ES2877368T3 - Método y sistema para la determinación in ovo no destructiva del género de las aves - Google Patents

Abstract

Método de identificación de forma no destructiva una característica de un embrión de Gallus Gallus domesticus in ovo, comprendiendo el método: (a) obtener una muestra de material asociado con un huevo que comprende el embrión, y (b) medir un valor de puntuación para la presencia de, y concentración de al menos un primer biomarcador en la muestra indicativo de la característica del embrión, y (c) aplicar un umbral al valor de puntuación y la concentración obtenidos en (b) para identificar la característica del embrión asociada con la presencia y concentración del primer biomarcador, en el que el primer biomarcador comprende un compuesto amino que tiene un peso molecular en el intervalo desde 150 a 170 g/mol; en el que la etapa (c) comprende además: (i) correlacionar cada señal de biomarcador relevante con un biomarcador de referencia haciendo coincidir el espectro de cada señal de correlación con el espectro esperado del biomarcador de referencia correlacionado usando una medida de similitud, para definir al menos una señal de correlación positiva; (ii) medir la intensidad de cada señal de correlación positiva y puntuar su intensidad de señal absoluta y/o relativa; y (iii) aplicar un umbral al valor de puntuación obtenido de una función de similitud para determinar la característica del embrión correlacionada; en el que el primer biomarcador es el ácido 3-[(2-aminoetil) sulfanil]butanoico, y una concentración del primer biomarcador en una cantidad de 50 ng/ml o más en el fluido alantoideo del embrión en el día 7, 8 o 9 se correlaciona con un embrión femenino, mientras que la presencia del primer biomarcador presente en menos de 50 ng/ml se correlaciona con un embrión masculino.

Description

DESCRIPCIÓN

Método y sistema para la determinación in ovo no destructiva del género de las aves

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la determinación no destructiva in ovo del género de una especie de ovíparo, particularmente de una especie de ave, más particularmente de la especie Gallus Gallus. El presente procedimiento se relaciona además con la selección de huevos masculinos y huevos femeninos, y con la producción de grupos de animales vivos usando estos huevos seleccionados.

Los animales ovíparos ponen huevos, con poco o ningún otro desarrollo embrionario dentro de la madre. El cultivo de animales ovíparos y sus huevos abastece a una parte cada vez mayor del suministro mundial de proteínas, así como a otros procesos industriales a gran escala, tales como la producción de vacunas. En la actualidad, los procesos más importantes para el cultivo de animales ovíparos incluyen la cría de especies aviares, tales como las aves de corral, y la acuicultura, esto es, el cultivo de organismos acuáticos tales como peces, crustáceos y moluscos. En particular, las aves de corral, más específicamente ave de la selva roja red, esto es, de la especie Gallus Gallus Domesticus, son, con mucho, las especies de ovíparos más criadas en el mundo.

Antecedentes de la invención

Los huevos de gallina fertilizados tienden a producir una distribución aproximadamente igual de animales masculinos y femeninos. Sin embargo, por diversas razones, en el manejo de los criaderos, puede ser deseable separar a los animales basándose en diversas características, en particular el género. En la producción comercial de pollos y huevos domésticos, por ejemplo, la incubación y cría de pollos masculinos es altamente indeseable, lo que lleva al sacrificio de miles de millones de pollos masculinos cada año.

Actualmente, en ambos casos, las poblaciones mixtas de pollitos eclosionados se someten a sexado mediante evaluación visual del animal juvenil, a veces incluso de la población adulta en los casos en que los juveniles no tengan rasgos apropiados. En cualquier caso, este es un procedimiento que consume mucho tiempo, requiere operadores altamente capacitados y, por lo general, es muy estresante para los animales.

Además, para la producción comercial de huevos, la incubación y cría de pollos masculinos es muy indeseable, lo que conduce al sacrificio de miles de millones de pollos masculinos cada año. Adicionalmente, hay un porcentaje de huevos que no están fertilizados o no comprenden un embrión viable al comienzo del período de incubación, lo que reduce en gran medida la capacidad de las incubadoras en los criaderos.

Además, cuando se sexan animales adultos, es necesario criar todas las poblaciones hasta una edad mínima, mientras que solo la mitad de los animales criados de este modo se usan para la proliferación después de la separación. Se pueden producir problemas adicionales cuando la presencia de por ejemplo, una población masculina puede conducir a una reducción de la productividad debido, por ejemplo, a canibalismo y reducción de la densidad de la explotación.

Adicionalmente, existe un porcentaje de huevos sin fertilizar o que no comprenden un embrión viable al comienzo del período de incubación, lo que reduce en gran medida la capacidad de las incubadoras empleadas en los criaderos, en particular para huevos de aves de corral.

Como resultado, se requiere una capacidad de incubación que sea al menos dos veces mayor de lo necesario si estuviera disponible una selección de género temprana, permitiendo la selección de embriones principalmente sólo masculinos o femeninos.

De acuerdo con lo anterior, sería de gran valor para el medio ambiente, por la reducción de la cantidad de energía y otros recursos requeridos, pero igualmente para la eliminación de animales innecesarios mediante el sacrificio, así como la reducción del estrés para los animales recién eclosionados, si se dispuso de un método de etapa temprana que permitiera determinar el género de los embriones de aves antes de la fase de incubación, permitiendo también incrementar fuertemente la capacidad de los criaderos. Un beneficio adicional sería si el método también permitiera seleccionar embriones viables sobre huevos no fertilizados y/o de otro modo no viables, aumentando aún más la eficiencia del procedimiento de eclosión.

Hay diversos métodos descritos en la bibliografía relacionados con la determinación del género de un embrión de ave mediante la detección de ciertos metabolitos en los huevos, por ejemplo, a través de espectroscopía de RMN, por ejemplo, Y. Feng et al., Appl. Magn. Reson. (2007), 32,257-268; por análisis de HPLC, véase Gu D.-C. et al., Chinese Journal of Animal Science, Vol. 7, 23-25), y mediante el uso de moléculas diana de unión específicas de biomarcadores que permiten la microscopía de fluorescencia cuantitativa, véase, por ejemplo, el documento WO2006/124456 para la determinación de la presencia de un compuesto esteroide estrogénico como marcador. En general, se observa que los esteroides son moléculas bastante grandes, que no se volatilizan fácilmente.

Una desventaja de la mayoría de los métodos mencionados anteriormente en este documento es que no pueden permitir la determinación no destructiva del género de un pollo, ya que se requieren mayores cantidades de metabolitos que pueden no permitir que un embrión subsista y se desarrolle completamente una vez se ha tomado una muestra. Además, los métodos requieren el uso de equipo que por lo general no se emplea en una granja de pollos debido al coste o la complejidad, y mucho menos que ofrezca un rendimiento apropiado para la cría comercial de pollos.

El documento WO2014/021715 describe un procedimiento para la determinación no destructiva del género, la fase de desarrollo y/o la viabilidad de un embrión de ave en un huevo, que comprende (a) detectar al menos un primer compuesto marcador del desarrollo seleccionado entre azúcares y/o aminoácidos, precursores y metabolitos de los mismos en un huevo en un período de tiempo desde el comienzo de la incubación del huevo hasta la eclosión; (b) medir la cantidad de al menos el primer compuesto marcador del desarrollo detectado, y (c) comparar la cantidad con una línea de base establecida para masculinos y femeninos, la fase de desarrollo del embrión y/o el embrión vivo y fallecido o no desarrollado, para determinar si el embrión es viable, masculino o femenino, y/o la fase de desarrollo del

embrión. Si bien el método descrito es muy útil para la determinación del género, la edad y la fase de desarrollo del embrión, requiere cantidades relativamente grandes de muestras debido a la baja sensibilidad de algunos de los métodos de medición cuantitativa. Además, algunos de los métodos automatizados son difíciles de implementar en un procedimiento de eclosión continuo en tiempo real, por ejemplo, usando métodos de resonancia nuclear o métodos de resonancia espectral, incluida la espectroscopia Raman. Otros métodos, aunque rápidos, requieren la presencia de equipos relativamente costosos y/o el uso de productos químicos especiales tales como marcadores de fluorescencia para moléculas de biomarcadores específicos.

El documento WO9814781 describe un método de determinación del género de un ave in ovo detectando un nivel elevado de una hormona relacionada con el sexo en el líquido extraembrionario del huevo de ave.

El documento WO2004016812) describe un método de determinación del sexo de un sujeto aviar, usando una sonda de ácido nucleico.

El documento WO2016000678) describe un método de determinación espectroscópica in ovo del sexo de huevos de aves fertilizados e incubados. Por tanto sigue existiendo la necesidad de un método más rápido y sensible para la determinación no destructiva del género, así como de la fase de desarrollo y/o viabilidad de un embrión animal ovíparo in ovo.

Sumario de la invención

Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un método de identificación de forma no destructiva una característica de un embrión de Gallus Gallus domesticus in ovo, comprendiendo el método:

(a) obtener una muestra de material asociado con un huevo que comprende el embrión, y

(b) medir un valor de puntuación para la presencia y concentración de al menos un primer biomarcador en la muestra indicativo de la característica del embrión, y

(c) aplicar un umbral al valor de puntuación y la concentración obtenidos en (b) para identificar la característica del embrión asociada con la presencia y concentración del primer biomarcador, en el que el primer biomarcador comprende un compuesto amino que tiene un peso molecular en el intervalo desde 150 a 170 g/mol; en el que la etapa (c) comprende además:

(i) correlacionar cada señal de biomarcador relevante con un biomarcador de referencia haciendo coincidir el espectro de cada señal de correlación con el espectro esperado del biomarcador de referencia correlacionado usando una medida de similitud, para definir al menos una señal de correlación positiva;

(ii) medir la intensidad de cada señal de correlación positiva y puntuar su intensidad de señal absoluta y/o relativa; y

(iii) aplicar un umbral al valor de puntuación obtenido de una función de similitud para determinar la característica del embrión correlacionada;

en el que el primer biomarcador es el ácido 3-[(2-amino-etil)-sulfanil]-butanoico, y una concentración del primer biomarcador en una cantidad de 50 ng/ml o más en el fluido alantoideo del embrión el día 7, 8 o 9 se correlaciona con un embrión femenino, mientras que la presencia del primer biomarcador presente en menos de 50 ng/ml se correlaciona con un embrión masculino.

En otro aspecto más, se proporciona un procedimiento para la incubación selectiva de crías de una especie de ovíparo con una característica específica, que comprende

a. proporcionar una multitud de huevos de la especie, y

b. someter los huevos al método de la invención para determinar una característica del embrión, y

c. seleccionar los huevos con la característica deseada para formar una multitud seleccionada de huevos, y d. incubar los huevos seleccionados hasta que eclosionen una o más crías.

Breve descripción de las figuras

La presente invención se describe ahora más completamente a continuación con referencia a los dibujos adjuntos, en los que se muestra una realización preferida de la invención. Sin embargo, esta invención se puede realizar de muchas formas diferentes y no se debe interpretar como limitada a las realizaciones expuestas en este documento; más bien, estas realizaciones se proporcionan para que esta divulgación sea minuciosa y completa, y transmita completamente el alcance de la invención a los expertos en la técnica.

La figura 1 representa A) Modelo de clasificación de regresión logística en una característica única, siendo la concentración del ácido 3-[(2-aminoetil)sulfanil]butanoico, con una precisión de más del 90 % para la predicción de género; y B) Regresión logística en 2 características: al aplicar un modelo de regresión logística en dos biomarcadores, la precisión podría aumentarse a > 95 % de precisión desde el día 10.

La figura 2 muestra un espectro LDPD del biomarcador según la invención en una prueba en serie, prueba automatizada de alto rendimiento. El método permite no solo medir la presencia del biomarcador, sino también la concentración absoluta, en menos de 10 segundos por muestra individual.

La figura 3 muestra cromatogramas de compuestos con diversos picos de masa que varían desde 220 a 145, extraídos a los 850 segundos de muestras masculinas (color gris oscuro) y femeninas (color gris claro).

Descripción detallada de la invención

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. La terminología usada en la descripción de la invención en este documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente y no pretende ser limitante de la invención.

Los términos "aviar" y "ave" como se usan en este documento, incluyen masculinos o femeninos de cualquier especie de ave, pero están destinados principalmente a abarcar aves de corral que se crían comercialmente para obtener huevos o carne. De acuerdo con lo anterior, los términos "ave" y "aviar" están destinados particularmente a abarcar aves de la selva rojas y grises, pollos, pavos, patos, gansos, codornices, palomas, avestruces, emúes y faisanes.

El término "incubación" en este documento se refiere al procedimiento mediante el cual las aves eclosionan sus huevos y al desarrollo del embrión dentro del huevo después de abandonar el tracto de la gallina. El período de incubación en este documento se refiere al tiempo ininterrumpido durante el cual un huevo en particular se somete a condiciones que emulan la incubación hasta la eclosión, esto es, la emergencia de las aves, incluyendo cualquier manipulación o transferencia desde por ejemplo, una incubadora a una unidad de cría, siempre que el desarrollo de un ave no se detenga.

El término "in ovo" como se usa en este documento, se refiere a embriones contenidos dentro de un huevo antes de la eclosión. La presente invención se puede poner en práctica con cualquier tipo de ave, incluyendo, pero no limitando a, huevos de gallina (domesticada), pavo, pato, ganso, codorniz y faisán.

Los términos "inyección" e "inyectar" en este documento abarcan métodos de inserción de un dispositivo (por lo general un dispositivo alargado) en un óvulo o embrión, incluidos métodos de administración o de descarga una sustancia en un huevo o embrión, métodos de extracción de una sustancia (esto es, una muestra) de un huevo o embrión, y/o métodos de inserción de un dispositivo detector en un huevo o embrión.

El término "espectrometría de masas" en este documento se refiere a una técnica analítica que clasifica los iones en base a su masa. La espectrometría de masas se usa por lo general para análisis químicos en muchas situaciones y podría aplicarse a cualquier muestra, desde una mezcla compleja de petróleo hasta los productos de la ingeniería genética. En términos simples, un espectro de masas dará una imagen de la composición química exacta de una muestra.

La presente solicitud, en un primer aspecto, se refiere a la determinación de uno o más compuestos amino que tienen un peso molecular en el intervalo desde 140 a 190 g/mol, preferiblemente desde 150 a 170 g/mol.

Los solicitantes descubrieron sorprendentemente que un metabolito específico, un isómero estructural de etionina, es indicativo de si un embrión se convertirá en una cría masculina o femenina. Preferiblemente, el compuesto biomarcador es de fórmula R3SCR1HCR2HCOOH (I), en el que preferiblemente, R1 representa CH3, H, NH2, R2 representa CH3, H, NH2 y R3 representa -(CH2)2-NH2, o isómeros estructurales de los mismos. Más preferiblemente, el compuesto biomarcador es de fórmula C6H13NO2S. Más preferiblemente, se puede seleccionar ventajosamente de aminoácidos tales como ácido 2-amino-4-tilsulfanilbutanoico (también denominado etionina), o isómeros estructurales del mismo, que incluyen, pero no se limitan a, 4-(metilsulfanil)isovalina, 4-(metilsulfanil)isovalina (también conocida como ácido 2-amino-2-metil-4-(metilsulfanil)butanoico), N- o isopropilcisteína, 3-(Metil-sulfanil) valina, 4-(Metilsulfanil) valina, 3-Metil-3-sulfanilisovalina, 4-(metilsulfanil) isovalina, ácido 2-amino-3-metil-4-metilsulfanil-butírico, 5(metilsulfanil)norvalina, ácido 2-amino-3-metil-3-sulfanilpentanoico, metil 3-sulfanil-valinato, metilsulfonio metionina, N-metil-D-metionina; ácido 5-amino-6-sulfanilhexanoico o similares; a partir de ésteres de aminoácidos tales como 2-amino-4-metilsulfanil) butanoato de metilo (también conocido como metioninato de metilo), o isómeros estructurales de los mismos, tales como metilcisteinato de etilo, cisteinato de isopropilo, cisteinato de N-propilo o compuestos relacionados tales como 2-[(2-hidroxietil)sulfanil]-N-metilpropanamida; homocisteinato de etilo, 2-isopropil-1,2-tiazolidina 1,1 -dióxido, 1-amino-2,2-dietoxietano-1-tiona,

3-[(2-hidroxietil)sulfanil]-N-metilpropanamida, 2-amino-3-sulfanilpropanoato de propilo, ácido 2-(metilamino)-4-(metilsulfanil)butanoico, ácido 2-[(2-aminoetil)sulfanil]-2-metilpropanoico, ácido 3-[(2-aminoetil) sulfanil]-2-metilpropanoico, ácido 3-[(2-aminoetil) sulfanil]butanoico, ácido 4-[(2-aminoetil) sulfanil] butanoico, ácido 2-amino-3-(propilsulfanil)propanoico, ácido 2-amino-3-(propan-2-ilsulfanil) propanoico y ácido 3-[(2-aminoetil)sulfanil]butanoico. Los compuestos o isómeros pueden ser racémicos o pueden comprender enantiómeros o estereoisómeros en proporciones y cantidades apropiadas.

Preferiblemente, el compuesto tiene la fórmula molecular C6H13NO2S y una masa monoisotópica Mw de 163.0690. En la actualidad, parece estar identificado como (ácido 3-[(2-aminoetil)sulfanil]butanoico), que tiene la estructura según la fórmula general I:

Los solicitantes encontraron que la concentración del compuesto (I), o de un isómero estructural, que se puede considerar como un aminoácido no proteinogénico, en el fluido alantoideo durante el período de incubación puede usarse ventajosamente para determinar el sexo del embrión en el huevo, con una certeza muy alta. Como beneficio adicional, este biomarcador es comparativamente fácil de extraer y/o volatilizar y, por tanto, se puede analizar con relativa facilidad en comparación con, por ejemplo, compuestos esteroides.

La etapa (a) comprende obtener una muestra de material asociado con un huevo que comprende el embrión.

Se pueden usar métodos y aparatos según las realizaciones de la presente invención para identificar una o más características de un huevo en cualquier momento durante el período de desarrollo embrionario, también denominado período de incubación del mismo. Las realizaciones de la presente invención no se limitan a un día particular durante el período de desarrollo embrionario.

El procedimiento según la presente invención comprende preferiblemente (a1) proporcionar una muestra que comprende un fluido de huevo; y (a2) adquirir el espectro de la muestra. La etapa opcional (a3) elimina preferiblemente la turbidez de las muestras, mediante un método apropiado tal como ultrafiltración o centrifugación. Como se indicó anteriormente, si bien los métodos invasivos permiten tomar una muestra directamente y someter el fluido muestreado a un análisis, preferiblemente el análisis se realiza de manera no invasiva debido a la eficiencia de tal método de análisis y al hecho de que la cáscara del huevo y sus membranas permanecen imperforadas. Puede emplearse cualquier método apropiado para realizar tal análisis no invasivo.

Cuando se va a emplear un método no invasivo, el término "fluido" en este documento se puede referir a compuestos volátiles que se pueden eliminar del huevo sin perforar la cáscara del huevo. Esto se puede realizar de manera ventajosa colocando un huevo en una cámara de detección, opcionalmente bajo una ligera depresión, y sometiendo los compuestos volátiles liberados a un método de identificación y cuantificación apropiado. En este caso, se pueden aplicar los métodos espectroscópicos de masas (MS) antes citados, incluido el uso de un espectrómetro de movilidad iónica (IMS).

Si el análisis se realiza de forma invasiva, esto por lo general incluye la extracción de una muestra de material de huevo. La muestra se toma preferiblemente de un líquido embrionario, preferiblemente del fluido alantoideo en el caso de las especies de aves, ya que es menos probable que esto dañe al embrión. El fluido alantoideo por lo general es un medio excretor para los metabolitos nitrogenados de un embrión de ave.

Los métodos y aparatos apropiados para la penetración de huevos y muestreo invasivo de material de huevo se describen, por ejemplo, en los documentos US-A- 20070137577, WOA-00/22921 o WO-A-99/34667. La muestra tomada de este modo se somete entonces preferiblemente a un protocolo apropiado para permitir la detección de los marcadores del desarrollo y un análisis de las cantidades relativas y/o absolutas de los marcadores del desarrollo presentes.

El fluido alantoideo comienza a formarse alrededor del día 3 de incubación, como se describe Hamburger, V and Hamilton, HL (1951). "A series of normal stages in the development of the chick embryo". Journal of Morphology 88 (1): 49-92. En este documento se indica que la alantoides era distinguible a las 65 horas después de la incubación, como una bolsa corta de paredes gruesas; aún no vesicular. Después de 72 horas, la alantoides era vesicular, de tamaño variable; en el promedio del tamaño del mesencéfalo, lo que indica que la alantoides y el fluido alantoideo están presentes a partir del día 3. Como resultado, el presente método se puede aplicar a partir del día 3 si se va a examinar el fluido alantoideo.

La alantoides alcanza un volumen máximo alrededor del día 13 de incubación y luego disminuye de volumen a medida que continúa la incubación debido a la pérdida de humedad y la reabsorción de fluidos, pero todavía está presente en volúmenes significativos el día 18 de incubación.

El fluido alantoideo está separado de la cáscara del huevo por las membranas de la cáscara interior y exterior y las membranas corioalantoideas. Aunque el fluido alantoideo abarca toda la periferia de un óvulo embrionado, el fluido alantoideo por lo general se acumula en la parte superior del huevo directamente debajo de las membranas que recubren la célula de aire.

La acumulación de fluido alantoideo en la parte superior del huevo se debe a la gravedad y al desplazamiento del embrión denso y el saco vitelino. Intentar muestrear con precisión el fluido alantoideo a través de la parte superior de un huevo mientras el huevo está en posición vertical puede ser difícil debido a la variabilidad del espacio de aire de un huevo a otro. La gravedad se puede usar para acumular el fluido alantoideo en un sitio localizado. Cuando un huevo se gira sobre su eje longitudinal, el fluido alantoideo se acumulará en la parte superior del huevo, directamente debajo de la cáscara. La puesta del huevo sobre su eje longitudinal hace que el fluido alantoideo sea útil para la extracción de una muestra.

La extracción de material, tales como fluido alantoideo, de los huevos se puede realizar de diversas formas, incluida la penetración de la cáscara del huevo y la inserción de una cánula de muestreo a través de las membranas. A continuación, se puede recuperar una muestra del fluido que se va a tomar como muestra, mientras que la membrana y/o la carcasa se sella activamente con un sellador apropiado, o se deja sellar por sí misma.

Como se indicó anteriormente, se puede emplear cualquier método apropiado para realizar un análisis no invasivo. En una realización preferida diferente del presente, el método no invasivo puede implicar la microextracción en fase sólida (SPME), junto con un aparato analítico apropiado. SMPE se refiere a una técnica de muestreo de extracción en fase sólida que implica el uso de una fibra recubierta con una fase de extracción, que puede ser líquida (polímero) o sólida (sorbente), que extrae diferentes tipos de analitos (incluyendo tanto volátiles como no volátiles) de diferentes tipos de medios, que pueden estar en fase líquida o gaseosa. La cantidad de analitos extraídos por la fibra es proporcional a su concentración en la muestra siempre que se alcance el equilibrio o, en caso de preequilibrio breve, con ayuda de convección o agitación. Esto se puede acoplar preferiblemente con un IMS, de modo que los volátiles se puedan medir directamente.

Aunque varias publicaciones han descrito en general el uso de métodos no invasivos, por ejemplo, los documentos US-A-2011/144473 y US-A-7950349, estas publicaciones describen sólo vagamente los espectros de emisión generales; que en la práctica no permiten seleccionar el género de un embrión. El presente procedimiento se diferencia en particular de los métodos descritos en que se determina la presencia de componentes específicos en el huevo, lo cual se puede realizar ventajosamente usando espectros de derivados secundarios que permitan buscar selectivamente las cantidades absolutas y relativas de uno o más compuestos marcadores de desarrollo.

Los huevos que comprenden embriones masculinos y femeninos presentan diferencias en la composición química a nivel molecular. A nivel macroscópico, los embriones también muestran diferencias de tamaño, forma y morfología celular.

El presente procedimiento permite ventajosamente determinar el género de un embrión. Preferiblemente, la determinación se realiza en un período desde 1 a 15 días, más preferiblemente desde 2 a 14, aún más preferiblemente desde 3 a 13, e incluso más preferiblemente desde 4 a 12 días después del inicio de la incubación, tal como realizando la etapa a) preferiblemente en un período de tiempo desde 6 a 12 días después del comienzo de la incubación del huevo.

Esto permite evitar los costes implicados en la incubación de huevos que no son viables y/o no tienen el género deseado. Adicionalmente, se puede determinar la fase de desarrollo real de un huevo. Para las especies con tiempos de incubación más cortos o más largos que los de los pollos domesticados, se pueden aplicar otros períodos, según convenga.

La muestra puede ser cualquier sustancia biológica de interés, pero ventajosamente es un tejido biológico y preferiblemente un fluido biológico tal como sangre o plasma.

La etapa (b) comprende medir un valor de puntuación para la presencia y concentración de al menos un primer biomarcador en la muestra indicativo de la característica del embrión.

El método de la invención se basa en la correlación de señales de masa observadas con masas de referencia y espectros de biomarcadores conocidos. Los datos de referencia se almacenan preferiblemente en un servidor informático, lo que permite realizar todo el procedimiento bajo control informático. Las señales se correlacionan con los patrones de referencia por comparación, por ejemplo, usando funciones computacionales como se describe en este documento.

Preferiblemente, las señales se caracterizan como "positivas" o "negativas" según se alcance un nivel umbral de similitud; las señales que son negativas y no alcanzan el nivel umbral de similitud se descartan en el procedimiento, mientras que las señales que son positivas se emparejan con biomarcadores y dan como resultado un diagnóstico de la presencia de dichos biomarcadores en una muestra biológica.

En el caso de implementación con patrones, la puntuación de las señales de biomarcadores puede calcularse mediante la proporción entre la señal del biomarcador presente en la muestra y el estándar interno agregado a la muestra. Se pueden analizar múltiples biomarcadores de la misma manera dando como resultado un factor de puntuación final.

Preferiblemente, se agregan uno o más patrones internos de biomarcadores de referencia marcados con una etiqueta atómica a la muestra antes del análisis por espectrometría de masas. Esto permite determinar y puntuar la intensidad absoluta de la señal midiendo la intensidad de la señal del biomarcador y comparándola con la intensidad de la señal de uno o más patrones internos conocidos. Tales patrones pueden, por ejemplo, estar marcados con un isótopo, lo que hace que la lectura del ensayo sea muy precisa en términos de cuantificación absoluta y también ventajosa. Las secuencias de calibración integradas dentro del cribado permitirán la medición de niveles absolutos de biomarcadores en una muestra.

El método de la invención se puede implementar preferiblemente de dos formas; usando patrones internos para proporcionar una referencia para cuantificar la intensidad de la señal, y sin tales patrones. De este modo, en una realización, se agregan uno o más patrones internos a la muestra antes del análisis por espectrometría de masas. Preferiblemente, los patrones internos están etiquetados. De manera ventajosa, la intensidad de la señal absoluta para cada señal de biomarcador luego se puede puntuar midiendo la intensidad de la señal de biomarcador y comparándola con la intensidad de señal de uno o más patrones internos conocidos. En la implementación alternativa, la muestra se procesa sin la adición de patrones internos. En dicha realización, la intensidad de la señal relativa se puntúa midiendo la proporción entre las intensidades de la señal del biomarcador individual en una muestra y la intensidad de la señal de referencia para un grupo de muestras.

Preferiblemente, una característica seleccionada puede ser la viabilidad o no viabilidad probable de un embrión para lograr el crecimiento completo hasta la eclosión. Otra característica seleccionada preferida es un pronóstico para la probable fase de desarrollo y el tiempo requerido para que el embrión progrese hasta la eclosión en condiciones de incubación. Preferiblemente, el método comprende aplicar uno o más de un método de formación de imágenes por resonancia magnética; un método de resonancia espectral; un método cromatográfico analítico junto con uno o más detectores apropiados; espectroscopia de fluorescencia; y/o métodos de ensayo que comprenden reactivos selectivos de biomarcadores.

La identificación y cuantificación de uno o más biomarcadores se puede realizar mediante cualquier método apropiado. Ventajosamente, esto se puede realizar mediante un método de formación de imágenes por resonancia magnética que incluye métodos de resonancia nuclear; métodos de resonancia espectral que incluyen espectroscopía UV/VIS, infrarroja o Raman; métodos analíticos tales como GC o HPLC junto con detectores apropiados; espectroscopia de fluorescencia; ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas, incluidos métodos húmedos y secos, tales como el método de tira reactiva; y el uso de aptámeros selectivos adecuadamente preparados o reactivos selectivos similares.

Por lo general, también se pueden emplear métodos cuantitativos de resonancia espectral que incluyen espectroscopía infrarroja o Raman, preferiblemente usando espectros secundarios para la determinación de la presencia y cantidades absolutas y/o relativas de marcadores de desarrollo presentes en un huevo. Si bien varias publicaciones han descrito el uso de métodos no invasivos, por ejemplo, los documentos US-A-2011/144473 y US-A-7950349, estas publicaciones solo describen vagamente los espectros de emisión generales; que en la práctica no permiten seleccionar la fase de desarrollo la viabilidad y/o el género de un embrión. El presente procedimiento se diferencia en particular de los métodos descritos en que se determina la presencia de componentes específicos en el huevo, lo cual se puede realizar ventajosamente usando espectros de derivados secundarios que permitan buscar selectivamente las cantidades absolutas y relativas de uno o más compuestos marcadores de desarrollo. En particular, la espectroscopia infrarroja de transformada de Fourier diferencial secundaria derivada (FTIR) y FT-Raman, o una combinación de las mismas, se pueden emplear ventajosamente para lograr la precisión y repetibilidad necesarias, mientras que los métodos de resonancia magnética nuclear se pueden emplear adecuadamente para determinar la naturaleza de los marcadores de desarrollo, y para establecer una línea base para calibrar el sistema. El presente procedimiento permite de manera ventajosa determinar la viabilidad y/o género de un embrión y/o preferiblemente las etapas de desarrollo desde el inicio de la incubación del huevo hasta la eclosión. En una realización preferida, la muestra se puede analizar mediante cualquier método espectrofotométrico de masas apropiado para detectar y adquirir un espectro que identifique y cuantifique la cantidad absoluta y relativa de biomarcadores presentes en la muestra. Preferiblemente, la muestra se puede analizar mediante un método que permita el análisis en tiempo real en menos de 20 segundos, más preferiblemente menos de 15 segundos por muestra,

Los ejemplos incluyen la infusión directa usando principios de nanoelectropulverización estática, análisis de inyección de flujo o inyección de flujo con enriquecimiento de la muestra. Preferiblemente, el análisis de espectrometría de masas comprende espectrometría de masas de ionización por electropulverización (ESI), espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz - tiempo de vuelo (MALDI-TOF) o espectrometría de masas por ionización por desorción láser mejorada de superficie - tiempo de vuelo (SELDI-TOF). El espectrómetro de masas funciona preferiblemente en modo tándem y/o de estudio.

Ventajosamente, la muestra se puede procesar antes del análisis espectroscópico de masas, de manera que el procesamiento de la muestra comprende la separación de la muestra mediante extracción en fase sólida (SPE), cromatografía de gases, cromatografía líquida de alta presión mono- o multifásica (HPLC).

Alternativamente, si los compuestos biomarcadores se pueden medir externamente, se puede realizar un análisis directo, no invasivo a través de mediciones directas no invasivas en huevos enteros, usando por ejemplo la tecnología IMS expuesta anteriormente.

Los métodos preferidos para la caracterización espectrométrica de masas de biomarcadores incluyen ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI) e ionización por electropulverización (ESI). Cualquiera puede combinarse ventajosamente con tiempo de vuelo (TOF) u otros tipos de sensores espectrométricos de masas para determinar la masa y/o el patrón de fragmentación de un biomarcador. Preferiblemente, la espectrometría de masas se puede emplear junto con técnicas cromatográficas y otras técnicas de separación en este documento. MALDI opera pulsando una muestra con láseres. Este tratamiento vaporiza e ioniza la muestra. A continuación, se determinan los pesos moleculares (masas) de los iones cargados en un analizador TOF. En este dispositivo, un campo eléctrico acelera las moléculas cargadas hacia un detector, y las diferencias en el lapso del tiempo que tardan los fragmentos ionizados en llegar al detector, esto es, su tiempo de vuelo, para revelar los pesos moleculares de los biomarcadores, por lo que los compuestos más pequeños llegan antes al detector. Este método genera perfiles de masa de la muestra, esto es, perfiles de pesos moleculares y cantidades de compuestos en la mezcla. Estos perfiles pueden usarse luego para identificar biomarcadores conocidos a partir de bases de datos de biomarcadores.

Con una interfaz ESI-MS para cromatografía líquida (LC/MS/MS), los compuestos eluyentes de la columna LC se introducen en la fuente de iones del espectrómetro de masas. Se aplica voltaje a una aguja fina. Luego, la aguja pulveriza gotitas en un analizador espectrométrico de masas donde las gotitas se evaporan y se liberan iones biomarcadores correspondientes a una variedad de estados de carga que están fragmentados y desde donde se puede determinar la composición. Alternativamente, SPE (extracción en fase sólida) o cromatografía de gases se pueden acoplar al espectrómetro de masas.

En particular, se encontró que SPE/MS/MS era útil para la aplicación industrial automatizada y de alto rendimiento del presente método, tal como usar un aparato Agilent Rapidfire MS (Rapidfire es una marca comercial registrada de Agilent Inc.); un Phytronics. La fuente de iones LDTD (desorción térmica por diodo láser) (LDTD es una marca comercial registrada de Phytronics Inc.).

Se descubrió que otro aparato útil usa un espectrómetro de movilidad iónica (IMS) calibrado, en base a las movilidades en fase gaseosa de los iones en un campo eléctrico. En este documento, los iones de una sustancia generada por descarga parcial, lámpara UV o una fuente de 63Ni dentro de una llamada cámara de ionización se separan entre sí en su camino a través de un tubo de deriva según su masa molecular y/o estructura geométrica. A continuación, el aparato mide los tiempos de deriva característicos de los iones a través de este tubo, lo que permite una rápida detección, identificación y cuantificación de la sustancia, con una sensibilidad extremadamente alta, y en pocos segundos por muestra.

Preferiblemente, el análisis de espectrometría de masas comprende espectroscopía de masas de ionización por electropulverización (ESI), espectroscopía de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz - tiempo de vuelo (MALDI-TOF) o espectroscopía de masas por desorción láser mejorada de superficie - tiempo de vuelo (SELDITOF), SPE/MS/MS, fuente de iones LDTD (desorción térmica por diodo láser), y/o uso de un sensor de movilidad de iones (IMS).

El sistema de espectrómetro de masas es preferiblemente una MS de ionización por electropulverización (ESI), MS de ionización de desorción láser asistida por matriz - de tiempo de vuelo (MALDI-TOF) o MS de ionización de desorción de láser mejorada en superficie - tiempo de vuelo (SELDI-TOF), o MS de desorción por ionización por diodo láser (LDID). En particular, se encontró que SPE/MS/MS era útil para una aplicación industrial automatizada y de alto rendimiento del presente método, tal como el uso de un aparato MS Agilent Rapidfire (Rapidfire es una marca comercial registrada de Agilent Inc.); un Phytronics La fuente de iones LDTD (desorción térmica por diodo láser) (LDTD es una marca comercial registrada de Phytronics Inc.).

Se descubrió que otro aparato útil usa un espectrómetro de movilidad iónica (IMS) calibrado, en base a las movilidades en fase gaseosa de los iones en un campo eléctrico. En este documento, los iones de una sustancia generada por descarga parcial, lámpara UV o una fuente de 63Ni dentro de una llamada cámara de ionización se separan entre sí en su camino a través de un tubo de deriva según su masa molecular y/o estructura geométrica. A continuación, el aparato mide los tiempos de deriva característicos de los iones a través de este tubo, lo que permite una rápida detección, identificación y cuantificación de la sustancia, con una sensibilidad extremadamente alta, y en pocos segundos por muestra.

Preferiblemente, la muestra de prueba se puede procesar antes del análisis. Preferiblemente, el procesamiento de la muestra comprende la separación de la muestra mediante extracción en fase sólida (SPE), cromatografía de gases, cromatografía líquida de alta presión mono- o multifásica (HPLC). Preferiblemente, se agregan uno o más patrones internos de biomarcadores de referencia a la muestra antes del análisis. Preferiblemente, la intensidad de la señal absoluta se puntúa midiendo la intensidad de la señal del biomarcador y comparándola con la intensidad de la señal de uno o más patrones internos conocidos. Preferiblemente, el método está completamente automatizado.

Preferiblemente, se examinan una multitud de huevos en busca de una o más características embrionarias.

Preferiblemente, el método comprende además determinar si un embrión en un huevo es viable y masculino, o viable y femenino, o no viable, y separar una multitud de huevos masculinos viables de una multitud de huevos femeninos viables, y uno o más huevos no viables.

Preferiblemente, el método comprende además identificar al menos un biomarcador de la pluralidad de biomarcadores de la muestra y comparar la concentración de al menos un biomarcador con los valores del mismo biomarcador en embriones de pollo individuales con características conocidas, en el que la concentración más alta o más baja con respecto a un umbral de uno o más biomarcadores es una indicación de que el embrión es masculino o femenino, viable o no viable, y/o la fase de desarrollo del embrión.

La etapa (c) comprende aplicar un umbral al valor de puntuación y la cantidad obtenida en (b) para identificar la característica del embrión asociada con la presencia y concentración del biomarcador. Preferiblemente, la etapa (c) comprende además: (i) correlacionar cada señal o firma de biomarcador relevante con un biomarcador de referencia haciendo coincidir el espectro de cada señal de correlación con el espectro esperado del biomarcador de referencia correlacionado usando una medida de similitud, para definir al menos una señal de correlación positiva; (ii) medir la intensidad de cada señal de correlación positiva y puntuar su intensidad de señal absoluta y/o relativa; y (iii) aplicar un umbral al valor de puntuación obtenido de una función de similitud para determinar la característica del embrión asociada con la presencia y concentración del biomarcador correlacionado.

Los solicitantes encontraron que la presencia de ácido 3-[(2-aminoetil) sulfanil]butanoico en una cantidad de 50 ng/ml o más en el fluido alantoideo el día 7, 8 o 9 se correlaciona con un embrión femenino, mientras que la presencia del biomarcador presente en menos de 50 ng/ml se correlaciona con un embrión masculino. Preferiblemente, el ácido 3-[(2-aminoetil)sulfanil]butanoico está presente en una cantidad desde 0.1 a 45 ng/ml, más preferiblemente en una cantidad desde 1 a 40 ng/ml en huevos masculinos el día 7, 8 o . Preferiblemente, el ácido 3-[(2-aminoetil)sulfanil]butanoico está presente en una cantidad desde 50.1 a 150 ng/ml, más preferiblemente en una cantidad desde 55 a 140 ng/ml en huevos femeninos el día 7, 8 o 9.

Si bien este único biomarcador ya puede proporcionar una certeza casi completa sobre la característica deseada, al menos un primer y un segundo biomarcador, o incluso más biomarcadores, se pueden detectar y analizar de forma ventajosa y simultánea. Las cantidades absolutas y/o relativas de al menos el primer y el segundo marcadores pueden emplearse entonces para determinar la una o más características con una certeza incluso mayor.

La presente invención también se refiere preferiblemente a un procedimiento para la incubación selectiva de crías de una especie de ovíparo con una característica específica, que comprende proporcionar una multitud de huevos de la especie y someter los huevos al método descrito en este documento, para determinar un característica del embrión, y seleccionar los huevos con la característica deseada para formar una multitud seleccionada de huevos, e incubar los huevos seleccionados hasta que una o más de las crías eclosionen.

La presente divulgación también se refiere preferiblemente a un sistema de análisis y detección de género de embriones de especies de ovíparos, que comprende:

(i) un sistema de toma de muestras para tomar muestras de huevos individuales;

(ii) un sistema analítico para la recolección de espectros;

(iii) una función de identificación del género y/o viabilidad que identifica mediante programación señales asociadas con uno o más biomarcadores de una o más muestras analizadas por el sistema analítico, la instalación además realiza un análisis comparando las señales con una biblioteca almacenada de espectros de control recolectados en los datos de muestra y/o con un patrón interno, para identificar la característica embrionaria; y

(iv) una salida significa acoplar la información de una o más características embrionarias a una muestra y/o un huevo analizado.

Preferiblemente, la función de identificación se implementa en software en un dispositivo electrónico interconectado con el sistema analítico.

La presente divulgación también se refiere preferiblemente al uso de una multitud de huevos obtenibles del método según la invención para la producción de alimentos para animales y/o humanos, para la producción y/o aislamiento de compuestos cosméticos, médicos y/o nutricionales, para la producción de metano por fermentación y/o producción de fertilizantes de alta calidad.

El término "fluido alantoideo" en este documento abarca fluido alantoideo con o sin la presencia de otros materiales de huevo derivados de huevos de aves. Por ejemplo, el término fluido alantoideo puede incluir una mezcla de sangre y fluido alantoideo. Las realizaciones de la presente invención no se limitan a extraer material del fluido alantoideo o de áreas cercanas a la superficie superior de un huevo. La eliminación de material del fluido alantoideo como se describe en este documento se proporciona simplemente como un ejemplo de posibles realizaciones de la presente invención. Diversos materiales que incluyen, pero no se limitan a, amnios, yema, cáscara, albúmina, tejido, membrana y/o sangre, se pueden extraer de un huevo y analizar para someterlos a un análisis espectrofotométrico, para identificar el género del embrión, como se describe a continuación.

Cuando se desee, se puede extraer material de huevos que tengan prácticamente cualquier orientación. El término "ubicación predeterminada" en este documento indica una posición o profundidad fija dentro de un huevo. Por ejemplo, se puede inyectar un dispositivo en un huevo a una profundidad fija y/o una posición fija en el huevo. En realizaciones alternativas, la inyección se puede llevar a cabo en base a la información obtenida del huevo, por ejemplo, con respecto a la posición del embrión o la cavidad subgerminal dentro del huevo.

En el presente procedimiento, los marcadores de desarrollo se pueden analizar preferiblemente de forma invasiva o no invasiva.

Preferiblemente, la determinación se realiza en un período de 1 a 15 días, más preferiblemente desde 2 a 14, aún más preferiblemente desde 3 a 13, e incluso más preferiblemente desde 4 a 12 días después del inicio de la incubación, tales como por ejemplo realizar la etapa a) preferiblemente en un período de tiempo desde 6 a 12 días después del comienzo de la incubación del huevo. Adicionalmente, se puede determinar la fase de desarrollo real de un huevo.

Preferiblemente, la determinación de la característica del embrión según la presente invención se realiza como un método no destructivo, esto es, permitiendo que los embriones probados de este modo crezcan, si así se desea, o para someterlos a etapas adicionales tales como la producción de vacunas in ovo, siempre que el embrión sea viable, o para hacer crecer los huevos masculinos hasta una población de pollos exclusivamente masculinos, por ejemplo, para la producción de carne, o para su uso los polluelos criados de este modo para otros fines.

El término "comparar los espectros" puede incluir ventajosamente un análisis univariante o preferiblemente multivariado de los espectros medidos, y una determinación de la asociación de un embrión de ave con una determinada población. La etapa puede comprender determinar la presencia de determinados picos de señal en el espectro mediante análisis estadístico multivariado de los datos espectrales. El programa de análisis estadístico multivariado comprende preferiblemente un programa de análisis de componentes principales y/o un programa de análisis de regresión de mínimos cuadrados parciales. De este modo, la divulgación también se refiere a un procedimiento, aparato y sistema para la determinación del género y/o viabilidad de un embrión de ave in ovo, que comprende un programa de análisis estadístico multivariado, así como un procedimiento implementado por microprocesador para la determinación del mismo. Preferiblemente, la etapa (b) comprende además la etapa de normalizar los efectos de intensidad debido a una diferencia de concentración entre dos muestras cualesquiera.

De acuerdo con lo anterior, la comparación comprende preferiblemente una estimación de la probabilidad de un género para una muestra usando análisis multivariante de los espectros medidos, y una determinación de la asociación de un embrión de ave con una determinada población. De manera ventajosa, esto se realiza usando análisis discriminado de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA). El procedimiento incluye preferiblemente el tratamiento matemático de los datos del compuesto trazador e incluye un análisis multivariable tal como PCA (análisis de componentes principales), preferiblemente seguido de un análisis supervisado, más preferiblemente PLS-DA (análisis discriminado por mínimos cuadrados parciales) o incluso más preferiblemente PLSDa ortogonal, o enfoques estadísticos apropiados similares. La etapa de coincidencia de patrones dentro del procedimiento del sujeto identificará una cierta medida de similitud. Usando la medida de similitud, se confirma la estructura correcta del biomarcador. Esta confirmación se realiza mediante coincidencia espectral. La coincidencia espectral se realiza mediante la comparación de los espectros de la muestra y los espectros de referencia en la base de datos. Para una identidad positiva en esta fase, se requiere una correlación apropiada para confirmar la determinación precisa. Los valores umbral apropiados y las medidas de similitud resultarán evidentes para los expertos en la técnica. Este procedimiento intenta reducir grandes cantidades de datos a un tamaño manejable y aplicar un modelo impulsado estadísticamente para determinar variables latentes indicativas de relaciones ocultas entre los datos observados.

A continuación, la función de identificación de características filtra los datos de la muestra, que identificarán los grupos de interés entre las muestras. Los grupos representan similitudes entre las muestras y se usan para identificar los perfiles de género. Preferiblemente, el análisis incluye análisis de componentes principales (PCA) y PLS-DA. PCA emplea algoritmos matemáticos para determinar las diferencias y similitudes en un conjunto de datos. PCA transforma un número de variables posiblemente relacionadas en un número menor de variables no relacionadas que se denominan componentes principales. El primer componente principal explica la mayor parte posible de la variabilidad de los datos. Cada componente adicional intenta dar cuenta de la mayor parte posible de la variabilidad restante en los datos. Los datos recopilados se pueden organizar en una matriz y p Ca resuelve los "valores propios" y los "vectores propios" de una matriz simétrica cuadrada con sumas de cuadrados y productos cruzados. El vector propio asociado con el valor propio más grande tiene la misma dirección que el primer componente principal. El vector propio asociado con el segundo valor propio más grande determina la dirección del segundo componente principal. La suma de los valores propios es igual a la traza de la matriz cuadrada y el número máximo de vectores propios es igual al número de filas (o columnas) de esta matriz. Una vez determinados, es posible dibujar gráficos en pantalla de los valores propios calculados. Los expertos en la técnica reconocerán que se pueden usar un número de algoritmos diferentes para calcular los valores propios y los vectores propios. Los datos se muestran mediante dos gráficos: i) el gráfico de puntuaciones que muestra el agrupamiento de grupos y ii) el gráfico de cargas en el que los datos espectrales responsables del agrupamiento de grupos se identifican como aquellos que se encuentran a la mayor distancia del origen.

El presente método puede determinar ventajosamente si un embrión en un huevo es viable y masculino, o viable y femenino, y separar los huevos probados en una multitud de huevos masculinos viables de una multitud de huevos femeninos viables, y una multitud de huevos no viables, para formar un huevo predominantemente masculino o predominantemente femenino, o selección de huevos predominantemente no viables. Si se desea, las selecciones de huevos viables femeninos o masculinos se pueden someter a incubación y al procedimiento de eclosión, para formar una población animal predominantemente femenina o masculina.

Los huevos se pueden usar para diversas aplicaciones, tales como por ejemplo, para la producción de vacunas, inyectando preferiblemente un virus o material similar a un virus en cada huevo identificado como que contiene un embrión vivo y masculino o femenino. Entonces, después de una incubación apropiada de los huevos inyectados de este modo, se puede aislar una vacuna o material base de vacuna de los huevos incubados. Una realización preferida adicional de la presente invención es un método de detección de la presencia de una sustancia en una muestra de fluido de huevo, por lo que una muestra en el intervalo generalmente de 0.1 a 35 |il puede ser suficiente.

La medida de similitud implica preferiblemente correlacionar el índice de retención y el patrón de fragmentación asociados con una señal de correlación positiva.

Además, las similitudes estadísticamente significativas se pueden detectar y registrar como identidades de biomarcadores relevantes o identidades de biomarcadores múltiples. La determinación de similitudes estadísticamente significativas implica el uso de bases de datos y algoritmos desarrollados para satisfacer las demandas de la metodología.

Esto puede incluir, en particular, cuando se determina la utilidad de un biomarcador para una nueva especie aplicando un análisis multivariado supervisado, preferiblemente análisis discriminado de mínimos cuadrados parciales, PLS-DA o análisis discriminado de mínimos cuadrados parciales ortogonales a los datos.

Preferiblemente, la característica que se va a determinar comprende el género, la edad, la fase de desarrollo y/o la viabilidad del embrión en el óvulo. Para aplicaciones industriales, se examinan una multitud de huevos en busca de una o más características embrionarias.

El presente método está preferiblemente completamente automatizado, proporcionando así un ensayo de biomarcadores en una muestra asociada con un huevo que es automatizado y preciso. De este modo, el ensayo se basa en la espectrometría de masas para identificar biomarcadores. De manera ventajosa, el método filtra y criba la masa y las identidades de los conjuntos de datos que se basan en cada una de las propiedades únicas de carga, masa y patrón de fragmentación asociadas con ciertos biomarcadores identificados en la muestra.

Al correlacionar el análisis de los datos del compuesto trazador con una biblioteca de muestras de género conocido, la selectividad de la determinación del género puede mejorarse adicionalmente de manera ventajosa. El presente procedimiento comprende además de manera ventajosa determinar si un embrión en un huevo es viable y masculino, o viable y femenino, y también permite separar una multitud de huevos masculinos viables de una multitud de huevos femeninos viables, para formar una selección de huevos predominantemente masculinos o predominantemente femeninos. Las selecciones de huevos femeninos o masculinos viables formadas de este modo se pueden someter ventajosamente a un procedimiento de incubación y eclosión para formar una población de pollos predominantemente femeninos o masculinos.

El método según la invención permite analizar, simultáneamente, cientos o miles de huevos, y cientos o miles de biomarcadores en una muestra tomada de cada huevo. El método se basa en una base de datos de biomarcadores, que se ha demostrado que están asociados con una característica, que comprende datos de masa y espectrales para cada uno de los biomarcadores y permite identificar los biomarcadores con precisión mediante un software apropiado en una muestra determinada.

Adicionalmente, se puede establecer una base de datos para una determinada especie cribando los biomarcadores presentes en una muestra y eliminando señales no deseadas sobre la base del índice de tiempo de retención, que se correlaciona con el tiempo de llegada del compuesto al detector de masas. Por tanto, muchas secuencias se pueden analizar en minutos e identificarse biomarcadores con alta confianza. Por tanto, el método es automatizable, de alto rendimiento y operable por técnicos relativamente no calificados y, por lo tanto, apropiado para su uso en ubicaciones remotas, por ejemplo, criaderos y granjas de pollos o peces.

La muestra se puede someter a análisis de masa sin procedimientos de separación previos. En dicha realización, la muestra se analiza preferiblemente mediante infusión directa usando por ejemplo, principios estáticos de nanoelectropulverización, análisis de inyección de flujo o inyección de flujo con enriquecimiento de la muestra.

Ventajosamente, la muestra se procesa antes del análisis de masas, preferiblemente para separar los componentes de la muestra antes de cargarlos en el espectrómetro de masas. Por ejemplo, el procesamiento de la muestra comprende la separación de la muestra mediante cromatografía líquida de alta presión mono- o multifásica (HPLC), cromatografía de gases (GC), o extracción en fase sólida (SPE).

El sistema de espectrómetro de masas es preferiblemente MS de ionización por electropulverización (ESI), MS de ionización por desorción láser asistida por matriz - tiempo de vuelo (MALDI-TOF) o MS de ionización por desorción láser mejorada en superficie - tiempo de vuelo (SELDI-TOF), o MS de desorción por ionización por diodo láser (LDID).

El método según la invención se automatiza ventajosamente y se realiza bajo control informático. La identificación de biomarcadores en una muestra se realiza mediante comparación con los datos de referencia de los biomarcadores; preferiblemente, la masa de referencia y los datos espectrales para una pluralidad de biomarcadores se almacenan en un ordenador. Los espectros de masas de referencia para un biomarcador definido son preferiblemente espectros promediados obtenidos a partir de datos reales y medidos obtenidos mediante un cálculo de agrupamiento, como se establece a continuación. Un biomarcador puede ser relevante tomado solo, en combinación con otros marcadores, para una característica que se mide y evalúa objetivamente como un indicador de una condición, tales como el género, la edad y la viabilidad, o el estado nutricional. Un biomarcador útil puede ser cualquier indicador identificable y medible asociado con una afección o enfermedad particular donde existe una correlación entre la presencia o el nivel del biomarcador y algún aspecto de la afección, incluida la presencia de la fase de desarrollo. La correlación puede ser cualitativa, cuantitativa o tanto cualitativa como cuantitativa. Por lo general, un biomarcador es un compuesto, fragmento de compuesto o grupo de compuestos. Tales compuestos pueden ser cualquier compuesto encontrado o producido por un organismo, incluyendo proteínas y péptidos, ácidos nucleicos, aminoácidos, azúcares y otros compuestos. Un biomarcador se puede describir como "una característica que se mide y evalúa objetivamente como un indicador de una condición, tal como el género, la edad y la viabilidad, o el estado nutricional". Un biomarcador es cualquier indicador identificable y medible asociado con una afección o enfermedad particular donde existe una correlación entre la presencia o el nivel del biomarcador y algún aspecto de la afección, incluyendo la presencia de la fase de desarrollo. La correlación puede ser cualitativa, cuantitativa o tanto cualitativa como cuantitativa. Los biomarcadores también pueden comprender compuestos que son metabolitos de moléculas precursoras trazadoras que se han introducido en el progenitor ovulante y luego son metabolizadas por el embrión durante su desarrollo, excretando metabolitos trazadores como biomarcadores.

Un conjunto de base de datos de espectros de control recogidos de muestras de control se compila inicialmente preferiblemente eligiendo muestras de un género específico de una raza de pollos determinada. Se consideró que una biblioteca o base de datos completa contenía muestras de ambos géneros.

Específicamente, la tipificación se basa en diferencias espectrales que aparecen en porciones tanto del intervalo visible como del ultravioleta. En la actualidad se desconoce el origen de estas diferencias, pero puede deberse a diferencias de absorción intrínsecas a nivel molecular.

Además, los medios de cálculo comprenden medios de software residentes en un ordenador.

Un experto en la técnica puede apreciar que se pueden contemplar realizaciones adicionales, incluidos sistemas y métodos para caracterizar otros componentes del huevo y sus constituyentes, tales como, pero no se limitan a, fluido alantoideo, yema de huevo, clara de huevo, y cáscara de huevo.

La presente divulgación también se refiere a la selección de huevos y, después de la eclosión, a un pollito o una población de pollitos obtenible mediante el procedimiento.

La presente divulgación también se refiere a un método, sistema y producto alimenticio para la determinación in ovo del género, la viabilidad y/o la fase de desarrollo de embriones de especies de ovíparos en términos más generales, esto es, no limitados a aves, o incluso más específicamente a Gallus Gallus Domesticus.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención también se refiere a un procedimiento para la determinación del género in ovo, la viabilidad y/o la fase de desarrollo de un embrión de una especie de ovíparo. El presente procedimiento se relaciona además con la selección de huevos masculinos y huevos femeninos, y con la producción de grupos de animales vivos usando estos huevos seleccionados. Los animales ovíparos ponen huevos, con poco o ningún otro desarrollo embrionario dentro de la madre. Este es el método de reproducción de la mayoría de los peces, anfibios, reptiles, todas las aves y la mayoría de los insectos, moluscos y arácnidos. El cultivo de animales ovíparos y sus huevos abastece a una parte cada vez mayor del suministro mundial de proteínas, así como a otros diversos procesos industriales a gran escala, tales como la producción de vacunas. En la actualidad, los procedimientos más importantes para el cultivo de animales ovíparos incluyen la cría de especies aviares, tales como las aves de corral, y la acuicultura, esto es, el cultivo de organismos acuáticos tales como peces, crustáceos y moluscos.

La presente divulgación también se refiere a un método de identificación del género, la viabilidad y/o la fase de desarrollo de un embrión ovíparo in ovo, que comprende a. proporcionar un producto alimenticio que comprende un material precursor trazador que comprende al menos un compuesto precursor trazador que es aceptable para su uso como aditivo en alimentos para el progenitor ovulante, y b. incubar un huevo durante un período apropiado para permitir el metabolismo del compuesto precursor trazador para formar al menos un compuesto trazador en una cantidad apropiada; y c. someter el huevo, o una muestra del huevo, a un análisis para determinar la presencia y cantidad de uno o más compuestos trazadores, y d. determinar el género, la viabilidad y/o la fase de desarrollo del embrión ovíparo a partir de los datos obtenidos en la etapa (c).

Los huevos fertilizados de la mayoría de las especies de ovíparos tienden a producir una distribución aproximadamente igual de animales masculinos y femeninos. Sin embargo, por diversas razones, en el manejo de los criaderos, puede ser deseable separar a los animales basándose en diversas características, en particular el género. En la producción comercial de pollos y huevos domésticos, por ejemplo, la incubación y cría de polluelos masculinos es altamente indeseable, lo que lleva al sacrificio de miles de millones de polluelos masculinos cada año. En la producción de camarón y langostino, es deseable criar una población exclusivamente femenina, debido a los procesos requeridos para inducir la maduración de los huevos.

Actualmente, en ambos casos, las poblaciones mixtas de animales eclosionados se someten a sexado mediante evaluación visual del animal juvenil, a veces incluso de la población adulta en la que los juveniles no tienen rasgos apropiados. En cualquier caso, este es un procedimiento que consume mucho tiempo, requiere operadores altamente capacitados y, por lo general, es muy estresante para los animales. Además, cuando se sexan animales adultos, es necesario criar toda la población hasta una edad mínima, mientras que solo la mitad de los animales criados de este modo se usan para la proliferación después de la separación. Se pueden producir problemas adicionales cuando la presencia de por ejemplo, una población masculina puede conducir a una reducción de la productividad debido, por ejemplo, a canibalismo y reducción de la densidad de la explotación, como se informa, por ejemplo, en the fresh water prawn M. Rosenbergii.

También en la piscicultura, la determinación del género o sexo de un pez permitiría criar poblaciones monosexuales predominantemente masculinas o femeninas, permitiendo así apuntar al crecimiento y la salud de la población de manera más específica, como se practica actualmente para la tilapia del Nilo. que se cultivan preferiblemente como una población exclusivamente masculina. Nuevamente, en la mayoría de los peces, solo en una etapa juvenil tardía o en la fase adulta, el género se puede determinar mediante inspección visual, de modo que se deben establecer patrones de reproducción complicados y poblaciones específicas con híbridos "super masculinos", que pueden ser propensos a mejorar la presencia de trastornos genéticos, y que también pueden ser propensos a ciertas enfermedades relacionadas con la muy pequeña diseminación genética de la población.

Adicionalmente, existe un porcentaje de huevos que no están fertilizados, o que no comprenden un embrión viable al comienzo del período de incubación, lo que reduce en gran medida la capacidad de las incubadoras empleadas en los criaderos, en particular para huevos de aves de corral.

Como resultado, se requiere una capacidad de incubación que sea al menos dos veces mayor de lo necesario si estuviera disponible una selección de género temprana, permitiendo la selección principalmente de embriones masculinos o femeninos solos.

De acuerdo con lo anterior, sería de gran valor para el medio ambiente, por la reducción de la cantidad de energía y otros recursos requeridos, pero igualmente para la eliminación de animales innecesarios mediante el sacrificio, así como la reducción del estrés para los animales recién eclosionados, si se dispuso de un método de fase temprana que permitiera determinar el género de los embriones de aves antes de la fase de incubación, permitiendo también incrementar fuertemente la capacidad de los criaderos. Un beneficio adicional sería si el método también permitiera seleccionar embriones viables sobre huevos no fertilizados y/o no viables, aumentando aún más la eficiencia del procedimiento de eclosión.

Para peces o camarones, se han publicado diversos métodos basados principalmente en anticuerpos o PCR. Sin embargo, estos son bastante costosos y complejos.

Por tanto, sigue existiendo la necesidad de un método más rápido y más fácil de aplicar para la determinación no destructiva del género, la fase de desarrollo y/o la viabilidad de un embrión de animal ovíparo in ovo.

Por lo tanto, otro objeto de la presente invención es proporcionar un método de identificación de una característica de un embrión de una especie de ovíparo in ovo, comprendiendo el método: (a) someter una muestra de material asociado con el huevo que comprende el embrión a un análisis espectrométrico de masas y registro del índice de tiempo de retención y la masa y masa correspondientes para cada señal detectada; (b) correlacionar la masa correspondiente a cada señal con una base de datos de referencia de masas de biomarcadores específicas para la especie para formar una correlación entre una o más señales y uno o más biomarcadores de referencia; (c) confirmar la correlación entre cada señal de correlación y un biomarcador de referencia haciendo coincidir el espectro de masas de cada señal de correlación con el espectro de masas del biomarcador de referencia de correlación usando una medida de similitud, para definir al menos una señal de correlación positiva; y (d) medir la intensidad de cada señal de correlación positiva y puntuar su intensidad de señal absoluta o relativa; y (e) aplicar un umbral al valor de puntuación obtenido de la función de discriminación para determinar la característica del embrión asociada con la presencia y concentración del biomarcador correlacionado.

Otro objeto es proporcionar tal instrumentación para su uso en criaderos. Otro objeto más es proporcionar un sistema capaz de realizar análisis en línea en tiempo real de huevos en ubicaciones remotas, tales como criaderos o acuicultivos. Estos y otros objetos son abordados por el aparato y el procedimiento. De acuerdo con lo anterior, la presente divulgación se refiere a un método de identificación de uno o más biomarcadores asociados con una característica de un embrión de una especie de ovíparo in ovo, comprendiendo el método: analizar una multitud de muestras de una multitud de huevos de una especie con un género conocido en un espectrómetro de masas para obtener una multitud de espectros de masas para establecer un patrón de biomarcadores, y realizar un reconocimiento de patrones en los espectros de masas para obtener un patrón de biomarcadores, y determinar biomarcadores y niveles de biomarcadores asociados con al menos una característica de un embrión en base al patrón de biomarcadores.

En un aspecto adicional, el procedimiento en cuestión también se refiere a una multitud de huevos femeninos viables, que forman una selección de huevos predominantemente masculinos o predominantemente femeninos. En otro aspecto más, el procedimiento en cuestión también se refiere a una población de animales juveniles obtenible mediante el método según la invención. En otro aspecto más, el procedimiento en cuestión también se refiere al uso de una multitud de huevos obtenibles del procedimiento para la producción de alimentos para animales y/o humanos, para la producción y/o aislamiento de compuestos cosméticos, médicos y/o nutricionales, para producción de metano mediante fermentación, producción de vacunas y/o producción de fertilizantes de alta calidad.

En otro aspecto más, el procedimiento en cuestión también se refiere a un sistema de análisis y detección de género de embriones de animales ovíparos, que comprende un aparato de preferencia completamente automatizado para la ejecución de los métodos en cuestión.

En otro aspecto más, la presente divulgación se refiere a un método de identificación del género, la viabilidad y/o la fase de desarrollo de un embrión ovíparo in ovo, que comprende (a) proporcionar un producto alimenticio que comprende un material precursor trazador que comprende al menos una compuesto precursor trazador que es aceptable para su uso como aditivo en alimentos para el progenitor ovulante, y (b) incubar un huevo durante un período apropiado para permitir el metabolismo del compuesto precursor trazador para formar al menos un compuesto trazador en una cantidad apropiada; y (c) someter el huevo, o una muestra del huevo a un análisis para determinar la presencia y cantidad de uno o más compuestos trazadores, y (d) determinar el género, la viabilidad y/o la fase de desarrollo del embrión ovíparo a partir de los datos obtenidos en la etapa (c).

En un aspecto adicional, la presente divulgación también se refiere a un producto alimenticio para la determinación del género del embrión, viabilidad y/o fase de desarrollo, y al uso de un compuesto precursor de trazas en alimentos para animales.

La presente divulgación también se refiere al sistema, en el que la función de identificación del género se implementa en software en un dispositivo electrónico interconectado con el sistema espectroscópico; y preferiblemente en el que la función de identificación comprende medios de software residentes en un ordenador.

La figura 1 representa un A) Modelo de clasificación de regresión logística en una característica única. Se evaluó un único modelo predictor para todas las características medidas y se observó la mejor precisión con la característica 1599, que proporciona una precisión > 90 % desde el día 9. B) Regresión logística en 2 características. Los modelos de regresión logística se evaluaron en todos los pares posibles de características medidas. Después de comprobar la solidez de las mediciones, se logró el mejor rendimiento mediante la combinación de las funciones 1599 y 507, que proporcionan > 95 % de precisión desde el día 10.

De este modo, el presente método se refiere a una determinación relativa de una propiedad, tal como el género. Esto se puede aumentar significativamente agregando características adicionales y, por ejemplo, eliminando valores atípicos o huevos con características dudosas, lo que aumenta significativamente la precisión.

La figura 3 muestra cromatogramas de compuestos con varios picos de masa que varían de 220 a 145, extraídos a los 850 segundos de muestras masculinas (color gris oscuro) y femeninas (color gris claro).

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. La terminología usada en la descripción de la invención en este documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente y no pretende ser limitante de la invención. Muchas especies de ovíparos se crían comercialmente.

La "acuicultura" implica el cultivo de poblaciones de agua dulce y salada en condiciones controladas, y puede contrastarse con la pesca comercial, que es la recolección de peces silvestres y otros animales marinos.

Las especies de "peces" en este documento incluyen todos los animales craneales acuáticos portadores de branquias que carecen de extremidades con dedos. En esta definición se incluyen actualmente peces mixinos, lampreas y especies de peces cartilaginosos y óseos, ya sean peces marinos o de aguas dulces. Las especies o familias de peces importantes que se cultivan comercialmente incluyen miembros de la familia de peces de agua dulce de los ciprínidos, tales como carpas, pececillos reales y sus parientes, por ejemplo, barbas, barbos y bagres y Pangasiidae, carpa herbívora, carpa común, carpa cabezona, carpa plateada, Catla, carpa cruciana y similares; Salmónidos, incluidos el salmón, la trucha, los carboneros, los peces blancos de agua dulce y los grises, por ejemplo, salmón del Atlántico, trucha de mar y trucha arcoíris; Serranidos tales como la barramundi o lubina asiática, lubina japonesa, lubina europea; Latidae; Sparidae, tales como besugos y pargos; Cichlidae como la tilapia del Nilo o Mozambique, y Acipenseridae, tales como el esturión atlántico o beluga.

"Crustáceos" en este documento se refiere a un grupo de especies de artrópodos que tienen sexos separados y se reproducen sexualmente, lo que incluye animales familiares como cangrejos, langostas, cangrejos de río, camarones.

Los "cangrejos" en este documento son crustáceos decápodos del orden Brachyura.

"Camarón" y/o "langostino" en este documento se refiere a cualquier tipo de crustáceo cultivable, tales como el Penaeidae de acuicultura en agua salada o salobre, preferiblemente el género de langostinos Penaeus, incluido el langostino tigre gigante, P. monodon, camarón blanco del Pacífico, Litopenaeus vannamei; camarón azul occidental (P. stylirostris); camarón blanco chino (P. chinensis; camarón Kuruma (P. japonicus); camarón blanco indio (P. indicus); camarón banana (P. merguiensis); y otros miembros de las familias Caridea o Dendrobranchiata; y crustáceos acuícolas de agua dulce tales como por ejemplo Macrobrachium rosenbergii, M. nipponense y M. malcolmsonii; cangrejos de los géneros Astacoidea y Parastacoidea, tales como Procambarus clarkii; y especies cultivables de langosta de las familias Nephropidae y Homaridae, así como langostas espinosas de la familia Palinuridae.

"Moluscos" en este documento se refiere a un gran filo de animales invertebrados conocido como el orden Mollusca, que incluye moluscos cefalópodos, tales como calamares, sepias y pulpos; conchas de bivalvos tales como polyplacophora, scaphopods y conchas de colmillos que tienen sexos separados, y en los que la fertilización es externa.

Los términos "aviar" y "ave" como se usan en este documento, incluyen masculinos o femeninos de cualquier especie de ave, pero están destinados principalmente a abarcar aves de corral que se crían comercialmente para huevos o carne. De acuerdo con lo anterior, los términos "ave" y "aviar" están destinados particularmente a abarcar pollo, pavos, patos, gansos, codornices, palomas, avestruces, emúes y faisanes.

El término "incubación" en este documento se refiere al procedimiento mediante el cual los animales ovíparos, tales como las aves, eclosionan sus huevos, y al desarrollo del embrión dentro del huevo después de abandonar el tracto de los adultos. El período de incubación en este documento se refiere al tiempo ininterrumpido durante el cual un huevo en particular se somete a condiciones que emulan la incubación hasta la eclosión, esto es, la emergencia de las crías, incluyendo cualquier manipulación o transferencia desde por ejemplo, una incubadora a una unidad de cría, siempre que el desarrollo de un animal no se detenga.

El término "in ovo" como se usa en este documento, se refiere a embriones contenidos dentro de un huevo antes de la eclosión. Los presentes aspectos se pueden practicar con cualquier tipo de huevo de ave, pez, molusco, reptil o crustáceo, incluyendo, pero no limitado a, huevos de gallina (domesticada), pavo, pato, ganso, codorniz y faisán, pescado, tales como carpa, huevos de salmónidos o tilapia; huevos de camarones o langostinos y huevos de moluscos.

Los términos "inyección" e "inyectar" en este documento abarcan métodos de inserción de un dispositivo (por lo general un dispositivo alargado) en un huevo o embrión, incluidos métodos de administración o descarga de una sustancia en un huevo o embrión, métodos para extraer una sustancia (esto es, una muestra) de un huevo o embrión, y/o métodos de inserción de un dispositivo detector en un huevo o embrión.

El término "espectrometría de masas" en este documento se refiere a una técnica analítica que clasifica los iones en base a su masa. La espectrometría de masas se usa por lo general para análisis químicos en muchas situaciones y se podría aplicar a cualquier muestra, desde una mezcla compleja de petróleo hasta los productos de la ingeniería genética. En términos simples, un espectro de masas dará una imagen de la composición química exacta de una muestra.

Un espectro de masas es un gráfico de la señal iónica en función de la proporción masa/carga. Estos espectros se usan para determinar la firma elemental o isotópica de una muestra, las masas de partículas y moléculas, y para dilucidar las estructuras químicas de las moléculas. La espectrometría de masas ioniza compuestos químicos para generar moléculas cargadas o fragmentos de moléculas y mide sus proporciones de masa a carga.

En un procedimiento típico de MS, una muestra, que puede ser sólida, líquida o gaseosa, se ioniza, por ejemplo, bombardeándola con electrones. Esto puede hacer que algunas de las moléculas se rompan en fragmentos cargados. Luego, estos iones se separan según su proporción masa/carga, por lo general acelerándolos y sometiéndolos a un campo eléctrico o magnético. Los iones de la misma proporción masa/carga sufrirán la misma cantidad de deflexión.

Los iones se detectan mediante un mecanismo apropiado capaz de detectar partículas cargadas, tales como un multiplicador de electrones. Los resultados se muestran como espectros de la abundancia relativa de iones detectados en función de la proporción masa-carga. Los átomos o moléculas de la muestra se pueden identificar correlacionando masas conocidas con las masas identificadas o mediante un patrón de fragmentación característico. En el presente contexto, la espectrometría de masas se aplica para identificar y detectar biomarcadores apropiados. La espectrometría de masas (MS) es una técnica analítica valiosa porque mide una propiedad intrínseca de una molécula, su masa, con una sensibilidad muy alta. Por lo tanto, la MS se puede usar para medir una amplia gama de moléculas de biomarcadores y una amplia gama de materiales muestreados. Se sabe que la preparación correcta de la muestra es crucial para la generación de señales de MS y la resolución y sensibilidad de los espectros. Por lo tanto, la preparación de muestras es un área crucial para la viabilidad y sensibilidad generales del análisis.

Los métodos preferidos para la caracterización espectrométrica de masas de biomarcadores incluyen ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI) e ionización por electropulverización (ESI). Cualquiera puede combinarse ventajosamente con tiempo de vuelo (TOF) u otros tipos de sensores espectrométricos de masas para determinar la masa y/o el patrón de fragmentación de un biomarcador. Preferiblemente, la espectrometría de masas se puede emplear junto con técnicas cromatográficas y otras técnicas de separación en este documento.

MALDI opera pulsando una muestra con láseres. Este tratamiento vaporiza e ioniza la muestra. A continuación, se determinan los pesos moleculares (masas) de los iones cargados en un analizador TOF. En este dispositivo, un campo eléctrico acelera las moléculas cargadas hacia un detector, y las diferencias en el lapso del tiempo que tardan los fragmentos ionizados en llegar al detector, esto es, su tiempo de vuelo, para revelar los pesos moleculares de los biomarcadores, por lo que los compuestos más pequeños llegan antes al detector.

Este método genera perfiles de masa de la muestra, es decir, perfiles de pesos moleculares y cantidades de compuestos en la mezcla. Estos perfiles se pueden usar luego para identificar biomarcadores conocidos a partir de bases de datos de biomarcadores.

Con una interfaz ESI-MS para cromatografía líquida (LC/MS/MS), los compuestos eluyentes de la columna LC se introducen en la fuente de iones del espectrómetro de masas. Se aplica voltaje a una aguja fina. Luego, la aguja pulveriza gotitas en un analizador espectrométrico de masas donde las gotitas se evaporan y se liberan iones biomarcadores correspondientes a una variedad de estados de carga que están fragmentados y desde donde se puede determinar la composición. Alternativamente, SPE (extracción en fase sólida) o cromatografía de gases se pueden acoplar al espectrómetro de masas. En particular, se encontró que SPE/MS/MS era útil para una aplicación industrial automatizada y de alto rendimiento del presente método, tal como el uso de un aparato Agilent Rapidfire MS (Rapidfire es una marca comercial registrada de Agilent Inc.); o un diodo láser o un aparato LDID de desorción de iones térmicos.

La espectrometría de masas en tándem (MS/MS) implica la activación de un ion precursor a través de colisiones con un gas objetivo y puede producir fragmentos cargados y neutros. La naturaleza de los iones del fragmento, así como sus intensidades, a menudo es indicativa de la estructura del ion precursor y, de este modo, puede proporcionar información útil para la identificación de analitos desconocidos, además de proporcionar una técnica de cribado útil para diferentes clases de analitos. La activación a través de múltiples colisiones prolonga el tiempo de activación y permite que se depositen energías más altas en los iones precursores. Las presiones de gas de colisión más altas también implican tasas de relajación de colisión más altas.

Preferiblemente, la determinación de la característica del embrión según la presente invención se realiza como un método no destructivo, esto es, permitiendo que los embriones probados de este modo crezcan, si así se desea, o para someterlos a etapas adicionales tales como la producción de vacunas in ovo, siempre que el embrión sea viable.

El término "fluido alantoideo" en este documento abarca fluido alantoideo con o sin la presencia de otros materiales de huevo derivados de huevos de aves. Por ejemplo, el término fluido alantoideo puede incluir una mezcla de sangre y fluido alantoideo. Las realizaciones de la presente invención no se limitan a extraer material del fluido alantoideo o de áreas cercanas a la superficie superior de un huevo. La eliminación de material del fluido alantoideo como se describe en este documento se proporciona simplemente como un ejemplo de posibles realizaciones de la presente invención. Diversos materiales que incluyen, pero no se limitan a, amnios, yema, cáscara, albúmina, tejido, membrana y/o sangre, se pueden extraer de un huevo y analizar para someterlos a un análisis espectrofotométrico, para identificar el género del embrión, como se describe a continuación.

Cuando se desee, se puede extraer material de huevos que tengan prácticamente cualquier orientación. El término "ubicación predeterminada" en este documento indica una posición o profundidad fija dentro de un huevo. Por ejemplo, se puede inyectar un dispositivo en un huevo a una profundidad fija y/o una posición fija en el huevo. En realizaciones alternativas, la inyección se puede llevar a cabo en base a la información obtenida del huevo, por ejemplo, con respecto a la posición del embrión o la cavidad subgerminal dentro del huevo.

Alternativamente, en particular en el caso de huevos de moluscos, peces o camarones, la alta translucidez de dichos huevos, así como su tamaño comparativamente pequeño en comparación con los huevos de aves, pueden permitir un análisis directo y no invasivo a través de un análisis directo, no invasivo, mediciones invasivas en huevos enteros.

El término "comparar los espectros" puede incluir ventajosamente un análisis univariado o preferiblemente multivariado de los espectros medidos, y una determinación de la asociación de un embrión de ave con una determinada población. La etapa puede comprender determinar la presencia de determinados picos de señal en el espectro mediante análisis estadístico multivariado de los datos espectrales. El programa de análisis estadístico multivariado comprende preferiblemente un programa de análisis de componentes principales y/o un programa de análisis de regresión de mínimos cuadrados parciales. La presente invención, de este modo, también pertenece a un procedimiento, aparato y sistema para la determinación del género y/o viabilidad de un embrión de ave in ovo, que comprende un programa de análisis estadístico multivariado, así como un procedimiento implementado por microprocesador para la determinación del mismo.

De acuerdo con lo anterior, la comparación comprende preferiblemente una estimación de la probabilidad de un género para una muestra usando análisis multivariante de los espectros medidos y una determinación de la asociación de un embrión de ave con una determinada población. De manera ventajosa, esto se realiza usando análisis discriminado de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA).

El procedimiento incluye preferiblemente el tratamiento matemático de los datos del compuesto trazador e incluye un análisis multivariable tal como PCA (análisis de componentes principales), preferiblemente seguido de un análisis supervisado, más preferiblemente PLS-DA (análisis discriminado por mínimos cuadrados parciales) o incluso más preferiblemente PLSDA ortogonal, o enfoques estadísticos apropiados similares.

La etapa de coincidencia de patrones dentro del procedimiento en cuestión identificará una cierta medida de similitud. Usando la medida de similitud, se confirma la estructura correcta del biomarcador. Esta confirmación se realiza mediante coincidencia espectral. La coincidencia espectral se realiza mediante la comparación de los espectros de la muestra y los espectros de referencia en la base de datos. Para una identidad positiva en esta fase, se requiere una correlación apropiada para confirmar la determinación precisa. Los valores umbral apropiados y las medidas de similitud resultarán evidentes para los expertos en la técnica.

Este procedimiento intenta reducir grandes cantidades de datos a un tamaño manejable y aplicar un modelo impulsado estadísticamente para determinar variables latentes indicativas de relaciones ocultas entre los datos observados.

A continuación, la función de identificación del género filtra los datos de la muestra, que identificarán los grupos de interés entre las muestras. Los grupos representan similitudes entre las muestras y se usan para identificar los perfiles de género. Preferiblemente, el análisis incluye análisis de componentes principales (PCA) y PLS-DA.

El PCA emplea algoritmos matemáticos para determinar las diferencias y similitudes en un conjunto de datos. PCA transforma un número de variables posiblemente relacionadas en un número menor de variables no relacionadas que se denominan componentes principales. El primer componente principal explica la mayor parte posible de la variabilidad de los datos. Cada componente adicional intenta dar cuenta de la mayor parte posible de la variabilidad restante en los datos. Los datos recopilados se pueden organizar en una matriz y PCA resuelve los "valores propios" y los "vectores propios" de una matriz simétrica cuadrada con sumas de cuadrados y productos cruzados.

El vector propio asociado con el valor propio más grande tiene la misma dirección que el primer componente principal. El vector propio asociado con el segundo valor propio más grande determina la dirección del segundo componente principal. La suma de los valores propios es igual a la traza de la matriz cuadrada y el número máximo de vectores propios es igual al número de filas (o columnas) de esta matriz. Una vez determinados, es posible dibujar gráficos en pantalla de los valores propios calculados. Los expertos en la técnica reconocerán que pueden usarse un número de algoritmos diferentes para calcular los valores propios y los vectores propios. Los datos se muestran mediante dos gráficos: i) el gráfico de puntuaciones que muestra el agrupamiento de grupos y ii) el diagrama de cargas en el que los datos espectrales responsables del agrupamiento de grupos se identifican como aquellos que se encuentran a la mayor distancia del origen.

El procedimiento según la presente divulgación comprende preferiblemente (a1) proporcionar una muestra que comprende un fluido de huevo; y (a2) adquirir el espectro de la muestra. Preferiblemente, la etapa (b) comprende además la etapa de normalizar los efectos de intensidad debido a una diferencia de concentración entre dos muestras cualesquiera. La etapa opcional (a3) elimina preferiblemente la turbidez de las muestras, mediante un método apropiado tales como ultrafiltración o centrifugación.

Preferiblemente, el embrión es un embrión de ave, un embrión de reptil, un crustáceo, un pez o un molusco. Lo más preferiblemente, los embriones de aves se someten a la prueba debido a la gran importancia del cultivo de aves de corral y debido al tamaño comparativamente grande, esto es, de los huevos que permite el muestreo.

El presente método puede determinar ventajosamente si un embrión en un huevo es viable y masculino, o viable y femenino, y separar los huevos probados en una multitud de huevos masculinos viables de una multitud de huevos femeninos viables, y una multitud de huevos no viables, para formar un huevo predominantemente masculino o predominantemente femenino, o selección de huevos predominantemente no viables. Si se desea, las selecciones de huevos viables femeninos o masculinos se pueden someter a incubación y al procedimiento de eclosión, para formar una población animal predominantemente femenina o masculina.

Las características que caracterizan la invención, tanto en la organización como en el método de funcionamiento, junto con otros objetos y ventajas de la misma, se comprenderán mejor a partir de la siguiente descripción usada junto con el dibujo adjunto. Se debe entender expresamente que los dibujos tienen el propósito de ilustrar y describir y no pretenden ser una definición de los límites de la invención. Estos y otros objetivos alcanzados, y las ventajas ofrecidas por la presente invención, resultarán más evidentes a medida que se lea la descripción que sigue a continuación junto con el dibujo adjunto.

Los métodos y aparatos según los aspectos de la presente divulgación se pueden usar para identificar una o más características de un huevo en cualquier momento durante el período de desarrollo embrionario, también denominado período de incubación del mismo.

El método de la invención se puede implementar de dos formas; usando patrones internos para proporcionar una referencia para cuantificar la intensidad de la señal, y sin tales patrones. De este modo, en una realización, se agregan uno o más patrones internos a la muestra antes del análisis por espectrometría de masas. Preferiblemente, los patrones internos están etiquetados. De manera ventajosa, la intensidad de la señal absoluta para cada señal de biomarcador se puede puntuar midiendo la intensidad de la señal de biomarcador y comparándola con la intensidad de señal de uno o más patrones internos conocidos. En la implementación alternativa, la muestra se procesa sin la adición de patrones internos. En dicha realización, la intensidad de la señal relativa se puntúa midiendo la proporción entre las intensidades de la señal del biomarcador individual en una muestra y la intensidad de la señal de referencia para un grupo de muestras.

La medida de similitud implica preferiblemente correlacionar el índice de retención y el patrón de fragmentación asociados con una señal de correlación positiva.

Además, las similitudes estadísticamente significativas pueden detectarse y registrarse como identidades de biomarcadores relevantes o identidades de biomarcadores múltiples. La determinación de similitudes estadísticamente significativas implica el uso de bases de datos y algoritmos desarrollados para satisfacer las demandas de la metodología.

Esto puede incluir, en particular, cuando se determina la utilidad de un biomarcador para una nueva especie aplicando un análisis multivariado supervisado, preferiblemente análisis discriminado de mínimos cuadrados parciales, PLS-DA o análisis discriminado de mínimos cuadrados parciales ortogonales a los datos.

Preferiblemente, la característica que se va a determinar comprende el género, la edad, la fase de desarrollo y/o la viabilidad del embrión en el óvulo. Para aplicaciones industriales, se examinan una multitud de huevos en busca de una o más características embrionarias.

En el método según la invención, se puede establecer una base de datos para una determinada especie mediante el cribado de los biomarcadores presentes en una muestra y la eliminación de señales no deseadas en base al índice de tiempo de retención, que se correlaciona con el tiempo de llegada del compuesto al detector de masas. Por tanto, muchas secuencias se pueden analizar en minutos e identificarse biomarcadores con gran confianza. Por tanto, el método es automatizable, de alto rendimiento y operable por técnicos relativamente no calificados y, por lo tanto, apropiado para su uso en ubicaciones remotas, por ejemplo, criaderos y granjas de pollos o peces.

La muestra se puede someter a análisis de masa sin procedimientos de separación previos. En tal realización, la muestra se analiza preferiblemente mediante infusión directa usando por ejemplo, principios estáticos de nanoelectropulverización, análisis de inyección de flujo o inyección de flujo con enriquecimiento de la muestra.

El sistema de espectrómetro de masas es preferiblemente MS de ionización por electropulverización (ESI), MS de ionización por desorción láser asistida por matriz en tiempo de vuelo (MALDI-TOF) o MS de ionización por desorción láser mejorada en superficie en tiempo de vuelo (SELDI-TOF), o MS de desorción por ionización por diodo láser (LDID) MS.

En particular, se encontró que SPE/MS/MS era útil para la aplicación industrial automatizada y de alto rendimiento del presente método, tal como usar un aparato Agilent Rapidfire MS (Rapidfire es una marca comercial registrada de Agilent Inc.); un Phytronics, la fuente de iones LDTD (desorción térmica por diodo láser) (LDTD es una marca comercial registrada de Phytronics Inc.).

Como se expuso anteriormente, la presente divulgación también se refiere a un producto alimenticio para la determinación del género, viabilidad y/o fase de desarrollo del embrión, y al uso de un compuesto precursor de trazas en alimentos para animales. Los solicitantes descubrieron sorprendentemente que la adición de compuestos precursores apropiados en el alimento del progenitor ovulante conduce a una expresión diferente de los metabolitos de los compuestos precursores en el huevo durante el desarrollo embrionario.

Como resultado, los huevos muestran una variación medible de ciertos metabolitos, dependiendo de una característica del embrión, tal como el género del embrión. Preferiblemente, el al menos un compuesto precursor trazador se selecciona de un compuesto que está listado como aditivo alimentario permisible por the US Food and Drug Administration (FDA) y/o the European Commission. El compuesto precursor trazador particularmente apropiado se puede seleccionar de hidroxianisol butilado (BHA) y/o el compuesto relacionado hidroxitolueno butilado (b Ht ), que son compuestos fenólicos agregados adecuadamente a los alimentos para conservar las grasas. BHA en este documento se refiere a una mezcla de los isómeros 3-tertbutil-4-hidroxianisol y 2-tertbutil-4-hidroxianisol; mientras que BHT se refiere a 3,5-di-tert-butil-4-hidroxitolueno; también conocido como metil-di-tert-butilfenol; 2,6-di-tert-butil-paracresol. BHA y BHT son antioxidantes conocidos; se cree que el oxígeno reacciona preferentemente con BHA o BHT en lugar de oxidar grasas o aceites, protegiéndolos así del deterioro. Además de ser oxidables, BHA y BHT son solubles en grasa. El material precursor trazador se agrega preferiblemente al producto alimenticio en una cantidad calculada para proporcionar una concentración predeterminada del, o de cada compuesto trazador en el producto. Preferiblemente, el material precursor trazador se agrega al producto en una cantidad calculada para proporcionar una concentración del o cada compuesto trazador en el huevo o la muestra de huevo en una concentración en el intervalo desde 5 ppb - 5 ppm, más preferiblemente en el intervalo desde aproximadamente 10 a 1000 ppb, y aún más preferiblemente de 50 - 500 ppb.

El material trazador puede comprender ventajosamente más de un compuesto trazador, seleccionándose las cantidades relativas de los compuestos trazadores para proporcionar una característica identificable para el género, la viabilidad y/o la fase de desarrollo de un embrión ovíparo, en el que el análisis del huevo o una muestra de huevo se realiza para identificar las cantidades relativas características de los compuestos trazadores. El análisis se realiza preferiblemente usando un espectrómetro de masas, tal como por ejemplo un sensor de movilidad iónica. La muestra se puede someter primero a cromatografía líquida, cromatografía de gases o una combinación de cromatografía de gases, que preferiblemente se acopla con un sensor apropiado. Una alternativa al sensor MS puede ser un detector fotométrico de llama.

Preferiblemente, el al menos uno de los compuestos trazadores presentes en una muestra tomada del huevo puede separarse, derivatizarse o concentrarse antes del análisis, después de la etapa de analizar el fluido del huevo de forma invasiva o no invasiva. Preferiblemente, el embrión cuya característica se va a investigar es un embrión de ave, un embrión de reptil, un embrión de crustáceo, un embrión de pez o un embrión de molusco. Más preferiblemente, el embrión es un embrión de ave, preferiblemente de la especie Gallus Gallus domesticus, o en el que el embrión es un embrión de una especie de crustáceo seleccionada del grupo que comprende Peneidae, Astacoidea y Parastacoidea, Macrobrachiae; Astacoidea; Parastacoidea; Nephropidae y Homaridae, o el embrión es un embrión de una especie de pez, preferiblemente seleccionada entre carpa, tilapia, bagre, besugo, lubina, atún, caballa, bonitos o jurel.

La presente divulgación también se refiere a un producto alimenticio para su uso con animales parentales que ovulan, que comprende una cantidad apropiada de un compuesto precursor trazador.

La estimación de la probabilidad de un género para una muestra comprende preferiblemente aplicar un análisis multivariado supervisado, preferiblemente análisis discriminado de mínimos cuadrados parciales, PLS-DA o análisis discriminado de mínimos cuadrados parciales ortogonales a los datos.

Ventajosamente, los valores atípicos pueden eliminarse de la población, aumentando así la certeza para la determinación aún más, mientras que también contribuye al flujo de huevos que se usarán para otros fines.

El presente método comprende además ventajosamente separar los huevos en multitudes de huevos masculinos o femeninos; también puede comprender ventajosamente además determinar la viabilidad del embrión y separar los huevos en uno o más, preferiblemente multitudes, de huevos viables y huevos no viables.

El presente método, en el que los valores atípicos se eliminan de la población, comprende además de manera ventajosa determinar si un embrión en un huevo es viable y masculino, o viable y femenino, y separar una multitud de huevos masculinos viables de una multitud de huevos femeninos viables, y valores atípicos, para formar una selección de huevos predominantemente masculinos o predominantemente femeninos.

El presente método comprende además ventajosamente someter las selecciones de huevos viables femeninos o masculinos a un procedimiento de incubación y eclosión para formar una población animal predominantemente femeninos o masculinos.

La viabilidad de un embrión se puede determinar ventajosamente usando los biomarcadores medidos. Fr huevos no fertilizados, así como embriones fallecidos después de un cierto período de tiempo (esto es, minutos después del final del metabolismo, los resultados medidos están claramente por completo fuera de la ventana de medición, lo que lleva a valores atípicos que se eliminan de los huevos viables. Igualmente al menos en el caso de los embriones de aves, cuando se usan muestras de, por ejemplo, alantoides, estos muy rápidamente después del final de la actividad metabólica se alterarán y eventualmente amarillearán debido a la disolución de las membranas que mantienen la yema de huevo separada. Adicionalmente, se pueden medir los latidos del corazón o el flujo de sangre para determinar las actividades metabólicas embrionarias.

La presente divulgación también se refiere al uso de una multitud de huevos obtenibles a partir del método descrito en este documento para la producción de alimentos para animales y/o humanos, para la producción y/o aislamiento de compuestos cosméticos, médicos y/o nutricionales, para la producción de metano por fermentación, para la producción de vacunas y/o producción de fertilizantes de alta calidad.

Los siguientes ejemplos no limitantes se proporcionan para ilustrar la invención.

Ejemplo 1:

Envío y almacenamiento de muestras

Para el descubrimiento de biomarcadores, se emplearon múltiples plataformas analíticas de perfilado de metabolitos, estas fueron las aminas biogénicas, lípidos polares negativos, perfilado global no dirigido y GC-MS.

En la fase de descubrimiento se analizaron 100 muestras. Otro conjunto de 350 muestras, de huevos con diferentes antecedentes en nutrición y raza, se analizaron para la fase de confirmación, encontrando biomarcadores para género y edad en al menos dos plataformas.

Las primeras 150 muestras de fluido alantoideo (de pollo marrón) se recogieron en los días de incubación 7-11 y se almacenaron a -80 °C.

Los datos de determinación de género genético para estas muestras se prepararon usando un método de PCR. Se seleccionaron muestras por género por día, mientras que las muestras en exceso del conjunto actual se usaron para el análisis de RMN. A continuación, se analizó el perfil metabólico de estas muestras usando la amina, los lípidos polares negativos, CG-MS (para compuestos de azúcar) y plataformas de elaboración de perfiles globales.

Se recogieron otras 300 muestras de fluido alantoideo en el criadero para los días de incubación 7-11 del pollo marrón. Se proporcionó un análisis genético de género, pero no se usó hasta la construcción del modelo estadístico. Estas muestras se usaron para confirmar las características encontradas en análisis de perfiles globales anteriores. Además, se tomaron 59 muestras de huevos blancos (línea Hey CV 24) y también se usaron para este estudio de confirmación. Alícuotas

Las muestras se descongelaron durante la noche a 4 °C antes de dividirlas en alícuotas. Las muestras se agitaron en vórtex y se dividieron manualmente en alícuotas de la siguiente manera: 5 |iL para el perfil de amina, 50 |iL para el perfil de lípidos polar negativo y 100 |iL para GC-MS (análisis de compuestos de azúcar). El grupo de control de calidad (QC) se generó tomando cantidades iguales de cada muestra seguido de una mezcla completa.

Diseño por lotes

Para la fase de descubrimiento, las muestras se aleatorizaron y distribuyeron en dos lotes para las mediciones de aminas. Para los lípidos negativos y el perfil global, las muestras se procesaron en un lote. Se eligieron réplicas cada siete muestras y también se incluyeron líneas de calibración, QC y blancos. Los QC se analizaron cada 10 muestras, se usan para evaluar la calidad de los datos y corregir la respuesta del instrumento. Los espacios de blanco se usan para restar los niveles de fondo de las muestras de estudio.

Los datos en bruto se procesaron previamente usando el software de análisis cuantitativo Agilent MassHunter (Agilent, versión B.05.01).

Perfilado de aminas

Todos los equipos, suministros y software mencionados son de Waters (Etten-Leur, Países Bajos), a menos que se indique lo contrario. La plataforma de amina cubre aminoácidos y aminas biogénicas que emplean una estrategia de derivación de etiquetas AccQ adaptada de Waters. Brevemente, las muestras de fluido alantoideo (5 |iL cada una) se enriquecieron con una solución de patrón interno (Tabla 1) y luego se sometieron a desproteinización con Me-OH (Actu-All Chemicals). El sobrenadante (10.000 rpm, 10 °C, 10 min) se secó en condiciones de vacío. El residuo se reconstituyó en solución reguladora de borato (pH 8.5) con reactivo de carbamato de 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidilo (AQC). La reacción de derivación se neutralizó con 10 |iL de ácido fórmico al 20 % (Acros Organics). El sobrenadante (10.000 rpm, 10 °C, 10 min) se transfirió a viales y se colocó en una bandeja de muestreador automático enfriada (10 °C) hasta la inyección (1 |iL) en el sistema UPLCMS/MS.

Análisis de los datos

Los datos adquiridos se evaluaron y los picos de MRM asignados se integraron usando el software TargetLynx. Los picos de MRM se normalizaron usando patrones internos apropiados, para el análisis de aminoácidos se usaron sus análogos marcados con 13C15N y para otras aminas se empleó el estándar interno de elución más cercana. Se usaron muestras de blanco para corregir el fondo. Se aplicaron algoritmos desarrollados internamente usando las muestras de control de calidad agrupadas para corregir los cambios en la sensibilidad del espectrómetro de masas sobre el lote.

Se llevó a cabo un análisis de datos exploratorio para investigar si se podía descubrir una característica específica de género. Para esto, se aplicaron métodos de análisis de datos estándar univariados y multivariados dentro de BMFL que usualmente usamos para descubrir biomarcadores.

A continuación, las muestras se someten a ensayo en un aparato automático SPE/M S/MS Rapidfire acoplado de alto rendimiento, así como en un aparato LDPD Phytronix. Los resultados indican que el género de los huevos viables se determina con una precisión superior al 95 %, en menos de 10 segundos por muestra. La figura 1 muestra la certeza resultante para la determinación del género, que ascendió a más del 95 % en el día 9 o 10 cuando se consideraron dos biomarcadores juntos.

Eclosión

Se permitió que una serie de 25 huevos considerados masculinos o femeninos que habían sido sometidos a muestreo como se indica anteriormente, se realizaran pruebas para proceder a la eclosión, usando un aparato de incubación comercial y condiciones de incubación típicas. Todas las crías emergieron efectivamente de los huevos, lo que demuestra la viabilidad del muestreo. Los pollitos eclosionados eran una población completamente masculina o femenina.

Ejemplo 2: Determinación no invasiva usando volátiles y microextracción en fase sólida (SPME)

La recolección de muestras volátiles se realizó transfiriendo un solo huevo a un frasco de vidrio sellado con papel de aluminio y tapa de metal. Luego, la jarra se colocó sobre una placa calefactora mientras se mantenía la temperatura dentro de la jarra a 37 °C. El huevo en el frasco se dejó durante 15 minutos para alcanzar el equilibrio con el espacio de cabeza del frasco. Se acondicionó un material de fibra de recolección antes de usarlo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego, se insertó la fibra y se realizó la extracción durante 50 min. Después de la extracción, la fibra se introdujo en el inyector del cromatógrafo de gases durante 5 minutos para la desorción de los analitos a 250 °C en modo splitless. El huevo se devolvió a la incubadora inmediatamente después de la recolección de volátiles. Los blancos se realizaron haciendo el SPME a un frasco vacío y antes del análisis se realizó el reacondicionamiento de la fibra para garantizar la ausencia de picos y la buena calidad del procedimiento SPME.

A continuación, se midieron los volátiles liberados del huevo mediante cromatografía de gases en un Agilent Technologies (Wilmington, DE, EE.UU.) 7890A equipado con un detector selectivo de masas de Agilent Technologies (MSD 5975C). Las separaciones cromatográficas se realizaron en una columna HP-5MS UI (fenilmetilsilox al 5 %), 30 m x 0.25 m DI con un espesor de película de 25 m (Agilent) usando helio como gas portador a una velocidad de flujo de 1 mL/min. Se usó un espectrómetro de masas de un solo cuadrupolo con ionización de electrones (El, 70 eV). El espectrómetro de masas se hizo funcionar en modo SCAN. Para la extracción de los compuestos volátiles se usó una fibra de microextracción en fase sólida (SPME) de calibre 24 PDMS/DVB Stableflex de 60 |im con soporte. Los datos en bruto se convirtieron a formato CDF usando MSD Chemstation F.01.00.1903. El script XCMS se diseñó y aplicó en el software R (R versión 3.2.0) para realizar la selección de picos. El método usado fue "matchedFilter, con fwhm = 4 (Ancho de pico), etapa = 0.5 (Ventana de masa) y snthresh = 5 (S/N). Para el análisis estadístico se usó Metaboanalyst 3.0. Finalmente, MassHunter Qualitative Analysis B.005.00 se usó para verificar manualmente las características más importantes según los resultados obtenidos, y para la identificación se usó NIST Mass Spectral Library Versión 2.0.

En este procedimiento, se obtuvieron 1486 características de diferentes masas en los diferentes tiempos de retención en segundos a partir del TIC de cada muestra. Luego de la extracción de estas características, se procesaron aplicando un método univariante con un Test usando metaboanalyst 3.0 para identificar las características distintivas de género con una confianza del 99 %.

Los solicitantes encontraron que un biomarcador particularmente relevante que muestra una diferencia significativa entre huevos masculinos y femeninos es el hidroxitolueno butilado, que es el derivado de BHT como precursor.

Los huevos femeninos exhibieron una concentración significativamente mayor de hidroxitolueno butilado en comparación con los huevos masculinos. De acuerdo con lo anterior, el uso de un precursor trazador condujo a un biomarcador que permitió distinguir entre embriones masculinos y femeninos de pollo in ovo con alta certeza de una manera totalmente no invasiva.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Método de identificación de forma no destructiva una característica de un embrión de Gallus Gallus domesticus in ovo, comprendiendo el método:

(a) obtener una muestra de material asociado con un huevo que comprende el embrión, y

(b) medir un valor de puntuación para la presencia de, y concentración de al menos un primer biomarcador en la muestra indicativo de la característica del embrión, y

(c) aplicar un umbral al valor de puntuación y la concentración obtenidos en (b) para identificar la característica del embrión asociada con la presencia y concentración del primer biomarcador, en el que el primer biomarcador comprende un compuesto amino que tiene un peso molecular en el intervalo desde 150 a 170 g/mol; en el que la etapa (c) comprende además:

(i) correlacionar cada señal de biomarcador relevante con un biomarcador de referencia haciendo coincidir el espectro de cada señal de correlación con el espectro esperado del biomarcador de referencia correlacionado usando una medida de similitud, para definir al menos una señal de correlación positiva;

(ii) medir la intensidad de cada señal de correlación positiva y puntuar su intensidad de señal absoluta y/o relativa; y

(iii) aplicar un umbral al valor de puntuación obtenido de una función de similitud para determinar la característica del embrión correlacionada;

en el que el primer biomarcador es el ácido 3-[(2-aminoetil) sulfanil]butanoico, y una concentración del primer biomarcador en una cantidad de 50 ng/ml o más en el fluido alantoideo del embrión en el día 7, 8 o 9 se correlaciona con un embrión femenino, mientras que la presencia del primer biomarcador presente en menos de 50 ng/ml se correlaciona con un embrión masculino.

2. El método según la reivindicación 1, en el que el primer y segundo biomarcador se detectan y analizan, y en el que las cantidades absolutas y relativas de al menos el primer y segundo marcadores se emplean para determinar una o más características.

3. El método según la reivindicación 1 o 2, que comprende aplicar uno o más de un método de formación de imágenes por resonancia magnética; un método de resonancia espectral; un método cromatográfico analítico junto con uno o más detectores apropiados; espectroscopia de fluorescencia; y/o métodos de ensayo que comprenden reactivos selectivos de biomarcadores, para medir la presencia y concentración de uno o más biomarcadores, preferiblemente en los que el análisis espectrométrico de masas comprende espectroscopía de masas de ionización por electropulverización (ESI), ionización por desorción láser asistida por matriz - espectroscopia de masas de tiempo de vuelo (MALDI-TOF) o ionización de desorción láser mejorada en superficie - espectroscopia de masas de tiempo de vuelo (SELDI-TOF), SPE/MS/MS, fuente de iones LDTD (desorción térmica de diodo láser) y/o uso de un sensor de movilidad de iones (IMS).

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra de prueba se procesa antes del análisis, preferiblemente en el que el procesamiento de la muestra comprende la separación de la muestra mediante extracción en fase sólida (SPE), cromatografía de gases, cromatografía líquida de alta presión mono- o multifásica. (HPLC).

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, en el que uno o más patrones internos de biomarcadores de referencia se agregan a la muestra antes del análisis por espectrometría de masas.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la intensidad de la señal absoluta se puntúa midiendo la intensidad de la señal del biomarcador y comparándola con la intensidad de la señal de uno o más patrones internos conocidos.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se examinan una multitud de huevos para una o más características embrionarias; y preferiblemente que comprende además determinar si un embrión en un huevo es viable y masculino, o viable y femenino, o no viable, y separar una multitud de huevos masculinos viables de una multitud de huevos femeninos viables, y uno o más huevos no viables.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el método está completamente automatizado.

9. El método según la reivindicación 8, que comprende además clasificar los huevos viables según el tiempo percibido hasta que es probable que el embrión eclosione.

10. Un procedimiento para la incubación selectiva de crías de una especie de ovíparo con una característica específica, que comprende

a. proporcionar una multitud de huevos de la especie, y

b. someter los huevos al método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para determinar una característica del embrión, y

c. seleccionar los huevos con la característica deseada para formar una multitud seleccionada de huevos, y d. incubar los huevos seleccionados hasta que eclosionen una o más crías.