KR20150108405A

KR20150108405A - 가금류 성능 개선을 위한 성장 인자의 난내 투여

Info

Publication number: KR20150108405A
Application number: KR1020157022491A
Authority: KR
Inventors: 파락 차리
Original assignee: 조에티스 서비시즈 엘엘씨
Priority date: 2013-02-22
Filing date: 2014-02-19
Publication date: 2015-09-25
Also published as: JP2016511768A; US20140242569A1; WO2014130529A1; BR112015019778A2; CA2900814A1; MX2015010927A; US9394515B2; EP2958581A1; AU2014219037A1

Abstract

가금류에서 흉근 중량을 증가시키기 위한 방법이 본원에 개시된다. 이들 방법에는 난내 투여를 통한 조성물의 전달이 포함될 수 있다. 본원에 개시된 방법은 또한 단백질의 전달, 예컨대 섬유아세포 성장 인자-2(FGF-2) 또는 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1)의 전달을 포괄한다. 본원에 개시된 방법은 배아에서 그리고 도축 연령에서 모두 가금류의 흉근 중량을 증가시키기 위해 효과적이다.

Description

가금류 성능 개선을 위한 성장 인자의 난내 투여{IN OVO ADMINISTRATION OF GROWTH FACTORS FOR IMPROVING POULTRY PERFORMANCE}

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 본원에 그 전문이 참조로 도입되는, 2013. 2. 22.에 출원한 U.S. 가출원 번호 61/767,961을 우선권 주장한다.

기술분야

본 출원의 요지는 부화 전 알로의 기질 전달을 통해 가금류에서 성능을 개선하는 방법이다. 이는 부화 전 및 후에 근육 성장 및 중량을 모두 증가시킨다.

현재 가금류의 성장 성능을 개선하기 위한 필요성이 존재하며, 여기에는 근육 형성 속도 및 양의 증가뿐만 아니라 대응하는 근육 중량의 증가가 포함된다. 가금류 및 다른 식품용 동물에서의 성능 개선을 달성하기 위해 친환경적인 접근을 확인하는데 대한 강조의 확대로 인해, 이러한 전략에 스테로이드나 다른 화학적 호르몬의 이용이 관여되지 않는 것이 바람직하다.

가금류에서, 위성 세포는 근육 세포의 전구체인 것으로 간주된다. 위성 세포가 활성화되는 생리적 조건 하에서, 이들은 증식하여 성숙 근육 세포로의 분화를 거친다(Kaung 및 Rudnicki, Trends in Mol Med; 14(2):82-91; 2008에서 리뷰로 다뤄짐). 가금류 위성 세포가 증식 및 분화에 대해 표적화될 수 있는 동안 본질적으로 2 단계 - 부화 전(배아) 단계 및 부화 후 단계가 존재한다. 따라서 가금류에서 근육 증량의 증가를 달성하기 위해 적합한 조성물을 확인하는 것뿐만 아니라 해당 조성물의 정확한 투여 시점 및 경로를 확인하기 위한 필요성이 충족되지 않은 채 있다.

본 발명의 방법은 놀랍고 예상치 못하게도 난내 단백질 투여가 부화 전 및 부화 후 단계 동안에 모두 근육 중량의 상당한 증가로 이어짐을 나타내는 예를 제공한다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 난내 단백질을 포함하는 조성물의 투여 단계를 포함하는 조류에서 근육 중량을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 하나 이상의 구현예에서, 단백질이 섬유아세포 성장 인자 및 인슐린 유사 성장 인자로 구성된 군으로부터 선택됨이 제공된다. 하나 이상의 구현예에서, 단백질은 섬유아세포 성장 인자이다. 하나의 구현예에서, 단백질은 섬유아세포 성장 인자-2(FGF-2)이다. 하나의 구현예에서, 단백질은 인슐린 유사 성장 인자이다. 하나의 구현예에서, 단백질은 인슐린 유사 성장 인자-1이다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 단백질이 섬유아세포 성장 인자-2(FGF-2) 및 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1) 또는 이들의 변이체로 구성된 군으로부터 선택됨이 제공된다.

본 발명의 하나 이상의 구현예에서, 단백질이 서열 목록 번호 1 내지 4 또는 이들의 변이체로 구성된 군으로부터 선택됨이 제공된다. 본 발명의 하나 이상의 구현예에서, 단백질이 서열 목록 번호 1, 또는 이들의 변이체임이 제공된다. 본 발명의 하나 이상의 구현예에서, 단백질이 서열 목록 번호 2, 또는 이들의 변이체임이 제공된다. 본 발명의 하나 이상의 구현예에서, 단백질이 서열 목록 번호 3, 또는 이들의 변이체임이 제공된다. 본 발명의 하나 이상의 구현예에서, 단백질이 서열 목록 번호 4, 또는 이들의 변이체임이 제공된다. 하나 이상의 구현예에서, 펩티드는 재조합 단백질이다.

본 발명의 하나 이상의 구현예에서, 방법은 난내 투여되는 섬유아세포 성장 인자-2의 용량이 최대 약 120ng/알임을 제공한다. 하나 이상의 구현예에서, FGF-2의 용량은 약 10ng/알 내지 60ng/알이다. 본 발명의 하나 이상의 구현예에서, 방법은 인슐린 유사 성장 인자-1의 용량이 최대 약 200ng/알임을 제공한다.

본 발명의 하나 이상의 구현예에서, 방법은 조류가 닭; 칠면조; 뿔닭; 꿩; 메추라기; 공작; 오리; 거위; 비둘기; 비둘기류, 및 평흉류로 구성된 군으로부터 선택됨을 제공한다. 하나의 구현예에서, 조류는 닭을 포함한다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 방법은 본 발명의 조성물이 투여가 난내 주입에 의한 것임을 제공한다. 하나의 구현예에서, 난내 주입은 알각을 뚫고 처리 성분을 알의 내부로 전달하는 장치에 의해 수행된다. 하나의 구현예에서, 방법은 투여 방법이 수동 난내 백신접종에 의한 것임을 제공한다.

하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 방법은 약 배아일 0 내지 18에 투여된다. 하나의 구현예에서, 투여는 약 배아일 0 내지 4에 일어났다. 하나 이상의 구현예에서, 투여는 약 배아일 0에 일어난다. 하나 이상의 구현예에서, 투여는 약 배아일 1에 일어났다. 하나 이상의 구현예에서, 투여는 약 배아일 2에 일어났다. 하나 이상의 구현예에서, 투여는 약 배아일 3에 일어났다. 하나의 구현예에서, 투여는 약 배아일 4에 일어났다. 하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 조성물의 투여는 약 배아일 4 내지 배아일 18에 일어났다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물의 투여는 배아 발생의 최종 사분기에 일어났다. 하나 이상의 구현예에서, 조성물의 투여는 약 배아일 18에 일어났다.

하나의 구현예에서, 단백질은 연장된 반감기를 갖는다. 하나 이상의 구현예에서, 단백질은 화학적으로 개질된다. 하나 이상의 구현예에서, 단백질은 융합 단백질이다. 하나의 구현예에서, 융합 단백질은 Fc 단편을 포함한다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 단백질의 투여는 적어도 약 2%의 근육 중량 증가로 이어진다. 하나의 구현예에서, 단백질의 투여는 도축 연령에 약 2% 내지 10%의 근육 중량으로 이어진다. 하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 단백질의 난내 투여가 약 3-7%의 근육 중량 증가로 이어진다는 것을 제공한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 위성 세포 증식의 증가로 이어진다. 하나의 구현예에서, 위성 세포 증식의 증가는 근육 과다형성의 증가로 이어진다.

본 발명의 하나 이상의 구현예에서, 방법은 본 발명의 방법에 의한 투여 단계를 포함하는, 가금류에서 근육 성장을 증가시키기 위한 단백질을 포함하는 조성물의 이용을 제공한다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 RNA 수준을 측정함으로써 흉근 조직 내 미오D, 미오게닌, 신데칸 및 글리피칸-1과 같은 단백질 전사체 수준을 측정하여 조류에서 증가된 성장을 결정하는 방법을 제공한다.

도 1a 및 1b: PBS의 난내 주입(대조군) 대비 120ng FGF-2(VH), 200ng IGF-1 및 40ng FGF-2의 ED4 후 난내 주입에서 웅성(a) 및 자성(b)에 대한 평균 35일(성장 발육) 흉근 중량 요약의 그래프 표시
도 2a: 50ng IGF-1(저), 100ng IGF-1(중) 및 200ng IGF-1(고) 및 PBS(대조군)의 ED4 후 난내 처리에서 배아일(ED18)에 측정된 대흉근의 주요 중량 측정의 그래프 표시.
도 2b: 40ng FGF-2 및 PBS(대조군)의 ED4 후 난내 처리에서 배아일 18(ED18)에 측정된 대흉근의 주요 중량 측정의 그래프 표시.
도 3a: 50ng IGF-1(저), 100ng IGF-1(중) 및 200ng IGF-1(고) 및 PBS(대조군)의 ED4 후 난내 처리에서 배아일 18(ED18)의 체중의 그래프 표시.
도 3b: 40ng FGF-2 및 PBS(대조군)의 ED4 후 난내 처리에서 배아일 18(ED18)의 체중의 그래프 표시.
도 4a: 50ng IGF-1(저), 100ng IGF-1(중) 및 200ng IGF-1(고) 및 PBS(대조군)의 ED4 후 난내 처리에서 배아일 18(ED18)의 체중 백분율로서의 대흉근의 그래프 표시.
도 4b: 40ng FGF-2 및 PBS(대조군)의 ED4 후 난내 처리에서 배아일 18(ED18)의 체중 백분율로서의 대흉근의 그래프 표시.
도 5: 상이한 농도(10ng, 20ng 및 40ng)의 FGF-2를 이용한 ED4에서의 난내 처리 후 ED18 흉근의 유전자 발현 데이터의 그래프 표시. 미오게닌 전사체의 발현을 측정하고, RNA 추출 및 qPCR 분석 후 GAPDH 발현 수준과 비교하였다.
도 6: 상이한 농도(10ng, 20ng 및 40ng)의 FGF-2를 이용한 ED4에서의 난내 처리 후 ED18 흉근의 유전자 발현 데이터의 그래프 표시. 글리피칸-1 전사체의 발현을 측정하고, RNA 추출 및 qPCR 분석 후 GAPDH 발현 수준과 비교하였다.
도 7: 상이한 농도(10ng, 20ng 및 40ng)의 FGF-2를 이용한 ED4에서의 난내 처리 후 ED18 흉근의 유전자 발현 데이터의 그래프 표시. 신데칸-1 전사체의 발현을 측정하고, RNA 추출 및 qPCR 분석 후 GAPDH 발현 수준과 비교하였다.
도 8: 상이한 농도(10ng, 20ng 및 40ng)의 FGF-2를 이용한 ED4에서의 난내 처리 후 ED18 흉근의 유전자 발현 데이터의 그래프 표시. 미오D 전사체의 발현을 측정하고, RNA 추출 및 qPCR 분석 후 GAPDH 발현 수준과 비교하였다.

서열 설명

상세한 설명

본원에서 언급되는 모든 문헌, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 이들의 전문이 참조로 도입된다.

하기 정의는 구현예의 설명에서 채용되는 용어에 적용될 수 있다. 하기 정의는 본원에 참조로 도입되는 각각의 개별 참고문헌에 포함된 임의의 반대되는 정의에 우선한다.

본원에서 본 발명의 설명에서 이용되는 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 목적이며, 본 발명을 제한하려는 것이 아니다.

본 발명의 설명 및 특허청구범위에서 이용되는 단수형에는 문맥 상 명확히 달리 나타내지 않는 한 복수 형태도 포함되는 것이다.

달리 나타내지 않는 한, 본원에서 이용되는 용어 "약" 또는 "대략"은 측정 가능한 수치 변수와 함께 이용되는 경우, 나타낸 변수값 및 나타낸 값의 실험 오차 이내(예로, 평균에 대해 95% 신뢰도 구간 이내) 또는 나타낸 값의 10% 이내인 변수의 모든 값 중 더 큰 것을 의미한다.

본원에서 이용되는 용어 "공기 셀"은, 달리 나타내지 않는 한 알의 큰 말단에서 흰자 및 껍질 간의 빈 공간을 의미한다.

본원에서 이용되는 용어 "아미노산"은, 달리 나타내지 않는 한 천연 생성 및 합성 아미노산뿐만 아니라 천연 생성 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모사체를 나타낸다. 천연 생성 아미노산은 유전 코드에 의해 인코딩되는 것들뿐만 아니라 이후 개질되는 아미노산, 예를 들어 비제한적으로 히드록시프롤린, 카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 20개의 통상적 아미노산의 입체이성질체(예로, D-아미노산), 비천연 아미노산, 예컨대 α 및 α-2치환 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 및 다른 비통상적 아미노산도 본 발명의 폴리펩티드를 위해 적합한 성분일 수 있다. 비통상적 아미노산의 예에는 하기가 포함된다: 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸라이신, ε-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시라이신, σ-N-메틸아르기닌, 및 다른 유사 아미노산 및 이미노산.

아미노산 유사체는 천연 생성 아미노산와 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소에 결합된 탄소, 카르복실기, 아미노기, 및 R기를 갖는 화합물을 나타낸다. 예시적인 아미노산 유사체에는, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭시드, 및 메티오닌 메틸 설포늄이 포함된다. 이러한 유사체는 개질된 R기(예로, 노르류신) 또는 개질된 펩티드 골격을 갖지만, 천연 생성 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산 모사체는 아미노산의 일반 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만 천연 생성 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 나타낸다.

아미노산은 이들의 일반적으로 공지된 3문자 기호에 의해 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에서 권장하는 1문자 기호에 의해 본원에서 나타낼 수 있다.

용어 "조류"에는 임의의 조류종의 웅성 또는 자성이 포함되는 것이지만, 주로 알 또는 고기를 위해 상업적으로 키우는 가금류를 포괄하려는 것이다. 따라서 용어 "조류"는 특히 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기 및 꿩의 암컷 및 수컷을 포괄하려는 것이다.

본원에서 이용되는 용어 "배아"는, 달리 나타내지 않는 한 수정란 내의 다세포성 이배체 진핵생물을 의미한다. 본원에서 이용되는 용어 "배아일" 또는 "ED"는, 달리 나타내지 않는 한 수정란을 인큐베이터에 넣은 후의 일수를 의미한다. 당분야 숙련자에게는 조류 수정란의 산란 시 알이 적절한 인큐베이션 온도에서 인큐베이터에 배치된 후 난내 발생하기 시작할 것임이 알려져 있다. 따라서 ED0은 산란-후 알을 인큐베이터에 배치한 날로 정의된다; ED21은 일반적으로 닭 배아에 있어서 부화일로 간주된다. 본원에서 이용되는 용어 "초기 배아 단계"는 ED0에서 시작하여 ED4 말에 끝나는 최초 배아 단계를 설명하기 위해 이용되고 있다. 본원에서 이용되는 용어 "후기 배아 단계"는 배아 인큐베이션의 최종 사분기를 설명하기 위해 이용되고 있다. 상기 단계는 약 ED18(배아일 18) 근처로 정의될 수 있다.

본원에서 이용되는 용어 "인큐베이션의 최종 사분기"는, 달리 나타내지 않는 한 새 또는 가축 새 발생란의 인큐베이션의 최종 사분기를 의미한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 최종 사분기는 닭의 경우 바람직하게는 인큐베이션 15-20일에, 가장 바람직하게는 인큐베이션 18 또는 19일에 수행된 난내 투여를 나타낸다. 칠면조의 경우, 난내 투여는 바람직하게는 인큐베이션 21-26일에 수행된다.

본원에서 이용되는 용어 "융합 단백질"은 원래 별도 단백질을 코딩하는 둘 이상의 유전자의 연결을 통해 생성되는 융합 단백질, 특히 Fc 융합 단백질을 의미한다. 상기 융합 유전자의 번역은 원래 단백질 각각에서 유래되는 기능적 특성을 갖는 단일 폴리펩티드를 생성한다. 재조합 융합 단백질은 생물학 연구 또는 치료제에서 이용하기 위해 재조합 DNA 기술에 의해 인공적으로 생성된다. Fc-기반 융합 단백질은 IgG 이소형 항체의 Fc 도메인이 상이한 단백질에 연결되는 것이다.

본원에서 이용되는 용어 "반감기"는, 달리 나타내지 않는 한 단백질 양의 절반이 분해되거나 사라지거나 모집단에서 제거되는데 걸리는 시간을 의미한다.

본원에서 이용되는 용어 "섬유아세포 성장 인자", "섬유아세포 성장 인자-1" 또는 "FGF-1", "섬유아세포 성장 인자-2", 또는 "FGF-2"는, 달리 나타내지 않는 한 혈관신생, 상처 치유 및 배아 발생에 관여되는 성장 인자 패밀리의 구성원인 단백질을 의미한다. 섬유아세포 성장 인자(FGF)는 헤파린-결합 단백질이며 세포-표면 연관된 헤파린 설페이트 프로테오글리칸과 상호작용하고, FGF 신호 전달에 필수적인 것으로 나타났다. 발생 과정에서 FGF의 기능에는 중배엽 유도, 전후 패턴화, 수족 발생, 신경 유도 및 신경 발생, 그리고 성숙 조직/시스템에서의 혈관신생, 각질세포 조직화 및 상처 치유 과정이 포함될 수 있다.

본원에서 이용되는 용어 "글리피칸" 또는 "글리피칸-1"은, 달리 나타내지 않는 한 헤파린 설페이트 프로테오글리칸으로 간주되는 단백질 패밀리의 단백질을 의미한다. 글리피칸은 세포 신호전달 경로를 변경하고 세포 증식 및 조직 성장에 기여할 수 있다. 글리피칸-1의 발현 증가는 조직 성장 증가를 제시한다.

본원에서 이용되는 용어 "성장-발육"은, 달리 나타내지 않는 한 소비용 새의 부화 및 수확 간의 시기를 의미한다. "부화 직후"라는 용어는 관련 분야에서 성장-발육에서의 0일을 나타내는 것으로 알려져 있다. 본원에서 이용되는 용어 "도축 연령"은, 달리 나타내지 않는 한 새가 수확되는 날을 의미한다.

본원에서 이용되는 용어 "난내 투여", 또는 "난내 주입"은, 달리 나타내지 않는 한 알각을 통과하고 조성물을 도입하는 임의 수단에 의한 본원에 기재된 배아를 함유하는 조류 알 내로의 본 발명의 조성물의 주입을 의미한다. 투여의 난내 경로는 여전히 알에 있으면서 각 배아에 균일한 용량의 조성물을 전달하는 편리한 방법을 제공한다. 용어 난내 투여는 조류의 알 내로 본 발명의 조성물을 주입하기 위해 이용되는 모든 상이한 여러 투여 절차를 나타낼 수 있다. 당분야 숙련자에게 잘 공지된 바와 같이, 난내 주입은 상이한 기법 및 부피의 시약을 이용하여 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 기본적으로, 난내 주입은 알각을 뚫고 처리 성분을 알의 내부로 전달하는 장치를 이용하는 또는 수동 기법을 이용하는 전달 방법으로 정의될 수 있다. 상기 투여는, 예를 들어 공기 셀 또는 각각의 알 내부의 임의의 다른 구조의 위치를 캔들링에 의해 확인하고 연필로 표시하는 수동 절차일 수 있다. 정의 상, 캔들링은 알 내부 배아의 성장 및 발생 영역을 연구하거나 위치를 확인하기 위해 이용되는 방법이다. 이 방법은 알 뒤의 밝은 광원을 이용해서 껍질을 통해 세부상황을 나타내며, 이용되는 원래 광원이 캔들이었기 때문이 이렇게 불린다. 바늘을 이용해서 원으로 표시된 영역의 중심에 구멍을 뚫고, 이를 통해 뚫린 구멍 내로 본 발명의 조성물을 적가하여 작지만 가변 부피의 배정된 처리를 투여한다. 이어서 구멍을 접착제로 밀봉하고, 알을 인큐베이터에 배치한다. 추가적으로, 난내 투여는 알각을 뚫고 처리 성분을 알의 내부에 전달하는 임의 장치에 의해 수행되는 방법을 의미할 수 있다. 본 발명의 방법은 난내 주입 방법으로 제한되지 않는다. 주입은 수동으로 수행될 수 있다. 주입은 장치에 의해 수행될 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 방법은 알 내로의 주입 위치에 의해 제한되지 않는다. 예를 들어, 초기 배아 단계에 수행된 난내 주입은 알의 공기 셀 내로 투여될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 후기 배아 단계, 예를 들어 배아일 18(ED 18) 또는 그 근처에 수행되는 난내 주입은 알의 양막 내로 투여될 수 있지만 이에 제한되지 않는다.

본원에서 이용되는 용어 "인슐린 유사 성장 인자", "인슐린 유사 성장 인자-1", 또는 "IGF-1"는, 달리 나타내지 않는 한 인슐린에 대해 높은 서열 유사성을 갖는 단백질을 의미한다. IGF은 이들의 생리적 환경과 소통하는데 이용되는 세포의 복잡한 체계의 일부이다. IGF-1은 3 분자간 디설피드 가교를 갖는 단일쇄의 70 아미노산으로 구성된다. IGF-1은 17,066달톤의 분자량을 갖는다. 그 일차 작용은 여러 조직 내의 여러 세포 유형 상에 존재하는 "IGF1R"로 약칭되는 인슐린 유사 성장 인자 1 수용체인 그 특이적 수용체로의 결합에 의해 매개된다. 수용체 티로신 키나아제인 IGF1R로의 결합은 세포내 신호전달을 개시한다; IGF-1은 AKT 신호전달 경로의 가장 강력한 천연 활성화제 중 하나, 세포 성장 및 증식 자극제, 그리고 프로그래밍된 세포사의 강력한 저해제이다. IGF-1은 성장 호르몬(GH) 효과의 일차 매개자이다. 인슐린 유사 성장 인자 1 수용체(IGF-1R) 및 다른 티로신 키나아제 성장 인자 수용체는 여러 경로를 통해 신호를 전달한다.

본원에서 이용되는 용어 "근육 질량" 또는 "근육 성장"은, 달리 나타내지 않는 한 근육 중량의 증가를 의미한다. 이는 과다형성 및 비대의 두 기간으로 구분될 수 있다. 본원에서 이용되는 용어 "과다형성"은 특정 자극에 대한 생리적(정상) 반응으로 간주되며, 과다형성 성장 세포는 여전히 정상적인 조절 제어 기전을 거친다. 본 발명의 범위에서, 과다형성은 근육 세포 또는 섬유의 수 증가로 정의된다. 용어 "비대"는 그 성분 세포의 확대로 인한 조직 부피의 증가이다. 비대는 세포가 대략 같은 크기로 유지되지만 수가 증가하는 과다형성과 구분되어야 한다.

본 발명의 방법은 놀랍고 예상치 못하게도 과다형성 반응, 또는 실제 근육수의 증가를 나타내었다. 이는 비대 근육 부피 증가에 대비해 관찰된 것과 비교된다. 과다형성은 혈액 공급의 병행 증가를 허용하지 않는 비대에 비해 혈액 공급의 병행 증가를 허용한다. 지금까지 가금류 산업은 비대 절차를 통한 빠른 획득에 집중해왔고, 이는 근육 괴사 문제를 갖는 시장 연령의 새에서의 불량한 혈관 공급으로 이어졌다. 본 발명의 방법은 놀랍고 예상치 못하게도 근육에 대한 우수한 혈관 공급에 기반한 유례 없는 수준의 과다형성을 나타내었고, 이는 근육 괴사 문제가 없이 수행되었다.

본원에서 이용되는 용어 "미오게닌"은 골격근 발생 및 보수의 협력에 관여되는 근육 특이적 전사 인자이다. 존재하는 미오게닌의 양 증가는 골격근 발생 증가를 제시한다.

본원에서 이용되는 용어 "미오D"는 근육 분화의 조절에서 주요 역할을 갖는 단백질로 정의된다. 미오D는 근육 조절 인자로 알려져 있는 단백질 패밀리에 속한다. 이들 염기성 나선 루프 나선 전사 인자는 근육 분화에서 순차적으로 작용한다. 미오D는 근육 위탁의 최초 마커 중 하나이다. 미오D는 활성화된 위성 세포에서 발현되지만 정지 위성 세포에서는 발현되지 않는다.

용어 "폴리펩티드", "펩티드", "단백질" 등은 당분야에 널리 공지되어 있고 상호 교환적으로 이용되며, 중합체 길이와 상관 없이 아미드 결합(펩티드 결합으로도 알려져 있음)에 의해 선형 연결된 아미노산 중합체를 나타낸다. 따라서 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, 및 단백질이 폴리펩티드의 정의 내에 포함된다. 상기 용어는 또한 폴리펩티드의 발현 후 개질을 특정하거나 배제하지 않지만, 예를 들어 글리코실기, 아세틸기, 포스페이트기, 지질기 등의 공유 부착이 포함되는 폴리펩티드에 제한되지 않음이 용어 폴리펩티드에 의해 명시적으로 포괄된다. 또한 폴리펩티드의 정의 내에는 하나 이상의 아미노산 유사체(예를 들어, 비-천연 생성 아미노산, 관련되지 않은 생물학적 시스템에서만 천연 생성되는 아미노산, 포유류 시스템으로부터 개질된 아미노산 등을 포함)를 함유하는 폴리펩티드, 치환 결합뿐만 아니라 천연 생성 및 비-천연 생성 모두의 당분야에 공지된 다른 개질을 갖는 폴리펩티드가 포함된다.

본원에서 이용되는 "약학적으로 허용 가능한"은, 달리 나타내지 않는 한 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 등이 없이 대상체의 조직과 접촉하여 이용하기 적합하고, 합리적인 이익 대 위험비를 갖고 어울리며 이들의 목적 용도에 효과적인 성분을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드 분자"는, 달리 나타내지 않는 한 사슬에 공유 결합된 뉴클레오티드 단량체로 이루어진 유기 중합체 분자를 의미한다. DNA(데옥시리보핵산) 및 RNA(리보핵산)는 독특한 생물학적 기능을 갖는 폴리뉴클레오티드의 예이다.

본원에서 이용되는 용어 "가금류"는, 달리 나타내지 않는 한 주로 고기 및 알을 위해 사육되는 가축 가금을 의미한다. 용어에는 갈리포르메(Galliforme)목의 새, 예로 닭, 칠면조, 뿔닭, 꿩, 메추라기, 및 공작; 및 안세리고르메스(Anserigormes, 수영하는 새)목의 새, 예로 오리 및 거위가 포함된다. 이 용어는 또한 비둘기, 비둘기류, 및 평흉류(비제한적으로 타조)를 나타낸다. 용어 "가금류", "새", 및 "조류"는 본원에서 상호 교환적으로 이용된다.

닭에 있어서, 이들은 두 가지 주요 군으로 구분될 수 있다 - 알을 산란하기 키우는 것들("산란용 새"), 및 고기 생산을 위해 키우는 것들("구이용 새"). 구이용 새는 개시된 발명의 방법의 바람직한 표적이다. 구이용 새는 특히 대규모의 효율적인 고기 생산을 위해 키우며, 일반적으로 알-산란 암탉 또는 전통적인 이중 목적 품종에 비해 훨씬 더 빨리 성장한다. 이들은 매우 빠른 성장율, 높은 사료 전환율을 가지며, 상대적으로 낮은 수준의 활성을 나타낸다. 이들은 종종 5주만에 4-5파운드(조리 가능 중량)의 도축 중량에 도달할 수 있다. 상기 시기가 "성장-발육" 기간으로 불린다. 닭의 품종에 있어서, 본 발명의 방법은 모든 품종에 대한 적용 가능성을 갖는다. 여러 상이한 상업적 새 품종이 존재한다. 더 유명한 구이용 품종은 비제한적으로 Cobb 및 Ross 품종이다. Cobb은 French Pullet de Breese 품종의 미국 변종이며, 1980년대 후반에 출현하였다. Cobb 새는 전형적으로 35일(5주)의 성장-발육기를 갖는다. Ross 품종은 뉴질랜드에서 유래되었으며, 스코틀랜드 Ross 및 미국 Cobb의 교배로 얻어졌다. Ross 새는 전형적으로 42일(6주)의 성장-발육기를 갖는다. 그러나 본 발명의 방법은 처리되는 새의 품종으로 제한되지 않으며, 상업적이거나 다른 임의 품종의 알이 이용될 수 있다.

본 발명의 하나의 구현예는 단백질을 포함하는 조성물의 난내 투여 단계를 제공하는 방법이다. 닭 배아의 난내 성장 주기는 대략 21일이다. 상기 21일 주기 동안 언제든지 본 발명의 방법을 수행할 수 있다. 본 발명의 방법은 0(배아일 0, 또는 ED0) 또는 그 근처, 인큐베이션의 최종 사분기 또는 인큐베이션의 ED18(배아일 18)일 또는 그 근처에 수행될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 ED0 내지 ED4 또는 그 근처에, 또는 ED0 또는 그 근처, 또는 ED4 또는 그 근처에 수행될 수 있다.

본원에서 이용되는 용어 "재조합 단백질" 또는 "재조합체"는, 달리 나타내지 않는 한 유도되는 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미하고, 원하는 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 DNA 구축물에 의해 형질전환된 세포로부터 이들을 생산하기 위한 기법이 당분야 숙련자에게 널리 공지되어 있고 이용된다.

본원에서 이용되는 용어 "위성 세포"는 골격근 세포에 대한 전구체 또는 전구체 세포이며, 위성 세포 또는 분화된 골격근 세포가 될 수 있다. 이들은 새로운 근육 섬유를 생성하거나, 이들의 모근육 섬유에 추가적인 근핵을 제공하거나, 또는 정지 상태로 회복될 잠재력을 갖는다. 보다 구체적으로, 활성화 시 위성 세포는 증식하고 근모세포로 분화하는 세포 주기로 재진입할 수 있다.

본원에서 이용되는 용어 "도축 연령"은, 달리 나타내지 않는 한 가금류종이 소비를 위해 희생되는 연령을 의미한다.

본원에서 이용되는 용어 "신데칸"은 특히 G 단백질-커플링된 수용체에 대한, 공동 수용체로 작용하는 것으로 여겨지는 단일 막통과 도메인 단백질이다. 이들 코어 단백질은 3 내지 5의 헤파란 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트 사슬을 수반하며, 이는 섬유아세포 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, 전환 성장 인자-베타, 피브로넥틴 및 항트롬빈-1을 포함하는 매우 다양한 리간드와의 상호작용을 허용한다.

본원에서 이용되는 용어 "처리 유효량"은, 달리 나타내지 않는 한 원하는 긍정적 효과를 일으키는데 필요한 양을 의미한다. 근육의 경우, 처리 유효량은 근육 중량의 발현 가능한 증가를 나타내는데 필요할 것이다.

본원에서 이용되는 용어 "변이체"는 원래 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열이 70% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 또는 97% 초과, 또는 98% 초과로 동일한 폴리펩티드를 포괄하는 특정 폴리펩티드에 대해 정의되지만, 본질적으로 이들의 특성이 줄지 않는 펩티드이다. 예를 들어, 이러한 변이체는 결실, 삽입, 및/또는 치환을 포함하는 천연 변이 또는 유전 조작의 결과일 수 있다.

폴리펩티드의 아미노산 서열 동일성은 공지된 컴퓨터 프로그램, 예컨대 Bestfit, FASTA, 또는 BLAST를 이용하여 통상적으로 결정될 수 있다(예로 Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98(1990); Pearson, Methods Mol . Biol. 132:185-219(2000); Altschul et al., J. Mol . Biol. 215:403-410(1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402(1997) 참고). 특정 서열이, 예를 들어 기준 아미노산 서열과 95% 동일한지 여부를 결정하기 위해 Bestfit 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 이용하는 경우, 파라미터는 동일성 백분율이 기준 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 계산되며 기준 서열 내 아미노산 잔기의 총 수의 5%까지 상동성에서 갭이 허용되도록 설정된다. 폴리펩티드 간 동일성 백분율을 결정하는 상기 언급된 방법은 본원에 개시된 모든 단백질, 단편, 또는 이들의 변이체에 적용 가능하다.

본원에서 이용되는 용어 "수의학적으로 허용 가능한 담체", 또는 "담체"는, 달리 나타내지 않는 한 철저한 의학적 판단 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 등이 없이 동물의 조직과 접촉하여 이용하기 적합하며, 합리적인 이익 대 위험비를 가지고 어울리고, 이들의 목적 용도에 효과적인 성분을 의미한다.

하기 설명은 본 발명의 구현예를 실시하는데 있어서 당분야 숙련자를 보조하기 위해 제공한다. 그럼에도 불구하고, 본원에 논의된 구현예에서의 개질 및 변이는 본 발명 발견의 요지 또는 범위에서 벗어나지 않고 당업자가 제조할 수 있으므로, 본 설명이 본 발명을 과도하게 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.

현재, 가금류의 성장 성능을 개선하기 위한 필요성이 존재하며, 여기에는 근육의 형성 속도 및 양을 증가시키는 것뿐만 아니라 근육 중량에서의 대응하는 증가가 포함된다. 본 발명의 방법은 과다형성 반응 또는 실제 근육의 증가를 나타내었다. 과다형성은 혈액 공급에서 병행 증가를 허용하지 않는 비대에 비해 혈액 공급에서의 병행 증가를 허용한다. 지금까지 가금류 산업은 비대 절차를 통한 빠른 획득에 집중해왔고, 이는 근육 괴사 문제를 갖는 시장 연령의 새에서의 불량한 혈관 공급으로 이어졌다. 본 발명의 방법은 놀랍고 예상치 못하게도 근육에 대한 우수한 혈관 공급에 기반한 유례 없는 수준의 과다형성이 근육 괴사 문제가 없이 수행되었음을 나타내었다.

전에 정의된 바와 같이, 위성 세포는 골격근-특이적인 이종성 줄기 또는 전구체 세포이다. 이들은 후궁하 편재, 근육 가능성 및 자가-재생능을 특징으로 한다. 위성 세포가 활성화되는 생리적 조건 하에서, 이들이 증식하고 성숙한 근육 세포로의 분화를 거친다(Kaung and Rudnicki, Trends in Mol Med; 14(2):82-91; 2008에서 리뷰로 다뤄짐). 여러 이전 연구는 증가된 근육 증량으로 이어져서 성능이 개선된 것으로 간주될 위성 세포의 자극을 나타내고자 하였다. 예를 들어, 부화-전 또는 -후 스테로이드 투여는 위성 세포 자극 및 근육 질량의 후속 증가로 이어지지 않았다. Henry 및 Burke(Poultry Sci.; 78:1006-1013, 1999)에서는 테스토스테론이 난내 투여되는 경우 흉근 중량에서 긍정적 효과가 나타나지 않았다. Keralapurath 등(Poultry Sci.; 89:1497-1501, 2010)에서는 L-카르니틴이 난내 투여되는 경우 성능 또는 도축 수율의 증가가 나타나지 않았다. 또한, 스테로이드의 이용은 일반적으로 인간 식품 사슬에 들어올 동물의 친환경적 처리 수단인 것으로 간주되지 않는다.

Wilson 등(Poultry Sci.; 62:811-815, 1983)에서는 갑상샘자극 요오드화 카제인이 부화 후 전달되는 경우 흉근 중량의 증가가 나타나지 않았다. Vasilatos-Younken(Poultry Sci; 78:759-768, 1999)에서는 성장 호르몬이 부화 후 투여되는 경우 조류 근육 성장의 유도가 나타나지 않았다. Huybrechts 등(Poultry Sci; 71:181-187, 1992)에서나 Tixier-Boichard 등(J Endocrinol; 133:101-110, 1992)에서는 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1)이 부화 후 투여되는 경우 중량 획득 증가가 나타나지 않았다. Spencer 등(Reproduction, Nutrition, Development; 30(4):515-521, 1990)에서는 IGF-1을 난내 투여하는 경우 전체 체중 및 다른 파라미터에 유의미한 긍정적 효과가 나타나지 않았고 외인성 IGF-1의 투여가 닭 배아의 추가 성장을 자극하지 않은 것으로 결론이 났다.

본 발명의 방법은 근육 줄기 세포(위성 세포)를 자극하여 증식하고 이들의 세포수를 증가시키기 위한 배아일 0(ED0) 내지 배아일 4(ED4)에 또는 배아일 18(ED18)에 펩티드, 예를 들어 섬유아세포 성장 인자-2 또는 인슐린 유사 성장 인자-1의 투여를 제공한다. 본 발명의 방법은 가금류 성능에서, 특히 과다형성을 통한 근육 질량의 증가에서 놀랍고 예상치 못한 개선을 제공하는 것이 본원에 예시된다.

조성물

본 발명의 하나의 구현예는 가금류에서 성능을 개선하고 근육 중량을 증가시키기 위한 다양한 유형의 화합물의 이용을 포괄한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 단백질을 이용하는 방법을 포괄할 수 있다. 이들 단백질은 본 발명의 방법에 따라 이용된다. 이러한 예에는 비제한적으로 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 예를 들어 비제한적으로 1형 및 2형 IGF, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 예를 들어 비제한적으로 1형 및 2형 FGF, 간세포 성장 인자(HGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 성장 호르몬(GH), 성장 호르몬 분비 호르몬(GRF), 및 갑상샘 자극 호르몬-분비 호르몬(TRF) 등이 포함된다. 이들은 또한 합성적으로 또는 재조합적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 서열 목록 번호 1은 인간 FGF-2의 성숙 형태의 아미노산 서열을 개시하며, 이는 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다. 서열 목록 번호 2는 인간 FGF-1의 성숙 형태의 아미노산 서열을 개시하며, 이는 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다. 서열 목록 번호 3은 닭 FGF-2의 성숙 형태의 아미노산 서열을 개시하며, 이는 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다. 서열 목록 번호 4는 닭 FGF-1의 성숙 형태의 아미노산 서열을 개시하며, 이는 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다. 본 발명은 또한 서열 목록 번호 1 내지 4 중 임의 하나의 변이체를 제공한다.

본 발명의 방법에서 이용하기 위한 조성물에는 하나 이상의 수의학적으로, 또는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 모두 상호 교환적으로 이용되는 담체가 포함될 수 있다. 이러한 담체에는 비제한적으로 물, 식염수, 완충 식염수, 인산염 완충액, 알코올/수용액, 에멀션 또는 현탁액이 포함된다. 또한 에탄올, 폴리올, 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 및 주사용 유기 에스테르가 포함된다. 완충액 및 pH 조정제도 채용될 수 있다. 완충액에는 비제한적으로 유기 산 또는 염기로부터 제조된 염이 포함된다. 대표적 완충액에는 비제한적으로 유기 산의 염, 예컨대 시트르산의 염, 예로 시트레이트, 아스코르브산, 글루콘산, 히스티딘-Hel, 카르본산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산, 프탈산, Tris, 트리메틸아민 히드로클로라이드, 또는 인산염 완충액이 포함된다. 비경구 담체에는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스, 트레할로스, 수크로오스, 락테이트화 링거, 또는 고정 오일이 포함될 수 있다. 정맥내 담체에는 수액 및 영양 보충제, 전해질 보충제, 예컨대 링거 덱스트로스에 기반한 것들 등이 포함될 수 있다. 보존제 및 다른 첨가제, 예를 들어 항균제, 항산화제, 킬레이트제(예로, EDTA), 불활성 기체 등이 또한 약학적 담체에 제공될 수 있다. 본 발명은 담체의 선택에 의해 제한되지 않는다. 적절한 pH, 등장성, 안정성 및 다른 통상적 특징을 갖는 상술된 성분으로부터 이들 약학적으로 허용 가능한 조성물의 제조는 당분야의 기술 내에 있다. 예로, [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed, Lippincott Williams & Wilkins, pub., 2000; 및 The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4^th Edition, eds. R. C. Rowe et al., APhA Publications, 2003]와 같은 텍스트를 참고하라. 여기에는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 보강제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제 등이 포함될 수 있다. 희석제에는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등이 포함될 수 있다. 등장화제에는 당분야 숙련자에게 공지된 것들 중에서 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨, 및 락토오스가 포함될 수 있다. 안정화제에는 당분야 숙련자에게 공지된 것들 중에서 알부민이 포함된다. 보존제에는 당분야 숙련자에게 공지된 것들 중에서 메르티올레이트, 클로로크레솔이 포함된다.

본원에 기재된 활성 화합물은 자체가 약학 제형으로서 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 투여되고 제조될 수 있다. 예를 들어, 비제한적으로 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 비설페이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설포네이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로요오다이드, 2-히드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트토실레이트 및 운데카노에이트의 산 부가염. 염기의 염에는 암모늄 염, 알칼리 금속 염, 예컨대 나트륨 및 칼륨 염, 알칼리 토금속 염, 예컨대 칼슘 및 마그네슘 염, 유기 염기와의 염, 예컨대 디시클로헥실아민 염, N-메틸-D-글루카민, 및 아미노산, 예를 들어 비제한적으로 아르기닌, 라이신 등과의 염이 포함된다.

발명의 표적, 전달 방법, 투여량

본원에서 이용되는 용어 "난내"는 부화 전에 알 내에 함유된 조류를 나타낸다. 본 발명은 비제한적으로 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기, 및 꿩 알을 포함하는 임의 유형의 조류 알과 함께 실시될 수 있다. 그러나 조류 알의 유형에 근거하여, 난내 인큐베이션 시간이 변할 것이다.

기준으로서, 산란된 조류 알은 아직 임의의 배아 발생이 없는 불활성 단계인 것으로 간주된다. 상기 단계는 ED0으로 불리며, 0-21일 상기 단계에 보관될 수 있고, 모두 ED0으로 간주된다. ED0의 알을 배아 발생을 시작시키는 열인 대략 화씨 99도에서 인큐베이터에 배치한다. 성숙한 발생 배아가 부화할 준비가 된 시점인 배아일 18까지 알을 인큐베이션한다. 이어서 알을 다음 3일 동안 알이 닭으로 부화하는 시점인 ED21까지(포함해서) 부화 트레이에 둔다. 이어서 이들 닭을 이들이 가공되는 시점인 시장 연령까지 성장시킨다. Cobb 품종에 대해서는 부화 후 35일 또는 Ross 품종에 대해서는 부화 후 42일이 성장-발육 기간으로 간주되며, 그 이전의 모든 것은 가금류 산업에 있어 바람직하지 못한 것으로 간주된다.

본원에서 이용되는 용어 "난내 투여"는 본 발명의 조성물을 조류 알각을 통해, 특히 알각을 뚫고 알 내부에 처리를 전달하여 수송하는 수단을 나타낸다. 주입 부위는 양수 및 배아 자체, 난황낭 중, 흰자 중 또는 공기 셀 중을 포함하여 양막에 의해 정의되는 영역 내일 수 있다. 본 발명의 실시를 위해, 공기 셀 내로의 주입이 바람직하다. 주입 기전은 중요하지 않지만, 처리가 부화 속도를 과도하게 감소시키지 않도록 방법이 배아 또는 이를 둘러싼 배아 외막의 조직 및 기관을 과도하게 손상시키지 않는 것이 바람직하다.

다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 비제한적으로 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기 및 꿩, 또는 임의의 다른 가축 가금을 포함하는 임의의 조류 대상체에서 수행될 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 처리되는 알은 본원에서 정의된 바와 같은 인큐베이션의 최초 또는 최종 사분기 동안 난내 주입에 의해 처리된다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 알은 배아일 0(ED0) 내지 배아일 18(ED18)에 처리된다. 하나의 구현예에서, 알은 조기 발생 동안, 바람직하게는 ED0 내지 ED4 근처에 처리된다. 하나의 구현예에서, 알은 ED0 또는 그 근처에 처리된다. 하나의 구현예에서, 알은 ED1 또는 그 근처에 처리된다. 하나의 구현예에서, 알은 ED2 또는 그 근처에 처리된다. 하나의 구현예에서, 알은 ED3 또는 그 근처에 처리된다. 하나의 구현예에서, 알은 ED4 또는 그 근처에 처리된다. 하나의 구현예에서, 알은 인큐베이션의 최종 사분기에 처리된다. 하나의 구현예에서, 알은 ED18(배아일 18) 또는 그 근처에 처리된다. 그러나 주지된 바와 같이, 기재된 이들 인큐베이션 시간은 계란에서의 시간이다. 다른 조류 알의 인큐베이션 시간은 당연히 변한다. 당분야 숙련자는 상기 사실을 인지하고 이에 따라 조정할 수 있을 것이다.

일반적으로 본 발명의 방법에서 이용되는 조성물에 대해 적절한 "유효량" 또는 투여량의 선택은 채용되는 조성물의 정체에 기반할 수 있다. 조성물 중 추가 성분의 존재도 조성물의 투여량 및 양에 영향을 줄 수 있다. 이러한 유효 용량의 선택 및 상향 또는 하향 조정은 확실히 당분야의 기술 범위 내이다. 상당한 유해 부작용 없이 대상체에서 원하는 효과를 유도하기 위해 필요한 조성물의 양은 이들 요인에 따라 변한다. 적합한 용량은 당분야 숙련자에 의해 쉽게 결정된다.

재조합 기법

본 발명의 방법의 하나의 구현예에서, 조성물은 재조합 단백질을 포함할 수 있다. 이러한 재조합 단백질은 단백질을 인코딩하는 이종성 삽입물 및 벡터로부터 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종성 삽입물은 본 발명의 아미노산 서열, 예로 서열 목록 번호 1 내지 4, 또는 이들의 변이체를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 삽입물은 선택적으로 이종성 프로모터, 예를 들어 당분야에 공지된 합성 프로모터를 포함할 수 있다. 대안적으로, 숙주 벡터의 프로모터는 삽입물의 발현에 대한 전사 제어를 발휘할 수 있다. 프로모터의 적합한 비제한적 예(벡터 선택에 따라, 천연 또는 이종성일 수 있음)는 H6 백시니아 프로모터, I3L 백시니아 프로모터, 42K 폭스바이러스 프로모터, 7.5K 백시니아 프로모터, 및 Pi 백시니아 프로모터이다.

본 발명의 방법에서 이용되는 조성물의 뉴클레오티드 서열을 클로닝하고 발현하기 위해 이용될 수 있는 몇몇 방법 또는 기법이 공지되어 있다. 예를 들어, 서열은 제한 단편으로 단리되고 클로닝 및/또는 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 서열은 또한 PCR 증폭되고 클로닝 및/또는 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있거나, 이들은 이들 두 방법의 조합에 의해 클로닝될 수 있다. 당분야에 공지되고 구체적으로 기재되지 않은 표준 분자 생물학 기법은 일반적으로 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York(1988); Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, New York; Birren et al(eds) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Vols . 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998)] 및 미국 특허 번호 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 및 5,272,057에 나타낸 방법론에 기재된 바를 따를 수 있다. 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)은 일반적으로 [PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, CA(1990)]에 기재된 바와 같이 수행된다.

본 발명의 방법은 벡터 및 숙주 세포를 포함하는 원핵생물 및 진핵생물 발현 시스템의 이용을 포괄할 수 있고, 이는 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 의해 발현되는 재조합 폴리펩티드의 절단 및 전장 형태 모두를 발현하기 위해 이용될 수 있다. 다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 본 발명의 방법에서 이용되는 폴리펩티드를 발현하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 또한 관심 코딩 서열이 클로닝되고 이후 정제될 수 있는 운반체를 나타낸다. 본 발명은 적절한 벡터 또는 뉴클레오티드 서열로 형질전환되거나 전달감염되는 경우 본 발명의 인코딩된 폴리펩티드 유전자 산물을 발현할 수 있는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 이러한 숙주 세포에는 미생물, 예컨대 비제한적으로 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아(예로, 이. 콜라이(E. coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 코리네박테리움(Corynebacterium)); 유전자 산물 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예로, 사카로마이세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia)); 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예로, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예로, 컬리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 재조합 플라스미드 발현 벡터(예로, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유류 세포의 게놈에서 유도된 프로모터(예로, 메탈로티오나인 프로모터) 또는 포유류 바이러스에서 유도된 프로모터(예로, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구축물을 보유하는 포유류 세포 시스템(예로, COS, CHO, BHK, 293, 3T3)이 포함된다.

본 발명의 방법에서 이용될 수 있는 벡터는 비제한적으로 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 효모 에피솜, 효모 염색체 요소, 포유류 바이러스, 포유류 염색체, 및 이들의 조합, 예컨대 비제한적으로 코스미드 및 파지미드를 포함하는 플라스미드 및 박테리오파지 유전 요소에서 유도된 것들에서 유도될 수 있다.

본 발명의 방법에서 이용될 수 있는 벡터는 폴리펩티드의 발현을 위해 이용될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 벡터에는 발현될 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 시스-작용 조절 영역이 포함된다. 조절 영역은 항상성 또는 유도성일 수 있다. 적절한 트랜스-작용 인자는 숙주에 의해 시험관내 번역 시스템에 의해, 상보적 벡터에 의해, 또는 숙주 내로의 도입 시 벡터 자체에 의해 공급된다.

본 발명의 방법에서 이용될 수 있는 벡터에는 비제한적으로 복제 기원 서열, 하나 이상의 프로모터, 항생제 내성 유전자, 리더 또는 신호 펩티드 서열, 다양한 태그 서열, 그 폴리펩티드가 항생제 내성을 부여하는 유전자를 인코딩할 수 있는 비필수 서열, 제한효소 부위, 리보솜 결합 부위, 번역 인핸서(전사 후 mRNA 안정성을 위한 줄기 루프 구조를 형성할 수 있는 서열), 정지 코돈이 없는 아미노산을 인코딩하는 서열, 및 박테리아 피막 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 발현 또는 디스플레이 벡터에 전형적으로 포함되는 임의 요소가 포함될 수 있다.

본 발명의 방법에서 이용하기 위한 펩티드의 단리를 촉진하기 위해, 펩티드 또는 이들의 특정 단편이 이종성 폴리펩티드에 연결되는 융합 폴리펩티드가 제조될 수 있고, 이는 친화도 크로마토그래피에 의한 단리를 가능케 한다. 바람직하게는, 융합 폴리펩티드는 당분야 숙련자에게 공지된 발현 시스템 중 하나를 이용해서 제조된다. 예를 들어, 펩티드 또는 이들의 특정 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이종성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산에 그 5' 또는 3' 말단에서 연결된다. 핵산은 융합 폴리펩티드의 생산을 가능케 하는 적절한 코돈 해독틀로 연결되며, 여기서 펩티드 또는 이들의 일부의 아미노 및/또는 카르복실 말단은 융합 폴리펩티드로서 항원의 단순화된 회수를 허용하는 이종성 폴리펩티드에 융합된다. 융합 폴리펩티드는 또한 항원이 정제 동안 분해되는 것을 방지할 수 있다. 일부 경우에서, 정제 후 이종성 폴리펩티드를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서 융합 폴리펩티드가 펩티드 및 이종성 폴리펩티드 간 접합부에 절단 부위를 포함하는 것이 또한 고려된다. 절단 부위는 그 부위에서의 아미노산 서열에 특이적인 효소로 절단되는 아미노산 서열로 구성된다. 고려되는 이러한 절단 부위의 예에는 엔테로키나아제에 의해 절단되는 엔테로키나아제 절단 부위, 인자 Xa에 의해 절단되는 인자 Xa 절단 부위, 및 GENENASE에 의해 절단되는 GENENASE 절단 부위가 포함된다(GENENASE는 New England Biolabs; Beverly, Mass.의 상표명임).

펩티드 또는 이들의 특정 단편을 생산하기 위한 원핵생물 발현 시스템의 예는 글루타치온 S-전달효소(GST) 유전자 융합 시스템(Amersham Pharmacia Biotech; Piscataway, N.J.)이다. 융합 단백질을 생산하기 위한 또 다른 방법은 항원을 인코딩하는 cDNA와 폴리히스티딘 태그를 인코딩하는 DNA 서열을 틀내 연결하는 방법이다. 상기 태그는 금속 친화도 크로마토그래피, 바람직하게는 니켈 친화도 크로마토그래피에 의한 융합 폴리펩티드의 정제를 허용한다. Xpress 시스템(Invitrogen; Carlsbad, CA)은 폴리히스티딘-폴리펩티드 융합 단백질을 제조한 뒤 단리하기 위해 이용 가능한 시판 키트의 예이다.

또한, pMAL 융합 및 정제 시스템(New England Biolabs; Beverly, MA)은 융합 폴리펩티드를 제조하기 위한 수단의 또 다른 예이며, 여기서 말토스-결합 단백질(MBP)은 펩티드 또는 이들의 특정 단편에 융합된다. MBP는 아밀로스 친화도 크로마토그래피에 의한 융합 폴리펩티드의 단리를 촉진한다.

다른 융합 파트너, 및 이러한 융합물을 생성하기 위한 방법은 쉽게 이용 가능하고 당분야 숙련자에게 공지되어 있다. 상기 융합물은 본 발명의 방법에서 이용되는 조성물로서 이들의 전체 이용될 수도 있고, 또는 이들은 펩티드 및 이종성 폴리펩티드 간 접합부에서 절단될 수도 있다.

대안적으로, 융합 단백질은 본 발명의 방법에서 이용되는 펩티드, 또는 이들의 특정 단편의 반감기를 연장시키기 위해 작용할 수 있다. 적합한 융합 단백질의 예에는 항체의 Fc 부분을 포함하는 항체 또는 이들의 단편이 포함된다. 알부민은 또한 트랜스페린이 할 수 있듯이, 본 발명의 방법에서 이용되는 조성물의 반감기를 연장시키기 위한 융합 파트너로서 작용할 수 있다. 다른 단백질이 본 발명의 방법에서 이용되는 조성물의 반감기를 연장시키기 위한 융합 파트너로서 이용될 수 있고, 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명의 방법에서 이용되는 폴리펩티드의 융합 파트너와의 융합 방법에는 또한 가교로 공지된 화학적 커플링 또는 바이오콘주게이션이 포함될 수 있다. 가교 방법을 위한 표적에는 일차 아민, 카르복실, 설프히드릴 및 카르보닐의 단백질 관능기가 포함된다. 적합한 가교제의 예에는 디숙신이미딜 수베레이트(DDS) 및 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(설포-SMCC)가 포함된다. 본 발명의 방법에서 이용되는 폴리펩티드는 또한 유전적 커플릴ㅇ에 의해 융합 파트너에 연결될 수 있다. 이는 원래 두 별도의 단백질을 인코딩하는 두 별도의 유전자가 연결되는 경우 일어날 수 있다. 상기 융합 유전자의 번역은 융합 또는 키메라 단백질로 알려져 있는 단일 폴리펩티드를 생성한다. 화학적 또는 유전적 커플링에 의한 융합 단백질의 생성 방법은 당분야 숙련자에게 쉽게 공지되어 있고, 본원에 구체적으로 개신된 것들로 제한되어서는 안 된다.

전반적으로, 본 발명은 ED0 - ED4 및 배아 인큐베이션의 최종 사분기 근처 시점의 기질을 이용한 개입이 시장 연령의 새에서 놀랍고 예상치 못한 성능 획득을 일으키는 것을 나타내는 방법을 제공한다. 이러한 놀라운 결과는 가금류 산업에 대한 상업적 가치를 위해 이용될 수 있다. 추가적으로, 방법은 다리 근육의 증가가 흉근 증가와 함께 보행 및 연관 문제가 없는 더 튼튼하고 더 건강한 새를 생성함을 추가로 제공한다. 본원에서 예시되는 전반적인 근육 중량 획득은 지금까지 가금류 산업에서 나타나지 않은 증가를 나타낸다.

본 발명이 하기 실시예에 의해 추가 예시되고 지지된다. 그러나 이들 실시예가 결코 본 발명의 범위를 추가로 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 반대로, 당업자는 본 발명의 요지 및/또는 특허청구범위의 범위에서 벗어나지 않고 본 발명의 다른 구현예, 개질 및 균등부가 존재함을 쉽게 이해할 것이다.

실시예

실시예 1 : 35일의 구이용 새의 성능에 대한 난내 제공된 FGF -2 또는 IGF -1의 효과.

본 연구의 목적은 배아일 4(ED4)에 공기 셀 내로 섬유아세포 성장 인자-2(FGF-2) 또는 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1)의 난내 투여 후 35일 흉근 중량 및 체중을 평가하기 위한 것이었다.

난내 상:

본 연구에는 4 처리군이 포함되었다: T01(PBS 대조군; 최대 40마리 새가 배치됨), T02(고 용량 IGF; 최대 40마리 새가 배치됨), T03(고 용량 FGF-2; 최대 40마리 새가 배치됨) 및 T04(매우 고 용량 FGF-2; 최대 30마리 새가 배치됨). 표 1을 참고하라.

표 1: 연구 설계

처리는 하기 절차를 이용해서 ED4에 난내 투여하였다:

1. 각 알의 공기 셀의 위치를 캔들링에 의해 확인하고 연필로 표시하였다.

2. 18G 바늘을 이용해서 원으로 표시한 영역 중심에 구멍을 뚫었다.

3. 배정된 처리를 허브에 삽입된 18G 1/4" 바늘 또는 플라스틱 피펫 팁을 갖는 Gilman 피펫을 이용해서 뚫린 구멍 내에 적가하여 100㎕ 부피로 투여하였다.

4. 뚫린 구멍을 글루 건의 고온 접착제로 밀봉하였다.

5. 알을 인큐베이터에 되돌려 넣었다.

모든 알을 상업적 인큐베이터에 두었다. 배정된 처리를 배아일(ED4)에 각 알의 공기 셀에 투여하였다. 처리 투여 후, 알을 무작위화 방식으로 인큐베이터 내 배정된 층 및 수준으로 되돌려 넣었다. ED18에 알을 캔들링으로 확인하고, 살아있는 알을 배정된 부화기 배스킷으로 옮겼다.

ED18에, 각 처리군으로부터 각각 30개 알을 수집하였다. 대흉근을 추출하였다. 각 알에 대한 흉근 중량을 기록하였다.

성장- 발육상:

부화(0일) 시, 남아 있는 모든 살아있는 병아리를 개별 칭량하고, 목에 태그를 달고 모든 새를 단일층 우리에 섞었다. 새는 연구 동안 사료와 물에 자유 접근할 수 있었다.

일반적 무리 상태, 조명, 물, 사료, 통기 및 예상치 못한 사건에 대해 매일 2회 관찰하였다. 모든 사체 및 도태체를 칭량하고 부검하여 새 성별과 사망 원인을 결정하였다.

개별 새 중량을 7, 14, 28 및 35일에 기록하였다. 35일에 개별 체중의 수집 후, 모든 살아있는 새를 안락사시키고 뼈와 피부를 제거한 좌측 흉근 절반을 제거하여 칭량하였다. 모든 흉근 중량을 기록하였다. 또한 각각의 새에 대해 성별을 결정하고 기록하였다.

분석

분석을 위한 일차 변수는 흉근 중량 및 평균 1일 획득이었다. 분석을 위한 이차 변수에는 사체 중량, 사체 중량 대 생체 중량의 비 및 흉근 중량 대 사체 중량의 비가 포함되었다. 체중 데이터를 반복 측정치에 대해 혼합 선형 모델을 이용해서 통계적으로 분석하였다. 모델에는 처리, 연구일, 및 연구 상호작용일 별 처리에 대한 고정 효과가 포함되었다. 무작위 효과에는 처리군 내 동물 및 잔여 오차가 포함되었다. 연구 기간(0-14, 28-34, 및 0-34) 동안 체중 및 평균 1일 획득에 대한 처리 최소 제곱 평균(LSMean)을 체중에 대한 반복 측정 모델로부터 산정하였다. 최소 제곱 평균의 표준 오차를 산정하고, 90% 신뢰도 구간을 구축하였다. 35일 체중 및 사체 데이터(흉근 중량, 사체 중량, 흉근 중량 대 사체 중량의 비, 사체 중량 대 생체 중량의 비)를 혼합 선형 모델을 이용해서 분석하였다. 모델에는 성별, 처리, 처리 상호작용 별 성별에 대한 고정 효과, 및 잔여 오차에 대한 무작위 효과가 포함되었다. 최소 제곱 평균을 처리 수단의 산정치로 이용하였다. 최소 제곱 평균의 표준 오차를 산정하고 90% 신뢰도 구간을 구축하였다.

결과:

35일의 최소 제곱 평균 체중은 T01-T04에 대해 각각 2097.8g, 2136.3g, 2222.7g 및 2092.5g이었다. 35일의 대흉근 중량의 분석을 표 2에 나타낸다.

표 2: 35일 흉근 중량(g)의 분석

상기 연구는 IGF 및 FGF-2의 난내 투여를 평가하였다. 처리를 ED4에 공기 셀로 난내 투여하였다. 상기 배아 발생 단계에서 상기 경로에 의한 IGF(200ng)의 투여는 35일에 흉근 중량의 7.0% 증가로 이어졌다. 동일 조건 하에 저 용량 FGF-2(40ng)의 투여는 35일에 흉근 질량의 7.2% 증가로 이어졌다. 그러나, 3X 용량의 FGF-2(120ng) 투여는 35일에 흉근 중량의 1.1% 감소로 이어졌다. 따라서 ED4에 알의 공기 셀 내로의 200ng IGF 또는 40ng FGF-2의 난내 투여는 식염수 대조군에 비해 35일에 전체 흉근 중량의 ≥7.0% 증가로 이어졌다.

실시예 2: 근육 발생 및 ED18 배아 흉근 중량에 대한 난내 제공된 FGF -2 또는 IGF의 효과

본 연구의 목적은 근육 발생 및 ED18 배아 흉근 중량에 대해 ED4에 난내 제공된 인간 FGF-2 또는 IGF-1의 효과를 평가하기 위한 것이었다.

상기 연구에는 5 처리군에 포함되었다: T01(PBS 대조군), T02(200ng IGF), T03(100ng IGF), T04(50ng IGF) 및 T05(40ng FGF). 아래 표 3을 참고하라.

표 3: 연구 설계

처리(표 3)를 하기 절차를 이용해서 ED4에 난내 투여하였다:

1. 각 알의 공기 셀 위치를 캔들링으로 확인하고 연필로 표시하였다.

4. 뚫린 구멍을 글루 건의 고온 접착제로 밀봉하였다.

5. 알을 인큐베이터에 되돌려 넣었다.

모든 알을 상업적 인큐베이터에 넣었다. 배정된 처리를 ED4에 각 알의 공기 셀에 투여하였다. 처리 투여 후, 알을 무작위화 방식으로 인큐베이터 내 배정된 층 및 수준으로 되돌려 넣었다. ED18에 각 처리군의 최대 30개 알을 제거하였다. 체중을 기록하고 대흉근을 수확하였다. 각 알에 대한 흉근 중량을 기록하였다.

분석

분석을 위한 일차 변수는 흉근 중량이었다. 흉근 중량 데이터를 혼합 선형 모델을 이용해서 통계적으로 분석하였다. 모델에는 처리에 대한 고정 효과 및 잔여 오차에 대한 무작위 효과가 포함되었다. 최소 제곱 평균을 처리 수단의 산정치로 이용하였다. 최소 제곱 평균의 표준 오차를 산정하고, 90% 신뢰도 구간을 구축하였다. 처리 효과가 유의미한 한, 선험적 대조를 이용해서 Fisher의 보호 LSD를 이용해서 처리 차이를 평가하였다. 처리 차이를 10% 유의성 수준에서 평가하였다(P < 0.10).

결과

ED18의 흉근 중량의 분석을 표 4에 나타낸다. 선험적 대조를 표 5에 나타낸다.

표 4: ED18의 흉근 중량의 분석

표 5: ED18의 흉근 중량에 대한 선험적 대조

ED18의 LSMean 흉근 중량은 T01-T05에 대해 각각 0.19, 0.24, 0.25, 0.25 및 0.24g이었다. 모든 IGF(T02-T04) 및 FGF(T05) 투여군은 식염수 대조군(T01)에 비해 유의미하게 더 높은 ED18 흉근 중량을 가졌다. 또한, 100ng의 IGF(T03)는 40ng의 FGF(T05)에 비해 유의미하게 더 높은 ED18 흉근 중량을 가졌다. IGF군 간에는 ED18 흉근 중량에 유의차가 없었다.

ED4에 공기 셀로 50-200ng/알의 IGF의 난내 투여는 ED18에 흉근 질량의 28-33% 증가로 이어졌다. ED4에 공기 셀로 40ng/알의 FGF의 난내 투여는 ED18에 흉근 질량의 24% 증가로 이어졌다.

실시예 3: 근육 발생 및 ED18 배아 흉근 중량에 대한 ED4에 난내 제공된 FGF -2의 효과

본 연구의 목적은 유전자 상향조절 및 근육 과다형성에 대해 ED4에 난내 투여된 인간 FGF-2의 효과를 평가하기 위한 것이었다.

본 연구에는 4 처리군에 포함되었다: T01(PBS, 우리-strep 대조군), T02(FGF-2, 10ng), T03(FGF-2, 20ng) 및 T04(FGF-2, 40ng).

표 6: 연구 설계

처리를 하기 절차를 이용해서 ED4에 난내 투여하였다:

1. 각 알의 공기 셀의 위치를 캔들링으로 확인하고 연필로 표시하였다.

4. 뚫린 구멍을 글루 건의 고온 접착제로 밀봉하였다.

5. 알을 인큐베이터에 되돌려 넣었다.

모든 알을 상업적 인큐베이터에 두었다. 배정된 처리를 ED4에 각 알의 공기 셀에 투여하였다. 처리 투여 후, 알을 인큐베이터 내 배정된 층 및 수준으로 되돌려 넣었다. ED18에 각 처리군의 최대 30개 알을 제거하였다. 체중을 기록하고, 대흉근을 수확하였다. 각 알에 대해 흉근 중량을 기록하고, 흉근 조직을 조직병리학 및 게놈 분석을 위해 수확하였다.

인큐베이터 내 두 층 상의 알을 원웨이 처리 구조로 완전 무작위화된 설계에 따라 처리에 배정하였다.

관련 변수 측정된 체중 및 ED18 흉근

ED18에, 각각의 처리군으로부터 최대 30개 알을 각각 수집하였다. 개별 배아 체중을 기록한 뒤 대흉근을 추출하였다. 각 배아의 대흉근 좌측 흉근의 중량을 칭량하고 기록하였다.

유전자 분석

흉근 조직에서 RNA를 추출하였다. RNA 표본을 글리피칸-1 및 미오게닌 유전자 발현에 대해 qPCR로 분석하였다. 프라이머를 표 7에 기재한다.

표 7: 이용한 프라이머

Mx3000P 시스템(Stratagene) 및 RT² SYBR® Green qPCR Mastermix(SABioscience)로 증폭 및 검출을 수행하였다. 개별 전사체 수준을 GAPDH 수준에 대해 표준화하였다.

결과: 유전자 발현

미오D, 신데칸4, 미오게닌 및 글리피칸-1 유전자 발현 데이터를 도 5-8에 나타낸다. 이들 데이터는 정량적 실시간 PCR로 측정된 전사체의 유전자 발현 수준을 나타낸다. 각각의 막대는 처리군 "C", "L", "M", 및 "H"로부터 3 또는 4 배아의 동량의 RNA를 풀링한 표본을 나타낸다. qRT-PCR을 위해 이용한 프라이머를 표 7에 기재한다. RNA에 대한 정량 및 풀링 정보를 표 8에 나타낸다.

표 8: RNA 정량 및 풀링 데이터

결과

ED4에 공기 셀 내 10-40ng의 FGF-2의 난내 투여는 대조군에 비해 ED18의 흉근 중량의 최대 26% 증가로 이어졌다. 체중의 백분율로서의 흉근도 유의미하게 증가하였다. ED18의 체중은 ED4에 FGF-2의 난내 투여에 의해 영향을 받지 않았다. 흉근 중량의 형태적 증가는 거의 1.5 내지 2배 상향조절된 글리피칸-1 및 미오게닌과 같은 바이오마커에 의해 확증되었다.

ED18 배아에 대한 평균 체중은 T01-T04에 대해 각각 28.99g, 29.13g, 28.98g 및 28.68g이었다. ED18의 평균 좌측 흉근 중량은 T01-T04에 대해 각각 0.195g, 0.233g, 0.247g 및 0.248g이었다. 모든 FGF-2 처리군(T02-T04)은 T01 대조군에 비해 유의미하게 더 무거운 흉근을 가졌다. 대흉근(좌측 근육 x 2)이 나타낸 체중 백분율은 T01-T04에 대해 각각 1.34, 1.61, 1.70 및 1.73%였다. 흉근은 대조군(T01)에 비해 모든 FGF-2 투여군(T02-T04)에 대해 ED18에 유의미하게 더 높은 체중비를 나타내었다. 미오D 및 글리피칸-1 유전자가 상향 조절되었다.

흉근 조직의 증가 이점에 부가하여, 배아 체중 및 보다 구체적으로 근육 중량의 전반적 증가는 바이러스 백신 제조 비용 감소에 대한 현저한 시사를 가질 것이다. 근육 및 섬유아세포가 서로 합쳐져 있으므로 배아 별로 증가된 근육 수확은 증가된 섬유아세포를 의미할 것이다. 알 별로 더 많은 섬유아세포는 바이러스 백신 생산을 위해 섬유아세포에서 키우는 바이러스를 성장시키기 위해 더 적은 수의 알이 필요함을 의미할 것이다.

본 실시예는 각 전사체의 RNA 수준을 측정하고, GAPDH와 같은 공지된 하우스키핑 유형 유전자에 대해 비교함으로써 흉근 조직 중 미오D, 미오게닌, 신데칸 및 글리피칸-1과 같은 단백질 전사체의 수준을 측정하여 조류에서 증가된 성장을 결정하는 방법을 나타낸다.

본 실시예는 개선된 혈관 공급으로 이어지고 이에 따라 시장 연령의 새(부화 후 5주)에서 근육 괴사를 나타내지 않는, 바이오마커의 측정에 의한 ED18 배아에서 과다형성 근섬유의 측정 방법을 추가로 제공한다.

실시예 4: 표준 상업 성장 조건 하에 웅성 및 자성 Cobb 500 구이용 새에서 33일에 ED0 및 ED4에 난내 투여된 IGF-1 및 FGF-2의 평가

본 연구의 목적은 3 용량 수준에서 ED0 또는 ED4에 IGF-1 및 FGF-2가 난내 투여된 33일령 웅성 및 자성 구이용 새의 건강 성능에 대한 표준 상업 성장 조건의 영향을 평가하기 위한 것이었다. 평가에는 중량 획득, 사료 전환 및 가공 수율이 포함되었다.

구이용 새를 전형적으로, 특히 미국 남부에서 키우는 조건을 가장 잘 모사하는 표준 상업 성장 조건을 이용하였다.

표 9: 연구 설계

처리를 하기 절차를 이용해서 ED0 또는 ED4에 난내 투여하였다:

4. 뚫린 구멍을 글루 건의 고온 접착제로 밀봉하였다.

5. 알을 인큐베이터에 되돌려 넣었다.

상기 연구에서 부화기상 동안, 처리를 원웨이 처리 구조를 갖는 완전 무작위화 설계에 따라 인큐베이터 트레이 및 컬럼에 배정하였다.

부화일(0일)에, 병아리 성별을 감별하고 성별을 전체 플롯 인자로 및 처리를 서브-플롯 인자로 하는 분리-플롯 설계에 따라 성장-발육상에 대한 우리 및 처리에 할당하였다. 전체 플롯 설계는 원-웨이 처리 구조를 갖는 완전 무작위화 설계였다. 가공을 위해 총 10마리 새를 각각의 우리에서 선택하였다. 처리군 및 성별 내에서, 새를 그 자리에서의 절차를 이용하여 해당 군에 배정된 우리에 무작위 배정하였다. 병아리를 1일에 백신접종 후 배치하였다(뉴캐슬 감염성 기관지염 백신을 스프레이 캐비넷을 이용해서 투여하였다). 새 밀도, 온도, 조명, 사료 공급장치 및 물 공간은 모든 처리군에 있어 유사하였다.

모든 새는 단일한 공통 초기(starter), 성장기(grower) 및 말기(finisher) 기본 사료 식이를 수여받았다. 사료를 연구 동안(예정된 가공 시간 전 대략 12시간까지) 자유롭게 제공하였다. 모든 새는 단일한 공통 초기, 성장기 및 말기 기본 사료 식이를 수여받았다. 1일부터 연구 말기까지 우리에서 첨가 및 제거한 사료를 칭량하고 기록하였다. 물을 연구 동안 자유롭게 제공하였다.

7일에 모든 처리에 대한 모든 우리를 조정하였다. 각 우리에 포함된 새의 총 수를 모든 처리 및 모든 우리에서 이용 가능한 가장 많은 수의 건강한 새에 기반하여 결정하였다(가능한 경우, 명백한 도태체 또는 아픈 새는 제거하였다). 제거한 모든 새를 칭량하고, 각 우리에 대한 사망률 시트에 기록하였다.

새를 대략 1, 7, 14, 21, 28일 및 연구 말기(33일)에 우리 별로 칭량하였다. 각 우리에서 남아있는 사료를 칭량하고, 대략 7, 14, 21, 28일 및 연구 말기(33일)에 기록하였다. 1-7, 1-14, 1-21, 1-28 및 1-33일 동안의 사료 섭취를 계산하였다. 사료를 14일에 초기에서 성장기 사료로, 28일에 성장기에서 말기 사료로 변경하였다.

우리 기준 별로 각 칭량일에 평균 새 중량을 요약하였다. 평균 사료 전환을 생존한 새의 전체 중량으로 나눈 우리에 대한 총 사료 소비를 이용해서 각 측정 기간에 대해 계산하였다. 조정된 사료 전환을 살아있는 새의 전체 중량 및 죽거나 해당 우리에서 제거된 새의 중량으로 나눈 우리에서의 총 사료 소비를 이용해서 계산하였다.

33일에, 대략 1,560마리 새(무작위화 계획에 의해 결정된 10마리 무작위 새/우리)를 개별적으로 태그화하고 최후 칭량 후 2일에 걸쳐 가공하였다. 새를 표준 산업 절차에 따라 가공하고, 가슴살 및 다리 하나를 제거하고 칭량하고 기록하였다. 가공된 각 새의 2개 다리살을 수집하였다. 개별 새에서 수집된 가공 데이터에는 생체 중량, 고온 사체 중량, 흉근 중량, 표면 흉근 중량, 텐더(심부 흉근) 중량 및 다리 하나의 중량이 포함되었다.

분석을 위한 일차 변수는 흉근 중량, 평균 1일 획득 및 사료 전환이었다. 33일 체중 및 사체 데이터(고온 사체 중량, 흉근 중량)를 혼합 선형 모델을 이용해서 통계적으로 분석하였다. 모델은 성별, 처리, 및 처리 상호작용 별 성별에 대한 고정 효과를 포함하였다. 무작위 효과에는 성별 내 블록, 성별 내 처리 상호작용 별 블록(우리 용어) 및 오차가 포함되었다. 사료 섭취(1-33일), 사료 전환(1-33일) 및 평균 1일 획득(1-33일)을 혼합 선형 모델을 이용해서 분석하였다. 모델은 성별, 처리, 및 처리 상호작용 별 성별에 대한 고정 효과를 포함하였다. 무작위 효과에는 성별 내 블록, 및 오차가 포함되었다. 최소 제곱 평균을 처리 수단의 산정치로 이용하였다. 최소 제곱 평균의 표준 오차를 산정하고 90% 신뢰도 구간을 구축하였다. 처리 차이를 10% 유의성 수준에서 평가하였다(P < 0.10).

처리군 별 6 우리가 흉근 중량에서 4% 개선을 나타내는 적어도 88% 파워; 사료 전환에서 4% 개선을 나타내는 적어도 90% 파워; 0.10 유의성 수준에서 미처리군에 비해 처리군에 대해 평균 1일 획득의 4% 개선을 위해 적어도 90% 파워를 제공할 것으로 예상되었다.

결과

새 건강-사망률은 상업적 구이용 새의 생산에 대한 예상 범위 내에 있었다. 비일반적 효과는 관찰되지 않았다.

심부 흉근 중량의 분석을 표 10에 나타낸다. 전체 흉근 중량(표면 흉근 + 심부 흉근)의 분석을 표 11에 나타낸다. 다리 하나의 중량 분석을 표 12에 나타낸다.

표 10: 심부 흉근 중량(kg)의 분석

*통계적으로 유의미함

주: P < 0.10

표 11: 전체 흉근 중량(kg)의 분석

*통계적으로 유의미함

주: P < 0.10

표 12: 다리 하나의 중량(kg) 분석

*통계적으로 유의미함

주: P < 0.10

자성 새에서, ED0에 10ng의 FGF-2 투여는 전체 흉근(4.5%) 및 심부 흉근(5.9%)에서 유의미한 증가를 일으켰다. 심부 흉근에서의 유의미한 증가는 ED0에 40ng의 FGF-2(5.1%), ED0에 200ng의 IGF-1(5.9%) 및 ED4에 100ng의 IGF-1(6.5%)의 투여 후 자성 새에서도 관찰되었다.

웅성 새에서, ED0에 50ng으로 투여된 IGF-1은 전체 흉근 중량, 심부 근육 중량 및 다리 하나의 중량에서 유의미한 증가를 일으켰다(각각 6.8% 증가). ED4에 10ng의 FGF-2 투여 후에도 웅성 새에서 심부 흉근(5.8%) 및 다리 하나(4.9%)의 유의미한 증가가 관찰되었다. ED0에 웅성 새에 대한 100ng의 IGF-1 투여는 심부 흉근(6.2%) 및 다리 하나 중량(5.6%)에서 유의미한 증가를 일으켰다. 웅성에서 다리 하나의 중량의 유의미한 증가가 또한 ED0에 10ng의 FGF-2(4.4%), ED0에 40ng의 FGF-2(4.6%), ED4에 20ng의 FGF-2(6.5%), ED0에 100ng의 IGF-1(5.6%) 및 ED4에 100ng의 IGF-1(4.2%)의 투여 후 관찰되었다.

결론적으로 조합된 성별에 대한 전반적 체중은 대조군에 비해 수치적으로 긍정적인 백분율 변화를 가졌다. ED0에 10ng의 FGF-2 및 50ng의 IGF-1의 투여는 대조군에 비해 근육 질량에서 가장 큰 증가를 일으켰다.

추가적으로, 흉근 증가와 동시에 일어나는 다리 근육의 증가는 보행 문제가 없는 더 튼튼하고 더 건강한 새로 이어진다. 이는 또한 더 덩치가 큰 새가 사료를 수득하기 위해 사료 공급장치 주위에 모일 수 있도록 하여 질환 및 기아를 방지한다. 상기 방식으로, 더 큰 새가 유의미한 건강 이익을 갖는다.

근육 증가에 관한 추가 장점은 새가 5주보다 빨리 표적 산업 근육 중량에 도달할 것이라는, 예를 들어 4주째에 표적 산업 근육 중량에 도달하여, 노동 수용, 사료 및 물에 있어서 큰 감소를 일으킨다는 것이다.

실시예 5: 성장-발육에서 웅성 및 자성 Cobb 500 구이용 새에서 ED18에 난내 투여된 IGF -1 또는 FGF -2의 평가.

표 13: 연구 설계

표 13에 따른 처리를 하기 절차를 이용해서 ED18에 난내 투여하게 된다:

1. 각 알에 주사하기 위해 ED18에 적절한 구조, 바람직하게는 양막의 위치를 확인한다.

2. 표시된 영역 중심에 구멍을 뚫는다.

3. 부피가 변할 수는 있지만, 약 100㎕의 배정된 처리를 뚫린 구멍 내로 적가하여 투여한다.

4. 뚫린 구멍을 글루 건의 고온 접착제로 밀봉한다.

5. 알을 인큐베이터로 되돌려 놓는다.

난내 주입은 수동으로 또는 알각을 뚫고 처리 성분을 알의 내부에 전달할 수 있는 장치를 이용해서 수행할 수 있다.

이용한 짚을 베딩으로 하여 콘크리트 층 우리에서 환경적으로 제어되는 시설 내에 새를 수용한다. 새는 부화장에서 Mareks 백신접종을 받지 않는다. 병아리 수령 시 뉴캐슬 감염성 기관지염(NCB) 백신을 스프레이 캐비넷을 이용해서 투여한다. 다른 백신접종 또는 처리(표 13에 나타낸 것을 제외하고)는 연구 동안 ㅌ투투여하지 않는다.

물 및 사료를 연구 동안 자유롭게 제공한다. 병아리 사료 공급장치 트레이를 대략 최초 4일 동안 각각의 우리에 배치한다. 모든 새는 단일한 공통 초기, 성장기 및 말기 기본 사료 식이를 수여받는다. 이들은 수령 시(0일) 단일한 공통 초기 기본 사료 식이 상에 배치된다. 모든 식이 변경은 모든 우리에 대해 동시에 수행된다. 0일부터 연구 말기까지 우리에 첨가되고 제거된 사료를 칭량하고 기록한다. 평가 시설, 우리 및 새를 일반적 무리 상태, 조명, 물, 사료, 통기 및 예상치 못한 사건에 대해 적어도 1일 2회 관찰한다. 임의의 1일 2회 관찰 시 비정상적 상태 또는 비정상적 거동이 주지되는 경우, 이들을 기록한다.

각각의 우리에 남아 있는 새 및 사료를 칭량하고, 7일부터 시작해서 주마다 우리 별로 기록한다. 우리 내로 칭량된 사료의 양에서 새를 칭량 시 사료 공급장치에 남아 있는 사료의 양을 빼서 각각의 체중 측정 기간에 각각의 우리에 대한 사료 섭취를 결정한다. 우리 별로 각각의 칭량일에 평균 새 중량을 요약한다. 평균 사료 전환을 살아있는 새의 전체 중량으로 나눈 우리에 대한 총 사료 소비를 이용해서 각각의 측정 기간 동안 계산한다. 살아있는 새의 전체 중량 및 해당 우리에서 죽거나 제거된 새의 중량으로 나눈 우리 내 총 사료 소비를 이용해서 조정된 사료 전환을 계산한다.

부화기의 선택된 트레이 및 스택에 무작위화 계획에 따른 처리로 할당한다. 처리를 원웨이 처리 구조를 갖는 완전 무작위화 설계에 따라 부화기 트레이 및 스택으로 배정한다. 각각의 처리를 처리 별로 총 1300개 알에 대해, 각각 130개 알을 포함하는 10개 트레이에 배정한다. 연구의 상기 상에서 처리을 위한 실험 단위는 스택 조합 별 트레이이다.

성장-발육상 동안, 병아리를 무작위화 계획에 따라 처리 및 우리에 할당한다. 부화일(0일)에, 병아리의 성별을 감별하고 성별을 전체 플롯 인자로, 및 처리를 서브 플롯 인자로 하는 분리-플롯 설계에 따라 우리 및 처리에 할당한다. 부검일 내에 성별 및 처리에 대한 균형을 보존하기 위해 부검일에 블록을 무작위 배정한다.

분석을 위한 일차 변수는 흉근 중량, 평균 1일 획득 및 사료 전환이다. 사체 데이터(말기 생체 중량, 고온 사체 중량, 사체 성분, 및 성분 대 고온 사체 중량의 비)를 혼합 선형 모델을 이용해서 분석한다. 모델은 성별, 처리, 부검일 및 이들 효과 간 모든 상호작용에 대한 고정 효과를 포함한다. 무작위 효과에는 블록, 성별 상호작용 별 블록, 처리 상호작용 별 블록, 처리 상호작용(우리 용어) 별 성별 별 블록, 및 잔여가 포함된다.

체중은 반복 측정치에 대해 혼합 선형 모델을 이용해서 분석한다. 모델에는 성별, 처리 및 연구일 그리고 이들 효과 간 모든 상호작용에 대한 고정 효과가 포함된다. 무작위 효과에는 블록, 성별 상호작용 별 블록, 처리 상호작용 별 블록, 처리 상호작용 별 성별 별 블록 및 잔여가 포함된다. 연구 기간 및 주간 기간에 대한 평균 1일 획득을 체중에 대한 통계 모델을 이용하여 각각의 처리군에 대해 산정한다.

사료 섭취(0-35일), 사료 전환(0-35일)을 혼합 선형 모델을 이용해서 분석한다. 모델은 성별, 처리, 및 처리 상호작용 별 성별에 대한 고정 효과를 포함한다. 무작위 효과에는 블록, 성별 상호작용 별 블록, 처리 상호작용 별 블록, 처리 상호작용 별 성별 별 블록 및 잔여가 포함된다.

최소 제곱 평균을 상기 모델에 대한 처리 수단의 산정치로 이용한다. 최소 제곱 평균의 표준 오차를 산정하고, 90% 신뢰도 구간을 구축한다. 적어도 하나의 처리 관련 효과가 유의미한 한, 선험적 대조를 이용해서 처리 차이를 평가한다. 관심 비교에는 T01 vs 모든 다른 처리가 포함될 것이다(반복된 측정 모델에 대한 시점 내 및 성별 내에서, 유의미한 성별 관련 처리 효과가 존재하는 경우). 처리 차이는 10% 유의성 수준에서 평가될 것이다(P < 0.10).

새를 안락사시키고, 칭량하고 기록한다. 가슴살 및 다리 하나를 제거하고, 칭량하고 기록한다. 생체 중량, 고온 사체 중량, 고온의 뼈와 피부를 제거한 흉근; 표면 흉근 및 텐더(심부 흉근) 및 고온 다리 하나의 중량을 포함하는 가공 데이터를 개별 새에서 수집한다.

실시예 6 : ED18의 배아 흉근 중량에 대한 난내 투여된 닭 섬유아세포 성장 인자의 효과.

본 연구는 hFGF-2 대비 E18 흉근 중량에 대한 닭 섬유아세포 성장 인자(cFGF: 서열 목록 번호 3)의 효과를 연구하기 위해 설계되었다. 본 연구는 대조군 대비 ED0에 난내 투여된 고 및 저 용량의 cFGF 및 인간 FGF(hFGF2)를 비교한다. 투여 방법은 ED0에 공기 셀 상의 직접 난내 투여이다.

운반체 대조군은 20mM 시트레이트 완충액 pH 6 + 수크로오스 + EDTA + 메티오닌 + Tween-80을 포함한다. 이 연구에서 Cobb 및 Ross 품종 알을 모두 이용하였다.

연구 설정

ED18에, 각각의 대조군 및 처리군으로부터의 모든 생활성 알을 안락사시키고 대흉근을 추출하고 칭량하였다. 근육 유전자 바이오마커에 대한 조직학 및 RNA 추출을 위해 근육을 수집하였다.

데이터를 하기와 같이 분석하였다: 흉근 중량을 혼합 선형 모델을 이용해서 분석하였다. 모델은 처리에 대한 고정 효과 및 잔여 오차에 대한 무작위 효과를 포함하였다. 최소 제곱 평균을 처리 수단의 산정치로 이용하였다. 최소 제곱 평균의 표준 오차를 산정하고, 90% 신뢰도 구간을 구축하였다. 처리 효과가 유의미한 한, 선험적 대조를 이용해서 Fisher의 보호 LSD를 이용한 처리 차이를 평가하였다. 처리 차이를 10% 유의성 수준에서 평가하였다(P < 0.10).

결과:

요약:

본 연구는 Cobb 및 Ross 계통의 새가 모두 닭 FGF를 이용해서 배아일 18에 유의미한 흉근 증가를 나타내었음을 보였다. 용량 관련 효과가 주지되었다.

실시예 7 : 35일 구이용 새 흉근 중량에 대한 난내 제공된 닭 FGF -2의 효과

본 연구는 성숙한 시장 연령의 새(품종 Cobb 500)의 흉근 중량에 대한 닭 섬유아세포 성장 인자(cFGF: 서열 목록 번호 3)의 효과를 연구하기 위해 설계되었다. 본 연구는 알 공기 셀에서 ED0에 난내 투여된 고 및 저 용량을 비교한다.

연구 설계

수집된 데이터

·시설 및 새의 매일 관찰, 매일 시설 온도.

·0, 7, 14, 21, 28 및 35일의 개별 새 중량.

·가공일: 체중 및 가슴살 wt.

·사망률: 성별, 중량 및 가능한 사망 원인.

·제거된 새: 도태 이유, 성별 및 중량.

모든 제거 및 사망률을 칭량하고, 사망 원인에 대해 부검하고 성별을 결정하였다.

데이터 분석:

분석을 위한 일차 변수는 흉근 중량 및 평균 1일 획득이었다. 분석을 위한 이차 변수에는 사체 중량, 사체 중량 대 생체 중량의 비 및 흉근 중량 대 사체 중량의 비가 포함되었다.

체중을 반복 측정치에 대한 선형 혼합 모델을 이용해서 분석하였다. 모델에는 처리, 연구일 및 연구 상호작용일 별 처리에 대한 고정 효과가 포함되었다. 무작위 효과에는 처리 내 동물 및 잔여 오차가 포함되었다.

연구 기간(0-14, 28-34, 및 0-34) 동안 체중 및 평균 1일 획득에 대한 처리 최소 제곱 평균을 체중에 대한 반복 측정 모델로부터 산정하였다. 최소 제곱 평균의 표준 오차를 산정하고 90% 신뢰도 구간을 구축하였다.

35일 체중 및 사체 데이터(흉근 중량, 사체 중량, 흉근 중량 대 사체 중량의 비, 사체 중량 대 생체 중량의 비)를 혼합 선형 모델을 이용해서 분석하였다. 모델은 성별, 처리 및 처리 상호작용 별 성별에 대한 고정 효과 및 잔여 오차에 대한 무작위 효과를 포함한다. 최소 제곱 평균을 처리 수단의 산정치로 이용하였다. 최소 제곱 평균의 표준 오차를 산정하고, 90% 신뢰도 구간을 구축하였다.

적어도 하나의 처리 관련 효과가 유의미한 한, 선험적 대조를 이용해서 Fisher의 보호 LSD를 이용한 처리 차이를 평가한다. 처리 차이를 10% 유의성 수준에서 평가하였다(P < 0.10).

결과:

*통계적으로 유의미함

주: P < 0.10

요약

흉근 중량:

웅성에서는 대조군 대비 흉근 수율이 9% 증가하였고, 자성에서는 이 증가가 4.6%였다. 본 연구는 Cobb 계통의 새에서 본 발명자들의 이전 연구 결과를 확인시켜준다.

유전자 발현 데이터

35일 연령의 Cobb 성장 발육에 대한 유전자 발현은 Ross 새로부터 근육 성장 패턴의 관점에서 차이를 나타낸다. Cobb 새는 미오D 발현으로 나타난 바와 같이 더 적은 근육 세포 증식을 갖는다. 웅성에서, 분화는 고수준의 미오게닌(MGN)으로 나타난 바와 같이 높다. 미오게닌은 분화의 마커이다. 이는 자성에서 덜하다. 확실히, 처리군에서의 근육 중량 증가는 미오게닌에 대한 이들 데이터에 의해 뒷받침된다. MRF4는 MRF4가 전통적으로 섬유 형성만을 위해 발현되는 것으로 고려되지만 최근 증거는 증식에서의 역할을 시사하므로 흥미롭다. 웅성에서, 조합된 데이터는 FGF 처리가 35d의 결정을 증가시키지만 섬유 형성은 영향받지 않음을 제시하였다. 그러나 자성에서, 처리군의 MRF4 증가는 일부 성숙 섬유 발생을 제시할 수 있다.

근육 조직학

이들 화합물을 이용한 처리 결과는 가슴 형태 구조를 개선한다. 개별 섬유가 증가된 근주막 및 근내막 공간과 함께 뚜렷해진다. 근내막 및 근주막 공간은 대조군에서 관찰되는 것처럼 섬유 변성의 예방에 필수적이다. 모세관 그물은 이들 연결 조직층 내에 위치하며, 하나의 기능은 근섬유 손상으로부터 락트산 축적을 제거하는 것이다. 또한 이들 공간은 조직 수화에 관여된 연결 조직 분자를 함유한다. 특히 처리로 관찰된 변화는 고기 품질을 증강시킬 유의미한 개선이다. 또한 35일에 근육 중량 수율 증가가 유의미하며, 웅성에서는 거의 9%였다.

SEQUENCE LISTING <110> Zoetis Services LLC <120> In Ovo Administration of Growth Factors for Improving Poultry Performance <130> PC71935A <140> PCT/US2014/017113 <141> 2014-02-19 <150> US 61/767,961 <151> 2013-02-22 <160> 12 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 154 <212> PRT <213> human <400> 1 Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr 20 25 30 Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val 35 40 45 Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln 50 55 60 Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg 65 70 75 80 Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val 85 90 95 Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn 100 105 110 Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg 115 120 125 Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala 130 135 140 Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 <210> 2 <211> 70 <212> PRT <213> Human <400> 2 Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe 1 5 10 15 Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 20 25 30 Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys 35 40 45 Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu 50 55 60 Lys Pro Ala Lys Ser Ala 65 70 <210> 3 <211> 157 <212> PRT <213> gallus gallus <400> 3 Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Asp 1 5 10 15 Asp Gly Gly Gly Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys 20 25 30 Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile Asn Pro Asp 35 40 45 Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu 50 55 60 Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Ser 65 70 75 80 Ala Asn Arg Phe Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Leu 85 90 95 Lys Cys Ala Thr Glu Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn 100 105 110 Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Ser Asp Trp Tyr Val Ala 115 120 125 Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Pro Gly Pro Lys Thr Gly Pro Gly 130 135 140 Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 4 <211> 70 <212> PRT <213> gallus gallus <400> 4 Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe 1 5 10 15 Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 20 25 30 Ser Ser Ser Arg Arg Leu His His Lys Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys 35 40 45 Phe Gln Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Ile 50 55 60 Lys Pro Pro Lys Ser Ala 65 70 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> TURKEY MYOD FORWARD PRIMER <400> 5 gatggcatga tggagtacag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> TURKEY MYOD REVERSE PRIMER <400> 6 agcttcagct ggaggcagta 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> TURKEY MYOGENIN FORWARD PRIMER <400> 7 cctttcccac tcctctccaa a 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> TURKEY MYOGENIN REVERSE PRIMER <400> 8 gaccttggtc gaagagcaac t 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> GLYPICAN1 FORWARD PRIMER <400> 9 acatcgggaa tgatgtggat 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> GLYPICAN 1 REVERSE PRIMER <400> 10 aagaggagga aggcagaagg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> SYNDECAN 4 FORWARD PRIMER <400> 11 ccaacagcag catctttgaa 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> SYNDECAN 4 REVERSE PRIMER <400> 12 gatgggtttc ttcccaaggt 20

Claims

조류에서 근육 질량을 증가시키는 방법에 있어서, 섬유아세포 성장 인자-2 및 인슐린 유사 성장 인자-1, 및 이들의 변이체로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질; 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물의 난내 투여 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단백질이 섬유아세포 성장 인자-2인 방법.
제1항에 있어서, 상기 단백질이 인슐린 유사 성장 인자-1인 방법.
제1항에 있어서, 상기 단백질이 서열 목록 번호 1 내지 4, 또는 이들의 변이체로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제2항에 있어서, 난내 투여된 섬유아세포 성장 인자-2의 용량이 최대 약 50ng/알(egg)인 방법.
제2항에 있어서, 난내 투여된 인슐린 유사 성장 인자-1의 용량이 최대 약 200ng/알인 방법.
제1항에 있어서, 상기 투여가 배아일 0 내지 18 근처에 일어나는 방법.
제5항에 있어서, 상기 투여가 배아일 0 내지 4 근처에 일어나는 방법.
제6항에 있어서, 상기 투여가 배아일 0 근처에 일어나는 방법.
제6항에 있어서, 상기 투여가 배아일 1(ED1) 근처에 일어나는 방법.
제6항에 있어서, 상기 투여가 배아일 2(ED2) 근처에 일어나는 방법.
제6항에 있어서, 상기 투여가 배아일 3(ED3) 근처에 일어나는 방법.
제6항에 있어서, 상기 투여가 배아일 4 근처에 일어나는 방법.
제1항에 있어서, 상기 투여가 인큐베이션의 최종 사분기에 일어나는 방법.
제5항에 있어서, 상기 투여가 배아일 18(ED18) 근처에 일어나는 방법.
제1항에 있어서, 상기 조류가 닭; 칠면조; 뿔닭; 꿩; 메추라기; 공작; 오리; 거위; 피존(pigeon); 도브(dove), 및 평흉류로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제16항에 있어서, 조류가 닭을 포함하는 방법.