はヘテロ
ダイマーハイブリッド分子は改善されたインターナリゼーション能力及び／又は
増加した補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)を有しうる。
Caronら, (1992) J. Exp. Med. 176:1191-1195及びShopes, B. (1992) J. Immun
ol. 148:2918-2922を参照されたい。抗腫瘍活性が高められたホモダイマーハイ
ブリッド分子は、Wolffら, (1993) Cancer Research 53:2560-2565に記載されて
いるようなヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。 別法として、二重Ｆｃ領域を有し、よって増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能
を有しうるヘテロダイマーハイブリッド分子を設計することができる。Stevenso
nら (1989) Anti-Cancer Drug Design 3:219-230を参照されたい。

【００３８】 Ｂ．細胞障害コンジュゲート また本発明は、細胞障害剤、例えば化学療法剤、例えばタンパク質毒素もしく
は細胞障害性薬物もしくは毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素
活性毒又はそれらの断片)、又は放射性アイソトープ(すなわち、放射性コンジュ
ゲート)に結合したここに記載の任意のハイブリッド分子又はペプチドリガンド
を含有するコンジュゲートにも関する。 このような免疫コンジュゲートの生成に有用な化学療法剤は上述した。化学療
法剤は、悪性腫瘍、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病を含む癌の治療に有用
な化合物である。化学療法剤の例には、カリケアマイシンのような微生物から単
離された抗生物質（Leeら, (1987) J. Am. Chem. Soc. 109:3464-3466; Hinman
ら, (1993) Cancer Res. 53:3336-3342）、メイタンシノイド（例えば、Liuら,
(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8323に記載されているもの）、ア
ドリアマイシン、ドキソルビシン、５-フルオロウラシル、シトシンアラビノシ
ド、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソール
、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマ
イシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、
ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン
、カルミノマイシン(Carminomydcin)、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マ
イトマイシン、ニコチンアミド、エスペラミシン、メルファラン、及び他の関連
したナイトロジェンマスタード、及びエンドクリン治療薬（例えば、ジエチルス
チルベストロール、タモキシフェン、ＬＨＲＨ-拮抗薬、プロゲスチン、抗プロ
ゲスチン等々）が含まれる。 使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の
非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas
aeruginosa)由来)、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アル
ファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロ
テイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phyto
laca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディ
カ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、ク
ロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gel
onin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノ
マイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。

【００３９】 種々の放射性核種も放射性コンジュゲートペプチドリガンド又はハイブリッド
分子の生産に利用できる。例としては^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９０ Ｙ及び^１８６Ｒｅが含まれる。炭素-１４標識された１-イソチオシアナトベンジ
ル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）はハイブリッド分
子へ放射性ヌクレオチドを結合させるためのキレート剤の例である。 ペプチドリガンド又はハイブリッド分子と細胞障害剤のコンジュゲートは、様
々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-
ピリジルチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミド
エステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エス
テル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グル
タルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキ
サンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベン
ゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソ
シアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニ
トロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、V
itettaら, (1987) Science 238:1098に記載されているようにして調製すること
ができる。 他の実施態様では、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプタ
ー」(例えばストレプトアビジン)にペプチドリガンド又はハイブリッド分子が結
合され、ペプチドリガンド又はハイブリッド分子-レセプターコンジュゲートが
患者に投与され、続いてキレート剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートが
除去され、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)に結合された「リガンド」(
例えばアビジン)が投与される。

【００４０】 Ｃ．リポソーム ここで開示されているハイブリッド分子又はペプチドリガンドはまた、リポソ
ームとして処方することもできる。ハイブリッド分子を含むリポソームは、例え
ばEpsteinら, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688；Hwangら, (1980)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030；及び米国特許第4,485,045号及び同4,54
4,545号に記載されているように、当該分野において知られている方法により調
製される。循環時間を増加したリポソームは米国特許第5,013,556号に開示され
ている。 特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ
-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含有する脂質組成物
を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められ
たフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。
例えば、ここに記載されたような免疫グロブリン定常ドメインを有するハイブリ
ッド分子は、ジスルフィド交換反応を介して、Martinら,J. Biol. Chem. 257:28
6-288(1982)に記載されているようにしてリポソームに結合させることができる
。場合によっては、化学療法剤はリポソーム内に包含される。Gabizonら, J. Na
tional Cancer Inst. 81(19)1484(1989)参照。

【００４１】 Ｄ．酵素媒介性プロドラッグ治療法 また、本発明のペプチドリガンド又はハイブリッド分子は、プロドラッグ(例
えばペプチジル化学療法剤、国際公開81/01145号を参照)を活性な抗癌剤に転化
させるプロドラッグ活性化酵素にペプチドリガンド又はハイブリッド分子をコン
ジュゲートさせることにより、適した標的分子を持った特定の細胞タイプに対し
て、ハイブリッド分子と結合する酵素部分を標的とするのに使用することもでき
る。例えば国際公開88/07378号及び米国特許第4,975,278号参照。 利用される免疫コンジュゲートの酵素成分は、抗体依存性酵素媒介プロドラッ
グ治療法(ＡＤＥＰＴ)に適したものであり、より活性な細胞毒形態に転化するよ
うに、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。限定するものではない
が、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の
薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロド
ラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-
フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに転化するのに有用なシトシン
デアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サ
ブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及
びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なもの；
Ｄ-アミノ酸置換基を含むプロドラッグの転化に有用なＤ-アラニルカルボキシペ
プチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤
に転化するのに有用なβガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼ；βラクタムで
誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用なβラクタマーゼ；及び
ペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチ
ル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化
するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる
。あるいは、「アブザイム」としてもまた当該分野で知られている酵素活性を有
する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるために使用す
ることもできる(例えば、Massey, (1987) Nature 328:457-458を参照)。ペプチ
ドリガンド／ハイブリッド分子-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載され
ているようにして、腫瘍細胞集団にアブザイムを送達するために調製することが
できる。 酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ
二官能性架橋試薬を使用することにより、ハイブリッド分子に共有的に結合させ
ることができる。あるいは、本発明のハイブリッド分子の少なくともペプチドリ
ガンド部分を含む融合タンパク質を、当該分野においてよく知られている組換え
ＤＮＡ技術を使用して作成することができる(Neubergerら, (1984) Nature 312:
604-608参照)。

【００４２】 Ｅ．医薬組成物 本発明のハイブリッド分子を含有する医薬組成物は、腸管外、局所、経口又は
局部的（エアロゾル又は経皮など）又はその任意の組み合わせを含む任意の適切
な形で投与されうる。好適な療法にはまた、静脈内ボーラス注射による最初の投
与に続いて一又は複数のインターバルで繰り返し投与を行うことが含まれる。 本発明の他の適した組成物は、製薬的に許容される担体を有する前記組成物の
任意のものからなるが、担体の性質は投与方式によって異なり、例えば経口投与
では通常固体担体が用いられ、Ｉ.Ｖ.投与では液体塩溶液担体である。 本発明の組成物は、患者及び本発明の組成物のタンパク質に適合する製薬的に
許容される成分を含む。これらは一般に懸濁物、溶液及びエリキシル剤、特にリ
ン酸緩衝塩水、塩水、ダルベッコの媒質などの生物学的バッファーを含む。エア
ロゾル、又はデンプン、糖、微結晶セルロース、希釈剤、顆粒化剤、潤滑剤、結
合剤、崩壊剤、等（経口固体調製物の場合、粉末、カプセル、及び錠剤）の担体
を用いてもよい。 ここで用いられる「製薬的に許容される」という用語は、好ましくは合衆国政
府又は州政府の監督官庁に許可されたこと、あるいは合衆国薬局方又は他の一般
に認められた薬局方に動物、特にヒトでの使用のために列挙されたことを意味す
る。

【００４３】 製剤の選択は、上記のバッファー、又は例えば製薬級のマンニトール、ラクト
ース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンセルロースナトリウム
、炭酸マグネシウム、等を含む賦形剤の種々のものを用いてなすことができる。
組成物の「ペグレーション(PEGlation)」は、この分野で知られた技術を用いて
実施してよい（例えば、国際特許公報番号WO92/16555、Enzonの米国特許第5,122
,614号、及び国際特許公報番号WO92/00748を参照）。 本発明の投与の好ましい経路は、エアロゾル又は吸入の形態である。本発明の
組成物は、分散剤と混合され、乾燥粉末のようなエアロゾル形態で、あるいは溶
液又は希釈液のような懸濁液として投与することができる。 ここで使用する用語「分散剤」とは、化合物のエアロゾル化又は肺組織でのタ
ンパク質の吸収、又は両方を助ける薬剤を意味する。好ましくは分散剤は製薬的
に許容可能である。ここで使用する用語「製薬的に許容される」とは、一般的に
、連邦または州政府の規制当局に承認されたもの又は米国薬局方又は動物、特に
ヒトに使用するための他の一般に認められた薬局方に列挙されているものを意味
する。適した分散剤は、当該分野にてよく知られ、これに限らないが界面活性剤
等を含む。例えば、液体エアロゾルを形成する溶液の噴霧化によって生じる表面
に発生する化合物、特にペプチド化合物の凝集を減少させるために、当該分野で
一般的に使用される界面仮性剤が使用されうる。限定しないが、このような界面
活性剤の例は、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル類及びアルコール類、及びポ
リオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである。使用される界面活性剤の量
は様々で、一般に製剤の０．００１から４重量％の範囲であろう。特定の様態で
は、界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート又はソルビタン
トリオレアートである。適した界面活性剤は当該分野でよく知られ、特定の処方
、化合物の濃度、希釈剤(液体形態の場合)又は粉末の形態(乾燥粉末の製剤の場
合)等により、所望の特性をもとに選択することができる。

【００４４】 更に、ペプチドリガンドの選択、所望の治療効果、肺組織の性質(例えば、病
気の又は健康な肺)、及び多くの他の要因によって、液体又は乾燥製剤は更に以
下に記載されるような更なる成分を含む。 一般に液体エアロゾル製剤は、製薬的に許容可能な希釈剤にペプチドリガンド
及び分散剤を含む。本発明の乾燥粉末エアロゾル製剤は、ペプチドリガンド及び
分散剤の細かく分離した固形からなる。液体又は乾燥粉末エアロゾル製剤のどち
らかを用いて、製品はエアロゾル化されなければならない。つまり、エアロゾル
化した投与量が実際に肺に届くようにするために液体又は固体粒子にまで壊さね
ばならない。一般に質量中位力学径(mass median dynamic diameter)は、薬の粒
子が肺胞に届くためには５マイクロメーター以下であろう（Wearley, L.L., 199
1, Crit. Rev. in Ther. Drug Carrier Systems 8:333）。「エアロゾル粒子」
という用語は、肺投与に適した、つまり肺胞に届きうる液体又は固体粒子を記載
するのにここで使用される。他の考慮すべきことは、例えば送達装置の様式、製
剤中の更なる化合物及び粒子特性が重要である。薬の肺投与のこれらの様態は、
当該分野においてよく知られ、当分野の通常の技術者には最もよく行う実験での
製剤の取り扱い、エアロゾル化方法及び送達装置の様式である。

【００４５】 送達装置の様式に関して、当分野で既知のエアロゾル化の任意の形式は、これ
に限らないが、ネブライザー、液体製剤の噴霧化又はポンプエアロゾル化、及び
乾燥粉末製剤のエアロゾル化を含み、本発明の実施に使用することができる。固
体製剤投与の独自に設計した送達装置が示される。しばしば、液体又は乾燥粉末
製剤のエアロゾル化は噴霧剤を要求されうる。噴霧剤は、一般的に当分野で使用
される任意の噴霧剤でよい。特に限定しないが、このように利用できる噴霧剤の
例は、クロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、ヒドロフルオロフル
オロカーボン、又はヒドロカーボンであり、トリフルオロメタン、ジクロロジフ
ルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、及び1,1,1,2-テトラフルオ
ロエタン、又はその組み合わせを含む。 本発明の好ましい態様では、エアロゾル化の装置は、定量吸入器である。定量
吸入器は、投与による様々な用量よりも、投与する際の特定の投与量を提供する
。このような定量吸入器は液体又は乾燥粉末エアロゾル製剤のどちらかで使用さ
れうる。定量吸入器は当分野でよく知られている。 ペプチドリガンドが肺に到達すると、多くの製剤依存因子が薬剤吸入に影響を
及ぼす。化合物の循環レベルを要求する疾患又は障害の治療において、エアロゾ
ル粒子サイズ、エアロゾル粒子形態、感染、肺疾患又は塞栓の有無のような要因
が化合物の吸入に影響しうることが理解されているであろう。ここの記載される
製剤のそれぞれにおいて、任意のルブリケータ、吸収促進剤、タンパク質安定剤
又は懸濁剤を適用してもよい。これらの更なる薬剤の選択は、目的により様々で
ある。化合物の局所送達が所望又は探求される場合、吸収促進のような変化はそ
れ程重要でないことが理解されるであろう。

【００４６】 液体エアロゾル製剤 本発明の液体エアロゾル製剤は、通常ネブライザーで使用される。ネブライザ
ーは圧縮気体吹きつけ又は超音波のどちらかである。当該分野で既知の任意のネ
ブライザーは、本発明と関連して使用することができ、これに限らないが：Ultr
avent、Mallinckrodt社(セントルイス、MO)；アクロンＩＩネブライザー(Marque
st Medical Products、エングルウッドCO)である。本発明と関連して利用できる
他のネブライザーは、1986年11月25日公開の米国特許第4,624,251号；1972年11
月21日公開の同第3,703,173号；1971年2月9日公開の同第3,561,444号及び1971年
1月13日公開の同第4,635,627号に記載されている。 製剤は担体を含みうる。担体は循環系に溶解でき、及び製薬的に許容可能な高
分子であり、ここで製薬的に許容可能とは当該分野での技術者が治療法の一部と
して患者に該担体を注入する製薬的に許容されることを意味する。好ましくは、
担体はクリアランスの許容可能な血中濃度半減期を有する循環系で比較的安定で
ある。このような高分子はこれに限らないが、大豆レシチン、オレイン酸及びソ
ルビタントリオレアートを含み、ソルビタントリオレアートが好ましい。 当実施態様の製剤はまた、タンパク質安定化剤又は浸透圧の調節に利用できる
他の薬剤も含んでいてもよい。薬剤の例は、これに限らないが、塩、例えば塩化
ナトリウム、又は塩化カリウム及び糖類、例えばグルコース、ガラクトース又は
マンノース等を含む。

【００４７】 エアロゾル乾燥粉末製剤 本医薬製剤はペプチドリガンドの細かく分包された粉末形態及び分散剤を含む
乾燥粉末吸入製剤として使用されうる。化合物の形態は、一般に凍結乾燥粉末で
ある。ペプチド化合物の凍結乾燥形態は標準的な技術で得られる。 他の実施態様では、乾燥粉末製剤は、本発明の１又は複数の化合物、分散剤及
び充填剤を含む細かく分包された乾燥粉末を含む。本製剤に混合して使用できる
充填剤は、ラクトース、ソルビトール、スクロース、又はマンニトールのような
薬剤を含み、装置からの粉末の分散を円滑にする量である。

【００４８】 調査及び診断用組成物 好ましい実施態様において、本発明のハイブリッド分子は個体支持体のような
高分子に非共有的に吸収、又は共有的に結合される。本発明は、両方のハイブリ
ッド分子と複合した高分子を包含することが理解される。一般に、固体支持体は
、不活性マトリックス、例えば高分子ゲルであり、３次元構造、物質の格子又は
網目を構成する。ほとんどの高分子、合成又は天然のものは、二官能試薬と安定
的に架橋しているときに、適した液体のゲルを形成する。好ましくは、選択され
る高分子は、親和性クロマトグラフィーでの使用に便利である。親和性クロマト
グラフィーに使用される最もクロマトグラフィックな物質は、キセロゲルである
。このようなゲルは、ゲルマトリックスのみを含むコンパクトな固体へと乾燥し
て縮む。乾燥キセロゲルが液体に再び入れられると、ゲルマトリックスは液体を
吸収し、膨張して、ゲル状態に戻る。ここでの使用に適したキセロゲルは、高分
子ゲル、例えばセルロース、架橋デキストラン(例えばセファロース)、アガロー
ス、架橋アガロース、ポリアクリルアミドゲル、及びポリアクリルアミド-アガ
ロースゲルを含む。 あるいは、エアロゲルが親和性クロマトグラフィーに使用される。これらのゲ
ルは、乾燥して縮んでいないが、周りの空気を吸収させているだけである。乾燥
ゲルが液体に暴露されると、それはゲル中で空気と入れ替わる。ここでの使用に
適したエアロゲルは、多孔性ガラス及びセラミックゲルである。 また、ここで包含されるのは、誘導化ゲルと連結した本発明のハイブリッド分
子であり、誘導化ゲルは、ゲルマトリックスへのハイブリッド分子の連結を円滑
にし、親和性クロマトグラフィーのペプチドリガンド標的分子相互作用のステア
リン妨害を回避する。あるいは、スぺーサーアームは、同様の役割で、ゲルマト
リックスとハイブリッド分子の間を緩衝することができる。

【００４９】 化学合成 本発明の化合物を製造する一方法は、化学合成を含む。これは、当業者に知ら
れた方法論を用いて実施される(Kelly, R.F. & Winkler, M.E. in Genetic Engi
neering Principles and Methods, Setlow, J.K, ed., Plenum Press, N.Y., vo
l. 12, pp 1-19(1990), Stewart, J.M. Young, J.D., Solid Phase Peptide Syn
thesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)参照；また米国特許第4,10
5,603号、第3,972,859号、第3,842,067号、及び第3,862,925号も参照)。 本発明のペプチド類似物は固相ペプチド合成を用いて便利に調製される(Merri
field, (1964)J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 ; Houghten,(1985) Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 82: 5132 )。固相合成は、保護されたアミノ酸を不活性個体支持
体に結合させることにより推定ペプチドのカルボキシ末端において開始される。
不活性な固体支持体は、開始アミノ酸のＣ-末端のアンカーとして働くことので
きる任意の高分子であり得る。通常、高分子支持体は、上掲のStewart及びYoung
の２及び４ページの図１-１及び２-１に示されるような架橋高分子樹脂（例えば
、ポリアミド又はポリスチレン樹脂）である。一実施態様では、Ｃ-末端アミノ
酸はベンジルエステルを形成するポリスチレン樹脂と連結している。高分子支持
体は、例えば、ペプチド合成の阻害アミノ酸のα-アミノ基を解放するのに使用
される条件下でペプチドアンカーが安定であるものが選択される。塩基不安定α
保護基が使用され、次いでペプチドと固体支持体の間の酸不安定結合を使用する
のが好ましい。例えば、酸不安定エーテル樹脂は、上掲のStewart及びYoungの１
６ページに記載されるような塩基不安定Ｆｍｏｃアミノ酸ペプチド合成に効果的
である。あるいは、ペプチドアンカー結合及び差別的にアシドリシスに移行する
α-保護基が使用できる。例えば、フェニルアセトアミドメチル(Ｐａｍ)樹脂の
ようなアミノメチル樹脂は、上掲のStewart及びYoungの１１-１２ページに記載
されるようにＢｏｃ-アミノ酸ペプチド合成に関連してうまく働く。

【００５０】 開始アミノ酸が不活性固体支持体に連結した後、開始アミノ酸のα-アミノ酸
保護基を例えば塩化メチレンのトリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)で除去し、例えばトリ
エチルアミン(ＴＥＡ)で中和する。開始アミノ酸の脱保護に続いて、合成におけ
る次のα-アミノ-及び側鎖保護したアミノ酸を添加する。残りのα-アミノ酸、
必要ならば側鎖保護されたアミノ酸を縮合により所定の順序で続けて結合させ、
樹脂に結合した中間体化合物を得る。あるいは、ペプチド断片を伸長している固
相ペプチド鎖に付加する前に、幾つかのアミ酸を互いに結合させて所望のペプチ
ド断片を形成してもよい。 ２つのアミノ酸、又はアミノ酸とペプチド、又はペプチドとペプチドの間の縮
合反応は、通常の縮合方法に従って実施され、その方法は、アジド法、混合酸無
水物法、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’-ジシクロヘキシルカルボジイミド）又はＤＩＣ（Ｎ
，Ｎ’-ジイソプロピルカルボジイミド）法、活性エステル法、ｐ-ニトロフェニ
ルエステル法、ＢＯＰ(ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス[ジメチルア
ミノ]ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート)法、Ｎ-ヒドロキシコハク酸イ
ミドエステル法など、及びウッドワード試薬Ｋ法等である。

【００５１】 ペプチドの化学合成に共通なのは、アミノ酸の任意の反応性側鎖基を適切な保
護基で保護することである。最終的には、これらの保護基は、所望のポリペプチ
ド鎖が連続的に組み立てられた後に除去される。さらに共通なのは、アミノ酸又
は断片上のα-アミノ基を保護するが、それがアミノ酸又はペプチド断片のＣ-末
端カルボキシル基で成長固体支持体ポリペプチド鎖の遊離Ｎ-末端のアミノ酸と
反応し、続いてα-アミノ酸保護基を選択的に除去し、その位置で次の反応が起
こるのを可能にすることである。従って、ペプチド合成においては、中間体化合
物が生成され、それはペプチド鎖の所望の配列に局在化した各アミノ酸残基を含
み、これら種々の残基は結合した保護基を有するのが通常である。これらの保護
基は、次いで、実質的に同時に共通して除去され、樹脂から取り外した後に所望
の結果的生成物が生成される。 α-及びε-アミノ酸側鎖基を、ベンジルオキシカルボニル（省略して、Ｚ）、
イソニコチニルオキシカルボニル（ｉＮＯＣ）、ｏ-クロロベンジルオキシカル
ボニル[Ｚ(２Ｃｌ)]、ｐ-ニトロベンジルオキシカルボニル［Ｚ(ＮＯ_２)］、ｐ-
メトキシベンジルオキシカルボニル［Ｚ(ＯＭｅ)］、t-ブトキシカルボニル（Ｂ
ｏｃ）、t-アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）、イソボロニルオキシカルボニル
、アダマンチルオキシカルボニル、２-(４-ビフェニル)-２-プロピル-オキシカ
ルボニル（Ｂｐｏｃ）、９-フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、メ
チルスルホンエトキシカルボニル(methylsulfonyethoxycarbonyl)（Ｍｓｃ）、
トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２-ニトロフェニルスルフェニル
（ＮＰＳ）、ジフェニルホスフィノチオイル（Ｐｐｔ）、及びジメチロホスフィ
ノチオイル（Ｍｐｔ）基などで保護できる。 カルボキシ官能基の保護基としては、ベンジルエステル（ＯＢｚｌ）、シクロ
ヘキシルエステル（Ｃｈｘ）、４-ニトロベンジルエステル（ＯＮｂ）、t-ブチ
ルエステル（Ｏｂｕｔ）、４-ピリジルメチルエステル（ＯＰｉｃ）等が例示さ
れる。アミノ及びカルボキシル基以外の官能基を有するアルギニン、システイン
、及びセリンなどの特定のアミノ酸は、適当な保護基で保護するのが望ましいこ
とが多い。例えば、アルギニンのグアニジノ基は、ニトロ、ｐ-トルエンスルホ
ニル、ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、ｐ-メトキ
シベンゼンスルホニル、４-メトキシ-２，６-ジメチルベンゼンスルホニル（Ｎ
ｄｓ）、１，３，５-トリメチルフェニルスルホニル（Ｍｔｓ）等で保護される
。システインのチオール基は、ｐ-メトキシベンジル、トリチルなどで保護され
る。

【００５２】 前記されるような多くの阻害アミノ酸は、Novabiochem(サンディエゴ,CA)、Ba
chem CA（Terrence, CA)又はPeninsula Labs(ベルモント,CA)のように商業的に
入手できる。 上掲のStewart及びYoungは、ペプチド調製のための詳細な情報を提供する。α
-アミノ基の保護は14-18頁に記載され、側鎖ブロックは18-24頁に記載されてい
る。アミン、ヒドロキシル及びスルフヒドリル官能基の保護基の表が149-151頁
に提供されている。 所望のアミノ酸配列が完成した後、ペプチドは固体支持体から離され、回収さ
れ、精製されうる。ペプチドは、ペプチド固相結合を崩壊することのできる試薬
により固体支持体から取り除かれ、場合によっては、ペプチドの阻害側鎖機能性
基を脱保護する。一実施態様では、ペプチドは、液体フッ化水素酸(ＨＦ)を有す
るアシドリシスにより固相から取り外すが、残っている側鎖保護基も切断する。
好ましくは、ポリペプチド中の残基のアルキル化（例えば、メチオニン、システ
イン、及びチロシン残基のアルキル化）を回避するために、チオ-クレゾール及
びクレゾール捕捉剤混合物を使用する。ＦＨ離脱の後、樹脂はエーテルで洗浄さ
れ、遊離ペプチドは酢酸溶液の連続洗浄で固相から抽出される。混合した洗浄液
は凍結乾燥され、ペプチドが精製される。

【００５３】 ジスルフィド結合ペプチド 前記したように、本発明のいくつかの実施態様では、環化ペプチドリガンドを
含む。ペプチドリガンドはシステイン基の間のジスルフィド結合の形成により環
化されうる。このようなペプチドは前記したような化学合成により作成され、次
いでジスルフィド結合の形成に使用される任意の簡単な方法により環化される。
例えば、ペプチドは、還元した形態のメルカプト基を有する固相合成物から回収
され、薄い溶液に溶解されるが、分子内システイン濃度は、分子内ジスルフィド
結合形態を最適化するための分子内システイン濃度を上回り、例えば２５ｍＭか
ら１μＭ、好ましくは５００μＭから１μＭ、より好ましくは２５μＭから１μ
Ｍのペプチド濃度であり、次いで分子内ジスルフィド結合を生成するのに十分な
弱酸化剤、例えば金属陽イオン、フェリシアン化カリウム、テトラチオン酸ナト
リウム等のような触媒を有する又は有しない分子酸素に遊離メルカプト基をさら
すことにより酸化される。一実施態様では、ペプチドは以下の実施例２に記載さ
れるようにして環化される。あるいは、ペプチドはPeltonら, (1986) J. Med. C
hem., 29:2370-2375に記載されるようにして環化することができる。 環化は、例えば第１のＣｙｓと第２のＣｙｓの間のジスルフィド結合又はラク
タム結合の形成により行われる。ジスルフィド結合を形成することのできる残基
は例えばＣｙｓ、Ｐｅｎ、Ｍｐｒ、及びＭｐｐ及びその２-アミノ基含有等価物
を含む。ラクタム結合を形成することのできる残基は、例えばＧｌｕ、Ｌｙｓ、
Ｏｒｎ、αβ-ジアミノブチル酸、ジアミノ酢酸、アミノ安息香酸、及びメルカ
プト安息香酸を含む。ここでの化合物は、例えばＣｙｓ１のＮ-末端アミノ基又
は他のアミノ酸に対して共有結合を形成する隣接していない残基の側鎖基を利用
することのできるラクタム結合により環化することができる。あるいは、結合構
築はまた、本発明の化合物を環化するのに使用することができ、例えばペプチド
及びペプチド類似物を含み、Ｓ-Ｓ、ＣＨ２-Ｓ、ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２、ラクタムエ
ステル又は他の結合により環化できる。

【００５４】 組換え合成 更なる実施態様において、本発明はここに記載されたペプチドをコードする単
離された核酸、好ましくはＤＮＡを含む物質の組成物を包含する。本発明のペプ
チドをコードするＤＮＡは当該分野で知られている様々な方法によって調製する
ことができる。これらの方法は、限定されるものではないが、出典明示により開
示の全体がここに取り込まれるEngelsら, (1989) Agnew. Chem. Int. Ed. Engl.
, 28:716-734に記載された任意の方法、例えばトリエステル、亜リン酸、ホスホ
ラミダイト及びＨ-ホスホネート法による化学合成を含む。一実施態様では、発
現宿主細胞により好まれるコドンはコード化ＤＮＡの設計に使用される。あるい
は、ペプチドをコードしているＤＮＡを、組換えＤＮＡ法、例えば部位特異的突
然変異誘発（Kunkelら, (1991) Methods Enzymol. 204:125-139; Carter, P.ら,
(186） Nucl. Acids. Res. 13:4331; Zoller, M.J.ら, (1982) Nucl. Acids Re
s. 10:6487）、カセット突然変異誘発（Wells. J.A.ら, (1985) Gene 34:315）
、制限選択突然変異誘発（Wells, J.A.ら,(1986)Philos. Trans. R. Soc. Londo
n SerA 317, 415）等々を使用して一又は複数の変異体をコードするように変更
させることができる。 本発明は更に作用可能に結合した発現コントロール配列、及びベクターで形質
転換した宿主細胞によりコントロール配列が認識されるＤＮＡ分子を含むプラス
ミドのような発現ベクターを更に含む。一般的には、プラスミドベクターは宿主
細胞と適合性がある種から取り出された複製及びコントロール配列を含む。ベク
ターは通常、複製部位並びに形質転換細胞において表現型の選択を提供すること
ができるタンパク質をコードする配列を有する。

【００５５】 原核生物宿主中での発現に対しては、好適なベクターにはｐＢＲ３２２（ＡＴ
ＣＣ第３７０１７）、ｐｈＧＨ１０７（ＡＴＣＣ第４００１１）、ｐＢＯ４７５
、ｐＳ０１３２、ｐＲＩＴ５、ｐＲＩＴ２０又はｐＲＩＴ３０シリーズの任意の
ベクター（Nilsson及びAbrahmsen, (1990) Meth. Enzymol., 185:144-161）、ｐ
ＲＩＴ２Ｔ、ｐＫＫ２３３-２、ｐＤＲ５４０及びｐＰＬ-ラムダが含まれる。本
発明の発現ベクターを含む原核生物宿主細胞には、大腸菌Ｋ１２株２９４(ＡＴ
ＣＣ第３１４４６)、大腸菌株ＪＭ１０１（Messingら, (1981) Nucl. Acid Res.
, 9:309）；大腸菌株Ｂ、大腸菌χ１７７６(ＡＴＣＣ第３１５３７)、大腸菌ｃ
６００（Appleyard, Genetics, 39: 440(1954)）、大腸菌Ｗ３１１０(Ｆ-、ガン
マ-、原栄養菌株、ＡＴＣＣ第２７３２５)、大腸菌株２７Ｃ７（Ｗ３１１０、ｔ
ｏｎＡ、ｐｈｏＡ、Ｅ１５、（ａｒｇＦ-ｌａｃ）１６９、ｐｔｒ３、ｄｅｇＰ
４１、ｏｍｐＴ、ｋａｎ^ｒ）（米国特許第5,288,931号、ＡＴＣＣ第５５２４４
）、枯草菌、サルモネラ菌、セラチア・マルセッセンス及びシュードモナス種が
含まれる。 原核生物に加えて、真核生物体、例えば酵母菌、あるいは多細胞生物体由来の
細胞を宿主細胞として使用することができる。一般的なパン酵母又はサッカロミ
セス・セレヴィシアのような酵母宿主細胞中での発現に対しては、好適なベクタ
ーには、２ミクロンプラスミドに基づくエピソーム的に複製するベクター、組込
み型ベクター、及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターが含まれる。ＳＦ９細胞
のような昆虫宿主細胞での発現に対しては、好適なベクターにはバキュロウイル
スベクターが含まれる。植物宿主細胞、特にタバコのような双子葉植物宿主にお
ける発現に対しては、好適な発現ベクターにはアグロバクテリウムツメファシエ
ンスのＴｉプラスミドに由来するベクターが含まれる。

【００５６】 しかしながら、所望のものは様々な宿主細胞で好適である。有用な哺乳動物宿
主細胞の例には、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, A
TCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン
化された293細胞、Grahamら, (1997) J. Gen Virol., 36:59）；ハムスター乳児
腎細胞(BHK, ATCC CCL 10)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO,
Urlaub及びChasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216)；マウスの
セルトリ細胞（TM4, Mather, (1980) Biol. Reprod., 23:243-251）；サルの腎
細胞 (CVI ATCC CCL 70)；アフリカミドリザルの腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-158
7)；ヒト子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL 2)； イヌ腎細胞 (MDCK, ATCC CCL 34)
；バッファローラット肝細胞 (BRL 3A, ATCC CRL 1442)；ヒト肺細胞 (W138, AT
CC CCL 75)；ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065)；マウス乳房腫瘍(MMT 060562, ATT
C CCL51)；ＴＲＩ細胞（Motherら, (1982) Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68
）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)が含まれる。哺乳
動物宿主細胞における発現に対しては、有用なベクターには、ＳＶ４０由来のベ
クター、サイトメガロウイルス由来のベクター、例えばｐＲＫ５及びｐＲＫ７を
含むｐＲＫベクター（Suvaら, (1987) Science, 237:893-896; ＥＰ307,247(3/1
5/89)、ＥＰ278,776(8/17/88))、ワクシニアウイルス又は他のポックスウイルス
由来のベクター、及びモロニーのマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）由来のベ
クターのようなレトロウイルスベクターが含まれる。 場合によっては、対象のペプチドをコードしているＤＮＡは宿主細胞による発
現産物の培地中への分泌を生じさせる分泌リーダー配列に作用可能に結合される
。分泌リーダー配列の例には、ｓｔＩＩ、エコチン（ecotin）、ｌａｍＢ、ヘル
ペスＧＤ、ｌｐｐ、アルカリホスファターゼ、インベルターゼ、及びアルファ因
子が含まれる。ここでの使用にまた適しているのはプロテインＡの３６アミノ酸
リーダー配列である（Abrahmsenら, (1985) EMBO J., 4:3901）。

【００５７】 宿主細胞はこの発明の上述の発現又はクローニングベクターで形質移入され、
好ましくは形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所
望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように変性された一般的な培
養液中で培養される。 形質移入は、コード化配列が実際に発現されようとされまいと、宿主細胞によ
る発現ベクターの取り込みを意味する。数多くの形質移入の方法が当業者に知ら
れており、例えばＣａＰＯ_４沈殿法及びエレクトロポレーション法である。この
ベクターの作用の任意の兆しが宿主細胞内で生じた場合に、一般に成功した形質
移入が認められる。 形質転換は、染色体外のエレメントとしてであろうと染色体構成成分によって
であろうと、ＤＮＡが複製可能であるように生物体中にＤＮＡを導入することを
意味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的
な方法を用いて形質転換はなされる。Sambrookら, Molecular Cloning (2版）,
Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1989)のセクション１．８２に記載された
塩化カルシウムを用いるカルシウム処理が、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を
含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスに
よる感染が、Shawら, (1983) Gene, 23:315及び1989年6月29日公開の国際公開第
89/05859に記載されているように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。
そのような細胞壁のない哺乳動物細胞に対しては、上掲のSambrookらのセクショ
ン１６．３０−１６．３７に記載されたリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺
乳動物宿主系の形質転換の一般的な側面は1983年8月16日に発行された米国特許
第4,399,216号にAxelによって記載されている。酵母菌への形質転換は典型的に
は、Van Solingenら, (1977) J. Bact.,130:946及びHsiaoら, (1979) Proc. Nat
l. Acad. Sci. (USA), 76:3829の方法に従って実施される。しかし、核注入、エ
レクトロポレーション、あるいは原形質融合のような細胞にＤＮＡを導入する他
の方法を使用することもできる。

【００５８】 本ペプチドを調製するのに使用される原核宿主細胞は、一般に上掲のSambrook
ら, に記載されるようにして培養することができる。 本発明のペプチドを調製するのに使用される哺乳動物宿主細胞は、様々な培地
で培養することができる。商業的に入手可能な培地、例えばハム(Ham)のＦ１０(
シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ)、シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダ
ルベッコの改良イーグル培地((DMEM)、シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。
さらに、Ham及びWallace, (1979) Meth. Enz. 58:44, Barnes及びSato, (1980)
Anal. Biochem. 102:255, 米国特許第4,767,704号；同4,657,866号；同4,927,7
62号；又は同4,560,655号；WO 90/03430；WO87/00195；米国特許再発行第30,985
号；又は米国特許第5,122,469号、文献によりここに取り込まれる全ての開示に
記載された任意の培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地
はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフ
ェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグ
ネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えば
アデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン(商品名）薬)、微
量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義され
る)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができ
る。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むこ
とができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細
胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。 この開示で引用される宿主細胞は、インビトロ培地の細胞、並びに宿主動物内
にある細胞を包含する。 以下の実施例は、例示のために提供されるもので、限定するものではない。明
細書中の全ての文献の開示は、ここに明示的に出典明示により取り込まれる。

【００５９】 実施例 実施例１ ペプチド−Ｆｃ融合体 方法 ＴＦ１５１−Ｆｃ及びＨＥＲ２−Ｆｃ（１．１ＦＩ−Ｆｃ）発現ベクターの構築
− ベクターｐＶＬ１３９３（Pharmigen）に基づく組換体転移ベクターの構築
には標準的な組換えＤＮＡ技術を用いた（Sambrook, J., Fritsch, E.F., 及びM
aniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, New York; O'Reilly, D. R., Miller, L. K.
,及びLuckow, V. A. (1994) Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory M
anual, Oxford University Press, New York）。ｐＶＬ１３９３由来プラスミド
ｐｂＰＨ．ＨｉｓをＮｃｏＩとＳｍａＩで直線化し、エビのアルカリホスファタ
ーゼで処理した（Dwyer, M. A.等 (1999) J. Biol. Chem. 274:9738-9743）。ヒ
トＩｇＧ１のＦｃ部分を、別のｐＶＬ１３９３由来プラスミドｐＶＬ１３９３．
ＩｇＧのＮｄｅＩを使用し、続いてクレノウ処理し、ＮｃｏＩを使用する制限酵
素による切断により、７００塩基対の断片として取得した。ＭＩＰ．５のシグナ
ル配列を、ＥｃｏＲＩで切断されたＰＣＲ断片としてＦｃ配列の前に導入したが
、その断片中にはＡｓｃＩ部位が含まれていた。ＡｓｃＩ部位は推定上のシグナ
ル配列切断部位に続いて生じる。ライゲーションに続いて、コンピテント化され
た大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅを形質転換し、ＤＮＡの配列解析により正しい組換体
プラスミド（ｐＶＬ１３９３．ＭＩＰ．５ｓｉｇ．Ｆｃ）を持つ大腸菌を選択し
た。ついで、ｐＶＬ１３９３．ＭＩＰ．５ｓｉｇ．ＦｃをＡｓｃＩとＳｔｕＩで
直線化し、エビのアルカリホスファターゼで処理した。直線化したベクターをつ
いで適合性末端を持つ合成ＤＮＡ片とライゲーションさせた。合成ＤＮＡ挿入断
片は以下の配列を持つ２オリゴをアニールすることにより：5'-GCC GGA GCT CCC
GCC TCC GCC CTC CAC GAA CTG GCA GTA CCA CCT GTC GAT TCT GGG GTT GTC GCA
CAG GGC GCC CAC GG-3'（配列番号：１１）及びGGGSSG（配列番号：１３）リン
カーを含むペプチド配列ＴＦ１５１（表１）に対するコード化配列である5'-CGC
GCC GTG GGC GCC CTG TGC GAC AAC CCC AGA ATC GAC AGG TGG TAC TGC CAG TTC
GTG GAG GGC GGA GGC GGG AGC TCC GGC-3'（配列番号：１２）、又は以下の配
列を持つ２オリゴをアニールすることにより：5'-CGC GCC CAG GTG TAC GAG TCC
TGG GGA TGC ATC GGC CCC GGC TGC GCC TGC CTG CAG GCC TGC CTG GGA GGC GGG
AGC TCC GGC-3’（配列番号：１４）及びGGGSSG（配列番号：１３）リンカーを
含むペプチド配列１．１ＦＩ（表１）に対するコード化配列である5'-GCC GGA G
CT CCC GCC TCC CAG GCA GGC CTG CAG GCA GGC GCA GCC GGG GCC GAT GCA TCC C
CA GGA CTC GTA CAC CTG GG-3’（配列番号：１３）生成した。

【００６０】 ライゲーションに続いて、コンピテント化された大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅを形
質転換し、ローダミンダイターミネーター法とアプライドバイオシステムズＡＢ
Ｉモデル３７３自動ＤＮＡシークエンサーを用いたＤＮＡ配列決定により正しい
組換体プラスミド（ｐＶＬ．１３９３．ＭＩＰ５．ＴＦ１５１−Ｆｃ又はｐＶＬ
．１３９３．ＭＩＰ５．１．１ＦＩ−Ｆｃと命名）を持つ大腸菌を選択した。組
換体転移ベクターをキアゲンのＭｉｎｉ−Ｐｒｅｐを用いて精製し、組換体バキ
ュロウィルスの構築に使用した。 組換体バキュロウィルスＡｃＮｐＶ．ＴＦ１５１−Ｆｃを、転移ベクターと直
線化した野生型バキュロウィルスＤＮＡ（Autographa californicanuclear poly
hedrosis virus（ＡｃＮｐＶ）、Pharmingen ）とのＳｆ９細胞の共形質移入に
よって産生した。組換体バキュロウィルスＡｃＮｐＶ．ＴＦ１５１−Ｆｃの最初
の増幅により、検出可能なタンパク質の発現を達成した。続いてプラーク精製と
ウイルスストック希釈を、プラークアッセイにおいて実施した。先に記載されて
いるような標準的な方法を利用した（O'Reilly, D. R., Miller, L. K.,及びLuc
kow, V. A. (1994) Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, O
xford University Press, New York）。 細胞培養− スポデプテラ・フルギペルダ(Spodeptera frugiperda)（Ｓｆ９
）昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）の接着培養を、ＧＲＡＣＥ（ＪＲＨ Bi
osciences, #51942-78P）、グルタミン、ストレプトマイシン／ペニシリン、及
び１０％のウシ胎仔血清（５６℃で３０分間、熱により不活性化したもの）が添
加されたヒンクのＴＮＭ−ＦＨ昆虫用培地中に２８℃で維持した。培養物を３日
毎に継代させた。Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ^ＴＭ細胞（Trichoplusia ni、ＢＴ１．ＴＮ
．ＳＢ１−４（Invitrogen））の攪拌培養物（２．０ｘ１０^６細胞／ｍｌで５０
０ｍｌ）を、０．５の感染多重度で感染させ、６０時間の形質移入後に収集した
。懸濁培養物は、ＥＳＦ−９２１タンパクフリーの昆虫細胞培地（Expression S
ystems LLC, #96-001）を使用して２８℃でスピナーフラスコ中に維持した。１
０^６細胞／ｍｌの最初の細胞密度になるまで３日毎に培養細胞を継代させた。

【００６１】 ペプチド−Ｆｃの精製− 最適化された感染プロトコールに従って、Ｈｉｇｈ
Ｆｉｖｅ^ＴＭ細胞を４℃にて１０分間、８００ｘｇにて遠心分離により除去し
た。清澄化された上清（０．５Ｌ）を０．４５μのＮａｌｇｅｎｅ社のフィルタ
ーを使用して濾過し、２５℃でＰＢＳ（phosphate buffered saline (リン酸緩
衝生理食塩水)）で平衡化された０．５ｍｌのＨｉ−ＴｒａｐプロテインＡカラ
ム（Amersham Pharmacia Biotech）に添加した。２０ｍｌのＰＢＳでの洗浄後、
カラムを３ｍｌの０．２Ｎ ＨＯＡｃで溶出させ、ペプチド−Ｆｃを含む画分を
凍結乾燥し、４℃にて保存した。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ− 試料を、レムリの方法（Laemmli, U. K. (1970) Nature
227:680-685）を使用して、４−２０％のトリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ（
Novex）にて、還元又はまた非還元でプレステインタンパク質分子量マーカー（S
eaBlue, Novex）を用いて解析した。 タンパク質の配列決定− 感染されたＳｆ９細胞の上清から精製したＴＦ１５
１−Ｆｃ及び１．１ＦＩ−ＦｃをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ついでＰＶＤＦ膜に
移した。ミリポアImmobilon-ＰＳＱ膜上へのエレクトロブロッティングをBioRad
のTrans-Blotトランスファーセルにより２５０ｍＡの定電流で１時間、実施した
（Matsudaira, P. (1987) J. Biol. Chem. 262: 10035-10038）。ＰＶＤＦ膜を
５０％メタノール中の０．１％クマジーブルーＲ−２５０で０．５分間染色し、
５０％メタノール中の１０％酢酸で２−３分間脱染色した。膜を十分に水で洗浄
し、−２０℃で保存する前に乾燥させた。約５０ｋＤのＴＦ１５１−Ｆｃ及び１
．１ＦＩ−Ｆｃのバンドをそれぞれ切り出し、オンラインＰＴＨ分析装置を備え
た４９４型Applied Biosystems シークエンサーを使用して最初の１１残基を配
列決定した。Nelson Analytical７６０インターフェースを使用してJustice Inn
ovation ソフトウェアでピーク面積を積算した。配列翻訳はＤＥＣアルファで実
施した（Henzel, W. J., Rodriquez, H., 及びWatanabe, C. (1987) J. Chromat
og. 404: 41-52）。

【００６２】 ＴＦ１５１−Ｆｃのアッセイ ＦＶＩＩａ結合ＥＬＩＳＡ− ＦＶＩＩａへの結合に対してＴＦ１５１と同じ
部位でＦＶＩＩａに結合することが知られているアミノ酸配列Ac-ALCDDPRVDRWYC
QFVEGSK-acaBiアミド（配列番号：１０）（表１）を有する、ＴＦ７６のビオチ
ン化型であるＴＦ１４７ｂと競合するＴＦ１５１−Ｆｃ融合ペプチドの能力を、
ＦＶＩＩａ結合ＥＬＩＳＡを使用してモニターした。マイクロタイタープレート
を４℃で５０ｍＭ、ｐＨ９の炭酸水素アンモニウム中２μｇ／ｍｌ組換えヒトＦ
ＶＩＩａで終夜コートした；全ての他の工程は室温で実施した。ついでプレート
をアッセイバッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、５ｍＭのＣａＣｌ _２ 、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中１％のＢＳＡでブロックした。アッセイバッファ
ー中のＴＦ１５１−Ｆｃの希釈物プラス０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を２０ｎＭの
ＴＦ１４７ｂと共に１時間の間、マイクロタイタープレートに加えた。マクロタ
イタープレートを３００μｌのアッセイバッファープラス０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０で３回洗浄し、結合したＴＦ１４７ｂをストレプタビジン／ＨＲＰ結合体（
Streptavidin-POD, Roche Molecular Biochemicals）で検出した。結合したＨＲ
Ｐの量をABTS/H₂O₂基質（Kirkegaard and Perry Laboratories）を用いて測定し
、４０５ｎｍにおける吸収をモニターした。４０５ｎｍにおける吸収値を、ウェ
ルに元々添加されていたペプチドの濃度に対してプロットした。非線形回帰分析
（Marquardt, J. Soc. Indust. Appl. Math. 11:431-441 (1963)）により、シ
グモイド曲線を、４つの変数の方程式にフィットさせた；このアッセイにおいて
最大値の半数のシグナルを与えるのに必要なＴＦ１５１−Ｆｃの濃度をこの曲線
から計算し、ＩＣ_５０値と呼んだ。

【００６３】 ＦＸ活性化アッセイ− ＴＦ−ＦＶＩＩａによるＦＸの活性化をＴＦ１５１−
Ｆｃ濃度の関数として室温にてモニターした。各アッセイ試料はＨＢＳ／Ｃａバ
ッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、５ｍＭのＣａＣｌ_２、１５０ｍ
ＭのＮａＣｌ、０．１％のＰＥＧ８０００）中に１００μｌの４６０ｐＭ再脂質
化ＴＦ_{１−２４３}（ＴＦ_ＰＣ）（Kelley, R. F.等 (1997) Blood 89:3219-3227
）と３０ｐMのＦＶＩＩａを含んでいた；２０分後、ＨＢＳ／Ｃａバッファーに
希釈した２５μｌのペプチドを添加した。３０分のインキュベーション後に、Ｈ
ＢＳ／Ｃａ中１μＭのＦＸを２５μｌ添加することによって反応を開始させた（
注：これは３０６ｐＭのＴＦ_ＰＣ、２０ｐＭのＦＶＩＩａ、及び１６６ｎＭのＦ
Ｘの最終濃度を生じる）。反応速度分析のために、ＦＸの最終濃度を２０及び５
００ｎＭの間で変化させた。２５μｌのアリコートを１、３、５、７及び９分で
除去し、５０ｍＭのＥＤＴＡ２５μｌで急冷した。各アリコートで産生されたＦ
Ｘａを、２５０ｎＭのSpectrozyme ｆＸａ（American Diagnostica）５０ｍＭの
トリス、ｐＨ８、５０ｎＭのＮａＣｌ、０．００２５％のトリトンＸ−１００の
１００μｌを添加することによって測定した。ＴＦ１５１−Ｆｃの各濃度で産生
されたＦＸａの割合は４０５ｎｍの吸光値対時間の最初の傾斜に比例していた。
非線形回帰分析（Marquardt, J. Soc. Indust. Appl. Math. 11:431-441 (1963
)）により、シグモイド曲線を、４つの変数の方程式にフィットさせた；このア
ッセイにおいて最大値の半数のシグナルを与えるのに必要な各ペプチドの濃度を
この曲線から計算し、ＩＣ_５０値と呼んだ。

【００６４】 凝固アッセイ− クエン酸化しプールした正常な血漿（ヒト又は様々な動物種
）でプロトロンビン時間（ＰＴ）凝固時間アッセイを実施した。凝固時間を、Ａ
ＣＬ３００自動化Coagulation Analyzer（Coulter Corp., Miami, FL）と次のよ
うな市販試薬を用いて決定した。 ＰＴアッセイに対しては、様々な濃度の（ＴＦ１５１−Ｆｃ）水溶液を、血漿
９部に対してインヒビター１部の比でクエン酸化されプールされた正常血漿に添
加する。３０分のインキュベーション後、これらの混合物を、ＡＣＬ３００Anal
yzerの試料カップに加えた。ヒト再脂質化組織因子とＣａ^２＋イオンの混合物で
あるInnovin(登録商標)（Dade International Inc., Miami, FL）を試薬カップ
に添加した。正確な容量の試料とInnovin(登録商標)（５０μｌ試料、１００μ
ｌInnovin）を、３７℃に予め平衡化されたアクリルローターのセルに自動的に
移した。２分のインキュベーション時間に続いて、２成分を遠心法により混合す
ることにより凝集を開始させた。凝集を光学的に測定し、凝固時間を秒で報告し
た。このシステムでは、コントロール血漿（血漿プラスインヒビター希釈物）の
凝固時間は典型的には８から１０秒であった。延長倍数はコントロールの凝固時
間に対するインヒビターの凝固時間であった。

【００６５】 １．１ＦＩ−Ｆｃ（ＨＥＲ２−Ｆｃ）のアッセイ ＨＥＲ２ファージ結合アッセイ− Ｅｒｂ２の固定化された細胞外ドメイン（
ＨＥＲ２−ＥＣＤ、Hudziak等 (1991) J. Biol. Chem. 266:24109-15）に対する
その表面にペプチド１．１ＦＩ（表１）の単一コピーを表示するファージの結合
阻害は、ファージＥＬＩＳＡを使用して評価した。ＨＥＲ２−ＥＣＤは、５０ｍ
Ｍの 炭酸水素アンモニウム、ｐＨ９．３中にて、５μｇ／ｍｌを使用して４℃
で一晩反応させ、直接、マキシソーププレート（Nunc）に固定化した。ウェルを
、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）を用いて、２５℃で１時間ブロッ
キングした。ＰＢＳ−ＢＳＡ中の１．１ＦＩ−Ｆｃの希釈物を、１．１ＦＩ表示
ファージの固定化ＨＥＲ２−ＥＣＤへの結合に対する阻害能について試験した。
マイクロタイタープレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎ）で洗浄し、ＨＥＲ２−ＥＣＤに結合したファージを、抗ｇＶＩ
ＩＩ／ＨＲＰモノクローナル抗体結合体（Amersham Pharmacia Biotech）により
検出した。結合したＨＲＰの量を、ＡＢＴＳ／Ｈ_２Ｏ_２基質を使用し、４０５ｎ
ｍにおける変化を検出することにより測定した。 ＨＥＲ２競合ＥＬＩＳＡ− ＨＥＲ２−ＥＣＤに対する１．１ＦＩ−Ｆｃへの
結合を、競合ＥＬＩＳＡにより測定した。試料をＰＢＳ−ＢＳＡにて希釈し、上
述したマイクロタイタープレートに固定化されたＨＥＲ２−ＥＣＤに対する４０
ｎＭのビオチン化１．１．ＦＩ−Ｚの結合（表１）を阻害する能力を試験した。
1時間のインキュベーション後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにて洗浄し、ス
トレプタビジン／ＨＲＰ結合体（Streptavidin-POD, Roche Molecular Biochemi
cals）を30分間添加した。プレートを、再度ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、結合
されたＨＲＰをＡＢＴＳ／Ｈ_２Ｏ_２基質（Kirkegaard & Perry Laboratories）
を用いてアッセイし、４０５ｎｍにおける吸収を測定した。４０５ｎｍにおける
吸収値を、ウェルに元々添加されていた１．１ＦＩ−Ｆｃの濃度に対してプロッ
トした。非線形回帰分析（Marquardt, J. Soc. Indust. Appl. Math. 11:431-44
1 (1963)）により、シグモイド曲線を、４つの変数の方程式にフィットさせた；
このアッセイにおいて最大値の半数のシグナルを与えるのに必要な１．１ＦＩ−
Ｆｃの濃度をこの曲線から計算し、ＩＣ_５０値と呼んだ。

【００６６】 表１ＨＥＲ２ペプチドリガンド １．１ＦＩ QVYESWGCIGPGCACLQAL（配列番号：１６） １．１ＦＩ-ファージ QVYESWGCIGPGCACLQACL-GGGSGGGASGGGSGSG-DFDYEK...（ｇ
ＩＩＩタンパク質）（配列番号：１７） １．１ＦＩ-Ｆｃ(ＨＥＲ２-Ｆｃ) SQAQRRA-QVYESWGCIGPGCACLQACL-GGGSSG-PDKT
HTCPPCPA...（Ｆｃ、ＩｇＧアイソタイプ１）（配列番号：１８） １．１ＦＩ-Ｚ QVYESWGCIGPGCACLQACL-GGGRGG-AQHD...（配列番号：１９） １．１ＦＩ-Ｚ-ビオチン 上述の通りであるが、Ｚドメインを通してランダムに
ビオチン化されているＴＦペプチドリガンド ＴＦ１５１ Ac-ALCDNPRIDRWYCQFVEG-NH2（配列番号：２０） ＴＦ１４７ｂ Ac-ALCDDPRVDRWYCQFVEGSK^＊-acaBi-アミド（配列番号：１０） ＴＦ７６ Ac-ALCDDPRVDRWYCQFVEG-アミド（配列番号：２１） ＴＦ１５１−Ｆｃ SQAQRRA-VGALCDNPRIDRWYCQFVEG-GGGSSG-PDKTHTCPPCPA...(Fc
, IgGアイソタイプ１)（配列番号：２２） ＡｃはＣＨ_３ＣＯ修飾Ｎ末端を示す；ＮＨ_２はＮＨ_２修飾Ｃ末端を示す；ａｃ
ａはアミノカプロン酸を示す；Ｂｉはビオチンを示す；^＊はリジンのεアミノ基
が誘導体化されていることを示す。

【００６７】 結果 ペプチドリガンド−Ｆｃ融合体のタンパク質特徴付け− 精製に続いて、およそ
８ｍｇのコントロール−Ｆｃ（融合したペプチドリガンドを欠くＦｃ）、ＴＦ１
５１−Ｆｃ又は１．１ＦＩ−Ｆｃを５００ｍｌの培養物から取得した。還元及び
非還元の融合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、約３０及び約６０ｋＤａにそれ
ぞれバンドが明らかになり、二つのペプチド−Ｆｃモノマーの会合がダイマーを
形成していることを示唆している（Ｆｉｇ４）。ＴＦ１５１−Ｆｃ又は１．１Ｆ
Ｉ−ＦｃのＮ末端配列分析により次の配列：SQAQRRAVGAL...(ＴＦ１５１−Ｆｃ)
（配列番号：２３）及びSQAQRRAQVYE...（１．１ＦＩ−Ｆｃ）（配列番号：２４
）が明らかになり、これはＦｃの融合体としてのペプチドの発現を示している。
ペプチドリガンド−Ｆｃ融合体の機能特徴付け− ＴＦ１５１-Ｆｃ活性− ＦＶＩＩａへの結合に対してＴＦ７６のビオチン化
型であるＴＦ１４７ｂと競合するＴＦ１５１−Ｆｃの能力をＦＶＩＩａ結合ＥＬ
ＩＳＡを使用して測定した。ＦＶＩＩａへのＴＦ１４７ｂの結合の阻害はペプチ
ドＴＦ１５１に匹敵し（表１）、Ｆｉｇ５に示す；ＴＦ１５１とＴＦ１５１−Ｆ
ｃ融合体はそれぞれ２及び３ｎＭのＩＣ_５０値を持っていた。ＴＦ１５１−Ｆｃ
融合体はまたＦＸ活性化アッセイにおいてＴＦ−ＦＶＩＩａによるＦＸ活性化の
効果的な阻害剤であった（Ｆｉｇ６）；コントロール−Ｆｃ及び１．１ＦＩ−Ｆ
ｃはこのアッセイでは効果はなかった。ＴＦ１５１−ＦｃでのＦＸ活性化を阻害
する能力はまたヒト血漿中のプロトロンビン時間を延ばす能力にもまた反映され
ていた（Ｆｉｇ７）。ＴＦ１５１−Ｆｃの効果はこのアッセイにおいてペプチド
ＴＦ１５１に匹敵した。 １．１ＦＩ−Ｆｃ融合体の特徴付け− ＨＥＲ２ファージ結合アッセイを使用し
て、１．１ＦＩ−Ｆｃが、Ｆｉｇ８に示されるように１．１．ＦＩ−Ｚど同様な
３ｎＭのＩＣ_５０値で、固定化ＨＥＲ２−ＥＣＤへの１．１ＦＩファージ結合を
阻害することが見いだされた（表１）。ＨＥＲ２競合ＥＬＩＳＡで試験したとき
、１．１ＦＩ−Ｆｃはまた１．１ＦＩ−Ｚと同様なＩＣ_５０値を有していた（Ｆ
ｉｇ９）。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【Ｆｉｇ．１】 Ｆｉｇ．１は、天然ＩｇＧ、及びパパイン及びペプシン消
化から生じるその断片の略図である。ジスルフィド結合は、例えばＣＨ１及びＣ
Ｌドメインの間の−Ｓ−Ｓ−により表される。図において、Ｖは可変ドメインで
あり；Ｃは定常ドメインであり；Ｌは軽鎖を表し、Ｈは重鎖を表す。

【Ｆｉｇ．２】 Ｆｉｇ．２Ａは天然ＩｇＧ Ｆｃ領域アミノ酸配列の配置
を示す。ヒト(ｈｕｍ)ＩｇＧ Ｆｃ領域配列を示して、ｈｕｍＩｇＧ１(非-Ａ及
びＡアロタイプ)(それぞれ配列番号：１及び２)、ｈｕｍＩｇＧ１(配列番号：３
)、ｈｕｍＩｇＧ３(配列番号：４)及びｈｕｍＩｇＧ４(配列番号：５)が示され
る。ヒトＩｇＧ１配列は非-Ａアロタイプであり、及びこの配列とＡアロタイプ(
位置３５６及び３５８；ＥＵ番号方式)の間の相違を、ヒトＩｇＧ１配列の下に
示す。また、天然マウス(ｍｕｒ)ＩｇＧ Ｆｃ領域配列を示して、ｍｕｒＩｇＧ
１(配列番号：６)、ｍｕｒＩｇＧ２Ａ(配列番号：７)、ｍｕｒＩｇＧ２Ｂ(配列
番号：８)及びｍｕｒＩｇＧ３(配列番号：９)も示される。Ｆｉｇ．２Ｂは、Ｆ
ｉｇ．２ＡのＦｃ領域配列の間の％同一性を示す。

【Ｆｉｇ．３】 Ｆｉｇ．３は、星印のついた配列間の相違を有する天然ヒ
トＩｇＧ Ｆｃ領域配列、ｈｕｍＩｇＧ１(非-Ａ及びＡアロタイプ)、ｈｕｍＩｇ
Ｇ２、ｈｕｍＩｇＧ３及びｈｕｍＩｇＧ４を示す。

【Ｆｉｇ．４】 還元した及び還元していないＴＦ１５１−ＦｃのＳＤＳＰ
ＡＧＥ分析を示し、暴露したＨＥＲ２-Ｆｃは二量体を形成する２つのペプチド-
Ｆｃモノマーの関係を示唆する約３０と約６０ｋＤａで結合する。

【Ｆｉｇ．５】 Ｆｉｇ．５は、ＴＦ１４７ｂ(配列番号：１０)とＦＶＩＩ
ａへの結合において競合するＴＦ１５１-Ｆｃの能力を決定するＥＬＩＳＡの結
果を示す。ＦＶＩＩａへの結合においてＴＦ１４７ｂに対して競合するＴＦ-１
５１Ｆｃの能力はペプチドリガンド、ＴＦ１５１のみの能力に対して比較された
。

【Ｆｉｇ．６】 Ｆｉｇ．６は、ＦＸ活性化において、ＴＦ／ＦＶＩＩａに
よるＦＸ活性化を抑制するためのＴＦ１５１-Ｆｃ融合の能力を示し；コントロ
ール-Ｆｃ及びＨＥＲ２-Ｆｃはこのアッセイにおいて効果を有しなかった。

【Ｆｉｇ．７】 ＴＦ-Ｆｃはヒト血漿のプロトロンビン時間(ＰＴ)を延長
する。

【Ｆｉｇ．８】 ＨＥＲ２ファージ結合ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＨＥ
Ｒ２-Ｆｃは、３ｎＭのＩＣ５０で固定したＨＥＲ２-ＥＣＤに対する１．１Ｆ１
ファージ結合を阻害することができる。

【Ｆｉｇ．９】 ＨＥＲ２-ＦｃはＨＥＲ２競合ＥＬＩＳＡにおいて、ペプ
チド１．１ＦＩ-Ｚと同様のＩＣ５０を有する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 15/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ 21/08 15/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ラザルス，ロバート，エー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94030， ミルブレー，ヒルクレスト ブールバード 237 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA43 BA80 CA04 CA07 DA02 DA05 DA06 DA11 DA12 EA04 4B064 AG01 AG26 CA02 CA05 CA06 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA72X AA90X AB01 BA02 CA24 CA25 CA44 4C085 AA22 AA25 AA26 AA27 CC22 EE03 GG10 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA17 BA18 CA40 DA75 EA20 FA74

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）ペプチドリガンド及び （ｂ）免疫グロブリン定常領域多量体化(multimerization)ドメイン ：を含むポリペプチド。
2. 【請求項２】 ペプチドリガンドが５０アミノ酸残基よりも少ない非自然発
   生アミノ酸配列である請求項１に記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】 ペプチドリガンドが約１０から約３０アミノ酸残基の間であ
   る請求項２に記載のポリペプチド。
4. 【請求項４】 免疫グロブリン定常領域多量体化ドメインがＩｇＧのＣＨ３
   ドメインを含む請求項３に記載のポリペプチド。
5. 【請求項５】 ペプチドリガンドが、Ｃ-末端で免疫グロブリン定常領域多
   量体化ドメインのＮ-末端と融合されている請求項４に記載のポリペプチドアミ
   ノ酸配列。
6. 【請求項６】 免疫グロブリン定常領域多量体化ドメインがＩｇＧ１、Ｉｇ
   Ｇ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４から得られる請求項５に記載のポリペプチドアミノ酸
   配列。
7. 【請求項７】 免疫グロブリン定常領域多量体化ドメインがＩｇＧ１重鎖の
   定常ドメインである請求項６に記載のポリペプチドアミノ酸配列。
8. 【請求項８】 請求項７のポリペプチドアミノ及び第２の免疫グロブリン定
   常領域多量体化ドメインを含む二量体。
9. 【請求項９】 免疫グロブリン定常領域多量体化ドメインが、機能的なＦｃ
   ドメインを形成するように結合する請求項８の二量体。
10. 【請求項１０】 （ａ）ＡＣＨ−ＡＣＨ； （ｂ）ＡＣＨ−ＶＨＣＨ−ＶＬＣＬ及び （ｃ）ＡＣＨ−ＶＨＣＨ、 ここで、Ａは同一の又は異なるペプチドリガンドを表し； ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり； ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり； ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり及び ＣＨは免疫グロブリン重鎖定常ドメインである からなる群から選択される請求項９に記載の二量体。
11. 【請求項１１】 請求項１から７の何れか１つによるポリペプチドアミノ酸
    配列をコードする核酸。
12. 【請求項１２】 請求項１１の核酸を形質移入された宿主細胞の培地からポ
    リペプチドを回収することを含む請求項１のポリペプチドを調製する方法。
13. 【請求項１３】 ポリペプチドが親和性成熟での吸着により回収される請求
    項１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 請求項１１の核酸を含む複製可能なベクター。
15. 【請求項１５】 請求項１４のベクターを含む宿主細胞。
16. 【請求項１６】 第２の免疫グロブリン重鎖の核酸を更に含む請求項１５に
    記載の宿主細胞。
17. 【請求項１７】 請求項１のポリペプチド及び細胞障害剤を含む組成物。
18. 【請求項１８】 細胞傷害剤がポリペプチドと共有的に結合している請求項
    １７に記載の組成物。
19. 【請求項１９】 細胞傷害剤が化学療法剤である請求項１８に記載の組成物
    。
20. 【請求項２０】 細胞傷害剤が毒素である請求項１９に記載の組成物。
21. 【請求項２１】 細胞傷害剤が放射性同位体である請求項２０に記載の組成
    物。
22. 【請求項２２】 請求項１のポリペプチドと酵素成分を含む組成物。
23. 【請求項２３】 酵素成分がポリペプチドとコンジュゲートする請求項２２
    に記載の組成物。
24. 【請求項２４】 酵素成分がプロドラッグ活性化酵素である請求項２３に記
    載の方法。
25. 【請求項２５】 製薬的に許容可能な賦形剤を更に含む請求項１７ないし２
    ４の何れかに記載の組成物。