ES2258074T3 - Activacion in ovo de un huevo aviar en la cascara. - Google Patents

Abstract

Método para producir un pollo vivo a partir de un huevo aviar desovado sin fertilizar en su cáscara, en el que el huevo comprende una yema rodeada por una membrana y un óvulo, que comprende activar el óvulo e incubar el huevo hasta la eclosión.

Description

Activación in ovo de un huevo aviar en la cáscara.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la activación de huevos aviares. En particular, la presente invención se refiere a métodos de activación de un huevo aviar en su cáscara. La invención se refiere asimismo a un método de activación de un huevo en su cáscara, en el que se incuba un pollo vivo.

Antecedentes de la técnica Cría tradicional

Típicamente, la cría en la industria avícola se realiza mediante cualquiera de dos sistemas:

Programa de cría en el suelo. El primer sistema se denomina "cría en el suelo" y se utiliza para producir la gran mayoría de todos los huevos incubados comercialmente. En este sistema, los machos simplemente se añaden a las bandadas de hembras en una proporción típica entre 10 y 15 por ciento. El sistema de cría en el suelo, incluso con sus ineficiencias, es actualmente el sistema de bajo coste para producir huevos incubados, porque requiere menos trabajo que los sistemas competidores. Los índices de incubación promedio varían de aproximadamente 83% para criadores de pollos estabulados a 92% para criadores de gallinas. Aunque este sistema ha sido la columna vertebral de la industria avícola durante muchos años, tiene muchas limitaciones.

Tamaño frente a capacidad reproductiva: La cría en el suelo ya no se lleva a cabo en pavos, debido a la intensa selección para la producción incrementada de músculo, que ha hecho que las razas comerciales de pavos sean incapaces de aparearse naturalmente. La misma tendencia se está observando en pollos. La selección para el tamaño incrementado en pollos ha puesto en peligro la fertilidad y la capacidad de apareamiento, y se predice que la fertilidad continuará disminuyendo a medida que aumente el peso corporal. Esto presenta un dilema para los productores de aves de corral, porque las reducciones en la fertilidad tienen un impacto negativo directo sobre su resultado neto.

Eliminación ineficiente de los desechos: El apareamiento natural tiene que realizarse en suelos sólidos para evitar las lesiones de las aves. Este requisito de diseño impide el uso de sistemas de eliminación de desechos automatizados y precisa la limpieza manual entre bandadas sucesivas de aves. Esto añade trabajo y gastos generales, reduciendo el uso productivo de las instalaciones.

Producción de huevos y calidad: Debido a que los huevos permanecen en los alojamientos con la bandada hasta el momento de la recogida, se contaminan frecuentemente con suciedad y material fecal, lo que puede reducir los índices de incubación. Además, típicamente entre 3 y 5% de los huevos producidos en alojamientos en el suelo se ponen directamente en el suelo, más que en las cajas de puesta proporcionadas, y se tienen que desechar.

Utilización ineficiente de espacio y de equipamiento: Mantener a los machos y hembras juntos en un alojamiento en el suelo requiere la instalación de dos sistemas independientes de comederos y bebederos, debido a los diferentes requisitos nutricionales y de producción para cada sexo. Además, requiere la instalación de cajas de puesta y sistemas de recogida de huevos automatizados. Todo este equipamiento ocupa un espacio limitado de suelo en el alojamiento. Por estas razones, la crianza en el suelo no es un uso eficiente del espacio de alojamiento y equipamiento, comparado con sistemas de jaulas apiladas.

Mortalidad y fertilidad: Los machos agresivos tienden a pelear, produciendo índices de mortalidad de machos mayores. Los índices de mortalidad de machos son por término medio 13% en alojamientos en el suelo, frente a 2% en alojamientos en jaulas. La agresividad de los machos frente a las gallinas durante el apareamiento, gradualmente se cobra un precio en forma de mortalidad femenina incrementada, fertilidad reducida y reducción en la longitud del ciclo de producción del huevo. A medida que los machos de una bandada se hacen mayores, la fertilidad comienza a descender. La solución estándar es "impulsar" la bandada con machos jóvenes para mejorar la fertilidad. Sin embargo, esto desata otra ronda de agresión con una reducción de la fertilidad a corto plazo, y un incremento de la mortalidad. La enfermedad es más común en alojamientos en el suelo, debido al contacto constante de las aves con la cama y el material de desecho que aloja organismos patógenos.

Conversión de alimento reducida: Los costes del control de la alimentación son críticos para realizar un funcionamiento competitivo de las aves de corral. Los costes de alimentación suponen hasta el 60% del coste de criar un pollo de carne, por ejemplo. En un estudio, las aves criadas en el suelo consumían 20% más de alimento para la misma cantidad de producción, cuando se comparaban con los criados en jaulas. Esta diferencia se debe al nivel incrementado de interacciones sociales, así como al nivel generalmente mayor de actividad física observada en los alojamientos en el suelo. Los machos consumen más alimento que las hembras, haciendo el sistema de cría en el suelo ineficiente respecto al consumo de alimento, debido al gran número de machos que se tiene que mantener.

Flexibilidad limitada en estrategias de cría: Debido al hecho de que machos y hembras se alojan en un gran grupo en la disposición de alojamiento de cría en el suelo, el criador está muy restringido en su capacidad de realizar cruces y selecciones avanzados en la raza de cría. Por esta razón, los alojamientos en el suelo se utilizan principalmente como herramienta para la multiplicación de razas genéticas preseleccionadas, para producir cruces comerciales finales.

Programa de cría por inseminación artificial: Otro sistema utilizado para generar huevos incubados se denomina inseminación artificial (IA). La IA se pone en práctica ampliamente por "criadores primarios" en la cumbre de la pirámide de cría, pero no se usa generalmente por los productores en la base de la pirámide. Los criadores primarios son compañías que poseen y mejoran las líneas genéticas seleccionadas que se cruzan para producir los pollos de carne, gallinas ponedoras y pavos que son productos comerciales finales. Las cantidades de aves se incrementan exponencialmente a medida que uno se mueve hacia abajo en la pirámide de cría, desde las líneas seleccionadas, a través de la raza de los abuelos, raza de los padres y, finalmente, hasta las aves comerciales reales. Mientras que las aves de composición genética de élite en la cúspide de la pirámide son muy caras, las aves de la base son baratas. Por estas razones, se utilizan diferentes modelos de actuación para la reproducción a diferentes
niveles.

En el sistema de IA, los machos y hembras se alojan en los mismos alojamientos, pero se enjaulan por separado. Las jaulas de hembras contienen típicamente entre dos y cinco gallinas, mientras que las jaulas de machos contienen un único gallito. Los programas de AI tratan muchas de las limitaciones de los alojamientos de cría en el suelo enumeradas anteriormente. Por ejemplo, debido a que se utilizan alojamientos en jaulas, la eliminación de los desechos se puede realizar automáticamente. Los alojamientos están en general mucho más limpios, produciendo menos problemas de enfermedades. La producción de huevos mejora, debido a que los huevos ruedan fuera de las jaulas y no se depositan sobre el suelo sucio. El equipamiento y el espacio de alojamiento se utilizan más eficientemente. La mortalidad se minimiza, debido a una reducción de la agresión social y las enfermedades. Los niveles de fertilidad se mantienen más constantemente, debido a que la interacción social y física se eliminan del proceso de reproducción. La conversión en alimento se incrementa. Y, finalmente, el sistema de producción ha incrementado la flexibilidad para realizar cruces y selecciones avanzados. Esta capacidad es absolutamente requerida por los criadores primarios, a fin de mejorar sus razas genéticas y de mantenerse competitivos en el mercado. Mientras que la mayoría de las ventajas enumeradas anteriormente son importantes también para criadores de multiplicación a escala comercial, se contrarrestan por una desventaja crucial, los elevados costes de trabajo asociados con los programas de IA.

Los programas de IA reemplazan el impulso sexual innato de las aves de corral por el trabajo humano. Los trabajadores tienen que recoger manualmente el semen de los machos en las jaulas e inseminar a las hembras en jaulas en una rotación de 7 días. El nivel de sofisticación requerido en estos programas implica un personal cualificado. Por esta razón, el programa de IA, aunque superior en cuanto a funcionamiento, no es práctico económicamente para programas de cría a escala comercial. Incluso el uso de gallinas enanas, una innovación que permite una producción de huevos similar con aproximadamente 30% menos de consumo de alimento, no puede justificar los costes de trabajo incrementados del programa de IA para criadores de multiplicación a escala comercial.

Proceso reproductivo

En el momento de la ovulación, el oocito aviar comprende un blastodisco, o disco germinal, que contiene el pronúcleo femenino y una masa de yema amarilla. El disco germinal y la masa de yema están rodeadas por la membrana celular del oocito, denominada zona pelúcida. Rodeando a la zona pelúcida esta la capa perivitelina (PL), denominada también capa perivitelina interna (IPL). El espacio entre el zona pelúcida y la IPL se denomina espacio perivitelino, que está atravesado por células granulosas. Una vez que el ovocito se libera de su folículo ovárico, se denomina óvulo. El óvulo se mueve hacia el interior del oviducto, donde es rodeado por el infundíbulo, donde se produce la fertilización si está presente el esperma.

A medida que el óvulo pasa hacia el infundíbulo posterior, otra capa, la capa perivitelina externa (OPL), rodea al óvulo. Esta membrana actúa evitando la polispermia, que es un estado letal que se produce cuando se une esperma múltiple al óvulo y penetra en él, en la región del blastodisco. El huevo se rodea luego con capas adicionales de chalaza y capas finas y gruesas de albúmina. Cuando el óvulo se mueve hacia el interior del istmo, se depositan dos membranas de cubierta, sobre las que se depositan pequeños cristales de carbonato cálcico, comenzando así la formación de la cáscara.

Los hechos precedentes se producen todos en las primeras pocas horas siguientes a la fertilización. A continuación, el óvulo se mueve hacia el interior del útero, donde durante las siguientes 18-20 horas, se completa la cáscara de calcio. A continuación el huevo se mueve hacia la vagina durante varios minutos, y luego se expulsa desde la vagina, o se desova (es decir, "se pone"). En este punto, si el huevo se ha fertilizado, el embrión contenido en el mismo tendrá de 40.000 a 70.000 células. (Johnston, "In vitro sperm binding, penetration and fertilization of recently oviposited chicken eggs", diciembre 1988, Universidad de Clemson); Olsen, M.W., J. Morph. 70:413-533 (1942); Etches et al., in Methods in Molecular Biology, vol. 62 Recombinant gene expression protocols, E. R. Tuan, Humana Press, Inc Totowa, NJ, págs. 433-450 (1997); Petitte et al., en Manipulation of the avian genoma, Ed. Etches et al., CRC Press, Boca Raton, FL, págs. 81-101 (1993)).

Transgénesis

Desde hace tiempo, una meta de los genetistas aviares ha sido completar los procedimientos de selección tradicional, insertando genes deseables directamente en la línea germinal aviar. Se ha realizado un progreso considerable a lo largo de estas líneas en especies de mamíferos, en las que los embriones tempranos son accesibles y en los que los pronúcleos se pueden visualizar para la inserción de DNA exógeno. La producción de ratones, ganado vacuno, ovino y caprino transgénicos se ha convertido en un procedimiento rutinario en grandes operaciones comerciales. En especies aviares, como contraste, el embrión temprano no ha sido accesible fácilmente, y los pronúcleos están visualmente ocultos, haciendo que la manipulación del genoma aviar en embriones tempranos en el huevo (in ovo) sea una meta casi inalcanzable.

El desarrollo de aves modificadas genéticamente requiere en la mayor parte de los casos acceso a células embrionarias pluripotentes de la fase temprana. Como las primeras etapas del desarrollo del embrión se producen en el oviducto de la hembra, la introducción de DNA heterólogo en el embrión temprano sólo ha sido posible extrayendo el embrión de la hembra, requiriendo el sacrificio de ésta. Además, aunque se ha logrado el cultivo de la etapa temprana del embrión hasta la eclosión, el método es extremadamente laborioso, y produce un índice de supervivencia poseclosión de sólo aproximadamente 10%. Sang et al., en Manipulation of the avian genome, Ed. Etches et al., CRC Press Boca Raton, Fl, págs. 121-133 (1993).

La presente invención proporciona una mejora pionera en biología aviar, haciendo posible activar un huevo desovado dentro de su cáscara, e incubar un ave viva desde la cáscara, denominada aquí activación en el huevo (in ovo). Tales métodos proporcionan una alternativa a la cría en el suelo y la inseminación artificial, que puede incrementar considerablemente la eficiencia de la producción de aves de corral. Tales métodos proporcionan asimismo acceso a embriones aviares tempranos, de forma que se pueden desarrollar más fácilmente especies aviares.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al campo de la reproducción aviar. En particular, la presente invención proporciona un método para activar un huevo dentro de su cáscara. La invención también proporciona un método de activación de un huevo en su cáscara, por medio del cual se incuba un pollo vivo.

Asimismo, la presente invención proporciona un huevo aviar desovado en su etapa temprana de desarrollo.

Descripción detallada de la invención

Según se usan aquí "un" o "el" pueden significar uno o más. Por ejemplo, "un" huevo puede significar un huevo o más de un huevo. Además, "el" huevo puede significar un huevo o más de un huevo.

Según se usa aquí, "activación" significa la iniciación del desarrollo del embrión en un huevo aviar desovado sin fertilizar u ovocito. Más adelante se exponen varias formas de activación. El procedimiento de activación de un huevo desovado en su cáscara se denomina aquí "activación en el huevo (in ovo)" (IOA).

La presente invención proporciona un método para activar un huevo aviar en su cáscara, en el que el huevo comprende una yema rodeada por una membrana y un óvulo, que comprende activar el óvulo. La presente invención se refiere al descubrimiento inesperado y sorprendente de que un huevo aviar desovado y sin fertilizar, se puede activar dentro de la cáscara y producir un pollo vivo. Según se utiliza aquí, la referencia a un huevo aviar en su cáscara se refiere a un huevo desovado, es decir, un huevo con una cáscara de carbonato cálcico que se ha expulsado desde la vagina del ave. La expulsión del huevo se denomina "desove". Consecuentemente, todas las referencias realizadas aquí a un "huevo en su cáscara" o a un "huevo desovado", se deberían entender como equivalentes en cuanto a significado.

Un huevo aviar comprende una cáscara calcificada, dura, en el momento en que se desova. Dentro de la cáscara está una yema que contiene nutrientes para mantener el crecimiento y desarrollo de un embrión. Según se usa aquí, un "embrión" es un organismo en desarrollo resultante de la reunión de un pronúcleo femenino y un pronúcleo masculino, durante el proceso de fertilización del huevo. Aunque un óvulo (célula única) fertilizado se puede denominar, por tanto, embrión, el embrión de una única célula se denomina aquí también específicamente zigoto.

Aunque la activación en el huevo (in ovo) se puede realizar sobre huevos hasta de 2 semanas de edad si los huevos se mantienen a temperatura ambiente, idealmente se usan huevos recién desovados para obtener los mejores resultados. En una realización preferida, la activación se produce entre 0 y 96 horas tras el desove. En una realización más preferida, la activación se produce entre 0 y 72 horas tras el desove. En una realización incluso más preferida, la activación se produce entre 0 y 48 horas tras el desove. En una realización altamente preferida, la activación se produce entre 0 y 24 horas tras el desove. Por tanto, se prefiere que el suceso de la activación se produzca tan pronto como sea posible tras el desove. Sin embargo, la secuencia de tiempo preferida puede depender de cómo se mantenga el huevo desovado, p.ej., temperatura, humedad, etc. Por ejemplo, la activación puede mejorar si el huevo desovado sin fertilizar se activa antes de que se lo deje enfriar.

En los métodos de la invención, la activación del huevo aviar en la cáscara se logra disgregando mecánicamente el huevo o suministrando una muestra biológica, p.ej., una muestra que contenga uno o más un espermatozoide, célula o núcleo, en el huevo (in ovo) desovado. La disgregación o suministro de la muestra biológica se puede lograr mediante cualquier método que permita que la muestra se suministre al interior de la cáscara, incluyendo, pero no limitados a, disolver un área de la cáscara, p.ej., con una solución ácida, usando electroporación y creando una abertura haciendo penetrar o rompiendo un área de la cáscara, por ejemplo usando una herramienta, como una aguja o un escalpelo.

Preferiblemente, la superficie del área de la cáscara a penetrar a fin de suministrar la muestra o disgregar el óvulo, se desinfecta antes de suministrar la muestra al interior, para evitar la contaminación del huevo. Cualquier método que sea compatible con el método de suministro se puede usar para desinfectar el huevo, incluyendo, pero no limitados a, el desinfectante IOFEC-20®, y peróxido de hidrógeno al 3%. La superficie del huevo en el sitio destinado a la penetración, se puede limpiar o pulverizar con el desinfectante, o el huevo se puede sumergir en un recipiente que contenga el desinfectante elegido.

Según se describió anteriormente, se puede realizar una abertura en la cáscara con una herramienta como un cuchillo o una aguja. Preferiblemente, la herramienta será estéril. Por ejemplo, en un procedimiento en dos etapas, se puede realizar primero una abertura en la cáscara con un cuchillo u otro instrumento afilado. En una segunda etapa, una aguja unida a una jeringa que contiene una muestra se puede hacer pasar a través de la abertura para suministrar la muestra al interior del huevo. La introducción de la muestra en el interior de la abertura en la cáscara se puede lograr también por otros medios, incluyendo, pero no limitados a, el uso de una pipeta, como una micropipeta. Alternativamente, en una etapa, se puede usar una aguja unida a una jeringa que contiene la muestra para penetrar en la cáscara, creando así la abertura y suministrando la muestra al interior del huevo mediante inyección. Por tanto "abertura" puede incluir un agujero creado por una aguja. Por supuesto, un técnico medio en la materia será capaz de elegir una aguja cuyo calibre sea lo suficientemente grande para permitir que la muestra se mueva a través de la aguja. En una realización, la aguja será del calibre más pequeño que permita suministrar la muestra intacta al interior de la cáscara y también será suficientemente robusta para penetrar la cáscara de calcio del huevo. Alternativamente, se puede usar una aguja separada u otro dispositivo independiente para hacer la abertura en la cáscara del huevo. Típicamente, se pueden usar agujas que varían del calibre 30 al calibre 16. En una realización se usa una aguja del calibre 22.

La abertura se puede realizar en cualquier lugar de la cáscara que efectúe una activación viable, pero se realiza típicamente en un área de la cáscara cerca del disco germinal. Aunque un huevo se puede manipular para colocar el disco germinal en diferentes regiones del huevo, el disco germinal en un huevo recién desovado se localiza típicamente en el extremo ancho de la cáscara, que recubre la celda de aire adyacente a la yema. Una vez creada una abertura en la cáscara, la muestra se suministra preferiblemente introduciendo la aguja, pipeta, etc. a través de la celda de aire y debajo de una membrana que está situada debajo de la celda de aire (membrana interna de la cáscara).

Preferiblemente, para evitar la contaminación del huevo y la muerte de un embrión, se sella la abertura de la cáscara. Se puede aplicar directamente a la abertura en la cáscara un adhesivo atóxico para sellarla. Alternativamente, se puede usar un trozo de cáscara de huevo como parche para cerrar la abertura y se puede unir a la cáscara con un adhesivo atóxico. En una realización, el adhesivo atóxico es cola de Elmer®. En otra realización, el adhesivo es una sustancia obturadora de silicona. Además, se puede usar también cualquier "pegamento de tejidos" para sellar la cáscara. Un "pegamento de tejidos" es un adhesivo estéril, atóxico, usado durante procedimientos de actuación quirúrgicos, para unir tejidos entre sí.

El método de la presente invención se puede usar para activar huevos desovados de especies aviares seleccionadas del grupo formado por pollos, codornices, patos, pavos, faisanes, avestruces, emúes, gansos, pavos reales, gallos, ñandúes, papagayos, ninfas, cacatúas, periquitos, y otras aves comercialmente valiosas.

La presente invención proporciona asimismo un método de activación de un huevo aviar en su cáscara, en el que el huevo comprende una yema rodeada rodeada por una membrana, y que incuba un pollo vivo.

Tras la activación según los métodos de la presente invención como se describieron, el huevo se incuba hasta que el pollo vivo rompe el cascarón. Un técnico medio tendrá en cuenta la cantidad de tiempo y las condiciones preferidas para incubar un huevo fertilizado perteneciente a una especie particular. Los siguientes son períodos de incubación para varias especies de aves: Pollo-21 días, codorniz-23 días, perdiz- 17 a 18 días, faisán-23 días, pavo-28 días, pato-28 a 33 días, ganso-28 a 30 días, periquito-18 días, papagayos-28 días, paloma-14 días, mainá-14 días, gorrión-14 días, torillo-16 días, colín de California-21 a 22 días, cisne-30 a 37 días. La incubación de huevos fertilizados por los métodos de la presente invención, comparada con huevos fertilizados naturalmente puede diferir sólo en que la longitud del tiempo de incubación se puede prolongar para incluir la cantidad de tiempo que el huevo fertilizado habría pasado en el cuerpo de la hembra antes del desove. En una realización preferida, el período de incubación dura de 21 a 23 días para huevos de pollo. Aunque un técnico medio en la materia podría determinar fácilmente la temperatura óptima para incubación de un huevo de una especie particular de ave, típicamente la temperatura de incubación será de 35ºC a 37,78ºC. Un huevo de pollo se incubará a aproximadamente 37,5ºC. En una realización más preferida, la temperatura a la que se incuba el huevo de pollo se reducirá a medida que el huevo se acerca al punto de eclosión. Por tanto, en una realización preferida actualmente, un huevo de pollo se incuba a 37,5ºC desde el día 1 de incubación hasta aproximadamente el día 18 de incubación, y a 37,94ºC desde el día 19 de incubación hasta la eclosión.

Según se conoce bien en la técnica, el grado de humedad al que se incuba el huevo puede ser importante para hacer que eclosione el huevo. Por tanto, típicamente el huevo se incuba a entre 75% y 90% de humedad. Preferiblemente, el huevo se incuba a aproximadamente 80% de humedad. Más preferiblemente, el grado de humedad al que se incuba el huevo se elevará a medida que el huevo se aproxima al punto de eclosión. Por tanto, en una realización preferida, un huevo de pollo se incuba al 80% de humedad desde el día 1 de incubación hasta aproximadamente el día 18 de incubación, y al 85% de humedad desde el día 19 de incubación hasta la eclosión. En una realización específica preferida, un huevo se incuba a 37,5ºC y 80% de humedad desde el día 1 de incubación hasta aproximadamente el día 18 de incubación, y a 37,94ºC y 85% de humedad desde el día 19 de incubación hasta la eclosión. Según se conoce bien en la técnica, girar los huevos durante la incubación es útil para estimular el crecimiento del embrión.

Se prefiere además que la incubación de los huevos se produzca en una incubadora comercial. Muchas compañías producen nacedoras e incubadoras, incluyendo PAS Reform, Jamesway, Chickmaster, Buckeye, Cumberland, Petersime, Humidaire Incubator Co., etc. Preferiblemente, los huevos se mueven desde una incubadora a una nacedora, aproximadamente 3 días antes de la eclosión. La cesta de la nacedora permite al huevo reposar en la zona en la que el pollo puede romper el cascarón más fácilmente. Esta cesta también permite al pollo andar casi inmediatamente después de la eclosión, lo que es necesario para el desarrollo y viabilidad del pollo.

En otra realización, la presente invención presenta un huevo aviar desovado que comprende un embrión nativo que tiene menos de 40.000 células, en el que el embrión puede desarrollarse en forma de pollo vivo. "Nativo" significa que crece, vive o se produce en su lugar de origen. Por tanto, un embrión nativo es un embrión que se desarrolla y eclosiona en la misma cáscara en la que se formó el pronúcleo femenino. Por tanto, el embrión desciende del óvulo nativo. En el momento en el que un óvulo que se ha fertilizado se ha desovado naturalmente, el embrión en desarrollo tiene típicamente entre 40.000 y 70.000 células. Sin embargo, el huevo de la presente invención se fertiliza después de que se ha desovado en su cáscara; por tanto, un embrión que se desarrolla en el huevo de la presente invención tendrá en algún momento durante la incubación menos de 40.000 células. De hecho, en el momento de la activación, el embrión en el huevo de la presente invención tendrá una célula y es un zigoto. A medida que el embrión crece dentro del huevo, se producirá la división celular normal e incrementará el número de células. Por tanto, el huevo desovado, activado, de la presente invención en algún momento durante la incubación comprenderá un embrión que tendrá, por ejemplo, 1.100, 1.000, 10.000, 20.000, 30.000 o 40.000 células, incluyendo números comprendidos entre estos números de células. Dos huevos aviares preferidos comercialmente son los de pollo y pavo.

En otra realización, la presente invención proporciona un huevo aviar en una cáscara que comprende un embrión con menos de 40.000 células (p.ej., 30.000; 20.000; 10.000; 1.000; 100 y 1 (zigoto)), en el que el embrión se puede desarrollar formando un pollo vivo, y en el que la cáscara tiene una abertura de menos de 4 centímetros. En otra realización, la abertura en la cáscara es de menos de 2 centímetros. En otra realización, la abertura en la cáscara es de menos de 1 centímetro o 0,5 centímetros. En otra realización, la abertura en la cáscara es sólo lo suficientemente ancha para alojar una aguja del calibre 22. Por tanto, la abertura puede ser de cualquier tamaño entre la abertura más pequeña que permitirá la inyección de una muestra o medios para disgregar el óvulo, hasta una más pequeña que el agujero requerido para colocar un óvulo fertilizado in vitro (es decir, fuera de la cáscara) de nuevo en la cáscara. "Abertura" significa un agujero que se ha hecho en algún punto del huevo después del desove. "Abertura" incluye un huevo en el que el agujero se ha sellado posteriormente. Por ejemplo, un huevo que tiene un agujero producido por una aguja usada para inyectar una muestra y luego sellado está, incluso después del sellado, incluido en la definición de huevo aviar con una abertura. El embrión puede ser nativo o no nativo respecto al huevo. "No nativo" incluye embriones desarrollados a partir de un óvulo no nativo respecto a la cáscara en la cual se ha desovado. Dos huevos preferidos comercialmente son los de pollo y pavo. Además, la invención proporciona un huevo aviar desovado que comprende un embrión y una yema nativa, en el que el embrión tiene menos de 40.000, 30.000, 20.000, 10.000, 5.000, 1.000 o 100 células, incluyendo números entre 1 y 40.000. Los pollos que eclosionan desde estos huevos pueden tener un cariotipo normal y un desarrollo normal.

Un huevo de la presente invención puede, por ejemplo, derivar de especies aviares seleccionadas del grupo formado por pollos, codornices, patos, pavos, faisanes, avestruces, emúes, gansos, pavos reales, gallos, ñandúes, papagayos, ninfas, cacatúas, periquitos, cisnes, palomas y otras aves comercialmente valiosas. En una realización más preferida comercialmente, el huevo deriva de especies aviares usadas en los métodos de la presente invención, y se selecciona del grupo formado por pollos, pavos, gansos, patos, codornices y faisanes. En una realización comercial más preferida, el huevo deriva de un pollo. El método se puede utilizar también efectivamente en especies aviares en zoos, etc., para ayudar a conservar especies en peligro.

Los métodos de la presente invención se pueden usar también para la activación de huevos de reptiles en el huevo (in ovo). Los huevos de reptiles, similares a los huevos aviares, comprenden una yema y un pronúcleo femenino y están protegidos por una cáscara cuando se depositan. Un huevo de reptil desovado, sin fertilizar, se puede activar en la cáscara según los métodos de la presente invención.

Los métodos de activación en el huevo (in ovo) descritos aquí, se pueden utilizar también conjuntamente con otros procedimientos en el huevo (in ovo). Por ejemplo, el embrión se puede vacunar después de la activación. Tales procedimientos de vacunación se conocen bien por los expertos en la técnica. Alternativamente, tal vacunación se puede producir simultáneamente con la activación en el huevo (in ovo), con la condición de que la vacuna no impida el desarrollo del embrión.

Adicionalmente, la activación en el huevo (in ovo) se puede automatizar, de forma que se activan simultáneamente múltiples huevos mediante, por ejemplo, técnicas de inyección. Por tanto, se podrían activar simultáneamente 50, 100, 200, 300 o más huevos.

El huevo desovado sin fertilizar se puede activar mediante varios métodos de activación específicos, según se expone más adelante. Los métodos de activación descritos anteriormente se pueden lograr por ejemplo con fertilización, partenogénesis y transferencia nuclear. Así, por ejemplo, según se describirá más adelante, la muestra suministrada para activación del huevo desovado sin fertilizar podría ser una muestra que comprenda esperma.

Fertilización

La presente invención proporciona un método de fertilización de un huevo aviar en una cáscara, en el que el huevo comprende una yema rodeada por una membrana, que comprende obtener una muestra de esperma que comprende esperma aviar en un vehículo fisiológicamente aceptable, y suministrar la muestra de esperma al interior del huevo, a fin de fertilizar el huevo. El procedimiento de fertilización de un huevo desovado en una cáscara se denomina aquí "fertilización dentro del huevo (in ovo)" (IOF).

El esperma de la muestra de esperma se puede obtener de un ave mediante métodos conocidos para una persona experta en la técnica, como el método de masaje abdominal, que es bien conocido para los expertos en la técnica. Este método permite la recogida de una eyaculación (semen) que comprende esperma, fluido seminal y fluido transparente. El fluido transparente es un fluido de tipo linfático que pasa desde los canales de la linfa hasta la superficie del falo durante la tumescencia fálica. El esperma aviar se puede obtener también de fuentes comerciales que son bien conocidas para los expertos en la técnica.

En una realización, el esperma de la muestra de esperma es de una única ave. En otra realización, el esperma de la muestra de esperma es una mezcla de esperma obtenida de más de un ave. Cuando se usa una mezcla de esperma de más de un ave en los métodos de la invención, la probabilidad de fertilizar con éxito el huevo puede incrementarse, porque si una de las aves de las que se ha recogido el esperma no es fértil, es posible que el esperma recogido del otro ave o aves sea capaz de fertilizar el huevo.

En una realización preferida, la muestra de esperma comprende esperma de aves que son miembros de la misma especie, y la muestra de esperma se usa para fertilizar huevos desovados por gallinas que son miembros de la misma especie como donadores de esperma. La presente invención considera también el uso de esperma de una especie y un huevo de otra especie, si el esperma es capaz de fertilizar el huevo.

Aunque se prefiere típicamente que el esperma se use en 30 minutos desde el momento de la recogida, se puede usar en los métodos de la invención esperma más viejo, e incluso esperma que se ha refrigerado o congelado previamente, siempre que el esperma conserve su capacidad de fertilizar un huevo. Cuando el esperma se tiene que usar más de 30 minutos después de su recogida, es preferible que se combine con un aditivo de esperma, según se describe más adelante.

Según se mencionó anteriormente, la muestra de esperma también comprende un vehículo fisiológicamente aceptable. Según se usa aquí, un "vehículo fisiológicamente aceptable" es un fluido en el que el esperma permanece móvil y viable. Ejemplos de un vehículo fisiológicamente aceptable incluyen, pero no están limitados a, semen inalterado, fluido seminal (bien original del esperma o añadido), fluido transparente (bien original del esperma o añadido), solución salina tamponada, aditivo de esperma, y sus combinaciones. Preferiblemente, el vehículo incluye aditivo de esperma, también denominado en la técnica diluyente. Según se mencionó anteriormente, el uso de un aditivo de esperma se prefiere especialmente cuando el esperma recogido no se va a usar para fertilización en 30 minutos tras la recogida. M.R. Bakst, en Manipulation of the avian genome, R.J. Etches y A.M. Verrinder Gibbons, redactores, CRC Press, Boca Raton, FL, págs. 15-28 (1993). Según se usa aquí, un "aditivo de esperma" es un vehículo fisiológicamente aceptable que se usa para diluir una muestra de esperma para producir una muestra de esperma de mayor volumen, en la que el esperma está menos concentrado. Preferiblemente, la composición del aditivo de esperma prolongará la vida de almacenamiento del esperma, y diluirá el esperma, a fin de incrementar el número de huevos que se pueden fertilizar por la cantidad de esperma recogida. Ejemplos de composiciones aditivas de esperma, índices de dilución sugeridos, tiempos de almacenamiento y condiciones óptimas, y fuentes de aditivo comerciales se pueden encontrar en Bakst ("Preservation of avian cells": en: Poultry breeding and genetics, R.D. Crawford (ed.) Elsevier, New York, págs. 91-108 (1990)). Otros diluyentes usados normalmente en la industria de las aves de corral son Lago Formulation Avian Semen Extender de Hygeia Biological Laboratories, Semaid Turkey Extender de Poultry Health Laboratories en Davis California, Beltsville Poultry Semen Extender de Tri Bio Laboratories, Inc. en State College, Pennsylvania. En una realización preferida, el aditivo de esperma es Avidiluent. Avidiluent es producido por IMB, calle Georges 10, 10 rue Georges, Clemenceau, BP 81, 61302 L'Aigle, Francia. Por tanto, en una realización, la muestra de esperma puede comprender espermatozoides y fluido seminal, es decir, semen. Además, la muestra de esperma puede comprender espermatozoides y fluido seminal que se diluye con un vehículo fisiológicamente aceptable, incluyendo, pero no limitado a solución salina tamponada y un aditivo de esperma.

La muestra de esperma se puede preparar también mediante métodos que estarán claros para un técnico medio en la materia, como lavar el semen de una o más aves con una solución tal como solución salina tamponada o aditivo de esperma, centrifugar la solución resultante, eliminar el sobrenadante y volver a poner en suspensión el esperma lavado en un volumen de una solución como solución salina tamponada o aditivo de semen. Un técnico medio en la materia entenderá fácilmente cómo alcanzar la concentración deseada de espermatozoides, volviendo a suspender el esperma en el volumen de solución apropiado. Por ejemplo, después de la centrifugación y eliminación del sobrenadante, el esperma envasado se puede pesar, y estimar la cantidad de espermatozoides usando valores conocidos para el peso de esperma aviar. A continuación, el esperma se puede volver a poner en suspensión en el volumen requerido para obtener la concentración de espermatozoides deseada. Alternativamente, el esperma centrifugado se puede volver a poner en suspensión después de la eliminación del sobrenadante, y luego volver a centrifugarlo, permitiendo la determinación del volumen de esperma envasado (Johnston, 1998). Posteriormente, la concentración de espermatozoides se puede calcular usando la fórmula de Maeza y Buss (Poultry Sci. 55:2059 (1976)).

Típicamente, la concentración de espermatozoides en semen de pollo es de 300 millones a 800 millones por mililitro, en semen de pavo de 800 millones a 1,5 billones por mililitro, en semen de pavo de Guinea de 400 millones a 800 millones por mililitro, en semen de pato de Pekín de 20 millones a 600 millones por mililitro. El valor estándar de espermatozoides usado para inseminación artificial es 100 millones en un volumen total de 50 microlitros. En los métodos de la presente invención, debido a que los espermatozoides se colocan directamente adyacentes al pronúcleo femenino, se requieren muchos menos espermatozoides para fertilizar el huevo. Por tanto, se puede usar sólo un espermatozoide en los métodos de la presente invención. De hecho, en la presente invención se puede usar un amplio intervalo de concentraciones de espermatozoides. En una realización, se diluye semen de pollo con un volumen igual de Avidiluent y se inyectan en un huevo aproximadamente 0,01 mililitros de esta muestra de esperma. Por tanto, aproximadamente se depositarán 1 millón de espermatozoides adyacentes al pronúcleo femenino.

En un método de la invención, la fertilización del huevo aviar en la cáscara se logra suministrando la muestra de esperma al huevo. El suministro de la muestra de esperma se puede lograr según se describió anteriormente. Un espermatozoide tiene aproximadamente 0,5 \mum en su punto más ancho y 100 \mum de longitud. Por tanto, en una realización preferida, se puede usar para inyecciones una aguja con un diámetro interno de al menos 10 \mum. En una realización, la aguja puede permanecer en la cáscara tras la inyección. Se podrían usar o adaptar varias agujas y métodos usados actualmente para la inyección de vacunas en huevos, para el suministro de esperma.

La abertura se puede realizar en cualquier lugar de la cáscara que efectúe la fertilización viable, pero se realiza típicamente en un área de la cáscara que está cerca del disco germinal. Aunque un huevo se puede manipular para colocar el disco germinal en diferentes regiones del huevo, el disco germinal en un huevo recién desovado se localiza típicamente en el extremo ancho de la cáscara, que recubre la celda de aire adyacente a la yema. Una vez creada una abertura en la cáscara, la muestra de esperma se suministra preferiblemente introduciendo la aguja, pipeta, etc., a través de la celda de aire y debajo de una membrana situada debajo de la celda de aire (membrana interna de la cáscara). El número de espermatozoides se puede incrementar o reducir, dependiendo de dónde y en qué forma se administre el esperma. En una realización adicional preferida, la muestra de esperma se suministra al huevo usando una aguja. En la naturaleza, las células espermáticas tienen que penetrar la membrana perivitelina interna y fundirse con el zona pelúcida para que se produzca la fertilización con éxito. Con la IOF, las células espermáticas tienen que penetrar también la membrana perivitelina antes de que pueda producirse la fertilización con éxito. Para incrementar la eficiencia de fertilización, se puede tratar la OPL o membrana de la yema. Se podría utilizar cualquier tratamiento que hiciese la OPL o membrana de la yema más permeable al esperma, por ejemplo, un ácido atóxico, una enzima proteolítica o la abrasión física.

En una realización, la aguja, pipeta, etc. se hace avanzar a través de la cáscara, a un ángulo de aproximadamente 15º, penetrando la membrana que recubre la cáscara. En un método de la invención, la aguja, pipeta, etc., se puede hacer avanzar a través de la celda de aire, hasta que encuentra la membrana interna de la cáscara. Una persona que ponga en práctica el método de la invención sabrá que el extremo de la aguja, pipeta, etc., ha encontrado la membrana cuando sienta una ligera resistencia al avance adicional del extremo. A medida que el extremo avanza cuidadosamente, la resistencia de la membrana cede, y se permite al extremo penetrar apenas la membrana. La muestra de esperma se puede suministrar al huevo adyacente a una región de la membrana y que está adyacente al disco germinal. Por tanto, el esperma se puede suministrar justo bajo la membrana, un procedimiento llamado inyección de esperma intracitoplasmática (ICSI). Volúmenes típicos de la muestra de esperma son tan pequeños como 0,005 ml o tan grandes como 0,10 ml. Un volumen típico de muestra de esperma inyectada es aproximadamente 0,01 ml.

Preferiblemente, para evitar la contaminación del huevo y la muerte de un embrión, la abertura en la cáscara se sella según se describió anteriormente. Según se describió anteriormente, el método de la presente invención se puede usar para fertilizar huevos desovados de especies aviares seleccionadas del grupo formado por pollos, codornices, patos, pavos, faisanes, avestruces, emúes, gansos, pavos, gallos, ñandúes, papagayos, ninfas, cacatúas, periquitos, y otras aves comercialmente valiosas.

La presente invención proporciona también un método de fertilización de un huevo aviar en su cáscara, en el que el huevo comprende una yema rodeada por una membrana y que incuba un pollo vivo, que comprende obtener una muestra de esperma que comprende esperma aviar en un vehículo fisiológicamente aceptable, suministrar la muestra de esperma al huevo, a fin de fertilizar el huevo, incubar el huevo y eclosionar el pollo vivo del huevo. Según se usa aquí, "obtener" incluye utilizar muestras de esperma prefabricadas y presuministradas.

Una vez que la muestra de esperma se ha suministrado al huevo, de acuerdo con los métodos de la presente invención según se describieron anteriormente, el huevo se incuba hasta que el pollo vivo eclosiona, según se describió anteriormente.

Según se describió anteriormente, los métodos de la presente invención se pueden usar también para fertilización dentro del huevo de huevos de reptil. Los huevos de reptil, similares a los huevos aviares, comprenden una yema y un pronúcleo femenino, y están protegidos por una cáscara cuando se ponen. Un huevo de reptil desovado, no fertilizado, se puede fertilizar en la cáscara según los métodos de la presente invención. En particular, se suministra una muestra de esperma, que comprende esperma de uno o más reptiles de la misma especie, al huevo desovado sin fertilizar, a través de una abertura creada en la cáscara y sobre la yema adyacente al pronúcleo femenino, en el que se produce la fertilización.

Según se describió anteriormente, los métodos de fertilización dentro del huevo descritos aquí, se pueden usar también conjuntamente con otros procedimientos dentro del huevo. Por ejemplo, el embrión se puede vacunar después de la fertilización. Tales procedimientos de vacunación se conocen bien por los expertos en la técnica. Alternativamente, tal vacunación puede producirse simultáneamente con la fertilización dentro del huevo, con la condición de que la vacuna no impida el desarrollo del embrión.

Adicionalmente, la fertilización dentro del huevo se puede automatizar, de forma que se fertilizan simultáneamente múltiples huevos mediante, por ejemplo, técnicas de inyección. Por tanto, 50, 100, 200, 300 o más huevos se podrían inyectar simultáneamente.

Partenogénesis

En una realización de la presente invención, la activación del huevo desovado sin fertilizar se induce por partenogénesis. Según se usa aquí, "partenogénesis" es la producción de células embrionarias procedentes de un gameto femenino, en ausencia de ninguna contribución de un gameto masculino.

En una realización preferida, la activación por patenogénesis de un huevo aviar desovado sin fertilizar se puede inducir por penetración de la membrana que rodea la yema (membrana de la yema) y el disco germinal, por ejemplo, dirigiendo una aguja de calibre 25 a través de la cáscara y hacia el huevo, para penetrar la membrana que rodea la yema. Preferiblemente, se evita la rotura de la yema. Por tanto, la penetración y disgregación de la membrana que rodea la yema puede iniciar la activación del huevo. Se considera que se pueden usar otros medios mecánicos de disgregación de la membrana que rodea la yema. Por ejemplo, se pueden usar láseres, incluyendo un láser no térmico (itrio-aluminio-granate), para disgregar la membrana que rodea la yema, en vez de usar una aguja en este procedimiento.

Existe evidencia de que es el incremento transitorio en el Ca2+ citosólico lo que inicia el programa de desarrollo del huevo. La concentración citosólica de Ca2+ se puede incrementar artificialmente, bien inyectando Ca2+ directamente en el huevo (in ovo), o mediante el uso de ionóforos que portan Ca2+, como A23187. Esto activa los huevos de todos los animales ensayados hasta el momento (Alberts, 1983). Evitar el incremento de Ca2+ inyectando el quelante de Ca2+ EGTA inhibe la activación del huevo tras la fertilización. Debido a que el incremento de la concentración de Ca2+ en el citosol es transitorio, durando sólo 2 o 3 minutos tras la fertilización, está claro que no puede intervenir en los fenómenos observados durante las etapas posteriores de la activación del huevo, incluyendo la síntesis de DNA y proteínas. En su lugar, el incremento en la concentración de Ca2+ sirve sólo para desencadenar la secuencia completa de sucesos del desarrollo; algún cambio más permanente se tiene que producir en el huevo (in ovo) mientras que la concentración de Ca2+ es elevada.

Aunque el mecanismo de activación no se comprende totalmente, está claro que el esperma sólo sirve para desencadenar un programa preestablecido en el huevo (in ovo). No se requiere el esperma en sí mismo. Un huevo se puede activar mediante una variedad de tratamientos químicos o físicos inespecíficos. Estos procesos se piensa también en general que incrementan el Ca2+ intracelular (Rickord y White, 1992). Por ejemplo, la perforación con una aguja puede activar un huevo de rana (Alberts, 1983). Ovocitos de ratón se han activado mediante exposición a medio exento de Ca2+ y Mg2+ (Surani y Kaufman, 1977), medio que contiene hialuronidasa (Graham, 1970), exposición a etanol (Cuthbertson, 1983), ionóforos o quelantes de Ca2+ (Steinhardt et al., 1974; Kline y Kline, 1992), inhibidores de la síntesis de proteína (Siracusa et al., 1978) y estimulación eléctrica (Tarkowski et al., 1970). Se ha descrito la activación de ovocitos bovinos por etanol (Nagai, 1987), estimulación eléctrica (Ware et al., 1989), exposición a temperatura ambiente (Stice y Keefer, 1992), y una combinación de estimulación eléctrica y cicloheximida (First et al., 1992; Yang et al., 1992). Estos métodos se pueden aplicar a huevos aviares desovados sin
fertilizar.

Un aplicación de la activación dentro del huevo por partenogénesis es la producción rápida de líneas endógamas puras de animales reproductores. La práctica de la industria actual implica el uso de diferentes combinaciones de líneas genitoras homozigóticas para producir productos aviares comerciales únicos. Se ha empleado mucho esfuerzo para obtener, mejorar y mantener estas líneas seleccionadas. con la partenogénesis, un gameto femenino se puede inducir a desarrollarse en un pollo vivo sin contribución genética del macho. El pollo resultante es enteramente homozigótico en cada alelo. Por tanto, se pueden crear líneas seleccionadas homozigóticas en una generación, en vez de los múltiples ciclos de endogamia requeridos hoy. Adicionalmente, el vez de usar poblaciones de aves para derivar la línea homozigótica, se puede usar un individuo superior único. Debido a que hay aves individuales en una población reproductiva que mejoran considerablemente el promedio, este método es una manera de obtener rápidamente las mejores características genéticas en el producto comercial final.

Transferencia nuclear

Las tecnologías de micromanipulación celular/transferencia nuclear se pueden utilizar para activar un huevo aviar desovado sin fertilizar. Por tanto, una realización de la presente invención considerada por separado implica el suministro de suspensiones fluidas que contienen núcleos celulares o "nucleoplastos". Se pueden generar nucleoplastos a gran escala usando ciertos procedimientos de centrifugación avanzados. En muchas especies, como ovejas, vacas y ratones, se ha determinado que se puede insertar un nucleoplasto aislado de una célula en otra célula enucleada, con el fin de generar un individuo clonado, idéntico. Según se usa aquí, "transferencia nuclear" es la inserción de un núcleo, también conocido como nucleoplasto, (bien en una célula o como un núcleo independiente de una célula), en otra célula en la que el núcleo nativo es inefectivo, p.ej., mediante eliminación o ablación. Los procedimientos aquí descritos permiten a los productores propagar eficientemente linajes genéticos de élite en bandadas comerciales y sirven como base para el desarrollo de una plataforma instrumental de transferencia nuclear automatizada.

Las etapas principales requeridas para la realización de esta estrategia son como sigue: (1) desarrollo de líneas celulares y condiciones adecuadas para el cultivo de donadores de nucleoplasto; (2) visualización y eliminación o ablación de estructuras nucleares en los huevos y/o zigotos aviares; (3) aislamiento de núcleos donadores; (4) transferencia de núcleos donadores a los huevos (citoplastos). También se puede efectuar la activación de huevos reconstituidos que conduce al desarrollo embrionario.

Células donadoras de nucleoplasto. Se ha demostrado que las células madre embrionarias y las células germinales primordiales permanecen totipotentes en el pollo y se pueden utilizar en un procedimiento NT aviar. Los pollos clonados generados de esta forma pueden ser valiosos para aplicaciones en ciertos esquemas de cría de aves de corral.

Alternativamente, las líneas celulares somáticas pueden ser ventajosas para otros escenarios de cría de aves de corral. Un factor en la selección de un tipo celular somático es su capacidad para sufrir "reprogramación". La reprogramación se puede utilizar para que el nucleoplasto contribuya a todas las líneas celulares embrionarias y, por tanto, conduzca al desarrollo embrionario normal.

Los fibroblastos embrionarios cultivados (CEF) se han utilizado ampliamente en mamíferos con buenos resultados, debido a su facilidad de cultivo y manipulación genética. Los CEF se pueden usar para transferencia nuclear de células somáticas en el sistema aviar. Alternativamente, se han cultivado y se pueden usar células blastodérmicas (BC) derivadas de embriones. Otro tipo de célula que se puede usar con la plataforma de transferencia nuclear es una célula B aviar.

Una ventaja de usar células B aviares es su capacidad de experimentar elevados niveles de recombinación. Esta capacidad puede ser importante debido a que hace que el proceso de incorporación del DNA exógeno mucho más eficiente. Las modificaciones realizadas en cualquiera de estas líneas celulares donadoras in vitro se incorporan a continuación al genoma del ave resultante. Se pueden realizar ensayos para identificar el tipo celular más ventajoso. Por ejemplo, se pueden crear nucleoplastos de estos tipos celulares y transferirse al citoplasto aviar (célula receptora). Aquellos tipos celulares que conducen al índice de supervivencia embrionaria más elevado se pueden incorporar a la plataforma de tecnología estándar.

La transferencia nuclear en mamíferos se ha realizado con éxito usando tanto huevos como zigotos, aunque se usan predominantemente los huevos para este propósito. Los procedimientos de transferencia nuclear estándar requieren típicamente la eliminación o ablación del núcleo celular existente, preferiblemente antes de la introducción del núcleo donador. Los huevos aviares son grandes, y la distancia entre un núcleo donador y el núcleo de una célula receptora es suficientemente grande para que la eliminación del núcleo de la célula receptora no se requiera estrictamente. Sin embargo, actualmente se prefiere que se produzca la enucleación.

El núcleo celular en un huevo aviar se oculta por gránulos de yema densa, haciendo que la microscopía de luz tradicional sea bastante inefectiva para la visualización. Por esta razón, el método actual elegido para enuclear huevos aviares implica el uso del marcaje nuclear fluorescente. Se pueden utilizar colorantes nucleares fluorescentes conocidos como el Hoescht 33342 (bis-benzamida) y DAPI (hidrocloruro de 4',6'-diamidino-2-fenilindol) por su capacidad para efectuar la visualización máxima del núcleo y su DNA asociado.

Se pueden utilizar dos estrategias estándar para enucleación: (1) eliminación a través de micropipeta de vidrio o (2) ablación con láseres. Ambas estrategias para micromanipulación celular se usan actualmente. El tipo de láser y la longitud de onda se pueden determinar empíricamente. La eliminación del área fluorescente en el citoplasma mediante cualquier método indicaría la eliminación del núcleo. En esta etapa se prefiere eliminar no sólo el DNA nuclear, sino también la maquinaria formadora del huso.

Varios factores influencian el desarrollo tras la transferencia nuclear, incluyendo un requerimiento de que el embrión reconstruido mantenga la ploidia normal. Cuando un núcleo se transfiere desde una célula que ha empezado a diferenciarse, el patrón de expresión genética se puede "reprogramar" desde el de un tipo celular diferenciado al de un embrión temprano. Experimentos en los que se ha variado el ciclo celular sugieren también que la eficiencia de este procedimiento se influencia tanto por la etapa del ciclo celular del donador como del re-
ceptor.

A partir de los mamíferos parece que la etapa del ciclo celular tanto de las células donadoras como receptoras influye en cuándo se produce la replicación en el embrión reconstruido. Debido a la influencia del factor estimulador de meiosis (MPF) en el citoplasma, la célula receptora puede tener una mayor influencia (Barnes et al., 1993; Campbell et al., 1993). La actividad de MPF durante la replicación puede aumentar en el momento de la formación de los husos y puede mantenerse elevada durante la metafase II. La trasferencia nuclear a un citoplasto con una concentración elevada de MPF puede estar seguida por rotura de la membrana nuclear, condensación cromosómica, nueva formación de la membrana nuclear y replicación del DNA, independientemente de la etapa del ciclo celular del núcleo donador. Como contraste, el núcleo determina si la replicación del DNA se produce a continuación de la transferencia a un ovocito con un grado bajo de actividad MPF (Campbell et al., 1993, 1994). A partir de este trabajo se cree que existen dos efectos: (1) una mayor oportunidad para reprogramar la expresión genética durante etapas específicas del ciclo celular; y (2) una ventaja de transferir a etapas similares del ciclo celular.

Se ha demostrado que el desarrollo embrionario se puede estimular cuando los núcleos celulares están en la fase G0 o G1 del ciclo celular. La oveja Dolly se desarrolló de un ovocito enucleado fusionado con una célula derivada de mamífero que se suponía que estaba en G0. Igualmente, se han usado células de Cumulus en los estados G0 y G1 para lograr la transferencia nuclear de células somáticas en ratones (Wakayama et al., 1998). Sin embargo, se han producido terneras clonadas usando núcleos de células donadoras no quiescentes (Cibelli et al., 1998). Esto indica que los requerimientos para transferencia nuclear con éxito en pollos se tienen que determinar empíricamente. Se pueden utilizar células en diversas etapas del ciclo celular para determinar el protocolo óptimo. El suministro de núcleos donadores se ha realizado a través de electrofusión de células donadoras con huevos/zigotos enucleados y vía inyección directa de núcleos donadores en huevos enucleados. Dado el gran tamaño de los huevos aviares y la facilidad de realizar las inyecciones, la inyección directa de núcleos donadores puede ser el método óptimo de suministro. Cuando la transferencia nuclear se realiza en huevos detenidos en metafase II, típicamente se requiere activar artificialmente los huevos. Esto se puede realizar a diversos intervalos de tiempo que varían desde simultáneos hasta varias horas después de la transferencia nuclear. Los mismos parámetros se pueden ensayar para el tiempo óptimo de activación.

Se puede diseñar un sistema automatizado de elevado rendimiento para realizar el procedimiento. Este tiene el potencial para eliminar una capa entera de la industria de las aves de corral, denominada "cría de multiplicación". Típicamente, en la cría de multiplicación, se necesitan varias generaciones para ir desde líneas seleccionadas a través de líneas de abuelos, líneas de padres y, finalmente, hasta las aves comerciales. Para que este proceso funcione se requieren poblaciones de aves. La IOA con transferencia nuclear puede producir el producto comercial final de una única ave superior. El efecto neto es producir bandadas de aves superiores genéticamente en una operación de cría extremadamente eficiente. Adicionalmente, las células utilizadas para transferencia nuclear o celular se pueden almacenar indefinidamente hasta que un producto comercial particular es requerido por el usuario final. Una ventaja igualmente importante sería la capacidad de producir bandadas enteras de aves unisexuales. Por ejemplo, los productores de pollos podrían requerir bandadas todas de machos para una eficiencia de crecimiento incrementada, mientras que los productores de huevos preferirían obviamente bandadas todas de hembras.

Transgénesis

La presente invención proporciona también un método para producir un embrión aviar que contiene ácido nucleico heterólogo, que comprende activar, p.ej., fertilizar un huevo aviar mediante los métodos de la presente invención aquí descritos, e introducir un ácido nucleico heterólogo en el huevo aviar. Según se usa aquí, ácidos nucleicos incluye, aunque no está limitado a, DNA, DNAc, RNA, RNAm y RNA antisentido. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios, dúplex o de múltiples hebras. Los ácidos nucleicos heterólogos pueden incluir ácidos nucleicos no nativos respecto a las especies aviares y ácidos nucleicos no expresados normalmente en la localización introducida en la célula o núcleo de las especies aviares.

Después de que un huevo aviar se ha activado por IOA, se puede acceder al embrión en desarrollo en cualquier etapa del desarrollo para manipular la composición genética de alguna o todas sus células. Para crear aves transgénicas tiene gran interés el embrión temprano. La IOA permite la transmisión de la línea germinal del ácido nucleico heterólogo, ya que permite la introducción lo más temprana posible del ácido nucleico heterólogo en el embrión aviar temprano. Esta manipulación genética del embrión en desarrollo puede, por ejemplo, producir aves transgénicas que comprenden material genético que se puede usar para modular DNA endógeno y su expresión, y crear células que pueden fabricar proteínas comercialmente valiosas para uso comercial.

La transferencia de un ácido nucleico al genoma aviar se puede realizar por una persona experta en la materia, según diversos métodos conocidos. (Harlow y Lane, Antibodies: A laboratory manual, Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Lennette et al., Manual of clinical microbiology, edición 14, Amer. Soc. for Microbiology, Washington, D.C., 1985; Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, 2ª edición, Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,1989; Antisense RNA and DNA, editor D.A. Melton, Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988); Freshney, Culture of animal cells, A manual of basic technique, 2ª edición, Alan R. Liss, Inc., New York (1987); Centers for Disease Control Laboratory Manual, U.S. Department of Health, Education, and Welfare, nº de publicación 79-8375, pág. 75, Centers for Disease Control, Atlanta, GA; Fundamental Virology, 2ª edición, Bernard N. Fields y David M. Knipe, editores jefe, Raven Press: New York, 1990). Ejemplos de métodos de transferencia de material genético al genoma aviar incluyen, pero no están limitados a, transgénesis en la que interviene la transducción del virus de la leucosis aviar (ALV), transgénesis en la que interviene un transposón, transgénesis en la que interviene una célula blastodérmica, transgénesis en la que interviene una célula germinal primordial y transferencia nuclear. El ácido nucleico heterólogo se puede introducir en el embrión y al mismo tiempo que se produce el suceso de activación, p.ej., al mismo tiempo que la muestra de esperma se introduce en el huevo, o en una etapa posterior del desarrollo embrionario.

Un método estándar usado actualmente para producir aves transgénicas es producir partículas transductoras derivadas de ALV, deficientes para replicación, que comprenden un inserto de DNA heterólogo. Debido a que las partículas no son capaces de replicarse en el ave, no hay riesgo de originar viremia y enfermedad en el ave o en seres humanos. Las partículas transductoras se pueden administrar directamente al huevo desovado que comprende el embrión aviar temprano, usando los métodos aquí descritos. Por ejemplo, se puede generar una ventana justo encima del embrión y las partículas transductoras se pueden introducir en la cavidad subgerminal del embrión. A continuación, se sella la ventana y los huevos se colocan en incubadoras para su desarrollo.

Otro método usado para transferir ácido nucleico heterólogo al genoma aviar es la transgénesis en la que interviene un transposón. Los transposones son elementos genéticos que son capaces de translocarse o de moverse dentro del genoma de sus especies hospedadoras. No se conocen transposones que existan en especies aviares. Sin embargo, se ha mostrado que ciertos transposones, reconstruidos desde otras fuentes, son capaces de funcionar en el genoma aviar. Estos transposones se pueden construir mediante ingeniería genética para servir como sistemas de vectores de ácido nucleico útiles para insertar genes en el genoma aviar.

Además, otro método para introducir DNA heterólogo en el embrión aviar es la transgénesis de células blastodérmicas. Las células blastodérmicas u otras células tempranas se pueden extraer de embriones en la etapa X (etapa embrionaria en la cual se pone el huevo fertilizado) y se pueden inyectar de nuevo en los embriones receptores, en los colonizan y crecen, produciendo pollos quiméricos. Un pollo "quimérico" está compuesto por células de dos linajes genéticos diferentes. Las células blastodérmicas inyectadas en embriones hospedadores irradiados en seguida después de su aislamiento, tienen la capacidad de contribuir a todos los tejidos del ave resultante, incluyendo la línea germinal (células que originan los espermatozoides y huevos y, por tanto, a todas las generaciones siguientes). Las células blastodérmicas se han cultivado y transfectado con DNA mediante varios métodos conocidos para los expertos en la técnica, en un intento de generar aves de corral transgénicas.

Por tanto, se pueden inyectar células blastodérmicas o células madre embrionarias (ES) en un embrión fertilizado en el huevo (in ovo), para crear aves de corral transgénicas. Estas aves de corral transgénicas se pueden cruzar y, asumiendo que presentan transmisión por línea germinal de las células blastodérmicas o ES, se puede crear un clon de la célula original inyectada.

Además, se puede usar transgénesis en la que intervienen células germinales primordiales, para crear aves transgénicas. A medida que el embrión en desarrollo crece, ciertas células se destinan a la línea germinal, para originar los espermatozoides y huevos. Estas células germinales primordiales (PGCs) migran al surco genital de la gónada en desarrollo, donde quedan latentes hasta que el ave alcanza la madurez sexual. Un enfoque para la transgénesis aviar es aislar estos PGCs, manipularlos genéticamente, y colocarlos de nuevo en un embrión en desarrollo para su desarrollo continuo. Este enfoque técnico es comparable al enfoque de la célula blastodérmica, tanto en el grado en el que se desarrolla, como en sus aplicaciones potenciales. Se ha demostrado que las células germinales primordiales contribuyen a la línea germinal cuando se inyectan en embriones receptores, como se habían inyectado las células blastodérmicas.

Otro aspecto de la presente invención implica el suministro de formulaciones líquidas al huevo aviar, que proporcionan información vital acerca del estado o constitución genotípica del ave individual. Por ejemplo, se podrían suministrar sondas de DNA y/o RNA al huevo aviar, con el fin de separar embriones por sexo o cualquier otro genotipo. Estas sondas se unen específicamente a sus secuencias diana, y proporcionan información específica acerca de la constitución genética del ave. El marcaje de las sondas con diversas moléculas fluorescentes, radioactivas o quimioluminiscentes, proporciona una tecnología altamente fiable para determinar el estado genotípico. Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos u otras proteínas de forma similar, como moléculas informadoras.

El uso de la presente invención incorpora ácidos nucleicos en ovocitos de una sola célula y los embriones tempranos permiten la incorporación de DNA exógeno en todas o la mayoría de las células del ave resultante. Sin embargo, en una realización alternativa, la presente invención se puede adaptar para suministrar estos ácidos nucleicos y vectores de ácidos nucleicos a embriones de la etapa tardía. Un protocolo actual para la producción de aves de corral transgénicas implica la inyección de partículas víricas en la cavidad subgerminal de embriones aviares en desarrollo. Otra aplicación será para la expresión transitoria de un producto génico particular en el embrión aviar. Las formulaciones de ácidos nucleicos se podrían suministrar con el intento específico de generar sistemas de biorreactores basados en huevos y/o animales. Se podrían suministrar también proteínas, antígenos y anticuerpos al embrión, a fin de afectar a la expresión génica.

Los métodos de activación en el huevo (in ovo) aquí descritos, se pueden utilizar también conjuntamente con otros procedimientos en el huevo (in ovo). Por ejemplo, el embrión se puede vacunar tras la fertilización. Alternativamente, tal vacunación puede suceder simultáneamente con la fertilización en el huevo (in ovo) con la condición, sin embargo, de que la vacuna no impida el desarrollo del embrión.

Automatización

La IOA se puede automatizar, de manera que se fertilicen múltiples huevos simultáneamente mediante, por ejemplo, técnicas de inyección. Por tanto, se pueden inyectar 50, 100, 200, 300 o más huevos simultáneamente. Quedará claro para los expertos en la técnica que los métodos de la presente invención se pueden aplicar fácilmente a una operación industrial a gran escala, usando la automatización para activar huevos recién puestos. Consecuentemente, un aparato que se haya usado previamente para, por ejemplo, inmunizar huevos puestos fertilizados, se puede adaptar para introducir en su lugar una muestra de esperma, núcleo, o se puede adaptar para partenogénesis, a fin de automatizar el procedimiento de IOA.

Como podrá apreciar un experto en la materia, las tecnologías automatizadas de manipulación de huevos se han desarrollado simultáneamente por varios inventores independientes a través del mundo. Las tecnologías existentes hoy en día implican sistemas de elevado rendimiento para inyectar sustancias líquidas en huevos con embriones aviares. Ejemplos incluyen la inyección de vacunas para mejorar el estado inmunológico de los pollos resultantes, inyección de virus para la producción de vacunas humanas y animales, y la inyección de proteínas para influenciar la salud, crecimiento y similares del pollo. Otro sistema automatizado útil para la producción de aves de corral permite la detección de embriones de pollo vivos frente a muertos, basada en iluminar con diversas fuentes de luz o diferenciales de temperatura entre huevos vecinos, en una superficie ópticamente plana de un huevo. Estas tecnologías, consideradas conjuntamente, representan el estado actual de la técnica en este campo. Sin embargo, existe la necesidad de una plataforma más avanzada, adaptada específicamente a las necesidades de los criadores aviares, necesidad que aborda y satisface la presente invención.

El progreso reciente en el área de la conservación de esperma, junto con la aparición de la tecnología IOF, han hecho posible avanzar hacia un modelo de organización mucho más eficiente para operaciones de cría de aves de corral. Varias de las tecnologías genéticas importantes descritas más adelante se pueden conectar entre sí para crear un plataforma verdaderamente versátil para la automatización de las tecnologías de cría de aves de corral.

A fin de realizar la IOA, p.ej., IOF, de forma automatizada, se consideran dos etapas. La primera etapa implica calcular el número de células de espermatozoides en la muestra de esperma, o muestra que contiene núcleo que contiene material para transferencia, que se carga en la máquina. Esta tarea se puede lograr mediante el uso de una unidad espectrofotométrica integrada (llamada algunas veces densímetro), similar a las comercializadas por Animal Reproduction Systems de Chino California y otras. Esta tarea se puede realizar también mediante un citómetro de flujo. La información obtenida de este análisis se comunica a una unidad procesadora central u otro sistema analizador, en el que se determinan los volúmenes óptimos de esperma y de aditivo de semen (diluyente), o células de material nuclear. Esta información se comunica luego a un mecanismo suministrador de fluido, produciendo los volúmenes de fluido correctos a suministrar en un recipiente de fluido central de un mecanismo de inyección de huevos, o sistema similar.

Para la segunda etapa, la unidad de tratamiento central activa el mecanismo de inyección de huevos, que suministra la cantidad adecuada de la muestra de esperma diluida células o núcleos que contienen la formulación de material, al huevo sin fertilidad, a la profundidad específica y en el ángulo adecuado para lograr la IOA, p.ej., IOF. El procedimiento de inyección incluye la perforación de la cáscara del huevo mediante un punzón tubular y la inserción de una aguja de inyección a través de la membrana de la cáscara y, posiblemente, de la membrana de la yema, para suministro de la formulación de la muestra.

El mecanismo de inyección del huevo puede tener un diseño similar a los fabricados y comercializados por Embrex, Inc., Merck Inc., y otros en la industria. Como ejemplo, en la patente de EE.UU. Nº 4.903.635, titulada "High speed automation injection aystem for avian embryos", que se incorpora aquí mediante referencia, se describe un diseño. Según se describe en la patente, el dispositivo descrito es un sistema de inyección automatizado de alta velocidad para embriones aviares, que puede inyectar huevos con sustancias fluidas, específicamente con un fluido inoculante. La máquina incluye dispositivos de succión, que levantan los huevos fuera de sus alojamientos en superficies, más que empujarlos, antes de inyectarlos. Por tanto, la máquina proporciona mecanismos y dispositivos separados, para formar primeramente una abertura en la cáscara del huevo, y luego inyectar el embrión aviar o el medio circundante con una sustancia fluida, evitando el uso de una única aguja o punzón, para perforar la cáscara de un huevo y suministrar sustancias fluidas al interior del huevo. Como se conoce también en la técnica, la presente invención considera también el uso de una aguja única para perforar la cáscara y suministrar sustancias fluidas. Otras patentes relevantes que describen la inyección de fluidos en huevos incluyen las patentes de EE.UU Nº^{s} 5.900.929, titulada "Method and apparatus for selectively injecting poultry eggs"; 5.722.342, titulada "Ovo antibiotic and microbial treatment to diminish Salmonellae populations in avians"; 5.699.751, titulada "Method and apparatus for in ovo injection"; 5.438.954, titulada "Method and apparatus for early embrionic in ovo injection"; 5.339.766, "Method of introducing material into eggs during early embrionic development"; 5.176.101, "Modular injection system for avian embryos"; 5.158.038, "Egg injection method, apparatus and carrier solution for improving hatchability and disease"; y 5.136.979, "Modular injection system for avian embryos", todas las cuales se incorporan aquí mediante referencia. En la realización más simple para IOF, el esperma se sustituye por antígeno en estas máquinas, y la profundidad de inyección se ajusta para lograr la IOF.

El proceso de IOA, p.ej. IOF, permite diseñar sistemas capaces de un funcionamiento de elevado rendimiento para la activación, p.ej., fertilización, de huevos aviares, después de que alcancen el criadero. Ventajosamente, la presente invención para IOF requiere cantidades mucho más pequeñas de esperma para este enfoque de fertilización directa, permitiendo funcionamientos de líneas de flujo, reduciendo drásticamente el número de machos en el esquema de cría. Los machos restantes se podrían alojar centralmente, suministrándose suficiente esperma reciente directamente al criadero para fertilizar los billones de huevos incubados en la industria cada año. El uso de menos machos permitiría a los criadores realizar progresos genéticos más rápidos en la mejora de sus líneas, usando sólo los ejecutores muy de élite para las inseminaciones. Además, la infraestructura de la industria se podría volver a racionalizar, basándose en la eliminación o reducción significativa de machos. Por ejemplo, se podrían sustituir los dispositivos de incubación de huevos existentes por una operación de puesta de huevos mucho más eficiente comercialmente, ya que sólo se requieren huevos sin fertilizar. En los programas de inseminación artificial, en los que las hembras representan de aproximadamente noventa y cinco a noventa y ocho por ciento(95-98%) de la bandada, sería posible eliminar la necesidad de inseminación manual y, por tanto, eliminar aproximadamente alrededor de noventa y cinco por ciento (95%) de los requerimientos de trabajo actuales asociados con estos programas.

Para la activación automatizada mediante transferencia nuclear, se puede adaptar adicionalmente el mecanismo de inyección del huevo, para incluir medios para hacer inefectivo el núcleo nativo. Por ejemplo, el mecanismo puede incluir una micropipeta o láser para eliminar o hacer inefectivo el núcleo nativo.

Además de la activación, p.ej., vía fertilización, se considera que la presente invención incluye asimismo los procedimientos de análisis genético, manipulación y propagación. Como apreciará un experto en la materia, estas herramientas se diseñan actualmente para uso de laboratorio, requiriendo técnicos altamente cualificados y, consecuentemente, no han sido prácticas hasta la fecha para su uso rutinario en la industria de aves de corral de pequeño margen. Según se aplican en la presente invención, muchas de estas tecnologías son susceptibles de incorporación en una plataforma totalmente automatizada para uso por personal de producción, así como genetistas y otros investigadores.

La presente invención se puede diseñar para incluir mecanismos y etapas adicionales para suministrar varias formulaciones líquidas destinadas a (a) fijar expresión genética en el embrión aviar conjuntamente con y/o posteriormente a la activación en el huevo (in ovo), p.ej., IOF, y/o (b) proporcionar información vital, como el estado genotípico del embrión. El aparato de suministro puede ser similar a los mecanismos de inyección del huevo para suministro de esperma analizados anteriormente. La presente invención puede emplear un recipiente de fluido común con el esperma o un recipiente separado, independiente del esperma, en el que se insertan agujas separadas en el huevo (in ovo) para cada fluido, o los fluidos se inyectan secuencialmente a través de una única aguja insertada en el huevo
(in ovo).

La presente invención considera también la incorporación de un mecanismo de detección para ayudar en varios tipos de análisis genéticos y basados en proteínas. Una realización de este mecanismo incluiría el uso de una fuente de luz de longitud de onda apropiada como, por ejemplo, un láser y un conjunto de colorantes expresado de forma diferencial en el huevo aviar como indicador de ciertos estados genotípicos o fisiológicos. Por ejemplo, esta realización podría clasificar los huevos por sexo utilizando sondas de sexaje marcadas con fluorescencia, promotores ligados al sexo y sistemas de expresión, anticuerpos de sexaje marcados con fluorescencia y similares.

El mecanismo de detección puede usar, por ejemplo, una cámara CCD u otro detector adecuado o señales fluorescentes para activar un mecanismo clasificador y/o identificador. En otra realización, el mecanismo de detección podría utilizar un contador de centelleo para métodos de detección basados en radioactividad y/o quimioluminiscencia, para los mismos fines generales descritos anteriormente. En otra realización adicional, el sistema podría utilizar "genechip", una micromatriz genética o tecnologías de macromatrices genéticas para fines de detección, un ejemplo de lo cual se produce por la compañía Affymetrix.

Como puede apreciar un experto en la materia, la clasificación de aves según su genotipo se puede usar en operaciones de producción. La clasificación de aves por sexo permite la optimización de la capacidad de producción. Es decir, los machos se desean en la industria de los pollos de carne, mientras que las hembras se desean como ponedoras. Asimismo, la presente invención, con la condición de una capacidad mejorada de los genetistas para realizar selecciones genéticas basadas en la identificación y genotipado de huevos a alta velocidad, produce un progreso genético más rápido hacia el desarrollo de líneas de aves de corral mejoradas.

Independientemente del tipo de detección utilizada para la clasificación genotípica, otro diseño considerado implica la clasificación de cada huevo como "vivo" o "muerto". También se consideran para este procedimiento mecanismos simples de luz y/o temperatura, como incorporados en sistemas existentes por PAS Reform, Breuil y Embrex. Para este aspecto de la presente invención, se incorpora aquí mediante referencia la patente de EE.UU. Nº 5.900.929.

Acoplado con los dispositivos de clasificación descritos más adelante, la presente invención inyecta la formulación líquida que proporciona una invención predeterminada, y su detección proporciona una plataforma versátil para cualquier tipo de aplicación de detección molecular.

Otra realización adicional de la presente invención incorpora un dispositivo de muestreo líquido para obtener muestras líquidas de los huevos aviares. este diseño usa una línea de vacío en comunicación con una aguja de muestreo, cuyo extremo se mueve alternativamente para rodearse de la parte líquida de un huevo aviar respectivo y luego eliminarse del mismo. Alternativamente, el diseño puede usar un gradiente electroosmótico, similar al utilizado en el analizador genético PE Biosystems 310, para extraer muestras fluidas hacia un capilar de muestreo.

A fin de utilizar lo máximo posible el mecanismo o mecanismos de detección descritos anteriormente, puede ser necesario en ciertos momentos amplificar la señal mediante diversas técnicas. Una realización para la amplificación de una señal de detección podría ser la incorporación de una unidad de ciclación térmica integrada, como las producidas por PE Biosystems, Hybaid MJ Research y otras, para amplificación de DNA. Este dispositivo sería importante, si no esencial, para el uso de dispositivos de genotipado basados matrices de genes, micromatrices y macromatrices, analizados anteriormente.

Para obtener información más detallada acerca de las muestras que se están analizando, se considera también separar las moléculas de la muestra, basándose en el tamaño, peso molecular, carga eléctrica u otras propiedades químicas y/o físicas. Una realización de este mecanismo de separación es una unidad de electroforesis. Por ejemplo, se podría utilizar una unidad de electroforesis capilar integrada como el analizador genético 310 producido por PE Biosystems o similar al mismo, para separar tanto ácidos nucleicos como proteínas. Esta realización de la presente invención podría ser útil, por ejemplo, para el genotipado de elevado rendimiento de huevos de líneas seleccionadas de aves de corral de un criador primario.

Por último, los datos obtenidos de las realizaciones anteriores, bien individual o colectivamente, se pueden tratar mediante programas informáticos en una unidad de procesamiento central u otro dispositivo, para evaluar el valor y estado de los huevos a medida que salen de la línea de tratamiento. Los huevos evaluados se pueden marcar, clasificar y transferir a cestas o bandejas de incubación consecuentemente.

El marcaje se puede realizar mediante un mecanismo de chorro de tinta, similar al que se encuentra actualmente en impresoras de Hewlett Packard y Epson. La clasificación y transferencia de los huevos se puede realizar mediante copas de succión automatizadas y cintas móviles que transportan bandejas de huevos a través del cuerpo de instrumento y hasta los carros de huevos en espera. Los mecanismos para esta parte del instrumento podrían usar diseños similares a los sistemas fabricados y comercializados por Breuil, Kuhl Corporation, Pas Reform y
Embrex.

La plataforma instrumental que se está describiendo aquí, se beneficiaría asimismo de ciertas capacidades existentes de análisis genético/de proteínas. Incorporando directamente las capacidades de análisis en la plataforma, estos procedimientos se podrían realizar a alta velocidad y a escala industrial. Se describen ejemplos en los que estas capacidades de análisis serían aplicables directamente a la industria de aves de corral comerciales.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los técnicos en la materia una exposición completa y descripción de cómo se realizan los métodos aquí reivindicados, se intenta que sean solamente ejemplares de la invención y no están destinados a limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención. Se han realizado esfuerzos para asegurar la precisión en cuanto a valores (p.ej. cantidades, temperatura, etc.) pero se puede responder de algunos errores y desviaciones. A no ser que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, la temperatura está en ºC y la presión es atmosférica o próxima a la misma.

Ejemplo 1

1. Se desinfectaron cuarenta y tres huevos de pollo Barred Rock recién puestos, sin fertilizar, empapando las cáscaras con peróxido de hidrógeno al 3% y se colocaron en caballetes.

2. Se obtuvo esperma de 4 gallitos Barred Rock en la misma mañana y se recogió en viales Vacutainer®, menos de 1 hora antes de realizar el procedimiento de fertilización.

3. Se agrupó el esperma de los 4 gallitos y se mezcló con 1 ml de Avidiluent®.

4. El esperma mezclado con Avidiluent® se succionó en una jeringa de 1 ml a través de una aguja de calibre 3,09 cm, para formar una muestra de esperma.

5. La aguja creó una abertura en el extremo ancho, romo de la cáscara de huevo y pasa a través de la abertura a un ángulo de 15º respecto a la superficie de la cáscara.

6. La aguja se hizo pasar a través de la celda de aire, hasta que el extremo penetró en la membrana que rodeaba la yema y el disco germinal.

7. Se inyectó una gota, 0,05 ml, de la muestra de esperma sobre la superficie de la yema adyacente a la membrana

8. La aguja unida a la jeringa se extrajo del huevo.

9. La abertura creada en la cáscara por la aguja se parcheó con un pequeño trozo de cáscara, y el parche se aseguró a la cáscara con un adhesivo como cola de Elmer®.

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10. Los huevos se colocaron en incubadoras de tipo comercial mantenidas a -173,65ºC y 80% de humedad desde el día 1 hasta aproximadamente el día 18 de la incubación. Los huevos se rotaron según métodos conocidos en la técnica y usados en incubadoras comerciales.

11. El día 19, los huevos se transfirieron a nacedoras comerciales, y se mantuvieron a -174,65ºC y 80% de humedad hasta la eclosión.

Diez días después de realizar el método de fertilización de la presente invención en 43 huevos, se realizó la observación rutinaria al trasluz de los huevos, para determinar qué huevos se habían fertilizado con éxito. Treinta y cinco huevos de los 43 se habían fertilizado. De los 35 huevos fertilizados, 32 se llevaron con éxito hasta la eclosión, y todos los pollos menos uno estaban sanos. Por tanto, 72% de los 43 huevos desovados tratados por el método de fertilización de la presente invención producían un pollo vivo sano.

Ejemplo 2 Datos sobre gallinas ponedoras de huevos morenos comerciales "Hy-line Variety Brown"

1. Se recogieron 270 huevos recién puestos a las 6:30 de la mañana.

2. Se recogió semen inmediatamente de machos Black Giant en diluyente, en una proporción 50:50.

3. Los huevos y el semen se suministraron al laboratorio en 20 minutos desde la recogida del semen.

4. Los huevos se dividieron en dos grupos, experimental y testigo negativo, con 135 huevos cada uno.

5. Los huevos experimentales se inyectaron como se describió previamente con 10 \mul de la preparación de semen diluida.

6. Los testigos negativos no se inyectaron.

7. Los huevos inyectados se sellaron con sellador de silicona y se colocaron en la incubadora, como se describió previamente.

8. La fertilidad se supervisó después de 5 días y se registró.

9. Se determinó que 33 de los 135 huevos (24%) eran fértiles en el grupo experimental. Ninguno de los huevos testigo negativos mostraba señales de desarrollo.

Ejemplo 3 Partenogénesis

1. Se recogieron 270 huevos recién puestos por la mañana.

2. Los huevos se dividieron en grupos experimental y testigo negativo, de 135 cada uno.

3. Se realizó una abertura de 2-3 mm a través de la cáscara del huevo y de las membranas de la cáscara, de forma que la yema fuese visible.

4. La membrana que rodea la yema y el disco germinal se picó y/o penetró suavemente, teniendo cuidado de no romper la yema. (Alternativamente, la creación de la abertura y penetración de la membrana de la yema se puede realizar al mismo tiempo, insertando simplemente una aguja de jeringa de calibre 25 a través de la cáscara y en la yema).

5. Los huevos tratados así se sellaron a continuación con sellador de silicona, y se colocaron en la incubadora.

6. Se supervisó el desarrollo de los huevos a los 5 días, y se registraron las velocidades de desarrollo antes de devolverlos a la incubadora.

7. Se dejó que los huevos se desarrollaran hasta la eclosión, registrándose entonces las velocidades de eclosión y las condiciones de salud.

Resultados

1. Los huevos con la yema rota se desecharon, quedando 131 huevos experimentales y 135 testigos negativos.

2. Se supervisó el desarrollo después de 5 días, mostrando 7 de los 131 huevos picados (5%), señales obvias de desarrollo embrionario.

3. De los 7 huevos que mostraban desarrollo embrionario, 5 eclosionaron produciendo pollos sanos normales.

4. Ninguno de los grupos testigo negativos mostraba señales de desarrollo embrionario.

Será obvio para los expertos en la técnica que se pueden realizar diversas modificaciones y variaciones en la presente invención, sin apartarse del alcance o espíritu de la invención. Otras realizaciones de la invención serán obvias para los expertos en la materia, teniendo en cuenta la memoria y la puesta en práctica de la invención descrita en la misma. Se pretende que la memoria y los ejemplos se consideren sólo como ejemplares, estando indicado el alcance verdadero y el espíritu de la invención por las reivindicaciones.

Claims (47)

1. Método para producir un pollo vivo a partir de un huevo aviar desovado sin fertilizar en su cáscara, en el que el huevo comprende una yema rodeada por una membrana y un óvulo, que comprende activar el óvulo e incubar el huevo hasta la eclosión.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la activación se produce induciendo partenogénesis en el huevo aviar.

3. El método de la reivindicación 2, en el que la partenogénesis se induce mediante penetración de la membrana de la yema.

4. El método de la reivindicación 3, en el que la penetración se logra mediante una aguja.

5. El método de la reivindicación 1, en el que la activación se logra suministrando una muestra de esperma, que comprende esperma aviar en un vehículo fisiológicamente aceptable, al huevo.

6. Un método de fertilización de un huevo aviar desovado en su cáscara, en el que el huevo comprende una yema rodeada por una membrana, que comprende:

a)

obtener una muestra de esperma que comprende esperma aviar en un vehículo fisiológicamente aceptable; y

b)

suministrar la muestra de esperma al interior del huevo, de forma que el huevo se fertilice.

7. El método de la reivindicación 5 o 6, en el que el huevo y el esperma derivan de miembros de la misma especie.

8. El método de la reivindicación 6 o 7, en el que la muestra de esperma comprende una mezcla de esperma obtenida de más de un ave.

9. El método de la reivindicación 5 o 6, en el que el vehículo es fluido seminal.

10. El método de la reivindicación 5 o 6, en el que el vehículo es fluido seminal diluido.

11. El método de la reivindicación 10, en el que el fluido seminal diluido comprende Avidiluent.

12. El método de la reivindicación 6 o 7, en el que el suministro de la muestra de esperma se logra creando una abertura en la cáscara, mediante penetración de la cáscara e introducción de la muestra de esperma en el huevo.

13. El método de la reivindicación 12, en el que la penetración e introducción se logran con una aguja.

14. El método de la reivindicación 12, en el que la abertura se sella.

15. El método de la reivindicación 14, en el que la abertura se sella con un adhesivo.

16. El método de la reivindicación 6 o 7, en el que la muestra de esperma se suministra adyacente a una membrana que rodea la yema.

17. El método de la reivindicación 16, en el que la muestra de esperma se suministra adyacente a una región de la membrana que es adyacente al disco germinal.

18. El método de la reivindicación 6 o 7, en el que la muestra de esperma se suministra debajo de la membrana.

19. El método de la reivindicación 6 o 7, en el que la membrana se trata de forma que permita al esperma fertilizar el huevo.

20. El método de la reivindicación 6, que comprende adicionalmente tratar la membrana con un ácido atóxico, una enzima proteolítica o abrasión física, para incrementar la eficiencia de fertilización.

21. El método de la reivindicación 6 o 7, en el que la especie aviar se selecciona del grupo formado por pollo, codorniz, pato, pavo, faisán, avestruz, ganso y ñandú.

22. El método de la reivindicación 1 o 21, en el que la especie aviar es pollo.

23. El método de la reivindicación 1, en el que la especie aviar es pavo.

24. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 6 y 7, en el que se activan o fertilizan múltiples huevos sustancialmente de forma simultánea.

25. El método de la reivindicación 24, en el que se activan o fertilizan al menos 20 huevos.

26. El método de la reivindicación 24, en el que se activan o fertilizan al menos 50 huevos.

27. El método de la reivindicación 5, en el que el huevo es un huevo de pollo, y la incubación del huevo tarda de 21 a 23 días.

28. El método de la reivindicación 5, en el que la incubación se realiza a una temperatura de aproximadamente 37,5ºC desde el día 1 hasta aproximadamente el día 18 de incubación, y a una temperatura de aproximadamente 36,94ºC desde aproximadamente el día 19 de incubación hasta la eclosión.

29. El método de la reivindicación 5, en el que la incubación se realiza al 80% de humedad desde el día 1 hasta la eclosión.

30. El método de la reivindicación 5, que comprende además la vacunación del embrión durante la incubación.

31. El método según la reivindicación 1 o 5, que comprende además introducir ácido nucleico heterólogo en el huevo aviar, produciendo un embrión aviar que contiene ácido nucleico heterólogo.

32. El método de la reivindicación 31, en el que el ácido nucleico heterólogo codifica una proteína farmacéutica, un antígeno, una hormona o un anticuerpo.

33. El método de la reivindicación 31, en el que el ácido nucleico heterólogo comprende partículas transductoras derivadas del virus de la leucemia aviar.

34. El método de la reivindicación 31, en el que el ácido nucleico heterólogo codifica una proteína.

35. El método de la reivindicación 31, en el que el ácido nucleico heterólogo está integrado de forma estable en el genoma aviar.

36. Un huevo aviar desovado que comprende un embrión con menos de 30.000 células, en el que el embrión se puede desarrollar formando un pollo vivo.

37. El huevo de la reivindicación 36, en el que la cáscara de huevo tiene una abertura de menos de 4 centímetros.

38. El huevo de la reivindicación 36 o 37, en el que el embrión tiene menos de 20.000 células.

39. El huevo de la reivindicación 36 o 37, en el que el embrión tiene menos de 10.000 células.

40. El huevo de la reivindicación 36 o 37, en el que el embrión es un zigoto.

41. El huevo de la reivindicación 37, en el que se sella la abertura.

42. El huevo de la reivindicación 37, en el que la abertura es inferior a 1 centímetro.

43. El huevo de la reivindicación 37, en el que la abertura es inferior a 5 milímetros.

44. El huevo de la reivindicación 37, en el que el embrión tiene menos de 20.000 células y en el que la abertura es inferior a 1 centímetro.

45. El huevo de la reivindicación 37, en el que el embrión es un zigoto y en el que la abertura es inferior a 1 centímetro.

46. El huevo de una cualquiera de las reivindicaciones 36-45, en el que el embrión es un embrión nativo.

47. El huevo de una cualquiera de las reivindicaciones 36-46, en el que el huevo es un huevo de pollo.