RU2756447C2 - Способ и система для неразрушающего in ovo определения пола птицы - Google Patents
Способ и система для неразрушающего in ovo определения пола птицы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2756447C2 RU2756447C2 RU2018142577A RU2018142577A RU2756447C2 RU 2756447 C2 RU2756447 C2 RU 2756447C2 RU 2018142577 A RU2018142577 A RU 2018142577A RU 2018142577 A RU2018142577 A RU 2018142577A RU 2756447 C2 RU2756447 C2 RU 2756447C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- embryo
- eggs
- biomarker
- sample
- egg
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 176
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims abstract description 229
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims abstract description 130
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims abstract description 120
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 41
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 40
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims abstract description 33
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 29
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 27
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 claims abstract 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 61
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 55
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 38
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 29
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 claims description 19
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 claims description 18
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 14
- 230000012447 hatching Effects 0.000 claims description 13
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 claims description 11
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 10
- 238000011524 similarity measure Methods 0.000 claims description 9
- GYCUGHGNCMGICI-UHFFFAOYSA-N 3-(2-aminoethylsulfanyl)butanoic acid Chemical group OC(=O)CC(C)SCCN GYCUGHGNCMGICI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- -1 amino compound Chemical class 0.000 claims description 8
- 238000001698 laser desorption ionisation Methods 0.000 claims description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- 238000003795 desorption Methods 0.000 claims description 5
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 claims description 5
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 claims description 5
- 238000000041 tunable diode laser absorption spectroscopy Methods 0.000 claims description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 claims description 2
- 238000009774 resonance method Methods 0.000 claims description 2
- 238000004989 laser desorption mass spectroscopy Methods 0.000 claims 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 19
- 210000001643 allantois Anatomy 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 230000017448 oviposition Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 97
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 67
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 46
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 31
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 24
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 24
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 24
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 23
- 238000011161 development Methods 0.000 description 22
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 22
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 21
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 21
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 20
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 18
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 18
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 15
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 description 14
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 13
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 12
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 11
- NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N Butylhydroxytoluene Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 description 10
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 10
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 10
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 9
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 9
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 8
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 8
- 235000010354 butylated hydroxytoluene Nutrition 0.000 description 8
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 8
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000000491 multivariate analysis Methods 0.000 description 8
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 8
- 238000002470 solid-phase micro-extraction Methods 0.000 description 8
- 239000004322 Butylated hydroxytoluene Substances 0.000 description 7
- 229940095259 butylated hydroxytoluene Drugs 0.000 description 7
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 6
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 6
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 6
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 6
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- MRBKEAMVRSLQPH-UHFFFAOYSA-N 3-tert-butyl-4-hydroxyanisole Chemical compound COC1=CC=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 MRBKEAMVRSLQPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 235000019282 butylated hydroxyanisole Nutrition 0.000 description 5
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 5
- 210000003278 egg shell Anatomy 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 125000002816 methylsulfanyl group Chemical group [H]C([H])([H])S[*] 0.000 description 5
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 5
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 5
- 230000020509 sex determination Effects 0.000 description 5
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 4
- 241000238017 Astacoidea Species 0.000 description 4
- 239000004255 Butylated hydroxyanisole Substances 0.000 description 4
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 4
- 241000238069 Nephropidae Species 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 229940043253 butylated hydroxyanisole Drugs 0.000 description 4
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 4
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 4
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 241000252210 Cyprinidae Species 0.000 description 3
- 241000252233 Cyprinus carpio Species 0.000 description 3
- 241000723298 Dicentrarchus labrax Species 0.000 description 3
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N Formic acid Chemical compound OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001149926 Parastacoidea Species 0.000 description 3
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 241000276707 Tilapia Species 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- GCHPUFAZSONQIV-UHFFFAOYSA-N isovaline Chemical compound CCC(C)(N)C(O)=O GCHPUFAZSONQIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- MEYZIGGCNFHINA-UHFFFAOYSA-N (6-aminoquinolin-2-yl) n-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)-n-hydroxycarbamate Chemical compound C1=CC2=CC(N)=CC=C2N=C1OC(=O)N(O)N1C(=O)CCC1=O MEYZIGGCNFHINA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 2
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 2
- 241000473391 Archosargus rhomboidalis Species 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 241000238366 Cephalopoda Species 0.000 description 2
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 2
- 241000271571 Dromaius novaehollandiae Species 0.000 description 2
- 241000252234 Hypophthalmichthys nobilis Species 0.000 description 2
- GGLZPLKKBSSKCX-YFKPBYRVSA-N L-ethionine Chemical compound CCSCC[C@H](N)C(O)=O GGLZPLKKBSSKCX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241000530454 Litopenaeus schmitti Species 0.000 description 2
- 241001157775 Litopenaeus stylirostris Species 0.000 description 2
- 241001327110 Macrobrachium rosenbergii Species 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 description 2
- 241000269821 Scombridae Species 0.000 description 2
- 241000272534 Struthio camelus Species 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 2
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 241001233037 catfish Species 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 2
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 2
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 241000238565 lobster Species 0.000 description 2
- 235000003715 nutritional status Nutrition 0.000 description 2
- 238000010238 partial least squares regression Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000003209 petroleum derivative Substances 0.000 description 2
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 210000004974 shell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- YAXAFCHJCYILRU-RXMQYKEDSA-N (2r)-2-(methylamino)-4-methylsulfanylbutanoic acid Chemical compound CN[C@@H](C(O)=O)CCSC YAXAFCHJCYILRU-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- AIFYCUKWFYJXJO-YFKPBYRVSA-N (2r)-2-(propan-2-ylamino)-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(C)N[C@@H](CS)C(O)=O AIFYCUKWFYJXJO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- LWBPPQSUNXQYIJ-ZCFIWIBFSA-N (2r)-2-amino-2,3-dimethyl-3-sulfanylbutanoic acid Chemical compound CC(C)(S)[C@](C)(N)C(O)=O LWBPPQSUNXQYIJ-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 1
- MQSDGAKLSVITHP-UHFFFAOYSA-N 2,2-diethoxyethanethioamide Chemical compound CCOC(C(N)=S)OCC MQSDGAKLSVITHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWQNFXDYOCUEER-UHFFFAOYSA-N 2,3-ditert-butyl-4-methylphenol Chemical compound CC1=CC=C(O)C(C(C)(C)C)=C1C(C)(C)C QWQNFXDYOCUEER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXJVTJCKCFBDZ-UHFFFAOYSA-N 2-((2-hydroxyethyl)sulfanyl)-N-methylpropionamide Chemical compound CNC(=O)C(C)SCCO DCXJVTJCKCFBDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCIINHBEGPYHQW-UHFFFAOYSA-N 2-(2-aminoethylsulfanyl)-2-methylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)(C)SCCN PCIINHBEGPYHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YAXAFCHJCYILRU-UHFFFAOYSA-N 2-(methylazaniumyl)-4-methylsulfanylbutanoate Chemical compound CNC(C(O)=O)CCSC YAXAFCHJCYILRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KAVACCZQLOLHTO-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-methyl-3-sulfanylpentanoic acid Chemical compound CCC(C)(S)C(N)C(O)=O KAVACCZQLOLHTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JNHATNWAMGXQJQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-methyl-4-methylsulfanylbutanoic acid Chemical compound CSCC(C)C(N)C(O)=O JNHATNWAMGXQJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZYVMPHJZWXIFDQ-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumyl-2-methyl-4-methylsulfanylbutanoate Chemical compound CSCCC(C)(N)C(O)=O ZYVMPHJZWXIFDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYSXZQIOOACQRG-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumyl-3-propan-2-ylsulfanylpropanoate Chemical compound CC(C)SCC(N)C(O)=O RYSXZQIOOACQRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XVRXCPBNKJSGGJ-UHFFFAOYSA-N 2-propan-2-yl-1,2-thiazolidine 1,1-dioxide Chemical compound CC(C)N1CCCS1(=O)=O XVRXCPBNKJSGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMOYOUMVYICGCA-UHFFFAOYSA-N 2-tert-butyl-4-hydroxyanisole Chemical class COC1=CC=C(O)C=C1C(C)(C)C IMOYOUMVYICGCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BBCXEDOCVLVVKH-UHFFFAOYSA-N 3-(2-hydroxyethylsulfanyl)-n-methylpropanamide Chemical compound CNC(=O)CCSCCO BBCXEDOCVLVVKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VPBSIQPOHQFTNP-UHFFFAOYSA-N 4-(2-aminoethylsulfanyl)butanoic acid Chemical compound NCCSCCCC(O)=O VPBSIQPOHQFTNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZIPKWPPCKXBHEO-UHFFFAOYSA-N 5-amino-6-sulfanylhexanoic acid Chemical compound NC(CCCC(=O)O)CS ZIPKWPPCKXBHEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000881711 Acipenser sturio Species 0.000 description 1
- 241000252338 Acipenseridae Species 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 241000239223 Arachnida Species 0.000 description 1
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000238144 Brachyura Species 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001609213 Carassius carassius Species 0.000 description 1
- 241000238564 Caridea Species 0.000 description 1
- 241000269775 Centropomidae Species 0.000 description 1
- 241000276616 Cichlidae Species 0.000 description 1
- 241000252230 Ctenopharyngodon idella Species 0.000 description 1
- 241000283323 Delphinapterus leucas Species 0.000 description 1
- 241000238551 Dendrobranchiata Species 0.000 description 1
- 241001235204 Fenneropenaeus merguiensis Species 0.000 description 1
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000160777 Hipparchia semele Species 0.000 description 1
- 241000235789 Hyperoartia Species 0.000 description 1
- 244000018606 Korthalsella japonica Species 0.000 description 1
- 241000442132 Lactarius lactarius Species 0.000 description 1
- 241000269795 Lateolabrax japonicus Species 0.000 description 1
- 241000269779 Lates calcarifer Species 0.000 description 1
- 241000238553 Litopenaeus vannamei Species 0.000 description 1
- 238000012307 MRI technique Methods 0.000 description 1
- 241000238561 Macrobrachium malcolmsonii Species 0.000 description 1
- 241000058338 Macrobrachium nipponense Species 0.000 description 1
- 241001124325 Marsupenaeus japonicus Species 0.000 description 1
- 240000008790 Musa x paradisiaca Species 0.000 description 1
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000238413 Octopus Species 0.000 description 1
- 241001327682 Oncorhynchus mykiss irideus Species 0.000 description 1
- 241000276703 Oreochromis niloticus Species 0.000 description 1
- 241000238035 Palinuridae Species 0.000 description 1
- 241000282376 Panthera tigris Species 0.000 description 1
- 241000238550 Penaeidae Species 0.000 description 1
- 241000927735 Penaeus Species 0.000 description 1
- 241000238552 Penaeus monodon Species 0.000 description 1
- 240000003109 Persicaria chinensis Species 0.000 description 1
- 241001600434 Plectroglyphidodon lacrymatus Species 0.000 description 1
- 241000238030 Procambarus clarkii Species 0.000 description 1
- 244000086363 Pterocarpus indicus Species 0.000 description 1
- UFRVABODKAYFCB-UHFFFAOYSA-N S-(2-carboxypropyl)-Cysteamine Chemical compound OC(=O)C(C)CSCCN UFRVABODKAYFCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GGLZPLKKBSSKCX-UHFFFAOYSA-N S-ethylhomocysteine Chemical compound CCSCCC(N)C(O)=O GGLZPLKKBSSKCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YDBYJHTYSHBBAU-YFKPBYRVSA-N S-methyl-L-methioninate Chemical compound C[S+](C)CC[C@H](N)C([O-])=O YDBYJHTYSHBBAU-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- WAAGBMYUYFBZIW-UHFFFAOYSA-N S-propylcysteine Chemical compound CCCSCC(N)C(O)=O WAAGBMYUYFBZIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000277263 Salmo Species 0.000 description 1
- 241000316146 Salmo trutta trutta Species 0.000 description 1
- 241000238371 Sepiidae Species 0.000 description 1
- 241001417495 Serranidae Species 0.000 description 1
- 241000269788 Sparidae Species 0.000 description 1
- 238000010811 Ultra-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Methods 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- XLOMVQKBTHCTTD-UHFFFAOYSA-N Zinc monoxide Chemical compound [Zn]=O XLOMVQKBTHCTTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003705 background correction Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960004217 benzyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N chelidonic acid Natural products OC(=O)C1=CC(=O)C=C(C(O)=O)O1 PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000013145 classification model Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 1
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001076 estrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003090 exacerbative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002657 fibrous material Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 238000009615 fourier-transform spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000007274 generation of a signal involved in cell-cell signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SFSJZXMDTNDWIX-UHFFFAOYSA-N homomethionine Chemical compound CSCCCC(N)C(O)=O SFSJZXMDTNDWIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 1
- 108010059642 isinglass Proteins 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 235000020640 mackerel Nutrition 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229960001913 mecysteine Drugs 0.000 description 1
- 210000001259 mesencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229960005173 methiosulfonium chloride Drugs 0.000 description 1
- FIXGPNLTDAUQQF-SCSAIBSYSA-N methyl (2r)-2-amino-3-methyl-3-sulfanylbutanoate Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)C(C)(C)S FIXGPNLTDAUQQF-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- UIHPNZDZCOEZEN-YFKPBYRVSA-N methyl (2s)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoate Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)CCSC UIHPNZDZCOEZEN-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N n-[4-(1,3-benzoxazol-2-yl)phenyl]-4-nitrobenzenesulfonamide Chemical class C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1S(=O)(=O)NC1=CC=C(C=2OC3=CC=CC=C3N=2)C=C1 SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001225 nuclear magnetic resonance method Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N octamethyltrisiloxane Chemical compound C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003909 pattern recognition Methods 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 238000009372 pisciculture Methods 0.000 description 1
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- AZDDIYKMQFIXBW-UHFFFAOYSA-N propyl 2-amino-3-sulfanylpropanoate Chemical compound CCCOC(=O)C(N)CS AZDDIYKMQFIXBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182852 proteinogenic amino acid Natural products 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010223 real-time analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000565 sealant Substances 0.000 description 1
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000013179 statistical model Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000003371 toe Anatomy 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 239000003039 volatile agent Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001325 yolk sac Anatomy 0.000 description 1
- 235000014692 zinc oxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011787 zinc oxide Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K43/00—Testing, sorting or cleaning eggs ; Conveying devices ; Pick-up devices
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/02—Food
- G01N33/08—Eggs, e.g. by candling
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/884—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample organic compounds
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области химии, а именно к способу неразрушающей идентификации половой характеристики эмбриона Gallus gallus domesticus in ovo и к способу селективной инкубации птенцов видов яйцекладущих со специфической половой характеристикой. Способ неразрушающей идентификации половой характеристики эмбриона Gallus gallus domesticus in ovo включает: получение образца материала, ассоциированного с яйцом, содержащим эмбрион, - аллантоисной жидкости эмбриона, измерение значения оценки на наличие и концентрацию по меньшей мере первого биомаркера - 3-[(2-аминоэтил)сульфанил]бутановой кислоты в образце, указывающего на половую характеристику эмбриона, применение порога к значению оценки и концентрации для идентификации половой характеристики для эмбриона, причем концентрация первого биомаркера, составляющая 50 нг/мл или больше в аллантоисной жидкости эмбриона в дни 7, 8 или 9, коррелирует с эмбрионом женского пола, тогда как наличие первого биомаркера, присутствующего при менее чем 50 нг/мл, коррелирует с эмбрионом мужского пола. Способ селективной инкубации птенцов видов яйцекладущих со специфической половой характеристикой включает: обеспечение множества яиц от видов, подвергание яиц способу для определения половой характеристики эмбриона, отбор яиц с желаемой половой характеристикой с формированием отобранного множества яиц и инкубацию отобранных яиц до вылупления одного или нескольких птенцов. Группа изобретений обеспечивает создание быстрого и чувствительного способа неразрушающего определения половой характеристики эмбриона Gallus gallus domesticus in ovo. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 пр.
Description
ОПИСАНИЕ
Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится к способу неразрушающего определения in ovo пола у видов яйцекладущих, в частности, у видов птиц, более конкретно, у вида Gallus gallus. Способ в соответствии с настоящим изобретением, кроме того, относится к отбору яиц мужского пола и яиц женского пола, а также к получению групп живых животных с использованием этих отобранных яиц.
Яйцекладущие животные откладывают яйца с непродолжительным эмбриональным развитием в организме матери или вообще без такового. Выращивание яйцекладущих животных и их яиц обеспечивает постоянно растущую часть мирового производства белка, а также различные другие крупные промышленные процессы, такие как производство вакцин. В настоящее время наиболее важные способы выращивания яйцекладущих животных включают в себя разведение видов птиц, таких как домашняя птица, и культивирование водных организмов, т.е. выращивание водных организмов, таких как рыба, ракообразные и моллюски. В частности, курица, а точнее джунглевая курица, т.е. вид Gallus gallus domesticus, безусловно, является наиболее выращиваемым видом яйцекладущих в мире.
Уровень техники настоящего изобретения
Оплодотворенные куриные яйца имеют тенденцию обеспечивать примерно равное распределение самцов и самок животных. Однако по разным причинам при управлении инкубаторно-птицеводческой станцией может быть желательно разделение животных по различным характеристикам, в частности, по полу. Например, при коммерческом производстве домашней курицы и яиц инкубация и выращивание цыплят мужского пола крайне нежелательны, что приводит к выбраковке миллиардов цыплят мужского пола каждый год.
В настоящее время в обоих случаях смешанные популяции вылупившихся цыплят подвергаются разделению по половому признаку путем визуальной оценки молоди животных, а иногда даже взрослой популяции, в тех случаях, когда молодь не имеет соответствующих признаков. В любом случае это очень трудоемкий процесс, требующий высококвалифицированных операторов и, как правило, очень стрессовый для животных.
Более того, для коммерческого производства яиц инкубация и выращивание цыплят мужского пола крайне нежелательны, что приводит к выбраковке миллиардов цыплят мужского пола каждый год. Кроме того, имеется процент яиц, которые не оплодотворены или не содержат жизнеспособного эмбриона в начале инкубационного периода, что значительно снижает производительность инкубаторов на инкубаторно-птицеводческих станциях.
Кроме того, если взрослых животных разделяют по полу, то все популяции необходимо выращивать до минимального возраста, в то время как только половина выращенных таким образом животных используется для размножения после разделения. Другие проблемы могут возникать, когда наличие, например, мужской популяции может приводить к снижению производительности, например, из-за каннибализма и снижения плотности фермерского хозяйства.
Кроме того, имеется процент яиц, которые не оплодотворены или не содержат жизнеспособного эмбриона в начале инкубационного периода, что значительно снижает производительность инкубаторов, используемых на инкубаторно-птицеводческих станциях, в частности, для яиц домашней птицы.
В результате требуется производственная мощность инкубатора, которая по меньшей мере вдвое превышает необходимую, если не возможен ранний отбор по полу, позволяющий отбирать в основном только мужские или женские эмбрионы.
Соответственно, это будет иметь большое значение для окружающей среды благодаря уменьшению количества энергии и других необходимых ресурсов, а в равной степени и для устранения ненужных животных путем выбраковки, а также для снижения стресса недавно вылупившихся животных, если способ был доступен на ранней стадии, что позволило определить пол эмбрионов птиц до стадии инкубации, что также позволило значительно увеличить производственную мощность инкубаторно-птицеводческой станции. Дополнительным преимуществом могло стать то, что этот способ также позволял бы отбирать жизнеспособные эмбрионы по сравнению с неоплодотворенными и/или иным образом нежизнеспособными яйцами, что еще больше повысило бы эффективность процесса вылупления.
В литературе раскрываются различные способы, качающиеся определений пола птичьего эмбриона посредством выявления некоторых метаболитов в яйцах, например, с помощью ЯМР-спектроскопии, например, см. Y. Feng et al., Appl. Magn. Reson. (2007), 32, 257-268; с помощью анализа HPLC, см. Gu D.-C. et al., Chinese Journal of Animal Science, Vol. 7, 23-25, а также с помощью применения специфически связывающего целевые молекулы биомаркера, который позволяет проводить количественную флуоресцентную микроскопию, см., например, WO 2006/124456 для определения присутствия эстрогенного стероидного соединения в качестве маркера. Обычно отмечают, что стероиды представляют собой довольно крупные молекулы, которые с трудом испаряются.
Недостаток большинства способов, упомянутых выше в настоящем документе, заключается в том, что они не способны обеспечить неразрушающее определение пола курицы, так как требуются большие количества метаболитов, что может не позволить эмбриону существовать и полностью развиваться после забора образца. Кроме того, для этих способов требуется использование оборудования, которое обычно не используется на птицеферме из-за стоимости или сложности, не говоря уже о предоставлении соответствующей производительности для коммерческого выращивания кур.
В WO 2014/021715 раскрывается способ неразрушающего определения пола, стадии развития и/или жизнеспособности птичьего эмбриона в яйце, включающий (а) выявление по меньшей мере первого соединения-маркера развития, выбранного из сахаров и/или аминокислот, их предшественников и метаболитов, в яйце в период времени от начала инкубации яйца до вылупления; (b) измерение количества по меньшей мере первого выявляемого соединения-маркера развития и (с) сравнение количества с базовой линией, установленной для мужского пола и женского пола, стадии развития эмбриона и/или живого и умершего или неразвитого эмбриона, для определения у эмбриона жизнеспособности, мужского пола или женского пола и/или стадии развития эмбриона. Хотя раскрытый способ очень полезен для определения пола, возраста и стадии развития эмбриона, он требует относительно больших количеств образцов из-за низкой чувствительности некоторых методов количественного измерения. Кроме того, некоторые автоматизированные способы трудно реализовать в режиме непрерывного реального времени процесса вылупления, например, с использованием методов ядерного резонанса или методов спектрального резонанса, в том числе спектроскопии комбинационного рассеяния света. Другие способы, хотя и быстрые, требуют наличия относительно дорогого оборудования и/или применения специальных химикатов, таких как маркеры флуоресценции, для конкретных биомаркерных молекул.
Следовательно, сохраняется потребность в более быстром и более чувствительном способе неразрушающего определения пола, а также стадии развития и/или жизнеспособности эмбриона яйцекладущих животных in ovo.
Сущность настоящего изобретения
Поэтому, цель настоящего изобретения заключается в обеспечении способа неразрушающей идентификации характеристики эмбриона Gallus gallus domesticus in ovo, при этом способ включает:
(a) получение образца материала, ассоциированного с яйцом, содержащим эмбрион, и
(b) измерение значения оценки на наличие и концентрацию по меньшей мере первого биомаркера в образце, указывающего на характеристику эмбриона, и
(c) применение порога к значению оценки и количеству, полученному на стадии (b), для идентификации характеристики для эмбриона, ассоциированной с наличием и концентрацией биомаркера,
при этом по меньшей мере первый биомаркер содержит аминосоединение, имеющее молекулярную массу в диапазоне от 140 до 190 г/моль, и при этом наличие и концентрация биомаркера коррелирует с вероятностью развития эмбриона во взрослую особь мужского пола или во взрослую особь женского пола.
Следующая цель заключается в обеспечении системы, способной выполнять анализ яйца в режиме реального времени в удаленных местоположениях, таких как инкубаторно-птицеводческие станции или объекты культивирования водных организмов. Эти и другие цели решаются с помощью устройства и способа в соответствии с настоящим изобретением.
Согласно следующему аспекту заявляемый способ также относится к множеству жизнеспособных яиц женского пола, обеспечивая отбор яиц преимущественно мужского пола или яиц преимущественно женского пола. Согласно следующим аспектам заявляемый способ также относится к популяции молоди животных, получаемой способом в соответствии с настоящим изобретением. Согласно следующим аспектам заявляемый способ также относится к применению множества яиц, получаемых данным способом, для получения продуктов питания для животного и/или человека, для получения и/или выделения косметических, лекарственных и/или питательных соединений, для получения метана посредством ферментации, для получения вакцин и/или для получения высококачественных удобрений.
Согласно следующим аспектам заявляемый способ также относится к системе выявления и анализа пола эмбрионов яйцекладущих животных, содержащей предпочтительно полностью автоматизированное устройство для осуществления заявляемых способов.
Настоящее изобретение также относится к системе, в которой средство идентификации пола реализуют в программном обеспечении на электронном устройстве, сопряженном со спектроскопической системой, и предпочтительно в которой средство идентификации содержит средства программного обеспечения, находящиеся в компьютере.
Краткое описание графических материалов
Далее настоящее изобретение описывается более подробно со ссылкой на сопровождающие графические материалы, в которых показан предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения. Настоящее изобретение, однако, может быть осуществлено во многих других формах и не должно ограничиваться вариантами осуществления, изложенными в настоящем документе; скорее данные варианты осуществления представлены для того, чтобы настоящее раскрытие было подробным и полным, а также полностью представляло объем настоящего изобретения специалистам в данной области.
На фиг. 1 изображена А) модель классификации логистической регрессии по одному признаку, представляющему собой концентрацию 3-[(2-аминоэтил)сульфанил]бутановой кислоты, с точностью более чем 90% для прогнозирования пола; и В) логистическая регрессия по 2 признакам, при этом при применении моделей логистической регрессии по двум биомаркерам точность может быть повышена до >95% точности со дня 10.
На фиг. 2 показан спектр LDPD биомаркера в соответствии с настоящим изобретением в серийном тесте, автоматизированном высокопроизводительном тесте. Способ обеспечивает не только измерение наличия биомаркера, но также и абсолютной концентрации в течение менее чем 10 секунд на отдельном образце.
На фиг. 3 показаны хроматограммы соединений с разными пиковыми значениями масс, варьирующими от 220 до 145, выделенными за 850 секунд из образцов мужского пола (темно-серый цвет) и женского пола (светло-серый цвет).
Подробное описание настоящего изобретения
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, что обычно известно рядовому специалисту в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Терминология, используемая в описании настоящего изобретения, приводится в настоящем документе исключительно с целью описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения настоящего изобретения.
Используемые в настоящем документе термины «птичьи» и «птица» включают в себя особей мужского пола или особей женского пола любых видов птиц, но главным образом охватывают домашнюю птицу, которую коммерчески выращивают для яиц или мяса. Следовательно, термины «птичьи» и «птица», в частности, охватывают красную и серую джунглевую курицу, цыпленка, индеек, уток, гусей, перепела, голубей, страуса, эму и фазанов.
Используемый в настоящем документе термин «инкубация» относится к способу, которым птицы высиживают свои яйца, и к развитию эмбриона в яйце после выхода из тракта несушки. Период инкубации в настоящем документе относится к непрерывному промежутку времени, на протяжении которого конкретное яйцо подвергается условиями, имитирующим высиживание до вылупления, т.е. появления птиц, в том числе любой обработке или перемещению, например, из инкубатора на инкубаторно-птицеводческую станцию, при условии, что развитие птицы не остановлено.
Используемый в настоящем документе термин «in ovo» относится к эмбрионам, содержащимся в яйце до вылупления. Настоящее изобретение может применяться на практике с птицами любого типа, в том числе без ограничения с яйцами (одомашненной) курицы, индейки, утки, гуся, перепела и фазана.
Используемые в настоящем документе термины «инъекция» и «инъецирование» охватывают способы введения устройства (как правило, удлиненного устройства) в яйцо или эмбрион, в том числе способы доставки или выпускания вещества в яйцо или эмбрион, способы извлечения вещества (т.е. образца) из яйца или эмбриона и/или способы введения детекторного устройства в яйцо или эмбрион.
Используемый в настоящем документе термин «масс-спектрометрия» относится к аналитической методике, которая сортирует ионы на основании их масс. Масс-спектрометрию, как правило, используют для химического анализа во многих ситуациях, и она может быть применена для любого образца от комплексной смеси нефтяных продуктов до продуктов генной инженерии. Проще говоря, масс-спектр даст картину точного химического состава образца.
Настоящая заявка согласно первому аспекту относится к определению одного или нескольких аминосоединений, имеющих молекулярную массу в диапазоне от 140 до 190 г/моль, предпочтительно от 150 до 170 г/моль.
Заявители неожиданно обнаружили, что специфический метаболит, структурный изомер этионина, указывает на то, будет ли эмбрион развиваться в птенца мужского пола или женского пола. Предпочтительно, биомаркерное соединение характеризуется формулой R3SCR1HCR2HCOOH (I), в которой предпочтительно R1 представляет собой СН3, Н, NH2, R2 представляет собой СН3, Н, NH2, a R3 представляет собой -(CH2)2-NH2, или его структурными изомерами. Более предпочтительно, биомаркерное соединение характеризуется формулой C6H13NO2S. Более предпочтительно, оно может быть выбрано из аминокислот, таких как 2-амино-4-этилсульфанилбутановая кислота (также называемая этионином) или ее структурные изомеры, в том числе без ограничения 4-(метилсульфанил)изовалин, 4-(метилсульфанил)изовалин (также известный как 2-амино-2-метил-4-(метилсульфанил)бутановая кислота), N- или изопропилцистеин, 3-(метил-сульфанил)валин, 4-(метилсульфанил)валин, 3-метил-3-сульфанил-изовалин, 4-(метилсульфанил)изовалин, 2-амино-3-метил-4-метилсульфанил-масляная кислота, 5-(метилсульфанил)норвалин, 2-амино-3-метил-3-сульфанилпентановая кислота, метил-3-сульфанил-валинат, метилсульфония метионин, N-метил-D-метионин; 5-амино-6-сульфанилгексановая кислота или подобные; из сложных эфиров аминокислот, таких как метил-2-амино-4-метилсульфанил)бутаноат (также известный как метилметионинат) или его структурные изомеры, такие как этилметил-цистеинат, изопропил-цистеинат, N-пропилцистеинат, или родственных соединений, таких как 2-[(2-гидроксиэтил)сульфанил]-N-метилпропанамид; этилгомоцистеинат, 2-изопропил-1,2-тиазолидин-1,1-диоксид, 1-амино-2,2-диэтоксиэтан-1-тион, 3-[(2-гидроксиэтил)сульфанил]-N-метилпропанамид, пропил-2-амино-3-сульфанилпропаноат, 2-(метиламино)-4-(метилсульфанил)бутановая кислота, 2-[(2-аминоэтил)сульфанил]-2-метилпропановая кислота, 3-[(2-аминоэтил)сульфанил]-2-метилпропановая кислота, 3-[(2-аминоэтил)сульфанил]бутановая кислота, 4-[(2-аминоэтил)сульфанил]бутановая кислота, 2-амино-3-(пропилсульфанил)пропановая кислота, 2-амино-3-(пропан-2-илсульфанил)пропановая кислота и 3-[(2-аминоэтил)сульфанил]бутановая кислота. Соединения или изомеры могут быть рацемическими или могут содержать энантиомеры или стереоизомеры в подходящих отношениях и количествах.
Предпочтительно, соединение характеризуется молекулярной формулой C6H13NO2S и моноизотопной массой MW 163,0690. В настоящее время оно, по-видимому, идентифицировано как (3-[(2-аминоэтил)сульфанил]бутановая кислота), характеризующаяся структурой согласно общей формуле I:
Заявители выяснили, что концентрация соединения (I) или структурных изомеров, которые могут считаться непротеиногенной аминокислотой, в аллантоисной жидкости на протяжении периода инкубации может быть успешно использована для определения пола эмбриона в яйце, с очень высокой достоверностью. В качестве дополнительного преимущества, этот биомаркер сравнительно легко экстрагируется и/или испаряется, и, поэтому, его можно анализировать относительно легко по сравнению, например, со стероидными соединениями.
Стадия (а) включает получение образца материала, ассоциированного с яйцом, содержащим эмбрион.
Способы и устройство согласно вариантам осуществления настоящего изобретения могут быть использованы для идентификации одной или нескольких характеристик яйца в любой момент времени на протяжении периода эмбрионального развития, также называемого периодом его инкубации. Варианты осуществления настоящего изобретения не ограничиваются конкретным днем на протяжении периода эмбрионального развития.
Способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно включает (a1) обеспечение образца, содержащего жидкость яйца; и (а2) получение спектра образца. Необязательная стадия (а3) устраняет предпочтительно мутность образцов подходящим способом, таким как ультрафильтрация или центрифугирование. Как изложено выше, тогда как инвазивные способы позволяют напрямую отбирать образцы и подвергать отобранную жидкость анализу, предпочтительно, чтобы анализ проводился неинвазивно, по причине эффективности такого способа анализа и того факта, что скорлупа яйца и его оболочки остаются неперфорированными. Любой подходящий способ может быть использован для проведения такого неинвазивного анализа.
Если используется неинвазивный способ, то термин «жидкость» в настоящем документе может относиться к летучим соединениям, которые могут быть удалены из яйца без прокола яичной скорлупы. Это можно успешно выполнить путем помещения яйца в камеру выявления, необязательно под небольшим давлением, и путем подачи высвобождаемых летучих соединений для подходящего способа идентификации и количественного определения. В данном случае могут применяться указанные выше способы масс-спектроскопии (МС), в том числе с применением спектрометра ионной подвижности (IMS).
Если анализ выполняют инвазивно, то он обычно включает выделение образца яичного материала. Образец предпочтительно отбирают из эмбриональной жидкости, предпочтительно из аллантоисной жидкости в случае видов птиц, так как это наименее вероятно повредит эмбриону. Аллантоисная жидкость обычно является экскреторной средой для азотсодержащих метаболитов птичьего эмбриона.
Подходящие способы и устройство для прокола яиц и инвазивного отбора образцов материала яйца раскрыты, например, в US-A-20070137577, WO-A-00/22921 или WO-A-99/34667. Взятый таким образом образец затем предпочтительно подвергают подходящему протоколу для обеспечения выявления маркеров развития и анализу относительных и/или абсолютных количеств присутствующих маркеров развития.
Аллантоисная жидкость начинает формироваться приблизительно в день 3 инкубации, как описано в Hamburger, V and Hamilton, HL (1951). "A series of normal stages in the development of the chick embryo". Journal of Morphology 88 (1): 49-92. Там указывается, что аллантоис был различим через 65 часов после инкубации в виде короткого толстостенного кармана; еще не везикулярным. Через 72 часа аллантоис был везикулярным, переменного размера; в среднем по размеру среднего мозга, что указывает на то, что аллантоис и аллантоисная жидкость присутствуют на день 3. В результате, способ в соответствии с настоящим изобретением может быть применен на день 3, если необходимо исследовать аллантоисную жидкость.
Аллантоис достигает максимального объема приблизительно на день 13 инкубации, а затем уменьшается в объеме по мере продолжения инкубации из-за потери влаги и всасывания жидкости, но все еще присутствует в значительных объемах на день 18 инкубации.
Аллантоисная жидкость отделяется от яичной скорлупы внутренней и внешней подскорлупными оболочками и хорионаллантоисными оболочками. Хотя аллантоисная жидкость охватывает всю периферию оплодотворенного яйца, аллантоисная жидкость, как правило, скапливается в верхней части яйца непосредственно под оболочками, расположенными над воздушной камерой.
Накопление аллантоисной жидкости в верхней части яйца происходит под действием силы тяжести и смещения плотным эмбрионом и желточным мешком. Попытка аккуратно отобрать аллантоисную жидкость через верхнюю часть яйца, когда яйцо находится в вертикальном положении, может быть затруднена из-за изменчивости воздушного пространства у яиц. Гравитация может быть использована для объединения аллантоисной жидкости в ограниченном месте. Когда яйцо поворачивается по своей продольной оси, аллантоисная жидкость будет скапливаться на верхней стороне яйца, непосредственно под скорлупой. Расположение яйца по его продольной оси обеспечивает применимость аллантоисной жидкости для извлечения образца.
Экстракция материала, такого как аллантоисная жидкость, из яиц может быть выполнена различными путями, в том числе проколом яичной скорлупы и введением канюли для отбора образцов через оболочки. Затем образец отобранной жидкости может быть извлечен, при этом оболочку и/или скорлупу функционально закупоривают подходящим герметиком или обеспечивают самостоятельное закупоривание.
Как указано выше, любой подходящий способ может быть использован для выполнения неинвазивного анализа. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения неинвазивный способ может включать твердофазную микроэкстракцию (SPME) в совокупности с подходящим аналитическим устройством. SMPE относится к методике твердофазной экстракции отбора образцов, которая включает применение волокна, покрытого экстрагирующей фазой, которая может быть жидкой (полимер) или твердой (сорбент) и которая экстрагирует разные виды аналитов (в том числе как летучие, так и нелетучие) из разных видов сред, которые могут быть в жидкой или газовой фазе. Количество аналитов, экстрагируемых волокном, пропорционально их концентрации в образце в случае достижения равновесия или в случае кратковременного предравновесия с помощью конвекции или перемешивания. Он может быть предпочтительно совмещен с IMS, так что могут быть непосредственно измерены летучие вещества.
Хотя в нескольких публикациях, как правило, раскрывается использование неинвазивных способов, например, в US-A-2011/144473 и US-A-7950349, эти публикации лишь неопределенно описывают общие спектры излучения, что на практике не позволяет выбрать пол эмбриона. Способ в соответствии с настоящим изобретением отличается, в частности, от раскрытых способов тем, что определяется наличие специфических компонентов в яйце, что может быть преимущественно выполнено с использованием вторичных производных спектров, которые позволяют избирательно искать абсолютные и относительные количества одного или нескольких соединений-маркеров развития.
Яйца, содержащие эмбрионы мужского пола и женского пола, демонстрируют различия в химическом составе на молекулярном уровне. На микроскопическом уровне эмбрионы также демонстрируют различия в размере, форме и клеточной морфологии.
Способ в соответствии с настоящим изобретением успешно обеспечивает определение пола эмбриона. Предпочтительно, определение выполняют в период от 1 до 15 дней, более предпочтительно от 2 до 14, еще более предпочтительно от 3 до 13 и еще более предпочтительно от 4 до 12 дней после начала инкубации, например, выполняют стадию а) предпочтительно в период времени от 6 до 12 дней после начала инкубации яйца.
Это позволяет избежать затрат на инкубацию яиц, которые или являются нежизнеспособными, и/или имеют нежелательный пол. Кроме того, может быть определена фактическая стадия развития яйца. Для видов с более коротким или более длинным временем инкубации, чем у домашней курицы, могут быть применены другие подходящие периоды.
Образец может представлять собой любое представляющее интерес биологическое вещество, но предпочтительно биологическую ткань и предпочтительно биологическую жидкость, такую как кровь или плазма.
Стадия (b) включает измерение значения оценки на наличие и концентрацию по меньшей мере первого биомаркера в образце, указывающего на характеристику эмбриона.
Способ в соответствии с настоящим изобретением основан на корреляции наблюдаемых массовых сигналов с эталонными массами и спектрами известных биомаркеров. Эталонные данные предпочтительно хранятся на компьютерном сервере, что позволяет выполнять всю процедуру под управлением компьютера. Сигналы коррелируют с эталонными стандартами путем сравнения, например, с использованием вычислительных функций, как описывается в настоящем изобретении.
Предпочтительно, сигналы характеризуют как «положительные» или «отрицательные» в зависимости от того, достигнут ли пороговый уровень подобия; сигналы, которые являются отрицательными и не достигают порогового уровня подобия, в способе отбрасываются, тогда как те сигналы, которые являются положительными, сопоставляются с биомаркерами и обеспечивают диагностику наличия указанных биомаркеров в биологическом образце.
В случае применения стандартов оценка сигналов биомаркера может быть рассчитана по отношению между сигналом биомаркера, присутствующего в образце, и внутренним стандартом, добавленным к образцу. Несколько биомаркеров могут быть проанализированы одинаково, что приводит к получению окончательного оценочного коэффициента.
Предпочтительно, один или несколько внутренних стандартов эталонных биомаркеров, меченных атомной меткой, добавляют к образцу перед анализом с помощью масс-спектрометрии. Это позволяет определять и оценивать абсолютную интенсивность сигнала путем измерения интенсивности сигнала биомаркера и сравнения его с интенсивностью сигнала одного или нескольких известных внутренних стандартов. Такие стандарты, например, могут быть помечены изотопом, что делает показания анализа очень точными, а также выгодными с точки зрения определения абсолютного количества. Встроенные последовательности калибровки в скрининге позволят измерять абсолютные уровни биомаркеров в образце.
Способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно может быть выполнен двумя путями: с использованием внутренних стандартов для обеспечения эталона для количественного определения интенсивности сигнала и без таких стандартов. Таким образом, согласно одному варианту осуществления один или несколько внутренних стандартов добавляют к образцу перед анализом с помощью масс-спектрометрии. Предпочтительно, внутренние стандарты метят. Предпочтительно, абсолютная интенсивность сигнала для каждого сигнала биомаркера затем может быть оценена путем измерения интенсивности сигнала биомаркера и сравнения с интенсивностью сигнала одного или нескольких известных внутренних стандартов. При альтернативном осуществлении образец обрабатывают без добавления внутренних стандартов. Согласно такому варианту осуществления относительную интенсивность сигнала оценивают путем измерения отношения между интенсивностями сигнала отдельного биомаркера в образце и интенсивностью сигнала эталона для группы образцов.
Предпочтительно, выбранной характеристикой может быть вероятная жизнеспособность или нежизнеспособность эмбриона для достижения полного роста для вылупления. Дополнительной предпочтительной выбранной характеристикой является прогноз вероятной стадии развития и времени, необходимого для развития эмбриона для вылупления в условиях инкубации. Предпочтительно, способ включает применение одного или нескольких из метода магнитно-резонансной визуализации, метода спектрального резонанса; аналитического хроматографического метода в совокупности с одним или несколькими подходящими детекторами, флуоресцентной спектроскопии и/или аналитических способов, включающих биомаркерные селективные реагенты.
Идентификация и количественное определение одного или нескольких биомаркеров могут быть выполнены любым подходящим способом. Предпочтительно, это может быть выполнено методом магнитно-резонансной визуализации, в том числе методами ядерного резонанса; методами спектрального резонанса, в том числе UV/VIS, инфракрасной или спектроскопией комбинационного рассеяния; аналитическими способами, такими как GC или HPLC, в совокупности с подходящими детекторами; флуоресцентной спектроскопией; ферментными иммуносорбентными анализами, в том числе влажными и сухими способами, например, с использованием способа с импрегнированным субстратом, и с применением полученных приемлемым образом селективных аптамеров или подобных селективных реагентов.
Как правило, также могут быть использованы количественные методы спектрального резонанса, в том числе инфракрасной или спектроскопии комбинационного рассеяния, предпочтительно с использованием вторичных спектров для определения наличия и абсолютных, и/или относительных количеств маркеров развития, присутствующих в яйце. Хотя в нескольких публикациях раскрывается использование неинвазивных способов, например, в US-A-2011/144473 и US-A-7950349, эти публикации лишь неопределенно описывают общие спектры излучения; которые на практике не позволяют выбрать стадию развития, жизнеспособность и/или пол эмбриона. Способ в соответствии с настоящим изобретением отличается, в частности, от раскрытых способов тем, что определяется наличие специфических компонентов в яйце, что может быть преимущественно выполнено с использованием вторичных производных спектров, которые позволяют избирательно искать абсолютные и относительные количества одного или нескольких соединений-маркеров развития. В частности, дифференциальная инфракрасная спектроскопия на основе преобразования Фурье (FTIR) и Фурье-спектроскопия комбинационного рассеяния или их комбинация могут быть предпочтительно использованы для достижения необходимой точности и воспроизводимости, тогда как методы ядерного магнитного резонанса могут быть приемлемым образом использованы для определения природы маркеров развития и для установления базовой линии системы калибровки. Способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно обеспечивает определение жизнеспособности, и/или пола эмбриона, и/или предпочтительно стадий развития от начала инкубации яйца до вылупления. Согласно предпочтительному варианту осуществления образец может быть анализирован любым масс-спектрометрическим способом, подходящим для выявления и получения спектра, который идентифицирует и определяет абсолютное и относительное количество биомаркеров, присутствующих в образце. Предпочтительно, образец может быть анализирован с помощью способа, который обеспечивает анализ в режиме реального времени в течение менее чем 20 секунд, более предпочтительно менее чем 15 секунд на образец.
Примеры включают в себя прямую инфузию с использованием статических принципов наноэлектрораспыления, анализ введения в поток или введение в поток с обогащением образца. Предпочтительно, масс-спектрометрический анализ включает в себя масс-спектрометрию с электрораспылительной ионизацией (ESI), времяпролетную масс-спектрометрию с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF), времяпролетную масс-спектрометрию или поверхностную лазерную десорбционную ионизацию (SELDI-TOF). Масс-спектрометр предпочтительно работает в тандемном и/или обзорном режиме.
Предпочтительно, образец может быть обработан перед масс-спектроскопическим анализом так, что обработка образца включает в себя отделение образца с помощью твердофазной экстракции (SPE), газовой хроматографии, одно- или многофазной жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC).
В качестве альтернативы, если биомаркерные соединения могут быть измерены извне, может быть выполнен прямой неинвазивный анализ посредством прямых неинвазивных измерений на целых яйцах с использованием, например, технологии IMS, изложенной выше.
Предпочтительные способы масс-спектрометрической характеристики биомаркеров включают ионизацию лазерной десорбцией с использованием матрицы (MALDI) и ионизацию электрораспылением (ESI), любая из которых предпочтительно может быть объединена с времяпролетным (TOF) или другими типами масс-спектрометрических датчиков для определения массы и/или паттерна фрагментации биомаркера. Предпочтительно, масс-спектрометрия может быть использована в тандеме с хроматографической и другими методиками разделения в настоящем документе. MALDI функционирует путем воздействия импульсов лазера на образец. Данная обработка выпаривает и ионизирует образец. Затем определяют молекулярные массы (массы) заряженных ионов на анализаторе TOF. В этом устройстве электрическое поле ускоряет заряженные молекулы по направлению детектора, и по различиям в продолжительности времени, которое требуется ионизированным фрагментам для достижения детектора, т.е. их времени пролета, выявляют молекулярные массы биомаркеров, при этом меньшие соединения достигают детектора раньше. Данный способ генерирует профили массы образца, то есть профили молекулярных масс и количеств соединений в смеси. Эти профили могут затем использоваться для идентификации известных биомаркеров из баз данных биомаркеров.
Благодаря интерфейсу ESI-MS с жидкостной хроматографией (LC/MS/MS) элюирующиеся соединения из колонки LC вводят в источник ионов масс-спектрометра. Напряжение подается на тонкую иглу. Затем игла распыляет капли в масс-спектрометрический анализатор, где капли испаряются, и ионы биомаркера высвобождаются в соответствии с различными зарядовыми состояниями, которые фрагментированы и по которым можно определить состав. В качестве альтернативы, SPE (твердофазная экстракция) или газовая хроматография могут быть связаны с масс-спектрометром.
В частности, SPE/MS/MS нашла применение для автоматизированного и высокопроизводительного промышленного применения способа в соответствии с настоящим изобретением, такого как с использованием устройства Agilent Rapidfire MS (Rapidfire является зарегистрированным товарным знаком компании Agilent Inc.); источника ионов LDTD (абсорбционной спектроскопии на основе настраиваемого диодного лазера) (LDTD является зарегистрированным товарным знаком компании Phytronics Inc.) Phytronics.
Следующее устройство, которое нашло применение, представляет собой калиброванный спектрометр ионной подвижности (IMS), основанный на подвижности ионов в газовой фазе в электрическом поле. В данном случае ионы вещества, генерируемые в результате частичного разряда, УФ-лампы или источника 63Ni, внутри так называемой ионизационной камеры отделяются друг от друга по пути через дрейфовую трубку в соответствии с их молекулярной массой и/или геометрической структурой. Затем устройство измеряет характерные времена дрейфа ионов через эту трубку, позволяя быстро обнаруживать, идентифицировать, а также количественно определять вещество с чрезвычайно высокой чувствительностью и в течение нескольких секунд на образец.
Предпочтительно, масс-спектрометрический анализ включает масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением (ESI), времяпролетную масс-спектроскопию с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF), времяпролетную масс-спектроскопию или поверхностную лазерную десорбционную ионизацию (SELDI-TOF), SPE/MS/MS, источник ионов LDTD (абсорбционной спектроскопии на основе настраиваемого диодного лазера) и/или применение датчика подвижности ионов (IMS).
Масс-спектрометрическая система предпочтительно представляет собой MS с ионизацией электрораспылением (ESI), времяпролетную MS с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF) или времяпролетную MS или поверхностную лазерную десорбционную ионизацию (SELDI-TOF) или абсорбционную MS на основе настраиваемого диодного лазера (LDID). В частности, SPE/MS/MS нашла применение для автоматизированного и высокопроизводительного промышленного применения способа в соответствии с настоящим изобретением, такого как с использованием устройства Agilent Rapidfire MS (Rapidfire является зарегистрированным товарным знаком компании Agilent Inc.); источника ионов LDTD (абсорбционной спектроскопии на основе настраиваемого диодного лазера) (LDTD является зарегистрированным товарным знаком компании Phytronics Inc.) Phytronics.
Следующее устройство, которое находит применение, представляет собой калиброванный спектрометр ионной подвижности (IMS), основанный на подвижности ионов в газовой фазе в электрическом поле. В данном случае ионы вещества, генерируемые в результате частичного разряда, УФ-лампы или источника 63Ni, внутри так называемой ионизационной камеры отделяются друг от друга по пути через дрейфовую трубку в соответствии с их молекулярной массой и/или геометрической структурой. Затем устройство измеряет характерные времена дрейфа ионов через эту трубку, позволяя быстро обнаруживать, идентифицировать, а также количественно определять вещество с чрезвычайно высокой чувствительностью и в течение нескольких секунд на образец.
Предпочтительно, образец может быть обработан перед анализом. Предпочтительно, обработка образца включает в себя отделение образца с помощью твердофазной экстракции (SPE), газовой хроматографии, одно- или многофазной жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC). Предпочтительно, один или несколько внутренних стандартов эталонных биомаркеров добавляют к образцу перед анализом. Предпочтительно, абсолютную интенсивность сигнала оценивают путем измерения интенсивности сигнала биомаркера и сравнения ее с интенсивностью сигнала одного или нескольких известных внутренних стандартов. Предпочтительно, способ является полностью автоматизированным.
Предпочтительно, осматривают множество яиц на предмет одной или нескольких эмбриональных характеристик.
Предпочтительно, способ дополнительно включает определение того, является ли эмбрион в яйце жизнеспособным и мужского пола, или жизнеспособным и женского пола, или нежизнеспособным, и отделение множества жизнеспособных яиц мужского пола от множества жизнеспособных яиц женского пола, и одного или нескольких нежизнеспособных яиц.
Предпочтительно, способ дополнительно включает идентификацию по меньшей мере одного биомаркера из ряда биомаркеров из образца и сравнение концентрации по меньшей мере одного биомаркера со значениями того же биомаркера в отдельных куриных эмбрионах с известными характеристиками, при этом более высокая или более низкая концентрация в отношении порога одного или нескольких биомаркеров является показателем того, является ли эмбрион мужского пола или женского пола, жизнеспособным или нежизнеспособные, и/или показателем стадии развития эмбриона.
Стадия (с) включает применение порога к значению оценки и количеству, полученному на стадии (b), для идентификации характеристики для эмбриона, ассоциированной с наличием и концентрацией биомаркера. Предпочтительно, стадия (с) дополнительно включает (i) корреляцию каждого соответствующего сигнала или сигнатуры биомаркера с эталонным биомаркером путем сопоставления спектра каждого корреляционного сигнала с ожидаемым спектром корреляционного эталонного биомаркера с использованием меры подобия для определения по меньшей мере одного положительно корреляционного сигнала; (ii) измерение интенсивности каждого положительно корреляционного сигнала и оценки его абсолютной и/или относительной интенсивности сигнала; и (iii) применение порога к значению оценки, полученной из функции подобия, для определения характеристики эмбриона, ассоциированной с наличием и концентрацией коррелируемого биомаркера.
Заявители выяснили, что наличие 3-[(2-аминоэтил)сульфанил]бутановой кислоты в количестве 50 нг/мл или больше в аллантоисной жидкости в день 7, 8 или 9 коррелирует с эмбрионом женского пола, тогда как наличие биомаркера, присутствующего при менее чем 50 нг/мл коррелирует с эмбрионом мужского пола. Предпочтительно, 3-[(2-аминоэтил)сульфанил]бутановая кислота присутствует в количестве от 0,1 до 45 нг/мл, более предпочтительно в количестве от 1 до 40 нг/мл в яйцах мужского пола в день 7, 8 или 9. Предпочтительно, 3-[(2-аминоэтил)сульфанил]бутановая кислота присутствует в количестве от 50,1 до 150 нг/мл, более предпочтительно в количестве от 55 до 140 нг/мл в яйцах женского пола в день 7, 8 или 9.
Тогда как этот единственный биомаркер уже может давать почти полную определенность желаемой характеристики, по меньшей мере первый и второй биомаркер или даже больше биомаркеров предпочтительно могут быть выявлены и анализированы одновременно. Абсолютные и/или относительные количества по меньшей мере первого и второго маркеров затем могут быть использованы для определения одной или нескольких характеристик даже с повышенной достоверностью.
Настоящее изобретение также предпочтительно относится к способу селективной инкубации птенцов видов яйцекладущих со специфической характеристикой, включающему обеспечение множества яиц от видов и подвергание яиц способу, раскрываемому в настоящем документе, для определения характеристики эмбриона и отбора яиц с желаемой характеристикой с формированием отобранного множества яиц, и инкубацию отобранных яиц до вылупления одного или нескольких из птенцов.
Настоящее изобретение также предпочтительно относится к системе выявления и анализа пола эмбриона видов яйцекладущих, содержащей:
(i) систему забора образцов для взятия образцов из отдельных яиц;
(ii) аналитическую систему для сбора спектров;
(iii) средство идентификации пола и/или жизнеспособности, программным образом идентифицирующее сигналы, ассоциированные с одним или несколькими биомаркерами из одного или нескольких образцов, анализируемых аналитической системой, при этом средство дополнительно выполняет анализ, сравнивая сигналы с сохраненной библиотекой данных зарегистрированных контрольных спектров образца и/или с внутренним стандартом, для идентификации эмбриональной характеристики; и
(iv) средство вывода, связывающее информацию одной или нескольких эмбриональных характеристик с образцом и/или анализируемым яйцом.
Предпочтительно, средство идентификации реализуют в программном обеспечении на электронном устройстве, сопряженном с аналитической системой.
Настоящее изобретение также предпочтительно относится к применению множества яиц, получаемого способом в соответствии с настоящим изобретением, для получения продуктов питания для животного и/или человека, для получения и/или выделения косметических, лекарственных и/или питательных соединений, для получения метана посредством ферментации и/или для получения высококачественных удобрений.
Используемый в настоящем документе термин «аллантоисная жидкость» охватывает аллантоисную жидкость с наличием или без наличия других яичных материалов, полученных из птичьих яиц. Например, термин «аллантоисная жидкость» может включают в себя смесь крови и аллантоисной жидкости. Варианты осуществления настоящего изобретения не ограничиваются извлечением материала из аллантоисной жидкости или из областей вблизи верхней поверхности яйца. Удаление материала из аллантоисной жидкости, как описывается в настоящем изобретении, представлено исключительно в качестве одного из примеров возможных вариантов осуществления настоящего изобретения. Различные материалы, в том числе без ограничения амнион, желток, скорлупа, альбумин, ткань, оболочка и/или кровь, могут быть извлечены из яйца и проанализированы с проведением спектрофотометрического анализа для идентификации пола эмбриона, как описывается ниже.
При желании материал может быть извлечен из яиц, имеющих практически любую ориентацию. Используемый в настоящем документе термин «заданное местоположение» обозначает фиксированное положение или глубину внутри яйца. Например, устройство может быть введено в яйцо на фиксированную глубину и/или в фиксированное положение в яйце. Согласно альтернативным вариантам осуществления инъекция может быть осуществлена на основе информации, полученной из яйца, например, относительно положения эмбриона или субгерминальной полости внутри яйца.
В способе в соответствии с настоящим изобретением маркеры развития могут предпочтительно анализироваться инвазивно или неинвазивно.
Предпочтительно, определение выполняют в период от 1 до 15 дней, более предпочтительно от 2 до 14, еще более предпочтительно от 3 до 13 и еще более предпочтительно от 4 до 12 дней после начала инкубации, например, выполняют стадию а) предпочтительно в период времени от 6 до 12 дней после начала инкубации яйца. Кроме того, может быть определена фактическая стадия развития яйца.
Предпочтительно определение характеристики эмбриона в соответствии с настоящим изобретением выполняют как неразрушающий способ, т.е. позволяющий тестируемым таким образом эмбрионам расти, если это желательно, или подвергать их дальнейшим стадиям, таким как in ovo получение вакцин, при условии, что эмбрион жизнеспособен, или для выращивания яиц мужского пола для исключительно мужской популяции кур, например, для производства мяса, или для использования выращиваемых таким образом цыплят в других целях.
Термин «сравнение спектров» предпочтительно может включать в себя одновариантный или предпочтительно многовариантный анализ измеренных спектров и определение ассоциации птичьего эмбриона с определенной популяцией. Стадия может включать определение наличия определенных пиков сигнала в спектре посредством многовариантного статистического анализа спектральных данных. Программа многовариантного статистического анализа предпочтительно включает в себя программу анализа главных компонентов и/или программу регрессионного анализа частичных наименьших квадратов. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу, устройству и системе для определения пола и/или жизнеспособности эмбриона птицы in ovo, включающим в себя многовариантную программу статистического анализа, а также к осуществляемому микропроцессором способу для определения этого. Предпочтительно, стадия (b) дополнительно включает в себя стадию нормализации эффектов интенсивности из-за разности концентраций между любыми двумя образцами.
Преимущественно, это выполняют с использованием дискриминационного анализа частичных наименьших квадратов (PLS-DA). Способ предпочтительно включает математическую обработку данных меченого соединения и включает многовариантный анализ, такой как РСА (анализ главных компонент), предпочтительно с последующим контролируемым анализом, более предпочтительно PLS-DA (дискриминационным анализом частичных наименьших квадратов) или даже более предпочтительно с ортогональным PLSDA или с аналогичными подходящими статистическими подходами. Стадия сопоставления с образцом в заявляемом способе будет идентифицировать определенную меру подобия. С использованием меры подобия подтверждают корректную структуру биомаркера. Это подтверждение выполняют с помощью спектрального соответствия. Спектральное соответствие выполняют путем сравнения спектров образца и эталонных спектров в базе данных. Для положительной идентичности на этой стадии требуется соответствующая корреляция, чтобы подтвердить точность определения. Подходящие пороговые значения и меры подобия будут очевидны для специалистов в данной области. Данный способ пытается уменьшить большие объемы данных до управляемого размера и применить статистически управляемую модель для определения скрытых переменных, указывающих на скрытые отношения между наблюдаемыми данными.
Средство идентификации характеристики затем фильтрует данные образца, которые будут идентифицировать представляющие интерес кластеры среди образцов. Кластеры представляют подобия среди образцов и используются для идентификации профилей пола. Предпочтительно, анализ включает в себя анализ главных компонент (РСА) и PLS-DA. РСА использует математические алгоритмы для определения различий и подобия в наборе данных. РСА трансформирует число возможно родственных переменных в меньшее число неродственных переменных, которые называются главными компонентами. Первая главная компонента учитывает как можно большую изменчивость данных. Каждая добавленная компонента пытается учесть как можно большую часть оставшейся изменчивости в данных. Собранные данные могут быть упорядочены в матрицу, и РСА выполняется для «собственных значений» и «собственных векторов» квадратно-симметричной матрицы с суммами квадратов и перекрестных произведений. Собственный вектор, ассоциированный с наибольшим собственным значением, имеет то же направление, что и первая главная компонента. Собственный вектор, ассоциированный со вторым наибольшим собственным значением, определяет направление второй главной компоненты. Сумма собственных значений равна трассировке квадратной матрицы, а максимальное число собственных векторов равно количеству строк (или столбцов) этой матрицы. После определения можно построить экранные графики рассчитанных собственных значений. Специалистам в данной области будет понятно, что ряд различных алгоритмов может использоваться для вычисления собственных значений и собственных векторов. Данные отображают с использованием двух графиков: i) графика оценок, который показывает кластеризацию группы, и ii) графика нагрузок, на котором спектральные данные, ответственные за кластеризацию группы, идентифицируются как те, что находятся на наибольшем расстоянии от источника.
Способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно может определять, является ли эмбрион в яйце жизнеспособным и мужского пола или жизнеспособным и женского пола, и отделять множество жизнеспособных яиц мужского пола от множества жизнеспособных яиц женского пола и множества нежизнеспособных яиц, проводить отбор преимущественно яиц мужского пола, или преимущественно яиц женского пола, или преимущественно нежизнеспособных яиц. При желании отобранные жизнеспособные яйца женского пола или мужского пола могут быть подвергнуты способу инкубации и вылупления для формирования популяции животных преимущественно женского пола или мужского пола.
Яйца могут быть использованы для различных применений, например, для получения вакцин, путем предпочтительно инъецирования вируса или подобного вирусу материала в каждое яйцо, идентифицированное как содержащее живой эмбрион и имеющее мужской пол или женский пол. Затем после соответствующей инкубации инъецированных таким образом яиц вакцину или материал на основе вакцин можно выделять из инкубируемых яиц. Дополнительный предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу выявления наличия вещества в образце жидкости яйца, при этом может быть достаточно образца, как правило, в диапазоне от 0,1 до 35 мкл.
Мера подобия предпочтительно включает корреляционный индекс удерживания и паттерн фрагментации, ассоциированный с положительно корреляционным сигналом.
Далее статистически значимое подобие может быть выявлено и зарегистрировано как релевантные биомаркерные идентичности или множественные биомаркерные идентичности. Определение статистически значимых подобий включает использование баз данных, а также алгоритмов, разработанных для удовлетворения требований способа.
Это может включать, в частности, при определении применимости биомаркера для нового применения, контролируемый многовариантный анализ, предпочтительно дискриминационный анализ частичных наименьших квадратов PLS-DA или ортогональный дискриминационный анализ частичных наименьших квадратов для данных.
Предпочтительно, характеристика, которая подлежит определению, включает в себя пол, возраст, стадию развития и/или жизнеспособность эмбриона в яйце. Для промышленного применения множество яиц проверяют на предмет одной или нескольких эмбриональных характеристик.
Способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно полностью автоматизирован, что обеспечивает анализ биомаркеров в образце, ассоциированном с яйцом, который является автоматическим и точным. Таким образом, анализ основан на масс-спектрометрии для идентификации биомаркеров. Предпочтительно, способ фильтрует и скринирует массу и идентичность наборов данных, которые основаны на каждом из уникальных свойств заряда, массы и паттерна фрагментации, ассоциированных с определенными идентифицируемыми биомаркерами в образце.
Путем сопоставления данных анализа меченого соединения с библиотекой образцов известного пола может быть дополнительно улучшена избирательность определения пола. Способ в соответствии с настоящим изобретением, кроме того, предпочтительно включает определение того, является ли эмбрион в яйце жизнеспособным и мужского пола или жизнеспособным и женского пола, а также выполнение отделения множества жизнеспособных яиц мужского пола от множества жизнеспособных яиц женского пола, проведение отбора преимущественно яиц мужского пола или преимущественно яиц женского пола. Отобранные таким образом жизнеспособные яйца женского пола или мужского пола предпочтительно могут быть подвергнуты способу инкубации и вылупления для формирования популяции животных преимущественно женского пола или мужского пола.
Способ в соответствии с настоящим изобретением позволяет одновременно анализировать сотни или тысячи яиц и сотни или тысячи биомаркеров в образце, взятом из каждого яйца. Способ основан на базе данных биомаркеров, которая, как было показано, ассоциирована с характеристикой, включающей в себя масс-данные и спектральные данные для каждого из биомаркеров, и позволяет точно идентифицировать биомаркеры с помощью подходящего программного обеспечения в данном образце.
Кроме того, база данных может быть создана для определенных видов путем скрининга биомаркеров, присутствующих в образце, и устранения нежелательных сигналов на основе индекса времени удерживания, который коррелирует со временем попадания соединения в детектор массы. Следовательно, многие последовательности могут быть проанализированы в течение минут, и данные биомаркеры могут быть идентифицированы с высокой достоверностью. Таким образом, способ является автоматизированным, высокопроизводительным, может использоваться относительно неквалифицированными специалистами и, поэтому, подходит для применения в удаленных местоположениях, например, на инкубаторно-птицеводческих станциях и куриных или рыбных фермах.
Образец может быть подвергнут анализу масс без процедур предварительного разделения. Согласно такому варианту осуществления образец предпочтительно анализируют путем прямой инфузии с использованием, например, статических принципов наноэлектрораспыления, анализа введения в поток или введения в поток с обогащением образца.
Предпочтительно, образец обрабатывают перед анализом масс, предпочтительно для отделения компонентов образца перед загрузкой их в масс-спектрометр. Например, обработка образца включает отделения образца одно- или многофазной жидкостной хроматографией высокого давления (HPLC), газовой хроматографией (GC) или твердофазной экстракцией (SPE).
Масс-спектрометрическая система предпочтительно представляет собой MS с ионизацией электрораспылением (ESI), времяпролетную MS с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF) или времяпролетную MS или поверхностную лазерную десорбционную ионизацию (SELDI-TOF) или абсорбционную MS на основе настраиваемого диодного лазера (LDID).
Способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно является автоматизированным и выполняется под контролем компьютера. Идентификацию биомаркеров в образце выполняют путем сравнения с эталонными данными для биомаркеров, предпочтительно, эталонная масса и спектральные данные для множества биомаркеров хранятся в компьютере. Эталонные масс-спектры для определенного биомаркера предпочтительно представляют собой усредненные спектры, полученные из фактических и измеренных данных, полученных расчетом кластеризации, как изложено ниже. Биомаркер может быть релевантным сам по себе, в сочетании с другими маркерами, для характеристики, которая объективно измеряется и оценивается как показатель состояния, такого как пол, возраст и жизнеспособность или статус питания. Применимым биомаркером может быть любой идентифицируемый и измеряемый индикатор, ассоциированный с конкретным состоянием или заболеванием, при этом существует корреляция между наличием или содержанием биомаркера и некоторым аспектом состояния, включая наличие стадии развития. Корреляция может быть качественной, количественной или как качественной, так и количественной. Обычно биомаркером является соединение, фрагмент соединения или группа соединений. Такими соединениями могут быть любые соединения, обнаруженные в организме или продуцируемые организмом, в том числе белки и пептиды, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, сахара и другие соединения. Биомаркер может быть описан как «характеристика, которая объективно измеряется и оценивается как индикатор состояния, такого как пол, возраст и жизнеспособность или статус питания». Биомаркером является любой идентифицируемый и измеримый индикатор, связанный с конкретным состоянием или заболеванием, при этом существует корреляция между наличием или уровнем биомаркера и некоторым аспектом состояния, включая наличие стадии развития. Корреляция может быть качественной, количественной или как качественной, так и количественной. Биомаркеры также могут включать в себя соединения, которые являются метаболитами меченых молекул-предшественников, которые были введены в овулирующий родительский организм, а затем метаболизированы эмбрионом в ходе его развития с выделением меченых метаболитов в качестве биомаркеров.
Базу данных контрольных спектров, собранных из контрольных образцов, предпочтительно первоначально составляют путем выбора образцов определенного пола данной куриной расы. Полной библиотекой или базой данных считают содержащую образцы обоих полов.
В частности, типизация основана на спектральных различиях, которые проявляются во всех частях как ультрафиолетового, так и видимого диапазона. В настоящее время происхождение этих различий неизвестно, но это может быть связано с внутренними различиями поглощения на молекулярном уровне.
Кроме того, вычислительные средства содержат программные средства, находящиеся в компьютере.
Специалисту в данной области должно быть понятно, что могут быть рассмотрены дополнительные варианты осуществления, в том числе системы и способы для характеристики других компонентов яйца и их составляющих, таких как без ограничения аллантоисная жидкость, яичный желток, яичный белок и яичная скорлупа.
Настоящее изобретение также относится к отбору яиц, а после вылупления - к птенцу или популяции птенцов, получаемых данным способом.
Настоящее изобретение также относится к способу, системе и пищевому продукту для in ovo определения пола, жизнеспособности и/или стадии развития эмбрионов видов яйцекладущих в более общих терминах, т.е. без ограничения курицей или даже более конкретно Gallus gallus domesticus.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу определения in ovo пола, жизнеспособности и/или стадии развития эмбриона видов яйцекладущих. Способ в соответствии с настоящим изобретением, кроме того, относится к отбору яиц мужского пола и яиц женского пола, а также к получению групп живых животных с использованием таких отобранных яиц. Яйцекладущие животные откладывают яйца, с непродолжительным эмбриональным развитием в организме матери или вообще без такового. Это репродуктивный способ большинства рыб, амфибий, рептилий, всех птиц и большинства насекомых, моллюсков и паукообразных. Выращивание яйцекладущих животных и их яиц обеспечивает постоянно растущую часть мирового производства белка, а также различные другие крупные промышленные процессы, такие как производство вакцин. В настоящее время наиболее важные способы выращивания яйцекладущих животных включают в себя разведение видов птиц, таких как домашняя птица, и культивирование водных организмов, т.е. выращивание водных организмов, таких как рыба, ракообразные и моллюски.
Настоящее изобретение также относится к способу идентификации пола, жизнеспособности и/или стадии развития эмбриона яйцекладущих in ovo, включающему а) обеспечение пищевого продукта, содержащего меченый материал-предшественник, содержащий по меньшей мере одно меченое соединение-предшественник, которое является приемлемым для применения в качестве добавки в пищу овулирующему родительскому организму, и b) инкубацию яйца на протяжении подходящего периода для обеспечения метаболизма меченого соединения-предшественника с образованием по меньшей мере одного меченого соединения в подходящем количестве; и с) подвергание яйца или образца из яйца анализу для определения наличия и количества одного или нескольких меченых соединений, и d) определение пола, жизнеспособности и/или стадии развития эмбриона яйцекладущих по данным, полученным на стадии (с).
Оплодотворенные яйца большинства видов яйцекладущих имеют тенденцию обеспечивать примерно равное распределение самцов и самок животных. Однако по разным причинам при управлении инкубаторно-птицеводческой станцией может быть желательно разделение животных по различным характеристикам, в частности, по полу. Например, при коммерческом производстве домашней курицы и яиц инкубация и выращивание цыплят мужского пола крайне нежелательна, что приводит к выбраковке миллиардов цыплят мужского пола каждый год. При производстве мелких ракообразных и креветок желательно выращивать исключительно женскую популяцию из-за способов, необходимых для стимулирования созревания яиц.
В настоящее время в обоих случаях смешанные популяции вылупившихся животных подвергают разделению по половому признаку путем визуальной оценки молоди, а иногда даже взрослой популяции, если у подростков нет подходящих признаков. В любом случае, это очень трудоемкий процесс, требующий высококвалифицированных операторов и, как правило, очень стрессовый для животных. Кроме того, если взрослых животных разделяют по полу, то все популяции необходимо выращивать до минимального возраста, в то время как только половина выращенных таким образом животных используется для размножения после отделения. Дополнительные проблемы могут возникать, когда присутствие, например, мужской популяции может привести к снижению производительности, например, из-за каннибализма и снижения плотности фермерского хозяйства, о чем сообщалось, например, в случае пресноводной креветки М. rosenbergii.
Также в рыбоводстве определение половой принадлежности или пола рыбы позволило бы вырастить преимущественно мужские или женские однополые популяции, что позволило бы более конкретно ориентироваться на рост и здоровье популяции, как это практикуется в настоящее время для нильской тилапии, которую культивируют предпочтительно в виде исключительно мужской популяции. Опять же, у большинства рыб только у молоди на поздней стадии или во взрослой стадии пол может быть определен визуальным осмотром, так что сложные паттерны скрещивания и специфические популяции должны быть установлены с «супермужскими» гибридами, которые могут быть склонны к усилению наличия генетических нарушений и которые также могут быть склонны к определенным заболеваниям, связанным с размножением очень небольшой генетической популяции.
Кроме того, имеется процент яиц, которые являются неоплодотворенными или не содержат жизнеспособный эмбрион на начало периода инкубации, что сильно снижает производительность инкубаторов, используемых на инкубаторно-птицеводческих станциях, в частности, для яиц домашней птицы.
В результате требуется производственная мощность инкубатора, которая по меньшей мере вдвое больше необходимой, если не возможен ранний отбор по полу, позволяющий отбирать в основном только мужские или женские эмбрионы.
Соответственно, это будет иметь большое значение для окружающей среды благодаря уменьшению количества энергии и других необходимых ресурсов, а в равной степени и для устранения ненужных животных путем выбраковки, а также для снижения стресса недавно вылупившихся животных, если способ был доступен на ранней стадии, что позволило определить пол эмбрионов птиц до фазы инкубации, что также позволило значительно увеличить производственная мощность инкубаторно-птицеводческой станции. Дополнительным преимуществом было бы, если бы данный способ также позволял отбирать жизнеспособные эмбрионы по сравнению с неоплодотворенными и/или иным образом нежизнеспособными яйцами, что еще больше повысило бы эффективность процесса вылупления.
В отношении рыб или мелких ракообразных были опубликованы различные способы, в основном основанные на PCR или антителах. Однако они довольно дорогие и сложные.
Следовательно, сохраняется потребность в более быстром и более легком в применении способе неразрушающего определения пола, а также стадии развития и/или жизнеспособности эмбриона яйцекладущих животных in ovo.
Поэтому, следующая цель настоящего изобретения заключается в обеспечении способа идентификации характеристики эмбриона видов яйцекладущих in ovo, при этом способ включает: (а) подвергание образца материала, ассоциированного с яйцом, содержащим эмбрион, масс-спектрометрическому анализу и регистрацию индекса времени удерживания и соответствующей массы и массы для каждого выявляемого сигнала; (b) корреляцию массы, соответствующей каждому сигналу, с эталонной базой данных биомаркерных масс, специфических для видов, с получением корреляции между одним или несколькими сигналами и одним или несколькими эталонными биомаркерами; (с) подтверждение корреляции между каждым корреляционным сигналом и эталонным биомаркером путем сопоставления масс-спектра каждого корреляционного сигнала с масс-спектром корреляционного эталонного биомаркера с использованием меры подобия для определения по меньшей мере одного положительно корреляционного сигнала; и (d) измерение интенсивности каждого положительно корреляционного сигнала и оценивание его абсолютной или относительной интенсивности сигнала; и (е) применение порога к значению оценки, полученному из функции распознавания, с определением характеристики для эмбриона, ассоциированной с наличием и концентрацией коррелируемого биомаркера.
Следующая цель заключается в обеспечении такого инструментария для применения на инкубаторно-птицеводческих станциях. Еще одной целью является обеспечение системы, способной выполнять анализ яиц в режиме реального времени в удаленных местоположениях, таких как инкубаторно-птицеводческие станции или объекты культивирования водных организмов. Эти и другие цели осуществляются с помощью устройства и способа в соответствии с настоящим изобретением. Следовательно, настоящее изобретение относится к способу идентификации одного или нескольких биомаркеров, ассоциированных с характеристикой эмбриона видов яйцекладущих in ovo, при этом способ включает анализ множества образцов от множества яиц видов с известным полом на масс-спектрометре с получением множества масс-спектров для установления биомаркерного паттерна и выполнение распознавания паттернов по масс-спектрам с получением биомаркерного паттерна, и определение биомаркеров и содержаний биомаркеров, ассоциированных по меньшей мере с одной характеристикой эмбриона, на основании биомаркерного паттерна.
Согласно следующему аспекту заявляемый способ также относится к множеству жизнеспособных яиц женского пола, обеспечивая отбор яиц преимущественно мужского пола или яиц преимущественно женского пола. Согласно следующим аспектам заявляемый способ также относится к популяции молоди животных, получаемой способом в соответствии с настоящим изобретением. Согласно следующим аспектам заявляемый способ также относится к применению множества яиц, получаемых способом, для получения продуктов питания для животного и/или человека, для получения и/или выделения косметических, лекарственных и/или питательных соединений, для получения метана посредством ферментации, для получения вакцин и/или для получения высококачественных удобрений.
Согласно следующим аспектам заявляемый способ также относится к системе выявления и анализа пола эмбрионов яйцекладущих животных, содержащей предпочтительно полностью автоматизированное устройство для осуществления заявляемых способов.
Согласно следующим аспектам настоящее изобретение относится к способу идентификации пола, жизнеспособности и/или стадии развития эмбриона яйцекладущих in ovo, включающему а) обеспечение пищевого продукта, содержащего меченый материал-предшественник, содержащий по меньшей мере одно меченое соединение-предшественник, которое является приемлемым для применения в качестве добавки в пищу овулирующему родительскому организму, и b) инкубацию яйца на протяжении подходящего периода для обеспечения метаболизма меченого соединения-предшественника с образованием по меньшей мере одного меченого соединения в подходящем количестве; и с) подвергание яйца или образца из яйца анализу для определения наличия и количества одного или нескольких меченых соединений, и d) определение пола, жизнеспособности и/или стадии развития эмбриона яйцекладущих по данным, полученным на стадии (с).
Настоящее изобретение также относится к системе, в которой средство идентификации пола реализуют в программном обеспечении на электронном устройстве, сопряженном со спектроскопической системой, и предпочтительно в которой средство идентификации содержит средства программного обеспечения, находящиеся в компьютере.
На фиг. 1 изображена А) модель классификации логистической регрессии по одному признаку. Прогностические модели одного признака оценивали по всем измеряемым признакам и наибольшую точность наблюдали с использованием признака 1599, который обеспечивает >90% точность со дня 9. В) Логистическая регрессия по 2 признакам. Модели логистической регрессии оценивали по всем возможным парам измеряемых признаков. После проверки робастности измерений наилучшую характеристику достигали с помощью комбинации признаков 1599 и 507, обеспечивающей >95% точность со дня 10.
Способ в соответствии с настоящим изобретением, таким образом, относится к относительному определению свойства, такого как пол. Это может быть существенно улучшено путем добавления дополнительных признаков и путем, например, удаления отклоняющихся значений или яиц с сомнительными признаками с существенным повышением тем самым точности.
На фиг. 3 показаны хроматограммы соединений с разными пиковыми значениями масс, варьирующими от 220 до 145, выделенными за 850 секунд из образцов мужского пола (темно-серый цвет) и женского пола (светло-серый цвет).
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, что обычно известно рядовому специалисту в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Терминология, используемая в описании настоящего изобретения, приводится в настоящем документе исключительно с целью описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения настоящего изобретения. Многие виды яйцекладущих выращивают коммерческим путем.
Фраза «культивирование водных организмов» включает культивирование пресноводных и морских популяций в контролируемых условиях и может отличаться от промышленного рыболовства, при котором вылавливают диких рыб и других морских животных.
Используемый в настоящем документе термин «рыбы» включает в себя всех жаберных водных имеющих череп животных, у которых отсутствуют конечности с пальцами. В это определение включены живущие в настоящее время миксины, миноги, а также виды хрящевых и костных рыб, будь то морских или пресноводных рыб. Важные виды или семейства рыб, которые культивируют в коммерческих целях, включают в себя представителей семейства пресноводных рыб Cyprinidae, таких как карпы, настоящие гольяны и их родственники, например, барбусы, усачи, сомы, и Pangasiida, белый амур, карп обыкновенный, пестрый толстолоб, обыкновенный толстолоб, катля, обыкновенный карась и т.п.; Salmonidae, в том числе лосось, форель, гольцы, пресноводные сиги и хариусы, например, атлантический лосось, морская форель и радужная форель; Serranidae, такие как баррамунди или азиатский морской окунь, японский морской окунь, европейский морской окунь; Latidae; Sparidae, такие как морской лещ и порги; Cichlidae, такие как тилапия Нила или Мозамбика, и Acipenseridae, такие как атлантический или белужий осетр.
Используемый в настоящем документе термин «ракообразные» относится к группе являющихся раздельнополыми и размножающихся половым путем видов членистоногих, которые включают в себя таких хорошо известных животных, как крабы, лобстеры, раки, мелкие ракообразные.
Используемый в настоящем документе термин «крабы» означает десятиногих ракообразных отряда Brachyura.
Используемый в настоящем документе термин «мелкое ракообразное» и/или «креветка» относится к любому виду культивируемого ракообразного, такому как культивируемые в соленой или солоноватой воде Penaeidae, предпочтительно креветки рода Penaeus, в том числе гигантская тигровая креветка P. monodon, тихоокеанская белая креветка Litopenaeus vannamei; западная голубая креветка (P. stylirostris); китайская белая креветка (P. chinensis); креветка курума (P. japonicus); индийская белая креветка (Р. indicus); банановая креветка (P. merguiensis) и другие представители семейств Caridea или Dendrobranchiata; и культивируемые в пресной воде ракообразные, такие как, например, Macrobrachium rosenbergii. М. nipponense и М. malcolmsonii; рак рода Astacoidea и Parastacoidea, такой как Procambarus clarkii; и культивируемые виды лобстера из семейств Nephropidae и Homaridae, а также лангусты из семейства Palinuridae.
Используемый в настоящем документе термин «моллюски» относится к большому филуму беспозвоночных животных, известному как отряд Mollusca, в том числе головоногие моллюски, такие как кальмар, каракатица и осьминог; двустворчатые моллюски, такие как панцирные, скафоподы и лопатоногие, которые являются раздельнополыми и характеризуются внешним оплодотворением.
Используемые в настоящем документе термины «птичьи» и «птица» включают в себя особей мужского пола или особей женского пола любых видов птиц, но главным образом охватывают домашнюю птицу, которую коммерчески выращивают для яиц или мяса. Следовательно, термины «птичьи» и «птица», в частности, охватывают красную и серую джунглевую курицу, цыпленка, индеек, уток, гусей, перепела, голубей, страуса, эму и фазанов.
Используемый в настоящем документе термин «инкубация» относится к способу, которым яйцекладущие животные, такие как птицы, высиживают свои яйца, и к развитию эмбриона в яйце после выхода из тракта взрослой особи. Период инкубации в настоящем документе относится к непрерывному промежутку времени, на протяжении которого конкретное яйцо подвергается условиями, имитирующим высиживание до вылупления, т.е. появления птиц, в том числе любую обработку или перемещение, например, из инкубатора на инкубаторно-птицеводческую станцию, при условии, что развитие животного не остановлено.
Используемый в настоящем документе термин «in ovo» относится к эмбрионам, содержащимся в яйце до вылупления. Настоящее изобретение может применяться на практике с яйцом любого типа птицы, рыбы, моллюска, рептилии или ракообразного, в том числе без ограничения с яйцами (одомашненной) курицы, индейки, утки, гуся, перепела и фазана, яйцами рыбы, такой как карп, лосось или тилапия; яйцами мелких ракообразных или креветок и яйцами моллюсков.
Используемые в настоящем документе термины «инъекция» и «инъецирование» охватывают способы введения устройства (как правило, удлиненного устройства) в яйцо или эмбрион, в том числе способы доставки или выпускания вещества в яйцо или эмбрион, способы извлечения вещества (т.е. образца) из яйца или эмбриона и/или способы введения детекторного устройства в яйцо или эмбрион.
Используемый в настоящем документе термин «масс-спектрометрия» относится к аналитической методике, которая сортирует ионы на основании их масс. Масс-спектрометрию, как правило, используют для химического анализа во многих ситуациях, и она может быть применена для любого образца от комплексной смеси нефтяных продуктов до продуктов генной инженерии. Проще говоря, масс-спектр даст картину точного химического состава образца.
Масс-спектр представляет собой график зависимости ионного сигнала от отношения массы к заряду. Эти спектры используют для определения элементной или изотопной сигнатуры образца, масс частиц и молекул, а также для выяснения химической структуры молекул. Масс-спектрометрия ионизирует химические соединения с образованием заряженных молекул или фрагментов молекул и измеряет их отношение массы к заряду.
В типичной процедуре MS образец, который может быть твердым, жидким или газообразным, ионизируют, например, бомбардируя его электронами. Это может вызывать распад некоторых молекул на заряженные фрагменты. Эти ионы затем разделяются в соответствии с их отношением массы к заряду, обычно путем их ускорения и воздействия на них электрическим или магнитным полем. Ионы с одинаковым отношением массы к заряду будут подвергаться одинаковому отклонению.
Ионы выявляют с помощью подходящего механизма, способного обнаруживать заряженные частицы, такого как электронный умножитель. Результаты отображаются в виде спектров относительного содержания выявленных ионов в зависимости от отношения массы к заряду. Атомы или молекулы в образце могут быть идентифицированы путем корреляции известных масс с идентифицированными массами или с помощью характерного паттерна фрагментации. В настоящем контексте масс-спектрометрию применяют для идентификации и обнаружения подходящих биомаркеров. Масс-спектрометрия (MS) является ценной аналитической методикой, поскольку она измеряет существенные свойства молекулы, ее массу, с очень высокой чувствительностью. Таким образом, MS можно использовать для измерения широкого спектра биомаркерных молекул и широкого спектра образцов материалов. Как известно, правильная подготовка образцов имеет решающее значение для генерации сигнала MS, разрешения и чувствительности спектров. Поэтому, подготовка образца является важной составляющей общей осуществимости и чувствительности анализа.
Предпочтительные способы масс-спектрометрической характеристики биомаркеров включают ионизацию лазерной десорбцией с использованием матрицы (MALDI) и ионизацию электрораспылением (ESI), любая из которых предпочтительно может быть объединена с времяпролетным (TOF) или другими типами масс-спектрометрических датчиков для определения массы и/или паттерна фрагментации биомаркера. Предпочтительно, масс-спектрометрия может быть использована в тандеме с хроматографической и другими методиками разделения в настоящем документе.
MALDI функционирует путем воздействия импульсов лазера на образец. Данная обработка выпаривает и ионизирует образец. Затем определяют молекулярные массы (массы) заряженных ионов на анализаторе TOF. В этом устройстве электрическое поле ускоряет заряженные молекулы по направлению детектора, и по различиям в продолжительности времени, которое требуется ионизированным фрагментам для достижения детектора, т.е. их времени пролета, выявляют молекулярные массы биомаркеров, при этом меньшие соединения достигают детектора раньше.
Данный способ генерирует профили массы образца, то есть профили молекулярных масс и количеств соединений в смеси. Эти профили могут затем использоваться для идентификации известных биомаркеров из баз данных биомаркеров.
Благодаря интерфейсу ESI-MS с жидкостной хроматографией (LC/MS/MS) элюирующиеся соединения из колонки LC вводят в источник ионов масс-спектрометра. Напряжение подается на тонкую иглу. Затем игла распыляет капли в масс-спектрометрический анализатор, где капли испаряются и ионы биомаркера высвобождаются в соответствии с различными зарядовыми состояниями, которые фрагментированы и по которым можно определить состав. В качестве альтернативы, SPE (твердофазная экстракция) или газовая хроматография могут быть связаны с масс-спектрометром. В частности, SPE/MS/MS нашла применение для автоматизированного и высокопроизводительного промышленного применения способа в соответствии с настоящим изобретением, такого как с использованием устройства Agilent Rapidfire MS (Rapidfire является зарегистрированным товарным знаком компании Agilent Inc.); или устройства лазернодиодной или термоионной десорбции LDID.
Тандемная масс-спектрометрия (MS/MS) включает активацию иона-предшественника посредством столкновений с целевым газом и может давать заряженные и нейтральные фрагменты. Природа ионов-фрагментов, а также их интенсивности часто указывают на структуру иона-предшественника и, таким образом, могут давать полезную информацию для идентификации неизвестных аналитов, а также обеспечивать полезную методику скрининга для различных классов аналитов. Активация посредством множественных столкновений продлевает время активации и позволяет придавать ионам-предшественникам более высокую энергию. Более высокое давление газа для соударений также предполагает более высокие скорости столкновительной релаксации.
Предпочтительно определение характеристики эмбриона в соответствии с настоящим изобретением выполняют как неразрушающий способ, т.е. позволяющий тестируемым таким образом эмбрионам расти, если это желательно, или подвергать его дальнейшим стадиям, таким как in ovo получение вакцин, при условии, что эмбрион жизнеспособен.
Используемый в настоящем документе термин «аллантоисная жидкость» охватывает аллантоисную жидкость с наличием или без наличия других яичных материалов, полученных из птичьих яиц. Например, термин «аллантоисная жидкость» может включают в себя смесь крови и аллантоисной жидкости. Варианты осуществления настоящего изобретения не ограничиваются извлечением материала из аллантоисной жидкости или из областей вблизи верхней поверхности яйца. Удаление материала из аллантоисной жидкости, как описывается в настоящем изобретении, представлено исключительно в качестве одного из примеров возможных вариантов осуществления настоящего изобретения. Различные материалы, в том числе без ограничения амнион, желток, скорлупа, альбумин, ткань, оболочка и/или кровь, могут быть извлечены из яйца и проанализированы для проведения спектрофотометрического анализа для идентификации пола эмбриона, как описывается ниже.
При желании материал может быть извлечен из яиц, имеющих практически любую ориентацию. Используемый в настоящем документе термин «заданное местоположение» означает фиксированное положение или глубину внутри яйца. Например, устройство может быть введено в яйцо на фиксированную глубину и/или в фиксированное положение в яйце. Согласно альтернативным вариантам осуществления инъекция может быть осуществлена на основе информации, полученной из яйца, например, относительно положения эмбриона или субгерминальной полости внутри яйца.
В качестве альтернативы, особенно в случае яиц моллюска, рыбы или мелкого ракообразного, высокая просвечиваемость таких яиц, а также их сравнительно небольшой размер относительно птичьих яиц может позволить прямой, неинвазивный анализ посредством прямых, неинвазивных измерений на целых яйцах.
Термин «сравнение спектров» предпочтительно может включать в себя одновариантный или предпочтительно многовариантный анализ измеренных спектров и определение ассоциации птичьего эмбриона с определенной популяцией. Стадия может включать определение наличия определенных пиков сигнала в спектре посредством многовариантного статистического анализа спектральных данных. Программа многовариантного статистического анализа предпочтительно включает в себя программу анализа главных компонентов и/или программу регрессионного анализа частичных наименьших квадратов. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу, устройству и системе для определения пола и/или жизнеспособности эмбриона птицы in ovo, включающим в себя многовариантную программу статистического анализа, а также к осуществляемому микропроцессором способу для определения этого.
Следовательно, сравнение предпочтительно включает оценку вероятности пола для образца с использованием многовариантного анализа измеренных спектров и определение ассоциации птичьего эмбриона с определенной популяцией. Преимущественно, его выполняют с использованием дискриминационного анализа частичных наименьших квадратов (PLS-DA).
Способ предпочтительно включает в себя математическую обработку данных меченого соединения и включает многовариантный анализ, такой как РСА (анализ главных компонент), предпочтительно с последующим контролируемым анализом, более предпочтительно PLS-DA (дискриминационным анализом частичных наименьших квадратов) или даже более предпочтительно с ортогональным PLSDA или с аналогичными подходящими статистическими подходами.
Стадия сопоставления с образцом в заявляемом способе будет идентифицировать определенную меру подобия. С использованием меры подобия подтверждают корректную структуру биомаркера. Это подтверждение выполняют с помощью спектрального соответствия. Спектральное соответствие выполняют путем сравнения спектров образца и эталонных спектров в базе данных. Для положительной идентичности на этой стадии требуется соответствующая корреляция, чтобы подтвердить точность определения. Подходящие пороговые значения и меры подобия будут очевидны для специалистов в данной области.
Данный способ пытается уменьшить большие объемы данных до управляемого размера и применить статистически управляемую модель для определения скрытых переменных, указывающих на скрытые отношения между наблюдаемыми данными.
Средство идентификации характеристики затем фильтрует данные образца, которые будут идентифицировать представляющие интерес кластеры среди образцов. Кластеры представляют подобия среди образцов и используются для идентификации профилей пола. Предпочтительно, анализ включает в себя анализ главных компонент (РСА) и PLS-DA.
РСА использует математические алгоритмы для определения различий и подобия в наборе данных. РСА трансформирует число возможно родственных переменных в меньшее число неродственных переменных, которые называются главными компонентами. Первая главная компонента учитывает как можно большую изменчивость данных. Каждая добавленная компонента пытается учесть как можно большую часть оставшейся изменчивости в данных. Собранные данные могут быть упорядочены в матрицу, и РСА выполняется для «собственных значений» и «собственных векторов» квадратно-симметричной матрицы с суммами квадратов и перекрестных произведений.
Собственный вектор, ассоциированный с наибольшим собственным значением, имеет то же направление, что и первая главная компонента. Собственный вектор, ассоциированный со вторым наибольшим собственным значением, определяет направление второй главной компоненты. Сумма собственных значений равна трассировке квадратной матрицы, а максимальное число собственных векторов равно количеству строк (или столбцов) этой матрицы. После определения можно построить экранные графики рассчитанных собственных значений. Специалистам в данной области будет понятно, что ряд различных алгоритмов может использоваться для вычисления собственных значений и собственных векторов. Данные отображают с использованием двух графиков: i) графика оценок, который показывает кластеризацию группы, и ii) графика нагрузок, на котором спектральные данные, ответственные за кластеризацию группы, идентифицируются как те, что находятся на наибольшем расстоянии от источника.
Способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно включает (a1) обеспечение образца, содержащего жидкость яйца; и (а2) получение спектра образца. Предпочтительно, стадия (b) дополнительно включает стадию нормализации эффектов интенсивности из-за различий в концентрации между любыми двумя образцами. Необязательная стадия (а3) устраняет предпочтительно мутность образцов подходящим способом, таким как ультрафильтрация или центрифугирование.
Предпочтительно, эмбрион является эмбрионом птицы, эмбрионом рептилии, ракообразного, рыбы или моллюска. Наиболее предпочтительно, тестированию подвергают птичьи эмбрионы из-за важного значения выращивания домашней птицы и из-за сравнительно крупного размера яиц, что позволяет отбор образцов.
Способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно может определять то, является ли эмбрион в яйце жизнеспособным и мужского пола, или жизнеспособным и женского пола, и разделять тестируемые яйца на множество жизнеспособных яиц мужского пола и множество жизнеспособных яиц женского пола, а также множество нежизнеспособных яиц, обеспечивая отбор яиц преимущественно мужского пола, или яиц преимущественно женского пола, или преимущественно нежизнеспособных яиц. При желании отобранные жизнеспособные яйца женского пола или мужского пола могут быть подвергнуты способу инкубации и вылупления с образованием популяции животных преимущественно женского пола или мужского пола.
Признаки, которые характеризуют настоящее изобретение, как в отношении организации и способа осуществления, так и в отношении других его целей и преимуществ, станут более понятными из последующего описания, используемого вместе с прилагаемыми графическими материалами. Следует четко понимать, что графические материалы предназначены для иллюстрации и описания, а не для ограничения настоящего изобретения. Эти и другие достигнутые цели, а также предлагаемые преимущества настоящего изобретения станут более понятными, поскольку последующее описание сопровождается графическими материалами.
Способы и устройство согласно вариантам осуществления настоящего изобретения могут быть использованы для идентификации одной или нескольких характеристик яйца в любой момент времени на протяжении периода эмбрионального развития, также называемого периодом его инкубации. Варианты осуществления настоящего изобретения не ограничиваются конкретным днем на протяжении периода эмбрионального развития.
Способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно может быть выполнен двумя путями: с использованием внутренних стандартов для обеспечения эталона для количественного определения интенсивности сигнала и без таких стандартов. Таким образом, согласно одному варианту осуществления один или несколько внутренних стандартов добавляют к образцу перед анализом с помощью масс-спектрометрии. Предпочтительно, внутренние стандарты метят. Предпочтительно, абсолютная интенсивность сигнала для каждого сигнала биомаркера затем может быть оценена путем измерения интенсивности сигнала биомаркера и сравнения с интенсивностью сигнала одного или нескольких известных внутренних стандартов. При альтернативном осуществлении образец обрабатывают без добавления внутренних стандартов. Согласно такому варианту осуществления относительную интенсивность сигнала оценивают путем измерения отношения между интенсивностями сигнала отдельного биомаркера в образце и интенсивностью сигнала эталона для группы образцов.
Мера подобия предпочтительно включает корреляционный индекс удерживания и паттерн фрагментации, ассоциированный с положительно корреляционным сигналом.
Далее статистически значимое подобие может быть выявлено и зарегистрировано как релевантные биомаркерные идентичности или множественные биомаркерные идентичности. Определение статистически значимых подобий включает использование баз данных, а также алгоритмов, разработанных для удовлетворения требований метода.
Это может включать, в частности, при определении применимости биомаркера для нового применения, контролируемый многовариантный анализ, предпочтительно дискриминационный анализ частичных наименьших квадратов, PLS-DA или ортогональный дискриминационный анализ частичных наименьших квадратов для данных.
Предпочтительно, характеристика, которая подлежит определению, включает в себя пол, возраст, стадию развития и/или жизнеспособность эмбриона в яйце. Для промышленного применения множество яиц проверяют на предмет одной или нескольких эмбриональных характеристик.
В способе в соответствии с настоящим изобретением база данных может быть создана для определенных видов путем скрининга биомаркеров, присутствующих в образце, и устранения нежелательных сигналов на основе индекса времени удерживания, который коррелирует со временем попадания соединения в детектор массы. Следовательно, многие последовательности могут быть проанализированы в течение минут, и данные биомаркеры могут быть идентифицированы с высокой достоверностью. Таким образом, способ является автоматизируемым, высокопроизводительным и может использоваться относительно неквалифицированными специалистами и, поэтому, подходит для применения в удаленных местоположениях, например, на инкубаторно-птицеводческих станциях и куриных или рыбных фермах.
Образец может быть подвергнут анализу масс без процедур предварительного разделения. Согласно такому варианту осуществления образец предпочтительно анализируют путем прямой инфузии с использованием, например, статических принципов наноэлектрораспыления, анализа введения в поток или введения в поток с обогащением образца.
Масс-спектрометрическая система предпочтительно представляет собой MS с ионизацией электрораспылением (ESI), времяпролетную MS с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF) или времяпролетную MS или поверхностную лазерную десорбционную ионизацию (SELDI-TOF) или абсорбционную MS на основе настраиваемого диодного лазера (LDID).
В частности, SPE/MS/MS нашла применение для автоматизированного и высокопроизводительного промышленного применения способа в соответствии с настоящим изобретением, такого как с использованием устройства Agilent Rapidfire MS (Rapidfire является зарегистрированным товарным знаком компании Agilent Inc.); источника ионов LDTD (абсорбционной спектроскопии на основе настраиваемого диодного лазера) (LDTD является зарегистрированным товарным знаком компании Phytronics Inc.) Phytronics.
Как изложено выше, настоящее изобретение также относится к пищевому продукту для определения пола, жизнеспособности и/или стадии развития эмбриона, а также к применению меченого соединения-предшественника в пище для животного. Заявители неожиданно выяснили, что добавление подходящих соединений-предшественников в пищу овулирующему родительскому организму приводит к иной экспрессии метаболитов соединений-предшественников в яйце на протяжении эмбрионального развития.
В результате яйца демонстрируют измеряемую вариацию некоторых метаболитов в зависимости от характеристики эмбриона, такой как пол эмбриона. Предпочтительно, по меньшей мере одно меченое соединение-предшественник выбрано из соединения, которое приводится как пищевая добавка, допустимая Управлением США по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и/или Европейской комиссией. В частности, подходящее меченое соединение-предшественник может быть выбрано из бутилированного гидроксианизола (ВНА) и/или родственного соединения бутилированного гидрокситолуола (ВНТ), которое представляет собой фенольное соединение, соответственно добавляемое в пищевые продукты для сохранения жиров. ВНА в настоящем документе относится к смеси изомеров 3-трет-бутил-4-гидроксианизола и 2-трет-бутил-4-гидроксианизола; тогда как ВНТ относится к 3,5-ди-трет-бутил-4-гидрокситолуолу; также известному как метил-ди-трет-бутилфенол; 2,6-ди-трет-бутил-пара-крезол. ВНА и ВНТ являются известными антиоксидантами; полагают, что кислород реагирует преимущественно с ВНА или ВНТ, а не окисляет жиры или масла, защищая тем самым их от порчи. В дополнение к способности окисляться ВНА и ВНТ являются жирорастворимыми. Меченый материал-предшественник предпочтительно добавляют в пищевой продукт в количестве, рассчитанном для обеспечения заданной концентрации или каждого меченого соединения в продукте. Предпочтительно, меченый материал-предшественник добавляют в продукт в количестве, рассчитанном для обеспечения заданной концентрации или каждого меченого соединения в яйце или образце яйца при концентрации в диапазоне от 5 частей на миллиард до 5 частей на миллион, более предпочтительно в диапазоне от приблизительно 10 до 1000 частей на миллиард и еще более предпочтительно от 50 до 500 частей на миллиард.
Меченый материал предпочтительно может содержать более чем одно меченое соединение, при этом относительные количества меченого соединения выбирают для обеспечения идентифицируемой характеристики для пола, жизнеспособности и/или стадии развития эмбриона яйцекладущих, при этом анализ яйца или образца яйца выполняют для идентификации характеристики относительных количеств меченых соединений. Анализ предпочтительно выполняют с использованием масс-спектрометра, такого как, например, датчик подвижности ионов. Образец может быть сначала подвергнут жидкостной хроматографии, газовой хроматографии или комбинации газовой хроматографии, которую предпочтительно объединяют с подходящим датчиком. Альтернативой MS датчику может быть пламенно-фотометрический детектор.
Предпочтительно, по меньшей мере одно из меченых соединений, присутствующих в образце, взятом из яйца, может быть отделено, дериватизировано или концентрировано перед анализом, после стадии анализа жидкости яйца инвазивно или неинвазивно. Предпочтительно, эмбрион, характеристика которого подлежит исследованию, является эмбрионом птицы, эмбрионом рептилии, эмбрионом ракообразного, эмбрионом рыбы или эмбрионом моллюска. Более предпочтительно, эмбрион является эмбрионом птицы, предпочтительно вида Gallus gallus domesticus, или при этом эмбрион является эмбрионом вида ракообразного, выбранного из группы, включающей в себя Peneidae, Astacoidea и Parastacoidea, Macrobrachiae; Astacoidea; Parastacoidea; Nephropidae и Homaridae, или при этом эмбрион является эмбрионом видов рыб, предпочтительно выбранного из карпа, тилапии, сома, морского леща, морского окуня, тунца, скумбрии, бонитоса или желтохвоста.
Настоящее изобретение также относится к пищевому продукту, применяемому для овулирующих животных-родителей, содержащему подходящее количество меченого соединения-предшественника.
Оценка вероятности пола для образца предпочтительно включает применение контролируемого многовариантного анализа, предпочтительно дискриминационного анализа частичных наименьших квадратов, PLS-DA или ортогонального дискриминационного анализа частичных наименьших квадратов для данных.
Предпочтительно, отклоняющиеся значения могут быть удалены из популяции, что тем самым еще больше усиливает достоверность определения, а также способствует получению яиц, подлежащих использованию для других целей.
Способ в соответствии с настоящим изобретением, кроме того, предпочтительно включает разделение яиц на множества яиц мужского пола или женского пола; кроме того, он также может предпочтительно включать определение жизнеспособности эмбриона и разделение яиц на одно или несколько, предпочтительно множество, жизнеспособных яиц и нежизнеспособных яиц.
Способ в соответствии с настоящим изобретением, в котором отклоняющиеся значения удаляют из популяции, предпочтительно дополнительно включает определение того, является ли эмбрион в яйце жизнеспособным и мужского пола, или жизнеспособным и женского пола, и отделение множества жизнеспособных яиц мужского пола от множества жизнеспособных яиц женского пола и отклоняющихся значений для обеспечения отбора преимущественно яиц мужского пола или преимущественно яиц женского пола.
Кроме того, способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно включает подвергание отобранных жизнеспособных яиц женского пола или мужского пола способу инкубации и вылупления для формирования популяции животных преимущественно женского пола или мужского пола.
Жизнеспособность эмбриона предпочтительно может быть определена с использованием измеряемых биомаркеров. Для неоплодотворенных яиц, а также умерших эмбрионов через определенный промежуток времени (т.е. через несколько минут после окончания метаболизма) измеряемые результаты явно полностью выходят за пределы окна измерения, что приводит к отклоняющимся значениям, которые удаляются из жизнеспособных яиц. В равной степени, по меньшей мере в случае эмбрионов птиц, при использовании образцов, например, аллантоиса, они очень быстро после окончания метаболической активности станут нарушенными и в конечном итоге желтыми из-за растворения оболочек, которые удерживают яичный желток отдельно. Кроме того, могут быть измерены сердцебиение или ток крови для определения эмбриональных метаболических активностей.
Настоящее изобретение также относится к применению множества яиц, получаемых раскрываемым в настоящем документе способом получения продуктов питания для животного и/или человека, для получения и/или выделения косметических, лекарственных и/или питательных соединений, для получения метана посредством ферментации, для получения вакцин и/или для получения высококачественных удобрений.
Далее представлены неограничивающие примеры для иллюстрации настоящего изобретения.
Пример 1. Транспортировка и хранение образцов
Для исследования биомаркеров использовали платформы определения профиля нескольких аналитических метаболитов, они представляли собой биогенные амины, отрицательные полярные липиды, определение нецелевого глобального профиля и GC-MS.
Для стадии исследования анализировали 100 образцов. Другой набор из 350 образцов из яиц с разными исходными значениями в отношении питания и расы анализировали для стадии подтверждения, при этом исследуемые биомаркеры для пола и возраста определяли по меньшей мере на двух платформах.
Первые 150 образцов аллантоисной жидкости (от бурой курицы) собирали в дни 7-11 инкубации и хранили при -80°С.
Данные определения генетического пола для данных образцов получали с использованием метода PCR. Отбирали образцы для пола на день, тогда как избыточные образцы данного набора использовали для анализа ЯМР. Затем метаболический профиль этих образцов анализировали с использованием амина, полярных отрицательных липидов, CG-MS (для соединений сахара) и платформ определения глобального профиля.
Другие 300 образцов аллантоисной жидкости собирали на инкубаторно-птицеводческой станции в течении дней 7-11 инкубации бурой курицы.
Анализ генетического пола обеспечивали, но не использовали до построения статистической модели. Данные образцы использовали для подтверждения признаков, обнаруженных предварительным анализом определения глобального профиля. Кроме того, 59 образцов собирали из белых яиц (линии Hey CV 24) и также использовали для данного подтверждающего исследования.
Аликвоты
Образцы оттаивали на протяжении ночи при 4°С перед их аликвотированием. Образцы откручивали на вортексе и вручную аликвотировали следующим образом: 5 мкл для аминного определения профиля, 50 мкл для определения профиля полярного отрицательного липида и 100 мкл для GC-MS (анализа соединений сахара). Создавали пул контроля качества (QC) путем отбора равных количеств из каждого образца с последующим тщательным смешиванием.
Схема партий
Для стадии исследования образцы рандомизировали и распределяли на две партии для измерений аминов. Для отрицательных липидов и определения глобального профиля образцы исследовали одной партией. В качестве повторностей выбирали каждые семь образцов, а также включали калибровочные линии, QC и пустые контроли. В качестве QC анализировали каждые 10 образцов, их использовали для оценивания качества данных и для коррекции по аналитическому сигналу. Пустые контроли использовали для вычитания фоновых уровней из исследуемых образцов.
Необработанные данные предварительно обрабатывали с использованием программного обеспечения Agilent MassHunter Quantitative Analysis (Agilent, версия B.05.01).
Аминное определение профиля
Все упомянутое оборудование, расходные материалы и программное обеспечение обеспечивала компания Waters (Etten-Leur, The Netherlands), если не указано иное. Аминная платформа охватывает аминокислоты и биогенные амины с использованием стратегии дериватизации AccQ-меткой, адаптированной компанией Waters. Вкратце, образцы аллантоисной жидкости (по 5 мкл каждый) дополняли раствором внутреннего стандарта (таблица 1), а затем депротеинизировали с помощью МеОН (Actu-All Chemicals). Надосадочную жидкость (10000 оборотов в минуту, 10°С, 10 минут) сушили в условиях вакуума. Остаток восстанавливали в боратном буфере (рН 8,5) с 6-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидилкарбаматным (AQC) реагентом. Реакцию дериватизации нейтрализовали с помощью 10 мкл 20% муравьиной кислоты (Acros Organics). Надосадочную жидкость (10000 оборотов в минуту, 10°С, 10 минут) переносили во флаконы и помещали в охлажденный (10°С) поддон авто дозатора до инъекции (1 мкл) в систему UPLC-MS/MS.
Анализ данных
Полученные данные оценивали и определенные MRM пики интегрировали с использованием программного обеспечения TargetLynx. MRM пики нормализовали с использованием соответствующих внутренних стандартов, для анализа аминокислот использовали их 13C15N-меченные аналоги, а для других аминов использовали наиболее близкий элюирующий внутренний стандарт. Образцы пустого контроля использовали для коррекции по фону. Применяли собственные разработанные алгоритмы с использованием объединенных образцов QC для коррекции по сдвигам в чувствительности масс-спектрометра в партии.
Анализ данных исследования выполняли для выяснения того, может ли быть обнаружен половой признак. Для этого применяли одновариантные и многовариантные стандартные способы анализа данных в BMFL, которые обычно используются авторами настоящего изобретения для обнаружения биомаркеров.
Затем образцы подвергали тестированию на автоматизированном устройстве совмещенной SPE/MS/MS Rapidfire с высокой пропускной способностью, а также на устройстве LDPD Phytronix. Результаты показывают, что пол жизнеспособных яиц определяли с точностью более чем 95%, менее чем за 10 секунд на образец. На фиг. 1 показана итоговая достоверность определения пола, которая составляла более чем 95% в день 9 или день 10, когда два биомаркера рассматривали вместе.
Вылупление
Серии из 25 яиц, считающихся яйцами мужского пола или женского пола, которые были подвергнуты отбору образцов, как указано выше, и тестированию, обеспечивали вылупление с использованием коммерческого инкубационного устройства и типичных условий инкубации. Все птенцы успешно вылупились из яиц, демонстрируя переносимость отбора образцов. Вылупившиеся цыплята полностью соответствовали популяции либо мужского пола, либо женского пола.
Пример 2. Неинвазивное определение с использованием летучих соединений и твердофазной микроэкстракции (SPME)
Сбор образцов летучих соединений выполняли путем переноса отдельно яйца в стеклянный сосуд, запечатываемый алюминиевой фольгой и металлической крышкой. Затем сосуд помещали на нагревательную пластину, поддерживая температуру внутри сосуда на уровне 37°С. Яйцо в сосуде оставляли на 15 минут для достижения равновесия со свободным пространством в сосуде. Сборный волокнистый материал кондиционировали перед использованием в соответствии с инструкциями производителя. Затем вводили волокно и экстракцию проводили в течение 50 минут. После экстракции волокно вводили в инжектор газового хроматографа на 5 минут для десорбции аналитов при 250°С в режиме без разделения. Яйцо возвращали в инкубатор сразу после сбора летучих соединений. Пустые контроли готовили путем проведения SPME в пустом сосуде и перед анализом проводили рекондиционирование волокна, чтобы гарантировать отсутствие пиков и хорошее качество процедуры SPME.
Летучие соединения, высвобождаемые из яйца, затем измеряли газовой хроматографией на Agilent Technologies (Wilmington, DE, USA) 7890A, оборудованном масс-селективным детектором Agilent Technologies (MSD 5975C). Хроматографическое разделение проводили на колонке HP-5MS UI (5% фенилметилсилокс), 30 м × 0,25 м ID с толщиной пленки 25 м (Agilent) с использованием гелия в качестве газа-носителя со скоростью потока 1 мл/минута. Использовали одноквадрупольный масс-спектрометр с электронной ионизацией (EI, 70 эВ). Масс-спектрометр работал в режиме SCAN. Для экстракции летучих соединений использовали волокно для твердофазной микроэкстракции (SPME) с размером пор 60 мкм PDMS/DVB Stableflex 24 калибра. Необработанные данные преобразовывали в формат CDF с использованием MSD Chemstation F.01.00.1903. Сценарий XCMS разрабатывали и применяли к программному обеспечению R (R, версия 3.2.0) для выполнения выбора пикового значения. Для этого использовали метод «matchedFilter» с fwhm = 4 (Peakwidth), шаг = 0,5 (окно Mass) и snthresh =5 (S/N). Использовали Metaboanalyst 3.0 для статистического анализа. Наконец, использовали MassHunter Qualitative Analysis В.005.00 для ручной проверки наиболее важных характеристик в соответствии с полученными результатами. NIST Mass Spectral Library версии 2.0 использовали для идентификации.
В данном способе из TIC каждого образца получали 1486 признаков различных масс при разных временах удерживания в секундах. После извлечения эти признаки обрабатывали с применением одновариантного способа с Test с использованием Metaboanalyst 3.0 для идентификации половых отличительных признаков с уверенностью 99%.
Заявители выяснили, что особенно важным биомаркером, показывающим значительную разницу между яйцами мужского пола и женского пола, является бутилированный гидрокситолуол, который представляет собой производное ВНТ, в качестве предшественника.
Яйца женского пола показывали значительно более высокую концентрацию бутилированного гидрокситолуола по сравнению с яйцами мужского пола. Следовательно, применение меченого предшественника привело к созданию биомаркера, который позволяет различать куриные эмбрионы мужского и женского пола в яйцеклетке in ovo с высокой степенью достоверности совершенно неинвазивным способом.
Claims (23)
1. Способ неразрушающей идентификации половой характеристики эмбриона Gallus gallus domesticus in ovo, включающий:
(a) получение образца материала, ассоциированного с яйцом, содержащим эмбрион,
и
(b) измерение значения оценки на наличие и концентрацию по меньшей мере первого биомаркера в образце, указывающего на половую характеристику эмбриона, и
(c) применение порога к значению оценки и концентрации, полученным на стадии (b), для идентификации половой характеристики эмбриона, ассоциированной с наличием и концентрацией первого биомаркера, при этом первый биомаркер содержит аминосоединение, имеющее молекулярную массу в диапазоне от 150 до 170 г/моль; при этом стадия (c) дополнительно включает:
(i) корреляцию каждого соответствующего сигнала биомаркера с эталонным биомаркером путем сопоставления спектра каждого корреляционного сигнала с ожидаемым спектром корреляционного эталонного биомаркера с использованием меры подобия для определения по меньшей мере одного положительно корреляционного сигнала;
(ii) измерение интенсивности каждого положительно корреляционного сигнала и оценки его абсолютной и/или относительной интенсивности сигнала; и
(iii) применение порога к значению оценки, полученной из функции подобия, для определения коррелированной характеристики эмбриона; причем первым биомаркером является 3-[(2-аминоэтил)сульфанил]бутановая кислота, а концентрация первого биомаркера составляющая 50 нг/мл или больше, в аллантоисной жидкости эмбриона в дни 7, 8 или 9 коррелирует с эмбрионом женского пола, тогда как наличие первого биомаркера, присутствующего при менее чем 50 нг/мл, коррелирует с эмбрионом мужского пола.
2. Способ по п.1, в котором выявляют и анализируют первый и второй биомаркер и в котором абсолютные и относительные количества по меньшей мере первого и второго маркеров используют для определения одной или нескольких характеристик.
3. Способ по п. 1 или 2, включающий применение одного или нескольких из способа магнитно-резонансной визуализации; метода спектрального резонанса; аналитического хроматографического метода в совокупности с одним или несколькими подходящими детекторами; флуоресцентной спектроскопии и/или способов анализа, включающих селективные в отношении биомаркера реагенты, для измерения наличия и концентрации одного или нескольких биомаркеров, предпочтительно в котором масс-спектрометрический анализ включает масс-спектрометрию с электрораспылительной ионизацией (ESI), времяпролетную масс-спектрометрию с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF) или времяпролетную масс-спектрометрию или поверхностную лазерную десорбционную ионизацию (SELDI-TOF), SPE/MS/MS, источник ионов LDTD (абсорбционную спектроскопию на основе настраиваемого диодного лазера) и/или применение датчика подвижности ионов (IMS).
4. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором тестируемый образец обрабатывают перед анализом, предпочтительно в котором обработка образца включает отделение образца с помощью твердофазной экстракции (SPE), газовой хроматографии, одно- или многофазной жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC).
5. Способ по любому из пп. 3 или 4, в котором добавляют один или несколько внутренних стандартов эталонных биомаркеров к образцу перед анализом с помощью масс-спектрометрии.
6. Способ по п.5, в котором абсолютную интенсивность сигнала оценивают путем измерения интенсивности сигнала биомаркера и сравнения ее с интенсивностью сигнала одного или нескольких известных внутренних стандартов.
7. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором множество яиц исследуют на предмет одной или нескольких эмбриональных характеристик и предпочтительно дополнительно включающий определение, является ли эмбрион в яйце жизнеспособным и мужского пола или жизнеспособным и женского пола или нежизнеспособным, и отделение множества жизнеспособных яиц мужского пола от множества жизнеспособных яиц женского пола и одного или более нежизнеспособных яиц.
8. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором способ является полностью автоматизированным.
9. Способ по п. 8, дополнительно включающий сортировку жизнеспособных яиц в соответствии с предполагаемым временем до вероятного вылупления эмбриона.
10. Способ селективной инкубации птенцов видов яйцекладущих со специфической половой характеристикой, включающий:
a) обеспечение множества яиц от видов, и
b) подвергание яиц способу по пп. 1-9 для определения половой характеристики
эмбриона, и
c) отбор яиц с желаемой половой характеристикой с формированием отобранного
множества яиц, и
d) инкубацию отобранных яиц до вылупления одного или нескольких птенцов.
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL2016818A NL2016818B1 (en) | 2016-05-24 | 2016-05-24 | Method, system and food product for the in ovo gender, viability and/or developmental stage determination of embryos of oviparian species. |
| NL2016818 | 2016-05-24 | ||
| NL2016819A NL2016819B1 (en) | 2016-05-24 | 2016-05-24 | Method and system for the non-destructive in ovo determination of fowl gender. |
| NL2016819 | 2016-05-24 | ||
| NL2017382 | 2016-08-29 | ||
| NL2017382 | 2016-08-29 | ||
| PCT/NL2017/050330 WO2017204636A2 (en) | 2016-05-24 | 2017-05-24 | Method and system for the non-destructive in ovo determination of fowl gender |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2018142577A RU2018142577A (ru) | 2020-06-25 |
| RU2018142577A3 RU2018142577A3 (ru) | 2020-11-05 |
| RU2756447C2 true RU2756447C2 (ru) | 2021-09-30 |
Family
ID=59366469
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018142577A RU2756447C2 (ru) | 2016-05-24 | 2017-05-24 | Способ и система для неразрушающего in ovo определения пола птицы |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11686732B2 (ru) |
| EP (2) | EP3859341A3 (ru) |
| JP (1) | JP7320353B2 (ru) |
| KR (1) | KR102530639B1 (ru) |
| CN (1) | CN109477840B (ru) |
| AU (1) | AU2017269050B2 (ru) |
| BR (1) | BR112018074071A8 (ru) |
| CA (1) | CA3025127A1 (ru) |
| DK (1) | DK3465222T3 (ru) |
| ES (1) | ES2877368T3 (ru) |
| HR (1) | HRP20210991T8 (ru) |
| HU (1) | HUE055153T2 (ru) |
| IL (1) | IL263138B2 (ru) |
| MX (2) | MX2018014484A (ru) |
| PL (1) | PL3465222T3 (ru) |
| PT (1) | PT3465222T (ru) |
| RU (1) | RU2756447C2 (ru) |
| UA (1) | UA127784C2 (ru) |
| WO (1) | WO2017204636A2 (ru) |
| ZA (1) | ZA201807967B (ru) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10798921B2 (en) * | 2017-02-07 | 2020-10-13 | Zoetis Services Llc | Method for reducing pathogens in poultry hatchery operations |
| WO2019154493A1 (en) * | 2018-02-07 | 2019-08-15 | Seleggt Gmbh | Method for sampling an egg |
| EP3599465A1 (en) * | 2018-07-24 | 2020-01-29 | Tronico | Method for determining a specific characteristic of an embryo in an unhatched egg |
| US12105062B2 (en) * | 2018-09-05 | 2024-10-01 | Bae Systems Information And Electronic Systems Integration Inc. | Carbide-derived carbon for solid-phase micro extraction media |
| KR102150837B1 (ko) * | 2019-02-22 | 2020-09-03 | 고려대학교 산학협력단 | 소변의 대사체 분석을 위한 소변 샘플 처리 방법 |
| NL2023176B1 (en) | 2019-05-22 | 2020-12-01 | In Ovo B V | Composition comprising eggs and use of such composition |
| WO2021119588A1 (en) * | 2019-12-13 | 2021-06-17 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | A system and method for determining the sex and viability of poultry eggs prior to hatching |
| US12105071B2 (en) | 2019-12-18 | 2024-10-01 | Bae Systems Information And Electronic Systems Integration Inc. | Multi-element, ultra-low SWaP chemical pre-concentrator |
| DE102020000214A1 (de) * | 2020-01-15 | 2021-07-15 | Technische Hochschule Ostwestfalen-Lippe | Vorrichtung und Verfahren zur in-ovo Geschlechtsbestimmung bei einem befruchteten Vogelei |
| NL2024699B1 (en) | 2020-01-17 | 2021-10-13 | In Ovo Holding B V | Egg Characteristic Determining Device |
| NL2026004B1 (en) | 2020-07-05 | 2022-03-11 | In Ovo Holding B V | Egg Determining Method and Device |
| CN112986451B (zh) * | 2021-05-06 | 2022-05-17 | 湖南师范大学 | 一种基于风味特征的杂交鱼类肉品质评价方法 |
| DE102021127696B3 (de) | 2021-10-25 | 2023-03-09 | Technische Universität Dresden, Körperschaft des öffentlichen Rechts | Verfahren und Anordnung zur in-ovo Geschlechtsbestimmung von Vogeleiern |
| KR102632163B1 (ko) | 2022-04-13 | 2024-02-01 | 오보젠 주식회사 | 가금류 알(卵)의 암수 검사 및 선별장치 그리고 이를 이용한 선별방법 |
| CN114755357A (zh) * | 2022-04-14 | 2022-07-15 | 武汉迈特维尔生物科技有限公司 | 一种色谱质谱自动积分方法、系统、设备、介质 |
| CN115015461A (zh) * | 2022-06-13 | 2022-09-06 | 聊城大学 | 一种肉类挥发性风味物质的鉴别方法及其应用 |
| CN115047129B (zh) * | 2022-06-16 | 2023-07-04 | 贵州茅台酒股份有限公司 | 一种基于挥发性物质组成特征的高粱品种鉴别方法 |
| CN115808414A (zh) * | 2023-01-18 | 2023-03-17 | 苏州贝康医疗器械有限公司 | 一种无创评估胚胎发育质量的拉曼光谱分析方法及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998014781A1 (en) * | 1996-10-04 | 1998-04-09 | Embrex, Inc. | Method of sorting birds in ovo |
| WO2004016812A1 (en) * | 2002-08-14 | 2004-02-26 | Roslin Institute (Edinburgh) | Avian sex determination method |
| EP1543323A2 (en) * | 2002-09-04 | 2005-06-22 | Sidney James Reeves | Method and apparatus for determining the viability of eggs |
| WO2014021715A2 (en) * | 2012-07-30 | 2014-02-06 | Bruins Wouter Sebastiaan | Gender, viability and/or developmental stage determination of avian embryos in ovo |
| WO2014116833A2 (en) * | 2013-01-23 | 2014-07-31 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Compositions and methods for detecting neoplasia |
Family Cites Families (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5158038A (en) | 1990-06-06 | 1992-10-27 | Sheeks Oliver B | Egg injection method, apparatus and carrier solution for improving hatchability and disease control |
| WO1993014629A1 (en) | 1992-01-27 | 1993-08-05 | North Carolina State University | Gene transfer in birds by introduction of dna into muscle in ovo |
| GB9226179D0 (en) | 1992-12-16 | 1993-02-10 | British Tech Group | Method of hatching avian eggs |
| US6240877B1 (en) | 1997-01-27 | 2001-06-05 | Edward G. Bounds | Egg injection apparatus and method |
| US6029080A (en) * | 1997-07-09 | 2000-02-22 | Reynnells; Richard D. | Method and apparatus for avian pre-hatch sex determination |
| UY25347A1 (es) | 1998-01-12 | 1999-05-14 | Embrex Inc | Procedimiento de inyeccion multiple para el tratamiento de embriones aviarios in ovo, y aparato automatizado para la inyeccion in ovo. |
| US6286455B1 (en) | 1998-01-12 | 2001-09-11 | Embrex, Inc. | Automated in ovo injection apparatus |
| US6365339B1 (en) | 1998-09-04 | 2002-04-02 | Bechtel Bwxt Idaho, Llc | Gender determination of avian embryo |
| US6176199B1 (en) | 1998-10-20 | 2001-01-23 | Embrex, Inc. | Method for localizing allantoic fluid of avian eggs |
| US7041439B2 (en) * | 2001-04-17 | 2006-05-09 | Embrex, Inc. | Methods and apparatus for selectively processing eggs having identified characteristics |
| US6850316B2 (en) | 2002-06-10 | 2005-02-01 | Embrex, Inc. | Methods and apparatus for harvesting vaccine from eggs |
| JP2008541090A (ja) | 2005-05-11 | 2008-11-20 | エンブレクス，インコーポレイテッド | 蛍光顕微鏡検査を利用する競合的微粒子イムノアッセイ法 |
| US7418922B2 (en) | 2005-10-05 | 2008-09-02 | Embrex, Inc. | Methods for injecting and sampling material through avian egg membranes |
| GB0611669D0 (en) * | 2006-06-13 | 2006-07-19 | Astrazeneca Uk Ltd | Mass spectrometry biomarker assay |
| US7950349B1 (en) | 2008-01-18 | 2011-05-31 | Jack Dean Rollins | Avian egg fertility and gender detection |
| CN101285773B (zh) * | 2008-05-23 | 2010-04-14 | 浙江大学 | 混纺织物组分的拉曼光谱定性检测方法 |
| KR101090505B1 (ko) | 2008-12-30 | 2011-12-06 | 최은아 | 난담반을 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물 |
| RU2406371C1 (ru) | 2009-07-21 | 2010-12-20 | Государственное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт птицеперерабатывающей промышленности (ГУ ВНИИПП) | Способ получения яичного белкового продукта |
| DK2336751T3 (en) | 2009-12-16 | 2014-11-17 | Fraunhofer Ges Forschung | Method for determining the sex of the bird eggs |
| DE102010006161B3 (de) * | 2010-01-21 | 2011-01-13 | Technische Universität Dresden | Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung des Geschlechtes von befruchteten und nicht bebrüteten Vogeleiern |
| CN102210708A (zh) | 2010-04-01 | 2011-10-12 | 王莉娜 | 中药鸡蛋外敷疗法 |
| US8665433B2 (en) | 2010-08-17 | 2014-03-04 | Exelis Inc. | Standoff explosives detector using deep-UV Raman spectroscopy |
| JP5718033B2 (ja) | 2010-11-29 | 2015-05-13 | 株式会社Ｂｂｂジャパン | 有機肥料製造方法 |
| JP5291770B2 (ja) * | 2011-08-10 | 2013-09-18 | 東洋ゴム工業株式会社 | 防振ユニットの製造方法 |
| DE102013205426A1 (de) * | 2013-03-27 | 2014-10-16 | Siemens Aktiengesellschaft | Verfahren zum Bestimmen des Geschlechts eines Embryos in einem Ei |
| DE102014010150A1 (de) | 2014-07-04 | 2016-01-07 | Technische Universität Dresden | Verfahren und Vorrichtung zur Raman-spektroskopischen in-ovo Geschlechtsbestimmung von befruchteten und bebrüteten Vogeleiern |
| JP7062652B2 (ja) * | 2016-07-29 | 2022-05-06 | ノヴァトランス グループ ソシエテ アノニム | 鶏胚の卵内雌雄鑑別システムおよび方法 |
-
2017
- 2017-05-24 BR BR112018074071A patent/BR112018074071A8/pt unknown
- 2017-05-24 MX MX2018014484A patent/MX2018014484A/es unknown
- 2017-05-24 UA UAA201811754A patent/UA127784C2/uk unknown
- 2017-05-24 EP EP21163951.3A patent/EP3859341A3/en active Pending
- 2017-05-24 WO PCT/NL2017/050330 patent/WO2017204636A2/en unknown
- 2017-05-24 US US16/302,812 patent/US11686732B2/en active Active
- 2017-05-24 JP JP2018561609A patent/JP7320353B2/ja active Active
- 2017-05-24 HU HUE17740802A patent/HUE055153T2/hu unknown
- 2017-05-24 CA CA3025127A patent/CA3025127A1/en active Pending
- 2017-05-24 PL PL17740802T patent/PL3465222T3/pl unknown
- 2017-05-24 RU RU2018142577A patent/RU2756447C2/ru active
- 2017-05-24 AU AU2017269050A patent/AU2017269050B2/en active Active
- 2017-05-24 ES ES17740802T patent/ES2877368T3/es active Active
- 2017-05-24 DK DK17740802.8T patent/DK3465222T3/da active
- 2017-05-24 EP EP17740802.8A patent/EP3465222B1/en active Active
- 2017-05-24 CN CN201780046108.6A patent/CN109477840B/zh active Active
- 2017-05-24 PT PT177408028T patent/PT3465222T/pt unknown
- 2017-05-24 KR KR1020187037171A patent/KR102530639B1/ko active IP Right Grant
-
2018
- 2018-11-20 IL IL263138A patent/IL263138B2/en unknown
- 2018-11-23 MX MX2022001463A patent/MX2022001463A/es unknown
- 2018-11-26 ZA ZA2018/07967A patent/ZA201807967B/en unknown
-
2021
- 2021-06-23 HR HRP20210991TT patent/HRP20210991T8/hr unknown
-
2023
- 2023-05-12 US US18/196,537 patent/US20240003895A1/en active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998014781A1 (en) * | 1996-10-04 | 1998-04-09 | Embrex, Inc. | Method of sorting birds in ovo |
| WO2004016812A1 (en) * | 2002-08-14 | 2004-02-26 | Roslin Institute (Edinburgh) | Avian sex determination method |
| EP1543323A2 (en) * | 2002-09-04 | 2005-06-22 | Sidney James Reeves | Method and apparatus for determining the viability of eggs |
| WO2014021715A2 (en) * | 2012-07-30 | 2014-02-06 | Bruins Wouter Sebastiaan | Gender, viability and/or developmental stage determination of avian embryos in ovo |
| WO2014116833A2 (en) * | 2013-01-23 | 2014-07-31 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Compositions and methods for detecting neoplasia |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| FENG Y. et al. Analysis of metabolites in allantoic fluid of chicken embryo by 900 MHz NMR spectroscopy//Appl. Magn. Reason. - 2007. - V.31. - N.3. - P.257-268, p.261-263. * |
| FENG Y. et al. Analysis of metabolites in allantoic fluid of chicken embryo by 900 MHz NMR spectroscopy//Appl. Magn. Reason. - 2007. - V.31. - N.3. - P.257-268, p.261-263. Menn F. M. Ethionine// Encyclopedia of Toxicology - 2014. -V.2. - P.501-502. * |
| Menn F. M. Ethionine// Encyclopedia of Toxicology - 2014. -V.2. - P.501-502. * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2756447C2 (ru) | Способ и система для неразрушающего in ovo определения пола птицы | |
| US20210215663A1 (en) | Apparatus for analysis of eggs | |
| Rodrigues et al. | Proteomics in aquaculture: applications and trends | |
| Melis et al. | Addressing marketplace gilthead sea bream (Sparus aurata L.) differentiation by 1H NMR-based lipid fingerprinting | |
| Lulijwa et al. | Metabolomics in salmonid aquaculture research: Applications and future perspectives | |
| Jaiswal et al. | Proteomics in fish health and aquaculture productivity management: Status and future perspectives | |
| Aru et al. | The plasma metabolome of Atlantic salmon as studied by 1H NMR spectroscopy using standard operating procedures: effect of aquaculture location and growth stage | |
| Zhang et al. | UHPLC‐QTOF/MS‐based comparative metabolomics in pectoralis major of fast‐and slow‐growing chickens at market ages | |
| NL2016818B1 (en) | Method, system and food product for the in ovo gender, viability and/or developmental stage determination of embryos of oviparian species. | |
| NL2016819B1 (en) | Method and system for the non-destructive in ovo determination of fowl gender. | |
| Hu et al. | Non-Targeted Metabolomics Reveals the Metabolic Alterations in Response to Artificial Selective Breeding in the Fast-Growing Strains of Pacific Oyster | |
| Parmar | 1H Nuclear Magnetic Resonance-linked Metabolomics Investigations of Broiler Poultry and Human Saliva | |
| Murray et al. | the physiological effects of food | |
| NL2009255C2 (en) | Gender determination of avian embryos in ovo. | |
| Wei et al. | A Comparative Study on the Quality of Large Yellow Croaker (Larimichthys crocea) of Different Sizes Cultured in Different Cage Systems | |
| Ding et al. | Variaiton in the composition of small molecule compounds in the egg yolks of Asian Short-toed Larks between early and late broods | |
| Kjørsvik et al. | Functional development of ballan wrasse & effects of start feed quality | |
| NL2009256C2 (en) | Age determination of avian embryos in ovo. | |
| Doherty | Advancing Technologies for Spatial and Temporal Proteomics |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HZ9A | Changing address for correspondence with an applicant |