JPH07504320A

JPH07504320A - インオボ（ｉｎ　ｏｖｏ）で筋肉内にＤＮＡを導入することによる鳥類への遺伝子伝達

Info

Publication number: JPH07504320A
Application number: JP5513422A
Authority: JP
Inventors: ペティット，ジェームズ・エヌ; リックス・キャサリン・エイ; ウィリアムズ，クリストファー; フェルプス，パトリシア・ブイ
Original assignee: ノース・カロライナ・ステート・ユニバーシティ; エンブレックス・インコーポレーテッド
Priority date: 1992-01-27
Filing date: 1993-01-26
Publication date: 1995-05-18
Also published as: AU678147B2; CA2117429A1; BR9305795A; IL104536A0; IL126685A0; MX9300447A; MX9300448A; WO1993014629A1; AU3596993A; US6395961B1; US5784992A; EP0625007A1; EP0625007A4; IL104536A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】鳥類への遺伝子伝達艮直ｉ蚕出願本出願は、米国特許出願第０７／８２６．０３０号（１９９２年１月２７日出願）の−１庸駈願てあり、この内容は参照として完全にここに取り入れる。

登りの分野本発明は、鳥類の筋肉内に外来ＤＮＡを導入することによって鳥類の表現型を変更する方法に関する。

発明Ｑ背旦商品として流通する飼鳥類は、極めて重要な食料源である。しかしながら、遺伝子工学打継ｉにより鳥類の表現型を有効に変化させる方法については、比軛灼注意が払われていない、このことは、前記同気（・初（古典的な改良技術よりも鳥類に望ましい表現型特性を導入するためのより迅速なす気付を提供するため、残念なことである。

−Ｍ的に、最も広く団究されている眞６類への遺伝子トランスフェクシジンの方法は、レトロウィルスベクターを用いている。典型的なものに、５ｏｕｚａら、Ｊ、Ｅｘ　ｔ−１，Ｚｏｏｌ、、２３２，４６５−４７３　＜１９８４＞があり、前記文献では、成長ホルモンをコードするレトロウィルスベクターを日齢９日の胚の卵黄嚢の導管化した部分に注射している。さらに、ＳｈｕｍａｎおよびＳｈ。

ｆｆｅｒ、ＰｏｕＩｔ、Ｓｃｉ、、６５．１４３７−１４４４（１９８６）；Ｓａ　Ｉ　ｔ　ｅ　ｒら、Ｐｏｕｌｔｒ　Ｓｃｉ、、６旦、１４４５−１．４６８　（１９８６）ＨＳａｌｔｅｒら、ｙ±ｒｏ工二産Ｌ−土旦ヱ、２３６−２４０　（１９８７）；Ｂｏｓｓｅ　Ｉｍａｎｎら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４旦、５３３ −５３５　＜１．９８９〉；ならびにＢｏｓｓｃｌｍａｎら、米国特許第５．１６２．２１５号を参照されたい。

Ｎａｂｅｌら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４９．１２８５−１２８８＜１９９０）およびＷｏ　Ｉ　ｆ　ｆら、５ｃ１ｅｎｃｅ、２４７．１４４５−１４６８（１９９０）は、２−５か月の−Ｔｈ生の発現がＤＮＡの直接微量注射により獲得されるかもしれないと述Ｊくているが、ｎ浦己翅１ｊをいかに飼鳥類の遺伝子工学応用しうるかについては示唆していない、Ｎａｂｅ　Ｉらは、ブタの動脈体節内に注射したβ−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡの発現は（改醍注射の部位によって制限されると述べている。Ａｃ５ａｄｉら、Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌｏｙｊｓｔ、旦、７１．−８１（１，９９１）は、心筋細胞がａＱｔしたター伝子を一晦勺に発現さぜることができたと述べている。

Ｓｊｍｋｉｓｓら、Ｐｒｏｔｏｐ　ｌ　ａｓｍａ、±５１．１６４−１．６６　（１，９８９）は、内国性１ノトロウイルス西Ｊりを含む第１７段階の胚の始原生殖細胞が、心臓育串１によりｌ／トロウィルスマーカーを欠損した比較可能な宿主である第１６段階の胚に伝達可１ｍて”あると述べている。インキュベーション１７日目で、宿主鳥類のドッｌ〜プロットは、供与体ＤＮＡが生殖腺に存在すること、ならびに微量のドナーＤＮＡが肝臓および毛ＮＵ職に存在することを示した、？遭寸したＤＮＡ分子の発現については報告されていない。

ＰＣＴ特許出、ａＵＳ９０１０１５１５は核酸配列をを維褒ｍ癲朋ｎ内部に伝達する方法について述べている。飢ｑ類内へのＤＮＡ分子の注射については報告され変化させる方法を提（”＝１−ることにある。

本発明の他の目的は、外因性ＤＮＡ１ｌυＩＩの発現が表現型の十分な変化を引き起こすことを含む２，１類の表現型を変化させる方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、鳥類の表現型を変化させる迅速かつ便利な方法を提供することにある。

発明の概栗本発明の第一の態様は、烏の表現型を変更する方法である。この方法は、ふ死後の烏の表現型の変化（例えば、成長速度、飼料効率、病気耐性、又はこれらの要素のすべての組み合わせの変化）の原因となるに有効なりＮＡ分子を用いて、へＤＮＡ分子を導入することからなる。ＤＮＡの導入は、胚本体を含む卵の任意の区分内にインオボでＤＮＡ分子を注射することを含む、任意の適当な手段によって実行されてよい。

望ましくは、ＤＮＡを導入された卵はふ化までインキュベーションされ、生まれた烏を少なくとも表現型に咳預メθυ見する適齢まで育てた。

望ましくＬｔｆｔｃｉ圃休へた連中体直接微量注射することによって、導入される。

本発明の第三の態様は、ＤＮＡ分子をインオボでインキュベーション中の卵に含まれる烏の筋肉組織内に導入することからなり、その中でＤＮＡ分子はふ死後の鳥の表現型を変化させる原因となるに有効である、烏の表現型を変更させるための方法である。

本発明の第四の態様は、ＤＮＡ分子をインオボでインキュベージジン中の卵内にある烏の筋肉組織内へ導入することからなり、その中でＤＮＡ分子は烏の免疫応答を誘導するのに有効である、烏の免疫化方法である。

本発明の第五の態様は、抗原をコードするＤＮＡ分子をインオボでインキュベーション中の卵に含まれる鳥の筋肉組織内に、母性抗体を中和するに十分な量、導入することからなる烏の処理方法である。望ましｂＩＭｆ５３＆では、ＤＮＡ分子めにＤＮＡ分子を使用することである。

本発明の第七の態様は、任意の前述の方法を実行するため、インオボでインキュベーション中の卵内にＤＮＡ分子を導入するための装置である。

図面の簡単な説明図はインオボで鳥類の筋肉内に物質を導入するための特定の方法および装置を示す。

Ｒ反ビ禮封町Ｚ閲男トリの肝の発達状況には、体細胞への遺伝子伝達の魅力ある凛的となるいくつめ４訳力ｆある。第一に、財４島乃最大のＪｔｌｌＲよ母親の生Ｍυψ攻ト側である卵の中で起こるため、ＩＩＺ４よ外因性、ＤＮＡを導入するために容易に接近することができる。

第二に、卵が多区画単位であるという事実は、生体物質を特定の胚部位に伝達するため４．ＪＩＪ用することかできる９例えば、早期胚の卵黄嚢は、造血機能をもつ。

ふ化直前に、卵黄嚢は一次栄養として働き、腸管内に取り込まれ、さらにふ化の間および後に盲腸の嚢状部に輸送される。故に、卵黄嚢へ飼料を投与すると、胚の盲腸又は血管系の両方に伝達することができる。ＤＮＡを卵黄嚢内へ投与することによるＤＮＡの血管系への伝達は、成長ホルモン、インターフェロンおよびインターロイキン−２のようなリンホカイン、インスリン様増殖因子、ある四よ甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＩ−１）といったような烏の生理活性ペプチドを発現する能力を持つＤＮＡ１ｙＳ造の投与にとってとくに望ましい、さらに、ペプチドあるいはＤＮＡ横築物の投与は、しよう尿膜上又は空気室膜上に分子を注射することによｒ）Ｉｌ”８勺に実行することができる。最後に、胚の筋肉区分への接近は、インキュベーションの最終四半期、さらにニワトリでは、より望ましくは、インキュベージジン１７−１９日に直接胚に注射を行うことにより達成すること分に誘発されさえすれば、たとえ形質転換された胚及びニワトリがキメラであっても、有害性はまったく問題にならない。

本発明の前述および他の態様は、以下のより多くの詳細で説明される。

八−去戊型Ω庶兜木発すＩ４ｔ、インオボで烏にＤＮＡ分子を導入することによりふ化ｔｔｆ＃１ ′）−２４型を変更させる多くの方法を提供する０本明細書で用いられる、烏の °゛表現型”の変更とは、烏の組織内で外来ＤＮＡが発現することによって、烏の細胞生化学上、慎ヲｊ鮮耐莞することを包括し、そり咳瀝υ用姦渠として一つ又はより多くのトリの身体介Ａ耐攻を変化させる、ことを意味する。このようにこの定義下では、表現型の変更は、サイズ、外観、内分泌物応答成長速度、特定抗原に対する免疫応答、代謝速度、飼料消費および効率、性ｑ４δ８ヒで有り得る。択一的に述べるならば、本発明はペプチドをコードし発現するＤＮＡ分子を工乞オボで鳥に投与することによりふ死後のトリに生理応答（例えば、免疫応答、又はホルモンもしくが、（ふ化の後まで持続するような生理応答をふ化前４：３発させるといったように）ふ死後二次的に誘発されてもよいことに注意されたい。

とくに興味ある表現型の変更は−ＤＮＡ分子の導入が烏を免疫化することを含む免疫応答の変化である。模範的な導入ＤＮＡ分子は、宿主の鳥から免疫応答を誘発する防御抗原タンパク質をコードするＤＮＡ分子である。これは、烏を特異的病原体から防御するためのワクチン接種と組み合わせて、又は、より望ましくは、ワクチン接種の代わりになされうる。

新生児に提供されるこれらの抗体は、特異的抗原と複合し、従って、新生児の免疫能発達前にそれらの抗原に対して自然の防御を提供する。不幸なことに、母性抗体はイ匂優θなワクチン接種処方をも媚ヂうる：母性抗体はワクチンの免疫成分に結合し、従って新生児期の抗体生産を阻害する。母性抗体の存在４ｍ４巳” 、Ｑｌｋ７）発達における早期のワクチン接種を妨げる０代表的には、もはやワクチンを妨げ略を提供する０本発明の一つの態様は、抗原をコードするＤＮＡ分子をインオボむワクチンを干渉しない；このように、その様なワクチンはトリを免疫化するなめに使用されうる。ＤＮＡ分子は、発現した時に、抗原が母性抗体を中和するだけでなく、特定の病原体に備えてトリにワクチン接種する免疫原を提供するために、有効な策を導入することができる。

導入されるＤＮＡ分子は、烏に存在する母性抗体を中和するであろう抗原をコートする任意の分子であることができる。興味ある模範的抗原には、ガンプロ病ウィルス、ニューカッスル病ウィルス（ＮＤＶ）　、感染性バーサル病ウィルス（ＩＢＤＶ）、ラウス肉腫ウィルス、大腸１ｆｉｉ（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）、およびコクシヂア（Ｃｏｃｃ　ｉ　ｄ　ｉａ）によって生産される抗原が含まれる。

ＤＮＡ分子は以下の０項に述べる任意の方法によって導入され、また以下に述べる任意のＤＮＡ横築物の配置力）らなる。

ＤＮＡ分子４ｉＪｌ勤挽疫能を発達させる時ある四詔姿、）勺にはインキュベージフンの最終四半期、に抗原を発現させるように導入されるのが望ましい、免疫能を持つと、ＤＮＡ構築物にコードされる表面抗原はＢ細胞およびＴ細胞の両方の応答を刺激することができ、結果としてふ化後野外で出くわす病原体による挑戦を受ける前に免疫化することができる。インキュベージジンの最終四半期のタイミングおよび期間は、トリの種閥駆）、インキュベージジン期間の違いによって異なる０例えば、ニワトリでは、インキュベーションの最終四半賜よ、ふ化前約１６日からであり二七面鳥では、最終四半ｊＩＩ）ＬＪ−化前約１９日からである。

旦ユ投函Ω対象りよび時期本発明はニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、うずら、およびこうらいきじを含む、がこれらに限定されるものではない、任意のトリを対象として実行されてよい、ＤＮＡはインオボでインキュベーション中の任意の時期に導入されてよ＜、ｗＡｔｔ川ｍに用り異なる０例えば、ＤＮＡはニワトリの卵内に、インキュベージジン初期（例えば、インキュベージジンのおおよそ２−３日の間）に、又はインキュベーションの末期（例えば、インキュベーションの最終四半期、すなわちインキュベーションのおおよそ１６−２１日の間）に、導入されてもよい。

ＤＮＡ分子は、空気室、卵白、しよう尿膜、卵黄嚢、卵黄、尿膜、羊膜、を含む卵の任意の部位、又は胚状態の烏に直接に導入してよい０本発明の望ましい実層多沫では、ＤＮＡ分子は胚期のトリの筋肉組織内に導入され、より望ましい実施態様では、ＤＮＡ分子は骨格筋肉組織内に導入される。筋肉細胞内にとどまるタンパク質をコードするＤＮＡ分子の導入は、外来タンパク質を直接（Ｎ）／７つ特異的に筋肉細胞に投与するために用いることができる。別殿方法として、筋肉細胞から分泌されるであろうタンパク質をコードするＤＮＡ分子を導入することができる；この方法は筋肉組織と血しようの間の接触を通じてトリのからだ全体にタンパク質を伝達するために使用することができる０例として、骨格筋組織導入部位は、卵殻の近くに位置し、そのため他の肝組織を傷つけることなく比較的容易に注射装置ｆｉ’Ｆ漣する、胸筋肉およびふ化筋肉組織である。

Ω−見ＮΔ撓箔迦イン！ＬｒΦ落人されるＤＮＡ分子は、一般的には、トリの細胞内で機能するプロモーター、およびプロモーターに機ｆｆ１Ｕに結合したペプチドある四まタンパク質をコードする遺伝子、からなる構築物である。望ましくは、タンパク質あるいはペプチドは生理活性があり、トリの表現型の変化を生ずることができる。

＝般的には、ＤＮＡ横ｍは直線ＤＮＡ分子であってもよく、ベクター、または、リボゾーム、リン酸カルシウムもしくはＤＭＳＯと言ったような他の適切なキャリヤーによって運ばれる分子であっても良い、ベクターは、以下に論するように。

プラスミド、ウィルス（レトロウィルスを含む）およびファージであってよく、それらは自然体又はその誘導体のどちらかである。ＤＮＡ分子は、望ましくは。

宿主のトリの染色体ＤＮＡ内に感染ＤＮＡを組込むに十分なレトロウィルスのＤＮＡ部分を含むべぎでない。

タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子の実例は、成長ホルモン、甲状腺遊離ホルモン（ＴＲＨ）　、表皮成長因子、ならびにマレック病ウィルス、感染性気管支炎ウィルス、マイコブラスマ、トリ白血病ウィルス、レオウィルス、ボックス病ウィルス、アデノウィルス、クリブトスボリディア、ニワトリ貧血因子、バステウレラ（エルニシア）種、トリのインフルエンザウィルス、マレックスＭＤＸ、ガンプロ病ウィルス、ニューカッスル病ウィルス（ＮＤＶ）−感染性バーサル病ウィルス（ＩＢＤＶ）、ラウス肉腫ウィルス、大腸菌、およびエイメリアテネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔ、ｅｎｅｌｌａ）のようなエイメリア種によって生産されるような免疫原組換え抗原からなる群より選択されたタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子である。

遁ｆ云子工学によるクローン化遺伝子、組換えＤＮＡ、ベクター、形質転換された宿主細胞、タンパク質およびタンパク質フラグメントの生産は良く知られている１例えば、Ｂｅ１ｌら、米国特許第４．７６１．３７１号、第６欄第３行かも第９欄第６５行ＨＣ１ａｒｋら、米国特許第４．８７”７，７２９号、第４欄第３８行かち第７欄第６行；５ｃｈｌ　ｌ　ｉｎｇ、米国特許第４．９１２，０３８号。

第３欄第２６行から第１４欄第１２行を参照されたい（出願人は特にここに引用したこれらおよび他の１ｉＷ号Ｉ例のすべての開示を参照としてここに取り入れるつもりである）、制限エンドヌクレアーゼ消化、ベクターの調製、ＤＮＡの精製、および他のその様な手順の処方は、本質的には、標準クローニング便覧に記載されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（第２版＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８９）を参照されたい。

ベクターは興味ある遺伝子をコードするＤＮＡを増幅および／または発現させるために使われる複製可能なりＮＡ＆ある。望ましい発現ベクターは、ベクターを適当な宿主に導入する時に、正しい方向に配置されたクローン化ｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡを発現させる能力を持つ制御成分を持つであろう、そのよよびボリアデコＩＥシグナルを含むが、これらに限定されるものではない、さらに、翻訳を可能にする能力を持ち、発現させる遺伝子と一勺番４をかする、リボゾーム結合部位としてのＤＮＡ配列をも必要とする。

旦旦Δ、旦旦、６４０４−６４０８　（１９８８））、骨格筋内で用いるのに適切な他の例示的なプロモーターは、骨格筋アクチン、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、デしドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ＞　、筋肉クレアチニンキナーゼ、および綿剣ｔＡ冊Ｗ長因子を発現さぜる遺１Ｒ子に関連するプロモーター、ヘルペスウィルスのプロモーター、チミジンキナーゼ、ならびにラウス肉腫ウィルスのようなウィルス性ＬＴＲ（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ　ｒｅｐｅａｔ）のプロモーターを含む。

ベクターは、プラスミド、ウィルス、Ｍ（例えば、アデノウィルス、シトメガロウイルス）、ファージ、および組換えによって宿主染色体内に組込まれうるＤＮＡフラグメントからなる。ベクターは、宿主染色体で独立的に複製し、機能する。

旦−逗伝子標的直接ＤＮＡ微量注射は、新たに受精させた卵の前核内に少址のＤＮＡ溶液を注入することにより、マウスのような実験動物、ならびに家畜のウシ、ヒツジ、およびブタのような大きい動物に用いて好結果を得た。飼鳥類へのこれらのシステムの利用は（産卵前の）新規に受精させな卵に限られるが、殻なし培養と代用卵１ −１０１　＜１９８７）：Ｐｅｒｒｙ、Ｎａｔ、ｕｒｅ、１旦１，７０−７２　（１９８８）、Ｎａ１ｔｏら１．Ｊ、Ｅｘ　ｔｌ−Ｚｏｏｌ、、２５４．３２２　３２６　（］　９９０））を含む、このシステムはおおよその第−非削分裂時にトリの卵の圃胞質内にＤＮＡを微量注射することを許し、胚内での一時的な発現が得られる。（ＳａｎｇおよびＰｅｒｒｙ、Ｍｏ１．Ｒｅ　ｒｏｄ、ａｎｄ　Ｄｅｖ、。

１．９８−１０６．（１，９８９））。

本発明において、ＤＮＡはトリの胚の筋肉組織内に注射、又は直接的に導入さい、ＤＮＡは、以下の詳細に、より詳しく論するが、代表的には筋肉組織内に中空の注射器または針を挿入し、さらに筋肉組織内にＤＮＡを含有する医薬的に許容しうるキャリアー水溶液を注射することによって導入されてよい、溶液の注射は筋肉組織から沿攬拍＋を引き抜く前または引き抜くと同時に実行されてよい、以下に論する実施態様では、注射は筋肉組織内に、力つこれを貫いて注射針を挿入することにより実行され、液体は筋肉組織を貫いた注射針を引き抜くと同時に注射針を通して放出され、それによってＤＮＡは注射針を引き抜くときに通った道筋に沿って筋肉組織内に導入される。

ｌ　へのＤＮＡ　“　２“ 段が用いられてよい、望ましくは、ＤＮＡは導入されるＤＮＡを含む医薬的悶午容しうる水溶液を筋肉内に導入することによって導入される。

インオボでの注射にどの様な注射手法を用いるかは重要ではないが、胚の組織および器官またはそれを取り巻く胚体夕Ｉを甚だしく傷つけず、結果としてその処理がふ化速度を減少させないような方法が望ましい、望ましい注射部位は、筋肉組織、詳しくは骨格筋、より詳しくは胸の筋肉およびふ化筋肉組織であり、それらは卵殻の近くに位置し、それ故地の胚体格造を傷つけることなく、さらに卵殻による保護を害することなく、注射装置が比較的容易に芋１漣する。おおよそ１８−２６ゲージの針の適合する皮下注射器が目的のために適当である０発達の正確な段階および胚の位置によって、１インチのａＱ＃Ｗｂヨコ上の流体内又はヒヨコそれ自身内のいずれかに針の久方）１漣するように差し込まれるであろう、注射針を通すための穴は、注射針の損傷または鈍りを防ぐため番″−ｆｌ’Ｕ＋針の挿入前にパンチまたはドリルて′殻にあけられてよい請求めに応じて、卵は、ワックスのような実質的に細菌不浸透の封印材料、または後の望ましくない細菌の侵入を防ぐ同様のもので封印することができる。

トリ胚のための高速自動注射システムが本発４％訪部こ特に好適であろうと想像される。多数のその様な装置が入手可能であり、模範的なものに、“’ＥＭＢＲＥＸ　ｌＮ０ＶＯＪＥＣＴ”システム（米国特許第４，６８１．０６３号、Ｈｅｂｒａｎｋに記載）、並びに米国特許第４，０４０，３８８号、第４．４６９゜０４７号および第４．５９３，６４６号、Ｍｉ　Ｉ　ｌｅｒ、がある、ここに引用したこれらの引例およびすべての引例の開示は参照としてここに収り入れる１本発明を実施するために応用されるようなその様なすべての装置は、ＤＮＡを含有する装置によってＤＮＡを伝達する卵に注射するために設置された前記ＤＮＡ含有？」１器からなる。さらに、注入装置と楢用迫りに関連する封印装置はそれを注入した後、卵の穴を封印するために提供されて良い。

本発明を苅鰐゛るための現時点での望ましい装置は、米国特許第４，６８１゜０６３号、Ｈｅｂｒａｎｋおよび米国特許第４，９０３，６２５号、）−１ｅｂｒａｎｋに開示されており、これらの開示は参照としてここに収り入れる。この装置は、多数の卵内に流体物質を伝達するための注射装置、および多数の個々の卵を上を向いた部分から一斉に保持して持ち上げ、力つ卵が吸引装置によって引き込まれると同時に卵に注射するための注射器と協力して働く、吸引装置からなる。

この装置の特徴は本発傅Ｖ層勃帳こあたって上述した装置の特徴と合同させてよい。

当業者は、以下の詳細により詳しく論するように、この器具が注射器の進入の深さを調節することにより卵の任意の部分への注入に応用されうることを正しく認識するであろう。

注入方法および装置のとくに望ましい実施態様を略図に示した。方法および装置は実質的には上述のようなものであるが、細長い注射器または注射針１０を卵１２の鈍端１１に城郭の長軸１５から角度Ａで設置し、その角度は針刃骸胚１６の肩または胸に向くように選択されるすることをも含む０次いで、針は、実質的に進入の直線路１７に沿って、胚の肩または胸肉に至【漣するのに十分な深さに、卵の殻を通って挿入される。卵内に導入される物質は、（望ましくは上述のＤＮＡを含む水溶液であるが、）液体であっても注射可能な固体であってもよく、次いで針を通して注射される。望ましい実施態様では、針は実質的に進入の直線路に沿って引ぎ抜かれ、カリ物質を注射する段階は針を引き抜く段階と同時に行われ、そうすることによって、物質は進入路に沿って卵内に投与される。オフセット角度Ａは肩または胸肉内への注射の確率を高めるのに十分である０代表的には、角度は１〜５度、望ましくは２〜３度である。紹邸８１８の殻の真下に、胚の肩または胸肉に達する又は通り過ぎるに十分な深さに挿入されてよい；代表的には、鉗↓卵内に７／８インチ（２，２ｃｍ）挿入される。装置は、吸引装置に対して針をある角度にｇ＝ｔｔす位置を定めるなどのように、角度Ａを作り出すための針に対して卵をある角度に位置させるための装置、と機能的に関連する手段を含むように修正されてよい。

本発明は以下の非限定の実施例の中でより良く説明される６本実施例中、“μじはマイクロリットルを意味し、“μｇ”はマイクログラムを意味し、”ｍＬ”はミリリットルを意味し、”ｃｃ”はキュービックセンナメートルを意味し、°“ ｍｍ”はミリメートルを意味し、　”ｍＭ”はミリモル濃度を意味し、”ｍｇ” はミリグラムを意味し、°Ｃ゛°は摂氏温度を意味する。

インキュベージジン１８日の羊膜て根室される領域内の胚内に１００μＬのリン酸塩Ｍ’１ｆｉｆ液（ＰＢＳ）に溶解した２５．５０、もしくは１００．ｕｇのｐｍｉｗＺまたはｐＲ３Ｖ−ＡＤＨＤＮＡを注射することにより行われる。胚はインキュベーション１９．２０または２１日て′犠牲にし、発現の仕方を調べ、るなめに筋肉組織を組肩ｎ幀勺に；にまたづ−る。ＬａｃＺの発現は、無萄汐カわしを質（ＩｍａＧｅｎｅ”　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ、）を用いて肝臓組織で、まＡＤＨの発現は、Ｄｒｏｓｏ　ｈｉｌａのＡＤＩ−１に特異的であってを椎動物のＡ１）１４に利用されない基質である２−ブタノール（Ｏｒｄａｈｌ、前出、（１９８６））を用いて、固定化組織で試験される。それ故、内因性の発現は外因性の発現と区別することができる。

構築物が発現した場合、胚に注射された他のト！ＪＪａ化させ、退会１−２１まで飼育される。この期間、いろいろな時点で烏を犠牲にして、１９−２１日の胚内へ注射した部位および発現した部位に関係する筋肉の一部分について、１１１ｍのβ−ガラクトシダーゼまたはＤｒｏｓｏ　ｈｉｌａのＡＤＨ活性を分析した。

ｍλ　＾　へのプラスミド　６　りおよび”２つのプラスミド構築物、ｐｍｉｗＺおよびｐＲ３Ｖ−ＬＬＩＸ、が筋肉組織への遺伝子の伝達を評価するために用いられた。プラスミドｐｍｉｗＺは大腸菌のβ−ガラクトシダーゼリポータ−遺伝子、ニワトリのａ−クリスタリンエンハンサ−１およびラウス肉種ウィルス（Ｒ５Ｖ）プロモーターからなる。この構築物は、エンハンサ−およびプロモーターが筋肉内で活性であり、且つβ−ガラクトシダーゼの組織化学的アッセイを行うのが簡単であると言う事実より選ばれた。

しかしながら、β−ガラクトシダー−ビｍσ河ユ新色は定性的アッセイである。

第２のｔｔ４第４築拗Ｒ３Ｖ−ＬＵＸプラスミド、は遺伝子発現に関して定量的アッセイができるため、且つ筋肉内に注射したＤＮＡの発現が１つの特別なプラスミド横築物に特異的でないことを証明するためＬｊ加ｆれた。このプラスミドはホタルのルシフェラーゼリポータ−遺伝子およびＲ３Ｖプロモーターを含む、ｐＲ３Ｖ−ＬＵＸプラスミドによってコードされる遺（ｋ石東成物の発現はルシフェラーゼ酵素によって生じたルミネセンスを測定する生化学的アッセイによって定量的に測定されてよい。

プラスミドＤＮＡは共有結合によって閉鎖されたの開環状型で精製された。注射される溶液は、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）中の２５０．５００．７５０または１１０００ｕ／ｍＬのＤＮＡ、および５０μＬ／ｍＬのＩｎｄｉａ　Ｉｎｋからなる。Ｉｎｄｉａ　Ｉｎｋは死体解剖時に注射した正確な部位を標識するために用いた；それは、筋肉内で少なくとも２週間代謝されず、持続した。各々のヒヨコはふ化時に腿の筋肉の後ろ部分に適当に希釈したＤＮＡを１００μＬ注射した。

注射は針が筋肉内に２ｍｍ入り込むようにカラーをつけた２６Ｇ３／８インチの針をつけたｌｃｃシリンジで実行した。ＤＮＡ溶液は、針の正確な配置を確実にするために足の筋肉を穏やかに圧迫して、伝達した０次いで、ヒヨコはＣＯ２で安楽死させるまで、１または２週間囲いの中に置かれた。

実杷一旦ポリメラーゼ　こよる　へ組　のＤＮＡ横築−Ｑ検出筋肉によるプラスミドＤＮＡの取り込みおよびＤＮＡ分子の持続性はポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を基本とした方法によって注則ｔヒ→雪ひぐ測定した。ｐｃＲ分析を行うためのＤＮＡサンプルを筋肉から得るために、注射部位の回りの筋肉を摘出し、５０ｍＭトリスｐＨ８，０，１００ｍＭ−ＥＤＴＡ　ｐＨ８，０，１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、および０．５ｍｇ／ｍ！ブロテイナービＫからなる緩衝液内においな、５５℃で一夜インキユベーションした後、サンプルは等容量のフェノールで一度、等容量のフェノール：クロロホルム溶液（５０：５０）で一度、および等容量のクロロホルムで一度、抽出し、次いでｍナトリウムおよびエタノールで沈殿させた。ＤＮＡは１０ｍＭ０ｍＭトリスル、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐ）４８．０に再懸濁し、濃度を定量した０次いで、ＤＮＡサンプルは、大腸菌の β−ガラクトシダーゼに特異的なオリゴヌクレオチドブライマーを用いて以下のｐｃＲｆｆｌ準技術に委ねた。ＰＣＲ生成物はゲル電気泳動によって試験し、注射したプラスミドＤＮＡ分子の存在または不在を決定した。

実施例田二己戟した方法から以下の表１に示すデータを得た。

青土　適齢１週の烏に存在するｐｍｉｗＺＤＮＡ投与量（μｇ＞　０　２５　５０　７５　１００鳥の総試験数　４６５５　１表１では、試験したｐｍｉｗＺ投薬量のすべてで、プラスミドが注射した部位に最も近い筋肉組織内に保持されていることをＰＣＲが示している。

この様にこれらのデータは、筋肉組織内に注射されたＤＮＡ横築物が少なくとも一週間そごに存在する能力を持つことを示している。また、これらの結果はＤＮＡ１ｌｉ築物の保存を妨げるヌクレアーゼが新たにふ化したトリの筋肉組織内には存在しないことを示している。

Ｘ倒立　Ｊ内組　・の　−ガラクトシダーゼの　川筋肉組織を、ｐｍｉｗＺの注射後４．６．７および１４日のβ−ガラクトシダーゼ活性を検出するための組織化学的染色を行うために得た。トリはＣＯ２で安楽死させ、注射部位に被さった皮膚を取り除いた。筋肉かん押子を（Ｉｎｄｉａｉｎｋ染色によって同定される）注射部位の回りにおき、筋肉をかん押子で切り取り周辺組織からサンプルを切り離した。かん押子で切り取った筋肉はＰＢＳで飽和させな目の荒い薄地の綿布（寒冷紗）上におき、室温に５分岱１保った。次いで、筋肉かん押子から筋肉を取り除き、液体窒素で冷やしたイソペンタン中で凍結させた。

凍結切片はゼラチン被覆スライド上に調製した。スライドは０．０５Ｍリン酸ｔｍ液ｐＨ７，４，０，２％グルタルアルデヒド、２％ホルムアルデヒドおよび２ｍＭ　ＭｇＣ１□中で、１０分間室温て′固定した。スライドを固定液より取り出し、０．０５Ｍす／ｆｆｆｌ緩街液ｐＨ７，４，２ｍＭ　ＭｇＣｌ２および０．０２％ＮＰ−４０の溶液中で各々２０分間３回すすいだ９次いで、スライドは、０゜０５Ｍすｍｉ液ｐＨ７，４，０，５ｍｇ／ｍＬ　Ｘ−ｇａｌ、５ｍＭへキサシアン鉄＜ＩＩＩ）酸カリウム、５ｍＭへキサシアン鉄（ＩＩ）　Ｋカリウム、および２４に保つことによって、ニワトリの内因性ガラクトシダーゼによるバックグラウンド象ぞす滓乳表される。

ついて実施され、組織化学的に分析された。結果を以下の表２に示す。

ｆＵ　ふイは表６日のβ−ガラクトシダーゼの検出ＤＮＡ投与Ｊｉ（μｇ＞　０　２５　５０　７５　１００鳥の総試験数　２２２１　１陽性サンカＬ／Ｔ＆　０　２　２　１　１これらの結果は、注射されたＤＮＡがヒヨコの筋肉内で注射後１０日まで活性タンパク質を発現する能力を持つことを証明している。

これらのデータは、烏に存在する内因性のヌクレアーゼおよびプロテアーゼがｐｍｉｗＺｆｌ築物の発現を妨げないことを示している。

ｐＲ３Ｖ−ＬＵＸをコードする椙探閉叡々ｍされた：この酵素により生成される０、２５．５０Ｍｇのこの′ｔＨ！ｈｈ（ふ化の日、筋肉内に注射された；筋肉は注射ｆ＆１退［’ｌｌ又凱した。

注射した筋肉内でのルシフェラーゼ活性の水準を定量するため、筋肉サンプルはニワトリの安楽死後収集され、即座に液体窒素で凍結した。サンプルはドライアイスで冷やした乳鉢および乳棒で微粉末になる丈ですりつぶし、溶解緩鏑中に再懸濁し、室温で１５分間インキュベージジンした９次いで、抽出液は凍結−解凍サイクルに３回委ね、１４．ＯＯＯｘｇで３分間遠心分離した。ベレットは新た調製した溶解緩衝液に再懸濁し、上述の手順を繰り返した０両上溌部よ、プールし、−７０℃で凍結した１次いで、サンプルは商品として入手可能なアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼ活性を検定した。

ルは生成した蛍光の光単位を測定することによってルシフェラーゼ活性を分析しな、結果を下の表出ごＲす。

８３　ルシフェラーゼ活性の検定ＤＮＡ投与量（μｇ）０２５５０鳥の総試験数　７　７　６陽性サンプル数　０　４　４これらのデータはＤＮＡ１ｌｉ築物）注射によってタンパク質が発現していることを７Ｆ４フｊＨ列８のデータの確認を提供する。さらに、これらのデータは発現したタンパク質量が注射中に伝達されたＤＮＡ量に直接的４．３系していることを示しプラスミドｐｍｉｗＺは実施例２に記載の方法で調製した。この調製物は１８日または１９日のヒヨコの胚の胸筋肉、ふ化筋肉、または腿の筋肉内に手動で注射した５２６ゲ一ジ５３／８インチの針が伝達に用いられた。投与量は１００７ｚＬの伝達べしタル中プラスミド０．２５および５０Ｍｇの恒筐ｓ−４ヒさせた。針によって作られた孔はポリエチレンフィルムで封印した。

トリはふ化させ、ＣＯ２で安楽死させな、筋肉サンプルを調製し、実施例３に記載の方法でＰＣＨによって分析した。

できた烏からのみ採取した。

注入データ　１８日胚　１９日胚烏の総試験数　８６陽性サンプル数　７６筋肉組織内に維持されうろことを示している。この発見は、筋肉組織が外因性タンパク質を生成するＤＮＡ横築物の注入部位として用いることができることを、またこの様な筋肉的注射は鳥類へ外来ＤＮＡを導入するための実行可能な方法であることを示唆している。

■、　の゛さ１”から１．　１／２”　＜２．５−３−８ｃｍ）ノ’　一本刀験右よ、深さ１”−１，５”　（２，５−３，８ＣＩ７１）の注射がヒヨコの胚の胸領域に到達するか否かを決定した。１８または１９日の胚のブロイラー卵にＩｎｄｉａ　ｉｎｋを１００μし、各々の卵にいろいろな深ざで注射した。卵は上部（鈍端）から注射した。すべての注射は自動車−卵注射器を用いて行った。

卵内の胚の位置が一定になるように卵の向きを合わせると言ったような試みは行わな力）っな０次いで、卵を割り、色素がどこに注入されたかを目で調べて明確に確定した。

結果を表５に示す０色素は行った注射の深さによって、３−６７％が胸領域内に注入された。

六亘　１８日および１９日の卵へσ又」十インキュベーション　注射の深さ　胸領域　その他　試験数１８　１　１、／２”＜３．８ｃｍ）　３４　６６　２７１９　］　１／２”＜３．８ｃｍ＞　１６　８４　４９１８　１°’　（２，５ｃｍ）　３６　６４　３５１９　１”　（２，５ｃｍ）　３３　６７　２８１８　１　１／４”（３，１ｃｍ）　６７＋　３３　３３１９　］、１／８°’　（２，８ｃｍ）　３　９７　３０Ｉ＋、　ｌ砿腿組　内へのパ、・−深さ］　１．／２”　（３，８ｃｍ１９日の胚ブロイラー卵４９個に、単−卵注射器を用いて、各々５０μＬのＩｎｄｉａ　ｉｎｋを］　１／２”　＜３．８ｃｒｎ）の深さに注射した０次いで、卵を割り、色素がどこに注入されたかを目て訓べて明確に確定した。８８％の卵の胚に注入力（認められ、注射の１６％が胸筋肉組織内に入っていた。結果を表６に示す。

試験数　首　喉　胸　胸及び　肺又は　卵黄のう　羊膜卵　筋肉　内臓　体腔４９　８％　５％　１２％　４％　５６％　２％　１２％ＩＩＩ　シＪ＋ｐ組　への２刊・（２さ７／８°′）１９日の胚ブロイラー卵に、手動で５０μＬのＩｎｄｉａ　ｉｎｋを７／８°。

（２，２ｃｍ）の深さに中心軸に沿って直接的に注射した。上述のように、卵を割り、ｊゼｔ’？４筋肉組織を横切っているか否かを調べ決定した。最初Ｖ頂欺では注射の４２．７％が胸筋南向に直接位置しているのに対して、３５％は胸筋間の上部の皮下に位置していることが分かった（表７）。

注入が正確に行われないのは貧しいインキュベージジン条件によるものではないことを保証するために、上述の実験を第二のふ化場で繰り返した。結果は同様であった。（データには示していない、）卵試験数　胸筋間　皮下　内臓　羊膜６８　４２．７％　３５．３％　１０−０％　１２％ｒｖ−；育のばらつきと？・　の正確さ発育のばらつき、およびそのばらつきと注入の正確さの関係を確かめるため、１８日および１９日の胚のブロイラー卵の空気室の奥行を決定した。

空気室の奥行きは胚が成長し、ふ化する姿勢に向かうに伴い減少する０次いで、自動の卵注射器を用いて１２０個の卵に卵の上部（鈍端）より７／８”　＜２− ２ｃｍ）の深さに５０μＬのＩｎｄｉａ　ｉｎｋを注射した。結果を表８に示す、８９％の卵は３−６ｍｍの空気室の奥行きを持ち：注大の正確さは空気室の奥行きが４−５あった。

ａ８　胸筋南向への注射における１９日ブロイラー卵の空気室の奥行の変化と効果 ηり（乞の舅片〒き　２３４５６７８　９分布％　３２９２７１８１３　２　５　１ふ化筋肉％　５０３７６５００００胸筋肉％　２５　２０　４７　３６　１９　０　３３　１００Ｖ、７／８”　（２，２ｃｍ）＜７Ｘさでの１９日Ｈへの１９日の胚ブロイラー卵６０個に上部（鈍端）から７／８°’　（２，２ｃｍ）の深さに注射する試験を２回行った１本ｍより、注射は常に直接的に胸の筋肉に命中するわけではないが、時折り最初に胚の背中才たは肩に命中し、体腔を通過して、右の胸筋中に又は胸筋を通りぬけている事が分かった。注射の少なくとも６０％が（表中、胸及び皮下と示すものでは）、ある時点で筋肉組織を通っていた。結果を表９に利− さらに、内臓注射の多くが、肺又は１提可肋骨（羽かく）内、直接的には胸筋間の下部にあった。

把　１９日のブロイラー卵の上部からのａＱ’ｔ　７　／　８”　（２，２ｃｍ）による染色の配置卵式験数　胸筋間　皮下　内臓　羊膜　胚試験１　６０　３６　２２　３４　３　９７試験２　６０　２７　１５　３７　３　９７平均　１２０　３１　２９　３６　３　９７ｖ１．′さを増しての沿Ａ・注射の深さを増してすべてのを主射力警胸を突き通るように、またＩｎｄｉａ　ｉｎｋは（注射した物質の足跡を残すために）針を引き抜ぎながら注射するように、実験を行った９本実験では針の進入路が筋肉細胞を通過しているか否かを調べた。

針を卵内に挿入し、針を適所に刺したままの卵を割り、針が筋肉組織を貫通しているか否かを、さらにどの様に貫通しているの力）を目に見えるようにした０本技術を用いて多数の結果が得られ、以下の結論に達した。針の進入銘仙Ｒ勿鴫＠よ胚の成長「清または卵内の各々の個体の胚の位置の変化のいずれかに一部依存する。胚がふ化に近い場合、胚の背中が卵の中心の方に向かって丸くなるなめ、胚るかのどちらかである。他の場合、針は体腔を通過するが、胸筋肉組織には入らず、胸部又は腹部の体腔内で止まっている。胚が軸の回りの中ｌｃ４こ位置する時、鉗よ羽根と胸部の間に入り、胸筋肉を貫通し胸すれすれを通り且つ直接的には戊膚の下部にまで達するくが筋肉組織を貫通するには至ってない）か、または胸を完全に突き損なって羊膜に達するかもしくは腹部領域に入るか、のいずれかである、もしも針を卵の真中に入れない場合は、注射器は胚の膜または首に達するこ事によって針が胸筋肉の上部を横切ってかすめ通る（結果として皮下注射となる）ことを防げるか否かを決定した１本技術では最初に針の通路に適切なように胚の方向を合わせる必要がある１本技術が筋肉組織内へ直接的に注入される割合（％）を増加させるか否かを決定するために実験をおこなった。

注射の最良の角度は、卵を光に透かして調べ、空気室又は肩の最も高い部分を記録することによって決定した。針は注射前に胚の肩または胸の方向へ向けた。

５度の角度で挿入した針は、６０％の頻度で胸の上部先端上に位置した。角度２゜５度で針を挿入した場合、調べた胚の７／９（７８％）では胸筋肉に命中し、一つの胚でシＪ侯、及び他の一つでは胸の最上部又は皮下であった。角度２．５％を今後の研究のすべてに用いた。

研究では、５０μＬ　Ｉｎｄｉａ　ｉｎｋの注射を行い、角度をつけた注射と次の研究に於いて、垂直注射の技術では試験した卵（ｎ＝２１）の５４％が何らかの部分で筋肉を力すめ通っていたが、それに対して角度をつけた方法では試験した卵（ｎ＝２２＞の９０％が筋肉組織を貫通していた１次に１０８の卵を用いて角度をつけた方法を研究したが、９２％の正確さで注入を実証した。角度をつけた方法を用いて行ったすべての実験の要約は、本技術では９３％の正確さで筋肉組織を通っていることを示唆した（表１１）。

轟１旦　垂直と角度を匍カリ注射技術との比較垂直　１８　３３％　３９％　２８％角度　２４　７１％　２１％　８％試験　胸筋肉命中数　卵試験数　％１　１７　２４　７１％２　９９　１０８　９２％３　１９　２１　９０％４　７　９　７８％５１５１７８８％に含まれる請求の範囲と等価である。

フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｍ　１１００　Ａ　９０５０−４ＢＣ１２Ｎ　１５１０９／／　Ａ６１　Ｋ　３１／７０　９４５４−４Ｃ４８１００８３１４−４ＣＣ１２Ｎ　５／１０（８１）指定図　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ。

ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎ。

、　ＮＺ、　ＰＬ、　ＰＴ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ、　ＳＫ。

Ａ（７２）発明者　ペティット、ジェームズ・エムアメリカ合衆国ノース・カロライナ州２７６０３　、ローリ、シャディウッド・レーン（７２）発明者　リックス・キャサリン・エイアメリカ合衆国ノース・カロライナ州２７６０３　、ローリ、マナー・リッジ・ドライブ３３３６

Claims

【特許請求の範囲】

１．インオボ（ｉｎｏｖｏ）でインキユベーシヨン中に卵内の鳥の筋肉組織にＤＮＡを導入することからなり、該ＤＮＡがふ化後の該鳥の表現型を変える原因となるに有効である、鳥の表現型の変更方法。
２．該導入段階が該ＤＮＡ分子を該鳥の筋肉粗組織内に注射することからなる請求項１記載の方法。
３．該ＤＮＡが胸筋肉粗織及びふ化筋肉組織（ｐｉｐｐｉｎｇｍｕｓｃｌｅｔｉｓｓｕｅ）からなる群より選択される筋肉組織内に導入される請求項１記載の方法。
４．該ＤＮＡがベクターによって運ばれる組換えＤＮＡ分子からなる請求項１記載の方法。
５．該ベクターがプラスミド、ウイルス、及びファージからなる群より選択される請求項４記載の方法。
６．該ＤＮＡがリボソームとＤＮＡ−リボソーム複合体のかたちで結合されていることからなる請求項１記載の方法。
７．調鳥がニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラ、及びコウライキジからなる群より選択される請求項１記載の方法。
８．該ＤＮＡがインキュベーションの最終四半期に導入される請求項１記載の方法。
９．該ＤＮＡが、トリの筋肉組織内て機能しうるプロモーター、及び該プロモーターと実施可能なように結合したペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子、からなる請求項１記載の方法。
１０．該遺伝子が成長ホルモン、インスリン様増殖因子、リンホカイン、表皮増殖因子、及び甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンからなる群より選択されるタンパク質又はペプチドをコードする請求項９記載の方法。
１１．該遺伝子が防御抗原タンパク質又はペプチドをコードする請求項９記載の法。
１２．さらに該卵をふ化までインキュベーションする段階からなる請求項１記載の方法。
１３．さらに、少なくとも表現型の該変化が発現する週齢まて該鳥を育てる段階からなる請求項１２記載の方法。
１４．インオボで卵に含まれる鳥の筋肉組織内にＤＮＡを導入することよりなり、該ＤＮＡが該鳥の免疫応答を誘導するために有効である、鳥の免疫化方法。
１５．該導入段階が該鳥の筋肉組織内に該ＤＮＡを注射することよりなる請求項１４記載の方法。
１６．該ＤＮＡを胸筋肉組織及びふ化筋肉組織よりなる鮮より選択された筋肉組織内に注射する請求項１４記載の方法。
１７．該ＤＮＡがベクターによって運搬される組換えＤＮＡ分子からなる請求項１４記載の方法。
１８．該ベクターがプラスミド、ウイルス及びファージからなる群より選択される請求項１７記載の方法。
１９．該ＤＮＡがリボソームとＤＮＡ−リボソーム複合体の形で結合されている請求項１４記載の方法。
２０．該鳥がニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ．ウズラ、及びコウライキジからなる群より選択される請求項１４記載の方法。
２１．該ＤＮＡがインキュベーションの最終四半期に導入される請求項１４記載の方法。
２２．該ＤＮＡが、トリの筋肉組織内て機能するプロモーター、及び該プロモーターと実施可能なように結合するペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子、がらなる請求項１４記載の方法。
２３．該遺伝子が防御抗原タンパク質又はペプチドをコードする請求項２２記載の方法。
２４．さらに、該卵をふ化までインキュベーションする段階よりなる請求項１４記載の方法。
２５．さらに、少なくとも該免疫応答が誘導される適齢まで該鳥を育てる段階からなる請求項２４記載方法。
２６．インオで卵に含まれる鳥の筋肉組織内に抗原をコードするＤＮＡを導入することからなり、卵が該抗原と結合する母性抗体を含み、該ＤＮＡが該母性抗体を中和するに十分な量導入される、インオボでトリを免疫化する方法。
２７．該導入段階が該ＤＮＡを該鳥の筋肉組織内に注射することよりなる請求項２６記載の方法。
２８．該ＤＮＡを胸筋肉組織及びふ化筋肉粗織からなる群より選択される筋肉組織内に注射する請求項２６記載の方法。
２９．該ＤＮＡがベクターによって運搬される組換えＤＮＡ分子からなる請求項２６記載の方法。
３０．該ベクターがプラスミド、ウイルス、及びファージからなる群より選択される請求項２９記載の方法。
３１．該ＤＮＡがリボソームとＤＮＡ−リボソーム複合体の形で結合されている請求項２６記載の方法。
３２．該鳥がニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラ、及びコウライキジからなる群より選択される請求項２６記載の方法。
３３．該ＤＮＡがインキュベーションの最終四半期に導入される請求項２６記載の方法。
３４．該ＤＮＡが、トリの筋肉組織内て機能しうるプロモーター、及び該プロモーターと機能的に結合したペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子、からなる請求項２６記載の方法。
３５．該遺伝子が防御抗原タンパク質又はペプチドをコードする請求項３４記載の方法。
３６．さらに、該卵がふ化するまでインキュベーションする段階からなる請求項２６記載の方法。
３７．さらに、少なくとも免疫応答が誘導される週齢まで該鳥を育てる段階からなる請求項３６記載の方法。
３８．ａ）細長い注射針を卵の鈍端（ｌａｒｇｅｅｎｄ）に、該卵の長軸と角度をつけて置き、斜が該胚の肩または胸に向けるように該角度を選択し、次いで、ｂ）針を該卵殻から、実質上進入の直線路に沿って、該胚の肩または胸を通り過ぎるに十分な深さに挿入し、次いで、ｃ）該物質を卵内に該針を通して注射する、ことからなる：インオポでインキュベーション中の卵に含まれる鳥の筋肉組織内に物質を導入する方法。
３９．さらに、該方法が実質上進入の直線路に沿って該針を引き抜く段階からなり；さらに、該物質を注射する該段階が該針を引き抜く該段階と同時に行われ、その結果該物質が該進入路に沿って投与される；請求項３８記載の方法。
４０．該角度が１−５度である請求項３９記載の方法。
４１．該角度が２−３度である請求項３９記載の方法。
４２．該針が該胚の肩または胸内に及び肩または胸を通って進むに十分な深さに挿入される請求項３９記載の方法。
４３．該針が該卵内に７／８インチ（２．２ｃｍ）挿入される請求項３９記載の方法。
４４．該物質がＤＮＡ分子よりなる請求項３９記載の方法。
４５．該鳥がニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラ、及びコウライキジからなる群より選択される請求項３９記載の方法。
４６．該物質が該卵のインキュベーションの最終四半期に導入される、請求項３９記載の方法
４７．さらに、該卵をふ化するまでインキュベーションする段階よりなる請求項３９記載の方法。
４８．多数の卵を保持するための保持手段；細長い針を該卵の殻から、実質上進入の直線路に沿って、肩又は胸内に到達するのに十分な深さにまで挿入するための，該保持手段と共同する注射手段：および細長い注射針を該卵の鈍端に該卵の長軸と角度をつけて該針を胚又は肩又は胸に向けて位置決めするための位置決定手段；からなる：多数の卵内のトリの胚の筋肉組織に同時に注射するための装置。
４９．引き込み手段が多数の各々の卵を同時に持ち上げるための引き込み手段からなる請求項４８記載の装置。