CN109477840B - 用于在卵内非破坏性地确定家禽性别的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于在卵内非破坏性地鉴定家鸡胚胎的特性的方法，所述方法包括：(a)获得与包含所述胚胎的卵相关的材料的样品，以及(b)测量所述样品中的至少第一生物标志物的存在的评分值和浓度，所述评分值和所述浓度指示所述胚胎的特性，以及(c)对在(b)中获得的评分值和浓度应用阈值，以鉴定与所述生物标志物的存在和浓度相关的所述胚胎的特性，其中至少第一生物标志物包括具有在从140g/摩尔至190g/摩尔的范围内的分子量的氨基化合物；其中步骤(c)还包括：(i)通过使用相似性度量将每个相关信号的光谱与相关参考生物标志物的预期光谱相匹配来将每个相关生物标志物信号与参考生物标志物相关联，以定义至少一个正相关信号；(ii)测量每个正相关信号的强度，并对它的绝对信号强度和/或相对信号强度进行评分；以及(iii)对从相似性函数获得的评分值应用阈值，以确定相关胚胎特性。

Description

用于在卵内非破坏性地确定家禽性别的方法和系统
发明领域
本发明涉及一种用于在卵内非破坏性地确定卵生动物物种、特别是禽类(avian)物种、更特别地是原鸡物种(Gallus Gallus species)的性别的方法。本方法还涉及雄性卵和雌性卵的选择，以及涉及使用这些所选择的卵来产生活动物群。
卵生动物产卵，在母亲体内具有很少其他胚胎发育或没有其他胚胎发育。卵生动物及其卵的培育满足了全球蛋白质供应的不断增长的部分以及各种其他大规模工业过程，诸如疫苗的生产。目前，用于培育卵生动物的最重要方法包括饲养禽类物种诸如家禽以及水产养殖，即养殖水生生物诸如鱼类、甲壳动物和软体动物。尤其是家禽、更具体地红原鸡(re jungle fowl chicken)，即家鸡(Gallus Gallus Domesticus)物种是目前世界上饲养最多的卵生动物物种。
发明背景
受精的鸡卵倾向于雄性动物和雌性动物的大致相等的分布。然而，出于各种原因，在孵化场管理中，可能期望基于各种特性、特别是性别来分开动物。例如，在商业家鸡和鸡蛋生产中，雄性雏鸡的孵化和饲养是非常不期望的，导致每年扑杀数十亿只雄性雏鸡。
目前，在这两种情况中，孵出的雏鸡的混合群体通过目视评估幼年动物、有时甚至在幼年动物没有合适性状的情况中通过目视评估成年群体来经受性别鉴定(sexing)。在任一种情况中，这都是非常耗时的过程，需要高度熟练的操作人员，且通常对动物来说压力很大。
还进一步地，对于商业鸡蛋生产，雄性雏鸡的孵化和饲养是非常不期望的，导致每年扑杀数十亿只雄性雏鸡。此外，有一定百分比的未受精的卵或者在孵化期开始时不包含能存活的胚胎，这大大降低了孵化场的孵化器的容量。
此外，在成年动物被进行性别鉴定的情况中，整个群体需要被饲养到最低年龄，而这样饲养的动物中只有一半在分离后用于繁殖。另外的问题可能出现，其中例如雄性群体的存在可能由于例如同类相食和降低的养殖密度而导致降低的繁殖能力。
此外，有一定百分比的未受精的，或者在孵化期开始时不包含能存活的胚胎的卵，这大大降低了在孵化场所使用的特别是用于家禽卵的孵化器的容量。
结果是，需要比如果早期性别选择可用所必要的孵化能力大至少两倍的孵化能力，该早期性别选择允许选择主要为仅雄性的胚胎或主要为仅雌性的胚胎。
因此，如果允许在孵化阶段之前确定禽类胚胎的性别的早期方法是可用的，那么通过减少所需的能量和其他资源的数量对环境、但同样对通过扑杀来消除不必要的动物以及减少新孵出的动物的压力有很大的价值，也允许大大提高孵化器的容量。另一个好处是，如果该方法也允许相对于未受精的卵和/或原本不能存活的卵而选择能存活的胚胎，则进一步提高孵出过程的效率。
存在在文献中公开的关于通过检测卵中的某些代谢物来确定禽类胚胎的性别的各种方法，例如通过NMR光谱法例如Y.Feng等人的Appl.Magn.Reson.(2007),32,257-268；通过HPLC分析，参见Gu D.-C.等人,Chinese Journal of Animal Science,Vol.7,23-25以及通过使用允许定量荧光显微术的特异性结合靶分子的生物标志物，参见例如WO2006/124456用于确定雌激素类固醇化合物作为标志物的存在。通常注意到，类固醇是不易挥发的相当大的分子。
上文提到的大多数方法的缺点是，它们不能允许非破坏性地确定鸡的性别，因为需要大量代谢物，这可能不允许胚胎在取得样品后，存活和完全发育。此外，这些方法需要使用由于成本或复杂性而通常不在养鸡场使用的设备，更不用说为商业鸡饲养提供合适的通量了。
WO2014/021715公开了一种用于在卵中非破坏性地确定家禽胚胎的性别、发育阶段和/或存活力的方法，所述方法包括：(a)在从卵孵化开始直到孵出的时间段检测卵中选自糖和/或氨基酸、其前体和代谢物的至少第一发育标志物化合物；(b)测量所述至少第一所检测的发育标志物化合物的量，和(c)将该量与为雄性和雌性、胚胎的发育阶段和/或活着的胚胎和死亡的胚胎或未发育的胚胎建立的基线进行比较，以确定胚胎是能存活的、雄性的还是雌性的，和/或胚胎的发育阶段。虽然所公开的方法对于确定胚胎的性别、年龄和发育阶段是非常有用的，但是由于一些定量测量方法的低灵敏度，它需要相对大量的样品。此外，一些自动化方法难以在实时连续孵出过程中实现，例如使用核共振方法或包括拉曼光谱法的光谱共振方法。其他方法虽然是快速的，但需要相对昂贵的设备的存在和/或使用专用化学品，诸如用于特异性生物标志物分子的荧光标记。
因此，仍然存在对用于在卵内非破坏性确定卵生动物胚胎的性别以及发育阶段和/或存活力的更快且更灵敏的方法的需求。
发明概述
因此，本发明的一个目的是提供一种用于在卵内非破坏性地鉴定家鸡胚胎的特性的方法，所述方法包括：
(a)获得与包含所述胚胎的卵相关的材料的样品，以及
(b)测量所述样品中的至少第一生物标志物的存在的评分值和浓度，该评分值和所述浓度指示所述胚胎的特性，以及
(c)对在(b)中获得的评分值和量应用阈值，以鉴定与所述生物标志物的存在和浓度相关的所述胚胎的特性，
其中至少第一生物标志物包括具有在从140g/摩尔至190g/摩尔的范围内的分子量的氨基化合物，并且其中所述生物标志物的存在和浓度与可能发育成雄性成体或雌性成体的胚胎相关。
本发明的又一个目的是提供一种能够在远程位置诸如孵化场或水产养殖场执行卵的实时在线分析的系统。这些和其它目的通过本发明的装置和方法来解决。
在另一方面中，主题方法还涉及大量能存活的雌性卵，形成以雄性卵为主的选择或以雌性卵为主的选择。在又一方面中，主题方法还涉及可通过根据本发明的方法获得的幼年动物群体。在又一方面中，主题方法还涉及从所述方法可获得的大量卵用于动物和/或人类食物生产、用于美容、医学和/或营养化合物的生产和/或分离、用于通过发酵进行的甲烷生产、用于疫苗生产和/或高质量肥料生产的用途。
在又一方面中，主题方法还涉及一种卵生动物胚胎性别检测和分析系统，所述系统包括用于执行主题方法的优选地全自动的装置。
本发明还涉及该系统，其中性别鉴定设备在与光谱系统通过接口连接的电子设备上用软件实现；并且优选地其中鉴定设备包括驻留在计算机中的软件装置。
附图简述
现在将在下文中参照附图更充分地描述本发明，在附图中示出本发明的优选实施方案。然而，本发明可以用很多不同形式实现且不应被理解为限于在本文阐述的实施方案；更确切地，提供这些实施方案使得本公开内容将是细致和完整的，并且将本发明的范围充分传达给本领域技术人员。
图1描绘了A)对单个特征的逻辑回归分类模型，所述单个特征为3-[(2-氨基乙基)硫烷基]丁酸的浓度，所述模型对性别预测具有超过90％的准确度；以及B)对两个特征的逻辑回归：当对两个生物标志物应用逻辑回归模型时，从第10天起，准确度可以提高到>95％准确度。
图2示出了根据本发明的生物标志物在一系列测试，即自动化高通量测试中的LDPD光谱。该方法不仅允许对测量生物标志物的存在，还允许在小于10秒测量每个单独的样品的绝对浓度。
图3示出了具有在850秒从雄性(深灰色)和雌性(浅灰色)样品中提取的范围从220至145的各个质量峰的化合物的色谱图。
发明详述
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。在本发明的描述中使用的术语仅为了描述特定的实施方案的目的，且不意图限制本发明。
如在本文使用的术语“禽类”和“鸟类”包括雄性或雌性的任何禽类物种，但主要意图包括为了蛋或肉而在商业上饲养的家禽。因此，术语“鸟类”和“禽类”特别意图包括红原鸡和灰原鸡、鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子、鸵鸟、鸸鹋和雉。
术语“孵化”在本文指鸟类孵出它们的卵的过程以及在离开雌禽的阴道后卵内的胚胎的发育。孵化期在本文中指不间断的时间，在该不间断的时间期间特定的卵经受模拟孵卵的条件直到孵出即鸟类的出现为止，包括任何处理或从例如孵化器到孵化厂单元的转移，条件是鸟类的发育没有停止。
如本文使用的术语“在卵内(in ovo)”指在孵出前包含在卵内的胚胎。可以用任何类型的鸟类——包括但不限于(家养)鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑和雉的卵——来实践本发明。
在本文中术语“注射(injection)”和“注射(injecting)”包括将装置(通常是细长装置)插入卵或胚胎内的方法，包括将物质递送或释放到卵或胚胎中的方法、从卵或胚胎中取出物质(即样品)的方法和/或将检测器装置插入卵或胚胎中的方法。
在本文中术语“质谱法”指基于离子的质量来分选离子的分析技术。质谱法通常用于在许多情况中的化学分析，并且可以应用于从石油的复杂混合物到基因工程的产品的任何样品。简而言之，质谱将给出样品的确切化学组成的图像。
在第一方面中，本申请涉及具有在从140g/摩尔至190g/摩尔、优选地从150g/摩尔至170g/摩尔的范围内的分子量的一种或更多种氨基化合物的确定。
申请人惊奇地发现，特定的代谢物——乙基硫氨酸的结构异构体——指示胚胎是发育成雄性幼雏还是雌性幼雏。优选地，生物标志物化合物为式R3SCR1HCR2HCOOH(I)，其中优选地，R1代表CH3、H、NH2，R2代表CH3、H、NH2，且R3代表-(CH2)2-NH2，或其结构异构体。更优选地，生物标志物化合物为式C6H13NO2S。更优选地，它可以有利地选自氨基酸，诸如2-氨基-4-乙基硫烷基丁酸(也被称为乙基硫氨酸)或其结构异构体，包括但不限于4-(甲基硫烷基)异缬氨酸、4-(甲基硫烷基)异缬氨酸(也被称为2-氨基-2-甲基-4-(甲基硫烷基)丁酸)、正丙基半胱氨酸或异丙基半胱氨酸、3-(甲基-硫烷基)缬氨酸、4-(甲基硫烷基)缬氨酸、3-甲基-3-硫烷基-异缬氨酸、4-(甲基硫烷基)异缬氨酸、2-氨基-3-甲基-4-甲基硫烷基丁酸、5-(甲基硫烷基)正缬氨酸、2-氨基-3-甲基-3-硫烷基戊酸、甲基3-硫烷基-缬氨酸酯、甲基硫鎓甲硫氨酸、N-甲基-D-甲硫氨酸；5-氨基-6-硫烷基己酸或类似物；选自氨基酸酯，诸如甲基(2-氨基-4-甲基硫烷基)丁酸酯(也被称为甲基甲硫氨酸酯)或其结构异构体，诸如乙基甲基-半胱氨酸酯、异丙基-半胱氨酸酯、正丙基半胱氨酸酯或相关化合物，诸如2-[(2-羟乙基)硫烷基]-N-甲基丙酰胺；乙基同型半胱氨酸酯、2-异丙基-1,2-噻唑烷1,1-二氧化物、1-氨基-2,2-二乙氧基乙烷-1-硫酮、3-[(2-羟乙基)硫烷基]-N-甲基丙酰胺、丙基2-氨基-3-硫烷基丙酸酯、2-(甲基氨基)-4-(甲基硫烷基)丁酸、2-[(2-氨基乙基)硫烷基]-2-甲基丙酸、3-[(2-氨基乙基)硫烷基]-2-甲基丙酸、3-[(2-氨基乙基)硫烷基]丁酸、4-[(2-氨基乙基)硫烷基]丁酸、2-氨基-3-(丙基硫烷基)丙酸、2-氨基-3-(丙烷-2-基硫烷基)丙酸和3-[(2-氨基乙基)硫烷基]丁酸。化合物或异构体可以是外消旋的，或者可以包含合适的比率和数量的对映异构体或立体异构体。
优选地，化合物具有分子式C6H13NO2S和163.0690的单同位素质量MW。目前，它表现得被鉴定为具有根据通式I的结构的(3-[(2-氨基乙基)硫烷基]丁酸)：
Figure GDA0001956613580000061
申请人发现，孵化期期间，尿囊液中的可以被认为是非蛋白氨基酸的化合物(I)或结构异构体的浓度可有利地用于以非常高的确定性确定卵中的胚胎的性别。作为另外的益处，这种生物标志物比较容易提取和/或挥发，且因此与例如甾族化合物相比可以比较容易地被分析。
步骤(a)包括获得与包含胚胎的卵相关的材料的样品。
根据本发明的实施方案的方法和装置可用于在胚胎发育期期间(也被称为其孵化期)的任何时间鉴定卵的一个或更多个特性。本发明的实施方案不限于在胚胎发育期间的特定的一天。
根据本发明的方法优选地包括：(a1)提供包含卵液的样品；以及(a2)从样品获取光谱。任选的步骤(a3)优选地通过合适的方法诸如超滤或离心来从样品去除浑浊。如上面所阐述的，虽然侵入性方法允许直接采取样品并使所取样的流体经受分析，但是优选地，由于这样的分析方法的效率以及卵壳和其中的膜保持不被穿孔的事实，该分析被非侵入性地执行。可以采用任何合适的方法来执行这种非侵入性分析。
在采用非侵入性方法的情况中，在本文中术语“流体”可以指可以在不刺穿卵壳的情况下从卵中去除的挥发性化合物。这可以有利地通过将卵放置在检测室中任选地在轻微的负压下并且通过使所释放的挥发性化合物经受合适的鉴定和量化方法来执行。此处，可以应用上面引用的质谱(MS)方法，包括使用离子迁移率光谱仪(IMS)。
如果分析被侵入性地执行，这通常包括提取卵材料的样品。样品优选地取自胚胎液，在禽类物种的情况中优选地取自尿囊液，因为这将最不可能伤害胚胎。尿囊液通常是禽类胚胎的含氮代谢物的排泄介质。
用于穿刺卵和侵入性采取卵材料的合适的方法和装置例如在US-A-20070137577、WO-A-00/22921或WO-A-99/34667中公开。然后，这样取得的样品优选地经受合适的方案，以允许检测发育标志物并分析存在的发育标志物的相对量和/或绝对量。
尿囊液在孵化的第三天左右开始形成，如由Hamburger,V和Hamilton,HL(1951)."A series of normal stages in the development of the chick embryo".Journal ofMorphology 88(1):49-92公开的。在本文中表明，尿囊在孵化后65小时可辨认为短的厚壁的袋；还不是囊状的。在72小时后，尿囊是囊状的，在尺寸上是可变的；平均为中脑的大小，表明尿囊和尿囊液从第3天起时存在。作为结果，如果要检查尿囊液，则从第3天起可以应用本方法。
尿囊在孵化的大约第13天达到最大体积，且然后当孵化继续时由于水分损失和液体再吸收而在体积上变小，但是在孵化的第18天仍然以显著的体积存在。
尿囊液通过内壳膜和外壳膜以及绒毛尿囊膜与卵壳分离。尽管尿囊液包围含胚卵的整个外周，但尿囊液通常积聚在卵的顶部，紧邻着覆在气室上面的膜的下方。
尿囊液在卵的顶部处的积聚是由于重力和由致密的胚胎和卵黄囊引起的位移。由于卵与卵之间的空气间隔的可变性，当卵直立时，试图通过卵的顶部准确地对尿囊液取样可能是困难的。重力可用于将尿囊液聚集在局部部位。当卵在其纵轴上转动时，尿囊液将聚集在卵的顶侧处，紧邻着卵壳下放。将卵放在其纵轴上使尿囊液对样品的提取变得有用。
从卵中提取材料诸如尿囊液可以以各种方式执行，包括穿透卵壳以及将取样套管穿过膜插入。然后，可以取得待取样的液体的样品，同时膜和/或壳用合适的密封剂被主动密封或者被允许密封自身。
如上文所述，可以采用任何合适的方法来执行非侵入性分析。在本发明的不同的优选实施方案中，非侵入性方法可以包括与合适的分析装置偶联的固相微萃取(SPME)。SMPE指固相萃取取样技术，其包括使用涂覆有萃取相的纤维，该萃取相可以是液体(聚合物)或固体(吸附剂)，纤维从可以处于液相或气相的不同种类的介质中提取不同种类的分析物(包括挥发性和非挥发性的)。借助于对流或搅拌，只要达到平衡或者在短时间预平衡的情况中，由纤维提取的分析物的量与它在样品中的浓度成正比。这可以优选地与IMS偶联，使得挥发物可以被直接测量。
虽然几个出版物例如US-A-2011/144473和US-A-7950349已经整体上公开了非侵入性方法的使用，但是这些出版物仅模糊地描述总体发射光谱；这实际上不允许选择胚胎的性别。本发明的方法特别不同于所公开的方法之处在于卵中的特定组分的存在被确定，这可以有利地通过使用允许选择性地寻找一种或更多种发育标志物化合物的绝对量和相对量的二阶导数光谱来完成。
包含雄性胚胎和雌性胚胎的卵表现出分子水平的化学组成的差异。在宏观水平处，胚胎还显示了在大小、形状和细胞形态上的差异。
本发明的方法有利地允许确定胚胎的性别。优选地，在孵化开始后的从1至15天、更优选地从2至14天、更优选地从3至13天以及甚至更优选地从4至12天的时间段内执行确定，诸如优选地在卵的孵化开始后的从6至12天的时间段内执行步骤a)。
这允许避免在孵化不能存活的和/或不是期望性别的卵时所涉及的成本。此外，可以确定卵的实际发育阶段。对于具有比家鸡的孵化时间更短或更长的孵化时间的物种，在合适时可以适用其他时间段。
样品可以是感兴趣的任何生物物质，但有利地是生物组织，且优选地是生物流体，诸如血液或血浆。
步骤(b)包括测量样品中的至少第一生物标志物的存在的评分值和浓度，该评分值和浓度指示胚胎的特性。
本发明的方法依赖于观察到的质量信号与已知生物标志物的参考质量和光谱的相关性。参考数据优选地存储在计算机服务器上，这允许整个过程在计算机控制下执行。通过比较，例如使用本文描述的计算函数来将信号与参考标准品相关联。
优选地，根据是否达到相似性的阈值水平，信号被表征为“正的”或“负的”；在该方法中丢弃负的且未达到相似性的阈值水平的信号，而为正的那些信号与生物标志物匹配，并导致所述生物标志物在生物样品中的存在的诊断。
在用标准品实施的情况下，生物标志物信号的评分可以通过存在于样品中的生物标志物的信号和添加到样品的内标物之间的比率来计算。多种生物标志物可以用相同的方式分析，导致最终评分因子。
优选地，在通过质谱法分析之前，将用原子标签标记的参考生物标志物的一个或更多个内标物添加到样品。这允许通过测量生物标志物信号强度并将它与一个或更多个已知内标物的信号强度进行比较来确定绝对信号强度并对绝对信号强度进行评分。例如，这样的标准物可以用同位素标记，使测定读出在绝对定量方面变得非常准确，也非常有利。在筛选中的内置校准序列将允许测量样品中的绝对生物标志物水平。
本发明的方法可以优选地以两种方式实现；使用内标物来为定量信号强度提供参考，以及不使用这样的标准品。因此，在一个实施方案中，在通过质谱法分析之前，将一个或更多个内标物添加到样品。优选地，内标物被标记。有利地，然后可以通过测量生物标志物信号强度并将它与一个或更多个已知内标物的信号强度进行比较来给每个生物标志物信号的绝对信号强度评分。在替代实施中，在不添加内标物的情况下处理样品。在这样的实施方案中，通过测量样品中的单独生物标志物信号强度和样品组的参考信号强度之间的比率来对相对信号强度评分。
优选地，选定特性可以是胚胎实现完全生长到孵出的可能存活力或不能存活力。另一个优选的选定特性是对可能的发育阶段和胚胎在孵化条件下进展到孵出所需的时间的预测。优选地，该方法包括应用磁共振成像方法；光谱共振方法；与一个或更多个合适的检测器偶联的分析色谱方法；荧光光谱法和/或包括生物标志物选择性试剂的测定方法中的一种或更多种。
一种或更多种生物标志物的鉴定和量化可以通过任何合适的方法来执行。有利地，这可以通过包括核共振方法的磁共振成像方法；包括UV/VIS、红外或拉曼光谱法的光谱共振方法；与合适的检测器偶联的分析方法诸如GC或HPLC；荧光光谱法；酶联免疫吸附测定法，包括湿法和干法，诸如使用浸量尺(dipstick)；以及使用适当制备的选择性适体或类似的选择性试剂来执行。
一般，也可以采用包括红外或拉曼光谱法的定量光谱共振方法，优选使用二次光谱，用于确定存在于卵中的发育标志物的存在和绝对量和/或相对量。虽然几个出版物例如US-A-2011/144473和US-A-7950349已经公开了使用非侵入性方法，但是这些出版物仅模糊地描述总体发射光谱；这实际上不允许选择胚胎的发育阶段、存活力和/或性别。本发明的方法特别不同于所公开的方法之处在于卵中的特定组分的存在被确定，这可以有利地通过使用允许选择性地寻找一种或更多种发育标志物化合物的绝对量和相对量的二阶导数光谱来完成。特别是，微分二阶导数傅立叶变换红外(FTIR)和FT-拉曼光谱法或其组合可以有利地用于实现必要的准确性和可重复性，而核磁共振方法可以适当地用于确定发育标志物的性质，并建立基线来校准系统。本发明的方法有利地允许确定胚胎的存活力和/或性别，和/或优选地从卵的孵化开始到孵出的发育阶段。在优选的实施方案中，可以通过适合于检测和获取光谱的任何质量光谱光度法来分析样品，该光谱鉴定和量化存在于样品中的生物标志物的绝对量和相对量。优选地，样品可以通过允许每个样品少于20秒、更优选少于15秒的实时分析的方法来分析。
实例包括使用静态纳米电喷雾原理的直接输注、流动注射分析或具有样品富集的流动注射。优选地，质谱分析包括电喷雾电离(ESI)质谱法、基质辅助激光解吸电离-飞行时间(MALDI-TOF)质谱法或表面增强激光解吸电离-飞行时间(SELDI-TOF)质谱法。质谱仪优选地以串联模式和/或扫描模式(survey mode)操作。
有利地，可以在质谱分析之前处理样品，使得样品处理包括通过固相萃取(SPE)、气相色谱法、单相或多相高压液相色谱法(HPLC)进行的样品分离。
可选地，如果生物标志物化合物可以在外部被测量，则可以使用例如上文阐述的IMS技术通过对整个卵的直接、非侵入性测量来执行直接的非侵入性分析。
用于生物标志物的质谱表征的优选方法包括基质辅助激光解吸电离(MALDI)和电喷雾电离(ESI)。任一种方法可以有利地与飞行时间(TOF)或其它类型的质谱传感器组合，以确定生物标志物的质量和/或裂解模式。优选地，质谱分析法在本文可以与色谱和其它分离技术串联地使用。MALDI通过用激光器脉冲样品来操作。这种处理使样品蒸发并电离。然后在TOF分析仪中确定带电离子的分子量(质量)。在这个设备中，电场使带电分子朝着检测器加速，且电离碎片到达检测器所花费的时间长度的差异(即它们的飞行时间)揭示生物标志物的分子量，因为较小的化合物更早到达检测器。这种方法产生样品的质量分布图，即混合物中的化合物的分子量和量的分布图。这些分布图然后可以用于从生物标志物数据库中鉴定已知的生物标志物。
使用与液相色谱法的ESI-MS接口(LC/MS/MS)，来自LC柱的洗脱化合物被引入到质谱仪的离子源内。电压被施加到细针上。然后，针将液滴喷射到质谱分析仪中，在那里液滴蒸发，且对应于裂解的各种电荷状态并且可从其确定组成的生物标志物离子被释放。可选择地，SPE(固相萃取)或气相色谱法可以与质谱仪偶联。
特别是，发现SPE/MS/MS对于本发明的方法的自动化和高通量工业应用是有用的，诸如使用Agilent Rapidfire MS装置(Rapidfire是Agilent Inc.的注册商标)、Photronics The LDTD(激光二极管热解吸)离子源(LDTD是Photronics Inc.的注册商标)。
发现另一个有用的装置使用基于在电场中的离子的气相迁移率的经校准的离子迁移率谱仪(IMS)。在这里，由于部分放电(discharge)、UV灯或被称为电离室的内部的63Ni源而生成的物质的离子在它们通过漂移管的途中根据它们的分子质量和/或几何结构而彼此分离。然后，该装置测量离子通过该管的特征漂移时间，允许以极高的灵敏度和在每样品几秒内快速检测、鉴定以及量化物质。
优选地，质谱分析包括电喷雾电离(ESI)质谱法、基质辅助激光解吸电离-飞行时间(MALDI-TOF)质谱法或表面增强激光解吸电离-飞行时间(SELDI-TOF)质谱法、SPE/MS/MS、LDTD(激光二极管热解吸)离子源和/或使用离子迁移率传感器(IMS)。
质谱仪系统优选地为电喷雾电离(ESI)MS、基质辅助激光解吸电离-飞行时间(MALDI-TOF)MS或表面增强激光解吸电离-飞行时间(SELDI-TOF)MS或激光二极管电离解吸(LDID)MS。特别是，发现SPE/MS/MS对于本发明的方法的自动化和高通量工业应用是有用的，诸如使用Agilent Rapidfire MS装置(Rapidfire是Agilent Inc.的注册商标)、Photronics The LDTD(激光二极管热解吸)离子源(LDTD是Photronics Inc.的注册商标)。
发现另一个有用的装置使用基于离子在电场中的气相迁移率的经校准的离子迁移率谱仪(IMS)。在这里，由于部分放电、UV灯或在被称为电离室的内部的63Ni源而生成的物质的离子在它们通过漂移管的途中根据它们的分子质量和/或几何结构而彼此分离。然后，该装置测量离子通过该管的特征漂移时间，允许以极高的灵敏度和在每样品几秒内快速检测、鉴定以及量化物质。
优选地，可以在分析之前处理测试样品。优选地，样品处理包括通过固相萃取(SPE)、气相色谱法、单相或多相高压液相色谱法(HPLC)进行的样品分离。优选地，在分析之前，将参考生物标志物的一个或更多个内标物添加到样品。优选地，通过测量生物标志物信号强度并将它与一个或更多个已知内标物的信号强度进行比较来对绝对信号强度评分。优选地，该方法是完全自动化的。
优选地，检查大量卵的一个或更多个胚胎特性。
优选地，该方法还包括确定卵中的胚胎是能存活的且雄性的、或能存活的且雌性的、或不能存活的，以及将大量能存活的雌性卵与大量能存活的雄性卵和一个或更多个不能存活的卵分离。
优选地，该方法还包括从来自样品的多种生物标志物中鉴定至少一种生物标志物，并将所述至少一种生物标志物的浓度与具有已知特性的单个鸡胚中的相同生物标志物的值进行比较，其中相对于一种或更多种生物标志物的阈值的较高或较低浓度指示胚胎是雄性还是雌性的、能存活还是不能存活的和/或胚胎的发育阶段。
步骤(c)包括对在(b)中获得的评分值和量应用阈值，以鉴定与生物标志物的存在和浓度相关的胚胎的特性。优选地，步骤(c)还包括：(i)通过使用相似性度量将每个相关信号的光谱与相关参考生物标志物的预期光谱相匹配来将每个相关生物标志物信号或鉴定标志(signature)与参考生物标志物相关联，以定义至少一个正相关信号；(ii)测量每个正相关信号的强度，并对它的绝对信号强度和/或相对信号强度进行评分；以及(iii)对从相似性函数获得的评分值应用阈值，以确定与相关生物标志物的存在和浓度相关的胚胎的特性。
申请人发现，在第7、8或9天，尿囊液中的50ng/ml或更大的量的3-[(2-氨基乙基)硫烷基]丁酸的存在与雌性胚胎相关，而以低于50ng/ml的生物标志物的存在与雄性胚胎相关。优选地，3-[(2-氨基乙基)硫烷基]丁酸在第7、8或9天在雄性卵中以从0.1ng/ml至45ng/ml的量存在，更优选地以从1ng/ml至40ng/ml的量存在。优选地，3-[(2-氨基乙基)硫烷基]丁酸在第7、8或9天在雌性卵中以从50.1ng/ml至150ng/ml的量、更优选地以从55ng/ml至140ng/ml的量存在。
虽然这个单个生物标志物已经可以给出对期望特性的几乎完全的确定性，但是至少第一生物标志物和第二生物标志物或者甚至更多的生物标志物可以有利地被同时检测和分析。然后，至少第一标志物和第二标志物的绝对量和/或相对量可以用于以甚至增加的确定性来确定一个或更多个特性。
本发明还优选地涉及一种用于选择性地孵化具有特定特性的卵生动物物种的幼雏的方法，包括提供来自该物种的大量卵，并使卵经受本文公开的方法以确定胚胎的特性，以及选择具有期望特性的卵以形成所选择的大量卵，并孵化所选择的卵直到一个或更多个幼雏孵出为止。
本发明还优选地涉及一种卵生动物物种胚胎性别检测和分析系统，所述系统包括：
(i)取样系统，所述取样系统用于从单独的卵中抽取样品；
(ii)分析系统，所述分析系统用于收集光谱；
(iii)性别和/或存活力鉴定设备，所述设备可编程地鉴定与来自由分析系统分析的一个或更多个样品的一种或更多种生物标志物相关的信号，该设备还执行分析，将信号与在样品数据上收集的对照光谱的存储文库和/或与内标物进行比较，以鉴定胚胎特性；以及
(iv)输出装置，所述输出装置将一个或更多个胚胎特性信息偶联到样品和/或所分析的卵。
优选地，鉴定设备在与分析系统通过接口连接的电子设备上用软件实施。
本发明还优选地涉及从根据本发明的方法可获得的大量卵用于动物和/或人类食物生产、用于美容、医学和/或营养化合物的生产和/或分离、用于通过发酵进行的甲烷生产和/或高质量肥料生产用途。
在本文中术语“尿囊液”包括在从禽类卵衍生时具有或不具有其他卵物质的存在的尿囊液。例如，术语“尿囊液”可以包括血液和尿囊液的混合物。本发明的实施方案不限于从尿囊液或从在卵的上表面附近的区域提取物质。如本文所述的从尿囊液中取出材料仅作为本发明的可能的实施方案的一个实例被提供。如下所述，各种材料——包括但不限于羊膜、卵黄(yolk)、外壳、蛋清(albumen)、组织、膜和/或血液——可以从卵中被提取并被提交给分光光度分析进行测定，以鉴定胚胎的性别。
在需要的情况中，材料可以从实际上具有任何定向的卵中提取。在本文中术语“预定位置”指示卵内的固定位置或深度。例如，可以将设备注射到卵中至卵中的固定深度和/或固定位置。在可选择的实施方案中，可以基于从卵获得的信息，例如关于胚胎或胚盘下腔在卵内的位置信息来执行注射。
在本发明的方法中，优选地可以侵入性或非侵入性地分析发育标志物。
优选地，确定在孵化开始后的从1至15天、更优选地从2至14天、更优选地从3至13天、并且甚至更优选地从4至12天的时间段内执行，诸如例如，优选地在卵的孵化开始后的从6至12天的时间段内执行步骤a)。此外，可以确定卵的实际发育阶段。
优选地，根据本发明的胚胎特性的确定是作为非破坏性的方法来执行的，即，允许如此测试的胚胎生长——如果期望这样的话，或者使它经受另外的步骤，诸如卵内疫苗生产，条件是胚胎是能存活的，或者使雄性卵生长到鸡的完全雄性的群体，例如用于肉类生产，或者将如此饲养的雏鸡用于其他目的。
术语“比较光谱”有利地可以包括所测量的光谱的单变量分析或优选地多变量分析，以及禽类胚胎与某个群体的关联的确定。该步骤可以包括通过光谱数据的多变量统计分析来确定光谱中某些信号峰的存在。多变量统计分析程序优选地包括主成分分析程序和/或偏最小二乘回归分析程序。因此，主题发明还涉及一种用于在卵内确定禽类胚胎的性别和/或存活力的方法、装置和系统，所述方法、装置和系统包括多变量统计分析程序以及用于其确定的微处理器实现的过程。优选地，步骤(b)还包括由于任何两个样品之间的浓度差而使强度效应归一化的步骤。
因此，该比较优选地包括使用所测量的光谱的多变量分析来估计样品的性别的可能性，以及确定禽类胚胎与某个群体的关联。有利地，这使用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)来执行。该方法优选地包括示踪化合物数据的数学处理，并且包括多变量分析，诸如PCA(主成分分析)，优选地随后是监督分析，更优选地是PLS-DA(偏最小二乘-判别分析)或者甚至更优选地是正交PLSDA或者类似的合适的统计方法。在主题方法中的模式匹配步骤将鉴定某个相似性度量。使用相似性度量来确认生物标志物的正确结构。这种确认是通过光谱匹配来进行的。光谱匹配通过比较样品光谱和数据库中的参考光谱来执行。对于在这个阶段的肯定身份(positive identity)，需要适当的相关性以便确认准确的确定。合适的阈值和相似性度量对本领域技术人员是明显的。该方法试图将大量数据减少到可管理的大小，并应用统计驱动模型，以便确定指示在所观察的数据之间的隐藏关系的潜在变量。
然后，特征鉴定设备过滤样品数据，这将鉴定样品中的感兴趣的簇。这些簇代表样品中的相似性并被用来鉴定性别分布。优选地，分析包括主成分分析(PCA)和PLS-DA。PCA使用数学算法来确定数据集中的差异和相似性。PCA将多个可能相关的变量转换成被称为主成分的较少量的不相关的变量。第一主成分尽可能多地解释数据的可变性。每个附加的成分都试图尽可能多地解释数据中的剩余的可变性。所收集的数据可以布置在矩阵中，且PCA用平方和以及叉积来对正方形对称矩阵的“特征值(eigenvalue)”和“特征向量(eigenvector)”求解。与最大特征值相关的特征向量具有与第一主成分相同的方向。与第二最大特征值相关的特征向量确定第二主成分的方向。特征值之和等于正方形矩阵的迹(trace)，且特征向量的最大数量等于这个矩阵的行(或列)的数量。一旦被确定，就可能绘制所计算的特征值排列图(screen plot)。本领域技术人员将认识到，许多不同的算法可以用于计算特征值和特征向量。使用两个图显示数据：i)示出群聚类的评分图和ii)负载图，其中负责群聚类的光谱数据被鉴定为离原点最大距离的那些光谱数据。
本发明的方法有利地可以确定卵中的胚胎是能存活的且雄性的还是能存活的且雌性的，并且将所测试的卵分成大量能存活的雌性卵以及大量能存活的雄性卵和大量不能存活的卵，以形成以雄性卵为主的选择或以雌性卵为主的选择，或者以不能存活的卵为主的选择。如果期望是这样的，则可以使能存活的雌性卵或雄性卵选择经受孵化和孵出过程，以形成以雌性动物为主的群体或以雄性动物为主的群体。
卵可以用于各种应用，诸如例如优选地通过将病毒或病毒样物质注射到被鉴定为含有活胚胎且雄性或雌性的每个卵中来用于疫苗生产。然后，在如此注射的卵的适当孵化后，可以从孵化的卵分离疫苗或疫苗基础物质。本发明的另外的优选实施方案是一种用于检测在卵流体样品中的物质的存在的方法，由此，通常0.1μl至35μl的范围内的样品可能就足够了。
相似性度量优选地包括将与正相关信号相关联的保留指数和裂解模式相关联。
此外，统计上显著的相似性可以被检测并登记为相关的生物标志物身份或多种生物标志物身份。确定统计上显著的相似性包括使用数据库以及为满足该方法的需求而开发的算法。
这可以包括对数据应用监督多变量分析、优选地偏最小二乘判别分析、PLS-DA或正交偏最小二乘判别分析，特别是当确定生物标志物对新物种的有用性时。
优选地，待确定的特性包括卵中的胚胎的性别、年龄、发育阶段和/或存活力。对于工业应用，检查大量卵的一个或更多个胚胎特性。
本发明的方法优选地是完全自动化的，从而提供了在与卵相关的样品中的生物标志物的自动化的且准确的测定。因此，该测定依赖于质谱法来鉴定生物标志物。有利地，该方法过滤和筛选质量和数据集的身份，这些数据集基于与样品中的某些所鉴定的生物标志物相关的电荷、质量和裂解模式的每个独特性质。
通过将示踪化合物数据的分析与已知性别的样品的文库相关联，可以有利地进一步改进性别确定的选择性。本发明的方法还有利地包括确定卵中的胚胎是能存活的且雄性的还是能存活的且雌性的，并且还允许将大量能存活的雄性卵与大量能存活的雌性卵分离，以形成以雄性卵为主的选择或以雌性卵为主的选择。这样形成的能存活的雌性卵选择或雄性卵选择可以有利地经受孵化和孵出过程，以形成以雌性雏鸡为主的群体或以雄性雏鸡为主的群体。
根据本发明的方法允许同时分析数百个或数千个卵以及从每个卵中取得的样品中的数百个或数千个生物标志物。该方法依赖于被示出与特性相关的生物标志物的数据库，所述数据库包括每个生物标志物的质量和光谱数据，并允许在给定样品中通过合适的软件来精确地鉴定生物标志物。
此外，可以通过筛选存在于样品中的生物标志物并基于与化合物到达质量检测器的时间相关的保留时间指数消除不期望的信号来为某些物种建立数据库。因此，可以在几分钟内分析许多序列并以高置信度鉴定给定生物标志物。因此，该方法是可自动化的、高通量的并且可由相对不熟练的技术人员操作，并且因此适合于在远程位置例如孵化场和养鸡场或养鱼场使用。
样品可以不经在先分离程序而经受质量分析。在这样的实施方案中，样品优选地通过使用例如静态纳米电喷雾原理的直接输注、流动注射分析或具有样品富集的流动注射来分析。
有利地，在质量分析之前处理样品，优选地以在将样品组分装载到质谱仪内之前分离样品组分。例如，样品处理包括通过单相或多相高压液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)或固相萃取(SPE)进行的样品分离。
质谱仪系统优选地为电喷雾电离(ESI)MS、基质辅助激光解吸电离-飞行时间(MALDI-TOF)MS或表面增强激光解吸电离-飞行时间(SELDI-TOF)MS或激光二极管电离解吸(LDID)MS。
根据本发明的方法有利地是自动化的，并且在计算机控制下被执行。通过与生物标志物的参考数据进行比较来进行样品中的生物标志物的鉴定；优选地，多种生物标志物的参考质量和光谱数据存储在计算机上。所定义的生物标志物的参考质谱优选地是从实际光谱和通过聚类计算获得的测量数据获得的平均光谱，如下面所阐述的。生物标志物可以单独地或与其他标志物组合，针对被客观地测量和评估为状况的指示物的特性诸如性别、年龄和存活力或营养状态是相关。有用的生物标志物可以是与特定状况或疾病相关的任何可鉴定和可测量的指示物，其中在生物标志物的存在或水平与状况的一些方面(包括发育阶段的存在)之间存在相关性。这种相关性可以是定性的、定量的，或者是定性的且定量的二者。一般，生物标志物是化合物、化合物片段或化合物组。这样的化合物可以是在生物体中发现的或由生物体产生的任何化合物，包括蛋白和肽、核酸、氨基酸、糖类和其他化合物。生物标志物可以被描述为“被客观地测量和评估为状况诸如性别、年龄和存活力或营养状态的指示物的特性”。生物标志物是与特定状况或疾病相关的任何可鉴定且可测量的指示物，其中在生物标志物的存在或水平与状况的一些方面(包括发育阶段的存在)之间存在相关性。这种相关性可以是定性的、定量的，或者是定性的且定量的二者。生物标志物还可以包括为示踪前体分子的代谢物的化合物，这些示踪前体分子已经被引入排卵亲本且然后由胚胎在其发育期间代谢，将示踪代谢物作为生物标志物排出。
从对照样品收集的对照光谱的数据库集优选地最初通过选择给定鸡种的特定性别的样品来被编译。完整的文库或数据库被设想为包含两种性别的样品。
具体地，分类(typing)基于在紫外线和可见光范围二者的部分内出现的光谱差异。目前，这些差异的来源是未知的，但它可能是由于在分子水平的内在吸收差异。
另外，计算装置包括驻留在计算机中的软件装置。
本领域技术人员可以认识到，可以设想另外的实施方案，包括用于表征其他卵组分及它们的成分，例如但不限于尿囊液、蛋黄、蛋白(egg white)和卵壳的系统和方法。
本发明还涉及卵选择，以及涉及在孵出后通过该方法可获得的雏鸡或雏鸡群体。
本发明还涉及一种用于在卵内确定卵生动物物种——更一般地，即不限于家禽，或者甚至更具体地不限于家鸡的胚胎的性别、存活力和/或发育阶段的方法、系统和食物产品。
因此，本发明还涉及一种用于在卵内确定卵生动物物种的胚胎的性别、存活力和/或发育阶段的方法。本发明的方法还涉及雄性卵和雌性卵的选择以及使用这些所选择的卵生产活动物的群体。卵生动物产卵，在母亲体内有很少或没有其他胚胎发育。这是大多数鱼、两栖动物、爬行动物、所有鸟类以及大多数昆虫、软体动物和蛛形纲动物的繁殖方法。卵生动物及其卵的培育迎合了全球蛋白供应的不断增长的部分以及各种其他大规模工业过程，例如疫苗生产。目前，用于培育卵生动物的最重要的方法包括饲养禽类物种诸如家禽以及水产养殖，即养殖水生生物诸如鱼类、甲壳动物和软体动物。
本发明还涉及一种用于在卵内鉴定卵生动物胚胎的性别、存活力和/或发育阶段的方法，所述方法包括：a.向排卵母体提供包括示踪前体物质的食物产品，所述示踪前体物质包括可接受作为食物中的添加剂使用的至少一种示踪前体化合物；b.将卵孵化一段合适的时间以允许示踪前体化合物的代谢，以形成合适量的至少一种示踪化合物；以及c.使卵或来自卵的样品经受分析，以确定一种或更多种示踪化合物的存在和量，以及d.从在步骤(c)中获得的数据确定卵生动物胚胎的性别、存活力和/或发育阶段。
大多数卵生动物物种的卵倾向于实现雄性和雌性动物的大致相等的分布。然而，出于各种原因，在孵化场管理中，可能期望基于各种特性、特别是性别来分开动物。例如，在商业家鸡和鸡蛋生产中，雄性雏鸡的孵化和饲养是非常不期望的，导致每年扑杀数十亿只雄性雏鸡。在虾和对虾生产中，由于诱导卵的成熟所需的过程，期望只饲养雌性群体。
目前，在这两种情况中，孵出的动物的混合群体通过目视评估幼年动物、有时甚至在幼年动物没有合适特征的情况中通过目视评估成年群体来经受性别鉴定。在任一种情况中，这都是非常耗时的过程，需要高度熟练的操作人员，且通常对动物来说压力很大。并且，在成年动物被进行性别鉴定的情况中，整个群体需要被饲养到最低年龄，而这样饲养的动物中只有一半在分离后用于繁殖。另外的问题可能出现，其中例如雄性群体的存在可能由于例如同类相食和降低的养殖密度而导致降低的繁殖能力，如例如从淡水对虾淡水长臂大虾(M.Rosenbergii)报告的。
同样在鱼类养殖中，鱼类的社会性别(gender)或生理性别(sex)的确定将允许饲养以雄性或雌性为主的单性别群体，从而允许更具体地以群体的生长和健康为目标，如目前对尼罗罗非鱼实践的，尼罗罗非鱼优选地以全雄性群体来培育。再次，在大多数鱼类中，只有在幼年晚期或成年阶段才可以通过目视检查来确定性别，使得复杂的繁殖模式和特定的群体必须使用“超级雄性”混合种被建立，这可能倾向于增加遗传紊乱的存在，且也可能倾向于与非常小的遗传群体扩散相关的某些疾病。
此外，有一定百分比的未受精的，或者在孵化期开始时不包含能存活的胚胎的卵，这大大降低了在孵化场所使用的特别是用于家禽卵的孵化器的容量。
结果是，需要比如果早期性别选择可用所必要的孵化能力大至少两倍的孵化能力，该早期性别选择允许选择主要为仅雄性的胚胎或主要为仅雌性的胚胎。
因此，如果允许在孵化阶段之前确定禽类胚胎的性别的早期方法是可用的，那么通过减少所需的能量和其他资源的数量对环境、但同样对通过扑杀来消除不必要的动物以及减少新孵出的动物的压力有很大的价值，也允许大大提高孵化器的容量。另一个好处是，如果该方法也允许相对于未受精的卵和/或原本不能存活的卵而选择能存活的胚胎，则进一步提高孵出过程的效率。
对于鱼或虾，已经公布了各种主要基于PCR或抗体的方法。然而，这些方法是相当昂贵和复杂的。
因此，仍然存在对用于在卵内非破坏性地确定卵生动物胚胎的性别、发育阶段和/或存活力的更快却更容易应用的方法的需求。
因此，本发明的另一个目的是提供一种用于在卵内鉴定卵生动物物种的胚胎的特性的方法，该方法包括：(a)使与包含胚胎的卵相关的材料的样品经受质谱分析，并记录保留时间指数和相应质量以及检测到的每个信号的质量；(b)将对应于每个信号的质量与对该物种特异性的生物标志物质量的参考数据库相关联，以形成一个或更多个信号和一个或更多个参考生物标志物之间的相关性；(c)通过使用相似性度量将每个相关信号的质谱与相关参考生物标志物的质谱进行匹配来确认每个相关信号和参考生物标志物之间的相关性，以定义至少一个正相关信号；以及(d)测量每个正相关信号的强度，并对它的绝对信号强度或相对信号强度进行评分；以及(e)从判别函数获得的评分值应用阈值，以确定与相关生物标志物的存在和浓度相关的胚胎的特性。
另一个目的是提供用于在孵化场中使用的这种仪器。又一个目的是提供一种能够在远程位置例如孵化场或水产养殖场执行卵的实时在线分析的系统。这些和其它目的通过本发明的装置和方法来解决。因此，本发明涉及一种用于在卵内鉴定与卵生动物物种的胚胎的特性相关的一种或更多种生物标志物的方法，该方法包括：在质谱仪中分析具有已知性别的来自物种的多个卵的多个样品以获得多个质谱，以建立生物标志物模式，以及鉴定质谱执行模式以获得生物标志物模式，以及基于生物标志物模式来确定与胚胎的至少一个特性相关的生物标志物和生物标志物水平。
在另一方面中，主题方法还涉及大量能存活的雌性卵，形成以雄性卵为主或以雌性卵为主的选择。在又一方面中，主题方法还涉及根据本发明的方法可获得的幼年动物群体。在又一方面中，主题方法还涉及从所述方法可获得的大量卵用于动物和/或人类食物生产、用于美容、医学和/或营养化合物的生产和/或分离、用于通过发酵进行的甲烷生产、疫苗生产和/或高质量肥料生产的用途。
在又一方面中，主题方法还涉及一种卵生动物胚胎性别检测和分析系统，所述系统包括用于执行主题方法的优选地全自动化的装置。
在又一方面中，本发明涉及一种用于在卵内鉴定卵生动物胚胎的性别、存活力和/或发育阶段的方法，所述方法包括：(a)向排卵亲本提供包含示踪前体物质的食物产品，所述示踪前体物质包括可被接受用作食物中的添加剂的至少一种示踪前体化合物，以及(b)将卵孵化一段合适的时间以允许示踪前体化合物的代谢，以形成合适量的至少一种示踪化合物；以及(c)使卵或来自卵的样品经受分析，以确定一种或更多种示踪化合物的存在和量，以及(d)从步骤(c)中获得的数据确定卵生动物胚胎的性别、存活力和/或发育阶段。
在另一方面中，本发明还涉及用于确定胚胎性别、存活力和/或发育阶段的食物产品，以及示踪前体化合物在动物食物中的用途。
本发明还涉及系统，其中性别鉴定设备在与光谱系统通过接口连接的电子设备上用软件实施；并且优选地其中鉴定设备包括驻留在计算机中的软件装置。
图1描绘了A)对单个特征的逻辑回归分类模型。对所有所测量的特征评估单个预测模型，并使用从第9天起提供了>90％准确度的特征1599观察到最佳的准确度。B)对两个特征的逻辑回归。对所有可能的所测量的特征对评估逻辑回归模型。在检查了测量的稳健性之后，由从第10天起提供>95％准确度的特征1599和特征507的组合实现最佳性能。
因此，本方法涉及特征诸如性别的相对确定。这可以通过添加另外的特征以及通过例如去除异常值或具有可疑特征的卵来显著增加，从而显著增加准确度。
图3示出了在850秒从雄性(深灰色)和雌性(浅灰色)样品中提取的具有范围从220至145的各种质量峰的化合物的色谱图。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。在本发明的说明书中使用的术语在本文中仅用于描述特定的实施方案的目的，且不意图限制本发明。许多卵生动物物种是在商业上饲养的。
“水产养殖”包括在受控条件下培育淡水群体和盐水群体，且可以与商业捕鱼相反，商业捕鱼是收获野生鱼类和其他海洋动物。
在本文中，“鱼类”物种包括缺少具有手指的四肢的所有具鳃水生具颅骨的动物。被包括在此定义中的是目前现存的盲鳗、七鳃鳗、软骨和硬骨鱼类物种，无论是海洋鱼类还是淡水鱼类。在商业上培育的重要鱼类物种或科包括淡水鱼类的鲤科(Cyprinidaefamily)的成员，诸如鲤鱼(carp)、真鱥(true minnow)及其亲缘动物，例如鲅鱼(barb)、鲅鱼(barbel)和鲶鱼(Catfish)以及巨鲶科(Pangasiidae)、草鱼(Grass carp)、鲤鱼(commoncarp)、鳙鱼(Bighead carp)、白鲢(silver carp)、厚唇鲃(Catla)、黑鲫(Crucian Carp)等；鲑科(Salmonidae)，包括鲑鱼(salmon)、鳟鱼(trout)、嘉鱼(chars)、淡水白鲑(freshwater whitefish)和茴鱼(grayling)，例如大西洋鲑鱼(Atlantic salmon)、海鳟鱼(Sea trout)和虹鳟鱼(Rainbow trout)；鮨科(Serranidae)，诸如尖吻鲈(barramundi)或亚洲海鲈(Asian seabass)、日本海鲈(Japanese seabass)、欧洲海鲈(Europeanseabass)；尖吻鲈科(Latidae)；鲷科(Sparidae)，诸如海鲷(sea breams)和鲷(porgies)；丽鲷科(Cichlidae)，诸如尼罗河罗非鱼(Nile tilapia)或莫桑比克罗非鱼(Mozambiquetilapia)，以及鲟科(Acipenseridae)，诸如大西洋鳇(Atlantic sturgeon)或欧洲鳇(beluga sturgeon)。
在本文中，“甲壳动物”指具有分开的性别并有性繁殖的一组节肢动物物种，其包括常见动物例如螃蟹、龙虾、淡水螯虾(crayfish)、虾。
在本文中，“螃蟹”是短尾目(brachyura)的十足目甲壳动物。
在本文中，“虾”和/或“明虾(prawn)”指任何种类的可培育的甲壳动物，诸如盐水或咸淡水水产养殖的对虾科(Penaeidae)，优选地明虾的对虾属(penaeus)，包括斑节对虾(giant tiger prawn)、斑节对虾(P.monodon)、太平洋白虾(Pacific white shrimp)、南美白对虾(Litopenaeus vannamei)；西部蓝虾(P.stylirostris)；中国白虾(P.chinensis)；日本对虾(P.japonicus)；印度白虾(P.indicus)；香蕉虾(P.merguiensis)；和真虾下目(Caridea)或枝鳃科(Dendrobranchiata family)的其他成员；以及淡水养殖的甲壳动物，诸如例如淡水长臂大虾(Macrobrachium rosenbergii)、日本沼虾(M.nipponense)和马氏沼虾(M.malcolmsonii)；来自螯虾总科(Astacoidea)和拟螯虾总科(Parastacoidea)的淡水螯虾，诸如原螯虾属(Procambarus)；和来自海螯虾科(Nephropidae)和螯龙虾科(Homaridae)的可培育的龙虾物种以及来自龙虾科(Palinuridae)的多刺龙虾。
在本文中，“软体动物”指被称为软体动物目的大型无脊椎动物门，包括头足纲(cephalopod)软体动物，诸如枪乌贼(squid)、墨鱼(cuttlefish)和章鱼(octopus)；具有分开的性别以及其中受精是体外的的双壳类贝类，诸如多板纲(polyplacophora)、掘足纲(scaphopod)和象牙贝(tusk shell)。
如本文中使用的术语“禽类”和“鸟类”包括雄性或雌性的任何禽类物种，但主要旨在包括为了蛋或肉而在商业上饲养的家禽。因此，术语“鸟类”和“禽类”特别旨在包括鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子、鸵鸟、鸸鹋和雉。
在本文中，术语“孵化”指卵生动物诸如鸟类孵出它们的卵的过程，以及离开成体的引导后卵内的胚胎的发育。在本文中，孵化期指不间断的时间，在该不间断的时间期间，特定的卵经受模拟孵卵的条件直到孵出即出现幼稚为止，包括任何处理或从例如孵化器到孵化场单元的转移，只要动物的发育没有停止。
如本文使用的术语“在卵内”指在孵出前包含在卵内的胚胎。本发明可以用任何类型的鸟、鱼、软体动物、爬行动物或甲壳动物卵来实践，包括但不限于(家养)鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑和雉卵、鱼诸如鲤鱼、鲑科鱼或罗非鱼卵、虾或对虾卵以及软体动物卵。
在本文中术语“注射(injection)”和“注射(injecting)”包括将装置(通常是细长装置)插入卵或胚胎内的方法，包括将物质递送或释放到卵或胚胎中的方法、从卵或胚胎中取出物质(即样品)的方法和/或将检测器装置插入卵或胚胎中的方法。
在本文中术语“质谱法”指基于离子的质量来分选离子的分析技术。质谱法通常用于在许多情况中的化学分析，并且可以应用于从石油的复杂混合物到基因工程的产品的任何样品。简而言之，质谱将给出样品的确切化学组成的图像。
质谱是离子信号作为质荷比的函数的曲线图。这些光谱用于确定样品的元素特征或同位素特征、颗粒和分子的质量，并阐明分子的化学结构。质谱法使化学化合物电离以生成带电分子或分子碎片，并测量它们的质荷比。
在典型的MS过程中，样品(其可能是固体、液体或气体)被电离，例如通过用电子轰击它。这可能引起一些分子分裂成带电的碎片。然后，这些离子根据它们的质荷比分离，通常通过使它们加速并使它们经受电场或磁场。相同质荷比的离子将经历相同量的偏转。
离子由能够检测带电粒子的合适机构诸如电子倍增器检测。结果被显示为被检测的例子的相对丰度作为质荷比的函数的光谱。样品中的原子或分子可以通过将已知质量与所鉴定的质量相关联或通过特征裂解模式来鉴定。在本上下文中，质谱法应用于鉴定和检测合适的生物标志物。质谱法(MS)是一种有价值的分析技术，因为它以非常高的灵敏度测量分子的内在特性，即它的质量。因此，MS可用于测量宽范围的生物标志物分子和宽范围的所取样的材料。已知正确的样品制备对于MS信号生成以及光谱分辨率和灵敏度至关重要。因此，样品制备是分析的总体可行性和灵敏度的关键领域。
用于生物标志物的质谱表征的优选方法包括基质辅助激光解吸电离(MALDI)和电喷雾电离(ESI)。任一种方法可以有利地与飞行时间(TOF)或其它类型的质谱传感器组合，以确定生物标志物的质量和/或裂解模式。优选地，质谱分析法在本文可以与色谱和其它分离技术串联地使用。
MALDI通过用激光器脉冲样品来操作。这种处理使样品蒸发并电离。然后在TOF分析仪中确定带电离子的分子量(质量)。在这个设备中，电场使带电分子朝着检测器加速，且电离碎片到达检测器所花费的时间长度的差异(即它们的飞行时间)揭示生物标志物的分子量，因为较小的化合物更早到达检测器。
这种方法产生样品的质量分布图，即混合物中的化合物的分子量和量的分布图。这些分布图然后可以用于从生物标志物数据库中鉴定已知的生物标志物。
使用与液相色谱法的ESI-MS接口(LC/MS/MS)，来自LC柱的洗脱化合物被引入到质谱仪的离子源内。电压被施加到细针上。然后，针将液滴喷射到质谱分析仪中，在那里液滴蒸发，且对应于裂解的各种电荷状态并且可从其确定组成的生物标志物离子被释放。可选择地，SPE(固相萃取)或气相色谱法可以与质谱仪偶联。特别是，发现SPE/MS/MS对于本发明的方法的自动化和高通量工业应用是有用的，诸如使用Agilent Rapidfire MS装置(Rapidfire是Agilent Inc.的注册商标)、Photronics The LDTD(激光二极管热解吸)离子源(LDTD是Photronics Inc.的注册商标)。
串联质谱法(MS/MS)涉及通过与目标气体的碰撞来活化前体离子，并可能产生带电碎片和中性碎片。碎片离子的性质以及它们的强度常常指示前体离子的结构，且因此可以产生对未知分析物的鉴定有用的信息，以及为不同类别的分析物提供有用的筛选技术。通过多次碰撞进行活化既延长了活化时间，又使更高的能量能够聚积到前体离子中。较高的碰撞气体压力也意味着较高的碰撞松弛率。
优选地，根据本发明的胚胎特性的确定是作为非破坏性的方法来执行的，即，允许如此测试的胚胎生长——如果期望这样，或者使它经受另外的步骤，诸如卵内疫苗生产，条件是胚胎是能存活的。
在本文中术语“尿囊液”包括在从禽类卵衍生时具有或不具有其他卵物质的存在的尿囊液。例如，术语“尿囊液”可以包括血液和尿囊液的混合物。本发明的实施方案不限于从尿囊液或从在卵的上表面附近的区域提取物质。如本文所述的从尿囊液中取出材料仅作为本发明的可能的实施方案的一个实例被提供。如下所述，各种材料——包括但不限于羊膜、卵黄(yolk)、外壳、蛋清(albumen)、组织、膜和/或血液——可以从卵中被提取并被提交给分光光度分析进行测定，以鉴定胚胎的性别。
在需要的情况中，材料可以从实际上具有任何定向的卵中提取。在本文中术语“预定位置”指示卵内的固定位置或深度。例如，可以将设备注射到卵中至卵中的固定深度和/或固定位置。在可选择的实施方案中，可以基于从卵获得的信息，例如关于胚胎或胚盘下腔在卵内的位置信息来执行注射。
可选择地，特别是在软体动物、鱼或虾卵的情况中，当与禽类卵相比时，这种卵的高度半透明性以及它们相对小的尺寸可以允许通过对整个卵的直接的非侵入性测量来进行直接的非侵入性分析。
术语“比较光谱”有利地可以包括所测量的光谱的单变量分析或优选地多变量分析，以及禽类胚胎与某个群体的关联的确定。该步骤可以包括通过光谱数据的多变量统计分析来确定光谱中某些信号峰的存在。多变量统计分析程序优选地包括主成分分析程序和/或偏最小二乘回归分析程序。因此，主题发明还涉及一种用于在卵内确定禽类胚胎的性别和/或存活力的方法、装置和系统，所述方法、装置和系统包括多变量统计分析程序以及用于其确定的微处理器实现的过程。
因此，该比较优选地包括使用所测量的光谱的多变量分析来估计样品的性别的可能性，以及确定禽类胚胎与某个群体的关联。有利地，这使用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)来执行。
该方法优选地包括示踪化合物数据的数学处理，并且包括多变量分析，诸如PCA(主成分分析)，优选地随后是监督分析，更优选地是PLS-DA(偏最小二乘-判别分析)或者甚至更优选地是正交PLSDA或者类似的合适的统计方法。
在主题方法中的模式匹配步骤将鉴定某个相似性度量。使用相似性度量来确认生物标志物的正确结构。这种确认是通过光谱匹配来进行的。光谱匹配通过比较样品光谱和数据库中的参考光谱来执行。对于在这个阶段的肯定身份(positive identity)，需要适当的相关性以便确认准确的确定。合适的阈值和相似性度量对本领域技术人员是明显的。
该方法试图将大量数据减少到可管理的大小，并应用统计驱动模型，以便确定指示在所观察的数据之间的隐藏关系的潜在变量。
然后，性别鉴定设备过滤样品数据，这将鉴定样品中的感兴趣的簇。这些簇代表样品中的相似性并被用来鉴定性别分布。优选地，分析包括主成分分析(PCA)和PLS-DA。
PCA使用数学算法来确定数据集中的差异和相似性。PCA将多个可能相关的变量转换成被称为主成分的较少量的不相关的变量。第一主成分尽可能多地解释数据的可变性。每个附加的成分都试图尽可能多地解释数据中的剩余的可变性。所收集的数据可以布置在矩阵中，且PCA用平方和以及叉积来对正方形对称矩阵的“特征值(eigenvalue)”和“特征向量(eigenvector)”求解。
与最大特征值相关的特征向量具有与第一主成分相同的方向。与第二最大特征值相关的特征向量确定第二主成分的方向。特征值之和等于正方形矩阵的迹(trace)，且特征向量的最大数量等于这个矩阵的行(或列)的数量。一旦被确定，就可能绘制所计算的特征值排列图(screen plot)。本领域技术人员将认识到，许多不同的算法可以用于计算特征值和特征向量。使用两个图显示数据：i)示出群聚类的评分图和ii)负载图，其中负责群聚类的光谱数据被鉴定为离原点最大距离的那些光谱数据。
根据本发明的方法优选地包括：(a1)提供包括卵液的样品；以及(a2)从样品中获取光谱。优选地，步骤(b)还包括由于在任意两个样品之间的浓度差而使强度效应归一化的步骤。任选的步骤(a3)优选地通过合适的方法诸如超滤或离心来从样品中除去浑浊。
优选地，胚胎是禽类胚胎、爬行动物胚胎、甲壳动物、鱼类或软体动物。最优选地，由于家禽培育的高度重要性以及由于允许取样的卵相对较大，使禽类胚胎经受测试。
本发明的方法有利地可以确定卵中的胚胎是能存活的且雄性的还是能存活的且雌性的，并且将所测试的卵分成大量能存活的雌性卵以及大量能存活的雄性卵和大量不能存活的卵，以形成以雄性卵为主的选择或以雌性卵为主的选择，或者以不能存活的卵为主的选择。如果期望是这样的，则可以使能存活的雌性卵或雄性卵选择经受孵化和孵出过程，以形成以雌性动物为主的群体或以雄性动物为主的群体。
从结合附图使用的以下描述中，将更好地理解关于组织和操作方法的表征本发明的特征以及本发明的另外的目的和优点。应当明确地理解，附图是为了说明和描述的目的，而并不意图作为本发明的限制的定义。当结合附图阅读现在接下来的描述时，由本发明达到的这些和其它目的以及由本发明提供的优点将变得更足够明显。
根据本发明的实施方案的方法和装置可用于在胚胎发育期期间(也被称为其孵化期)的任何时间鉴定卵的一个或更多个特性。本发明的实施方案不限于在胚胎发育期间的特定的一天。
本发明的方法可以以两种方式实现；使用内标物来为定量信号强度提供参考，以及不使用这样的标准品。因此，在一个实施方案中，在通过质谱法分析之前，将一个或更多个内标物添加到样品。优选地，内标物被标记。有利地，然后可以通过测量生物标志物信号强度并将它与一个或更多个已知内标物的信号强度进行比较来给每个生物标志物信号的绝对信号强度评分。在替代实施中，在不添加内标物的情况下处理样品。在这样的实施方案中，通过测量样品中的单独生物标志物信号强度和样品组的参考信号强度之间的比率来对相对信号强度评分。
相似性度量优选地包括将与正相关信号相关联的保留指数和裂解模式相关联。
此外，统计上显著的相似性可以被检测并登记为相关的生物标志物身份或多种生物标志物身份。确定统计上显著的相似性包括使用数据库以及为满足该方法的需求而开发的算法。
这可以包括对数据应用监督多变量分析、优选地偏最小二乘判别分析、PLS-DA或正交偏最小二乘判别分析，特别是当确定生物标志物对新物种的有用性时。
优选地，待确定的特性包括卵中的胚胎的性别、年龄、发育阶段和/或存活力。对于工业应用，检查大量卵的一个或更多个胚胎特性。
在根据本发明的方法中，可以通过筛选存在于样品中的生物标志物并基于与化合物到达质量检测器的时间相关的保留时间指数消除不期望的信号来为某些物种建立数据库。因此，可以在几分钟内分析许多序列并以高置信度鉴定给定生物标志物。因此，该方法是可自动化的、高通量的并且可由相对不熟练的技术人员操作，并且因此适合于在远程位置例如孵化场和养鸡场或养鱼场使用。
样品可以不经在先分离程序而经受质量分析。在这样的实施方案中，样品优选地通过使用例如静态纳米电喷雾原理的直接输注、流动注射分析或具有样品富集的流动注射来分析。
质谱仪系统优选地为电喷雾电离(ESI)MS、基质辅助激光解吸电离-飞行时间(MALDI-TOF)MS或表面增强激光解吸电离-飞行时间(SELDI-TOF)MS或激光二极管电离解吸(LDID)MS。
特别是，发现SPE/MS/MS对于本发明的方法的自动化和高通量工业应用是有用的，诸如使用Agilent Rapidfire MS装置(Rapidfire是Agilent Inc.的注册商标)、Photronics The LDTD(激光二极管热解吸)离子源(LDTD是Photronics Inc.的注册商标)。
如上面所阐述的，本发明还涉及用于确定胚胎性别、存活力和/或发育阶段的食物产品，以及示踪前体化合物在动物食物中的用途。申请人惊奇地发现，在排卵亲本的食物中添加合适的前体化合物导致在胚胎发育期间在卵中的前体化合物的代谢物的不同表达。
作为结果，根据胚胎的特性诸如胚胎的性别，卵示出了某些代谢物的可测量的变化。优选地，至少一种示踪前体化合物选自被美国食品和药品管理局(FDA)和/或欧盟委员会列为可允许的食物添加剂的化合物。特别合适的示踪前体化合物可以选自丁基羟基苯甲醚(BHA)和/或相关化合物丁基化羟基甲苯(BHT)，其是适当地添加到食物中以保存脂肪的酚类化合物。本文中，BHA指异构体3-叔丁基-4-羟基苯甲醚和2-叔丁基-4-羟基苯甲醚的混合物；而BHT指3,5-二叔丁基-4-羟基甲苯；也被称为甲基二叔丁基苯酚；2,6-二叔丁基对甲酚。BHA和BHT是已知的抗氧化剂；据信氧优先与BHA或BHT反应而不是氧化脂肪或油，从而保护脂肪或油不变质。除了是可被氧化的之外，BHA和BHT是脂溶性的。示踪前体材料优选地以被计算为在产品中提供该示踪化合物或每种示踪化合物的预定浓度的量添加到食物产品中。优选地，示踪前体物质以被计算为提供卵或卵样品中的该示踪化合物或每种示踪化合物的以浓度从5ppb到5ppm的范围内、更优选地以从约10ppb到1000ppb以及还更优选地50ppb-500ppb的范围内的浓度的量添加到产品中。
示踪物质可以有利地包括多于一种示踪化合物，示踪化合物的相对量被选择以提供卵生动物胚胎的性别、存活力和/或发育阶段的可鉴定特性，其中执行卵或卵样品的分析以鉴定示踪化合物的特征相对量。优选地使用质谱仪诸如例如离子迁移率传感器来执行分析。样品可以首先经受液相色谱法、气相色谱法或优选地与合适的传感器结合的气相色谱法的组合。MS传感器的替代物可以是火焰光度检测器。
优选地，在侵入性或非侵入性地分析卵液的步骤之后，可以在分析之前分离、衍生或浓缩存在于取自卵的样品中的至少一种示踪化合物。优选地，特征将被研究的胚胎是禽类胚胎、爬行动物胚胎、甲壳胚胎、鱼类胚胎或软体动物胚胎。更优选地，胚胎是禽类胚胎，优选地是物种家鸡的胚胎，或者其中胚胎是选自包括以下的组的甲壳动物物种的胚胎：对虾科(peneidae)、螯虾总科和拟螯虾总科、沼虾属(Macrobrachiae)；螯虾总科；拟螯虾总科；海螯虾科(Nephropidae)和螯龙虾科(Homaridae)，或者其中胚胎是优选地选自以下的鱼类物种的胚胎：鲤鱼、罗非鱼、鲶鱼、鲷鱼、海鲈、金枪鱼、鲭鱼、鲣鱼或鰤鱼。
本发明还涉及一种供排卵亲本动物使用的食物产品，所述食物产品包括适当量的示踪前体化合物。
对样品的性别的可能性的估计优选地包括对数据应用监督多变量分析、优选地偏最小二乘判别分析、PLS-DA或正交偏最小二乘判别分析。
有利地，可以从群体中去除异常值，从而更多地增加对该确定的确定性，同时也有助于使卵的流用于其他目的。
本发明的方法还有利地包括将卵分成大量雄性卵或雌性卵；它还可以有利地包括确定胚胎的存活力，并将卵分成一个或更多个，优选地大量能存活的卵和不能存活的卵。
其中异常值从群体中被去除的本方法还有利地包括确定卵中的胚胎是能存活的且雄性的还是能存活的且雌性的，并且将大量能存活的雄性卵与大量能存活的雌性卵中卵和异常值分离，以形成以雄性卵为主或以雌性卵为主的选择。
本方法还有利地包括使能存活的雌性卵或雄性卵选择经受孵化和孵出过程，以形成以雌性动物为主或以雄性动物为主的群体。
胚胎的存活力可以有利地使用所测量的生物标志物来确定。对于未受精的卵以及在某个时间段之后(即在新陈代谢结束后几分钟)死亡的胚胎，测量结果明显完全在测量窗口之外，导致异常值从能存活的卵中去除。同样，至少在禽类胚胎的情况中，当使用例如尿囊的样品时，由于保持蛋黄分离的膜的溶解，在代谢活动结束后，这些样品将很快变得浑浊(perturbed)并最终变黄。此外，可以测量心跳或血流量，以确定胚胎代谢活动。
本发明还涉及可从本文公开的方法可获得的大量卵用于动物和/或人类食物生产、用于美容、医学和/或营养化合物的生产和/或分离、用于通过发酵进行的甲烷生产、疫苗生产和/或高质量肥料生产的用途。
提供以下非限制性实例来阐述本发明。
实施例1：
样品装运和储存
对于生物标志物发现，采用了多种分析代谢物分布平台，这些平台是生物胺、负极性脂质、非目标全局分布和GC-MS。
在发现阶段中，分析了100个样品。来自在营养和品种方面具有不同背景的卵的另一组350个样品被分析用于确认阶段，发现在至少两个平台上发现性别和年龄的生物标志物。
尿囊液的前150个样品(来自褐鸡(brown chicken))在孵化第7-11天被收集，并储存在-80℃。
使用PCR方法来制备这些样品的遗传性别确定数据。每天每性别地选择样品，而当前组的过量样品被用于NMR分析。然后使用胺、负极性脂质、CG-MS(对于糖类化合物)和全局分布平台来分析这些样品的代谢分布。
在孵化场收集孵化7-11天的褐鸡的另外300个尿囊液样品。
提供遗传性别分析，但直到构建统计模型才使用。这些样品用于确认先前的全局分布分析发现的特征。此外，从白蛋(Hey家系CV 24)收集59个样品并将其也用于这项确认研究。
等分试样
样品在等分之前在4℃解冻过夜。将样品漩涡并如下地手动等分：5μL用于胺分布，50μL用于负极性脂质分布，以及100μL用于GC-MS(糖类化合物分析)。质量控制(QC)池通过从每个样品取相等的量，然后充分混合而产生。
批量设计
对于发现阶段，样品被随机排列并分布在两批上用于胺测量。对于负脂质和全局分布，样品在一批中运行。每七个样品选择一次重复，且还包括校准线、QC和空白。每10个样品分析QC，它们用于评估数据质量并校正仪器响应。空白用于从研究样品中减去背景水平。
使用Agilent MassHunter定量分析软件(Agilent,版本B.05.01)来对原始数据进行预处理。
胺分布
除非另外指明，所有提到的设备、供应品和软件都来自Waters(Etten-Leur,TheNetherlands)。胺平台覆盖氨基酸和生物胺，采用改编自Waters的AccQ-标签衍生策略。简而言之，向尿囊液样品(每个5μL)掺入了内标物溶液(表1)，且然后是MeOH(Actu-AllChemicals)脱蛋白。将上清液(10.000rpm，10℃，10分钟)在真空条件下干燥。残余物用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)试剂在硼酸盐缓冲液(pH 8.5)中重构。衍生反应用10μL 20％甲酸(Acros Organics)中和。将上清液(10.000rpm，10℃，10分钟)转移到小瓶中，并置于冷却的(10℃)自动进样器盘中，直到注射(1μL)到UPLC-MS/MS系统中为止。
数据分析
使用TargetLynx软件评估所采集的数据，并整合所分配的MRM峰值。MRM峰使用适当的内标物来归一化，对于氨基酸的分析，使用它们的13C15N标记的类似物，并且对于其他胺，使用最接近洗脱的内标物。空白样品用于校正背景。使用汇集的QC样品应用内部开发的算法来校正质谱仪在批次之间的灵敏度的漂移。
执行探索性数据分析，以研究是否可以发现性别特异性特征。对此，在我们通常使用来发现生物标志物的BMFL中应用这个单变量和多变量标准数据分析方法。
然后样品在自动化高通量偶联的SPE/MS/MS Rapidfire装置以及LDPD Phytronix装置中经受测试。结果表明，能存活的卵的性别以高于95％的准确度以每样品不到10秒的时间内被确定。图1示出了对性别确定得到的确定性，当两种生物标志物被一起考虑时确定性在第9天或第10天合计大于95％。
孵出
被认为是雄性或雌性的一系列25个卵已经经受上面阐述的取样，使用商业孵化装置和一般孵化条件来允许测试继续进行到孵出。所有幼雏都有效地从卵中出现，显示取样的可行性。孵出的雏鸡是完全雄性或完全雌性的群体。
实施例2：使用挥发物和固相微萃取(SPME)的非侵入性确定
挥发性样品收集是通过将单个卵转移到用铝箔和金属盖密封的玻璃瓶中来执行的。然后，将瓶放在加热板上，同时将瓶内部的温度保持在37℃。将瓶内的卵留置15分钟，以与瓶内的顶部空间达到平衡。收集纤维材料在使用前根据制造商的说明被调节。然后，插入纤维并在50分钟期间执行提取。在提取后，在5分钟期间在气相色谱注射器上引入纤维，用于以无分流模式在250℃解吸分析物。在挥发物收集后，立刻将卵返回到孵化器。通过对空瓶进行SPME来制造空白，并且在分析之前重新调节纤维，以确保峰的不存在和SPME程序的良好质量。
然后，在配备有Agilent Technologies(Wilmington,DE,USA)质量选择检测器(MSD 5975C)的Agilent Technologies 7890A上通过气相色谱法测量从卵释放的挥发物。在具有25m(Agilent)的膜厚度的HP-5MS UI(5％苯基甲基硅氧烷(phenyl methyl silox))30m×0.25m ID柱上使用流速为1mL/min的氦气作为载气来执行色谱分离。使用具有电子电离(EI，70eV)的单四极杆质谱仪。质谱仪以扫描模式操作。为了提取挥发性化合物，使用具有保持架的60μm PDMS/DVB Stableflex 24号固相微萃取(SPME)纤维。使用MSDChemstation F.01.00.1903将原始数据转换成CDF格式。XCMS脚本在R软件(R版本3.2.0)上被设计和应用，以执行峰挑选。用于峰挑选的方法是“matchedFilter”，fwhm＝4(峰宽)，步长＝0.5(质量窗口)，snthresh＝5(S/N)。Metaboanalyst 3.0用于统计分析。最后，根据所获得的结果，MassHunter定性分析B.005.00被用来手动地验证最重要的特征。NIST质谱库2.0版用于鉴定。
在这个方法中，从每个样品的TIC中获得在以秒计的不同保留时间的不同质量的1486个特征。在提取这些特征后，它们通过使用metaboanalyst3.0的测试应用单变量方法处理，以99％的置信度鉴定性别区分特征。
申请人发现，在雄性卵和雌性卵之间显示显著差异的特别相关的生物标志物是丁基化羟基甲苯，其是以BHT为前体的衍生物。
雌性卵显示与雄性卵相比明显更高浓度的丁基化羟基甲苯。因此，示踪前体的使用导致允许以完全非侵入性的方式以高确定性区分卵内的雄性和雌性鸡胚胎的生物标志物。

Claims (13)

1.一种用于在卵内非破坏性地鉴定家鸡(Gallus Gallus domesticus)胚胎的特性的方法，所述方法包括：
(a)在包含所述胚胎的卵的孵化开始后的7至11天的时间段内获得与所述卵相关的材料的样品，其中所述样品取自尿囊液以及
(b)测量所述样品中的生物标志物的存在的评分值和浓度，所述评分值和所述浓度指示所述胚胎的特性，以及
(c)对在(b)中获得的所述评分值和浓度应用阈值，以鉴定与所述生物标志物的存在和浓度相关的所述胚胎的特性，
其中所述生物标志物包括具有在从140g/摩尔至190g/摩尔的范围内的分子量的氨基化合物；其中步骤(c)还包括：
(i)通过使用相似性度量将每个相关信号的光谱与相关参考生物标志物的预期光谱相匹配来将每个相关生物标志物信号与参考生物标志物相关联，以定义正相关信号；
(ii)测量每个正相关信号的强度，并对它的绝对信号强度和/或相对信号强度进行评分；以及
(iii)对从相似性函数获得的所述评分值应用阈值，以确定相关胚胎特性；
其中所述生物标志物的存在和浓度与可能发育成雄性成体或雌性成体的胚胎相关，并且其中所述生物标志物是3-[(2-氨基乙基)硫烷基]丁酸。
2.根据权利要求1所述的方法，包括应用磁共振成像法、光谱共振法、与一个或更多个合适的检测器偶联的分析型色谱法、荧光光谱法和/或包括生物标志物选择性试剂的测定方法中的一种或更多种，来测量所述一种或更多种生物标志物的存在和浓度。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在分析之前处理测试样品。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述样品处理包括通过固相萃取(SPE)、气相色谱法、单相或多相高压液相色谱法(HPLC)进行的样品分离。
5.根据权利要求3所述的方法，其中在通过质谱法分析之前将参考生物标志物的一个或更多个内标物添加到所述样品。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述绝对信号强度通过测量所述生物标志物信号强度并将它与一个或更多个已知内标物的信号强度进行比较来评分。
7.根据权利要求1所述的方法，其中检查大量卵的一个或更多个胚胎特性。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是完全自动化的。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法包括质谱分析，所述质谱分析包括电喷雾电离(ESI)质谱法、基质辅助激光解吸电离-飞行时间(MALDI-TOF)质谱法或表面增强激光解吸电离-飞行时间(SELDI-TOF)质谱法、SPE/MS/MS、使用LDTD(激光二极管热解吸)离子源和/或使用离子迁移率传感器(IMS)。
10.根据权利要求1所述的方法，还包括确定卵中的胚胎是能存活的且雄性的、或是能存活的且雌性的、还是不能存活的，以及将大量能存活的雌性卵与大量能存活的雄性卵和一个或更多个不能存活的卵分离。
11.根据权利要求10所述的方法，还包括根据感测的时间分选能存活的卵，直到可能孵出胚胎。
12.一种用于选择性孵化具有特定特性的卵生动物物种的幼雏的方法，所述方法包括：
a.提供来自所述物种的大量卵，以及
b.使所述卵经受根据权利要求1至11中任一项所述的方法以确定所述胚胎的特性，以及
c.选择具有期望特性的卵以形成所选择的大量卵，以及
d.孵化所述卵直到一个或更多个幼雏被孵出。
13.从根据权利要求1至11中任一项所述的方法获得的大量卵用于动物和/或人类食物生产、用于美容、医学和/或营养化合物的生产和/或分离、用于通过发酵进行的甲烷生产、用于疫苗生产和/或高质量肥料生产的用途。
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