KR102530639B1 - 난 내 가금류 성별의 비파괴적인 판단 방법 및 시스템 - Google Patents
난 내 가금류 성별의 비파괴적인 판단 방법 및 시스템 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 (a) 배아를 포함하는 난과 관련된 물질의 시료를 얻는 단계와, (b) 상기 배아의 특성을 나타내는 상기 시료 중 적어도 제 1 바이오 마커의 존재 및 농도에 대한 점수값을 측정하는 단계와, (c) (b) 단계에서 얻은 점수값 및 농도에 임계값을 적용하여 상기 바이오 마커의 존재 및 농도와 관련된 배아의 특성을 확인하는 단계를 포함하는 난에서 (in ovo) 갈루스 갈루스 도메스티쿠스 (Gallus Gallus Domesticus) 배아의 특성을 비파괴적으로 확인하는 방법으로서, 상기 적어도 제 1 바이오 마커는 분자량이 140 내지 190 g/mole 범위인 아미노 화합물을 포함하고, (c) 단계는 (i) 유사도 척도를 이용하여 각 연관 신호의 스펙트럼을 연관 대조 바이오 마커의 예상 스펙트럼과 매칭하여 각 관련 바이오 마커 신호를 대조 바이오 마커와 연관시켜, 적어도 하나의 양의 연관 신호를 정의하는 단계와, (ii) 각 양의 연관 신호의 강도를 측정하고 절대 및/또는 상대 신호 강도에 점수를 부여하는 단계와, (iii) 유사도 함수로부터 얻은 점수값에 임계값을 적용하여 연관된 배아 특성을 판단하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 난생(oviparian) 종, 상세하게는 조류 종, 보다 상세하게는, 갈루스 갈루스(Gallus Gallus) 종의 성별을 비파괴적으로 판단하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 수컷 난 및 암컷 난의 선별 및 선별된 난을 이용한 살아있는 동물군의 생산에 관한 것이다.
난생 동물은 모체 내 배아가 거의 또는 전혀 발달되지 않고 알을 낳는다. 난생 동물과 이들의 난의 육성은 전 세계적인 단백질 공급을 지속적으로 높이는 영역일 뿐만 아니라, 백신 제조 등과 같은 다양한 대규모 산업 공정을 충족시킨다. 현재, 난생 동물의 배양에 가장 중요한 과정은 가금류 등 조류 종의 사육과, 어류, 갑각류 및 연체류 등 수생 생물의 양식, 즉 사육을 포함한다. 특히, 가금류, 특히 적색 야계(red jungle fowl chicken), 즉 갈루스 갈루스 도메스티쿠스(Gallus Gallus Domesticus) 종은 지금까지 세계에서 가장 많이 사육되는 난생 종이다.
닭의 수정란에서는 수컷과 암컷 동물이 거의 동등한 분포로 출산되는 경향이 있다. 그러나, 여러 가지 원인으로 부화장 관리에서 다양한 특성, 특히, 성별에 따라 동물을 분리하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 상업적인 국내 닭과 계란 생산에 있어서, 수컷 병아리의 배양과 사육은 매우 바람직하지 않으며, 매년 수십억 마리의 수컷 병아리가 도태(culling)되고 있다.
현재, 두 경우 모두, 부화된 병아리의 혼합 개체군은 청소년 동물의 시각적 평가에 의해 성별이 감별되며, 때로는 청소년에게 적합한 특성이 없는 경우, 성인 개체도 그러하다. 어느 경우에나 고도로 숙련된 조작자가 필요한 시간이 매우 많이 소요되는 과정이며, 동물은 일반적으로 심한 스트레스를 받는다.
그러나, 상업적인 계란 생산을 위해서는 수컷 병아리의 배양과 사육이 매우 바람직하지 않아, 매년 수십억 마리의 수컷 병아리가 도태되고 있다. 또한, 일부 난은 수정되지 않거나 배양기 초기에 생존 가능한 배아를 포함하지 않아 부화장에서 배양기의 능력이 크게 저하된다.
또한, 성인 동물의 성을 감별하는 곳에서는, 전체 개체군을 최소 연령까지 사육할 필요가 있으며, 사육된 동물의 절반만이 분리 후 증식에 사용된다. 예를 들어, 수컷 개체군의 존재가 식인 풍습과 영농 밀도 감소 등에 따른 생산성 감소를 초래하는 경우에 다른 문제가 발생할 수 있다.
또한, 일부 난은 배양기 초기에 수정되지 않거나 생존 가능한 배아를 포함하지 않아 부화장에서 특히, 가금류 난에 있어서 배양기의 능력이 크게 저하될 수 있다.
결과적으로, 조기 성별 선택이 가능할 경우 적어도 배양력(incubation capacity)이 최소한 두 배 이상 필요하며, 수컷 또는 암컷 배아만을 우선적으로 선택할 수 있게 된다.
따라서, 필요한 에너지와 다른 자원의 양을 줄여 환경 측면에서 가치가 높을 수 있지만, 도태를 통한 불필요한 동물의 제거는 물론 갓 부화한 동물의 스트레스의 감소도 마찬가지로 가능할 것이다. 배양 단계 전에 조류 배아의 성별을 결정할 수 있는 조기 방법을 이용할 수 있다면, 부화장의 능력을 크게 증진할 수도 있다. 또 다른 장점은 본 방법으로 미수정 난 및/또는 생존 불가능한 난으로부터 생존 가능한 배아를 선별할 수 있다면, 부화 과정의 효율을 더욱 높일 수 있다는 점이다.
난에서 특정 대사 산물의 검출에 의해, 예를 들면, NMR 분광기 (예컨대, Y. Feng et al., Appl. Magn. Reson. (2007), 32, 257-268)에 의해, HPLC 분석 (Gu D.-C. et al., Chinese Journal of Animal Science, Vol. 7, 23-25)에 의해, 정량적 형광 현미경 검사가 가능한 바이오 마커 특이적 결합 표적 분자를 사용하여 (예컨대, 마커로서 에스트로겐 스테로이드 화합물의 존재의 판별에 대한 WO 2006/124456 참조), 조류 배아의 성별 결정에 대한 문헌에 다양한 방법이 개시되어 있다. 일반적으로 스테로이드는 쉽게 휘발되지 않는 비교적 큰 분자라는 점에 유의해야 한다.
본 명세서에서 언급된 방법의 대부분의 단점은 일단 시료를 채취하면 배아가 생존하고 완전히 성장하게 하지 못할 정도로 많은 양의 대사 산물이 필요하므로 닭의 성별을 비파괴적으로 결정할 수 없다는 점이다. 또한, 본 방법은 상업 목적의 닭 사육에 있어서 적절한 처리량(throughput)을 제공하지 못할 뿐만 아니라, 비용이나 복잡성으로 인해 병아리 농장에서 일반적으로 사용되지 않는 장비를 사용해야 한다.
WO 2014/021715는 (a) 난의 배양이 시작될 때부터 부화할 때까지의 기간 동안 난에서의 당 및/또는 아미노산, 이들의 전구체 및 대사 물질로부터 선택된 적어도 제 1 발달 마커 화합물을 검출하는 단계와, (b) 상기 검출된 적어도 제 1 발달 마커 화합물의 양을 측정하는 단계와, (c) 상기 측정된 양을 수컷 및 암컷, 배아의 발달 단계 및/또는 생존하고 감소하거나 성장하지 않은 배아에 대하여 설정한 기준선과 비교하여 배아가 생존 가능한지, 암컷 또는 수컷인지 및/또는 배아의 발달 단계인지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 난에서의 조류 배아의 성별, 발달 단계 및/또는 생존력을 비파괴적으로 결정하는 방법을 개시한다. 개시된 방법은 배아의 성별, 연령 및 발달 단계를 결정하는데 매우 유용하지만, 일부 정량적인 측정법의 감도가 낮으므로 비교적 많은 양의 시료가 필요하다. 또한, 일부 자동화된 방법은, 예를 들면, 핵 공명법 또는 라만 분광학을 포함한 스펙트럼 공명법을 이용한 실시간 연속 부화 과정으로 구현하기 어렵다. 다른 방법은 빠르지만 비교적 비싼 장비의 존재 및/또는 특정 바이오 마커 분자를 위한 형광 마커 등 특정 화학 물질의 사용이 필요하다.
따라서, 난에서(in ovo) 난생 동물 배아의 성별뿐만 아니라 발달 단계 및/또는 생존력을 비파괴적으로 결정하기 위한 보다 빠르고 보다 민감한 방법이 필요하다.
따라서, 본 발명의 목적은 (a) 배아를 포함하는 난과 관련된 물질의 시료를 얻는 단계와, (b) 상기 배아의 특성을 나타내는 상기 시료 중 적어도 제 1 바이오 마커의 존재 및 농도에 대한 점수값을 측정하는 단계와, (c) (b) 단계에서 얻은 점수값 및 양에 임계값을 적용하여 상기 바이오 마커의 존재 및 농도와 관련된 배아의 특성을 확인하는 단계를 포함하는, 난에서 (in ovo ) 갈루스 갈루스 도메스티쿠스 (Gallus Gallus Domesticus) 배아의 특성을 비파괴적으로 확인하는 방법으로서, 상기 적어도 제 1 바이오 마커는 분자량이 140 내지 190 g/mole(몰) 범위인 아미노 화합물을 포함하고, 상기 바이오 마커의 존재 및 농도는 수컷 성인 또는 암컷 성인으로 성장할 가능성이 있는 배아와 연관되는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 부화장 또는 양식장과 같은 원격지에서 난의 실시간 온라인 분석을 수행할 수 있는 시스템을 제공하는 것이다. 이들 목적과 다른 목적은 본 발명의 장치 및 방법에 의해 해결된다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 공정은 우위적으로 수컷 또는 우위적으로 암컷 난의 선택군을 형성하는 다수의 생존 가능한 암컷 난에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 공정은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 청소년 동물 개체군에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 공정은 동물 및/또는 인간 식품의 제조 공정, 화장품, 의료 및/또는 영양 화합물의 제조 및/또는 분리 공정, 발효를 통한 메탄 제조 공정, 백신 제조 공정 및/또는 고품질 비료 제조 공정으로부터 얻을 수 있는 다수의 난의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 공정은 또한 본 방법을 수행하기 위한, 바람직하게는 완전 자동화 장치를 포함하는 난생 동물 배아의 성 판별 및 분석 시스템에 관한 것이다.
본 발명은 또한 성별 확인 장치가 분광 시스템과 연결되는 (interfaced) 전자 장치에서 소프트웨어로 구현되는 시스템에 관한 것으로, 바람직하게는 상기 확인 장치는 컴퓨터에 내장된 소프트웨어 수단을 포함한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 많은 다른 형태로 구현될 수 있으며, 본 명세서에서 기술된 실시예에 한정되는 것은 아니라, 이러한 실시예는 본 명세서가 철저하고 완전하게 이루어질 수 있도록 제공되며, 당업자에게 본 발명의 범위를 충분히 전달할 것이다.
도 1에서 A)는 단일 피쳐(feature)에 대한 로지스틱 회귀 분류 모델(Logistic Regression Classification Model)을 나타내며, 3-[(2-아미노에틸)설파닐]부탄산의 농도에서 성별 예측 정확도가 95%보다 높은 것을 보여주며, B)는 2 피쳐(2 Features)의 로지스틱 회귀를 나타내며, 두 바이오마커에 로지스틱 회귀 모델을 적용하는 경우에, 10일부터 정확도는 95% 정확도보다 높게 증가할 수 있었다.
도 2는 일련의 자동화된 고처리량 시험에서 본 발명에 따른 바이오 마커의 LDPD 스펙트럼을 나타낸다. 본 방법은 바이오 마커의 존재를 측정할 뿐만 아니라 시료당 10초 이내에 절대 농도를 측정할 수 있다.
도 3은 수컷 (암회색) 및 암컷 (연회색) 시료로부터 850초에 추출된 220 내지 145 범위의 다양한 질량 피크를 갖는 화합물의 크로마토그램을 나타낸다.
도 1에서 A)는 단일 피쳐(feature)에 대한 로지스틱 회귀 분류 모델(Logistic Regression Classification Model)을 나타내며, 3-[(2-아미노에틸)설파닐]부탄산의 농도에서 성별 예측 정확도가 95%보다 높은 것을 보여주며, B)는 2 피쳐(2 Features)의 로지스틱 회귀를 나타내며, 두 바이오마커에 로지스틱 회귀 모델을 적용하는 경우에, 10일부터 정확도는 95% 정확도보다 높게 증가할 수 있었다.
도 2는 일련의 자동화된 고처리량 시험에서 본 발명에 따른 바이오 마커의 LDPD 스펙트럼을 나타낸다. 본 방법은 바이오 마커의 존재를 측정할 뿐만 아니라 시료당 10초 이내에 절대 농도를 측정할 수 있다.
도 3은 수컷 (암회색) 및 암컷 (연회색) 시료로부터 850초에 추출된 220 내지 145 범위의 다양한 질량 피크를 갖는 화합물의 크로마토그램을 나타낸다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술을 가진 사람이 통상적으로 이해할 수 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위한 목적으로만 제시될 뿐, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "조류(avian)" 및 "새 (bird)"는 모든 조류 종의 수컷 또는 암컷을 포함하지만 주로 알이나 고기를 위해 상업적으로 사육하는 가금류를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, "조류(avian)" 및 "새 (bird)"라는 용어는 특히 적색 및 회색 야계(fowl chicken), 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기, 비둘기, 타조, 에뮤 (emu) 및 꿩을 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용된 용어 "배양(incubation)"은 조류가 그들의 난을 부화시키고, 암탉의 소관을 떠난 후에 난에 배아가 성장하는 과정을 의미한다. 본 발명의 배양 기간이란 조류의 성장이 지연되지 않는다면, 부화 즉, 조류의 출현까지 배양기에서 부화기로 취급 또는 이동을 포함하는 취소(brooding)를 모방한 조건이 가해지는 동안에 중단되지 않은 시간을 말한다.
본 명세서에 사용된 용어 "난 내 (in ovo)"는 부화되지 전 난에 포함된 배아를 의미한다. 본 발명은 (가축용) 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기 및 꿩을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 일종의 조류의 난으로 실시될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어인 "주입 (injection 및 injecting)"는 난 또는 배아에 물질을 전달 또는 방출하는 방법, 난 또는 배아로부터 물질(즉, 시료)을 제거하는 방법 및/또는 난 또는 배아에 검출 장치를 삽입하는 방법을 포함하는 난 또는 배아에 장치 (전형적으로는 신장형 장치)를 삽입하는 방법을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "질량 분석법(mass spectrometry)"은 질량을 기준으로 이온을 분류하는 분석 기술을 말한다. 질량 분석법은 일반적으로 여러 상황에서 화학 분석에 사용되며, 복잡한 석유 혼합물에서 유전 공학 제품을 비롯한 모든 시료에 적용될 수 있다. 간단히 말해, 질량 스펙트럼은 시료의 정확한 화학 조성을 설명할 것이다.
본 출원의 제 1 양태는 140 내지 190 g/mole 범위, 바람직하게는 150 내지 170 g/mole 범위의 분자량을 갖는 하나 이상의 아미노 화합물의 판단에 관한 것이다.
출원인은 놀랍게도 특정 대사 산물인 에티오닌의 구조 이성질체는 배아가 암컷 또는 수컷 동물로 성장할 수 있을 것인지를 나타내는 지표 역할을 하는 것을 발견하였다. 바람직하게는, 상기 바이오 마커 화합물은 R3SCR1HCR2HCOOH (I)의 구조식으로 나타내며, 여기서 R1은 CH3, H, NH2을 나타내고, R2는 CH3, H, NH2을 나타내고, R3는 -(CH2)2-NH2, 또는 이들의 구조 이성질체를 나타낸다.
보다 바람직하게는, 바이오 마커 화합물은 화학식 C6H13NO2S이다. 보다 바람직하게는, 바이오 마커 화합물은 2-아미노-4-에틸설파닐부탄산 (에티오닌으로도 지칭됨) 등의 아미노산, 또는 4-(메틸설파닐)이소발린, 4-(메틸설파닐)이소발린 (2-아미노-2-메틸-4-(메틸설파닐)부탄산으로도 알려짐), N- 또는 이소프로필시스테인, 3-(메틸설파닐)발린, 4-(메틸설파닐)발린, 3-메틸-2-설파닐-이소발린, 4-(메틸설파닐)이소발린, 2-아미노-3-메틸-4-메틸설파닐-부티르산, 5-(메틸설파닐)노르발린, 2-아미노-3-메틸-3-설파닐펜탄산, 메틸 3-설파닐-발리네이트, 메틸-설포늄 메티오닌, N-메틸-D-메티오닌; 5-아미노-6-설파닐헥산 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 이의 구조 이성질체; 메틸-(2-아미노-4-메틸설파닐)부타노에이트 (메틸 메티오네이트로도 알려져 있음) 등 아미노산 에스테르, 또는 에틸 메틸-시스테이네이트, 이소프로필-시스테이네이트, N-프로필시스테이네이트 등 이의 구조 이성질체, 또는2-[(2-하이드록시에틸)설파닐]-N-메틸프로판아미드; 에틸 호모시스테이네이트, 2-이소프로필-1,2-티아졸리딘 1,1-디옥사이드, 1-아미노-2,2-디에톡시에탄-1-티온, 3-[(2-히드록시에틸)설파닐]-N-메틸프로판아미드, 프로필 2-아미노-3-설파닐프로파노에이트, 2-(메틸아미노)-4-(메틸설파닐)부탄산, 2-[(2-아미노에틸)설파닐]-2-메틸프로판산, 3-[(2-아미노에틸)설파닐]-2-메틸프로판산, 3-[(2-아미노에틸)설파닐]부탄산, 4-[(2-아미노에틸)설파닐]부탄산, 2-아미노-3-(프로필설파닐)프로판산, 2-아미노-3-(프로판-2-일설파닐]프로판산 및 3-[(2-아미노에틸)설파닐]부탄산에서 선택되는 것이 유리하다. 상기 화합물 또는 이성질체는 라세미일 수 있거나 적합한 비율과 양으로 거울상 이성질체 또는 입체 이성질체를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 화합물은 C6H13NO2S의 분자식을 갖고 동위원소 질량 (Mw)은 163.0690이다. 현재, 이는 하기 일반식 I에 따른 구조를 갖는 (3-[(2-아미노에틸)설파닐]부탄산)으로 확인되는 것으로 생각된다.
본 출원인은 배양 기간 동안 요막액에서 비단백질성 아미노산으로 생각될 수 있는 화합물 (I) 또는 구조 이성질체의 농도는 매우 확실하게 난에서 배아의 성별의 결정에 유리하게 사용될 수 있음을 발견하였다. 다른 이점은 본 바이오 마커가 추출 및/또는 휘발하기에 비교적 용이하여, 스테로이드 화합물 등에 비해 상대적으로 용이하게 분석될 수 있다.
(a) 단계는 배아를 포함하는 난과 관련된 물질의 시료를 얻는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시예에 따른 방법 및 장치는 배아 성장 기간 (이의 배양 기간으로도 칭함) 중 임의의 시간에 하나 이상의 특성을 확인하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 실시예는 배아 성장 기간 중 특정일에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 공정은 바람직하게는 (a1) 난액을 포함하는 시료를 제공하는 단계와, (a2) 상기 시료로부터 스펙트럼을 획득하는 단계를 포함한다. 선택적인 단계 (a3)는 바람직하게는 한외 여과 또는 원심 분리와 같은 적합한 방법으로 시료에서 탁도를 제거한다. 상기한 바와 같이, 침습적인 방법은 시료를 직접 취하고, 취한 난액을 분석할 수 있으나, 분석은 이러한 분석법의 효율성과, 난각과 내막은 비천공 상태로 남아있는 사실로 인해 비침습적으로 수행되는 것이 바람직하다. 적합한 방법이 이러한 비침습적 분석을 수행하기 위해 사용될 수 있다.
비침습적 방법이 사용되는 경우, 본 명세서에서 사용되는 용어 "액(fluid)"은 난각을 통과하지 않으면서 난에서 제거될 수 있는 휘발성 화합물을 의미할 수 있다. 이는 유리하게 선택적으로 낮은 압력에서 검출 챔버에 난을 배치하거나 용출된 휘발성 화합물을 적절한 식별 및 정량화 방법에 적용함으로써 유리하게 수행될 수 있다. 여기서, 이온 이동도 분광기 (ion mobility spectrometer, IMS)의 이용을 비롯하여 상술한 질량 분석법 (mass spectroscopic, MS)을 적용할 수 있다.
분석이 침습적으로 수행되는 경우, 전형적으로 난 물질 (egg material) 시료의 추출을 포함한다. 시료는 조류 종의 경우 배아액, 바람직하게는 요막액으로부터 얻는 것이 바람직한데, 이는 배아를 손상할 가능성이 적기 때문이다. 요막액은 전형적으로 조류 배아의 질소 대사 산물에 대한 배설 매체이다.
난의 침투와 난 물질의 침투성 시료 채취에 적합한 방법 및 장치는 예를 들어 US-A-20070137577, WO-A-00/22921 또는 WO-A-99/34667에 개시된다. 이와 같이 채취한 시료는 발달 마커의 검출 및 발달 마커의 상대적 및/또는 절대적 함량의 분석을 가능하게 하는 적절한 프로토콜을 가하는 것이 바람직하다.
요막액은 Hamburger, V and Hamilton, HL (1951), "일련의 정상적인 병아리 배아 발달 단계". Journal of Morphology 88 (1) : 49-92. 에 의해 개시된 바와 같이, 배양 3일경에 형성되기 시작한다. 이 때, 요막은 배양 후 65시간이 지난 후에 짧고 두꺼운 벽으로 이루어진 주머니 형태로 구별할 수 있으며 아직 소포 형태는 아니었다. 72시간 후, 요막은 소포 형태였고, 크기는 다양하였으며, 평균으로 중뇌 크기였는데, 이는 요막과 요막액이 3일째부터 존재하는 것을 나타낸다. 그 결과, 요막액을 검사할 경우 3일째부터 본 방법을 적용할 수 있다.
요막은 배양 후 약 13일째 되는 날에 최대 부피를 갖고 그 후 배양이 계속되면서 수분 손실 및 체액 재흡수로 인해 부피가 감소하지만, 배양 18일째에 상당한 양이 여전히 존재한다.
요막액은 내피막 및 외피막과 장요막에 의해 난각에서 분리된다. 요막액이 배양된 (embryonated) 난의 전체 주변을 둘러싸고 있지만, 요막액은 전형적으로 기포(air cell)를 덮고 있는 막 바로 아래에 있는 난의 상부에 축적된다.
난의 상부에 요막액이 축적되는 것은 조밀한 배아와 난황낭에 의한 중력과 변위로 인한 것이다. 난이 직립되어 있는 동안에 난의 상부를 통해 요막액에서 정확하게 시료를 채취하려고 시도하는 것은 난과 난 사이의 공기 공간(air space)의 다양성으로 인해 어려울 수 있다. 중력은 국부에 요막액을 수집(pool)하기 위해 사용될 수 있다. 난이 장축을 향하게 되면, 요막액은 난각 바로 아래, 난의 상부에 모이게 될 것이다. 난을 세로축으로 배치하면, 요막액은 시료 추출에 유용할 수 있다.
난으로부터 요막액 등 물질의 추출은 난각을 천공하고 세포막을 통해 시료 채취 캐뉼라를 삽입하는 것을 포함하는 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 이어서, 시료 채취될 요막액의 시료가 회수될 수 있는 반면에, 세포막 및/또는 난각은 적절한 밀봉제를 이용하여 능동적으로 밀봉되거나 그 자체로 밀봉될 수 있다.
전술한 바와 같이, 적합한 방법이 비침습적 분석을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 바람직한 실시예에서, 비침습적 방법은 적절한 분석 장치와 연계되는 고상 미세추출 (micro-phase microextraction; SPME)을 포함할 수 있다. SMPE는 액상 (폴리머) 또는 고체 (흡착제)일 수 있는 추출상으로 코팅된 섬유의 사용을 포함하는 고상 추출 시료 채취(sampling)법을 말하며, 액체 또는 기체 상태일 수 있는 여러 종류의 매질로부터 다양한 종류의 분석 물질 (휘발성 및 비휘발성 물질 모두 포함)을 추출한다. 섬유에 의해 추출되는 분석물질의 양은 평형에 도달하는 한 시료의 농도에 비례하며, 단시간의 사전 평형의 경우에는 대류 또는 교반의 도움이 필요하다. 이는 바람직하게는 IMS와 결합되어, 휘발성 물질을 직접 측정 할 수 있다.
여러 공개 공보는 일반적으로 비침습적 방법, 예를 들어, US-A-2011/144473 및 US-A-7950349에서 비침습적 방법의 사용을 개시하고 있지만, 이들 공개 공보는 전체 방출 스펙트럼을 단지 막연하게만 설명하며, 실제 배아의 성별을 선별할 수는 없다. 본 공정은, 난에 특정 성분의 존재를 판단하는 데 있어, 하나 이상의 발달 마커 화합물의 절대량 및 상대량을 선택적으로 찾을 수 있게 하는 2차 미분 스펙트럼 (secondary derivative spectra)을 사용하여 유리하게 이루어질 수 있다는 점에서 개시된 방법과 다르다.
암컷과 수컷 배아로 구성된 난은 분자 수준에서 화학적 조성의 차이를 보인다. 거시적 수준에서 배아는 크기, 모양 및 세포 형태의 차이를 보여준다.
본 발명의 방법은 유리하게는 배아의 성 감별이 가능하다. 바람직하게는, 감별은 배양이 시작된 후 1 내지 15일, 더욱 바람직하게는 2 내지 14일, 더욱 바람직하게는 3 내지 13일, 더욱 더 바람직하게는 4 내지 12일의 기간 동안 수행된다. 바람직하게는, a) 단계는 난의 배양 시작 후 6 내지 12일의 기간 동안 수행된다.
이는 생존이 불가능하거나 원하는 성별이 아닌 난을 배양하는 데 드는 비용을 막을 수 있다. 또한, 난의 실제 발달 단계를 결정할 수 있다. 가축 닭보다 배양기가 더 짧거나 긴 종은 적합하다면, 다른 기간이 적용될 수 있다.
시료는 모든 이익이 있는 생물학적 물질일 수 있지만, 유리하게는 생체 조직이고, 바람직하게는 혈액 또는 혈장과 같은 생체액이다.
(b)단계는 배아의 특성을 나타내는 시료 중 적어도 제 1 바이오 마커의 존재 및 이의 농도에 대한 점수값을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 관찰된 질량 신호와 알려진 바이오 마커의 대조 질량 및 스펙트럼과의 연관 관계에 의존한다. 대조 데이터는 바람직하게는 컴퓨터 서버에 저장되어 컴퓨터 제어 하에 전체 공정이 수행된다. 신호는 본원에 설명된 것과 같이 연산 기능 등을 사용한 비교에 의해 대조 표준과 연관된다.
바람직하게는, 신호는 유사성의 임계값이 성취되는지 여부에 따라 "양성" 또는 "음성"의 특성을 갖는다. 유사성의 임계값을 달성하지 못한 음성 신호는 본 공정에서 배제되고, 양성 신호는 바이오 마커와 매칭되어 생체 시료에서 바이오 마커의 존재를 진단하게 된다.
표준으로 구현하는 경우, 바이오 마커 신호의 채점(scoring)은 시료에 포함된 바이오 마커의 신호와 시료에 첨가된 내부 표준 간의 비로 계산할 수 있다. 여러 바이오 마커가 동일한 방식으로 분석되어 최종 채점 요소를 얻을 수 있다.
바람직하게는, 원자 태그로 표시한 대조 바이오 마커의 하나 이상의 내부 표준을 질량 분석법에 의한 분석 전에 시료에 첨가한다. 이를 통해 바이오 마커 신호 강도를 측정하고 이를 하나 이상의 알려진 내부 표준의 신호 강도와 비교하여 절대 신호 강도를 결정하고 이에 대한 점수를 부여할 수 있다. 그러한 표준은 예를 들어 동위 원소로 표시하여, 절대적인 정량 측면에서 매우 유리할 뿐만 아니라, 분석 판독 값이 매우 정확하게 된다. 선별(screening)에서 보정 시퀀스를 구축하여 시료 내 절대적인 바이오 마커 수준을 측정할 수 있다.
본 발명의 방법은 신호 강도를 정량화하기 위한 대조값(reference)을 제공하기 위해 내부 표준을 사용하는 방법과 내부 표준을 사용하지 않는 방법의 두 가지 방법으로 바람직하게 구현될 수 있다. 따라서, 일 실시예에서, 질량 분석에 의한 분석에 앞서 하나 이상의 내부 표준이 시료에 첨가된다. 내부 표준에는 표지를 붙이는 것이 바람직하다. 유리하게도, 각 바이오 마커 신호에 대한 절대적인 신호 강도는 바이오 마커 신호 강도를 측정하고, 이를 하나 이상의 알려진 내부 표준의 신호 강도와 비교하여, 점수를 부여할 수 있다. 다른 구현예에서, 시료는 내부 표준을 추가하지 않고 처리된다. 이러한 실시예에서, 상대적인 신호 강도는 시료에서 각 바이오 마커 신호 강도와 시료군에 대한 기준 신호 강도 사이의 비를 측정하여 점수가 부여된다.
바람직하게는, 선택된 특성은 부화될 때까지 배아가 완전히 성장하기 위한 생존 가능성 또는 생존 불가능성일 수 있다. 다른 바람직한 선택된 특성은 배양 조건에서 배아가 부화하는 데 필요한 발달 단계와 시간에 대한 예후이다. 바람직하게는, 상기 방법은 자기 공명 영상법, 스펙트럼 공명법, 하나 이상의 적합한 검출기와 결합된 분석 크로마토그래피법, 형광 분광법, 및/또는 바이오 마커 선택성 시약을 포함한 에세이법의 하나 이상을 포함한다.
하나 이상의 바이오 마커의 확인 및 정량은 적합한 방법으로 수행될 수 있다. 유리하게는, 이는 핵 공명법을 포함하는 자기 공명 영상법, UV/VIS, 적외선 또는 라만 분광법을 포함한 스펙트럼 공명법, 적합한 검출기와 결합된 GC 또는 HPLC와 같은 분석법, 형광 분광법, 딥스틱 (dipstick) 법 등 습식 및 건식 방법을 포함하는 효소 결합 면역 흡착 분석, 및 적절히 제조된 선택성 압타머 (aptamer) 또는 유사 선택성 시약을 사용하여 수행된다.
전형적으로, 바람직하게는 난에 발달 마커가 포함되는지의 여부와 이의 절대량 및/또는 상대량을 판단하기 위해 2차 스펙트럼을 이용하여 적외선 또는 라만 분광법을 포함하는 정량적 스펙트럼 공명법이 사용될 수 있다. 여러 공개 공보, 예를 들면 US-A-2011/144473 및 US-A-7950349에는 비침습적 방법의 사용이 개시되지만, 이들 공개 공보는 전체 방출 스펙트럼을 막연하게 설명할 뿐, 사실상 배아의 발달 단계, 생존력 및/또는 성별의 선택은 불가능하다. 본 발명의 방법은 난 내 특정 성분 존재의 판단이 하나 이상의 발달 마커 화합물의 절대량 및 상대량을 선택적으로 찾을 수 있는 2차 미분 스펙트럼을 사용하여 유리하게 이루어질 수 있는 된다는 점에서 개시된 방법과 특히 다르다. 특히, 핵 자기 공명법이 발달 마커의 성질을 결정하는 데 적절하게 사용될 수 있는 반면에, 차등 2차 미분 푸리에 변환 적외선 (differential second-derivative Fourier transform infrared, FTIR) 및 FT-라만 분광법 또는 이들의 조합은 필요한 정확도 및 반복성을 달성하기 위해 유리하게 사용될 수 있으며, 핵 자기 공명법은 발달 마커의 성질을 판단하고, 시스템을 보정하는 기본선을 확립하는 데 적절하게 이용될 수 있다. 본 발명의 방법은 난의 배양이 시작할 때부터 부화될 때까지 배아의 생존력 및/또는 성별 및/또는 바람직하게는 발달 단계를 결정할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 시료는 시료에 포함되는 바이오 마커의 절대량 및 상대량을 확인하고 정량하는 스펙트럼의 검출 및 획득에 적합한 질량 분광 광도법에 의해 분석될 수 있다.
바람직하게는, 시료는 20초 이내, 보다 바람직하게는 15초 이내에 실시간 분석이 가능한 방법으로 분석될 수 있다.
그 예로는 정적 나노-전기 분사 원리를 이용한 직접 주입, 유량 주입 분석 또는 시료 농축을 통한 유량 주입을 들 수 있다. 바람직하게는, 질량 분광 분석은 전자 분무 이온화 (ESI) 질량 분석법, 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화-비행 시간 (MALDI-TOF) 질량 분석법 또는 표면 강화 레이저 탈착 이온화-비행 시간 (SELDI-TOF) 질량 분석법을 포함한다. 질량 분석기는 바람직하게 탠덤 (tandem) 및/또는 조사 모드로 작동한다.
유리하게는, 시료는 질량 분광 분석 전에 처리되어, 고상 추출 (SPE), 기체 크로마토그래피, 단상 또는 다상 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의한 시료 분리를 포함한다.
또는, 바이오 마커 화합물을 외부에서 측정할 수 있는 경우, 상술한 IMS 기술 등을 사용하여 전체 난에 대한 직접적이고 비침습적 측정을 통한 직접적이고 비 침습적인 분석을 수행할 수 있다.
바이오 마커의 바람직한 질량 분광 특성 분석 방법은 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 (MALDI) 및 전기 분무 이온화 (ESI)를 포함한다. 이들 모두 비행 시간 (TOF, time-of-flight) 또는 다른 유형의 질량 분광 센서와 조합하여 바이오 마커의 질량 및/또는 단편화 패턴을 유리하게 결정할 수 있다. 바람직하게는, 질량 분석법은 본원에서 명시한 크로마토그래피 및 다른 분리 기술과 함께 사용될 수 있다. MALDI는 레이저로 시료에 펄스를 가하여 작동한다. 이 처리를 통해 시료는 증발하여 이온화된다. 하전 이온의 분자량(질량)은 TOF 분석기에서 결정된다. 이 장치에서, 전계는 검출기를 향해 하전 분자를 가속화하여, 이온화 단편이 검출기에 도달하는 시간, 즉 비행 시간의 차이는 바이오 마커의 분자량을 나타내며, 작은 화합물은 일찍 검출기에 도달한다. 이 방법은 시료의 질량 프로파일, 즉 혼합물 중 화합물의 분자량과 함량의 프로파일을 형성한다. 그 후, 이러한 프로파일은 바이오 마커 데이터베이스로부터 알려진 바이오 마커를 동정하는 데 사용될 수 있다.
액체 크로마토그래피 (LC/MS/MS)에 대한 ESI-MS 인터페이스를 이용하여 LC 컬럼의 용리 화합물은 질량 분석기의 이온 소스로 도입된다. 미세 바늘에 전압을 가한다. 그 후, 바늘은 액적을 질량 분광 분석기로 분사하고, 액적이 증발하고 바이오 마커 이온은 단편화된 다양한 전하 상태에 대응하여 조성을 결정할 수 있는 곳으로부터 방출된다. 다른 방법으로는, SPE (고상 추출) 또는 기체 크로마토그래피는 질량 분석기와 연결될 수 있다.
특히, SPE/MS/MS는 Agilent Rapidfire MS 장치 (Rapidfire는 Agilent사의 등록 상표), 또는 Phytronics The LDTD (Laser Diode Thermal Desorption) Ion Source (LDTD는 Phytronics사의 등록 상표임)를 사용하는 등 본 방법의 자동화 고처리량 산업 용도에 유용한 것이 확인되었다.
다른 유용한 장치는 전계에서 이온의 기상 이동도를 기준으로 보정된 이온 이동도 분광계 (IMS)를 이용하는 것이 확인되었다. 여기서, 소위 이온화 챔버 내부에서 부분 방전, UV 램프 또는 63Ni 소스로 인해 생성된 물질의 이온은 분자량 및/또는 기하학적 구조에 따라 표류관(drift tube)을 통과하면서 서로 분리된다. 본 장치는 표류관을 통해 이온의 특징적인 표류 시간을 측정하여 물질의 신속한 검출, 식별 및 정량을 매우 높은 감도로 시료당 몇 초 이내에 수행할 수 있다.
바람직하게는, 질량 분광 분석은 전자 분사 이온화 (ESI) 질량 분석법, 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화-비행 시간 (MALDI-TOF) 질량 분석법 또는 표면 강화 레이저 탈착 이온화-비행 시간 (SELDI-TOF) 질량 분석법, SPE/MS/MS, LDTD (레이저 다이오드 열 탈착) 이온 소스 및/또는이온 이동성 센서 (ion mobility sensor, IMS)의 이용을 포함한다.
질량 분광계 시스템은 바람직하게는 전자 분사 이온화 (ESI) MS, 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화-비행 시간 (MALDI-TOF) MS 또는 표면 강화 레이저 탈착 이온화-비행 시간 (SELDI-TOF) MS, 또는 레이저 다이오드 이온화 탈착 (LDID) MS이다. 특히, SPE/MS/MS는 Agilent Rapidfire MS 장치 (Rapidfire는 Agilent사의 등록 상표), 또는 Phytronics LDTD (Laser Diode Thermal Desorption) Ion Source (LDTD는 Phytronics사의 등록 상표)을 사용하는 등 본 방법의 자동화 고처리량 산업 용도에 유용한 것이 확인되었다.
다른 유용한 장치는 전계에서 이온의 기상 이동도를 기준으로 보정된 이온 이동도 분광계 (IMS)를 이용하는 것이 확인되었다. 여기서, 소위 이온화 챔버 내부에서 부분 방전, UV 램프 또는 63Ni 소스로 인해 생성된 물질의 이온은 분자량 및/또는 기하학적 구조에 따라 표류관을 통과하면서 서로 분리된다. 본 장치는 표류관을 통해 이온의 특징적인 표류 시간을 측정하여 물질의 신속한 검출, 식별 및 정량을 매우 높은 감도로 시료 당 몇 초 이내에 수행할 수 있다.
바람직하게는, 시험 시료는 분석 전에 처리된다. 바람직하게는, 시료 처리는 고상 추출 (SPE), 기체 크로마토그래피, 단상 또는 다상 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의한 시료 분리를 포함한다. 바람직하게는, 대조 바이오 마커의 하나 이상의 내부 표준은 분석 전에 시료에 첨가된다. 바람직하게는, 절대 신호 강도는 바이오 마커 신호 강도를 측정하고, 이를 하나 이상의 알려진 내부 표준의 신호 강도와 비교하여 점수를 부여한다. 바람직하게는, 방법은 전적으로 자동식이다.
바람직하게는, 다수의 난을 하나 이상의 배아 특성에 대해 조사한다.
바람직하게는, 상기 방법은 난에 배아가 생존 가능하고 수컷인지, 생존 가능하고 암컷인지, 또는 생존 불가능한지를 판단하는 단계와, 다수의 생존 가능한 암컷 난으로부터 다수의 생존 가능한 수컷 난 및 하나 이상의 생존 불가능한 난을 분리하는 단계를 더 포함한다.
바람직하게는, 상기 방법은 시료로부터 다수의 바이오 마커로부터 적어도 하나의 바이오 마커를 확인하는 단계와, 적어도 하나의 바이오 마커의 농도를 알려진 특성을 갖는 닭의 배아에서의 동일한 바이오 마커의 값과 비교하는 단계를 더 포함하며, 여기서 하나 이상의 바이오 마커의 임계값에 대하여 더 높거나 낮은 농도는, 배아가 수컷 또는 암컷인지, 생존 가능한 배아 또는 생존 불가능한 배아인지 및/또는 배아가 발달 단계인지를 나타낸다.
(c) 단계는 상기 (b) 단계에서 얻어진 점수값 및 양에 임계값을 적용하여 바이오 마커의 존재 여부 및 농도와 관련된 배아의 특성을 확인하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, (c) 단계는 (i) 유사도 척도를 이용하여 연관 신호의 스펙트럼을 연관 대조 바이오 마커의 예상 스펙트럼과 매칭하여 각 관련 바이오 마커 신호 또는 특성을 대조 바이오 마커와 연관시켜, 적어도 하나의 양의 연관 신호를 정의하는 단계와, (ii) 각 양의 연관 신호의 강도를 측정하고 절대 및/또는 상대 신호 강도에 점수를 부여하는 단계와, (iii) 유사도 함수로부터 얻은 점수값에 임계값을 적용하여 연관된 바이오 마커의 존재 및 농도와 관련된 배아에 대한 특성을 판단하는 단계를 포함한다.
본 출원인은 7, 8 또는 9일에 요막액에 50 ng/ml 이상의 3-[(2-아미노 에틸)-설파닐]부탄산이 포함되는 것이 암컷 배아와 연관되며, 50 ng/ml 미만으로 포함되는 바이오 마커는 수컷 배아와 관련되는 점을 발견하였다. 바람직하게는, 7, 8 또는 9일에 3-[(2-아미노에틸)설파닐]부탄산은 수컷 난에 0.1 내지 45 ng/ml, 보다 바람직하게는 1 내지 40 ng/ml의 양이 포함된다. 바람직하게는, 7, 8 또는 9일에 3-[(2-아미노에틸)설파닐]부탄산은 암컷 난에 50.1 내지 150 ng/ml, 보다 바람직하게는 55 내지 140 ng/ml의 양이 포함된다.
단일 바이오 메이커가 이미 원하는 특성에 대해 거의 완벽한 확실성을 부여할 수 있지만, 적어도 제 1 및 제 2 바이오 마커 또는 더 많은 바이오 마커가 유리하게 동시에 검출되고 분석될 수 있다. 적어도 제 1 및 제 2 마커의 절대량 및/또는 상대량은 보다 높은 확실하게 하나 이상의 특성을 결정하는데 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 바람직하게는 난생 종으로부터 다수의 난을 제공하는 단계와, 난을 본 명세서에 개시된 방법으로 처리하여 배아의 특성을 판단하는 단계와, 원하는 특성을 갖는 난을 선택하여 선택된 다수의 난을 형성하는 단계와, 하나 이상의 동물이 부화될 때까지 선택된 난을 배양하는 단계를 포함하는 특정 특성을 갖는 난생 종 동물의 선택적 배양 공정에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 바람직하게는
(i) 난에서 시료를 채취하는 시료 채취 시스템과,
(ii) 스펙트럼을 수집하는 분석 시스템과,
(iii) 상기 분석 시스템에 의해 분석된 하나 이상의 시료로부터 하나 이상의 바이오 마커와 관련된 신호를 프로그램으로 식별하고, 상기 신호를 상기 시료 데이터에 수집된 제어 스펙트럼의 저장 라이브러리 및/또는 내부 표준과 비교하는 분석을 추가로 수행하여 배아 특성을 확인하는 성별 및/또는 생존력 확인 장치와,
(iv) 하나 이상의 배아 특성 정보를 시료 및/또는 분석된 난에 결합하는 출력 수단을 포함하는 난생 종 배아의 성 감별 및 분석 시스템에 관한 것이다.
바람직하게는, 확인 장치는 분석 시스템과 연결되는 전자 장치의 소프트웨어로 구현된다.
또한, 본 발명은 바람직하게는 동물 및/또는 인간의 식품 제조, 화장품, 의료 및/또는 영양 화합물의 제조 및/ 또는 분리, 발효를 통한 메탄 제조 및/또는 고품질의 비료 제조를 위한 본 발명에 따른 방법으로부터 얻을 수 있는 다수의 난의 용도에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "요막액(allantoic fluid)"은 조류의 난으로부터 유래 된 다른 난 물질이 존재하거나 존재하지 않는 요막액을 포함한다. 예를 들어, 요막액이라는 용어는 혈액과 요막액의 혼합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 실시예는 요막액 또는 난의 상면 주변 영역으로부터 물질을 추출하는 것에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 바와 같이 요막액으로부터 물질의 제거는 본 발명에서 가능한 실시예의 일 예로서 제공될 뿐이다. 양막, 난황, 난각, 알부민, 조직, 막 및/또는 혈액을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 물질을 난에서 추출하고 분광 광도 분석으로 분석하여 후술하는 바와 같이 배아의 성을 식별할 수 있다.
필요한 경우, 실제 임의의 배향을 갖는 난에서 물질을 추출할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "소정의 위치(predetermined location)"라는 용어는 난 내부에 일정한 위치 또는 깊이를 나타낸다. 예를 들어, 장치는 난의 일정한 깊이에 및/또는 난의 일정한 위치에 주입될 수 있다. 다른 실시예에서, 주입은, 예를 들어, 난 내부의 배아 또는 배하강의 위치에 관한, 난으로부터 얻을 수 있는 정보를 기준으로 수행될 수 있다.
본 공정에서 발달 마커는 바람직하게는 침습적 또는 비침습적으로 분석될 수 있다.
바람직하게는, 결정은 배양이 시작된 후 1 내지 15일, 더욱 바람직하게는 2 내지 14일, 더욱 바람직하게는 3 내지 13일, 더욱 더 바람직하게는 4 내지 12일의 기간 동안 수행된다. 예를 들어, a) 단계는 바람직하게는 난의 배양 시작 후 6 내지 12일의 기간 동안 수행된다. 또한, 난의 실제 발달 단계가 결정될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 배아 특성의 판단은, 바람직한 경우 시험 배아를 성장시키거나, 배아가 생존하는 경우 난 내(in ovo) 백신 제조와 같은 추가 단계를 거치거나, 예컨대, 고기 생산을 위해 수컷 난을 닭의 수컷 개체군만으로 키우거나, 다른 용도로 이렇게 키운 병아리를 사용하는 비파괴 방법으로 수행된다.
"스펙트럼 비교(comparing the spectra)"라는 용어는 유리하게는 측정된 스펙트럼의 단변량 또는 바람직하게는 다변량 분석 및 조류 배아와 특정 개체군의 연관성(association)의 판단을 포함할 수 있다. 상기 단계는 스펙트럼 데이터의 다변량 통계 분석에 의해 스펙트럼 내 특정 신호 피크의 존재를 판단하는 단계를 포함할 수 있다. 다변량 통계 분석 프로그램은 바람직하게는 주요 구성 성분 분석 프로그램 및/또는 부분 최소 자승 회귀 분석 프로그램을 포함한다. 따라서, 본 발명은 난에서 조류 배아의 성별 및/또는 생존력을 판단하기 위한 다변량 통계 분석 프로그램뿐만 아니라 마이크로 프로세서 구현 프로세스를 포함하는, 난에서 조류 배아의 성별 및/또는 생존력을 판단하는 방법, 장치 및 시스템에 관한 것이다. 바람직하게는, (b) 단계는 임의의 두 시료 간 농도 차이로 인한 강도 영향을 표준화하는 단계를 더 포함한다.
따라서, 비교는 바람직하게는 측정된 스펙트럼의 다변량 분석을 이용하여 시료에 대한 성별 가능성의 추정 및 조류 배아와 특정 개체군의 연관성의 판단을 포함한다. 유리하게도, 이는 부분 최소 자승 판별 분석 (Partial Least Squares Discriminate Analysis, PLS-DA)을 사용하여 수행된다. 상기 공정은 바람직하게는 트레이서(tracer) 화합물 데이터의 수학적 처리를 포함하며, PCA (Principle Component Analysis)와 같은 다변량 분석을 포함하며, 바람직하게는 통제 분석 (supervised analysis), 보다 바람직하게는 PLS-DA (부분 최소 자승-판별 분석), 보다 바람직하게는 직교 PLSDA, 또는 이와 유사한 적합한 통계적 접근법을 따른다. 상기 공정 중 패턴 매칭(matching) 단계는 특정 유사도 척도를 식별한다. 유사도 척도를 이용하여 바이오 마커의 정확한 구조를 확인한다. 확인은 스펙트럼 매칭을 통해 이루어진다. 스펙트럼 매칭은 데이터베이스에서 시료 스펙트럼과 기준 스펙트럼을 비교하여 수행된다. 이 단계에서 양의 유사성을 위해서는 적절한 연관 관계가 정확한 판단을 확인하기 위해 필요하다. 적절한 임계값 및 유사도 척도는 당업자에게 자명할 것이다. 이 과정은 많은 양의 데이터를 관리 가능한 크기로 줄이고 관찰한 데이터 사이의 숨은 관계를 나타내는 잠재적인 변수를 결정하는 데 통계적으로 유도된 모델을 적용하고자 한다.
그 후, 특성 확인 장치는 시료 데이터를 필터링하여 시료 사이에 이익이 있는 클러스터를 식별한다. 클러스터는 시료 간 유사성을 나타내며 성별 프로파일을 식별하는 데 사용된다. 바람직하게는, 분석은 PCA (Principal Component Analysis) 및 PLS-DA를 포함한다. PCA는 수학적 알고리즘을 사용하여 데이터 세트의 차이점과 유사점을 판단한다. PCA는 많은 관련 변수를 “주요 구성 성분”이라고 칭하는 더 적은 수의 비관련 변수로 변환한다. 첫 번째 주요 구성 성분은 가능한 한 많은 데이터 가변성을 설명한다. 각 추가 성분은 가능한 한 데이터의 나머지 가변성을 설명하는 역할을 한다. 수집된 데이터는 행렬로 배열될 수 있으며, PCA는 정방 대칭 행렬과 다변량 제곱합의 "고유값"과 "고유 벡터"를 계산한다. 가장 큰 고유값과 연관된 고유 벡터는 제 1 주요 구성 성분과 동일한 방향을 갖는다. 두 번째로 큰 고유값과 연관된 고유 벡터는 제 2 주요 구성 성분의 방향을 결정한다. 고유값의 합은 정방 행렬의 대각합 (trace)와 같고, 최대 고유 벡터 수는 이 행렬의 행 (또는 열)의 수와 같다. 일단 결정되면, 계산된 고유값의 스크린 좌표(screen plots)를 만들 수 있다. 당업자는 다수의 상이한 알고리즘를 사용하여 고유값과 고유 벡터를 계산할 수 있음을 인식할 수 있을 것이다. 데이터는 i) 그룹 군집(group clustering)을 나타내는 점수 그래프 (scores plot)와 ii) 그룹 군집 역할을 하는 스펙트럼 데이터가 원점으로부터 가장 먼 거리에 위치하는 것을 확인하는 적재 그래프 (loadings plot)의 두 가지 그래프를 사용하여 표시된다.
본 방법은 유리하게는 난에 배아가 생존 가능하고 수컷인지 또는 생존 가능하고 암컷인지의 여부를 판단할 수 있고, 시험 난을 다수의 생존하는 암컷 난으로부터 다수의 생존하는 수컷 난으로 분리하고, 생존 불가능한 난을 분리하여, 우위적으로 수컷 난 또는 우위적으로 암컷 난, 또는 우위적으로 생존 불가능한 난의 선택군을 형성한다. 필요한 경우, 생존 가능한 암컷 또는 수컷 난의 선택군은 배양 및 부화 과정을 거쳐 우위적으로 암컷 또는 수컷 개체군을 형성할 수 있다.
난은 바람직하게는 살아있는 배아 및 수컷 또는 암컷을 포함하는 것으로 확인되는 난에 바이러스 또는 바이러스 유사 물질을 주입함으로써, 백신 제조 등을 위한 다양한 용도로 사용될 수 있다. 그 후, 주입된 난의 적절한 배양 후, 백신 또는 백신계 물질은 배양된 난으로부터 분리될 수 있다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시 예는 난액 시료에 물질의 존재 여부를 확인하는 방법으로서, 일반적으로 0.1 내지 35 ㎕ 범위의 시료면 충분할 수 있다.
유사도 척도는 바람직하게는 양의 연관 신호와 관련된 단편화 패턴 및 보존 지수를 연관시키는 것을 포함한다.
또한, 통계적으로 유의한 유사성은 관련 바이오 마커 동일성 또는 다수의 바이오 마커 동일성으로서 검출 및 등록될 수 있다. 통계적으로 유의한 유사성을 판단하는 것은 방법론의 요구 사항을 충족하기 위해 개발된 알고리즘은 물론 데이터베이스를 사용하는 것을 포함한다.
특히, 이는 새로운 종에 대한 바이오 마커의 효용성을 결정할 때, 통제 다변량 분석, 바람직하게는 부분 최소 자승 판별 분석, PLS-DA 또는 직교 부분 최소 자승 판별 분석을 상기 데이타에 적용하는 것을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 판단되는 특성은 난에서 배아의 성별, 연령, 발달 단계 및/또는 생존력을 포함한다. 산업 용도를 위해서는 다수의 난을 하나 이상의 배아 특성에 대해 조사한다.
본 방법은 바람직하게는 완전히 자동화로 이루어져, 난과 관련된 시료에서의 바이오 마커에 대한 자동화되고 정확한 분석을 제공한다. 따라서, 이 분석법은 질량 분석에 따라 바이오 마커를 확인한다. 유리하게는, 상기 방법은 시료에서 확인된 특정 바이오 마커와 관련된 전하, 질량 및 단편화 패턴의 고유한 특성을 기준으로 데이터 세트의 질량 및 동일성을 여과 및 선별한다.
트레이서(tracer) 화합물 데이터의 분석을 공지된 성의 시료 라이브러리와 연관시킴으로써, 성 감별의 선택성을 유리하게 더욱 향상시킬 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 유리하게는 난에 배아가 생존 가능하고 수컷인지, 또는 생존 가능하고 암컷인지를 판단하는 단계를 포함하며, 다수의 생존 가능한 암컷 난으로부터 다수의 생존 가능한 수컷 난을 분리하여, 우위적으로 수컷 또는 우위적으로 암컷 난의 선택군을 형성할 수 있다. 이와 같이 형성된 생존 가능한 암컷 또는 수컷 난 선택군은 배양 및 부화 과정에 유리하게 적용되어 우위적으로 암컷 또는 수컷 병아리 개체군을 형성할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 각 난으로부터 채취된 시료에서 수백 또는 수천 개의 난 및 수백 또는 수천 개의 바이오 마커를 동시에 분석할 수 있다. 상기 방법은 각 바이오 마커에 대한 질량 및 스펙트럼 데이터를 포함하는 특성과 관련되는 것으로 밝혀진 바이오 마커의 데이터베이스에 따르며, 주어진 시료에서 적합한 소프트웨어에 의해 정확하게 바이오 마커를 식별한다.
또한, 시료에 포함되는 바이오 마커를 선별(screening)하고, 질량 검출기에서 화합물의 도달 시간과 연관 관계가 있는 보유 시간 지수를 기준으로 원하지 않는 신호를 제거함으로써 특정 종에 대한 데이터베이스를 확립할 수 있다. 따라서, 많은 시퀀스를 몇 분 내에 분석할 수 있으며, 높은 신뢰도로 바이오 마커를 식별할 수 있다. 따라서, 이 방법은 자동화가 가능하고, 처리량이 높으며, 상대적으로 숙련되지 않은 기술자에 의해 처리 가능하며, 부화장, 닭 또는 어류 양식장 등 원격 위치에서 사용하기에 적합하다.
사전 분리 절차 없이 시료를 질량 분석할 수 있다. 이러한 실시예에서, 시료는 바람직하게는 예를 들어, 정적 나노-전기 분사 원리, 유량 주입 분석 또는 시료 농축을 통한 유량 주입으로 분석되는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 시료는 질량 분석 전에 처리되고, 바람직하게는 질량 분석기에 로딩하기 전에 시료 성분은 분리된다. 예를 들어, 시료 처리는 단상 또는 다상 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 기체 크로마토그래피 (GC) 또는 고상 추출 (SPE)에 의한 시료 분리를 포함한다.
질량 분석 시스템은 바람직하게는 전자분사 이온화 (ESI) MS, 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화-비행 시간 (MALDI-TOF) MS 또는 표면 강화 레이저 탈착 이온화- 비행 시간 (SELDI-TOF) MS, 또는 레이저 다이오드 이온화 탈착 (LDID) MS이다.
본 발명에 따른 방법은 유리하게 자동화되고 컴퓨터 제어하에 수행된다. 시료 내 바이오 마커의 확인은 바이오 마커에 대한 대조 데이터와의 비교에 의해 이루어진다. 바람직하게는, 다수의 바이오 마커에 대한 대조 질량 및 스펙트럼 데이터는 컴퓨터에 저장된다. 정의된 바이오 마커에 대한 대조 질량 스펙트럼은 바람직하게는 후술된 바와 같이, 실제 데이터 및 군집(clustering) 계산에 의해 얻어진 측정 데이터로부터 얻어진 평균 스펙트럼이다. 바이오 마커는 단독으로 채취되거나, 성별, 연령 및 생존력, 또는 영양 상태 등 상태의 지표로서 객관적으로 측정되고 평가되는 특징을 위해 다른 마커와 함께 채취될 수 있다. 유용한 바이오 마커는 바이오 마커의 존재 또는 수준과, 발달 단계의 존재를 비롯한 상태의 일부 특성 사이에 연관 관계가 있는 경우, 특정 조건 또는 질병과 관련된 모든 식별 가능하고 측정 가능한 지표일 수 있다. 연관 관계는 질적 또는 양적이거나, 질적이면서 동시에 양적일 수 있다. 전형적으로, 바이오 마커는 화합물, 화합물 단편 또는 화합물의 군이다. 이러한 화합물은 단백질 및 펩티드, 핵산, 아미노산, 당 및 다른 화합물을 포함한 유기체에서 발견되거나 유기체에 의해 생성되는 모든 화합물일 수 있다. 바이오 마커는 "성, 연령 및 생존력, 영양 상태 등 상태의 지표로서 객관적으로 측정되고 평가되는 특성"으로 설명할 수 있다. 바이오 마커는 바이오 마커의 존재 또는 수준과, 발달 단계의 존재를 비롯한 상태의 일부 특성 사이에 연관 관계가 있는 경우, 특정 조건 또는 질병과 관련된 모든 식별 가능하고 측정 가능한 지표일 수 있다. 연관 관계는 질적 또는 양적이거나, 질적이면서 동시에 양적일 수 있다. 전형적으로, 바이오 마커는 화합물, 화합물 단편 또는 화합물의 군이다. 또한, 바이오 마커는 배란 모체에 도입된 후 이의 발달 과정 중에 배아에 의해 대사되어, 트레이서 대사 산물을 바이오 마커로서 배출하는 트레이서 전구체 분자의 대사 산물인 화합물을 포함한다.
대조 시료로부터 수집된 대조 스펙트럼 데이터베이스 세트는 바람직하게는 초기에 주어진 닭 경쟁의 특정 성별 시료를 선택하여 구성된다. 전체 라이브러리 또는 데이터베이스는 두 성 모두의 시료를 포함하는 것으로 고려하였다.
구체적으로, 유형 분류(typing)은 자외선 및 가시 범위의 일부에 나타나는 스펙트럼 차이를 기준으로 이루어진다. 현재, 이러한 차이의 근원은 확인되지 않았지만, 분자 수준에서 본질적인 흡수 차이로 인한 것일 수 있다.
또한, 연산 수단은 컴퓨터에 내장된 소프트웨어 수단을 포함한다.
당업자는 예컨대, 요막액, 난황, 난백 및 난각을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는, 다른 난 성분 및 이들의 구성 요소의 특성을 분석하기 위한 시스템 및 방법을 포함하는 추가 실시예를 고려할 수 있음을 인지할 수 있을 것이다.
또한, 본 발명은 난 선택군과, 부화 후 상기 공정에 의해 수득 가능한 병아리 또는 병아리 개체군에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 난생 종 (보다 일반적인 용어로, 닭에 제한되지 않거나, 보다 구체적으로, 갈루스 갈루스 도메스티쿠스(Gallus Gallus Domesticus) 에 제한되지 않음)의 배아의 난 에서의 성별, 생존력 및/또는 발달 단계를 결정하는 방법, 시스템 및 식품에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 난생 종의 배아의 난에서 성별, 생존력 및/또는 발달 단계를 결정하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 또한 수컷 난 및 암컷 난의 선택 및 선택된 난을 사용한 살아있는 동물군의 생산에 관한 것이다. 난생 동물은 모체 내 배아가 거의 또는 전혀 발달되지 않고 알을 낳는다. 이는 대부분의 어류, 양서류, 파충류, 모든 조류, 및 대부분의 곤충, 연체류 및 거미류의 생식 방법이다. 난생 동물과 이들의 난의 사육은 전 세계적인 단백질 공급을 지속적으로 높이는 영역일 뿐만 아니라, 백신 제조 등과 같은 다양한 대규모 산업 공정을 충족시킨다. 현재, 난생 동물의 배양에 가장 중요한 과정은 가금류 등 조류 종의 사육과, 어류, 갑각류 및 연체류 등 수생 생물의 양식, 즉 사육을 포함한다.
또한, 본 발명은 a. 식품에 첨가제로 사용하기에 적합한 적어도 하나의 트레이서 전구체 화합물을 포함하는 트레이서 전구체 물질을 포함하는 식품을 배란 모체에 제공하는 단계와, b. 상기 트레이서 전구체 화합물의 대사에 소요되는 적절한 기간 동안 난을 배양하여 적절한 양의 적어도 하나의 트레이서 화합물을 형성하는 단계와, c. 난 또는 난의 시료를 분석하여 하나 이상의 트레이서 화합물의 존재 및 양을 판단하는 단계와, d. (c) 단계에서 수득된 데이터로부터 난생 배아의 성별, 생존력 및/또는 발생 단계를 판단하는 단계를 포함하는 난 내 난생 배아의 성별, 생존력 및/또는 발달 단계를 확인하는 방법에 관한 것이다.
대부분의 난생 종의 수정란에서는 수컷과 암컷 동물이 거의 동등한 분포로 출산되는 경향이 있다. 그러나, 여러 가지 이유로 부화장 관리에서 다양한 성격, 특히, 성별에 따라 동물을 분리하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 상업적인 국내 닭과 계란 생산의 경우, 수컷 병아리의 배양 및 사육은 매우 바람직하지 않으며, 매년 수십억 마리의 수컷 병아리가 도태(culling)되고 있다. 새우 생산에서는 난의 성숙을 유도하는 과정이 필요하기 때문에 여성 개체군만을 배타적으로 키우는 것이 바람직하다.
현재, 두 경우 모두, 부화된 동물의 혼합 개체군은 청소년 동물의 시각적 평가에 의해 성별이 감별되며, 때로는 청소년에게 적합한 특성이 없으면, 성인 개체의 경우도 그러하다. 어느 경우에나 고도로 숙련된 조작자가 필요한 시간이 매우 많이 소요되는 과정이며 동물은 일반적으로 심한 스트레스를 받는다. 또한, 성인 동물의 성을 감별하는 곳에서는, 전체 개체군을 최소 연령까지 사육할 필요가 있으며, 사육된 동물의 절반만이 분리 후 증식에 사용된다. 예를 들어, 담수 새우 M. Rosenbergii로부터 보고된 바와 같이, 수컷 개체가 존재하여 식인 풍습과 영농 밀도 감소 등에 따른 생산성이 감소하는 경우 다른 문제가 발생할 수 있다.
또한, 어류 양식에서 어류의 성을 감별하면 수컷 또는 암컷의 단일 개체군을 우위적으로 사육하여, 개체군의 성장과 건강을 목표로 할 수 있으며, 보다 상세하게는, 현재 역돔 (Nile tilapia)에서 시행되고 있는 바와 같이, 바람직하게는 수컷 개체군만이 사육된다. 다시 말하면, 대부분의 어류는 청소년 후기나 성인기에서만 육안 검사를 통해 성을 감별할 수 있기 때문에 "초수컷(super male)" 잡종으로 복잡한 번식 패턴과 특정 개체군을 확립해야 하며, 이는 유전 장애의 발병을 개선하는 경향이 있고, 유전적 소규모 인구 확산과 관련된 특정 질병에 걸리기도 쉽다.
또한, 일부 난은 수정되지 않거나 배양기 초기에 생존 가능한 배아를 포함하지 않아 특히, 가금류 난을 위한 부화장에서 배양기의 능력이 크게 저하된다.
결과적으로, 조기 성별 선택이 가능할 경우 적어도 부화력(incubation capacity)이 최소한 두 배 이상 필요하며, 수컷 또는 암컷 배아만을 우선적으로 선택할 수 있게 된다.
따라서, 필요한 에너지와 다른 자원의 양을 줄여 환경 측면에서 가치가 높을 수 있지만, 도태를 통한 불필요한 동물의 제거는 물론 갓 부화한 동물의 스트레스의 감소도 마찬가지로 가능할 것이다. 배양 단계 전에 조류 배아의 성별을 결정할 수 있는 조기 방법을 이용할 수 있다면, 부화장의 능력을 크게 증진할 수도 있다. 또 다른 장점은 본 방법으로 미수정 난 및/또는 생존 불가능한 난으로부터 생존 가능한 배아를 선별할 수 있다면, 부화 과정의 효율을 더욱 높일 수 있다는 점이다.
어류 또는 새우의 경우, 다양한 PCR 또는 항체 기반 방법이 공개되었다. 그러나, 이러한 방법은 비용이 다소 비싸고 복잡하다.
따라서, 난생 동물 배아의 난 에서의 성별, 발달 단계 및/또는 생존력을 비파괴 적으로 판단할 수 있는 보다 신속하고 간편한 방법이 여전히 필요하다.
따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 (a) 배아를 포함하는 난 관련 물질의 시료를 질량 분광 분석하고 및 보유 시간 지수와 대응 질량과 검출된 각 신호에 대한 질량을 기록하는 단계와, (b) 난생 종에 특정된 바이오 마커 질량의 대조 데이터베이스에 각 신호에 대응하는 질량을 연관시켜 하나 이상의 신호와 하나 이상의 대조 바이오 마커 사이의 연관 관계를 형성하는 단계와, (c) 유사도 척도를 이용하여 각 연관 신호의 질량 스펙트럼을 연관 대조 바이오 마커의 질량 스펙트럼과 매칭시켜 각 연관 신호와 대조 바이오 마커 간의 연관 관계를 확인하여 적어도 하나의 양의 연관 신호를 정의하는 단계와, (d) 각 양의 연관 신호의 강도를 측정하고 그 절대 또는 상대 신호 강도에 점수를 부여하는 단계와, (e) 상기 판별 함수로부터 얻은 점수값에 임계값을 적용하여 연관 바이오 마커의 존재 및 농도와 관련된 배아에 대한 특성을 판단하는 단계를 포함하는 난에서 난생 종의 배아의 특징을 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 부화장에서 사용하기 위한 장치를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 부화장 또는 양식장과 같은 원격지에서 난의 실시간 온라인 분석을 수행할 수 있는 시스템을 제공하는 것이다. 이러한 목적과 다른 목적은 본 발명의 장치 및 방법에 의해 해결된다. 따라서, 본 발명은 질량 분석기를 이용하여 종의 알려진 성별을 갖는 다수의 난으로부터 다수의 시료를 분석하여 바이오 마커 패턴을 확립할 수 있는 다수의 질량 스펙트럼을 얻는 단계와, 상기 질량 스펙트럼에서 패턴을 인식하여 바이오 마커 패턴을 얻는 단계와, 상기 바이오 마커 패턴을 기준으로 배아의 적어도 하나의 특성과 관련된 바이오 마커 및 바이오 마커 수준을 판단하는 단계를 포함하는 난에서 난생 종의 배아의 특징과 관련된 하나 이상의 바이오 마커를 확인하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 공정은 우위적으로 수컷 또는 우위적으로 암컷 난의 선택군을 형성하는 다수의 생존 가능한 암컷 난에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 공정은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 청소년 동물 개체군에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 공정은 동물 및/또는 인간 식품의 제조 공정, 화장품, 의료 및/또는 영양 화합물의 제조 및/또는 분리 공정, 발효를 통한 메탄 제조 공정, 백신 제조 공정 및/또는 고품질 비료 제조 공정으로부터 얻을 수 있는 다수의 난의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 공정은 또한 본 방법을 수행하기 위한, 바람직하게는 완전 자동화 장치를 포함하는 난생 동물 배아의 성 판별 및 분석 시스템에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 식품에 첨가제로 사용하기에 적합한 적어도 하나의 트레이서 전구체 화합물을 포함하는 트레이서 전구체 물질을 포함하는 식품을 배란 모체에 제공하는 단계와, (b) 상기 트레이서 전구체 화합물의 대사에 소요되는 적절한 기간 동안 난을 배양하여 적절한 양의 적어도 하나의 트레이서 화합물을 형성하는 단계와, (c) 난 또는 난의 시료를 분석하여 하나 이상의 트레이서 화합물의 존재 및 양을 판단하는 단계와, (d) (c) 단계에서 수득된 데이터로부터 난생 배아의 성별, 생존력 및/또는 발생 단계를 판단하는 단계를 포함하는 난에서 난생 배아의 성별, 생존력 및/또는 발달 단계를 확인하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 배아의 성별, 생존력 및/또는 발달 단계를 판단하기 위한 식품과, 트레이서 전구체 화합물을 동물 식품에 사용하기 위한 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 성별 확인 장치가 분광 시스템과 연결되는 (interfaced) 전자 장치에서 소프트웨어로 구현되는 시스템에 관한 것으로, 바람직하게는 성별 확인 장치는 컴퓨터에 내장된 소프트웨어 수단을 포함한다.
도 1에서 A)는 단일 피쳐(feature)에 대한 로지스틱 회귀 분류 모델(Logistic Regression Classification Model)을 나타낸다. 단일 예측 모델에 대하여 모든 측정된 특성을 평가하였으며, 가장 높은 정확도는 9일부터 90%보다 높은 정확도를 제공하는 Feature 1599를 사용하여 관찰하였고, B)는 2 피쳐(feature)의 로지스틱 회귀를 나타낸다. 로지스틱 회귀 모델에 대하여 모든 측정될 수 있는 특성의 쌍을 평가하였다. 측정의 견고성(robustness)을 확인한 후에, 10일부터 95%보다 높은 정확도를 제공하는, Feature 1599와 507을 조합하여 가장 우수한 성능을 얻었다.
따라서, 본 방법은 성별과 같은 특성의 상대적인 판단에 관한 것이다. 이는 다른 특성을 부가하고, 예를 들어, 이상치 (outliers)나 애매한 특성이 있는 난을 제거함으로써 정확도를 크게 높일 수 있다.
도 3은 수컷 (암회색) 및 암컷 (연회색) 시료로부터 850초에 추출된 220 내지 145 범위의 다양한 질량 피크를 갖는 화합물의 크로마토그램을 나타낸다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술을 가진 사람이 통상적으로 이해할 수 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위한 목적으로만 제시될 뿐, 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 많은 난생 종은 상업적으로 사육된다.
"양식 (Aquaculture)"은 통제 조건에서 담수 및 염수 동물을 기르는 것을 포함하며, 야생 어류 및 기타 바다 동물을 수확하는 상업적인 어업과 대조될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "어류(fish)"는 모든 사지가 없는 아가미를 지니는 수생 두개 동물을 포함한다. 해양 어류 또는 단수(sweetwater) 어류를 구분하지 않고, 현재 먹장어류, 칠성장어류, 연골어류 및 경골어류 등이 이러한 정의에 포함된다. 상업적으로 양식되는 중요한 어류종 또는 어류과는 예컨대, 바브(barbs), 바벨 (barbels), 메기 (catfishes), 메콩메기류 (Pangasiidae), 초 잉어 (Grass carp), 일반 잉어, 대두 잉어 (Bighead carp), 은 잉어 (Silver carp), 카틀라 (Catla), 크루시안 잉어 (Crucian carp) 등 잉어, 참다랑어 및 이들의 동족류; 대서양 연어, 바다 송어(sea trout) 및 무지개 송어(rainbow trout) 등 연어, 송어, 곤들메기 (chars), 민물 송어 (freshwater whitefishes), 및 살기 (graylings)를 비롯한 연어과 (Serranidae); 폐어 (barramundi) 또는 아시아 농어, 일본 농어, 유럽 농어와 같은 바리과 (Serranidae); 선농어과; 감성돔과 도미와 같은 도미과 (Sparidae); 역돔 (Nile or Mozambique tilapia) 와 같은 키크리과 (cichlidae), 대서양 또는 벨루가 철갑 상어와 같은 철갑 상어과 (Acipenseridae)를 포함한다.
본 명세서에서 "갑각류(Crustaceans )"는 게, 바다 가재, 왕새우, 새우 등과 같은 친숙한 동물을 포함하는 별개의 성별을 갖고 유성 생식하는 절지 동물군을 의미한다.
"게(crabs)"는 게 (Brachyura) 목의 십각 갑각류(decapod crustaceans)이다.
본 명세서에서 "새우 (shrimp 및/또는 prawn)"는 염수 또는 기수에서 양식된 보리새우과 (Penaeidae), 바람직하게는, 자이언트 타이거 새우, 홍다리 얼룩 새우 (P. monodon), 태평양 흰다리 새우 (Pacific white shrimp), 흰다리 새우(Litopenaeus)를 포함한 흰다리 새우 (Penaeus) 속; 서양 청새우 (Western blue shrimp, P. stylirostris); 중국 백새우 (P. chinensis), 보리 새우 (Kuruma shrimp, P. japonicus), 인도 흰새우 (Indian white shrimp, P. indicus), 바나나 새우 (Banana shrimp, P. merguiensis) 및 기타 생이하목(Caridea)과 또는 수상새아목(Dendrobranchiata)과; 및 Macrobrachium rosenbergii. M. nipponense 및 M. malcolmsonii 등 담수 양식된 갑각류; Procambarus clarkii와 같은 가재상과 (Astacoidea) 및 남방가재상과(Parastacoidea) 속의 가재류;가시발새우과 (Nephropidae 및 Homaridae) 뿐만 아니라 닭새우과 (Palinuridae)의 가시 바다 가재 등 모든 양식가능한 갑각류를 말한다.
본 명세서에서, "연체류(mollusks)"은 별개의 성별을 갖고, 수정은 체외에서 이루어지는 오징어, 갑오징어, 낙지와 같은 두족류 연체류와, 다판강 (polplacophora), 굴족강 (scaphopods) 및 뿔조개 (tusk shells)과 같은 쌍각류 조개를 포함하는 연체류목 (Mollusca order)으로 알려진 무척추 동물의 대문 (large phylum)을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "조류(avian)" 및 "새 (bird)"는 모든 조류 종의 수컷 또는 암컷을 포함하지만, 주로 알 또는 고기를 위해 상업적으로 사육하는 가금류를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, "조류(avian)"및 "새 (bird)"라는 용어는 특히 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기, 비둘기, 타조, 에뮤(emu) 및 꿩을 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용된 용어 "배양(incubation)"은 새와 같은 난생 동물이 난을 부화시키고, 성인의 소관을 떠난 후에 난에 배아가 성장하는 과정을 의미한다. 본 발명의 배양 기간이란 조류의 성장이 지연되지 않는다면, 부화 즉, 조류의 출현까지 배양기에서 부화기로 취급 또는 이동을 포함하는 취소(brooding)를 모방한 조건이 가해지는 동안에 중단되지 않은 시간을 말한다.
본 명세서에 사용된 용어 "난 내에서 (in ovo)"는 부화 전 난에 포함된 배아를 의미한다. 본 발명은 조류, 어류, 연체류, 파충류 또는 갑각류의 난으로 구현될 수 있는 바, 이들은 (가축용) 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기 및 꿩 등 조류의 난, 잉어, 연어 또는 역돔 등 어류의 난, 새우의 난, 및 연체류의 난을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어인 "주입 (injection 및 injecting)"는 난 또는 배아에 물질을 전달 또는 방출하는 방법, 난 또는 배아로부터 물질(즉, 시료)을 제거하는 방법 및/또는 난 또는 배아에 검출 장치를 삽입하는 방법을 포함하는 난 또는 배아에 장치 (전형적으로는, 신장형 장치)를 삽입하는 방법을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "질량 분석법(mass spectrometry)"은 질량을 기준으로 이온을 분류하는 분석 기술을 의미한다. 질량 분석법은 일반적으로 여러 상황에서 화학 분석에 사용되며, 복잡한 석유 혼합물에서 유전 공학 제품을 비롯한 모든 시료에 적용될 수 있다. 간단히 말하면, 질량 스펙트럼은 시료의 정확한 화학 조성을 설명할 것이다.
질량 스펙트럼은 질량-대-전하 비의 함수로서 이온 신호를 나타내는 그래프이다. 이 스펙트럼은 시료의 원소 또는 동위 원소 특성과, 입자 및 분자의 질량을 결정하고 분자의 화학 구조를 확인하는 데 사용된다. 질량 분석법은 화학 화합물을 이온화하여 하전 분자 또는 분자 단편을 생성하고 이들의 질량 대 전하 비를 측정한다.
전형적인 MS 과정에서, 고체, 액체 또는 기체일 수 있는 시료는 예를 들어 전자로 충격을 가하여 이온화된다. 이로 인해, 일부 분자가 하전된 단편으로 분해될 수 있다. 그 후, 이들 이온은 전형적으로는, 이를 가속하고 전기장 또는 자기장을 가하여, 질량-대-전하 비에 따라 분리된다. 동일한 질량-대-전하 비율을 갖는 이온은 동일한 양으로 편향된다.
이온은 전자 증배기(electron multiplier)와 같은 하전 입자를 검출할 수 있는 적합한 메커니즘에 의해 검출된다. 결과는 질량-대-전하 비의 함수로서 검출된 이온의 상대적 양의 스펙트럼으로 표시된다. 시료에서 원자 또는 분자는 알려진 질량을 식별된 질량과 연관시키거나 특징적인 단편화 패턴을 통해 동정할 수 있다. 이러한 이유에서, 질량 분석법은 적절한 바이오 마커를 확인하고 검출하기 위해 적용된다. 질량 분석법 (MS)은 매우 높은 감도로 분자의 고유한 특성인 질량을 측정하기 때문에 가치있는 분석 기술이다. 따라서, MS는 광범위한 바이오 마커 분자와 광범위한 시료 물질을 측정하는 데 사용할 수 있다. 적절한 시료 제조는 MS 신호 생성과 스펙트럼 분해능 및 감도에 중요한 것으로 알려져 있다. 따라서, 시료 제조는 분석의 전반적인 실행 가능성과 감도를 결정하는 중요한 영역이다.
바이오 마커의 바람직한 질량 분광 특성 분석 방법은 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 (MALDI) 및 전기 분무 이온화 (ESI)를 포함한다. 이들 모두 비행 시간 (TOF, time-of-flight) 또는 다른 유형의 질량 분광 센서와 조합하여 바이오 마커의 질량 및/또는 단편화 패턴을 유리하게 결정할 수 있다. 바람직하게는, 질량 분석법은 본원에서 명시한 크로마토그래피 및 다른 분리 기법과 함께 사용될 수 있다.
MALDI는 레이저로 시료를 펄스를 가하여 작동한다. 이 처리를 통해 시료는 증발하여 이온화된다. 하전 이온의 분자량 (질량)은 TOF 분석기에서 결정된다. 이 장치에서 전계는 검출기를 향해 하전 분자를 가속화하여, 이온화 단편이 검출기에 도달하는 시간, 즉 비행 시간의 차이는 바이오 마커의 분자량을 나타내며, 작은 화합물은 일찍 검출기에 도달한다.
이 방법은 시료의 질량 프로파일, 즉 혼합물 중 화합물의 분자량과 양을 형성한다. 그 후, 이러한 프로파일은 바이오 마커 데이터베이스로부터 알려진 바이오 마커를 동정하는 데 사용될 수 있다.
액체 크로마토그래피 (LC/MS/MS)에 대한 ESI-MS 인터페이스를 이용하여 LC 컬럼의 용리 화합물은 질량 분석기의 이온 소스로 도입된다. 미세 바늘에 전압을 가한다. 그 후, 바늘은 액적을 질량 분광 분석기로 분사하고, 액적이 증발하고 바이오 마커 이온은 단편화된 다양한 전하 상태에 대응하여 조성을 결정할 수 있는 곳으로부터 방출된다. 다른 방법으로는, SPE (고상 추출) 또는 기체 크로마토그래피는 질량 분석기와 연결될 수 있다. 특히, SPE/MS/MS는 Agilent Rapidfire MS 장치 (Rapidfire는 Agilent사의 등록 상표), 또는 Phytronics LDTD (Laser Diode Thermal Desorption) Ion Source (LDTD는 Phytronics사의 등록 상표)를 사용하는 등 본 방법의 자동화 고처리량 산업 용도에 유용한 것이 확인되었다.
텐덤 질량 분석 (tandem mass spectrometry, MS/MS)은 표적 가스와의 충돌을 통해 전구체 이온을 활성화시키고 하전된 중성 단편을 생성할 수 있다. 단편 이온뿐만이 아니라 이들의 강도의 성질은 전구체 이온의 구조를 나타내므로, 미지의 분석물의 확인을 위한 유용한 정보를 부여할 뿐만 아니라, 다른 종류의 분석물에 대한 유용한 선별 기법을 제공할 수 있다. 다중 충돌을 통한 활성화는 활성화 시간을 연장하고, 보다 높은 에너지가 전구체 이온에 증착되게 한다. 충돌 가스 압력이 높을수록 충돌 완화 속도가 빨라진다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 배아 특성의 판단은, 바람직한 경우에 시험 배아를 성장시키거나, 배아가 생존하는 경우에 난 내 백신 제조와 같은 추가 단계를 거치는 비파괴적인 방법으로 수행된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "요막액(allantoic fluid)"는 조류의 난으로부터 유래 된 다른 난 물질의 존재하거나 존재하지 않는 요막액을 포함한다. 예를 들어, 요막액이라는 용어는 혈액과 요막액의 혼합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 실시예는 요막액 또는 난의 상면 주변 영역으로부터 물질을 추출하는 것에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 바와 같이 요막액으로부터 물질의 제거는 본 발명에서 가능한 실시예의 일 예로서 제공될 뿐이다. 양막, 난황, 난각, 알부민, 조직, 막 및/또는 혈액을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 물질을 난에서 추출하고 분광 광도 분석으로 분석하여 후술하는 바와 같이 배아의 성을 식별할 수 있다.
필요한 경우, 실제 임의의 배향을 갖는 난에서 물질을 추출할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "소정의 위치(predetermined location)"라는 용어는 난 내부에 일정한 위치 또는 깊이를 나타낸다. 예를 들어, 장치는 난의 일정한 깊이에 및/또는 난의 일정한 위치에 주입될 수 있다. 다른 실시예에서, 주입은, 예를 들어, 난 내부의 배아 또는 배하강의 위치에 관한, 난으로부터 얻을 수 있는 정보를 기준으로 수행될 수 있다.
또는, 특히 연체류, 어류 또는 새우의 난의 경우, 조류의 난에 비하여 상대적으로 작은 크기뿐만 아니라 높은 투명도를 가지므로, 난 전체에 대한 직접적, 비침습적 측정을 통한 직접적이고 비침습적 분석이 가능하다.
"스펙트럼 비교(comparing the spectra)"라는 용어는 유리하게는 측정된 스펙트럼의 단변량 또는 바람직하게는 다변량 분석 및 조류 배아와 특정 개체군의 연관성(association)의 판단을 포함할 수 있다. 상기 단계는 스펙트럼 데이터의 다변량 통계 분석에 의해 스펙트럼 내 특정 신호 피크의 존재를 판단하는 단계를 포함할 수 있다. 다변량 통계 분석 프로그램은 바람직하게는 주요 구성 성분 분석 프로그램 및/또는 부분 최소 자승 회귀 분석 프로그램을 포함한다. 따라서, 본 발명은 난에서 조류 배아의 성별 및/또는 생존력을 판단하기 위한 다변량 통계 분석 프로그램뿐만 아니라 마이크로 프로세서 구현 프로세스를 포함하는, 난에서 조류 배아의 성별 및/또는 생존력을 판단하는 방법, 장치 및 시스템에 관한 것이다.
따라서, 상기 비교는 바람직하게는 측정된 스펙트럼의 다변량 분석을 이용하여 시료에 대한 성별의 가능성의 추정 및 조류 배아와 특정 개체군의 연관성의 판단을 포함한다. 유리하게도, 이는 부분 최소 자승 판별 분석 (Partial Least Squares Discriminate Analysis, PLS-DA)을 사용하여 수행된다.
상기 공정은 바람직하게는 트레이서(tracer) 화합물 데이터의 수학적 처리를 포함하며, PCA (Principle Component Analysis)와 같은 다변량 분석을 포함하며, 바람직하게는 통제 분석 (supervised analysis), 보다 바람직하게는 PLS-DA (부분 최소 자승-판별 분석), 보다 바람직하게는 직교 PLSDA, 또는 이와 유사한 적합한 통계적 접근법을 따른다.
상기 공정 중 패턴 매칭(matching) 단계는 특정 유사도 척도를 식별한다. 유사도 척도를 이용하여 바이오 마커의 정확한 구조를 확인한다. 확인은 스펙트럼 매칭을 통해 이루어진다. 스펙트럼 매칭은 데이터베이스에서 시료 스펙트럼과 기준 스펙트럼을 비교하여 수행된다. 이 단계에서 양의 유사성을 위해서는 적절한 연관 관계가 정확한 판단을 확인하기 위해 필요하다. 적절한 임계값 및 유사도 척도는 당업자에게 자명할 것이다.
이 과정은 많은 양의 데이터를 관리 가능한 크기로 줄이고 관찰한 데이터 사이의 숨은 관계를 나타내는 잠재적인 변수를 결정하는 데 통계적으로 유도된 모델을 적용하고자 한다.
그 후, 성별 확인 장치는 시료 데이터를 필터링하여 시료 사이에 이익이 있는 클러스터를 식별한다. 클러스터는 시료 간 유사성을 나타내며 성별 프로파일을 식별하는 데 사용된다. 바람직하게는, 분석은 PCA (Principal Component Analysis) 및 PLS-DA를 포함한다.
PCA는 수학적 알고리즘을 사용하여 데이터 세트의 차이점과 유사점을 판단한다. PCA는 많은 관련 변수를 "주요 구성 성분"이라고 칭하는 더 적은 수의 비관련 변수로 변환한다. 첫 번째 주요 구성 성분은 가능한 한 많은 데이터 가변성을 설명한다. 각 추가 성분은 가능한 한 데이터의 나머지 가변성을 설명하는 역할을 한다. 수집된 데이터는 행렬로 배열될 수 있으며, PCA는 정방 대칭 행렬과 다변량 제곱합의 "고유값"과 "고유 벡터"를 계산한다.
가장 큰 고유값과 연관된 고유 벡터는 제 1 주요 구성 성분과 동일한 방향을 갖는다. 두 번째로 큰 고유값과 연관된 고유 벡터는 제 2 주요 구성 성분의 방향을 결정한다. 고유값의 합은 정방 행렬의 대각합 (trace)와 같고, 최대 고유 벡터 수는 이 행렬의 행 (또는 열)의 수와 같다. 일단 결정되면, 계산된 고유값의 스크린 좌표(screen plots)를 만들 수 있다. 당업자는 다수의 상이한 알고리즘를 사용하여 고유값과 고유 벡터를 계산할 수 있음을 인식할 수 있을 것이다. 데이터는 i) 그룹 군집(group clustering)을 나타내는 점수 그래프 (scores plot)와 ii) 그룹 군집 역할을 하는 스펙트럼 데이터가 원점으로부터 가장 먼 거리에 위치하는 것을 확인하는 적재 그래프 (loadings plot)의 두 가지 그래프를 사용하여 표시된다.
본 발명에 따른 공정은 바람직하게는 (a1) 난액을 포함하는 시료를 제공하는 단계와, (a2) 상기 시료로부터 스펙트럼을 획득하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, (b) 단계는 임의의 두 시료 사이의 농도 차이로 인한 강도 영향을 표준화하는 단계를 더 포함한다. 선택적인 단계 (a3)는 바람직하게는 한외 여과 또는 원심 분리와 같은 적합한 방법에 의해 시료로부터 탁도를 제거한다.
바람직하게는, 배아는 조류 배아, 파충류 배아, 갑각류 배아, 어류 배아 또는 연체류 배아이다. 가장 바람직하게는, 조류 배아는 가금류 배양은 매우 중요하고 시료를 채취하는 난은 상대적으로 크기 때문에 시험을 거치게 된다.
본 방법은 유리하게는 난에 배아가 생존 가능하고 수컷인지 또는 생존 가능하고 암컷인지의 여부를 판단할 수 있고, 시험 난을 다수의 생존하는 암컷 난으로부터 다수의 생존하는 수컷 난으로 분리하고, 생존 불가능한 난을 분리하여, 우위적으로 수컷 난 또는 우위적으로 암컷 난, 또는 우위적으로 생존 불가능한 난의 선택군을 형성한다. 필요한 경우, 생존 가능한 암컷 또는 수컷 난의 선택군은 배양 및 부화 과정을 거쳐 우위적으로 암컷 또는 수컷 개체군을 형성할 수 있다.
본 발명의 구성과 구현 방법에 대한 특성과 다른 목적 및 이의 장점은 첨부된 도면을 참고로 하여 후술되는 설명으로부터 보다 잘 이해될 수 있을 것이다. 도면은 예시하고 설명하기 위한 목적으로 제공되는 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아님을 명백하게 이해할 수 있을 것이다. 본 발명에 의해 달성되는 목적 및 다른 목적과 이점은 첨부된 도면과 함께 병합되어 후술되는 설명으로부터 보다 명백해질 것이다.
본 발명의 실시예에 따른 방법 및 장치는 배아의 발달 기간 (배양 기간이라고도 함) 중 임의의 시간에 난의 하나 이상의 특성을 확인하는 데 이용될 수 있다. 본 발명의 실시예는 배아의 발달 기간 중 특정일에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 신호 강도를 정량화하기 위한 기준(reference)을 제공하기 위해 내부 표준을 사용하는 방법과 내부 표준을 사용하지 않는 방법의 두 가지 방법으로 구현될 수 있다. 따라서, 일 실시예에서, 질량 분석에 의한 분석에 앞서 하나 이상의 내부 표준이 시료에 첨가된다. 내부 표준에는 표지를 붙이는 것이 바람직하다. 유리하게도, 각 바이오 마커 신호에 대한 절대적인 신호 강도는 바이오 마커 신호 강도를 측정하고, 이를 하나 이상의 알려진 내부 표준의 신호 강도와 비교하여, 점수를 부여할 수 있다. 다른 구현예에서, 시료는 내부 표준을 추가하지 않고 처리된다. 이러한 실시예에서, 상대적인 신호 강도는 시료에서 각 바이오 마커 신호 강도와 시료군에 대한 기준 신호 강도 사이의 비를 측정하여 점수가 부여된다.
유사도 척도는 바람직하게는 양의 연관 신호와 관련된 단편화 패턴 및 보존 지수를 연관시키는 것을 포함한다.
또한, 통계적으로 유의한 유사성은 관련 바이오 마커 동일성 또는 다수의 바이오 마커 동일성으로서 검출 및 등록될 수 있다. 통계적으로 유의한 유사성을 판단하는 것은 방법론의 요구 사항을 충족하기 위해 개발된 알고리즘은 물론 데이터베이스를 사용하는 것을 포함한다.
특히, 이는 새로운 종에 대한 바이오 마커의 효용성을 결정할 때, 통제 다변량 분석, 바람직하게는 부분 최소 자승 판별 분석, PLS-DA 또는 직교 부분 최소 자승 판별 분석을 적용하는 것을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 판단되는 특성은 난에서 배아의 성별, 연령, 발달 단계 및/또는 생존력을 포함한다. 산업 용도를 위해서는 다수의 난을 하나 이상의 배아 특성에 대해 조사한다.
본 발명에 따른 방법에서, 시료에 포함되는 바이오 마커를 선별(screening)하고, 질량 검출기에서 화합물의 도달 시간과 연관 관계가 있는 보유 시간 지수를 기준으로 원하지 않는 신호를 제거함으로써 특정 종에 대한 데이터베이스를 확립할 수 있다. 따라서, 많은 시퀀스를 몇 분 내에 분석할 수 있으며, 높은 신뢰도로 바이오 마커를 식별할 수 있다. 따라서, 이 방법은 자동화가 가능하고, 처리량이 높으며, 상대적으로 숙련되지 않은 기술자에 의해 처리 가능하며, 부화장, 닭 또는 어류 양식장 등 원격 위치에서 사용하기에 적합하다.
사전 분리 절차 없이 시료를 질량 분석할 수 있다. 이러한 실시예에서, 시료는 바람직하게는 예를 들어, 정적 나노-전기 분사 원리, 유량 주입 분석 또는 시료 농축을 통한 유량 주입으로 분석되는 것이 바람직하다.
질량 분석 시스템은 바람직하게는 전자분사 이온화 (ESI) MS, 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화-비행 시간 (MALDI-TOF) MS 또는 표면 강화 레이저 탈착 이온화- 비행 시간 (SELDI-TOF) MS, 또는 레이저 다이오드 이온화 탈착 (LDID) MS이다.
특히, SPE/MS/MS는 Agilent Rapidfire MS 장치 (Rapidfire는 Agilent사의 등록 상표), 또는 Phytronics LDTD (Laser Diode Thermal Desorption) Ion Source (LDTD는 Phytronics사의 등록 상표)을 사용하는 등 본 방법의 자동화 고처리량 산업 용도에 유용한 것이 확인되었다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 또한 배아 성별, 생존력 및/또는 발생 단계를 판단하기 위한 식품과, 트레이서 전구체 화합물의 동물 식품에 대한 용도에 관한 것이다. 본 출원인은 놀랍게도, 배란 모체의 식품에 적절한 전구체 화합물을 첨가하면 배아 성장 중 난에 함유된 전구체 화합물의 대사 산물이 다르게 발현되는 것을 발견하였다.
결과적으로, 난은 배아의 성별과 같은 배아의 특성에 따라 특정 대사 물질의 측정 가능한 변화를 나타낸다. 바람직하게는, 적어도 하나의 트레이서 전구체 화합물은 미국 식약청 (FDA) 및/또는 유럽 위원회가 허가한 식품 첨가물로 열거한 화합물로부터 선택된다. 특히, 적절한 트레이서 전구체 화합물은 지방을 보호하기 위해 식품에 적절히 첨가되는 페놀 화합물인 부틸화 하이드록시아니솔 (BHA) 및/또는 관련 화합물인 부틸화 하이드록시톨루엔 (BHT)으로부터 선택될 수 있다. 본원에서 BHA는 3-tert-부틸-4-하이드록시아니솔 및 2-tert-부틸-4-하이드록시아니솔 이성질체의 혼합물을 말하며, BHT는 메틸-디-t-부틸페놀, 및 2,6-디-tert-부틸-파라-크레졸로도 알려져 있는 3,5-디-tert-부틸-4-하이드록시톨루엔을 말한다. BHA 및 BHT는 공지된 항산화제이며, 산소는 지방이나 기름을 산화시키는 것이 아니라, BHA 나 BHT와 우선적으로 반응하여 이들이 부패되지 않도록 보호되는 것으로 생각된다. BHA와 BHT는 산화될 수 있을 뿐만 아니라, 지용성이다. 트레이서 전구체 물질은 바람직하게는 식품에 소정의 농도의 각 트레이서 화합물을 제공하도록 계산된 양으로 식품에 첨가된다. 바람직하게는, 트레이서 전구체 물질은 5 ppb 내지 5 ppm 범위의 농도로, 보다 바람직하게는 약 10 내지 1000 ppb 범위의 농도로, 및 더욱 바람직하게는 50 내지 500 ppb 범위의 농도로 난 또는 난 시료 중 각 트레이서 화합물을 제공하도록 계산된 양으로 식품에 첨가된다.
상기 트레이서 물질은 유리하게는 하나 이상의 트레이서 화합물을 포함할 수 있으며, 트레이서 화합물의 상대적인 양은 난생 배아의 성별, 생존력 및/또는 발달 단계에 대한 식별 가능한 특성을 제공하도록 선택되며, 난 또는 난 시료의 분석은 트레이서 화합물의 특징적인 상대적인 양을 확인하기 위해 수행된다. 분석은 바람직하게는 예를 들어 이온 이동도 센서와 같은 질량 분석기를 사용하여 수행된다. 시료는 우선 액체 크로마토그래피, 기체 크로마토그래피 또는 바람직하게는 적절한 센서와 결합되는 기체 크로마토그래피의 조합에 적용될 수 있다. MS 센서의 대안은 불꽃 광도 검출기(flame photometric detector)일 수 있다.
바람직하게는, 난에서 채취한 시료에 포함되는 적어도 하나의 트레이서 화합물은 침습적 또는 비침습적으로 난액을 분석하는 단계 후, 분석 전에 분리, 유도 또는 농축될 수 있다. 바람직하게는, 특성을 조사하게 될 배아는 조류 배아, 파충류 배아, 갑각류 배아, 어류 배아 또는 연체류 배아이다. 보다 바람직하게는, 상기 배아는 조류 배아, 바람직하게는 갈루스 갈루스 도메스티쿠스(Gallus gallus domesticus) 종의 조류 배아이고, 배아는 보리새우과 (Peneidae), 가재상과 (Astacoidea) 및 남방가재과 (Parastacoidea), 징거미새우과(Macrobrachiae), 가재상과 (Astacoidea), 남방가재과 (Parastacoidea), 및 가시발새우과 (Nephropidae 및 Homaridae)를 포함하는 군으로부터 선택된 갑각류 종의 배아이거나, 배아는 잉어, 역돔, 메기, 도미, 농어, 참치, 고등어, 보니토스 (bonitos), 또는 방어에서 선택되는 어류 종의 배아이다.
본 발명은 또한 적절한 양의 트레이서 전구체 화합물을 포함하는 배란 모체 동물로 사용하기 위한 식품에 관한 것이다.
시료에 대한 성별 가능성의 예측은 바람직하게는 통제 다변량 분석, 바람직하게는, 부분 최소 자승 차별 분석, PLS-DA 또는 직교 부분 최소 자승 차별 분석을 데이터에 적용하는 것을 포함한다.
유리하게도, 개체군에서 이상치((outliers)를 제거함으로써, 판단의 확실성을 보다 높일 수 있고, 난을 다른 목적에 사용할 수 있다.
본 방법은 또한 유리하게는 난을 다수의 수컷 또는 암컷 난으로 분리하는 단계를 더 포함하고, 배아의 생존력을 판단하는 단계와, 난을 하나 이상의, 바람직하게는, 다수의 생존 가능한 난과 생존 불가능한 난으로 분리하는 단계를 더 포함한다.
개체군에서 이상치를 제거하는 본 방법은 유리하게도 난에 있는 배아가 생존 가능하고 남성인지, 또는 생존 가능하고 암컷인지를 판단하는 단계와, 다수의 생존 가능한 암컷 난으로부터 다수의 살아있는 수컷 난 및 이상치를 분리하여 우위적으로 수컷 또는 우위적으로 암컷 난 선택군을 형성하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법은 또한 유리하게도 생존 가능한 암컷 또는 수컷 난 선택군을 배양 및 부화 공정 처리하여 우위적으로 암컷 또는 수컷 동물 개체군을 형성하는 단계를 포함한다.
배아의 생존력은 측정된 바이오 마커를 사용하여 유리하게 결정될 수 있다. 미수정란과 일정 기간 (즉, 대사 완료 후 수 분) 후 감소한 배아는 측정 결과가 모두 측정 윈도우를 명확하게 벗어나 있으므로, 생존 가능한 난에서 이상치의 제거된다. 마찬가지로, 적어도 조류 배아의 경우, 요막 등의 시료가 사용될 때, 대사 활성이 사라지자 마자, 난황을 분리하는 막이 용해되어 시료는 섭동되어 마침내 황색이 된다. 또한, 심장 박동 또는 혈류를 측정하여 배아의 대사 활성을 판단할 수 있다.
또한, 본 발명은 동물 및/또는 인간의 식품 제조, 화장품, 의료 및/또는 영양 화합물의 제조 및/ 또는 분리, 발효를 통한 메탄 제조 및/또는 고품질의 비료 제조를 위한 본 발명에 따른 방법으로부터 얻을 수 있는 다수의 난의 용도에 관한 것이다.
다음의 비제한적 예는 본 발명을 설명하기 위해 제공된다.
실시예
1:
시료 채취 및 보관
바이오 마커 탐색을 위해, 여러 분석 대사 물질 프로파일링 플랫폼이 사용되었으며, 이들은 생체 아민, 음극성 지질, 비표적 글로벌 프로파일링 및 GC-MS였다.
탐색 단계에서 시료 100개를 분석하였다. 확인 단계를 위해 영양과 인종 등 배경이 다른 난으로부터 350개의 다른 시료 세트를 분석하였고, 성별과 연령에 대한 바이오 마커가 적어도 두 플랫폼에서 발견됨을 확인하였다.
요막액 (갈색 닭 유래)의 최초 150개 시료를 배양 7 내지 11일에 수집하여 -80℃에서 보관하였다.
이들 시료의 유전적 성 감별 데이터는 PCR 방법을 사용하여 준비하였다. 매일 각 성별마다 시료를 선택하고, 과량의 현재 시료 세트는 NMR 분석에 사용하였다. 그 후, 이들 시료의 대사 프로파일을 아민, 음극성 지질, CG-MS (설탕 화합물의 경우) 및 글로벌 프로파일링 플랫폼을 이용하여 분석하였다.
배양 7-12일에 부화장에서 갈색 닭으로부터 또 다른 300개의 요막액 시료를 채취하였다.
유전적 성별 분석은 제공되었으나, 통계 모델 구축까지는 사용되지 않았다. 이들 시료는 이전의 글로벌 프로파일링 분석에서 알려진 기능을 확인하는 데 사용되었다. 또한, 흰 계란 (Hey line CV 24)에서 채취한 시료 59개를 이러한 확인 연구에 사용하였다.
분취
(Aliquots)
분취 전에 시료를 4℃에서 하룻밤 동안 녹였다. 시료를 볼텍싱하고 수동으로 다음과 같이 분취하였다: 아민 프로파일링을 위해 5 μL, 극성 음이온 프로파일링을 위해 50 μL 및 GC-MS (당 화합물 분석)를 위해 100 μL. 품질 관리 (QC) 풀은 각 시료에서 동일양을 취한 후, 충분히 혼합하여 생성하였다.
배치 설계
탐색 단계에서, 시료를 무작위로 추출하여 아민 측정을 위해 두 배치에 분배하였다. 음극성 지질 및 글로벌 프로파일링을 위해서는 시료를 일 배치로 실행하였다. 반복실험(replicates)은 시료 7개마다 선택되었으며 보정선, QC 및 블랭크도 포함되었다. QC는 시료 10개마다 분석되었으며, 데이터 품질을 평가하고 장치 반응을 보정하는 데 사용된다. 블랭크는 연구 시료에서 배경 수준을 배제하는 데 사용된다.
미가공 데이터는 Agilent MassHunter Quantitative Analysis software (Agilent, version B.05.01)를 사용하여 전처리되었다.
아민
프로파일링
달리 명시된 경우를 제외하고, 언급된 모든 장비, 소모품 및 소프트웨어는 Waters사 (Etten-Leur, The Netherlands)에서 제공되었다. 아민 플랫폼은 Waters사에서 채택한 AccQ-tag 유도 전략을 사용하여 아미노산과 생체 아민을 다룬다. 간단히, 요막액 시료 (각각 5 μL)에 내부 표준 용액 (표 1)을 첨가한 후, MeOH (Actu-All Chemicals) 탈단백질화를 수행하였다. 상등액 (10.000 rpm, 10℃, 10 분)을 진공 조건에서 건조시켰다. 잔사를 6-아미노퀴놀릴-N-히드록시숙시니미딜 카바메이트 (AQC) 시약으로 붕산염 완충액 (pH 8.5)에서 재구성하였다. 유도 반응물을 10 μL 20% 포름산 (Acros Organics)으로 중화시켰다. 상등액 (10.000 rpm, 10℃, 10분)을 바이알에 옮기고, UPLC-MS/MS 시스템에 주입 (1 μL) 할 때까지 냉각(10℃) 오토샘플러 트레이에 배치하였다.
데이터 분석
획득된 데이터를 평가하고 할당된 MRM 피크를 TargetLynx 소프트웨어를 사용하여 통합하였다. MRM 피크는 적절한 내부 표준을 사용하여 표준화하였으며, 아미노산 분석을 위해서는 이들의 13C15N-표지 유사체를 사용하였고, 다른 아민의 경우에는 가장 가까운 용출 내부 표준을 사용하였다. 블랭크 시료를 이용하여 배경을 보정하였다. 수집된(pooled) QC시료를 사용하여 자체 개발된 알고리즘을 적용하여 배치 전반에 걸친 질량 분광계의 감도 변이를 보정하였다.
탐색 자료 분석을 수행하여 성별 특이적 특성이 발견될 수 있는지를 조사하였다. 이러한 단변량 및 다변량 표준 데이터 분석을 위해, 일반적으로 바이오 마커를 발견하는 데 사용되는 BMFL 에서 방법을 적용하였다.
시료는 LDPD Phytronix 장치뿐만 아니라 자동화 고처리량 결합 SPE/MS/MS Rapidfire 장치에서 시험을 거치게 된다. 결과는 생존 가능한 난의 성이 시료당 10초 이내에 95%보다 높은 정확도로 감별되는 것을 보여준다. 도 1은 두 가지 바이오 마커를 함께 고려했을 때, 9일 또는 10일에 이에 따른 성 감별 확실성이 95% 보다 높은 것을 보여준다.
부화
상술한 시료 채취를 거친 암컷 또는 수컷으로 간주되는 일련의 25개의 알에 대하여 시판되는 배양 장치와 일반적인 배양 조건을 사용하여 부화할 때까지 시험을 진행하였다. 알에서 효과적으로 나타난 모든 부화 동물은 시료 채취의 실현 가능성을 보여준다. 부화한 동물은 전부 수컷 또는 암컷 개체군이었다.
실시예
2: 휘발성 물질 및 고상 미세 추출 (
SPME
)을 이용한 비침습적 판단
휘발성 시료 수집은 하나의 알을 알루미늄 호일과 금속 캡으로 밀봉된 유리 용기에 옮겨 수행하였다. 그 후, 용기의 온도를 37℃로 유지하면서 용기를 가열판에 배치하였다. 용기에 알을 15분간 방치하여, 용기의 헤드 스페이스와 평형을 이루게 하였다. 수집 섬유 물질은 제조사의 지침에 따라 사용하기 전에 컨디셔닝하였다. 그 후, 섬유를 삽입하고 50분간 추출하였다. 추출 후, 섬유는 비분할(splitless) 모드로 250℃에서 분석 물질의 탈착을 위해 5분간 기체 크로마토그래프 주입기에 도입하였다. 휘발성 물질 수집 직후 알을 배양기로 다시 배치하였다. 블랭크는 빈 용기에 SPME를 수행하여 형성하였으며, 분석 전 피크의 부존과 SPEA 절차의 우수한 품질을 보장하기 위해 섬유 컨디셔닝을 수행하였다.
그 후, 알에서 방출된 휘발성 물질은 Agilent Technologies사의 질량 선택 검출기 (MSD 5975C)가 장착된 Agilent Technologies사 (Wilmington, DE, USA) 7890A에서 기체 크로마토그래피로 측정되었다. 크로마토그래피 분리는 운반 기체로서 헬륨을 사용하여 25 ㎛ (Agilent사)의 막 두께를 갖는 HP-5MS UI (5 % Phenyl Methyl Silox), 30 m × 0.25 m ID 컬럼에서 유속 1 mL/min으로 수행되었다. 전자 이온화 (EI, 70 eV) 단일 사중극자 질량 분석기가 사용되었다. 질량 분석기는 SCAN 모드에서 작동되었다. 휘발성 화합물의 추출을 위해, 홀더가 구비된 60 μm PDMS/DVB Stableflex 24 게이지 고상 미세추출 (SPME) 섬유를 사용하였다. 미가공 데이터는 MSD ChemStation F.01.00.1903을 사용하여 CDF 형식으로 변환되었다. XCMS 스크립트는 피크 선택(peak picking)을 수행하기 위해 R 소프트웨어 (R version 3.2.0)에서 설계되어 적용되었다. 이에 사용된 방법은 fwhm = 4 (피크 폭), 단계 = 0.5 (질량 윈도우) 및 snthresh = 5 (S/N)인 “matchedFilter”를 사용하였다. Metaboanalyst 3.0은 통계 분석에 사용되었다. 마지막으로, MassHunter 정성 분석 B.005.00을 사용하여 얻은 결과에 따라 가장 중요한 특성을 수동으로 확인하였다. NIST Mass Spectral Library Version 2.0이 식별에 사용되었다.
이 과정에서, 각 시료의 TIC로부터 초 단위로 상이한 체류 시간에 다른 질량의 1486 피쳐(features)를 얻었다. 이러한 특성을 추출한 후, metaboanalyst 3.0을 사용한 시험을 통해 단변량 방법을 적용하여 99%의 신뢰도로 성 감별 특성을 확인하였다.
출원인은 수컷 난과 암컷 난 사이에 유의한 차이를 나타내는 특히 관련된 바이오 마커가 전구체로서 BHT의 유도체인 부틸화 하이드록시톨루엔인 것을 발견하였다.
암컷 난은 수컷 난에 비해 유의하게 높은 농도의 부틸화 하이드록시톨루엔을 나타내었다. 따라서, 트레이서 전구체를 이용하면 바이오 마커는 전적으로 비침습적 방식으로 난에서 수컷 및 암컷 닭의 배아를 매우 확실하게 감별할 수 있었다.
Claims (74)
- (a) 배아를 포함하는 난과 관련된 물질의 시료를 얻는 단계;
(b) 상기 배아의 특성을 나타내는 상기 시료 중 3-[(2-아미노에틸)설파닐]부탄산을 포함하는 제 1 바이오 마커의 존재 및 농도에 대한 점수값을 측정하는 단계;
(c) (b) 단계에서 얻은 점수값 및 농도에 임계값을 적용하여 상기 바이오 마커의 존재 및 농도와 관련된 배아의 특성을 확인하는 단계;를 포함하는난에서 (in ovo) 갈루스 갈루스 도메스티쿠스 (Gallus Gallus Domesticus) 배아의 특성을 비파괴적으로 확인하는 방법으로서,
(c) 단계는
(i) 유사도 척도를 이용하여 각 연관 신호의 스펙트럼을 연관 대조 바이오 마커의 예상 스펙트럼과 매칭하여 각 관련 바이오 마커 신호를 대조 바이오 마커와 연관시켜, 양의 연관 신호를 정의하는 단계;
(ii) 각 양의 연관 신호의 강도를 측정하고 절대 신호 강도 및 상대 신호 강도 중 어느 하나 이상에 점수를 부여하는 단계;
(iii) 유사도 함수로부터 얻은 점수값에 임계값을 적용하여 연관된 배아 특성을 판단하는 단계;를 포함하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 제1 바이오마커는 상기 배아의 요막액 내에 존재하는 것인 방법. - 청구항 1에 있어서,
자기 공명 영상법, 스펙트럼 공명법, 하나 이상의 검출기와 결합된 분석 크로마토그래피법, 형광 분광법, 바이오 마커 선택성 시약을 포함한 에세이법 중 하나 이상을 적용하여 하나 이상의 바이오 마커의 존재 및 농도를 측정하는 단계;를 포함하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 시료는 분석 전에 처리되고,
상기 시료의 처리는 고상 추출 (SPE), 기체 크로마토그래피, 단상 또는 다상 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의한 시료 분리를 포함하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
대조 바이오 마커의 하나 이상의 내부 표준이 분석 전에 시료에 첨가되는 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 절대 신호 강도는 바이오 마커 신호 강도를 측정하고, 이를 하나 이상의 알려진 내부 표준의 신호 강도와 비교하여 점수를 부여하는 방법. - 청구항 2에 있어서,
배양이 시작된 후 7, 8 또는 9일째 되는 날에 상기 배아의 요막액 내의 상기 제1 바이오마커의 농도가 50 ng/ml 이상인 것은 암컷 배아와 연관되며, 50 ng/ml 미만으로 포함되는 제1 바이오 마커의 존재는 수컷 배아와 연관되는 것을 특징으로 하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 방법은 전적으로 자동식인 방법. - 삭제
- a.난생 종으로부터 다수의 난을 제공하는 단계;
b.상기 난을 청구항 1에 따른 방법으로 처리하여 배아의 특성을 판단하는 단계;
c.원하는 특성을 갖는 난을 선택하여 선택된 다수의 난을 형성하는 단계; 및
d.하나 이상의 동물이 부화될 때까지 선택된 난을 배양하는 단계;를 포함하는 특정 특성을 갖는 난생 종 동물의 선택적 배양 공정. - 삭제
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