PT1682583E - Complexo de proteína utilizando um fragmento de imunoglobulina e um processo para a sua preparação - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

COMPLEXO DE PROTEÍNA UTILIZANDO UM FRAGMENTO DE IMUNOGLOBULINA Ξ UM PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO Âmbito técnico A presente invenção tem por objecto um conjugado de proteína que compreende um polipéptido, activo sob o ponto de vista fisiológico, um polímero não peptídico e um fragmento de Fc de uma imunoglobulina, que estão ligados covalentemente e têm uma acção fisiológica de duração prolongada, comparada com a da forma natural. Técnica anterior

Dado que os polipéptidos tendem a ser facilmente desnaturados, devido à sua baixa estabilidade, tendem a degradar-se no sangue por meio de enzimas proteolíticas e tendem a passar facilmente através do rim ou do fígado, os medicamentos à base de proteína, incluindo polipéptidos, como componentes eficazes sob o ponto de vista farmacêutico, necessitam de ser administrados frequentemente aos doentes para manter as concentrações e os títulos desejados no sangue. Contudo, esta administração frequente de medicamentos de proteínas, especialmente através de injecções, causa dor aos doentes. Para resolver estes problemas, têm-se feito muitos esforços para melhorar a estabilidade dos fármacos de proteína no soro e para manter os fármacos no sangue em níveis elevados, durante um período de tempo prolongado e assim maximizar a eficácia farmacêutica dos fármacos. As composições farmacêuticas com actividade sustentada necessitam por isso de aumentar a estabilidade dos fármacos de proteína e manter os títulos 1 em níveis suficientemente elevados sem causar respostas imunitárias em doentes.

Para estabilizar as proteínas e prevenir a degradação enzimática e a purificação pelos rins, utilizou-se, adequadamente, um polímero com elevada solubilidade, tal como polietileno-glicol (daqui para a frente referido simplesmente como "PEG"), para modificar quimicamente a superfície de um fármaco de proteína. Por meio da ligação de uma proteína-alvo a regiões variadas ou regiões específicas, o PEG estabiliza a proteína e previne a hidrólise, sem causar efeitos colaterais sérios (Sada et al. , J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139, 1991). Contudo, apesar da sua capacidade para aumentar a estabilidade da proteína, este acoplamento do PEG tem problemas tal como o facto de reduzir significativamente o número de títulos de proteínas activas sob o ponto de vista fisiológico. Além disso, o rendimento diminui com o aumento do peso molecular do PEG devido à reactividade reduzida das proteínas.

Recentemente têm sido sugeridos conjugados de fármacos de polímero-proteína. Por exemplo, tal como descrito na patente norte-americana U.S. No. 5.738.846, pode-se preparar um conjugado ligando um fármaco de proteína idêntica a ambas as extremidades de PEG para melhorar a actividade do fármaco de proteína. Do mesmo, tal como descrito na publicação da pat. internacional No. WO 92/16221 podem ligar-se dois fármacos de proteína diferentes às duas extremidades de PEG para se obter um conjugado com duas actividades diferentes. Os processos anteriores, contudo, não tiveram muito sucesso na sustentação da actividade dos fármacos de proteína. 2

Por outro lado, Kinstler et al. referiram que uma proteína de fusão, preparada por acoplamento do factor de estimulação de colónias de granulócitos (FEC-G) a albumina humana, exibiu uma maior estabilidade (Kinstler et al., Pharmaceutical Research 12 (12): 1883-1888, 1995). Nesta publicação, contudo, dado que o fármaco modificado, com uma estrutura de FEC-G-PEG-albumina, apenas mostrou um aumento do tempo de aproximadamente quatro vezes, no tempo de permanência no corpo e um ligeiro aumento do semi-período de vida no soro, comparados com a administração de apenas FEC-G natural, ainda não foi industrializado como uma formulação eficaz de actuação prolongada para fármacos de proteína.

Um processo alternativo para melhorar a estabilidade in vivo das proteínas activas sob o ponto de vista fisiológico consiste em ligar um gene da proteína activa sob o ponto de vista fisiológico a um gene que codifica uma proteína que tenha uma elevada estabilidade no soro, por meio da tecnologia da recombinação genética e a cultura de células transfectadas com o gene recombinante para produzir uma proteína de fusão. Por exemplo, pode-se preparar uma proteína fusão por conjugação de albumina, uma proteína conhecida por ser a mais efectiva no aumento da estabilidade da proteína ou de um seu fragmento para uma proteína activa sob o ponto de vista fisiológico, de interesse para a recombinação genética (publicações das pat. internacionais nos. WO 93/15199 e WO 93/15200, publicação da pat. europeia n°. 413.622) . Uma proteína de fusão de interferão alfa e albumina, desenvolvida pela Human Genome Science Company e comercializada sob o nome comercial de 'Albuferon™', aumentou o semi-período de vida de 5 horas para 93 horas, em macacos, mas sabe-se que é problemática porque diminui a actividade in vivo para menos 3 de 5 % do interferão alfa não modificado (Osborn et al., J. Phar. Exp. Ther. 303 (2): 540-548, 2002).

Por outro lado, uma imunoglobulina (Ig) é composta principalmente por duas regiões: Fab com um sitio de ligação do antigénio e Fc com um sitio de ligação do complemento. Fizeram-se outras tentativas para fundir um fármaco de proteína com um fragmento de Fc de imunoglobulina, por recombinação genética. Por exemplo, o interferão (publicação da pat. coreana No. 2003-9464) e o receptor de interleucina-4, o receptor de interleucina-7 ou

o receptor de eritropoietina (EPO) (pat. coreana com o registo No. 249572) foram previamente expressos em mamíferos numa forma fundida com um fragmento de Fc de imunoglobulina. A publicação da pat. internacional No. WO 01/03737 descreve uma proteína de fusão compreendendo uma citocina ou um factor de crescimento ligado a um fragmento Fc de imunoglobulina, através de um ligante de oligo-péptido.

Além disso, a pat. norte-americana U.S. No. 5.116.964 descreve uma LHR (glicoproteína da superfície das células linfocitárias) ou uma proteína CD4 fundida com um terminal carboxilo ou um terminal amino de um fragmento de Fc de uma imunoglobulina por meio de recombinação genética e a pat. norte-americana U.S. No. 5.349.053 descreve uma proteína de fusão de IL-2 e um fragmento de Fc de uma imunoglobulina. Outros exemplos de proteínas de fusão de Fc preparadas por recombinação genética incluem uma proteína de fusão de interferão-beta ou um seu derivado e um fragmento de Fc de uma imunoglobulina (publicação da pat. internacional No. WO 00/23472), uma proteína de fusão do receptor de IL-5 e um fragmento de Fc de uma imunoglobulina (pat. norte-americana U.S. No. 5.712.121), uma proteína de fusão do interferão- 4 alfa e um fragmento de Fc de uma imunoglobulina G4 (pat. norte-americana U.S. No. 5.723.125) e uma proteína de fusão da proteína CD4 e um fragmento de Fc de uma imunoglobulina G2 (pat. norte-americana U.S. No. 6.451.313). Na pat. norte-americana U.S. No. 5.605.690 também se descreve uma variante de Fc com uma alteração de um aminoácido especialmente num sítio de ligação do complemento ou num sítio de ligação de um receptor, que se pode fundir com o receptor de FNT, por tecnologias de ADN recombinante, para se obter uma proteína de fusão de Fc RENT-IgGl. Desta forma, os processos de preparação de uma proteína de fusão, utilizando um fragmento de Fc de uma imunoglobulina modificado por recombinação genética, estão também descritos nas pat. norte-americanas U.S. Nos. 6.277.375, 6.410.008 e 6.444.792. A pat. norte-americana U.S. No. 6.660.843 descreve um processo de produção de um conjugado que compreende uma proteína-alvo fundida com um fragmento de Fc de uma imunoglobulina por meio de um ligante, em E. coli, por recombinação genética. Este processo permite produzir o conjugado a um custo mais baixo do que quando se utilizam sistemas de expressão de mamíferos e providencia o conjugado numa forma glicosilada. Contudo, como a proteína-alvo e o fragmento de Fc de imunoglobulina são produzidos em conjunto na E. coli, se a proteína-alvo for glicosilada na natureza, é difícil aplicar essa proteína-alvo utilizando este processo. Este processo tem outro problema de expressão do conjugado como corpos de inclusão, resultando em taxas de enovelamento muito altas.

Contudo, essas proteínas de fusão de Fc, produzidas por recombinação genética, têm as seguintes desvantagens: a fusão da proteína ocorre apenas numa região específica de 5 um fragmento de Fc de uma imunoglobulina, que é a extremidade do terminal carboxilo ou amino; produziram-se apenas formas homodiméricas e não formas monoméricas; e pode ocorrer uma fusão apenas entre as proteínas glicosiladas ou entre as proteínas não glicosiladas e é impossível produzir uma proteina de fusão composta por uma proteina glicosilada e uma proteina não glicosilada. Além disso, uma nova sequência de aminoácidos, criada pela fusão, pode desencadear respostas imunitárias e uma região ligante pode tornar-se susceptivel de degradação proteolitica.

Por outro lado, no que respeita ao desenvolvimento das proteínas de fusão utilizando um fragmento de Fc de uma imunoglobulina, não há nenhum relato de um conjugado que compreende uma proteina-alvo ligada a uma Fc natural derivada de um ser humano, utilizando um agente de reticulação. A preparação de um conjugado, utilizando um ligante, tem a vantagem de facilitar a selecção e o controlo dos sitios de ligação e a orientação de duas proteínas ligadas uma à outra e permite a expressão num monómero, dimero ou multimero e a preparação de estruturas homólogas ou heterólogas. 0 fragmento de Fc de uma imunoglobulina pode ser produzido por tecnologias de ADN recombinante utilizando células de mamíferos ou de E. coli. Contudo, até à data, não há nenhum relato de um fragmento de Fc de uma imunoglobulina natural que seja simplesmente produzido em massa, com elevados rendimentos, na E. coli e que se possa aplicar a formulações de actuação prolongada. Até à data, também não houve nenhuma tentativa para a produção de um conjugado compreendendo uma proteina-alvo ligada a esse fragmento de Fc de uma imunoglobulina derivado de E. coli, produzido por tecnologias de ADN recombinante, por meio de um agente de reticulação. 6

Por outro lado, as imunoglobulinas têm funções de anticorpo, tal como citotoxicidade mediada por células dependentes do anticorpo (CCDA) ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e partes de açúcar presentes num fragmento de Fc de imunoglobulinas desempenham papéis importantes nos efeitos da CCDA e da CDC (Burton D., Molec. Immun. 22, 161-206, 1985). As imunoglobulinas, a que faltam partes de açúcar têm semi-períodos de vida semelhantes às imunoglobulinas glicosiladas mas 10 a 1000 vezes menos afinidade de ligação para o complemento e para a ligação do receptor (Waldmann H., Eur. J. Immunol. 23, 403-411, 1993; Morrison S., J. Immunol. 143, 2595-2601, 1989).

Stevenson et al. (Journal of Immunology, 1997, 158, pp. 2242-2250) descreve um conjugado que consiste num componente charneira de Fc e um componente de Fab activo sob o ponto de vista fisiológico. A ligação entre os dois componentes é feita por via de ligações estáveis de tioéter. Dl não menciona a ligação de um polipéptido, activo sob o ponto de vista fisiológico e de um fragmento Fc de imunoglobulina por via de um polímero não peptídico. A patente europeia EP 0580171A refere-se a um conjugado de Fc e carbodi-imida com uma substância anti-tumor tal como mitomicina ou doxorubicina. Também neste caso, a EP0580141A não descreve a ligação por via de um componente de polímero não peptídico. A patente norte-americana US 5.045.312A descreve um conjugado de carbodi-imida da hormona de crescimento humano com uma imunoglobulina. Uma vez mais esta referência não descreve a ligação do polipétido activo, sob o ponto de vista fisiológico e a imunoglobulina por via de um polímero 7 não peptídico. Além disso a patente norte-americana US 5.045.312A não utiliza um fragmento de Fc da IgG, como requerido pela reivindicação 1, mas uma IgG de comprimento completo. A patente WO 01/03737A1 descreve uma proteína de fusão enquadrada por Fc com ligantes de péptidos e limita-se a proteínas de fusão do Fc do fármaco. A patente WO 01/81415A2 descreve polipéptidos terapêuticos de PTH ligados por via de um ligante não peptídico a um fragmento de Fc. A patente WO01/81415A2 não descreve o conjugado específico da presente invenção.

Tal como descrito antes, tentaram-se vários processos para ligar um polímero a uma proteína activa sob o ponto de vista fisiológico. Os processos convencionais melhoram a estabilidade dos polipéptidos mas reduzem significativamente a sua actividade ou aumentam a actividade dos polipéptidos, independentemente da estabilidade. Assim, há necessidade de um novo processo capaz de conseguir tanto a redução da actividade minima como o aumento da estabilidade para um fármaco de proteína.

Sob este ponto de vista, par se chegar à presente invenção, fez-se uma investigação intensiva e cuidadosa para desenvolver uma formulação de um fármaco de proteína de acção prolongada capaz de cumprir tanto a redução da actividade mínima como o aumento da estabilidade, o que convencionalmente era considerado como difícil de atingir e resultou na descoberta de que um conjugado de proteína, preparado por ligação covalente de um fragmento de Fc de uma imunoglobulina, um polímero não peptídico e um polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico, que 8 prolonga significativamente o semi-periodo de vida da proteína activa sob o ponto de vista fisiológico, no soro e que mantém títulos mais elevados do que os fármacos com as proteínas conhecidas.

Descrição da invenção

Por isso, constitui um objecto da presente invenção providenciar um conjugado de proteínas que minimize a redução da actividade de um polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico, ao mesmo tempo que prolonga o semi-periodo de vida do polipéptido no soro, reduzindo ao mesmo tempo o risco de induzir respostas imunitárias e um processo para preparar esse conjugado de proteína.

Constitui um outro objecto da presente invenção providenciar uma formulação de fármaco de proteína de acção prolongada compreendendo o conjugado de proteína com o semi-periodo de vida no soro prolongado, como componente eficaz.

Constitui um outro objecto da presente invenção providenciar um processo para melhorar a estabilidade e a duração da acção fisiológica minimizando a redução de actividade de um polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico, ao mesmo tempo que prolonga o semi-periodo de vida do polipéptido no soro.

Breve descrição dos desenhos

Os objectivos anteriores e outros, as caraterísticas e outras vantagens da presente invenção serão compreendidos de forma mais clara a partir da descrição detalhada que se 9 segue, em conjunto com os desenhos que a acompanham, em que: A FIG. 1 mostra os resultados da cromatografia de um fragmento Fc de imunoglobulina obtido por clivagem de uma imunoglobulina com papaina; A FIG. 2 mostra os resultados EGPA-SDS de um fragmento Fc de imunoglobulina purificado (M: marcador da dimensão molecular, coluna 1: IgG, coluna 2: Fc) ; FIG. 3 mostra os resultados da EGPA-SDS do conjugado de IFNcx-PEG-Fc (A) , 17Ser-G-CSF-PEG-Fc (B) e EPO-PEG-Fc (C), que são gerados por uma reacção de acoplamento (M: marcador da dimensão molecular, coluna 1: Fc, coluna 2: proteína activa sob o ponto de vista fisiológico, coluna 3: conjugado de proteína activa sob o ponto de vista fisiológico - Fc de PEG); A FIG. 4 mostra os resultados da cromatografia por exclusão de dimensão de um conjugado de IFNcx-PEG-Fc que é purificado depois da reacção de acoplamento; A FIG. 5 mostra os resultados da espectrometria de massa de MALDI-TOF de um conjugado de EPO-PEG-Fc;

As FIGS. 6a e 6b mostram os resultados da espectrometria de massa de MALDI-TOF e a análise por EGPA-SDS, respectivamente, de um Fc de uma imunoglobulina natural e um Fc desglicosilado de uma imunoglobulina (Fc DG); A FIG. 7 mostra os resultados da espectrometria de massa de MALDI-TOF de um conjugado de IFNcx-PEG-Fc e um conjugado de IFNcx-PEG-Fc de DG;

As FIGS. 8a a 8c mostra os resultados da CLAR de fase inversa dos conjugados derivados de IFNcx-PEG-Fc, IFNcx-PEG-Fc DG e IFNcx-PEG-Fc NG recombinante; A FIG. 9 representa um gráfico que mostra os resultados da análise f armacocinética de um IFNcx natural, um 10 complexo de IFNa-PEG de 4 0K, um conjugado de IFNa-PEG-albumina e um conjugado de IFNa-PEG-Fc; A FIG. 10 representa um gráfico que mostra os resultados da análise farmacocinética de uma EPO natural, uma EPO altamente glicosilada, um conjugado de EPO-PEG-Fc e um conjugado de EPO-PEG-Fc de AG; A FIG. 11 representa um gráfico que mostra os resultados da análise farmacocinética de conjugados de derivados de IFNcx-PEG-Fc, IFNa-PEG-Fc de DG e IFNa-PEG-Fc NG recombinante; A FIG. 12 representa um gráfico que mostra a farmacocinética de um Fab', um complexo de Fab'-S-PEG de 40K, um conjugado de Fab'-N-PEG-N-Fc e um conjugado de Fab'-S-PEG-N-Fc; A FIG. 13 representa um gráfico que mostra as actividades in vivo de um complexo de Fab'-S-PEG de 4 0 K, um conjugado de Fab'-N-PEG-N-Fc e um conjugado de Fab'-S-PEG-N-Fc; A FIG. 14 representa um gráfico que mostra os resultados da comparação das subclasses de IgG humana no que respeita à afinidade de ligação ao complemento C1 q; e A FIG. 15 representa um gráfico que mostra os resultados da comparação de um Fc glicosilado, um Fc de desglicosilado enzimaticamente (DG) e um conjugado de interferão-PEG-veículo em que o veiculo é Fc NG produzido por E. coli para a afinidade de ligação do complemento de Clq.

Melhor prática para a realização da presente invenção

Num aspecto, para concretizar os objectivos anteriores, a presente invenção providencia um conjugado de proteína compreendendo um polipéptido activo, sob o ponto 11 de vista fisiológico, um polímero não peptídico com um grupo reactivo em ambas as extremidades e um fragmento de Fc de imunoglobulina, em que o polímero não peptídico está ligado linearmente, em ambas as extremidades, ao polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico e ao fragmento de Fc de imunoglobulina, por uma ligação covalente e em que o polímero não peptídico é polietileno-glicol. A expressão "conjugado de proteína" ou "conjugado", tal como utilizada aqui, refere-se a um conjugado que contém um ou mais polipéptidos activos sob o ponto de vista fisiológico, um ou mais polímeros não peptídicos com um grupo reactivo nas duas extremidades e um ou mais fragmentos de Fc de imunoglobulina, em que os três componentes estão ligados covalentemente. Além disso, para distinguir de "conjugado", uma estrutura que compreende apenas duas moléculas diferentes, seleccionadas entre um polipéptidos activo sob o ponto de vista fisiológico, um polímero não peptídico e um fragmento de Fc de imunoglobulina, em que as duas moléculas estão ligadas covalentemente, designa-se por "complexo". 0 conjugado de proteína da presente invenção é uma variante de um fármaco de proteína para reduzir a redução da actividade fisiológica e para aumentar a duração do fármaco de proteína, in vivo, que é caracterizado pela ligação de um fragmento de Fc de imunoglobulina ao fármaco de proteína. 0 fragmento de Fc de imunoglobulina é seguro para ser utilizado como um veículo de fármaco porque é um polipéptido biodegradável que é metabolizado no corpo. 0 fragmento de Fc de imunoglobulina também tem um peso 12 molecular relativamente baixo comparado com o das moléculas completas de imunoglobulina, sendo assim, devido a isso, vantajoso na preparação, purificação e obtenção dos conjugados. Dado que o fragmento de Fc de imunoglobulina não contém o fragmento Fab, cuja sequência de aminoácidos difere entre as subclasses de anticorpos e que assim é muitíssimo pouco homogénea, pode aumentar significativamente a homogeneidade das substâncias e pode ser menos antigénica. A expressão "fragmento de Fc de imunoglobulina", tal como se utiliza aqui, refere-se a uma proteína que contém a região constante 2 de cadeia pesada (CP2) e a região constante 3 de cadeia pesada (CP3) de uma imunoglobulina e não contém regiões variáveis das cadeias pesada e leve, a região constante 1 de cadeia pesada (CP1) e a região constante 1 de cadeia leve (CL1) da imunoglobulina. Pode ainda incluir a região de charneira na região constante de cadeia pesada. O fragmento Fc de imunoglobulina da presente invenção também pode conter um porção ou toda a região constante 1 de cadeia pesada (CP1) e/ou a região constante 1 de cadeia leve (CL1), excepto para as regiões variáveis de cadeias pesada e leve. Do mesmo modo, desde que tenha uma função fisiológica praticamente similar ou melhor do que a da proteína natural, o fragmento de Fc da IgG pode ser um fragmento com uma eliminação numa porção relativamente longa da sequência de aminoácidos de CP2 e/ou CP3. Isto é, o fragmento de Fc da imunoglobulina da presente invenção pode compreender 1) um domínio CP1, um domínio CP2, um domínio CP3 e um domínio CP4, 2) um domínio CP1 e um domínio CP2, 3) um domínio CP1 e um domínio CP3, 4) um domínio CP2 e um domínio CP3, 5) uma combinação de um ou mais domínios e uma região charneira de imunoglobulina (ou uma porção da região de charneira) e 6) um dímero de cada 13 domínio das regiões constantes de cadeia pesada e da região constante de cadeia leve. 0 fragmento de Fc de imunoglobulina da presente invenção inclui uma sequência de aminoácidos naturais e derivados dessa sequência (mutantes). Um derivado de uma sequência de aminoácidos é uma sequência que é diferente da sequência de aminoácidos naturais devido a uma eliminação, uma inserção, uma substituição não conservadora ou uma substituição conservadora ou combinações de um ou mais resíduos de aminoácidos. Por exemplo, num Fc de IgG, podem utilizar-se resíduos de aminoácidos conhecidos por serem importantes na ligação, nas posições 214 a 238, 297 a 299, 318 a 322 ou 327 a 331, como alvo apropriado para a modificação. Também é possível utilizar outros derivados, incluindo um no qual foi eliminada uma região capaz de formar uma ligação de dissulfureto ou em que certos resíduos de aminoácidos estão eliminados na extremidade do terminal N de uma forma natural de Fc ou em que se adiciona um resíduo de metionina. Além disso, para eliminar as funções efectoras, pode ocorrer uma eliminação num sítio de ligação do complemento, tal como num sítio de ligação de Clq e um sítio de CCDA. As técnicas de preparação desses derivados de sequências do fragmento de Fc de imunoglobulina estão descritas na publicação das pat. internacionais nos. WO 97/34631 e WO 96/32478.

As permutas de aminoácidos nas proteínas e nos péptidos, que geralmente não alteram a actividade das proteínas ou dos péptidos, são conhecidas na técnica (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque, 197 9) . As permutas que ocorrem com maior frequência são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Tre/Ser, Ala/Gli, Ala/Tre, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gli, Tre/Fen, Ala/Pro, Lis/Arg, 14

Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gli, em ambas as direcções.

Além disso, o fragmento de Fc, se desejado, pode ser modificado por fosforilação, sulfação, acrilação, glicosilação, metilação, farnesilação, acetilação, amidação e similares.

Os derivados de Fc, mencionados antes, são derivados que têm uma actividade biológica idêntica à do fragmento de Fc da presente invenção ou que melhoram a estabilidade estrutural, por exemplo, face ao calor, pH ou similar.

Além disso, estes fragmentos de Fc podem ser obtidos a partir de formas naturais isoladas de seres humanos e de outros animais incluindo vacas, cabras, porcos, murganhos, coelhos, hamsters, ratos e cobaias ou podem ser recombinantes ou os seus derivados, obtidos de células transformadas de animais ou de microrganismos. Podem obter-se a partir de uma imunoglobulina natural por isolamento de imunoglobulinas completas a partir de organismos humanos ou de animais e tratando-as com uma enzima proteolitica. A papaina digere a imunoglobulina natural nos fragmentos Fab e Fc e pepsina e o tratamento resulta na produção de fragmentos de pF'c e de F(ab')2. Estes fragmentos podem ser submetidos, por exemplo, a cromatografia de exclusão por dimensão para isolar Fc ou pF'c.

Preferencialmente, um fragmento de Fc derivado de um ser humano é um fragmento de Fc recombinante de imunoglobulina que se obtém de um microrganismo.

Além disso, o fragmento Fc de imunoglobulina da presente invenção pode estar sob a forma que tem cadeias 15 naturais de açúcar, um aumento das cadeias de açúcar comparando com uma forma natural ou um decréscimo das cadeias de açúcar comparando com uma forma natural ou pode estar numa forma desglicosilada. 0 aumento, a diminuição ou a eliminação das cadeias de açúcar do fragmento Fc de imunoglobulina podem ser conseguidos por processos comuns na técnica, tal como um processo químico, um processo enzimático e um processo de engenharia genética utilizando um microrganismo. A eliminação das cadeias de açúcar de um fragmento Fc resulta num decréscimo pronuncidado da afinidade de ligação à parte Clq do primeiro componente do complemento Cl e uma diminuição ou uma perda da citotoxicidade mediada pelas células, dependente do anticorpo (CCDA) ou da citotoxicidade dependente do complemento (CDC), não induzindo assim resposta imunitárias desnecessárias in vivo. Sob este ponto de vista, um fragmento de Fc de imunoglobulina, numa forma desglicosilada ou não glicosilada, pode ser mais apropriado, para o objecto da presente invenção, como um veículo do fármaco.

Tal como se utiliza aqui, o termo "desglicosilação" refere-se à eliminação, por via enzimática, das partes de açúcar de um fragmento de Fc e o termo "sem glicosilação" significa que se produz um fragmento de Fc sob uma forma não glicosilada por meio de um procarioto, de preferência E. coli.

Por outro lado, o fragmento de Fc de imunoglobulina pode derivar de seres humanos ou de outros animais incluindo vacas, cabras, porcos, murganhos, coelhos, hamsteres, ratos e cobaias e, preferencialmente, de seres humanos. Além disso, o fragmento Fc de imunoglobulina pode ser um fragmento de Fc que deriva de IgG, IgA, IgD, IgE e 16

IgM ou é produzido pelas suas combinações ou os seus híbridos. De preferência, deriva de IgG ou de IgM, que está entre as proteínas mais abundantes no sangue humano e, mais preferencialmente, de IgG, que é conhecida por aumentar os semi-períodos de vida das proteínas que se ligam a um ligando.

Por outro lado, o termo "combinação", tal como utilizado aqui, significa que os polipéptidos que codificam as regiões Fc de imunoglobulina de cadeia simples, da mesma origem, estão ligados a um polipéptido de cadeia simples de uma origem diferente, para formar um dímero ou um multímero. Isto é, um dímero ou um multímero pode ser formado a partir de dois ou mais fragmentos selecionados no grupo que consiste em fragmentos de Fc de IgGl, Fc de IgG2, Fc de IgG3 e Fc de IgG4. 0 termo "híbrido", tal como utilizado aqui, significa que as sequências que codificam dois ou mais fragmentos de Fc de imunoglobulina, de origens diferentes, estão presentes num fragmento de Fc de imunoglobulina de cadeia simples. Na presente invenção, são possíveis vários tipos de híbridos. Isto é, os híbridos do domínio podem ser compostos por um a quatro domínios seleccionados no grupo que consiste em CPI, CP2, CP3 e CP4 de Fc de IgGl, de Fc de IgG2, de Fc de IgG3 e de Fc de IgG4 e podem incluir a região de charneira.

Por outro lado, a IgG divide-se nas subclasses de IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4 e a presente invenção inclui as suas combinações e os seus híbridos. Preferem-se as subclasses de IgG2 e IgG4 e, o mais preferido, é o fragmento de Fc de IgG4 que raramente tem funções efectoras 17 tais como CDC (citotoxicidade dependente do complemento) (ver as fig. 14 e 15).

Isto é, como veículo de fármaco da presente invenção, o fragmento de Fc de imunoglobulina mais preferido é um fragmento de Fc não glicosilado, derivado de IgG4 humana. Um fragmento de Fc com origem humana é mais preferido do que um fragmento de Fc com origem não humana, que pode actuar como um antigénio no corpo humano e causar respostas imunitárias indesejáveis tal como a produção de um novo anticorpo contra o antigénio. A presente invenção é caracterizada pelo facto de o fragmento de Fc de imunoglobulina e a proteína de fármaco estarem ligados por via de um polímero não peptídico. A expressão "polímero não peptídico", tal como utilizada aqui, refere-se a um polímero biocompatível incluindo duas ou mais unidades que se repetem ligadas umas às outras por uma ligação covalente excluindo a ligação do péptido. 0 polímero não peptídico capaz para ser utilizado na presente invenção é o poli(etileno-glicol) (PEG). Os seus derivados, bem conhecidos na técnica e que se preparam facilmente no âmbito desta técnica, também estão incluídos no âmbito da presente invenção. 0 peso molecular do polímero não peptídico varia, preferencialmente, de 1 a 100 kDa e, preferencialmente, de 1 a 20 kDa. O polímero não peptídico da presente invenção ligado ao fragmento de Fc da imunoglobulina pode ser um polímero ou também uma combinação de diferentes tipos de polímeros. 18 0 polímero não peptídico útil na presente invenção tem um grupo reactivo capaz de se ligar ao fragmento de Fc da imunoglobulina e ao fármaco da proteína. 0 polímero não peptídico tem um grupo reactivo nas duas extremidades que se selecciona, preferencialmente, no grupo que consiste num grupo aldeído reactivo, um grupo aldeído de propiona, um grupo aldeído de butilo, um grupo maleimida e um derivado de succinimida. 0 derivado de succinimida pode ser propionato de succinimidilo, hidroxi-succinimidilo, carboximetil-succinimidilo ou carbonato de succinimidilo. Em particular, quando o polímero não peptídico tem um grupo reactivo aldeído nas duas extremidades, é eficaz na ligação de ambas as extremidades com um polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico e um fragmento Fc de imunoglobulina com reacções mínimas não específicas. Um produto final gerado por alquilação redutora, por via de uma ligação de um aldeído, é mais estável do que quando está ligado por via de uma ligação de amida.

Os grupos reactivos, em ambas as extremidades do polímero não peptídico, podem ser iguais ou diferentes. Por exemplo, o polímero não peptídico pode comportar um grupo maleimida numa extremidade e, na outra extremidade, um grupo aldeído, um grupo aldeído propiónico ou um grupo aldeído butílico. Quando se utiliza, como o polímero não peptídico, um polietileno-glicol (PEG) com um grupo hidroxi reactivo nas suas duas extremidades, o grupo hidroxi pode ser activado com vários grupos reactivos por meio de reacções químicas conhecidas ou um PEG com um grupo reactivo modificado, comercialmente disponível, pode ser utilizado para preparar o conjugado de proteína da presente invenção. 19

Por outro lado, na presente invenção, um complexo do fragmento de Fc da imunoglobulina e o polímero não peptídico estão ligados a um polipéptido, activo sob o ponto de vista fisiológico, para dar origem a um conjugado de proteína.

As expressões "polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico", "proteína activa sob o ponto de vista fisiológico", "polipéptido activo", "fármaco de polipéptido" ou "fármaco de proteína", tal como se utilizam aqui, são intermutáveis nos seus significados e são características pelo facto de estarem sob a forma activa, sob o ponto de vista fisiológico, exibindo várias funções fisiológicas in vivo. 0 fármaco de proteína tem a desvantagem de ser incapaz de suster a acção fisiológica durante um longo período de tempo devido à sua propriedade de ser facilmente desnaturado ou degradado por meio de enzimas proteolíticas presentes no corpo. Contudo, quando o fármaco de polipéptido está conjugado com o fragmento de Fc de imunoglobulina da presente invenção para formar um conjugado, tendo o fármaco uma estabilidade estrutural acrescida e uma degradação do semi-período de vida. 0 polipéptido conjugado com o fragmento de Fc também tem uma diminuição menor da actividade fisiológica do que outras formulações conhecidas de fármacos de polipéptido. Por isso, comparado com a biodisponibilidade in vivo dos fármacos convencionais de polipéptido, o conjugado do polipéptido e o fragmento de Fc de imunoglobulina, de acordo com a presente invenção, é caracterizado por ter melhorado significativamente a biodisponibilidade in vivo. Isto está também claramente descrito através das modalidades da presente invenção. Isto é, quando ligado a 20 um fragmento de Fc da imunoglobulina da presente invenção, IFNa, FEC-G, hGH e outros fármacos de proteína exibiram um aumento de duas a seis vezes da biodisponibilidade in vivo, comparada com as suas formas convencionais conjugadas apenas com PEG ou tanto com PEG como com albumina (quadros 8, 9 e 10) .

Por outro lado, a ligação de uma proteína e do fragmento de Fc da imunoglobulina da presente invenção é caracterizada pelo facto de não ser uma fusão por um processo de recombinação convencional. Obtém-se uma forma de fusão do fragmento de Fc da imunoglobulina e um polipéptido activo utilizado como um fármaco por um processo de recombinação, de tal modo que o polipéptido está ligado ao terminal N ou ao terminal C do fragmento de Fc e é assim expresso e dobrado como um polipéptido simples de uma sequência de nucleótidos que codifica a forma de fusão.

Isto origina uma diminuição pronunciada da actividade da proteína de fusão resultante por causa da actividade de uma proteína, como uma substância funcional sob o ponto de vista fisiológico, que é determinada pela conformação da proteína. Assim, quando um fármaco de polipéptido se funde com Fc por meio de um processo de recombinação, não há nenhum efeito no que se refere à biodisponibilidade in vivo mesmo quando a proteína de fusão tem uma estabilidade estrutural acrescida. Dado que essa proteína de fusão está também muitas vezes enovelada e assim expressa como corpos de inclusão, o processo de fusão não é económico na produção de proteínas e no rendimento do isolamento. Além disso, quando a forma activa ou um polipéptido está numa forma glicosilada, o polipéptido pode ser expresso em células eucarióticas. Neste caso, Fc está também 21 glicosilado e esta glicosilação pode causar respostas imunitárias indesejáveis in vivo.

Isto é, só a presente invenção torna possível produzir um conjugado de um polipéptido activo glicosilado e um fragmento de Fc não glicosilado de imunoglobulina e ultrapassa todos os problemas anteriores, incluindo a melhoria do rendimento da produção de proteína porque os dois componentes do complexo são preparados individualmente e isolados pelos melhores sistemas.

Por outro lado, o polipéptido, activo sob o ponto de vista fisiológico, aplicável ao conjugado de proteína da presente invenção é exemplificado por hormonas, citocinas, interleucinas, proteínas de ligação à interleucina, enzimas, anticorpos, factores de crescimento, factores reguladores da transcrição, factores de coagulação, vacinas, proteínas estruturais, proteínas ou receptores de ligando, antigénios da superfície das células, antagonistas do receptor e os seus derivados.

Em detalhe, exemplos não limitativos do polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico incluem hormona do crescimento humano, hormona de libertação da hormona de crescimento, péptido de libertação da hormona de crescimento, interferões e receptores de interferões (por exemplo, interferão α, β e γ, receptor de interferão do tipo I solúvel em água, etc.), factores de estimulação de colónias, interleucinas (por exemplo, interleucina-1, -2 -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15 -16, -17, -18, -19, - 20, - 21, -22, -23, -24, -25, -26 -27, -28, -29, -30, etc.) e receptores de interleucina (por exemplo, receptor de IL-1, receptor de IL-4, etc.), enzimas (por exemplo, glucocerebrosidase, iduronato-2-sulfatase, 22 alfa-galactosidase-A, alfa-L-iduronidase, butiril-colinesterase, quitinase, glutamato-descarboxilase, imiglucerase, lipase, uricase, acetil-hidrolase como factor de activação de plaquetas, endopeptidase neutra, mieloperoxidase, etc.) , proteínas de ligação a interleucina e a citocina (por exemplo, IL de 18 pb, proteína de ligação ao FNT, etc.), factor de activação de macrófagos, péptido de macrófagos, factor de células B, factor de células T, proteína A, inibidor de alergias, glicoproteínas de necrose das células, imunotoxina, linfotoxina, factor de necrose do tumor, supressores de tumor, factor de crescimento de metástases, antitripsina alfa-1, albumina, alfa-lactalbumina, apolipoproteína E, eritropoietina, eritro-poietina altamente glicosilada, angiopoietinas, hemoglobina, trombina, péptido de activação do receptor de trombina, trombomodulina, factor VII, factor VIIA, factor VIII, factor IX, factor XIII, factor de activação de plasminogénio, péptido de ligação da fibrina, urocinase, estreptocinase, hirudina, proteína C, proteína C reactiva, inibidor de renina, inibidor de colagenase, superóxido-dismutase, leptina, factor de crescimento derivado de plaquetas, factor de crescimento epitelial, factor de crescimento epidérmico, angiostatina, angiotensina, factor de crescimento ósseo, proteína de estimulação dos ossos, calcitonina, insulina, atriopeptina, factor indutor da cartilagem, elcatonina, factor de activação do tecido conjuntivo, inibidor da via do factor de tecido, hormona de estimulação do foliculo, hormona de luteinização, hormona de libertação da hormona de luteinização, factores de crescimento dos nervos (por exemplo, factor de crescimento do nervo, factor neurotrófico ciliar, factor 1 da axogénese, péptidos semelhantes ao glucagon (por exemplo, GLP-1 etc.), péptido natriurético do cérebro, factor neurotrófico derivado da glial, netrina, factor inibidor de 23 neutrófilos, factor neurotrófico, neuturina, etc.), hormona paratiróide, relaxina, secretina, somatomedina, factor de crescimento semelhante à insulina, hormona das suprarenais, glucagon, colecistocinina, polipéptido pancreático, péptido de libertação de gastrina, factor de libertação de corticotropina, hormona de estimulação da tiróide, autotaxina, lactoferrina, miostatina, receptores (por exemplo, RFNT(P75), RFNT(P55), receptor de IL-1, receptor de FCEV, receptor do factor de activação das células B, etc.), antagonistas de receptores (por exemplo, ILl-Ra etc.), antigénios da superfície das células (por exemplo, CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69, etc.), anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpos (por exemplo, scFv, Fab, Fab', F(ab')2 e Fd), e antigénios de vacinas derivadas de vírus.

Em particular, os polipéptidos preferidos como polipéptidos activos sob o ponto de vista fisiológico são os que requerem uma dose frequente de administração ao corpo para a terapia ou a prevenção de doenças que incluem a hormona do crescimento humano, interferões (interferão a, β, γ, etc.), factor de estimulação de colónias de granulócitos, eritropoietina (EPO) e fragmentos de anticorpos. O fármaco de polipéptido mais preferido é o interferão alfa. Além disso, alguns derivados estão incluídos no âmbito dos polipéptidos activos sob o ponto de vista fisiológico da presente invenção desde que tenham a função, a estrutura, a actividade ou a estabilidade praticamente idêntica ou melhor comparada com as formas naturais dos polipéptidos activos sob o ponto de vista fisiológico. 24

Na presente invenção, um fragmento de anticorpo pode ser Fab, Fab', F(ab')2, Fd ou scFv, que é capaz de se ligar a um antigénio especifico e, preferencialmente Fab'. Os fragmentos Fab contêm o domínio variável (VL) e o domínio constante (CL) da cadeia leve e o domínio variável (VP) e o primeiro domínio constante (CP1) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab em termos de adição de vários resíduos de aminoácidos incluindo um ou mais resíduos de cisteína da região de charneira com o terminal de carboxilo do domínio CP1. Os fragmentos Fd compreendem apenas o domínio VP e o domínio CP1 e os fragmentos F(ab')2 são produzidos como um par de fragmentos Fab' quer por meio de ligações de dissulfureto ou uma reacção química. Os fragmentos scFv (Fv de cadeia simples) compreendem os domínios VL e VP que estão ligados uns aos outros por meio de um ligante de péptido e assim estão presente numa única cadeia de polipéptido.

Por outro lado, quando um fragmento de Fc de imunoglobulina e um fármaco de proteína estão ligados por meio de um polímero não peptídico, ligando sítios do fragmento de Fc de imunoglobulina incluem um ou mais grupos reactivos livres de resíduos de aminoácidos presentes na região de charneira ou na região constante.

Preferencialmente, a região constante do Fc de imunoglobulina e o fármaco de proteína estão ligados covalentemente na extremidade do terminal amino e um grupo amino de um resíduo de lisina, um grupo amino de um resíduo de histidina ou um resíduo de cisteína livre com um grupo reactivo nas respectivas extremidades do polímero não peptídico. 0 conjugado de proteína da presente invenção pode incluir uma ou mais estruturas unitárias de "polipéptido 25 polimero não activo sob o ponto de vista fisiológico -peptidico - fragmento de Fc de imunoglobulina", em que todos os componentes estão ligados linearmente por uma ligação covalente. Dado que o polimero não peptidico não possui um grupo reactivo nas suas duas extremidades, está ligado ao polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico e ao de um fragmento Fc de imunoglobulina através de uma ligação covalente. Isto é, pode-se ligar, a um fragmento simples de Fc de imunoglobulina, um ou mais complexos de um polimero não peptidico com um polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico, por meio de uma ligação covalente para dar origem a um monómero, dimero ou multimero do polipéptido, activo sob o ponto de vista fisiológico, por meio do fragmento Fc de imunoglobulina, conseguindo-se assim uma melhoria efectiva da actividade e da estabilidade in vivo.

No conjugado de proteina da presente invenção, a proteina, activa sob o ponto de vista fisiológico, pode ligar-se ao fragmento de Fc de imunoglobulina em várias proporções molares.

Além disso, como é conhecido convencionalmente, ligar duas proteinas diferentes por via de um oligopéptido, uma sequência de aminoácidos, criada no sitio da junção, tem o risco de induzir respostas imunitárias e os sitios de ligação das proteinas estão limitados ao terminal de N e ao terminal de C. Ao contrário, dado que o conjugado de proteina da presente invenção é mediado por um polimero não peptidico biocompativel, é vantajoso, em termos de não haver efeitos secundários tais como toxicidade ou indução de respostas imunitárias e permitir a preparação de vários conjugados de proteina devido à diversidade dos seus sitios de ligação. 26

Além disso, o processo convencional da fusão directa de um fragmento de Fc de imunoglobulina com uma proteína activa, por recombinação genética, é problemática porque permite que a fusão se faça apenas numa sequência do terminal do fragmento de Fc de imunoglobulina utilizado como um parceiro de fusão e porque limita o rendimento da proteína de fusão devido ao seu modo de produção ser dependente de uma cultura de células de animal. 0 processo convencional tem outros problemas em que a actividade da proteína activa pode diminuir devido à glicosilação não natural, a dobragem da proteína deve ocorrer com precisão e a proteína de fusão pode ser produzida numa forma de homodímero. Em particular, quando se produzem os conjugados em E. coli, os conjugados enovelados insolúveis são muito difíceis de remover. Por outro lado, o conjugado de proteína da presente invenção pode alcançar uma duração de acção mais longa e uma estabilidade muito maior sem causar estes problemas, é preferível, no que respeita à manutenção da actividade de um polipéptido e permite a preparação de um conjugado que compreende uma proteína terapêutica glicosilada ligada a um Fc não glicosilado.

Por outro lado, ligantes químicos de baixo peso molecular, tal como carbodi-imida ou glutaraldeído, têm os seguintes problemas: ligam-se simultaneamente a vários sítios numa proteína, levando à desnaturação da proteína e não se ligam de forma específica, tornando assim difícil controlar os sitios de ligação ou purificar uma proteína ligada. Pelo contrário, dado que o conjugado de proteína da presente invenção utiliza um polímero não peptídico, facilita o controlo dos sítios de ligação, minimiza as reacções não específicas e facilita a purificação da proteína. 27 A utilidade da presente invenção está descrita com mais detalhe com base nas modalidades da presente invenção, tal como se segue. 0 conjugado de proteína (polipéptido-PEG-Fc) da presente invenção, compreendendo um polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico e um fragmento de Fc de imunoglobulina, gue estão ligados a cada extremidade de PEG, exerce uma estabilidade muito maior do que um complexo de polipéptido-PEG ou um conjugado de polipéptido-PEG-albumina. A análise farmacocinética revelou que IFNa tem um semi-período de vida no soro aumentado cerca de 20 vezes quando ligados a um PEG de 40 kDa (complexo de IFNa-PEG de 40 K) e de cerca de 10 vezes num conjugado de IFNa-PEG-albumina, comparado com o IFNa natural. Pelo contrário, um conjugado de IFNa-PEG-Fc, de acordo com a presente invenção mostrou um semi-período de vida significativamente aumentado de cerca de 50 vezes (ver, quadro 3). Além disso, observou-se o mesmo resultado noutras proteínas-alvo, hormona de crescimento humano (HCh), factor de estimulação de colónias de granulócitos (FEC-G) e os seus derivados (17S-FEC-G) ou eritropoietina (EPO) . Os conjugados de proteína, de acordo com a presente invenção, compreendem, cada um, uma proteína-alvo ligada a PEG-Fc, exibem aumentos de cerca de 10 vezes do tempo médio de permanência (TMP) e do semi-período de vida no soro, comparados com as formas naturais das proteínas e as formas conjugadas com PEG ou PEG-albumina (ver, quadros 4 a 7).

Além disso, quando um complexo de PEG-Fc se liga a um grupo -SH próximo do terminal de C de um Fab' ou de um terminal de N do Fab', o conjugado de Fab'-PEG-Fc resultante exibe um semi-período de vida no soro 2 a 3 vezes mais longo do que o de um complexo de PEG de 40K-Fab' (ver, fig. 12). 28

Além disso, quando se preparam conjugados de proteína utilizando um Fc desglicosilado de imunoglobulina (Fc DG) , em que se eliminam as partes de açúcar e quanto aos derivados de Fc não glicosilados de imunoglobulina (Fc NG), os seus semi-períodos de vida no plasma e a sua actividade in vitro mantiveram-se semelhantes aos dos conjugados de proteína preparados utilizando o Fc natural (ver, quadro 3 e fig. 8 e 11) .

Por isso, dado que os conjugados de proteína da presente invenção têm semi-períodos de vida no soro aumentados e um tempo médio de permanência (TMP) aumentado, quando aplicados a uma variedade de polipéptidos activos sob o ponto de vista fisiológico, incluindo hormona de crescimento humano, interferão, eritropoietina, factor de estimulação de colónias ou os seus derivados, são úteis para o desenvolvimento de formulações de acção prolongada de diversos polipéptidos activos sob o ponto de vista fisiológico.

Noutro aspecto, a presente invenção tem por objecto um processo de preparação de um conjugado de proteína com uma duração in vivo e uma estabilidade aumentadas, compreendendo: (a) a facilitação de uma reacção entre um polímero não peptídico com um grupo reactivo nas suas duas extremidades, um polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico e um fragmento de Fc de imunoglobulina a ligarem-se covalentemente; e (b) o isolamento do conjugado resultante compreendendo o polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico e um fragmento de Fc de imunoglobulina que estão ligados covalentemente com cada uma das extremidades do polímero não peptídico. 29

Na etapa (a), a ligação covalente dos três componentes ocorre sequencialmente ou simultaneamente. Por exemplo, quando o polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico e o fragmento de Fc de imunoglobulina estão ligados a cada uma das extremidades do polímero não peptídico, qualquer um dos polipéptidos activos sob o ponto de vista fisiológico e o fragmento de Fc de imunoglobulina está ligado a uma extremidade do polímero não peptídico e o outro está então ligado à outra extremidade do polímero não peptídico. Esta ligação sequencial é preferida para minimizar a produção de subprodutos para além de um conjugado de proteína desejado.

Assim, a etapa (a) pode incluir (al) a ligação covalente de um fragmento de Fc de imunoglobulina ou de um polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico, a uma extremidade de um polímero não peptídico; (a2) isolamento de um complexo compreendendo o fragmento de Fc de imunoglobulina ou o polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico ligados ao polímero não peptídico a partir da mistura reaccional resultante; e (a3) a ligação covalente de um fragmento de Fc de imunoglobulina ou de um polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico à outra extremidade do polímero não peptídico do complexo isolado, para se obter um conjugado de proteína compreendendo o fragmento de Fc de imunoglobulina e o polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico, que estão ligados a cada uma das extremidades do polímero não peptídico.

Na etapa (al), a proporção molar óptima da reacção do polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico e do polímero não peptídico pode variar de 1:2,5 a 1:5 e a proporção molar óptima da reacção do fragmento do Fc de 30 imunoglobulina e o polímero não peptídico pode variar de 1:5 a 1:10.

Por outro lado, na etapa (a3), a proporção molar, na reacção, entre o complexo obtido na etapa (a2) e o fragmento do Fc de imunoglobulina ou o polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico pode variar de 1:0,5 a 1:20 e, preferencialmente, de 1:1 a 1:3.

Se desejado, as etapas (al) e (a3) podem realizar-se na presença de um agente redutor dependendo do tipo de grupos reactivos em ambas as extremidades do polímero não peptídico que participa nas reacções nas etapas (al) e (a3). Os agentes de redução preferidos podem incluir cianoboro-hidreto sódio (NaCNBH3) , boro-hidreto de sódio, borato de dimetilamina e borato de piridina.

Tendo em consideração os requisitos de pureza nas etapas (a2) e (b) e os pesos moleculares e as cargas dos produtos, pode-se seleccionar um processo apropriado de isolamento de proteína entre os processos utilizados normalmente na técnica de isolamento de proteínas. Por exemplo, pode-se aplicar uma variedade de processos conhecidos incluindo a cromatografia por exclusão por dimensão e cromatografia de permuta iónica. Se desejado, pode-se utilizar uma combinação de uma variedade de processos diferentes para se obter um grau elevado de purificação.

Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto uma composição farmacêutica para providenciar um polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico tendo uma melhoria da duração in vivo e da estabilidade, compreendendo o conjugado de proteína da presente invenção 31 como um componente eficaz, em conjunto com um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. 0 termo "administração", tal como utilizado aqui, significa a introdução, no paciente, de uma quantidade pré-determinada de uma substância, por um determinado processo apropriado. 0 conjugado da presente invenção pode ser administrado por via de qualquer uma das vias normais, desde que seja capaz de atingir o tecido desejado. Considera-se uma variedade de modos de administração, incluindo a administração intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica, oral, tópica, intranasal, intrapulmonar e intrarectal, mas a presente invenção não se limita a estes modos de administração exemplificados. Contudo, dado que os péptidos são digeridos após a administração oral, os ingredientes activos de uma composição para administração oral devem estar revestidos ou devem ser formulados para a protecção contra a degradação no estômago. Preferencialmente, a presente composição pode ser administrada numa forma injectável. Além disso a composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada utilizando um determinado dispositivo capaz de transportar os ingredientes activos para uma célula-alvo. A composição farmacêutica que compreende o conjugado de acordo com a presente invenção pode incluir um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Para a administração oral, o veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico pode incluir ligantes, lubrificantes, desintegrantes, excipientes, solubilizantes, agentes dispersantes, estabilizantes, agentes de suspensão, agentes corantes e perfumes. Para as preparações injectáveis, o veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico pode 32 incluir agentes de tamponamento, agentes conservantes, analgésicos, solubilizantes, agentes isotónicos e estabilizantes. Para as preparações para administração tópica, o veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico pode incluir bases, excipientes, lubrificantes e agentes conservantes. A composição farmacêutica da presente invenção pode ser formulada numa variedade de formas de dosagem em combinação com os veiculos, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, mencionados antes. Por exemplo, para administração, a composição farmacêutica pode ser formulada em comprimidos, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes ou hóstias. Para preparações injectáveis, a composição farmacêutica pode ser formulada numa forma de dosagem unitária, tal como um recipiente com várias doses ou uma ampola como uma forma de dosagem de dose única. A composição farmacêutica pode também ser formulada sob a forma de soluções, suspensões, comprimidos, cápsulas e preparações de acção prolongada.

Por outro lado, exemplos de veiculos, excipientes e diluentes apropriados para as formulações farmacêuticas incluem lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, amido, borracha de acácia, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, celulose, metilcelulose, celulose microcristalina, poli-vinilpirrolidona, água, hidroxibenzoato de metilo, hidroxi-benzoato de propilo, talco, estearato de magnésio e óleos minerais. Além disso, as formulações farmacêuticas podem ainda incluir cargas, agentes anti-coagulantes, lubrificantes, humectantes, perfumes, emulsionantes e antissépticos.

Pode-se determinar uma dose substancial de um fármaco em combinação com o fragmento de Fc da presente invenção, 33 como veículo, por meio de vários factores relacionados incluindo os tipos de doenças a serem tratadas, as vias de administração, a idade, o género e o peso dos doentes e a gravidade da doença, assim como por meio de os tipos de fármacos como componente activo. Dado que a composição farmacêutica da presente invenção tem uma duração da acção muito longa, in vivo, tem a vantagem de reduzir significativamente a frequência de administração dos fármacos farmacêuticos.

Pode-se ter um melhor entendimento da presente invenção através dos exemplos que se seguem que foram estabelecidos para ilustrar, mas não foram imaginados como um limite da presente invenção. EXEMPLO 1: Preparação I de um conjugado de IFNcx-PEG-fragmento de Fc de imunoglobulina <Etapa 1> Preparação do fragmento de Fc de imunoglobulina utilizando imunoglobulina

Preparou-se um fragmento de Fc de imunoglobulina tal como se segue. 200 mg de imunoglobulina G (IgG) de 150 kDa (Green Cross, Coreia) dissolvida em tampão de fosfato 10 mM foram tratados com 2 mg de uma enzima proteolítica, papaína (Sigma), a 37 °C, durante 2 h, com uma agitação ligeira.

Depois da reacção com a enzima, o fragmento de Fc de imunoglobulina assim regenerado foi submetido a cromatografia para purificação utilizando, sequencialmente, uma coluna Superdex, uma coluna de proteína A e uma coluna permutadora de catiões. Em detalhe, carregou-se a solução da reacção numa coluna Superdex 200 (Pharmacia) equilibrada com tampão de fosfato de sódio 10 mM (PBS, pH 7,3) e eluíu-se a coluna com o mesmo tampão, a uma velocidade de fluxo 34 de 1 ml/min. As moléculas de imunoglobulina (IgG) que não reagiram e F(ab')2, que tinha um peso molecular relativamente elevado comparado com o fragmento de Fc de imunoglobulina, foram removidos utilizando a sua propriedade se serem eluidos mais cedo do que o fragmento de Fc de Ig. Os fragmentos Fab, com um peso molecular similar ao do fragmento de Fc de Ig foram eliminados por meio de uma cromatografia em coluna de proteina A (fig. 1). As fracções resultantes, contendo o fragmento de Fc de Ig eluido da coluna Superdex 200 foram carregados a uma velocidade de fluxo de 5 ml/min numa coluna de proteina A (Pharmacia) equilibrada com tampão de fosfato 20 mM (pH 7,0) e lavou-se a coluna com o mesmo tampão para eliminar as proteínas não ligadas à coluna. Depois, eluíu-se a coluna da proteína A com tampão de citrato de sódio 100 mM (pH 3,0) para se obter um fragmento de Fc de imunoglobulina altamente puro. As fracções de Fc recolhidas da coluna de proteina A foram finalmente purificadas utilizando uma coluna de permuta de catiões (polyCAT, PolyLC Company), em que esta coluna, carregada com as fracções de Fc, foi eluida com um gradiente linear de NaCl 0,15-0,4 M em tampão de acetato 10 mM (pH 4,5), providenciando assim fracções de Fc altamente puras. As fracções de Fc altamente puras foram analisadas por EGPA-SDS a 12 % (coluna 2 na fig. 2).

<Etapa 2> Preparação do complexo de IFNa-PEG

Misturou-se polietileno-glicol de 3,4 kDa com um grupo reactivo de aldeído nas duas extremidades, ALD-PEG-ALD (Shearwater) , com interferão alfa-2b humano (IFNah-2b, PM: 20 kDa) dissolvido em tampão de fosfato 100 mM numa quantidade de 5 mg/ml) numa relação molar de IFNa:PEG de 1:1, 1:2,5, 1:5, 1:10 e 1:20. A esta mistura, adicionou-se um agente de redução, cianoboro-hidreto de sódio (NaCNBH3, 35

Sigma) , a uma concentração final de 20 mM e deixou-se reagir, a 4 °C, durante 3 h, com uma ligeira agitação, para permitir que o PEG se ligue à extremidade do terminal amino do interferão alfa. Para se obter um complexo de PEG e interferão alfa a 1:1, a mistura reaccional foi submetida a cromatografia por exclusão de dimensão utilizando uma coluna SuperdexR (Pharmacia). O complexo de IFNa-PEG foi eluido a partir da coluna utilizando tampão de fosfato de potássio 10 mM (pH 6,0) como tampão de eluição e interferão alfa não ligado a PEG, PEG que não reagiu e os subprodutos de dimero em que PEG estava ligado a duas moléculas de interferão alfa foram eliminados. O complexo de IFNa-PEG purificado foi concentrado para 5 mg/ml. Através desta experiência, verificou-se que a relação molar óptima da reacção entre IFNa e PEG, que providenciou a mais alta reactividade e gerou a menor quantidade de subprodutos tais como dimeros, era de 1:2,5 a 1:5. <Etapa 3> Preparação do conjugado de IFNa-PEG-Fc

Para ligar o complexo de IFNa- -PEG purificado na etapa 2 anterior ao terminal de N de um fragmento de Fc de imunoglobulina, dissolveu-se 0 fragmento de Fc de imunoglobulina (cerca de 53 kDa) preparado na etapa 1 anterior em tampão de fosfato 10 mM e misturou- -se com 0 complexo de IFNa-PEG num complexo numa proporção molar de IFNa-PEG:Fc de 1:1, 1:2, 1:4 e 1: 8 . Depois da concentração do tampão de fosfato da solução reaccional ser ajustada para 100 mM, adicionou-se, à solução reaccional, um agente de redução, NaCNBH3, a uma concentração final de 20 mM e deixou-se reagir, a 4 °C, durante 20 h, com uma agitação ligeira. Através desta experiência, verificou-se que a relação molar óptima da reacção, entre o complexo de IFNa-PEG e Fc, providenciando a mais alta reactividade e gerando 36 a menor quantidade de subprodutos tais como dimeros, era de 1:2. <Etapa 4> Isolamento e purificação do conjugado de IFNa- PEG-Fc

Depois da reacção da etapa 3 anterior, submeteu-se a mistura reaccional a cromatografia por exclusão de dimensão numa coluna Superdex de modo a eliminar as substâncias que não reagiram e os subprodutos e purificar o conjugado de proteina de IFNa-PEG-Fc produzido. Depois concentrou-se a mistura reaccional e carregou-se numa coluna Superdex, fez-se passar tampão de fosfato 10 mM (pH 7,3) através da coluna a uma velocidade de fluxo de 2,5 ml/min para eliminar o Fc não ligado e as substâncias que não reagiram, seguido da eluição da coluna para recolher as fracções de conjugado de proteína IFNoí-PEG-Fc. Dado que as fracções de conjugado de proteína de IFNa-PEG-Fc recolhidas continham uma pequena quantidade de impurezas, o Fc que não reagiu e os dimeros de interferão alfa foram submetidos a uma cromatografia de permuta catiónica para eliminar as impurezas. As fracções de conjugado de proteína IFNa-PEG-Fc foram carregadas numa coluna de PolyCAT LP (PolyLC) equilibrada com acetato de sódio 10 mM (pH 4,5) e eluiu-se a coluna com um gradiente linear de NaCl a 0-0,5 M em solução de tampão de acetato de sódio 10 mM (pH 4,5) utilizando NaCl 1 M. Finalmente, o conjugado de proteína de IFNa-PEG-Fc foi purificado utilizando uma coluna de permuta aniónica. Carregaram-se as fracções de conjugado de proteína IFNa-PEG-Fc numa coluna PolyWAX LP (PolyLC) equilibrada com Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) e depois eluiu-se a coluna com NaCl com um gradiente linear de 0-0,3 M em Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) utilizando NaCl 1 M, isolando assim o 37 conjugado de proteína de IFNa-PEG-Fc numa forma muitíssimo pura. EXEMPLO 2: Preparação II do conjugado de proteína de IFNa-PEG-Fc

<Etapa 1> Preparação do complexo de Fc-PEG

Misturou-se polietileno-glicol de 3,4 kDa com um grupo reactivo de aldeído, em ambas as extremidades, ALD-PEG-ALD (Shearwater), com o fragmento de Fc de imunoglobulina preparado na etapa 1 do exemplo 1, numa relação molar entre Fc: PEG de 1:1, 1:2,5, 1:5, 1:10 e 1:20, em que o fragmento de Fc de Ig tinha sido dissolvido em tampão de fosfato 100 mM numa quantidade de 15 mg/ml. A esta mistura adicionou-se um agente de redução, NaCNBH3 (Sigma), numa concentração final de 20 mM e deixou-se reagir, a 4 °C, durante 3 h, com uma agitação ligeira. Para se obter um complexo de PEG e Fc a 1:1, a mistura reaccional foi submetida a cromatografia por exclusão de dimensão utilizando uma coluna SuperdexR (Pharmacia). 0 complexo de Fc-PEG foi eluído a partir da coluna utilizando tampão de fosfato de potássio 10 mM (pH 6,0) como tampão de eluição e um fragmento de Fc de imunoglobulina não ligado a PEG, PEG que não reagiu e os subprodutos de dímero em que PEG estava ligado a duas moléculas do fragmento de Fc de imunoglobulina foram eliminados. O complexo de Fc-PEG purificado foi concentrado para cerca de 15 mg/ml. Através desta experiência, verificou-se que a relação molar óptima, da reacção entre Fc e PEG e Fc, providenciando a mais alta reactividade e gerando a menor quantidade de subprodutos, tais como dímeros, era de 1:3 a 1:10. 38 <Etapa 2> Formação e purificação do conjugado do complexo de Fc-PEG e interferão alfa

Para ligar o complexo de Fc-PEG, purificado na etapa 1 anterior, ao terminal de N de IFNa, misturou-se o complexo de Fc-PEG com IFNa dissolvido em tampão de fosfato 10 mM nas proporções molares entre o complexo de Fc-PEG e IFNa de 1:1, 1:1,5, 1:3 e 1:6. Depois da concentração do tampão de fosfato da solução reaccional ser ajustada para 100 mM, adicionou-se à solução reaccional um agente de redução, NaCNBH3, numa concentração final de 20 mM e deixou-se reagir, a 4 °C, durante 20 h com uma agitação ligeira. Depois de a reacção estar completa, eliminaram-se as substâncias que não reagiram e os subprodutos, de acordo com os mesmos processos de purificação da etapa 4 do exemplo 1, isolando assim o conjugado de proteina de Fc-PEG-IFNa, numa forma muitíssimo pura. EXEMPLO 3: Preparação do conjugado de HCh-PEG-Fc

Preparou-se um conjugado de HCh-PEG-Fc e purificou-se de acordo com o mesmo processo que no exemplo 1, excepto no facto de se ter utilizado fármacos para além de interferão alfa, hormona de crescimento humano (HCh, PM: 22 kDa) e uma relação molar de HCh:PEG de 1:5. EXEMPLO 4: Preparação do conjugado de FEC-G-PEG-Fc

Preparou-se um conjugado de FEC-G-PEG-Fc e purificou-se de acordo com o mesmo processo do exemplo 1, excepto no facto de se ter utilizado fármacos para além do interferão alfa, factor de estimulação de colónias de granulócitos humanos (FEC-Gh), que se utilizou numa relação molar de HCh-CSF:PEG de 1:5. 39

Por outro lado, preparou-se um conjugado de proteína 17S-G-CSF-PEG-Fc e purificou-se de acordo com o mesmo processo descrito antes utilizando um derivado de FEC-G, 17S-G-CSF, tendo uma substituição de serina no décimo sétimo resíduo de aminoácido de FEC-Gh natural. EXEMPLO 5: Preparação do conjugado de EPO-PEG-Fc

Preparou-se um conjugado de EPO-PEG-Fc e purificou-se de acordo com o mesmo processo que no exemplo 1, excepto no facto de se ter utilizado o fármaco, para além de interferão alfa, eritropoietina (EPO) e de ser utilizado numa relação molar de EPO:PEG de 1:5. EXEMPLO 6: Preparação do conjugado de proteína utilizando PEG com diferentes grupos reactivos

Preparou-se um conjugado de proteína de IFNa-PEG-Fc utilizando PEG com um grupo reactivo de propionato de succinimidilo (PAS) nas duas extremidades, tal como se segue. Misturou-se polietileno-glicol de 3,4 kDa, SPA-PEG-SPA (Shearwater) com 10 mg de interferão alfa dissolvido em tampão de fosfato 100 mM numa relação molar de IFNocPEG de 1:1, 1:2,5, 1:5, 1:10 e 1:20. Deixou-se então a mistura reagir, à temperatura ambiente, com uma agitação ligeira, durante 2 h. Para se obter um complexo de PEG e interferão alfa (complexo de IFNa-PEG) a 1:1, em que PEG se estava ligado selectivamente ao grupo amino de um resíduo de lisina do interferão alfa, submeteu-se a mistura reaccional a uma cromatografia por exclusão de dimensão numa coluna Superdex. O complexo de IFNa-PEG foi eluído a partir da coluna utilizando tampão de fosfato de potássio 10 mM (pH 6,0) como tampão de eluição e, eliminou-se o interferão alfa não ligado a PEG, PEG que não reagiu e os subprodutos 40 de dímeros em que duas moléculas de interferão alfa estavam ligadas às duas extremidades de PEG. Para ligar o complexo de IFNa-PEG ao grupo amino de um resíduo de lisina do Fc de imunoglobulina, concentrou-se o complexo purificado de IFNa-PEG para cerca de 5 mg/ml e preparou-se um conjugado de IFNa-PEG-Fc e purificou-se de acordo com os mesmos processos das etapas 3 e 4 do exemplo 1. Através desta experiência, verificou-se que a relação molar óptima da reacção entre IFNa e PEG, providenciando a mais alta reactividade e gerando o mínimo de subprodutos, tais como dímeros, era de 1:2,5 a 1:5.

Por outro lado, preparou-se outro conjugado de IFNa-PEG-Fc de acordo com os mesmos processos que foram descritos antes utilizando PEG, com um grupo reactivo de N-hidroxisuccinimidilo (NHS) nas duas extremidades, NHS-PEG-NHS (Shearwater) ou PEG com um grupo reactivo de aldeído butílico nas duas extremidades, BUA-PEG-BUA (Shearwater). EXEMPLO 7: Preparação de um conjugado de proteína utilizando PEG com diferentes pelos moleculares

Preparou-se um complexo de IFNa-PEG de 10K utilizando polietileno-glicol de 10 kDa com um grupo reactivo de aldeído nas duas extremidades, ALD-PEG-ALD (Shearwater). Preparou-se este complexo e purificou-se de acordo com o processo da etapa 2 do exemplo 1. Através desta experiência, verificou-se que a proporção molar óptima da reacção entre IFNa e PEG de 10 kDa, providenciando a mais elevada reactividade e gerando a mais pequena quantidade de subprodutos, tais como dímeros, era de 1:2,5 a 1:5. O complexo de IFNa-PEG de 10K purificado foi concentrado para cerca de 5 mg/ml e, utilizando este concentrado, preparou-se um conjugado de IFNa-PEG de ÍOK-Fc e purificou-se de 41 acordo com os mesmos processos das etapas 3 e 4 do exemplo 1. EXEMPLO 8: Preparação do conjugado de Fab'-S-PEG-N-Fc (grupo -SH) <Etapa 1> Expressão e purificação de Fab'

Fez-se crescer um transformante de E. coli, BL21/poDLHF (número de acesso: KCCM-10511), que expressa Fab' do factor alfa de necrose anti-tumor, em 100 ml de meio LB, durante a noite, com agitação e inoculou-se num fermentador de 5 L (Marubishi) e fez-se uma cultura, a 30 °C e 500 rpm e com uma velocidade de fluxo de ar de 20 vvm. Para compensar os nutrientes insuficientes para o crescimento bacteriano durante a fermentação, as culturas foram complementadas com glicose e extratos de levedura, de acordo com os estados fermentados das bactérias. Quando as culturas atingiram um valor de ΌΟδοο de 80-100 adicionou-se às culturas um indutor, IPTG, para induzir a expressão da proteína. Prolongaram-se as culturas durante mais 40 a 45 h até o valor de DO, a 600 nm, ter aumentado para 120 a 140. O fluido de fermentação assim obtido foi centrifugado a 20.000xg, durante 30 min. Recolheu-se o sobrenadante e eliminaram-se os peletes.

Submeteu-se o sobrenadante a uma cromatografia em coluna em três etapas para purificar o Fab' do factor alfa de necrose anti-tumor. Carregou-se o sobrenadante numa coluna de proteína G HiTrap (5 ml, Pharmacia) equilibrada com tampão de fosfato 20 mM (pH 7,0) e eluíu-se a coluna com glicina 100 mM (pH 3,0). As fracções de Fab' recolhidas foram então carregadas numa coluna Superdex 200 (Pharmacia) equilibrada com tampão de fosfato de sódio 10 mM. (PBS, pH 42 7,3) e eluíu-se esta coluna com o mesmo tampão. Finalmente carregaram-se as segundas fracções de Fab' numa coluna de polyCAT de 21x250 (PolyLC) e eluíu-se esta coluna com um gradiente linear de NaCl de 0,15-0,4 M em tampão de acetato 10 mM (pH 4,5), providenciando assim fracções altamente puras de Fab' de factor alfa de necrose anti-tumor.

<Etapa 2> Preparação e purificação do complexo de Fc-PEG

Para ligar o ligante de PEG ao terminal de N de um Fc de uma imunoglobulina, dissolveu-se o Fc de uma imunoglobulina, preparado de acordo com o processo usado na etapa 1 do exemplo 1, em tampão de fosfato 100 mM (pH 6,0) a uma concentração de 5 mg/ml e misturou-se com NHS-PEG-MAL (3,4 kDa, Shearwater) numa relação molar de Fc:PEG de 1:10, seguido de incubação, a 4 °C, durante 12 h. com agitação ligeira.

Depois de a reacção estar completa, trocou-se o tampão de reacção por tampão de fosfato de sódio 20 mM (pH 6,0) para eliminar NHS-PEG-MAL não ligado. Depois, carregou-se a mistura reaccional numa coluna polyCAT (PolyLC). Eluíu-se a coluna com um gradiente linear de NaCl de 0,15-0,5 M em tampão de fosfato de sódio 20 mM (pH 6,0) . Durante esta eluição, o complexo de Fc de imunoglobulina-PEG foi eluído antes do Fc de imunoglobulina que não reagiu e o Fc de Ig que não reagiu foi eluído mais tarde, eliminando assim as moléculas de Fc de Ig que não reagiram. <Etapa 3> Preparação e purificação do conjugado de Fab'-S-PEG-N-Fc (grupo -SH)

Para ligar o complexo de Fc de imunoglobulina-PEG a um grupo de cisteína do Fab', dissolveu-se o Fab' purificado, 43 na etapa 1 anterior, em tampão de fosfato de sódio 100 mM (pH 7,3) a uma concentração de 2 mg/ml e misturou-se com o complexo de Fc de imunoglobulina-PEG preparado na etapa 2 anterior numa relação molar de Fabcomplexo de 1:5. Concentrou-se a mistura reaccional até a uma concentração final de proteína de 50 mg/ml e incubou-se, a 4 °C, durante 24 h, com agitação ligeira.

Depois de a reacção estar completa, carregou-se a mistura reaccional numa coluna Superdex 200 (Pharmacia) equilibrada com tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 7,3) e eluíu-se a coluna com o mesmo tampão, a uma velocidade de fluxo de 1 ml/min. O conjugado de Fab'-S-PEG-N-Fc acoplado foi eluído relativamente cedo devido ao seu elevado peso molecular e o complexo de Fc de imunoglobulina-PEG e Fab' foram eluídos mais tarde, eliminando assim as moléculas que não reagiram. Para eliminar completamente Fc de imunoglobulina-PEG que não reagiu, as fracções do conjugado de Fab'-S-PEG-N-Fc recolhidas foram novamente carregadas numa coluna de polyCAT de 21x250 (PolyLC) e eluíu-se esta coluna com um gradiente linear de NaCl de 0,15-0,5 M em tampão de fosfato de sódio 20 mM (pH 6,0), providenciando assim um conjugado de Fab'-S-PEG-N-Fc puro compreendendo o complexo de Fc-PEG ligado a um grupo -SH próximo do terminal de C do Fab' . EXEMPLO 9: Preparação do conjugado de Fab'-N-PEG-N-Fc (terminal de N) <Etapa 1> Preparação e purificação do complexo de Fab'-PEG (terminal de N)

Dissolveu-se 40 mg do Fab' purificado na etapa 1 do exemplo 8 em tampão de fosfato de sódio 100 mM (pH 6,0) a 44 uma concentração de 5 mg/ml e misturou-se com ALD butílico-PEG-ALD butílico (3,4 kDa, Nektar) numa relação molar entre Fab':PEG de 1:5. Adicionou-se um agente de redução, NaCNBH3, à mistura reaccional, a uma concentração final de 20 mM e deixou-se a mistura reaccional reagir, a 4 °C, durante 2 h, com agitação ligeira.

Depois de a reacção estar completa, trocou-se o tampão de recção com tampão de fosfato de sódio 20 mM (pH 6,0) . Depois, carregou-se a mistura reaccional numa coluna polyCAT (PolyLC). Eluíu-se a coluna com um gradiente linear de NaCl de 0,15-0,4 M em tampão de acetato 20 mM (pH 4,5). Durante esta eluição da coluna, o complexo de Fab'-PEG, compreendendo o ligante de PEG em linha com o terminal de N do Fab' foi eluido mais cedo do que o Fab' que não reagiu e 0 Fab' que não reagiu foi eluido mais tarde, eliminando assim as moléculas de Fab' que não reagiram. <Etapa 2> Preparação e purificação do conjugado de Fab'-N-PEG-N-Fc

Para ligar o complexo de Fab'-PEG, purificado na etapa 1 anterior, ao terminal de N de um Fc de imunoglobulina, dissolveu-se o complexo de Fab'-PEG em tampão de fosfato de sódio 100 mM (pH 6,0) a uma concentração de 10 mg/ml e misturou-se com o Fc de imunoglobulina dissolvido no mesmo tampão numa relação molar do complexo de Fab'-PEG:Fc de 1:5. Depois de a mistura reaccional estar concentrada a uma concentração final de proteina de 50 mg/ml, adicionou-se um agente redutor, NaCNBH3, à mistura reaccional, até a uma concentração final de 20 mM e depois fez-se reagir a mistura reaccional, a 4 °C, durante 24 h, com uma agitação ligeira. 45

Depois de a reacção estar completa, carregou-se a mistura reaccional numa coluna Superdex 200 (Pharmacia) equilibrada com tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 7,3) e eluiu-se a coluna com o mesmo tampão, a uma velocidade de fluxo de 1 ml/min. O conjugado de Fab'-N-PEG-N-Fc acoplado foi eluido relativamente cedo devido ao seu peso molecular elevado e o complexo de Fc de imunoglobulina e Fab'-PEG que não reagiu foi eluido mais tarde, eliminando assim as moléculas que não reagiram. Para eliminar completamente as moléculas de Fc de imunoglobulina que não reagiram, as fracções do conjugado de Fab'-N-PEG-N-Fc recolhidas foram novamente carregadas numa coluna de polyCAT de 21x250 (PolyLC) e eluiu-se esta coluna com um gradiente linear de NaCl de 0,15-0,5 M em tampão de fosfato de sódio 20 mM (pH 6,0), providenciando assim um conjugado de Fab'-N-PEG-N-Fc puro compreendendo o complexo de Fc de imunoglobulina-PEG ligado ao terminal de N do Fab'. EXEMPLO 10: Preparação e purificação do Fc desglicosilado de imunoglobulina

Dissolveu-se 200 mg de um Fc de imunoglobulina, preparado pelo mesmo processo que o do exemplo 1, em tampão de fosfato 100 mM (pH 7,5), a uma concentração de 2 mg/ml e misturou-se com 300 U/mg de uma desglicosilase, PNGase F (NEB) . Deixou-se a mistura reaccional reagir, a 37 °C, durante 24 h, com uma agitação ligeira. Depois, para purificar o Fc desglicosilado de imunoglobulina, carregou-se a mistura reaccional numa coluna SP Sepharose FF (Pharmacia) e eluiu-de a coluna com um gradiente linear de NaCl de 0,1-0,6 M em tampão de acetato 10 mM (pH 4,5) utilizando NaCl 1 M. O Fc da imunoglobulina natural foi eluido mais cedo e o Fc desglicosilado de imunoglobulina (Fc DG) foi eluido mais tarde. 46

EXEMPLO 11: Preparação do conjugado de IFNa-PEG-Fc DG

Para ligar o Fc desglicosilado de imunoglobulina, preparado no exemplo 10, ao complexo de IFNoí-PEG purificado na etapa 2 do exemplo 1, misturou-se o complexo de IFNoí-PEG com o Fc DG dissolvido em tampão de fosfato 10 mM numa relação molar do complexo de IFNoí-PEG:Fc DG de 1:1, 1:2, 1:4 e 1:8. Depois da concentração do tampão de fosfato ser ajustada para 100 mM, adicionou-se um agente de redução, NaCNBH3, à solução reaccional, a uma concentração final de 20 mM e deixou-se reagir, a 4 °C, durante 20 h com uma agitação ligeira. Através desta experiência, verificou-se que a relação molar óptima da reacção entre o complexo de IFNoí-PEG e Fc DG, que providenciou a mais alta reactividade e gerou a menor quantidade de subprodutos tais como dimeros, era de 1:2.

Depois da reacção de acoplamento, submeteu-se a mistura reaccional a cromatografia por exclusão de dimensão utilizando uma coluna SuperdexR (Pharmacia) de modo a eliminar as substâncias que não reagiram e os subprodutos e purificou-se o conjugado de proteina de IFNa-PEG-Fc DG. Depois carregou-se a mistura reaccional na coluna, fez-se passar um tampão de fosfato (pH 7,3) através da coluna a uma velocidade de fluxo de 2,5 ml/min para eliminar o Fc DG não ligado e as substâncias que não reagiram, seguido da eluição da coluna para recolher as fracções de conjugado de proteina de IFNa-PEG-Fc DG. Dado que as fracções do conjugado de proteina de IFNa-PEG-Fc DG recolhidas continham uma pequena quantidade de impurezas, submeteu-se o Fc DG que não reagiu e o complexo de IFNa-PEG, a uma cromatografia de permuta catiónica para eliminar as impurezas. As fracções de conjugado de proteina IFNa-PEG-Fc DG foram carregadas numa coluna PolyCAT LP (PolyLC) 47 equilibrada com tampão de acetato de sódio 10 mM (pH 4,5) e eluíu-se a coluna com um gradiente linear de NaCl a 0-0,6 M em solução de tampão de acetato de sódio 10 mM (pH 4,5) utilizando NaCl 1 M. Finalmente, purificou-se o conjugado de proteína de IFNa-PEG-Fc DG utilizando uma coluna de permuta aniónica. Carregaram-se as fracções de conjugado de proteína de IFNa-PEG-Fc numa coluna PolyWAX LP (PolyLC) equilibrada com Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) e depois eluíu-se a coluna com NaCl, com um gradiente linear de 0-0,3 M em Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) utilizando NaCl 1 M, isolando assim o conjugado de proteína de IFNa-PEG-Fc DG numa forma muitíssimo pura. EXEMPLO 12: Preparação e purificação de derivados de Fc de imunoglobulina não glicosilado recombinante <Preparação do vector de expressão 1 derivado de Fc de IgG4>

Para preparar regiões constantes de cadeia pesada da imunoglobulina humana IgG4, preparou-se um primeiro derivado (IgG4 delta-Cis), com uma eliminação de nove aminoácidos no terminal de amino da região de charneira natural e preparou-se um segundo derivado (monómero de IgG4), a que faltava a região de charneira, por meio da eliminação dos doze aminoácidos da região de charneira. Utilizou-se como vector de expressão contendo uma sequência secretora de E. coli, pT14SlSH-4T20V22Q (pat. coreana No. 38061), desenvolvido antes da presente invenção pelos requerentes.

Para se obter regiões constantes de cadeia pesada da imunoglobulina humana IgG4, realizou-se uma RCP-TI utilizando ARN isolado de células humanas de sangue, como 48 matriz, tal como se segue. Primeiro isolou-se o ARN total de cerca de 6 ml de sangue utilizando um estojo de ARN de sangue Qiamp (Qiagen) e realizou-se a amplificação do gene utilizando como matriz o ARN total e um estojo de RCP-TI de uma etapa (Qiagen). Nesta RCP, utilizou-se um par de iniciadores sintetizados, representados pelas SEQ ID Nos. 1 e 2 e utilizou-se outro par de iniciadores sintetizados representados pelas SEQ ID Nos. 2 e 3. A SEQ ID NO. 1 é uma sequência de nucleótidos começando no 10° residuo, serina, de 12 resíduos de aminoácidos, que se seguem, da região charneira de IgG4. A SEQ ID NO. 3 foi concebida para ter uma sequência de nucleótidos que codificam um domínio Cp2 com a alanina como primeiro resíduo de aminoácido. A SEQ ID NO. 2 foi concebida para ter um sítio de reconhecimento de BamHI contendo um codão de paragem. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 gag tcc aaa tat ggt ccc cca tgc cca tca tgc cca ctc agg ttt ata cca ggg ggt acg ggt. agt acg ggt Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

Para clonar cada um dos fragmentos da região constante de IgG4 num vector de expressão contendo um derivado da sequência secretora de E. coli, utilizou-se pTl4SlSH-4T20V22Q (pat. coreana No. 38061), desenvolvido antes da presente invenção pelos requerentes. Este vector de expressão contém um derivado da sequência secretora de enterotoxina, estável ao calor, que tem uma sequência de nucleótidos representada pela SEQ ID NO. 4. Para facilitar a clonagem, inseriu-se um sitio de reconhecimento StuI numa extremidade da sequência secretora de enterotoxina, estável ao calor, de E. coli do plasmido pT14SlSH-4T20V22Q através da mutagénese dirigida do sítio utilizando um par de 49 iniciadores representado SEQ ID Nos. 5 e 6 para induzir a mutagénese para introduzir o sitio StuI numa sequência de nucleótidos que codifica para o último residuo de aminoácidos da sequência secretora. Verificou-se que esta inserção do sitio StuI tinha sucesso por meio da sequenciação de ADN. 0 plasmido pT14SlSH-4T20V22Q resultante, contendo um sitio StuI, foi designado por "pmSTII". 0 plasmido pmSTII foi tratado com StuI e BamHI e foi submetido a electroforese com gel de agarose e purificou-se um grande fragmento (4,7 kb), que continha um derivado da sequência secretora de enterotoxina, estável ao calor, de E. coli. Depois, os fragmentos de gene amplificados foram digeridos com BamHI e ligados com o vector de expressão linearizado, providenciando assim pSTIIdCG4Fc e pSTIIG4Mo.

Os vectores de expressão final foram transformados individualmente em BL21(DE3) de E. coli e os transformantes resultantes foram designados por "BL21/pSTIIdCG4Fc (HM10932)" e "BL21/pSTIIdCG4Mo (HM10933)", que foram depositados no Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) (Centro coreano de cultura de microrganismos) em 15 de Set. de 2004 e a que foram atribuídos os números de acesso KCCM-10597 e KCCM-10598, respectivamente. Depois, quando as culturas atingiram um valor de ϋΟεοο de 80, adicionou-se um indutor, IPTG, às culturas para induzir a expressão da proteína. Depois continuaram-se as culturas durante mais 40 a 45 h até ao valor de DO, a 600 nm, aumentar para 100 a 120. As células de E. coli recolhidas dos fluidos de fermentação foram desorganizadas e os lisados de células resultantes foram submetidos a uma cromatografia em coluna, em duas etapas, para purificar os derivados de região constante da imunoglobulina recombinante presentes no citosol de E. coli. 50

Equilibrou-se uma coluna de afinidade de proteína A de 5 ml (Pharmacia) com SBF e carregaram-se os lisados de células na coluna a uma velocidade de fluxo de 5 ml/min. Lavaram-se as proteínas não ligadas com SBF e eluíram-se as proteínas ligadas com citrato 100 mM (pH 3,0). Dessalizinaram-se as fracções recolhidas utilizando uma coluna de dessalinização HiPrep 26/10 (Pharmacia) com tampão de Tris 10 mM (pH 8,0) . Depois, realizou-se a cromatografia secundária em coluna de permuta aniónica utilizando 50 ml de uma coluna Q HP 26/10 (Pharmacia). Carregaram-se as fracções primárias de Fc não glicosilado recombinante de imunoglobulina numa coluna de Q-Sefarose HP 26/10 e eluiu-se a coluna com um gradiente linear de NaCl de 0-0,2 M em tampão de Tris 10 mM (pH 8,0), providenciando assim um Fc não glicosilado (Fc NG) recombinante de imunoglobulina altamente puro, delta-Cis de IgG4 e uma fracção de monómero de IgG4 altamente puro. EXEMPLO 13: Preparação de conjugado de complexo de IFNcx-PEG e um derivado de Fc NG recombinante

De acordo com os processos dos exemplos 1 e 11, o complexo de IFNa-PEG foi ligado ao terminal de N de delta-Cis de IgG4 como um derivado de Fc NG preparado no exemplo 12. Depois da reacção de acoplamento, as substâncias que não reagiram e os subprodutos foram removidos da mistura reaccional e o conjugado de proteína de IFNa-PEG-Fc NG (I) assim produzido foi purificado utilizando principalmente 50 ml de uma coluna de Q HP 26/10 (Pharmacia) e foi depois purificado por um ensaio de cromatografia líquida de alta pressão utilizando uma coluna polyCAT 21,5x250 (polyLC), purificando assim o conjugado em alto grau. Dessalizinizou-se a solução da reacção de acoplamento utilizando uma coluna de dessalinização HiPrep 26/10 (Pharmacia) com 51 tampão de Tris 10 mM (pH 8,0). Depois, carregou-se a solução reaccional em 50 ml de uma coluna Q HP 26/10 (Pharmacia) a uma velocidade de fluxo de 8 ml/min e eluiu-se esta coluna com um gradiente linear de NaCl de 0-0,2 M para se obter as fracções desejadas. As fracções recolhidas foram carregadas novamente numa coluna polyCAT 21,5x250 equilibrada com tampão de acetato 10 mM (pH 5,2) a uma velocidade de fluxo de 15 ml/min e eluiu-se esta coluna com um gradiente linear de NaCl de 0,1-0,3 M, providenciando assim fracções altamente puras. De acordo com o mesmo processo descrito antes, preparou-se outro conjugado de proteina de IFNa-PEG-Fc NG (II) utilizando outros derivados de Fc NG preparados no exemplo 12, monómero de IgG4. EXEMPLO 14: Preparação do conjugado de EPO-PEG-derivado de Fc NG recombinante

De acordo com o mesmo processo que no exemplo 13, preparou-se um conjugado de EPO-PEG-derivado de Fc NG recombinante por meio da ligação de um derivado de Fc NG, delta-Cis de IgG4, ao complexo de EPO-PEG.

EXEMPLO COMPARATIVO 1 Preparação do complexo de IFNa-PEG de 4 0K

Dissolveu-se 5 mg de interferão alfa em tampão de fosfato 100 mM para se obter um volume final volume de 5 ml e misturou-se com metoxi-PEG-aldeido activado de 40 kDa (Shearwater) , numa relação molar de IFNocPEG de 40 kDa de 1:4. Adicionou-se a esta mistura um agente de redução, NaCNBH3, para uma concentração final de 20 mM e deixou-se reagir, a 4 °C, durante 18 h, com agitação ligeira. Para o PEG inactivo, que não reagiu com IFNa, adicionou-se 52 etanolamina à mistura reaccional, numa concentração final de 50 mM.

Utilizou-se uma coluna Sephadex G-25 (Pharmacia) para eliminar o PEG que não reagiu e trocou-se o tampão por outro tampão. Em primeiro lugar, equilibrou-se esta coluna com dois volumes de coluna (VC) de tampão de Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) e carregou-se com a mistura reaccional. O fluxo que a atravessou foi detectado medindo a densidade óptica a 260 nm utilizando um espectrofotómetro de UV. Quando se eluiu a coluna, com o mesmo tampão, eluiu-se primeiro o interferão alfa modificado pela adição de PEG, com um peso molecular mais elevado, ao seu terminal N e o PEG que não reagiu foi eluido mais tarde, permitindo assim o isolamento de apenas IFNa-PEG de 40K. A cromatografia que se seguiu foi realizada para purificar mais o complexo de IFNa-PEG de 40K a partir das fracções recolhidas. Equilibrou-se 3 ml de uma coluna PolyWAX LP (PolyLC) com Tris-HCl 10 mM (pH 7,5).

Carregaram-se as fracções recolhidas, contendo o complexo de IFNa-PEG de 40 K na coluna, a uma velocidade de fluxo de 1 ml/min e lavou-se a coluna com 15 ml de um tampão de equilíbrio. Depois eluiu-se a coluna com um gradiente linear de NaCl de 0-100 % utilizando 30 ml de NaCl 1 M, eluindo-se assim sequencialmente o conjugado de interferão alfa com tri-, di- e mono-PEG. Para purificar ainda mais o interferão alfa, conjugado com mono-PEG, submeteram-se as fracções recolhidas, contendo o interferão alfa conjugado com mono-PEG, a uma cromatografia por exclusão de dimensão. Concentraram-se as fracções e carregaram-se numa coluna Superdex 200 (Pharmacia) equilibrada com tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 7,0) e eluiu-se a coluna com o mesmo tampão a uma velocidade de fluxo de 1 ml/min. As moléculas 53 de interferão alfa conjugadas com tri- e di-PEG foram eliminadas com base na sua propriedade se ser eluida primeiro do que o interferão alfa conjugado com mono-PEG numa forma altamente pura.

De acordo com o mesmo processo que foi descrito antes, conjugou-se PEG de 40K com o terminal de N da hormona de crescimento humano, o factor de estimulação de colónias de granulócitos (FEC-G) e um derivado de FEC-G, providenciando assim GHh-PEG de 40 K, PEG, FEC-G-PEG de 40K e complexos derivados de PEG de 40 K-17S-FEC-G. EXEMPLO COMPARATIVO 2 Preparação do conjugado de IFNa-PEG-albumina

Para ligar o complexo de IFNa-PEG purificado na etapa 2 do exemplo 1 ao terminal de N da albumina, misturou-se o complexo de IFNa-PEG com albumina de soro humano (ASH, de cerca de 67 kDa, Green Cross) dissolvido em tampão de fosfato 10 mM, numa relação molar do complexo de IFNa-PEG: albumina de 1:1, 1:2, 1:4 e 1:8. Depois da concentração do tampão de fosfato da solução reaccional ser ajustada para 100 mM, adicionou-se um agente de redução, NaCNBH3, à solução reaccional para uma concentração final de 20 mM e deixou-se reagir, a 4 °C, durante 20 h, com uma agitação ligeira. Através desta experiência, verificou-se que a relação molar óptima, da reacção entre o complexo de IFNa-PEG e albumina, providenciou a mais alta reactividade e gerou a menor quantidade de subprodutos tais como dimeros, era de 1:2.

Depois da reacção de acoplamento, submeteu-se a mistura reaccional a cromatografia por exclusão de dimensão utilizando uma coluna SuperdexR (Pharmacia) de modo a 54 eliminar as substâncias que não reagiram e os subprodutos e purificou-se o conjugado de proteína IFNa-PEG-albumina produzido. Depois concentrou-se a mistura reaccional e carregou-se na coluna, fez-se passar através dela tampão de acetato de sódio 10 mM, a uma velocidade de fluxo de 2,5 ml/min para eliminar a albumina não ligada e as substâncias que não reagiram, seguido da eluição da coluna para purificar apenas o conjugado de proteína IFNa-PEG-albumina. Dado que as fracções de conjugado de proteína IFNa-PEG-albumina recolhidas continham uma pequena quantidade de impurezas, a albumina que não reagiu e os dímeros de interferão alfa foram submetidos a uma cromatografia de permuta catiónica para eliminar as impurezas. Carregaram-se as fracções de conjugado de proteína de IFNa-PEG-albumina numa coluna SP5PW (Waters) equilibrada com acetato de sódio 10 mM (pH 4,5) e depois eluíu-se a coluna com um gradiente linear de NaCl 0-0,5 M em tampão de acetato de sódio 10 mM (pH 4,5) utilizando NaCl 1 M, isolando assim o conjugado de proteína de IFNa-PEG-Fc numa forma muitíssimo pura.

De acordo com o mesmo processo que foi descrito antes, conjugou-se a albumina com hormona de crescimento humano, FEC-G e um derivado de FEC-G, providenciando conjugados de GHh-PEG-albumina, FEC-G-PEG-albumina e 17S-FEC-G-PEG-albumina.

EXEMPLO COMPARATIVO 3 Preparação do complexo de Fab'-S-PEG de 40K

Activou-se o resíduo de cisteína livre do Fab' purificado na etapa 1 do exemplo 8 por meio da incubação num tampão de activação (acetato de sódio 20 mM (pH 4,0), DTT 0,2 mM) durante 1 h. Depois trocou-se o tampão por um tampão de modificação de PEG, adicionou-se fosfato de 55 potássio 50 mM (pH 6,5), maleimida-PEG (PM: 40 kDa,

Shearwater) numa relação molar de Fab':PEG de 40 kDa de 1:10 e fez-se reagir, a 4 °C, durante 24 h, com uma ligeira agitação.

Depois de a reacção estar completa, carregou-se a solução reaccional numa coluna Superdex 200 (Pharmacia) equilibrada com tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 7,3) e eluiu-se a coluna com o mesmo tampão, a uma velocidade de fluxo de 1 ml/min. O Fab' conjugado com PEG de 40 kDa (Fab'-PEG de 40K) foi eluido relativamente cedo devido ao seu peso molecular elevado e o Fab', que não reagiu, foi eluido mais tarde, eliminando assim o Fab' que não reagiu.

Para eliminar completamente o Fab' que não reagiu, as fracções do complexo de Fab'-PEG de 40 K recolhidas foram novamente carregadas numa coluna de polyCAT de 21x250 (PolyLC) e eluiu-se esta coluna com um gradiente linear de NaCl de 0,15-0,5 M em tampão de fosfato de sódio 20 mM (pH 4,5), providenciando assim um complexo de Fab'-S-PEG de 40 K compreendendo o PEG de 40 K ligado a um grupo -SH do Fab' . EXEMPLO EXPERIMENTAL 1: Identificação e análise quantitativa dos conjugados de proteína <1-1> Identificação dos conjugados de proteína

Analisaram-se os conjugados de proteína preparados nos exemplos anteriores por meio de EGPA-SDS não reduzido utilizando um gel com um gradiente de 4-20 % e um gel a 12 % e ELISA (R&D System).

Como resultado da análise de EGPA-SDS, como se mostra na fig. 3, uma reacção de acoplamento de um polipéptido 56 PEG e um fisiológico, de um polimero não peptídico, fragmento de Fc de uma imunoglobulina resultou na produção, com sucesso, de um conjugado de IFNa-PEG-Fc (A), um conjugado de 17Ser- FEC-G-PEG-Fc (B) e um conjugado de EPO-PEG-Fc (C).

Além disso, o Fc DG preparado no exemplo 10 foi analisado por EGPA-SDS a 12 % não reduzido. Como se mostra na fig. 6b, detectou-se uma banda de Fc DG numa posição, o que corresponde ao peso molecular do Fc natural a que faltam as partes de açúcar. <l-2> Análise quantitativa dos conjugados de proteina

Os conjugados de proteina preparados nos exemplos anteriores foram quantificados por cromatografia de exclusão por dimensão utilizando uma coluna HiLoad 26/60 Superdex 75 (Pharmacia) e um tampão de fosfato de potássio 10 mM (pH 6,0), como tampão de eluição, em que se comparou uma área de pico de cada conjugado de proteina com a do grupo de controlo. Os padrões analisados quantitativamente, previamente, IFNa, HCh, FEC-G, 17S-FEC-G, EPO e Fc, foram individualmente submetidos a cromatografia por exclusão de dimensão e determinou-se um factor de conversão entre uma concentração e um pico. Submeteu-se uma quantidade pré-determinada de cada conjugado de proteina à mesma cromatografia por exclusão de dimensão. Subtraindo uma área de pico correspondendo a um fragmento de Fc de imunoglobulina da área do pico assim obtido, determinou-se um valor quantitativo para uma proteina, activa sob o ponto de vista fisiológico, presente em cada conjugado de proteina. A fig. 4 mostra o resultado da cromatografia por exclusão de dimensão do conjugado de IFNcx-PEG-Fc purificado, em que se observou um único pico. Este 57 resultado indica que o conjugado de proteína purificada não contém impurezas multiméricas tais como um dímero, um trimero ou um número superior de monómeros.

Quando um conjugado de um polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico com Fc foi analisado quantitativamente utilizando um anticorpo especifico para o polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico, o anticorpo foi impedido de se ligar ao polipéptido, resultando num valor mais baixo do que um valor actual calculado por cromatografia. No caso do conjugado de IFNa-PEG-Fc, um ensaio por ELISA resultou num valor de ELISA correspondendo a cerca de 30 % do valor actual. <l-3> Avaliação da pureza e da massa dos conjugados de proteína

Os conjugados de proteína preparados nos exemplos anteriores foram submetidos a cromatografia por exclusão de dimensão e mediu-se a densidade óptica a 280 nm. Como resultado, os conjugados de IFNa-PEG-Fc, HCh-PEG-Fc, FEC-G-PEG-Fc e 17Ser-FEC-G-PEG-Fc exibiram um único pico com um tempo de retenção de uma substância de 70 a 80 kDa.

Por outro lado, realizou-se a CLAR de fase inversa para determinar as purezas dos conjugados de proteína preparados nos exemplos 1, 11 e 13, IFNcx-PEG-Fc, IFNa-PEG-Fc DG e derivados de IFNa-PEG-Fc NG recombinante. Utilizou-se uma coluna de fase inversa (coluna 259 VHP54, Vydac). Eluíu-se a coluna com um gradiente de acetonitrilo de 40-100 % com ATF a 0,5 % e analisaram-se as purezas medindo a densidade óptica a 280 nm. Como resultado, tal como se mostra na fig. 8, as amostras não continham interferão não ligado ou Fc de imunoglobulina e verificou-se que todos os 58 conjugados de proteína, IFNa-PEG-Fc (A), IFNa-PEG-Fc DG (B) e derivado de IFNa-PEG-Fc NG recombinante (C), tinham uma pureza maior do que 96 %.

Para determinar os pesos moleculares precisos dos conjugados de proteínas purificados, analisou-se a massa para cada conjugado, utilizando um espectrofotómetro de massa MALDI-TOF de elevado rendimento (Voyager DE-STR, Applied Biosystems). Utilizou-se como matriz o ácido sinapínico. Revestiu-se uma lâmina da amostra com 0,5 μΐ de cada amostra de ensaio e secou-se ao ar, misturou-se novamente com um volume igual de uma solução da matriz e secou-se ao ar e introduziu-se numa fonte de iões. A detecção foi realizada de uma forma positiva utilizando um analisador TOF de modo linear. Aceleraram-se os iões com uma fonte de iões de extracção dividida operada por extracção retardada (ER) usando um tempo de extracção retardada de 750 nsec a 1500 nsec, a uma voltagem de aceleração total de cerca de 2,5 kV.

Os pesos moleculares observados pela espectrometria de massa de MALDI-TOF para os conjugados de proteína de Fc preparados nos exemplos estão ilustrados no quadro 1, a seguir. A fig. 5 mostra os resultados da espectrometria de massa de MALDI-TOF para os conjugados de EPO-PEG-Fc e a fig. 7 mostra os resultados da espectrometria de massa de MALDI-TOF para os conjugados de IFNa-PEG-Fc e IFNa-PEG-Fc DG. Como resultado, verificou-se que o conjugado de proteína de EPO-PEG-Fc tinha uma pureza superior a 95 % e um peso molecular muito próximo de um PM teórico. Também se verificou que a EPO se acopla ao fragmento de Fc de imunoglobulina numa proporção de 1:1. QUADRO 1 59 PM teórico (kDa) PM medido (kDa) IFNa-PEG-Fc (E.l) 75,4 75, 9 HCh-PEG-Fc (E.3) 78,4 78, 6 FEC-G-PEG-Fc (E.4) 75,3 75, 9 17S-derivado de FEC-G-PEG-Fc (E.4) 75, 0 75, 9 EPO-PEG-Fc (E.5) 91,4 91,0

Além disso, quando se examinou o Fc e o Fc DG, preparados no exemplo 10, quanto aos seus pesos moleculares, por espectrometria de massa de MALDI-TOF, verificou-se que o Fc DG era de 50 kDa, que é cerca de 3 kDa inferior ao de Fc natural (fig. 6a) . Dado que um PM de 3 kDa corresponde à dimensão teórica das partes de açúcar, os resultados demonstram que as partes de açúcar foram completamente eliminadas. O quadro 2 a seguir, mostra os resultados da espectrometria de massa de MALDI-TOF do conjugado de IFNa-PEG-Fc DG preparado no exemplo 11 e os conjugados derivados de IFNa-PEG-Fc NG recombinante (I e II) preparados no exemplo 13. Verificou-se que o conjugado de IFNa-PEG-Fc DG era 3 kDa mais leve e que o conjugado derivado de IFNa-PEG-Fc NG recombinante (I) era cerca de 3-4 kDa mais leve do que o conjugado de IFNa-PEG-Fc de 75,9 kDa. O conjugado de IFNa-PEG-derivado de Fc NG recombinante (II) acoplado a um monómero de Fc exibiu uma diminuição do peso molecular de 24,5 kDa, correspondendo ao peso molecular do monómero de Fc. QUADRO 2 60 PM teórico (kDa) PM medido (kDa) IFNa-PEG-Fc DG (E.ll) 72,8 73,0 IFNa-PEG-derivado de Fc NG recombinante (I) (E.13) 72,3 72,2 IFNa-PEG-derivado de Fc NG recombinante (II) (E.13) co 46, 6

EXEMPLO EXPERIMENTAL 2: Análise farmacocinética I

Avaliaram-se as formas naturais de proteínas activas sob o ponto de vista fisiológico (controlos) e os conjugados de proteínas preparados nos exemplos e nos exemplos comparativos, complexos de PEG de 40K, conjugados de PEG-albumina, conjugados de PEG-Fc, conjugados de PEG-Fc DG e conjugados de derivados de PEG-Fc NG recombinante, quanto à estabilidade no soro e os parâmetros farmacocinéticos em ratos SD (cinco ratos por grupo). Os controlos e os complexos de PEG de 40 K, conjugados de PEG-albumina, conjugados de PEG-Fc, conjugados de PEG-Fc DG e conjugados de derivados de PEG-Fc NG recombinante (grupos de ensaio) foram injectados individualmente, sub-cutaneamente, numa dose de 100 yg/kg. Depois da injecção subcutânea, colheram-se as amostras de sangue às 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 30, 48, 72 e 96 h nos grupos de controlo e, nos grupos de ensaio, às 1, 6, 12, 24, 30, 48, 72, 96, 120, 240 e 288 h. Recolheram-se as amostras de sangue em tubos com um anticoagulante, heparina, e centrifugou-se, durante 5 min, utilizando uma mciro-centrifugadora de Eppendorf de alta velocidade, para eliminar as células sanguíneas. Os níveis de proteína no soro foram medidos por ELISA utilizando anticorpos específicos para as proteínas activas sob o ponto de vista fisiológico.

Os resultados das análises farmacocinéticas das formas naturais de IFNoí, HCh, FEC-G e EPO e PEG de 40 K e os seus complexos, os seus conjugados de PEG-albumina, os seus conjugados de PEG-Fc e os seus conjugados de PEG-Fc DG 61 estão ilustrados nos quadros 3 a 7, a seguir. Nos quadros que se seguem, Tmax indica o tempo necessário para atingir a concentração máxima de fármaco no soro, T1/2 indica que o semi-periodo de vida no soro de um fármaco e o TMR (tempo médio de residência) indica o tempo médio que uma molécula de fármaco reside no corpo. QUADRO 3

Farmacocinética do interferão alfa IFNa natural IFNa-PEG de 4 0 K(C.E.l) IFNa-PEG- albumina (C.E.2) IFNa-PEG Fc (E.l) IFNa- PEG-Fc DG (E.11) IFNa-PEG-derivado de Fc NG recomblnante (I) (E. 13) IFNa-PEG-derivado de Fc NG recombinante (II) (E.13) Tmax (h) 1,0 30 12 30 48 24 24 Tl/2 1,7 35,8 17,1 90,4 71,0 61,2 31,2 (h) 2,1 71,5 32,5 150,1 120, 6 111,0 58,8 QUADRO 4

Farmacocinética do factor de crescimento humano Natural hGH-PEG de 40 K hGH-PEG-albumina hGH-PEG-Fc hGH (C.E.l) (C.E.2) (E. 3) ^max (h) 1,0 12 12 12 T1/2 (h) 1,1 7,7 5,9 11,8 TMP (h) 2,1 18,2 13, 0 18,8 QUADRO 5

Farmacocinética de FEC-G FEC-G FEC-G-PEG de 40 K FEC-G-PEG-albumina FEC-G-PEG-Fc (E.4) natural (C.E.l) (C.E.2) Tmax (Tl) 2,0 12 12 12 T1/2 (h) 2,8 4,8 5,2 6,9 TMP (h) 5,2 24,5 25, 0 32, 6 62 QUADRO 6

Farmacocinética de derivados de ''s-FEC-G Derivado de ''s-FEC- 1Ç-FEC-G-PEG de 40 "S-FEC-G-PEG- 1 / S-FEC-G-PEG-Fc G natural K (C.E.l) albumina (C.E.2) (E.4) Tmax (h) 2,0 24 24 24 Ti/2 (h) 2,9 4,3 6,4 7,0 TMP (h) 5,8 24,4 25, 1 33,2 QUADRO 7

Farmacocinética da EPO EPO natural EPO altamente glicosilada EPO-PEG-Fc (E.5) EPO-PEG-derivado de Fc NG recombinante (E.13) Tmax (h) 6, 0 12 30 48 Tl/2 (h) 9,4 18,4 61,5 87, 9 TMP (h) 21, 7 26,8 117, 6 141, 6

Como se mostra, a partir dos dados do quadro 3 e do gráfico da farmacocinética da fig. 9, o conjugado de proteína de IFNa-PEG-Fc tem um semi-período de vida no soro de 90,4 h que é cerca de 50 vezes mais elevado do que o do IFNa natural e cerca de 2,5 vezes mais elevado do que o do IFNa-PEG de 40K com um semi-periodo de vida de 35,8 h, preparado no exemplo comparativo 1. Também se verificou que o conjugado de proteína de IFNa-PEG-Fc da presente invenção tem um semi-período de vida no soro superior ao de IFNa-PEG-albumina, que tem um semi-período de vida de 17,1 h.

Por outro lado, como se mostra no quadro 3 e na fig. 11, o conjugado de IFNa-PEG-Fc DG tem um semi-período de vida no soro de 71,0 h, que era quase o mesmo que o do conjugado de IFNa-PEG-Fc, indicando que a desglicosilação de Fc não afecta grandemente a estabilidade in vivo do conjugado de IFNa-PEG-Fc DG. Também se verificou que o conjugado preparado utilizando o derivado de Fc NG recombinante produzido por um processo recombinante tem um efeito idêntico ao da forma natural derivada de Fc DG. 63

Contudo, o semi-período de vida no soro de um complexo acoplado a um monómero de Fc foi cerca de metade do de um complexo acoplado a um dimero normal de Fc.

Como se mostra no quadro 4, a hormona do crescimento humano também exibiu um semi-período de vida prolongado no soro, quando conjugada com o fragmento de Fc de IgG de acordo com a presente invenção. Isto é, comparado com a forma natural (1,1 h) , o complexo de HCh-PEG de 40 K e o conjugado de HCh-PEG-albumina tem um semi-período de vida ligeiramente aumentados de 7,7 h e 5,9 h, respectivamente, enquanto o conjugado de proteína de HCh-PEG-Fc da presente invenção exibiu um semi-período de vida no soro bastante aumentado de 11,8 h.

Como é evidente dos dados farmacocinéticos de FEC-G e dos seus derivados, nos quadros 5 e 6, os conjugados de FEC-G-PEG-Fc e 17-FEC-G-PEG-Fc exibiram um semi-período de vida no soro mais longo do que o semi-período de vida do complexo de PEG de 40 K e um conjugado de PEG-albumina. Verificou-se que o fragmento de Fc de imunoglobulina no soro prolonga a duração da acção das proteínas, activas sob o ponto de vista fisiológico, nas suas formas naturais, assim como os seus derivados com alterações de alguns resíduos de aminoácidos em níveis semelhantes aos das formas naturais. A partir destes resultados, é facilmente previsível que o processo da presente invenção terá um efeito similar noutras proteínas e nos seus derivados.

Como se mostra no quadro 7 e na fig. 10, a conjugação de EPO natural glicosilada com o fragmento de Fc também resultou num aumento do semi-período de vida no soro. Isto é, a EPO tem um semi-período de vida no soro de 9,4 h na forma natural e um semi-período de vida no soro prolongado 64 de 18,4 h quando altamente glicosilado para melhorar a estabilidade no soro. 0 conjugado de EPO-PEG-Fc, compreendendo EPO acoplado ao fragmento de Fc de imunoglobulina, de acordo com a presente invenção, exibiu um semi-periodo de vida no soro bastante prolongado de 61,5 h. Também quando conjugado com o derivado de Fc não glicosilado (NG), recombinante, derivado de E. coli, o semi-periodo de vida EPO aumentou para 87,9 h, indicando que a não glicosilação do fragmento de Fc permite a preparação de um conjugado de proteína que não afecta a estabilidade da proteína no soro, sem funções de anticorpo.

Como é evidente dos resultados anteriores, os conjugados de proteína ligados covalentemente ao fragmento de Fc de imunoglobulina, através de um polímero não peptídico, de acordo com a presente invenção, exibiram semi-períodos de vida no soro aumentados de várias vezes a várias dezenas de vezes em relação à forma natural. Do mesmo modo, quando o Fc de imunoglobulina não era gi icosilado pela produção em E. coli ou desglicosilado pelo tratamento com enzima manteve-se, a um nível similar, o seu efeito de aumento do semi-periodo de vida no soro dos seus conjugados de proteína.

Em particular, comparados com proteínas modificadas com o PEG de 4 0 kDa, tendo a duração de acção mais longa entre as moléculas de PEG, para aumentar a duração de acção das proteínas no soro, os conjugados de proteína de Fc de imunoglobulina têm uma estabilidade no soro muito superior. Além disso, comparados com os conjugados de proteína acoplados a albumina em vez de Fc de imunoglobulina, os conjugados de proteína da presente invenção exibiram uma excelente estabilidade no soro, indicando que os conjugados de proteína da presente invenção são eficazes no 65 desenvolvimento de formas de fármacos de proteína de actuação prolongada. Daqui resulta que os conjugados de proteína da presente invenção têm excelentes efeitos na estabilidade no soro e o TMP numa vasta gama de proteínas, incluindo os derivados de factor de estimulação de colónias, por mutação pontual, comparados com as proteínas conjugadas convencionais de PEG ou albumina, indicam que a estabilidade e os efeitos de prolongamento da duração dos conjugados de proteína da presente invenção são aplicáveis a outros polipéptidos activos sob o ponto de vista fisiológico.

Por outro lado, quando o conjugado de proteína de IFNa-PEG de ÍOK-Fc (exemplo 7), preparado utilizando um polímero não peptídico, PEG de 10 kDa, foi avaliado quanto ao seu semi-período de vida no soro, de acordo com o mesmo processo que foi descrito antes, mostrou um semi-período de vida no soro de 48,8 h, que era de alguma forma menor do que o semi-período de vida no soro (79,7 h) de um conjugado de proteína preparado utilizando um PEG de 3,4 kDa.

Além disso, os semi-períodos de vida no soro dos conjugados de proteína diminuíram com o aumento do peso molecular do polímero não peptídico PEG. Estes resultados indicam que o principal factor que aumenta a estabilidade e a duração no soro dos conjugados de proteína é o conjugado do fragmento de Fc imunoglobulina e não o polímero não peptídico.

Mesmo quando o grupo reactivo de PEG foi permutado com um grupo reactivo diferente do grupo aldeído, os conjugados de proteína com o PEG apresentaram modelos similares, no peso molecular aparente e no semi-período de vida no soro, dos acoplados com PEG com um grupo aldeído reactivo. 66

EXEMPLO EXPERIMENTAL 3: Análise farmacocinética II

Para determinar os semi-períodos de vida no soro dos conjugados de Fab'-S-PEG-N-Fc e Fab'-N-PEG-N-Fc, preparados nos exemplos 8 e 9 e o complexo de Fab'-S-PEG de 40 K, preparado no exemplo comparativo 3, realizaram-se análises farmacocinéticas do fármaco, de acordo com o mesmo processo usado no exemplo experimental 2 utilizando como controlo Fab', os conjugados e o complexo. Os resultados estão ilustrados na fig. 12.

Como se mostra na fig. 12, os conjugados de Fab'-S-PEG-N-Fc e Fab'-N-PEG-N-Fc exibiram semi-periodos de vida no soro prolongados duas ou três vezes, comparados com os de Fab' ou o complexo de Fab'-S-PEG de 40 K. EXEMPLO EXPERIMENTAL 4: Avaliação da actividade intracelular dos conjugados de proteína <4-l> Comparação dos conjugados de proteína de IFNa quanto à actividade intracelular

Para comparar a actividade intracelular dos conjugados de proteína de IFNa avaliou-se IFNa-PEG-Fc (exemplo 1), IFNa-PEG-Fc DG (exemplo 11), IFNa-PEG-derivado de Fc NG recombinante (exemplo 13), IFNa-PEG de 40K (exemplo comparativo 2) e IFNa-PEG-albumina (exemplo comparativo 2) quanto à actividade antiviral por meio de um bioensaio de cultura de células utilizando células de rim de bovino Madin Darby (RBMD) (ATCC CCL-22) infectadas com o vírus da estomatite vesicular. O interferão alfa-2b sem PEG, 67 disponível no National Institute for Biological Standards and Controls (NIBSC), foi utilizado como o material padrão.

Fez-se uma cultura de células RBMD em MEM (meio essencial mínimo, JBI) complementado com SFB a 10% FBS e penicilina/estreptomicina a 1 %, a 37 °C, em atmosfera de CO2 a 5 %. Diluíram-se as amostras a serem analisadas e o material padrão com o meio de cultura para pré-determinar as concentrações e colocaram-se alíquotas de 100 μΐ em cada poço de uma placa de 96 poços. Destacaram-se as células da cultura, adicionaram-se à placa contendo as amostras num volume de 100 μΐ e fez-se a cultura durante cerca de 1 h, a 37 °C, em atmosfera de CO2 a 5 %. Depois, adicionou-se, a cada poço da placa, 50 μΐ de vírus da estomatite vesicular (VEV) de 5-7χ103 UFP e as células ficaram em cultura durante cerca de 16 a 20 h, a 37 °C, em atmosfera de CO2 a 5 %. Utilizou-se um poço que não continha a amostra nem o material padrão, mas continha apenas o vírus, como controlo negativo e utilizou-se como controlo positivo um poço que continha apenas células.

Depois retirou-se o meio de cultura, adicionou-se à placa 100 μΐ de uma solução vermelha neutra para corar as células viáveis, seguida da incubação, durante 2 h, a 37 °C em atmosfera de CO2 a 5 %. Depois dos sobrenadantes terem sido eliminados, adicionou-se, a cada poço da placa, 100 μΐ de uma mistura de etanol a 100 % e ácido acético a 1 % numa proporção de 1:1. Depois de se misturar cuidadosamente para dissolver todos os cristais vermelhos neutros, eluíu-se a partir das células coradas, medindo-se a densidade óptica a 540 nm. Utilizou 0 controlo negativo como um branco e calcularam-se os valores de DE50 (doses que causam a inibição de 50 % do crescimento das células), em que 0 68 crescimento das células do controlo positivo foi fixado em 100 %. QUADRO 8

Cone. (ng/ml) Actividade específica (IU/mg) Actividade relativa (%) para IFNa natural IFNa natural 100 4,24E+08 100 IFNa-PEG de 40 K 100 2,04E+07 CO vT IFNa-PEG-albumina 100 2,21E+07 5,2 IFNa-PEG-Fc 100 1,19E+08 28,1 IFNa-PEG-Fc DG 100 1,09E+08 25, 7 iFNa-PEG-derivado de Fc NG recombinante 100 9,58E+07 22, 6

Como se mostra no quadro 8, a actividade de IFNa-PEG de 40 K decresceu até 4,8 % da do IFNa natural. Especialmente, como a dimensão das partes de PEG aumentaram, um conjugado de proteína melhorou a estabilidade no soro mas decresceu gradualmente a actividade. Já foi relatado que o interferão alfa tem actividade, in vitro, de 25 % quando modificado com PEG de 12 kDa e cerca de 7 % quando modificado com PEG de 40 kDa (P. Bailon et al., Bioconjugate Chem. 12: 195-202, 2001). Isto é, dado que um conjugado de proteína tem um semi-período de vida mais longo mas diminui drasticamente a actividade biológica, à medida que o peso molecular das partes de PEG aumentam, há uma necessidade de desenvolvimento de um conjugado de proteína com um semi-período de vida no soro mais longo e uma actividade mais forte. Além disso, o conjugado de IFNoí-PEG-albumina exibiu uma actividade fraca de cerca de 5,2 %, comparada com a de IFNa natural. Pelo contrário, os conjugados de IFNa-PEG-Fc e IFNa-PEG-Fc DG da presente invenção exibiram uma actividade relativa significativamente aumentada de 28,1 % e 25,7 % comparada com a de IFNa natural. A conjugação de IFNa com o derivado de Fc NG recombinante resultou também 69 num aumento similar da actividade. A partir destes resultados, espera-se que o interferão alfa, conjugado com o fragmento de Fc de imunoglobulina, tenha um semi-periodo de vida no soro marcadamente aumentado e uma eficácia farmacêutica, in vivo, muito aumentada. <4-2> Comparação dos conjugados de proteina de hormona de crescimento humano no que respeita à actividade intracelular

Para comparar a actividade intracelular dos conjugados de proteina de hormona de crescimento humano, comparou-se HCh-PEG-Fc, HCh-PEG de 40 K e HCh-PEG-albumina no que respeita à actividade intracelular.

As actividades intracelulares dos conjugados de HCh foram medidas por meio de um ensaio in vitro, utilizando uma linha de células de linfomas de nódulos de ratos, Nb2 (European Collection of Cell Cultures (ECACC) #97041101), que desenvolve mitogénese dependente da hormona de crescimento humano.

Fez-se uma cultura de células Nb2 em meio de Fisher complementado com SBF (soro bovino fetal) a 10 %, NaCC>3 a 0,075 %, 2-mercaptoetanol 0,05 mM e glutamina 2 mM e voltou a fazer-se uma cultura, num meio semelhante não contendo SBF a 10 %, durante 24 h. Depois contaram-se as células da cultura e colocaram-se alíquotas, de cerca de 2*104 células, em cada poço de uma placa de 96 poços. Diluiu-se HCh-PEG-Fc, HCh-PEG de 40 K, HCh-PEG-albumina, um padrão disponível no National Institute for Biological Standards and Controls (NIBSC) como controlo e hormona de crescimento humano natural (HM-HCh) e adicionaram-se, a cada poço, em concentrações variáveis, seguida de incubação, durante 48 70

Depois, para medir a h, a 37 °C em atmosfera de CO2 a 5 %. actividade de proliferação das células, por meio da determinação do número de células em cada poço, adicionou-se, a cada poço, 25 μΐ de um reagente de uma solução aquosa de titulação de células 96 (Promega) e as células foram ainda postas em cultura, durante 4 h. Mediu-se a densidade óptica a 490 nm e calculou-se um titulo para cada amostra. Os resultados estão apresentados no quadro 9, a seguir. QUADRO 9

Cone. (ng/ml) Actividade específica* (U/mg) Actividade relativa (%) para HM-HCh natural HCh natural 100 2.71E+06 100 HCh (padrão disponível no NIBSC) 100 2.58E+06 95,2 HCh-PEG de 40 100 0.206E+06 7,6 HCh-PEG-albumina 100 0.141E+06 5,2 HCh-PEG-Fc 100 0.76E+06 28,1 Actividade especifica* = l/DE5oxl06 (DE50: quantidade de proteína necessária para 50 % do crescimento máximo das células

Como se mostra no quadro 9, também no caso da hormona do crescimento humano, a conjugação com PEG de 40 kDa (HCh-PEG de 40 kDa) resultou num decréscimo da actividade para cerca de 7,6 % da forma natural e o conjugado de HCh-PEG-albumina exibiu uma actividade baixa, in vitro, que era de cerca de 5,2 % da HCh natural. Contudo, o conjugado de HCh-PEG-Fc da presente invenção aumentou marcadamente na actividade relativa para mais do que 28 % comparada com a da HCh natural. A partir destes resultados, espera-se que a hormona de crescimento humano ligada ao fragmento de Fc de imunoglobulina tenha um semi-período de vida no soro marcadamente aumentado e uma eficácia farmacêutica, in vivo, muito aumentada. Além disso, crê-se que o aumento da actividade dos conjugados de proteina do Fc de imunoglobulina é devido ao aumento da estabilidade no soro e à afinidade de ligação preservada aos receptores devido ao Fc de imunoglobulina ou devido ao espaço formado pelo polimero 71 não peptídico. Prevê-se que estes efeitos sejam aplicáveis aos conjugados de proteínas de Fc de imunoglobulina acoplados a outras proteínas activas sob o ponto de vista fisiológico. <4-3> Comparação dos conjugados de proteína de FEC-G quanto à actividade intracelular

Para comparar a actividade intracelular dos conjugados de proteína com um derivado de FEC-G, o FEC-G natural (Filgrastim, Jeil Pharm. Co., Ltd.), derivado de 17Ser-FEC-G, PEG de 20 K-FEC-G (Neulasta) , PEG de 40K-17S-FEC-G, 17Ser-FEC-G-PEG-albumina e 17S-FEC-G-PEG-Fc foram comparados quanto à actividade intracelular.

Em primeiro lugar, fez-se uma cultura de uma linha de células mielóides humanas, HL-60 (ATCC CCL-240, doente com leucemia promielocítica/36 anos de idade, mulher caucasiana) em RPMI 1640, complementado com SBF a 10 %. Fez-se uma suspensão de células de cultura a uma densidade de cerca de 2,2χ105 células/ml e adicionou-se DMSO (dimetilsulfóxido, grau de cultura, Sigma) a uma concentração final de 1,25 %(v/v). Depois, semeou-se 90 μΐ da suspensão de células em cada poço de uma placa de 96 poços (Corning/placa de 96 poços de baixa evaporação), providenciando assim uma densidade de cerca de 2*104 células por poço e fez-se uma cultura numa incubadora, a 37 °C em CO2 a 5 %, durante cerca de 72 h.

Cada amostra, cuja concentração de proteína foi determinada utilizando um estojo de ELISA de FEC-G (R&D Systems), diluiu-se com RPMI 1640 até a uma concentração idêntico a 10 yg/ml e diluiu-se ainda duas vezes com RPMI 1640, dezanove vezes. As diluições duplas em série foram 72 individualmente adicionadas a cada poço contendo células HL-60, a um volume de 10 μΐ, de modo que a concentração de cada amostra comece em 1 yg/ml. Depois, fez-se uma cultura das células numa incubadora, a 37 °C durante 72 h. A proliferação das células HL-60 foi analisada utilizando o Cell Titer 96™ (Promega, n° de catálogo G4100) e determinou-se o aumento do número de células medindo a densidade óptica a 670 nm. QUADRO 10 DE50 (Ul/mg) Actividade relativas (%) para FEC-G-natural FEC-G natural 0,30 100 1 ter-FEC-G 0,26 115 FEC-G-PEG de 20 K (Neulasta) 1,20 25 1 Ger-FEC-G-PEG de 40 K 10, 0 < 10,0 1 'Ser-FEC-G-PEG-albumina 1,30 23,0 1 ter-FEC-G-PE G-Fc 0,58 51,7

Como se mostra no quadro 10, os conjugados de proteína de Fc de imunoglobulina acoplados com um derivado de FEC-G com uma substituição de aminoácido, 17Ser-FEC-G, também exibiram efeitos similares aos dos conjugados de proteínas acoplados a FEC-G natural. O 17Ser-FEC-G-PEG foi referido previamente como tendo um semi-período de vida no soro aumentado mas uma actividade diminuída comparada com a de 17Ser-FEC-G sem PEG (publicação da pat. coreana No. 2004-83268) . Em especial, como a dimensão das partes de PEG aumentaram, um conjugado de proteína tinha aumentado a estabilidade no soro mas decresceu gradualmente a actividade. 0 17Ser- FEC-G-PEG de 40 K exibiu uma actividade muito baixa, inferior a cerca de 10 % comparada com a da forma activa. Isto é, dado que um conjugado de proteína tem um semi-período de vida no soro prolongado mas diminui drasticamente a actividade à medida que o peso molecular das partes de PEH aumenta, há necessidade de desenvolver um conjugado de proteína com um semi-período de 73 vida no soro longo e com uma forte actividade. 0 conjugado de 17Ser-FEC-G-PEG-albumina também exibiu uma actividade baixa de cerca de 23 % comparada com a de FEC-G natural. Pelo contrário, o conjugado de 17Ser- FEC-G-PEG-Fc aumentou muito a actividade relativa para mais de 51 % comparada com a de FEC-G natural. A partir destes resultados, pode-se esperar que 17Ser-FEC-G, ligado ao fragmento de Fc de imunoglobulina tenha um semi-período de vida no soro bastante aumentado e uma eficácia farmacêutica, in vivo, muitíssimo aumentada. <4-4> Ensaio de neutralização da citotoxicidade para os conjugados de Fab'

Realizou-se um ensaio de actividade in vitro utilizando os conjugados de Fab'-S-PEG-N-Fc e Fab'-N-PEG-N-Fc preparados nos exemplos 8 e 9 e o complexo de Fab'-S-PEG de 40 K, preparado no exemplo comparativo 3. Através de um ensaio de citotoxicidade, baseado na medição da citotoxicidade mediada por FNTa, avaliaram-se os conjugados de Fab' para determinar se neutralizam a apoptose induzida por FNTa numa linha de célula de fibroblasto de murganho, L929 (ATCC CRL-2148) .

Os conjugados de Fab'-S-PEG-N-Fc e Fab'-N-PEG-N-Fc e o complexo de Fab'-S-PEG de 40 K foram diluidos duas vezes em série e colocaram-se aliquotas de 100 μΐ nos poços de uma placa de 96 poços. Adicionou-se, a cada poço, rhFNT-α (R&D Systems) e actinomicina D (Sigma) usada como inibidor da sintese de ARN para concentrações finais, em cada poço, de 10 ng/ml e 1 yg/ml, respectivamente, incubou-se, durante 30 minutos, numa incubadora, a 37 °C, em atmosfera de CO2 a 5 % e transferiu-se para uma microplaca para o ensaio. Adicionaram-se células L929 a cada poço, a uma densidade de 74 5χ104 células/50 μΐ meio e fez-se uma cultura durante 24 h, numa incubadora, a 37 °C, em atmosfera de CO2 a 5 %. Depois do meio de cultura ter sido retirado, adicionou-se, a cada poço, 50 μΐ de MTT (Sigma) dissolvido em SBF, a uma concentração de 5 mg/ml e as células continuaram em cultura durante cerca de 4 h, numa incubadora, a 37 °C, em atmosfera de CO2 a 5 %. Adicionou-se, a cada poço, 150 μΐ de DMSO e determinou-se o grau de neutralização da citoxicidade medindo a densidade óptica a 540 nm. Como controlo, utilizou-se o Fab' purificado na etapa 1 do exemplo 8.

Como se mostra na fig. 13, todos os conjugados de proteína utilizados neste ensaio tinham um titulo semelhante ao de Fab'. Estes resultados indicam que se prepara um conjugado de proteína por meio da ligação de um Fc de imunoglobulina a um resíduo de cisteína livre próximo do terminal de N ou do terminal de C de um Fab' através de PEG, exibindo Fab' um semi-período de vida no soro marcadamente aumentado e uma elevada actividade in vivo. <4-5> Ensaio de citotoxicidade dependente do complemento (CDC)

Para determinar se os derivados preparados nos exemplos e as proteínas que correspondem às regiões constantes das imunoglobulinas, expressas nos transformantes de E. coli e purificados, ligados a Clq humano, realizou-se um ensaio por imunoabsorção ligado a enzimas (ELISA) como se segue. Como grupos de ensaio, utilizaram-se as regiões constantes de imunoglobulina, produzidas pelos transformantes HM10932 e HM10927, depositados no Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) em 15 de Set. de 2004 e a que foram atribuídos os 75 números de acesso KCCM-10597, KCCM-10588 e utilizaram-se os derivados preparados nos exemplos anteriores. Como padrões, utilizou-se uma imunoglobulina glicosilada (IVIG-globulina S, Green Cross PBM) e utilizaram-se vários anticorpos disponíveis comercialmente como anticorpos terapêuticos. As amostras de ensaio e o padrão foram preparados em tampão de carbonato 10 mM (pH 9,6) a uma concentração de 1 pg/ml. Prepararam-se alíquotas das amostras em placas de 96 poços (Nunc) numa quantidade de 200 ng por poço e revestiu-se a placa, durante a noite, a 4 °C. Depois, lavou-se cada poço com SBF-T (NaCl 137 mM, KC1 2 mM, Na2HP04 10 mM, KH2P04 2 mM, Tween 20 a 0,05 %) três vezes, bloqueou-se com 250 μΐ de um tampão de bloqueio (albumina de soro bovino a 1 % em SBF-T), à temperatura ambiente, durante 1 h lavou-se novamente, três vezes, com o mesmo SBF-T. As amostras de ensaio e o padrão foram diluídas em SBF-T até a uma concentração pré-determinada e adicionou-se aos poços revestidos com anticorpo e incubou-se a placa, à temperatura ambiente, durante lhe lavou-se, três vezes, com SBF-T. Depois adicionou-se à placa 2 yg/ml de Clq (R&D Systems) e deixou-se reagir, à temperatura ambiente, durante 2 h e lavou-se a placa, seis vezes, com SBF-T. Adicionou-se, a cada poço, 200 μΐ de uma diluição de um conjugado de anticorpo humano de Clq anti-humano e peroxidase a 1:1000 (Biogenesis, EUA) em tampão de bloqueio e deixou-se reagir, à temperatura ambiente, durante 1 h. Depois lavou-se cada poço, três vezes, com SBF-T, misturaram-se volumes iguais dos reagentes de cor A e B (cor A: peróxido estabilizado e cor B: cromogénio estabilizado; DY 999, R&D Systems) e adicionou-se 200 μΐ da mistura, a cada poço, seguido da incubação, durante 30 min. Depois, adicionou-se a cada poço 50 μΐ de uma solução de terminação da reacção, ácido sulfúrico 2 M. Leu-se a placa utilizando um leitor de microplacas (Molecular Device). 76

Mediu-se a densidade óptica das amostras do ensaio e do padrão, a 450 nm, e os resultados estão ilustrados nas figs. 14 e 15, respectivamente.

Quando se compararam subclasses de imunoglobulina umas com as outras, quanto à actividade do complemento, no seu fragmento de Fc de imunoglobulina, verificou-se a mais elevada afinidade de ligação com Clq na imunoglobulina humana IgGl (Fitzgerald), a seguir na IgG2 (Fitzgerald) e depois na IgG4 (Fitzgerald), indicando que há uma diferença entre as subclasses no que respeita à actividade do complemento. A IVIG utilizada neste ensaio, que é um aglomerado de subclasses de IgG, exibiu uma afinidade de ligação a Clq quase igual à da IgGl purificada, porque a IgGl equivale à maior parte das IVIG. Comparado com estes padrões, no que respeita às alterações na afinidade de ligação a Clq, por aglicosilação, o Fc de IgGl que tinha actividade do complemento marcadamente mais forte decresceu quando não estava glicosilado. O Fc de IgG4, conhecido por não induzir a activação do complemento, raramente tem afinidade de ligação a Clq, indicando que o Fc de IgG4 é utilizado como um excelente veiculo recombinante sem actividade do complemento (fig. 14).

Para determinar se o veiculo mantém a sua propriedade de não ter afinidade de ligação com Clq, mesmo depois de estar conjugado com um péptido activo sob o ponto de vista fisiológico, preparam-se os conjugados de IFN alfa-Fc utilizando Fc glicosilado, Fc desglicosilado enzimaticamente e Fc recombinante não glicosilado como veiculos para IFN alfa e foram avaliados quanto à sua afinidade de ligação a Clq. Um Fc glicosilado, acoplado a um conjugado de IFN alfa (IFNcx-PEG-Fc: Fc glicosilado de IgGl) manteve uma elevada afinidade de ligação para Clq. 77

Pelo contrário, quando o interferão alfa foi acoplado a um Fc desglicosilado, utilizando F de PNGase e outras enzimas, o conjugado resultante (IFNa-PEG-Fc DG:Fc desglicosilado de IgGl exibiu uma afinidade de ligação com Clq marcadamente diminuida, que era semelhante à do conjugado de Fc não glicosilado derivado de E. coli. Além disso, quando a parte de IgGl do Fc não glicosilado de IgGl acoplado com o conjugado de interferão alfa (IFNa-PEG-Fc NG Gl:Fc não glicosilado de IgGl foi trocado com a parte de IgG4, verificou-se que o conjugado de interferão resultante (IFNa-PEG-derivado 1 de Fc G4:Fc não glicosilado de IgG4) tinha perdido completamente a sua afinidade de ligação a Clq. Quando parte do Fc de IgGl foi trocado com o monómero de Fc de IgG4, verificou-se que o conjugado resultante (IFNa-PEG-derivado 2 de Fc de G4:Fc não glicosilado de IgG4). Estes resultados indicam que essas formas do fragmento de Fc de IgG4 são úteis como veiculos excelentes que não têm as funções efectoras dos fragmentos de anticorpos (fig. 15).

Aplicabilidade industrial

Tal como descrito aqui antes, o conjugado de proteina da presente invenção aumenta muitíssimo os semi-períodos de vida no plasma dos fármacos de polipéptidos para níveis superiores aos de qualquer proteína convencional modificada. Por outro lado, os conj ugados de proteínas ultrapassam a desvantagem mais significativa das formulações convencionais de acção prolongada, diminuindo os títulos do fármaco, tendo assim um tempo de circulação no sangue e uma actividade in vivo superior aos da albumina, previamente conhecida como a mais eficaz. Além disso, os conjugados de proteína não têm o risco de induzir respostas imunitárias. Devido a estas vantagens, os 78 conjugados de proteína são úteis para o desenvolvimento de formulações de acção prolongada dos fármacos de proteína. As formulações de fármacos de proteínas, de acção prolongada, de acordo com a presente invenção, são capazes de reduzir a dor do doente a partir de injecções frequentes e de manter as concentrações no soro dos polipéptidos activos, durante um período de tempo prolongado, providenciando assim, de forma estável, a eficácia farmacêutica.

Além disso, o presente processo de preparação de um conjugado de proteína ultrapassa as desvantagens da produção de proteínas de fusão por meio de manipulação genética, incluindo o difícil estabelecimento de sistemas de expressão, glicosilação diferente da da forma natural, glicosilação diferente da de uma forma natural, indução de resposta imunitária e orientação limitada da proteína de fusão, baixos rendimentos devidos a reacções não específicas e problemas de acoplamento químico tal como toxicidade dos compostos químicos utilizados como ligantes, providenciando assim fármacos de proteínas de obtenção fácil, sob o ponto de vista económico, com um semi-período de vida no soro prolongado e uma actividade elevada. <110> Hanmi Pharm. Co., Ltd.

<12 0> COMPLEXO DE PROTEÍNA UTILIZANDO UM FRAGMENTO DE IMUNOGLOBULINA E UM PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO <150> KR10-2003-0080299 <151> 2003=11-13 <160> 6 79 <17Ο> Kopatentln 1.71

<210> 1 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 1 cgtcatgccc agcacctgag ttcctggggg gacca 35

<210> 2 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 2 gggggatcct catttaccca gagacaggga gaggctcttc tg 42 <210> 3 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 3 80 29 cggcacctga gttcctgggg ggaccatca

<210> 4 <211> 69 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 4 atgaaaaaga caatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaat 60 gcccaggcg 69

<210> 5 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador <400> 5 tctattgcta caaatgccca ggccttccca accattccct tatcc 45

<210> 6 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador <400> 6 agataacgat gtttacgggt ccggaagggt tggtaaggga atagg 45 Lisboa, 4 de Abril de 2012. 81

Claims (24)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Conjugado de proteína caracterizado pelo facto de compreender um polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico, um polímero não peptídico e um fragmento de Fc de imunoglobulina, em que o polímero não peptídico está ligado linearmente, em ambas as extremidades, ao polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico e ao fragmento de Fc de imunoglobulina por uma ligação covalente e em que o polímero não peptídico é polietileno-glicol.
2. 2. Conjugado de proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de um ou mais complexos do polipéptido, activo sob o ponto de vista fisiológico e do polímero não peptídico estarem ligados covalentemente a uma única molécula do fragmento de Fc de imunoglobulina.
3. 3. Conjugado de proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o fragmento de Fc de imunoglobulina não estar glicosilado.
4. 4. Conjugado de proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o fragmento de Fc de imunoglobulina ser composto por um a quatro domínios selecionados no grupo que consiste nos domínios CP1, Cp2, CP3 e CP4.
5. 5. Conjugado de proteína, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o fragmento de Fc de imunoglobulina incluir ainda uma região charneira. 1
6. 6. Conjugado de proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o fragmento de Fc de imunoglobulina ser selecionado no grupo que consiste em fragmentos de Fc de IgG, IgA, IgD, IgE, IgM e as respectivas combinações e híbridos.
7. 7. Conjugado de proteína, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o fragmento de Fc de imunoglobulina ser selecionado no grupo que consiste em fragmentos de Fc de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 e as respectivas combinações e híbridos.
8. 8. Conjugado de proteína, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o fragmento de Fc de imunoglobulina ser um fragmento de Fc de IgG4.
9. 9. Conjugado de proteína, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o fragmento de Fc de imunoglobulina ser um fragmento de Fc glicosilado de IgG4 humana.
10. 10. Conjugado de proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o polímero não peptídico ter um grupo reactivo selecionado no grupo que consiste num grupo aldeído, um aldeído de propiona, um grupo de aldeído butílico, um grupo maleimida e um derivado de succinimida.
11. 11. Conjugado de proteína, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de o derivado de succinimida ser propionato de succinimidilo, carboxi-metil-succinimidilo, hidroxi-succinimidilo ou carbonato de succinimidilo. 2
12. 12. Conjugado de proteína, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de o polímero não peptídico ter um grupo aldeído reactivo como grupo reactivo nas suas duas extremidades.
13. 13. Conjugado de proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o polímero não peptídico estar ligado, em cada uma das suas extremidades, a um grupo reactivo livre na extremidade do terminal amino, um residuo de lisina, um resíduo de histidina ou um resíduo de cisteína do fragmento de Fc de imuno-globulina e o polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico.
14. 14. Conjugado de proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico se selecionar no grupo que consiste em hormonas, citocinas, enzimas, anticorpos, factores de crescimento, factores reguladores da transcrição, factores de coagulação, vacinas, proteínas estruturais, proteínas de ligandos e receptores.
15. 15. Conjugado de proteína, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de o polipéptido, activo sob o ponto de vista fisiológico, se selecionar no grupo que consiste em hormona do crescimento humano, hormona de libertação da hormona do crescimento, péptido que liberta a hormona do crescimento, interferões, receptores de interferão, factores de estimulação de colónias, similares de glucagon, receptor acoplado à proteína G, interleucinas, receptores de interleucina, enzimas, proteínas de ligação a interleucina, proteínas de ligação a citokina, factor de activação de macrófagos, péptido de 3 macrófagos, factor de células B, factor de células T, proteína A, inibidor de alergia, glicoproteínas de necrose de células, imunotoxina, linfotoxina, factor de necrose do tumor, supressores de tumor, factor de crescimento de metástases, antitripsina alfa-1, albumina, alfa-lactalbumina, apolipoproteína E, eritro-poietina, eritropoietina altamente glicosilada, angio-poietinas, hemoglobina, trombina, receptor de trombinaque activa péptidos, trombomodulina, factor VII, factor Vila, factor VIII, factor IX, factor XIII, factor de activação de plasminogénio, péptido de ligação a fibrina, urocinase, estreptocinase, hirudina, proteína C, proteína C reactiva, inibidor de renina, inibidor de colagenase, superóxido-dismutase, leptina, factor de crescimento derivado de plaquetas, factor de crescimento epitelial, factor de crescimento epidérmico, angiostatina, angiotensina, factor de crescimento ósseo, proteína de estimulação dos ossos, calcitonina, insulina, atriopeptina, factor de indução de cartilagem, elcatonina, factor de activação do tecido conjuntivo, inibidor da via do factor dos tecidos, hormona de estimulação do folículo, hormona de luteinização, hormona de libertação da hormona de luteinização, factores de crescimento dos nervos, hormona da paratiróide, relaxina, secretina, somatomedina, factor de crescimento semelhante à insulina, hormona adrenocortical, glucagon, colecistocinina, polipéptido pancreático, péptido de libertação de gastrina, factor de libertação de corticotropina, hormona de estimulação da tiróide, autotaxina, lactoferrina, miostatina, receptores, antagonistas de receptores, antigénios da superfície das células, antigénios de vaccínia derivados de vírus, 4 anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e fragmentos de anticorpos.
16. 16. Conjugado de proteína, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de o polipéptido activo, sob o ponto de vista fisiológico, ser hormona do crescimento humano, interferão alfa, factor de estimulação de colónias de granulócitos, eritropoietina ou um fragmento do anticorpo Fab'.
17. 17. Processo para a preparação do conjugado de proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender: (a) a ligação covalente de um ou mais polímeros não peptídicos com um grupo reactivo em ambas as suas extremidades, um ou mais polipéptido, activos sob o ponto de vista fisiológico e um ou mais fragmentos de Fc de imunoglobulina; e (b) o isolamento do referido conjugado de proteína, compreendendo o polipéptido, activo sob o ponto de vista fisiológico, ligado covalentemente, polimero não peptídico e fragmento de Fc de imunoglobulina, em que o polímero não peptídico é polietileno-glicol.
18. 18. Processo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de a etapa (a) compreender: (al) a ligação covalente de um fragmento de Fc de imunoglobulina ou de um polipéptido, activo sob o ponto de vista fisiológico, a uma extremidade de um polímero não peptídico activado; 5 (a2) isolamento de um complexo compreendendo o fragmento de Fc de imunoglobulina ou o polipéptido, activo sob o ponto de vista fisiológico, ligado ao polímero não peptídico, a partir da mistura reaccional resultante; e (a3) a ligação covalente de um fragmento de Fc de imunoglobulina ou de um polipéptido, activo sob o ponto de vista fisiológico, à outra extremidade do polímero não peptídico do complexo isolado, para se obter um conjugado de proteína compreendendo o fragmento de Fc de imunoglobulina e o polipéptido, activo sob o ponto de vista fisiológico, que estão ligados a cada uma das extremidades do polímero não peptídico.
19. 19. Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de, na etapa (al), o polipéptido, activo sob o ponto de vista fisiológico e o polímero não peptídico serem usados na reacção numa proporção molar de 1:1,25 a 1:5.
20. 20. Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de, na etapa (al), o fragmento de Fc de imunoglobulina e o polímero não peptídico serem usados na reacção numa proporção molar de 1:5 a 1:10.
21. 21. Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de, na etapa (a3), o complexo obtido na etapa (a2) e o fragmento de Fc de imunoglobulina ou o polipéptido, activo sob o ponto de vista fisiológico, serem usados na reacção numa proporção molar de 1:0,5 a 1:20. 6
22. 22. Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de as etapas (al) e (a3) serem realizadas na presença de um agente redutor.
23. 23. Processo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto de o agente redutor ser seleccionado no grupo que consiste em cianoboro-hidreto de sódio (NaCNBH3) , boro-hidreto de sódio, borato de dimetilamina e borato de piridina.
24. 24. Composição farmacêutica caracterizada pelo facto de providenciar um polipéptido activo sob o ponto de vista fisiológico, com uma maior duração in vivo e uma maior estabilidade, compreendendo o conjugado de proteína, de acordo com as reivindicações 1 a 16 como componente eficaz e um seu veículo, aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Lisboa, 4 de Abril de 2012. 7