TWI314163B

TWI314163B - In ovo activation of an avian egg in the shell

Info

Publication number: TWI314163B
Application number: TW090103415A
Authority: TW
Inventors: Cantrell Timothy; Wooten Andrew
Original assignee: Ovo Biosciences Inc
Priority date: 2000-02-15
Filing date: 2001-02-15
Publication date: 2009-09-01
Also published as: US20070261128A1; US7481179B2; DE60118535T2; US7237505B2; US6573097B2; CN1423521A; EP1265984A2; US20010027569A1; CA2400399C; PT1265984E; CN1240272C; MXPA02007913A; MY119970A; WO2001060978A3; ES2258074T3; US20010039668A1; DE60118535D1; EP1129617A1; AU3841301A; JP2003523198A

Description

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五、發明說明（1 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本申請書係聲請2000年2月15g申請之us臨時申請筹 S.N. 60/182,432，及2〇〇〇年2月16日申請iUs臨時專利寺請案S.N. 6〇/182,969之優先權。發明背景發明範圍本發明係關於鳥類繁殖之領域。特定言之，本發明提供一種於殼中活化卵之方法。本發明亦提供一種於殼中活介卵之方法，藉此可孵化出活的小鳥。技藝背景傳統育種一般而言，家禽工業中育種之進行係藉由下列兩種系統中之一種：地板育種計劃。第一種系統稱爲"地板育種”且其被用以生產大多數之商業化解化印。於此系、统中，❹地將雄性以典型的介於1〇至15%之比例加入雌性群體中。地板育種系統雖然效率低，但爲目前用以生產孵化卵之低成本系統，因爲其勞力需求較競爭系統爲低。平均孵化率之範園由燒烤用惑嫩禽種禽之約83%至產卵種禽之92〇/〇。雖然此系统成爲家禽工業之讀已有多年之久，但其具有許多限制性。丨i、對繁殖能力：地板育種已不再實施於火難，由於對提高其產肉率之強勢篩選，故已無法經由自然交配而得到商業化之火難品種。相同之趨勢亦可見於燒烤用之嫩禽。對於較大燒烤用嫩禽之篩選需於出生率及交配能力上取得折衷且預期上，當體重增加時，出生率會持續下降。此=

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1314163 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製、發明說明（2 ) 於家禽生產者而言是一種困境，因爲出生率降低會直接對其根底產生負面之衝擊。抶用廢棄物之移除：自然交配必需於堅實地板上進行以免傷害琢鳥類。此等設計需求已預先排除自動化廢棄物移除系統之使用並必需於連續之鳥群間進行人工清掃。此於減少設備有效利用之同時，亦增加勞力及過多之成本。卵之生產及品質：因爲直至收集時間爲止，卵均與禽群一起存在於屋内’·卵經常會受到灰塵及排泄物之污染，其可能降低孵化率。此外，通常生產於地板屋内之卵有3至5% 會直接產於地板上而非產在所提供之產卵箱中且必需丟棄之。無效2間及設備之利用：將雄性及雌性一起維持於地板屋中必需設置兩套獨立的餵養及給水系統，因爲每種性別工營養及生產需求不同。其亦需設置產卵箱及自動集卵系統此等5又備均會佔據屋内有限之地板空間。因爲此等理由，故地板飼育法與籠架系統相較之下，並未對屋内空間及設備作有效之利用D 死C率及出生率：有侵略性的雄禽喜歡打鬥，故導致較雄禽叱ΤΓ率。雄禽平均死亡率爲於地板屋之13%相對於龍屋I2%。於交配期間，雄禽對雌禽之侵略使得雌禽之死 ΤΓ率逐漸提咼，出生率降低，且縮短產卵週期之長度。隨著族群中之雄禽老化，出生率開始降低。標準的解決方式係以年輕雄禽"滲透"入族群中以改善出生率。然而，此會引發另一回合之爭鬥而使得短期内之出生率下降且死亡率本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公楚） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製升高。疾病較普遍發生於地板屋中，因爲鳥病微生物之墊物及廢棄物之恆常接觸。、葛藏勤降低之飼料轉化率：铜料成本控管爲執行競爭性作中重要I-環。譬如：於燒烤用難其飼養成本中，古至 —飼料成本。於—研究中發現，匈養於地面之鳥類：独寺出生於龍中纟，於相同產量下多消耗2()%之食物。異係因於地板屋中之社群交互作用程度提高及Μ體量通常較高之故。雄禽較雌禽消耗更多食物，由於=維持較多數量之雄禽，故使得地板育種系統在匈料消耗:輕無效率。育種策略中之彈性限制：由於實際上是將雄禽及雌禽關在地板育種屋内成爲—大群，故旬育者極受限於對铜育種禽進行進一步之雜交或篩選之能力。因此，地板屋主要用來作爲預先篩選之基g)品種之增殖1具以生產最終化雜交品係。人工受精育種計劃：另—種用以生產畔化_之系統係稱爲人工受精（AI)。AI爲育種金字塔頂端之，，初級飼育者”所廣泛實施，但一般不爲位於金字塔底部之商業化生產者所採用。初級飼育者係爲擁有並改良優良純基因品係之公司，該品係係用以交配生產最終之商業化產品_燒烤用嫩禽，生蛋禽及火雞。沿著育種金字塔往下移動，由純種品係經由祖父代品種，親代品種，及最後成爲實際之商業用鳥類，鳥類之數量係呈指數性增加。雖然位處金字塔頂端之優良基因改良鳥類非常昂貴，但位於金字塔底之鳥類則不貴。 6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公髮） f請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1314163 部智慧財 j. 局員工消費合作杜印製發明說明（4 因此，不同的層次中會利用不同的繁殖操作系統。於AI系統中，將雄禽與雌禽關在相同之房舍内，但分別關於籠中:雌禽籠中通常維持二至五之雄鳥，而雄禽籠中則僅關-隻雄鳥。AI計劃可解決許多上狀地板育種屋之限制例如因爲使用蘢狀屋舍，廢棄物之移除可採自動化進行。屋舍通常會較乾淨，使得疾病問題較少。卵之生產亦改善，因爲卵可滾出蘢外且不會生在髒地板上。設備及房舍空間可較有效利用。死亡率可降至最低，因爲社群〈侵略^疾病均減少。出生率較能穩定維持，因爲社群及身體之交互作用已由繁殖方法中消除。飼料轉換率提高。且最後，此生產系統可增加進行進階雜交及篩選之彈性。此能力爲初及飼育者絕對必需以便於改良其基因品種並維持其於商場上之競爭力。雖然上列之多數優點對商業級增殖句育者很重要’但其會受到_項重要的缺點所抵销，因AI計劃所需之勞工成本高。 AI 4劃以人工取代家禽先天之性驅動力。工作者必須以人工，集龍内雄禽之精液並採7天之循環料至籠内之雕禽此等片劃中所需之摻雜程度係由熟練之作業負來判斷。因此AI 4劃雖爲較高偕之操作，但在經濟上較不實用商業、及目種计劃。雖然使用矮種雌鳥使其於相同之卵產時，旬料消耗约減少3G%，但仍無法使得…計劃中所增之勞工成本爲商業級增殖飼育者所接受。繁殖方法I排卵時’烏類之卵母細胞含有胚盤，或胚板，其包

於量加含規格⑵Q χ 297公髮 1314163 ^_____ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 發明說明（5 ) 卵原核，及卵黃團。該胚板及卵黃團被稱爲卵黃膜之卵母細胞膜所包圍。環繞卵黃膜者爲圍卵黃液層（PL)，亦稱爲内圍卵黃液層（IPL)。卵黃膜及IPL間之空間稱爲圍印黃液空間，其係由粒層細胞所貫穿。當卵母細胞由s其卵巢渡泡中釋出’其變成爲卵細胞。即細胞移入輸卵管中由其漏斗所呑沒，若有精子存在則可發生受精作用。當*衾卵傳送至後邵漏斗内時，另一層，外部園印黃液層 (OPL)會環繞該卵細胞。此膜之作用乃是避免多次受精，當多個精子於胚盤區結合並穿透卵細胞時，會發生致死之情況。該卵會再圍繞其他之胚索層及濃稠及稀薄卵白層。當卵細胞移入峽區時，有兩種殼膜沉澱出來，於其上有小的碳酸鈣沉澱，因此開始形成蛋殼。前述事件均於受精後之最先數小時内發生。卵細胞再移入子宮中，於該處再經18-20小時，則完成該鈣殼。該卵再移入陰道中數分鐘，並再由陰道擠出，或產印（即：”生蛋") 。於此時’若該卵已受精，則其内所含之胚胎有4〇〇〇〇至 70,000 個細胞。（J〇hnston(”In Vitro Sperm Binding,

Penetration, and Fertilization of Recently Oviposited Chicken Eggs,"December. 1988, Clemson University) ; Olsen, M.W., J. Morph. 70:413-533(1942); Etches et al., in Methods in Molecular Biology, vol. 62 Recombinant Gene Exp ression Protocols, Ed. R. Tuan, Humana Press, Inc. Totowa, NJ, pp.433-450(1997); Petitte et al., in Manipulation of the Avian Genome, Ed. Etches et al., CRC Press, Boca Raton, -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1314163 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 i、發明說明（6 FL, pp.8 卜 101(1993))。倘若該卵於產出時並未受精，則其爲先前所謂之無法形成活小鳥者（多個例證）。 / 轉基因長久以來，鳥類基因學家便將於鳥類胚細胞中直接插入所欲基因以支援傳統篩選過程視爲一種目標。沿此等路線之大步邁進已於哺乳類中進行，此等哺乳類之早期胚胎容易取得且其原核可顯現以便於外來DNA之插入。轉基因老鼠，牛，綿羊，及山羊之生產已成爲大量商業化操作中之例行程序。反之，於鳥類中，早期胚胎並不易取得且其原核顯得模糊不清，使得於卵中之早期胚胎中之鳥類基因组操作幾乎爲無法克服之目標。經基因修飾之鳥類之發育需要大量藉助於早期，有多種作用之胚胎細胞。因爲胚胎發育之最早時期發生於雌禽之輸卵管中，故唯有將該胚胎由雌禽中移出才可能於早期胚胎中導入異源之DNA，此必需犧牲該雌禽。更甚者，將早期胚胎培養至孵育完成使得此方法過度耗費人力，且其孵同後之存活率僅有約1 〇〇/〇。Sang等人，於Manipulation 〇f the Avian Genome，Ed·· Etches 等人，CRC Press, B〇ca Raton, FL, pp.121-133(1993)。本發明提供一種於鳥類生物學中徹底突破之改良方法，其藉由使得產出之卵可於殼中活化，且可由該殼中孵化出活鳥’此處稱之爲於卵中活化。此等方法可取代地板育種及IV授精，其可大大提高家禽生產之效率。此等方法亦提本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之#J意事項再填寫本頁)

1314163 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（ ’、至早期鳥類胚胎之途徑，藉此該轉基因鳥類可較容易發育。發明概要本發明提供—種方法，其係由產出之殼中之未受精鳥類卩產活j鳥，其中該卵含有一被膜包覆之卵黃及卵細胞，包括活化該卵細胞並將該卵培育之孵化爲止。本發明提供—種於殼中對鳥類卵授猜之方法，其中該卵口有被膜包覆之卵黃，包括取得於生理可接受性載體中含有鳥Μ子之精予“，並將料人卵中，藉此使得該卵受猜。本發明亦提供-種於殼中對鳥類卵授精之方法，其中該印含有-被膜包覆之卵黃’並孵化活小鳥，包括取得於生里可接又(生載fa_中含有鳥類精子之精子樣品，並將該精子樣品送入卵中，藉此使得該印受精，培育該卵，並由該印孵化出活小鳥。本發明亦提供者爲使早期產出之鳥類卵發育之方法。發明之詳細説明本文中所使用之"一"或”該”係意指—或多。例如："一"印可指-個印或多於一個泖。再者，"該"卵可指一個卵或多於一個印。本發明提供一種方法，其係由產出之殼中之未受精鳥類卵生產活小鳥，其中該卵含有一被膜包覆之卵黃，包括活化該卵細胞並將該卵培育之孵化爲止。本文中所使用之"卵細胞”及”卵母細胞，，可互換使用。本發明係關於出乎意料且本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) 零裝------- —訂--------- 1314163 A7

部智慧財產局員工消費社印 Μ 之卵，，或，，產出之卵"係爲同義。本之::精之方法於本文中稱之爲使“ 鳥類炙卵於該卵產出時含有堅硬，黃，其含有提供胚胎成長發育 ’’〈殼。殼内爲卵胎,，係指於印授精過程中，因㈣拉刀及/文中所使用之，，胚發育性生物體。雖炊受精之二，精原核結合而形成之，㈣本文令！、、(早胞)卵細胞可因而稱爲胚胎 ’早細肋財特频之爲受精即。雖然於卵中受猜可於保持於室溫下之2週大但使用理想情況之新鮮產出之卵會有最佳之灶果。於丁車: =體實續，精子樣品係於印產出後❹至96小時間‘ ,、中。& 一極佳之具體實施後〇至24小時間送人其中。因此，h精子樣係於卵產出 …… ”口此，於印產出後盡快將精子樣中較佳1而，精確之授精時機可視所產出之卵之狀況而P例如：溫度，澄度等等。舉例而t，精於其冷卻前加以授精，則可改善其受精情況， ,“中（精子可藉由此技藝中已知之方法由付，例如採用彼等熟習此技藝者所熟知之腹部按摩法：此 1收集到其射出之體液（精液），其含有精子，精液流體，及这明液體。透明液體.係爲琳巴狀液，其於陰莖勃起時穿由淋巴管傳送至阶贫矣而 ·* •二技藝者所熟知之^化來源精子料得自彼等熟習此於一具體實施例中，精子樣品中之精子係來自單一隻鳥 :於另-具體實施例中，精子樣品中之精子係來自多：二隻鳥<精子混合物。若於本發明方法中使用多於—隻鳥、 _ - 12- 本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（210 X 297公髮）

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五、發明說明（1〇精子混合物時，可增加卵授精成功之或然率，因爲倘若所收集精子中有一隻鳥之精子無受精能力，則由其他之鳥所收集到之精子仍可使印受精。 … 於一較佳之具體實施例中，該精子樣品含有來自於同品係鳥種之精子，且該精子樣品係用於與精子提供者同品係又雌鳥所產出之卵之授精。本發明亦涵蓋使用一種品種之精子及另一品種之卵’倘若該精子可使該卵受精。雖然通常精子於收集到之30分鐘内使用較佳，但較老之精子，及甚至於事先冷凍或冷凍乾燥之精子亦可用於本發明之方法中，只要該精子仍保留使卵細胞受精之能力。若精子於收集到之30分鐘後使用，其較佳爲併用精子増量劑，如同説明於下者。如上文所提及，精子樣品亦包含生理上可接受之载體。本文中所使用之，'生理上可接受之載體"係爲一種流體，精子於其中仍可運動及存活。生理上可接受之載體之實例包括，但不限爲未變化之精液，精液流體（精子原有或再加入者）’透明液體（精子原有或再加入者），緩衝之生理鹽水，精子增量劑，及其組合。較佳者，該載體爲精子增量劑，其於此技藝中亦稱爲稀釋劑。如上文所提及，精子增量劑之使用特別較佳於精子收集到之30分鐘内仍未用於授精者。M.R. Bakst，於Manipulation of the Avian Genome，R. J. Etches 及 AM.Verrinder Gibbons, eds., CRC Press, Boca Raton，FL，pp. 15-28 (1993)。本文中所使用之”精子增量劑” 係指一種生理上可接受之載體，其用以稀釋精子樣品以產 -13- 本紙張尺^適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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五、發明說明（12) 心’移除上清液，再將洗滌過之精子懸浮於一定量之溶液 ’例如緩衝之生理鹽水溶液或精液增量劑中。此技藝中之 —般熟練者已知如何將精子再懸浮於適當體積之溶液中以達到所預知精子濃度。例如：於離心並去除上清液後，可將聚集之精子秤重，再利用已知之鳥類精子重量數値估算精子之數目。再將該精子再懸浮於所需之體積中以得到所奴之濃度。或者，可將離心後之精子於移除上清液後再懸浮，並再離心，再測定聚集精子之體積。（Johnson,，1998) 。隨後，可利用Maeza及Buss公式計算精子之濃度。 (Poultry Sci. 55 : 2059(1976))。通常，難精液中之精子濃度爲每毫升3〇億至8〇億，火難之精液爲每毫升80億至B0億，幾内亞禽之精液爲每毫升4〇億至80億，北京鴨之精液爲每毫升2億至⑼億。用於人工授精之標準精子數目爲50微升之總體積中有1〇億個。於本發明之方法中，因爲精子係直接置於印原核旁邊，故即受精所需之精子遠少於此。因此，本發明之方法最少可用一個精子。事實上，本發明可使用之精子濃度範圍很大。於一具體實施例中，以等體積之愛維稀釋劑稀釋難之精液並將大約〇.〇1毫升之此精子樣品注入卵中。因&，大約可使一百萬個精子聚集於卵原核旁邊。本發明之方法中，鳥類卵於殼中之沪 . 彳又椅係猎由將精子樣品送入卵中而％成。精子樣品傳送凌&々 # 、 &成可稭由任何可將精子送入殼中之方法，包括但不限農· 馬.以例如：酸溶液將殼之一區域溶解，利用電穿孔法，乃茲及猎由穿透或割裂殼之 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝·--— — — —— 訂·--!!! 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1314163 A7

VP 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製潑'明說明（13 區域以製造一個開例如利用工具，如：針或解剖送入之前^了便於^人精子而穿透之殼表面區域於精子何、、、二^消毒，以免污染該卵。適合該傳送方法之任 2_，及3。/、包括但不限爲：消毒劑IOFEC- 毒劑擦拭切m、、/ ^位置以消中。、灑或知该卵泡於含有所選用消毒劑之容器如同上述說明，殼t夕製造…“ 可利用例如刀或針之工具來中护' ，焱工具係經殺菌。例如：於一兩步驟程序 ^上q口可首先由刀子或其他尖銳之器具製造出來万:弟_步驟中，再將連接於含有精子樣品之注射筒之针 1工由m 口將精子樣品送人卵中。將精子樣品導入該殼、開口亦可藉由其他方式來完成，其包括但不限爲：利用滴5 例如：微量滴管。或者，採用一步驟，使用連接 a s有精子樣品之注射筒之針頭穿透並因而於殼上製造— ^ 再藉由注射將该精子樣品送入即中。因此，開口包針七'所製k之孔洞。當然，此技藝中之—般熟練者可選擇夠大尺寸之針頭，已使得精子樣品可通過該針頭。於— 具體實施例中，該針頭爲可將完整精子送入殼中之最小尺寸且亦夠堅硬可穿透鈣質卵殼者。或者，可使用分開之針或其他裝置於卵殼中製造一開口。通常，可使用30號至16 號之針頭。於一具體實施例中係使用22號針頭。精子之最寬點約爲0.5微米且長度爲1 〇〇微米。因此，於一較佳具體刀 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝---丨丨！丨訂------I--- 1314163 A7 五、發明說明（14 ) 實施例中，可使用内徑至少爲10微米之針頭來注射。於— 具體實施例中，該針頭可於注射後仍於殼内。頃疫苗至卵中之各種針頭及方法可用以或適於傳送精子、。子於殼上任何地方製造之開口均彳有效地授精，但通常各製造於殼上靠近胚盤之區域。雖然可經由操作而心盤二於印之不同區域，但新鮮產出之即之胚盤係位於殼之㈣，其位於氣室下方與印黃相鄰。—但於殼中製造出—開2 ，則精子樣品較佳爲藉由針頭，滴管等經由氣室及氣室下方之膜（OPL)而傳送。精子數目可增加或減少，其可視精子施用之位置及形式而定。於—進—步較佳之具體實施例中 ’琢精子樣品係利用針頭送人卵中。爲了提高授精效率，可處理該〇PL。任何可使帆切黃膜更易被精子穿透之化合物均可使用，例如：無毒之酸。於一具體實施例中，該針頭，滴管等係以大約l5E之角度插^亥殼，？透殼之内膜。於本發明之方法中，該針頭，滴嘗等可穿過氣室，直至其碰到包圍卵黃及胚盤之膜爲止。實施本發明之方法者於進一步推送針頭，滴管等之尖端時感見文到輕微之抗力時，會知道該尖端已碰到該膜。當慢慢推進該尖端時，來4於膜之抗力消失且該尖端可直接牙透该腠。精子樣品即可送入卵中，至相鄰於該膜之區碱且其相鄰於胚盤。精子樣品之典型體積可小至〇〇〇5毫补戒大至0.10¾升。典型之精子樣聘注入體積約爲〇〇1毫升。較佳者，爲了避免卵之污染及胚胎死亡，故將殼上之開口封起。可將無毒性接著劑直接圖於殼上之開口以封閉之 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝--------訂--------- ·Γ<濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -17 1314163 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 A7 五、發明說明（15 或者，可使用—片卵殼作爲補丁以關閉該開口且可以無母)生接著劑將之黏於殼上。於—具體實施例中，該無毒性接著劑爲Elmer's®膠。甚且，任何，，組織膠，，亦可用以密封該豉。組織膠"係爲經殺菌，無毒性之接著劑，其用於外科手術之過程中以使組織結合在一起。本發明疋方法可用以使鳥類已產出之卵受精，該鳥類係延自由難、鶴鶉、鴨、火難、雉、鴕鳥、鶴描（emu)、鵝、孔雀、松雞、三趾鴕鳥（rhea)、鸚鵡、難尾鸚鵡、白鸚、長尾小鹤轉、及其他有商業價値之鳥類所組成之族群。本發明亦提供一種鳥類卵於殼中受精之方法，其中該卵含有被膜包覆之卵黃，及孵育活小鳥之方法，包括取得於生理上可接受之載體中含有鳥類精之精子樣品，將該精子樣品送入卵中，使得該卵受精，培育該卵，並由該卵中孵化出活小鳥。本文中所使用之"取得"包括使用預先製備及預先傳送之精子樣品。當精子樣品根據上述之本發明方法送入卵中之後，培育該卵直至孵化出活小鳥。一般熟練者知道受精卵所需之時間及較佳之培育條件係依特定品種而不同。下列爲各品種鳥類之培育期：雞-21天.，鵪鶉_23天，科尼（c〇runix)鵪鹑- 17至18天，雉-23天，火雞_28天，鴨_28至33天，鵝至天，長尾小鸚鵡-18天，鸚鵡_28天，鴿子_14天，印产乂哥 14天，雀鳥-14天，鈕扣鵪鶉_16天，溪谷鵪鶉_2ι至U天天鵝-30至37天。經由本發明方法受精之卵之培育與自然受精之卵相比較，其不同處僅有培育時間可能較長，立 /、包括 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) it t n B—

1314163 A7 B7 五、發明說明（16 ) 該受精卵於產出前於雌體中所花費之時間。於一較… 實1例中’雞#之培育期持續21至23天。雖然此技藝中= 叙晃、練者會決疋來自於特定鳥種之卵之最適培育溫卢，二=之=溫度係介於95下至_間。難蛋可培育二、更佳之具體實施例中，當難蛋接近孵化點時，該卵之培育溫度可卩条很。m" 幸低因此，於目前之較佳具體實中，係將雞蛋於99.5T培育之^天至約第18天培育於995 F，且由弟19天至孵化均培育於98_5下。如同此技藝中已被熟知者’卵之培育歷度對卵之轉化很重要。因此’通常騎培育於75%至9()%之澄度下。較佳者，該印係培育於歷度約戰。更佳者，當卵接料化點時，孩卵之培育濕度可提高。因此，於—較佳具體實施例中， :刼雄蛋万;培同之第!天至約第18天培育於溼度，且由第19天謂化均培育於85%財。於—特職佳之具體實施射，係、將難蛋於培育之第i天至約第18天培育於9 9 $下及 80%禮度，且由第19天至孵化均培育於98 5下及μ%产产。如同此技藝中已被熟知者，於培育期間轉動㈣對輕進胚胎之生長有所幫助。進-步更佳者係、於商業化培育器中進行卵之培育。商業化畔化器及安置器有許多公司生產，包括pAs Ref_

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Hunnd繼Incubator Co.,等。較佳者，將該即於解化前約3 天由安置培育器移至稃化培育器。赙化藍可使即側躺，以使小鳥更容易破殼而出。此籃亦可使小鳥稃化後幾乎立刻 •19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） <請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 i I I ---訂！_1- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制^ 1314163 五經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 發明說明（17) 便可行走，此爲小鳥發育及存活所必須。於另-具體實施例中，本發明提供產出之鳥類卵，其含有少於40,000個細胞之天然胚胎，其中該胚胎可發育成活小鳥。”天然"係指於其起源處生長，居住或生產。因此，天然胚胎係爲於已形成卵原核之同一殼中發育及孵化之胚胎。因此，咸胚胎係由天然之卵細胞而來。當自然受精之卵細胞被產出時，發育中之胚胎具有4〇,〇〇〇至7〇,〇〇〇個細胞。然而，本發明之卵係於產出後於殼中受精；因此，於本發明之印中發育之胚胎於培育期間之些許時候，其含有少於40,000個細胞。事實上，於受精之時刻，於本發明之卵中之胚胎具有一個細胞且爲卵母細胞。當胚胎於卵中發育時’可發生正常之細胞分裂且細胞數目會增加。因此，本發明之受精之已產出之卵於培育期間之些許時候含有一胚胎，其具有例如：10,000,20,000或30,000個細胞，包括少於或介於此等細胞數目。兩種商業化較佳之鳥類卵係爲難及火雞。於另一具體實施例中，本發明提供一種殼中之鳥類卵，其含有少於40,000個細胞（即：30,000 ; 20,000 ; 1〇,〇00 ; 1，000 ; 100及1個（卵母細胞））之胚胎，其中該胚胎可發育成活小鳥，且其中該殼具有小於4公分之開口。於另一具體實施例中’該殼上之開口係小於2公分。於另一具體實施例中，該殼上之開口係小於1公分或· 5公分。於另一具體實施例中，該殼上之開口大小僅夠容纳22號針頭。因此，謗開口之大小可最小爲容許精子注入，大至較可將體外受精（即 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 Ίδ_ ' 1314163 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（18 之=回殼中稍小之孔润。所謂"開出夂卵上心某些點製造出之孔被封起之孔洞。例如：—個且古、開口.，包括印上隨後會之孔、ϋ β ，、有被針製造出用以注入精子疋孔洞並再封起之卵，縱然在封口、口之鳥類印中。卵之胚胎可爲天然或非天=f具' 包括由卵細胞發育而凌、 "天…者。非天然 °兩種商業化較佳之鳥類㈣爲難及火雞。以者因此，本發明提供—種產出之，

於40,000，30，_，2 “有胚胎及V 細胞…，包括之二，。，，⑽或⑽個 /、匕括〈數目爲1至40,000。所謂 " 係指該卵黃及殼爲同-卵，其以原貌產出然^ 雞本：明=殼，例如：衍生自選自由雞、.鶴、鴨、火雄、雉、乾鳥、_(叫、鵪、孔雀、松難、三趾 (rhea)、鸚鵡、雞尾鸚鶴' ^ 業價値之鳥類所組成之族群二長尾:鹦：、及其他有商 “ K狹群义鳥類。於-商業上較佳之具二^ 卵係衍生自本發明之方法中所使用之鳥類 _ '人雄 '轉、鴨、嫣鶉、及雉所組成之族群。於商業化具體實施例中，該"衍生自雞。本方法地利用於動㈣之烏種，例如:幫助保存無危、：發：之方法亦可用於嶋即之於卵中授精。爬蟲類，卵，類似於鳥類卵，其含有卵黃及卵原核且於生出= 成（保遵。未$精’已產出之攸蟲類卵可根據本發明之法於殼中《。特別言之，將精子樣品，其含有來自於一本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x 297公复〉 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

21 · 1314163 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（19 ) 或多隻相同品種之欣蟲類，經由殼上被製造出之開口送入未受精，已產出之卵中，並置於相鄰於印原核之印黃上，於該處發生受精作用。一本文中所説明之於卵中授精亦可與其他於卵中之程序結合。例如：胚月台可於受精後接種疫苗。A等疫苗接種程序° 爲彼等熟習此技藝者所熟知。或者，此等疫苗接種可與於卵中授精同時進行，只要該疫苗不會妨害胚胎之發育即可。此外’於卵中授精可自動化，使得多個卵可同時藉由例如：注射技術來授精。因此，50, 1〇〇, 2〇〇, 3〇〇或更多個卵可同時注射。單性生殖於本發明〈一具體實施例巾，&產出之未受㈣之活化係藉由單性生殖來謗發。本文中所使用之，，單性生殖”係指於無任何雄性配子貢獻之狀況下，由雌性配子生產出胚胎細胞。於一較佳之具體實施例中，藉由單性生殖之未受精已產出之鳥類卵之活化可經由穿透園繞卵黃之膜（印黃膜）及胚盤而謗發，例如：藉由將25號針頭插入外殼並進入卵中以穿透圍繞印黃之膜。較佳者，要避免使卵黃破裂。因此，將圍繞卵黃之膜穿透並使之分裂即可開始該卵細胞之活化。其涵蓋其他可用以分裂園繞卵黃之膜之機械性方法。例如 :雷射法，包括無熱YAG (釔_鋁_石榴石）雷射，可用以替代此過程中使用之針頭，用來分裂圍繞印黃之膜。證據顯示細胞質之Ca2+短暫性升高可啓動印發育程序。 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297 公釐） Μ--------訂·------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1314163 A7 B7 五、發明說明（ 20 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製細胞g《Ca2+濃度可被人爲提高，其可經由直接於卵中注入Ca2+或使用Ca2 +攜帶性離子載體，例如：a23 187。此可活化目前爲止所試驗過之所有動物卵（Alberts 1983)。藉由注入Ca2+螯合劑合劑EGTA來避免Ca2 +提高可抑制卵受精後之活化作用。因爲細胞質内之Ca2+濃度升高爲短暫性的，其僅於文精後持續2-3分鐘，所以很清楚地其無法調節於卵活化之較後期中所觀察到之事件，包括DNA及蛋白質之合成。反而，Ca2+濃度升高僅用以引發完整之發育程序；當Ca2+濃度咼時’一些較持久之改變必然發生於卵中。雖然活化之機制尚未完全了解，但很清楚的是精子僅用以引發已預SSL於印中之程序。精子本身並非必需。印可藉由多種無專一性之化學或物理性處理而活化。此等方法一般亦爲提咼細胞内之Ca2 + (Rickord及White，1992)。舉例而以針戳洞可活化青娃卵。（Alberts，1983)。老鼠之印母細胞之活化亦可藉由暴露於無Ca2+ --Mg2 +培養基（Surani 及Kaufman ’ 1977) ’含玻尿酸酶之培養基（Graham，1970) ，暴露至酒精（Cuthbertson，1983)，Ca2+ i〇noph〇res或螯合劑（Steinhardt等人，1974 ; Kline 及Kline，1992)，蛋白質合成抑制劑（Siracusa等人，1978)及電刺激（Tarkowski等人，1970)。已發表之牛類卵母細胞之活化係藉由酒精(Nagai ，1987)，電刺激（Ware等人，1989)，暴露於室溫（stice及 Keefer，1992)，及併用電刺激與環己醯亞胺（First等人， 1992 ; Yang等人，1992)。此等方法可應用於未受精之已產出鳥類卵。 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 111 I 訂1!111! 1314163 Α7 Β7 五、發明說明（ 21 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製藉由單性生殖之於印中活化之一應用係爲快速生產育種庫之純種同係繁殖細胞。目前於工業上之實際應用包括使用純種親代細胞之不同组合已生產獨特之商業化烏類產品。許多之精力係投注於獲得，改良及維持此等純種細胞。藉由單性生殖，雌性配子可不需雄性配子隻基因性貢獻即可被謗發而發育成活小鳥。所產生之小鳥之每個對偶基因均％全同種胚。因此，可於一世代中創造出同種胚之純種細胞以取代今日所需之多回合近親繁殖。更甚者，可使用單一優良個體以取代使用鳥群來衍生出純種細胞。因爲育種族群中之個別鳥與平均値有頗大之差距，故此法係—種可快速將可得之最佳基因特性導入最終商業產品之途徑。核轉移可利用核轉移/細胞顯微操作技術來活化未受精已產出之鳥類卵。因此，本發明個別涵蓋之具體實施例包括含有細胞核或核原質”之液態懸浮物之傳送。核原質可利用相當先進之離心步驟來大量生產。許多測定過之品種，例如： '綿羊，乳牛，及老鼠中，已可將來自於一細胞之核原質插入另一個去核之細胞以達到生產特定選殖個體之目的。本文中所使用之”核轉移”係指由一細胞移出其合並將該核，亦稱爲核原質’插入另一個細胞中，該細胞之天然核已經典作用’例如：藉由移除。本文所説明之步驟可使生產者有效地將優良基因之純種遺傳至商業化族群中並作爲發展自動化核轉移工具平台之基礎。此策略之實行所需之主要步驟如下：（1)開發適當之細胞 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格⑵Q χ挪公 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝！|訂_|------

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五、發明說明（22) 株及核原質供應者之培養條件；⑺於鳥類卵及/或受精卵中員現並切除核構造；分離供應者之核；（4)將供應者之乂轉私至卵（細胞質）中。將重新建構之卵活化使之進入胚胎發育亦可實現。 —核原質供應細胞。雞之胚胎幹細胞及原始的胚細胞已顯示其仍具完全之功能且可利用於鳥類之NT裡序中。以此方式生成之避殖難於相當之禽類育種流程應用中極有價値。不然，fa細胞可有益於其他禽類之育種過程。篩選體細胞形式之因素係爲其忍受"再操作"之能力。再操作是必 2的以便使核原質貢獻至所有之胚胎細胞株並因此造成正常之胚胎發育。培養之胚胎纖維織母細胞（CEF)已廣泛地利用於哺乳類中得到良好之結果，因爲其易於培養及基因操作。CEFs可用於鳥類系統中之體細胞核轉移。或者，由胚胎衍生之胚模細胞（BCs)已可培養及利用。其他可使用之具鳥類核轉移平台之細胞形式爲鳥類B細胞。使用鳥類B細胞之優點之一係爲其忍受高程度重組之能力。此能力很重要，因爲其可使外來DNA併人鳥類基因組之過程更有效率。任何此等供應細胞株進行體外修飾後均併入所產生之鳥類基因組.中。可進行試驗以確認最優秀之^ 胞形式。例如：彳由此等係幫形式中製造核原質並轉移至心胞P彼等具有最高之胚胎存活率之細胞形式可併入標準技術平台中。哺乳類之核轉移已可利用卵或受精卵成功地進行，雖然卵爲達此目的之較佳使用者。標準核轉移程序需要將所存 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱婧背面之注意事項再填寫本頁)

1314163 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（23) 在之細胞核移出或切除，較佳爲於導入供應核之前。此可使得所導入之核在不受天然核干擾之情況下進行正常之 DNA複製。鳥類之卵爲大型且供應核與接受細胞之核間之距離夠大，故移除接受細胞之核並非絶對必要。然而，目前較佳者爲有清除者。鳥類印中之細胞核因濃厚之卵黃粒而模糊不清，使得傳統光學顯微鏡之觀察極無效率。因此，選用來清除鳥類卵之方法中利用核螢光標示法。已知之核螢光染劑例如： H〇escht 33342 (雙-苯驢胺）及 DApi (4v_diamid副·2_ phenylindole，hydrochlonce)可加以利用，因其具有顯現核及其相關性DNA之最大效能。有兩用策略可用於核清除；（1)藉由玻璃微量吸管移除或 (2)以雷射清除。此兩種細胞顯微操作均爲目前所使用者。雷射形式及波長可憑經驗決定。以此等方法清除細胞質中之螢光區域R表核之移！^。重要的{此型之移除不僅移去核DNA，亦移除紡錘生成组織。許多因素會影響核轉移後之發育，其包括需要維持重新组合惑胚胎之正常染色體套數。當核由—開始分化之細胞轉移而來時，基因表現.可由一分化細胞之形式”重新安排,, 爲早期胚胎之樣式。於細胞週期變化之實驗中亦提示此方法之效率會受到供應者及接受者細胞週期階段之影響。由哺乳類顯示於重組之胚胎中發生DN A複製時，供麻者及接受者細胞之週期階段均有影響。因爲可影響細胞質中之減數分裂促進因子（MPF)，故接受者細胞之影響較大 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---- -- - -訂||_--II--_

------ 1314163 A7 B7 五、發明說明（ 24 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (Barnes等人，1993 ; Campbell等人，1993)。MPF之活性於複製期間之纺錘形成時會升高且於轉變期π期間仍高。將核轉移至高量MPF之細胞質可接著破壞核模，染色體濃縮，核模再形成及DNA複製，其與供應細胞之細胞週期階段無關。反之，若MPF活性低時，該核可決定轉移至卵後是否發生DNA複製（Campbell等人，1993，1994)。咸信此等作業具有兩種效用··（1)於細胞週期之特定期中有較大之機會重新士排基因表現；及（2)轉移至細胞週期之相同期之益處。已知胚胎發育於供應細胞處於細胞週期之(3〇或G1期時會增強。由去核之卵與經推測處於GO期之乳房衍生細胞融合而發肓成桃莉羊（Dolly the sheep)。同樣地，處於(^及⑴期之丘細胞已被用以達成老鼠體細胞之核轉移（Wakayama，等人，1998)。然而，已可利用來自非靜止之供應細胞之核生產選殖之小牛（Cibelli等人，1998)。此表示於禽類成功地核轉私需求需憑經驗決定。處於不同細胞週期階段之細胞均可用以決定最適之程序。供應核之傳遞之實施可藉由將供應細胞電融合至去核之卵/受精卵及藉由直接將供應核注射至去核之卵。由於鳥類卵爲大型且實施注射較容易，故直接注射供應核係爲較佳之傳遞方法。若將核轉移至處於轉變期Π之印，通常需經人工活化該即。其可實施於不同之時間間隔，範圍爲核轉移時至轉移後數小時。可試驗此等相同之參數以找出最適之活化時間。 ^可設計自動化之高生產系統來實行此方法。此具有減少家禽工業種禽之潛力，其稱爲"增殖性育"。通常增殖性育 (請先閱婧背面之注意事項再填寫本頁) %

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27· 1314163 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（種（數世代係需由純種細胞經過祖代細胞，親代細胞並最後成爲商業化鳥類。此過程需以鳥類之族群來操作。以核轉移〈IOA可由單—優秀鳥生產出最終之商業化產品。其淨效應係於極有效之育種操作下生產基因優秀之鳥群。更甚者，所利用於核或細胞轉移之細胞可無限期地貯存直至終 ‘使用者要求特4之商業化產品爲止。同等重要之利基係爲其可生產整群單一性別鳥類之能力。譬如燒烤用雞之生產者可要求全雄性之群集以提高生長效率，而蛋之生產者則較偏好全雌性之群集。 d 本發明 < 另一方面中，亦可使用含有細胞及/或細胞核於皤浮液中之液態調配物來生產夢幻動物及/或選殖動物。細胞’例如：鳥類之胚膜細胞，已可注入鳥類胚胎中以達到生產想像性爲類之特殊目的。轉基因本發明亦包括一種用以生產含異源性核酸之鳥類即之方法’其包括藉由本發明揭示於本文中之方法活化—鳥類卵 ’例如：授精’並將異源之核酸導入該卵中。本文中所使用之核酸包括但不限爲：DNA，cDNA，RNA , mRNA& 反義RNA。該核酸可爲單、雙或多股。異源核酸可包括對鳥類而言分非爲天然之核酸及通常不於鳥類細胞或核之導入位置表現之核酸。鳥類卵經IOA活化之後，發育中之胚胎可進入發育之任何時期以進行一些或所有細胞之基因排列。所製造出之轉基因鳥類最受矚目處爲其早期胚胎。IOA可容許胚細胞株傳送 -28 - 本紙張尺度適用冲國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1314163 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（26 ) 異源核酸，因其可容許早期鳥類胚胎之最早可能之異源核酸導入。此等發育中胚胎之基因操作可，例如：生產轉基因鳥類，其含有可用以調整内源性DNA及其表現之基因物質及製造細胞，其可生產有商業價値之蛋白質以供商業用。將核酸轉入鳥類基因組可藉由熟習此技藝者根據數種已知之方法來實施。（Harlow and Lane, Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Lennette et al., Manual of Clinical Microbiology, 14th Ed., Amer. Soc. For Microbiology, Washington, D.C., 1985; Sambrook et al., Molecular Cloning ： A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989; Antisense RNA and DNA, D.A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY( 1988))Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, 2nd Ed. Alan R. Liss, Inc., New York (1987); Centers for Disease Control Laboratory Manual, U.S. Department of Health, Education, and Welfare Pub. No.79-83 75, p. 75, Centers fo.r Disease Control, Atlanta, GA; Fundamental Virology, 2nd Ed. Bernard N. Fields and David M. Knipe, Chief Eds·，Raven Press:New York, 1990)。將基因物質轉移至鳥類基因組之方法之實例包括，但不限於鳥類 leukosis病毒（ALV)轉導媒介之轉基因，轉位子媒介之轉基因，胚膜細胞媒介之轉基因，原始胚細胞媒介之轉基因及 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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發明說明（27 ) 核轉移。異源核酸可於活化結果發生之同時導入胚胎中，例如：於精子樣品導入卵中之同時，或於胚胎發育之較後階段。目前用以生產轉基因鳥類之標準方法係生產有複製缺陷之ALV衍生性轉導粒子，其含有插入之dn A。因爲該粒子热'法於鳥類中複製’故典引起鳥類或人類之viremia及疾病之風險。可於胚胎之正上方開一窗口並將轉導粒子轉導入孩胚胎之近胚孔洞中。再密封該窗口，並將該卵置於培養器中發育。另一種用以將異源核酸轉入鳥類基因組中之方法係爲轉位子媒介之轉基因。轉位子係爲可於其宿主品種之基因組内轉位置或移動之基因元件。於鳥種中並未發現已知之轉位子。然而，已知有相當之轉位子，其由其它來源再祖合而成’可於鳥類基因組中具有功能。可操作此等轉位子以使之成爲將基因插入鳥類基因组之有用核酸載體系統。再者，另一種將異源核酸導入鳥類胚胎之方法係爲胚膜細胞轉基因。胚膜細胞或其他早期細胞可由乂期（受精卵生出之胚胎時期）胚胎取得，其可再注回接受胚胎中並於該處定殖並成長，漸生長成想像中之小難。"想像中之小雞”係由來自於兩種不同基因血統之細胞所構成。於分離出後馬上注入經照光之宿主胚細胞之胚膜細胞具有可貢獻於所產生I鳥之所有組織，包括：胚細胞（可演變成精子及卵並因而成所有接續之世代之細胞）之能力。胚膜細胞已可藉由熟習此技蟄者以各種已知用於生成轉基因家禽之方法由DNA 本紙張尺度刺+ _國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公髮） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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1314163 A7 B7 五、發明說明（ 28 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製培養或轉染而成。因此，胚膜細胞或胚幹（ES)細胞可注入於卵中授精之胚胎中，以創造出夢幻（chimeric)家禽。此等夢幻家禽可再雜交且，假設其具有胚膜或ES細胞之胚細胞轉移，則吾人可建立原始注入細胞之無性繁殖株。更甚者，可使用原始之胚細胞媒介性轉基因來產生轉基因鳥。發育中之胚胎成長時，有相當之與胚細胞有關之細胞會轉變成精子及卵。此等原始胚細胞（PGCs)遷移至發育中性腺之生殖崤，於該處保持休止狀態直至該鳥達到性成热爲止。一種鳥類轉基因之方法係爲分離此等PGCs，基因性操作之並將之置回發育中之胚胎以使之持續發育。此等技術性方法於其研發之程度及潛在之應用性兩方面均可與胚膜細胞法相比擬。原始胚細胞與胚膜細胞一樣，當其注入接受胚胎時，可對胚細胞有貢獻。本發明仍有一方面係關於將液態調配物送入鳥類卵中，提供該基因型狀態之生命訊息或構成鳥個體。譬如：可將 DNA及/或RNA探針送人鳥類卵巾，以達到藉由性別或任何其他之基因型來篩選胚胎之目的。此等探針可專一性地結合至其目標序列並提供有關於該鳥之基因修飾之特定訊: 。以各種榮光，放射性，或化學發光性分子來標示探針；提供測定基因狀態之高信賴度技術。或者，可利用抗其他蛋白質充當爲回報者分子。一使用本發明將核酸併入單細胞之卵〜、，'田胞及早期胚胎中允4將外來之DN A併入所產生之鳥之所 κ所有或大多數細胞中本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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-31 - 1314163 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（29) 。然而，於一替代性具體實施例中，本發明可適於傳送此等核酸及核酸載體至較晚期之胚胎中。一種目前用以生產轉基因家禽之程序包含將有機粒子注入發育中鳥類胚胎之近胚孔洞中。另一應用爲於鳥類胚胎中，短暫性表現特定之基因產物。核酸調配物之傳送可具有生產卵及/或動物基底足生物反應系統之特定目的。亦可將蛋白質，抗原及抗體送入胚胎中以影響基因表現。本文中所説明之於卵中活化方法亦可與其他於卵中之程序聯合利用。例如：胚胎可於授精後接種疫苗。或者，此等疫苗接種可與於卵内授精同時發生，只要該疫苗不會妨礙胚胎之發育。自動化 ΙΟA可自動化使得多個細胞可藉由例如：注射技術同時授精。因此，可同時注射50，1〇〇，200，300或更多個卵。彼等此技藝中之一般熟習者可清楚本發明之方法可容易地利用自動化活化新產出之卵而應用於大規模工業化操作中。據此’先萷所使用之設備，例如：用以免疫已產出之受精卵者可改裝以替代性用於精子細胞，核之導入，或改裝成適合單性生殖，以便於Ij〇 A程序之自動化。因熟習此技藝者之需求，自動化卵處理技術已同時由全世界之許多個別發明加以研發。目前所存在之技術係利用高生產率系統，將液態物質注入鳥類胚胎化之卵中。實例包括注入疫田以改善所有鳥類之免疫狀悲’注入病毒以生產人類及動物疫苗，注入蛋白質以影響鳥類之健康，生長 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公H ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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1314163 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（30) 及類似者。另-種可用於家禽生產之自動化系統係基於以各種光源照光或卵盤中相都即間之溫度差來偵測活的或死的鳥類胚胎。此等技術可共同代表此領域目前之發展狀態。然而，頃需要更進階之平台以特別適用於鳥類育種者之需求，即本發明所提出並可滿足之需求。近來於精子保存之進步加上I0F技術之發明，使得家禽育種操作可傾向較有效率之管理模式。數種説明於下之重要基因技術可互相整合以創造出一種用於家禽育種技術之自動化之多功能平台。爲要以自動化方式施行IOA，例如：I0F，需採取兩個步驟。第一步驟包括計算載至機器上之精子樣品中之精細胞數目，或含有用於轉移之細胞或核物質之樣品。此任務之達成可藉由使用可積分之分光光度計單元（有時稱之爲密度计），其相同於由 Animal Reproduction Systems of Chino CaUfornia或其他公司所銷售者。將由此等分析所得之資料連接至中央處理單元或其他分析系統，於其中計算出最適當之精子及精液增量劑（稀釋劑），或細胞或核物質之體積。再將此貪料連接至卵注射機或同類系統之液體分配性貯存器中。 . 第二個步驟係使中央處理單元驅動卵注射機，使之傳送適當量之稀釋精子樣品或細胞或核物質調配物至未受精卵之特定深度並以適合達成IOA，例如：IOF之角度。注射程序包括以管狀打孔器將卵殼穿孔並將注射針穿入卵黃膜以傳送樣品調配物。 -33- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1314163 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（31 ) 印注射機之設計可相同於彼等由£mbrex, Inc., Merck Inc., 及其他工廠所製造並販售者。舉例言之，其中一種設計係揭7F於美國專利第4,903,635號，標題爲，'High Speed Automation Injection System f0r Avian Embryos”，其於本文中併列爲參考。如該專利所説明者，該揭示之裝置係爲鳥類胚胎之咼速自動化注射系綵，其可將液態物質，特別是接種液注入卵中。該機器包括抽氣裝置，其可於其注射前由表面將卵抬起使之進入產位，而不需推擠之。因此，該機器提供分開之機制及裝置以首先於卵殼上形成一開口並再以流體物質注入鳥類胚胎或其周圍環境，避免使用單一針頭或穿孔器於卵殼之穿孔及將流體物質傳送至卵之内部。如同此技藝中亦已知者，本發明於此處亦涵括於卵殼之穿孔及傳送流體物質時使用單一針頭。其他揭示將流體注入卵中之專利包括美國專利第5,900,929號，標題爲"Method and Apparatus for Selectively Injecting Poultry Eggs” ；第 5,722,342 號’標題爲"Ονο Antibiotic and Microbial Treatment to Diminish Salmonellae Populations in Avians"；第 5,699,75 1號，標題爲"Method and Apparatus for in Ovo Injection” ；第 5,438,954.號，標題爲”Method and Apparatus for Early Embryonic in Ονο Injection";第 5,339,766號， "Method of Introducing Material into Eggs During Early Embryonic Development” ；第 5,176,101 號，"Modular Injection System for Avian Embryos";第 5,158,038 號， "Egg Injection Method, Apparatus and Carrier Solution for -34- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公楚） 1314163 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（32)

Improving Hatchability and Disease” ；及第 5,136,979 號， "Modular injection system for avian embryos,”其均於本文中並列爲參考。於I〇F之最簡單具體實施例中，於此等機器中以精子取代抗原並調整注射之深度以達成IOF。 IOA，即IOF之流程使其可設計出高生產量操作法，以將抵達孵化場之鳥類卵活化，例如：授精。優點在於本發明之IOF於其直接授精方法中需要很小量之精子，此使其可以於育種流程中戲劇性地減少雄禽之數量而進行現代化操作。剩餘之雄禽可集中收容，以有足夠之新鮮精液直接送至孵化場以授精至每年於此工業中孵化之數十億個卵。使用較少之雄禽可使育種者只利用極優秀之表現者來授精，以使細胞株之改良有較快速之基因性進展。此外，該工業之基礎結構可基於雄禽之削減或顯著之減少而重新合理化。譬如：可以更有效率之商業化產蛋操作直接取代現行之孵蛋設備，因其僅需要未受精之卵。於人工授精過程中，雌禽約佔族群之百分之九十五至九十八（95_98%)，可以減少人爲授精之需求，且因此去除約超過百分之九十五（95%)之與此等程序有關之現行勞工需求。於藉由核轉移之自動化活化中’吾人可進一步修改卵注射機制以包括使天然核失效之方法。例如··該機制可包括一微量吸管或雷射，以將天然核移除或使之失效。除了活化，例如：透過授精之外，本發明亦涵括者包括基因分析，操作，及增殖之方法。由於熟習此技藝者之賞識’此等工具目前之設計係針對需要高度技巧之技術員之 -35- 本紙張f度適时國國家標準規格（⑽x 297 )--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝--— — — — —— ^-1-------. 1314163 Λ7 部智慧財產局員工消費杜印製五、發明說明（33 ) 實驗室用途且，因此，其至今尚未能實用於低毛利之家禽工業之例行用途。如同本發明中所實行者，許多此等技術可望併入全自動化平台中，以供生產人員及基因學家及其他研究者使用。本發明之設計可包括其它傳送各種液態調配物之機制及步驟，其用以（a)在於卵中活化，例如：I〇F之同時或隨後影籑鳥類胚胎中之基因表現，及/或提供關於胚胎基因型狀恐您生命訊息。傳送設備可同於上述用於精子傳送之卵注射機制。本發明可利用具有精子之普遍液體貯存器或精子獨立之分離式貯存器，於其中以分開之針頭分別插入即中以注射每種液體，或使液體經由插入印之單一針頭連續注本發明亦涵括將各種型式之根據基因或蛋白質之分析器具中，併入偵測機制。此等機制之—個具體實施例係包括使用通當波長之光源，例如：雷射，及相關之染劑，並可 2鳥類Μ有差異性表現以作以目當之基因態之指示劑。譬如：此且难與β γ丨狀此具收貝她例可利用螢光標示之性別採針，性聯啓動子及表現系統，' 類似者來筛選卵之性別：以“〈性別抗體該偵m可’例如：制咖照像光訊號偵測器來啓動篩選及/或識別機制。於另例中，為偵測機制可利用閃燦、光基底之偵測方法以達到相同於上性及/或化學 -具體實施例中，該系統可利用片=7。於再 U卵片，基因微矩及螢施發另 ^--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) n I · 訂· _ -36 - l3Hl63 A7 B7 五、發明說明（34 經濟部智慧財產局消費合作社印製及/或基因微矩陣技術以達偵測目的，其實例之—係由 Affymetrix公所生產。由&熟白此技藝者之賞識，依據基因型之鳥類分類可使用於生產操作中。以性別將鳥分類可使生產能力最適化。此即：雄禽爲燒烤難工業所欲，而雌禽爲爲產蛋者所欲。本1月亦k供基因學家—種增強之能力，以根據卵之自動化向速識別及遺傳來進行基因篩選，使其可以更快因進展來研發改良之家禽品種。土無論使用何種型式來進行基因型分類，另一涵括之方式係私每個卵分爲"活的”或"死的,，。於此過程中亦可使用簡單 '、、光及/或，皿度機制，如同pAS ，及、；見行系、.’充中併入者。就本發明之此方面而言，將歸屬於 En^brex之美國專利第5,9〇〇,929號於本文中併列爲參考。、與説明於下文之選別裝置相結合，則本發明之注入液態调配物可提供先測指標且其债測可提供一種適用於所有分子偵測方法之多功能平台。本發明尚有另一句具體實施例，其合併一種液體取樣裝置以由鳥類卵中取得液態樣品。此設計係利用連接眞空管土取k針，將其頂端來·回移動以被各別鳥類卵之液態部分包圍並再將之由該處移除。或者，該設計可利用電滲透梯度，其相同於使用於PE Bl〇systems 31〇基因分析儀者，以將液態樣品吸至取樣毛細管中。爲了發揮上述偵測裝置之最大利用性，頃需要藉由各種技術於相當之時機將訊號放大。將訊號放大之—具體實施 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 ----訂·！---！▲ -37- 1314163 A7 B7 五經濟部智慧財產局員工消費合作社印製發明說明（35 ) 二係可併用—個積分性熱循環單元來將DNA增幅，例如彼代，、.i〇SyStems’ Hybaid MJ Research及其他所生產者。等取u_對上述之基因晶片，微陣列，及微陣列基底之基因分析裝置很重要-若其非爲必需。爲要取得與所分析樣品之更詳細資料，亦可考慮依分予 ^小’分子量’電荷或其他化學/物理性f來分離樣品。此等刀離機制〈-具體實施例係爲電泳單元。例如：積分性毛細電冰單元，例如或相同於PE Biosystems所生產之310 ic Analyzer可用以分離核酸及蛋白質。本發明之此具 ^ 施例可’譬如，用以由初級育種者之種禽細胞株進行卵之高生產率遺傳操作。取後’可將知自上述具體實施例之單一或全體數據以中央處理早7L或其他裝置中之軟體處理以評估處理完成之即乙價値及狀態。經評估之卵可加以標示，選別，並轉移至粹化藍或盤。標示之進行可藉由喷墨機制，相同於現今用於Hewlett Packard&Eps〇I^p表機者。印之選別及轉移之進行可藉由自動化抽氣杯及輸$帶，#可將蛋盤經由器械本體輸送至等#中之運送車。此部份之器械機制可利用與 BreuU ’ Kuhl公司，Pas .Reform，及Embrex所製造及銷售之相同系統。本文中所説明之器械平台亦可具有現行之基因/蛋白質分析能力之優點。若直接將該分析性能併入此平台中，則此等程序可於高速及工業化規模下f施。實例中將説明此等分析性能可直接應用於商業化家禽工業。 38 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公复） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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1314163 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（36) 實例 ’、〗之4疋出係用以提供彼等此技藝中之一般熟習者套—々揭示及説明，使其了解如何實施本文所聲稱之方法，並單純作爲本發明之示範且不能限制發明者所認爲之發明範圍。對於數字（例如：數量，溫度等）之正確性之確認已經盡力，但需説明其中仍有—些誤差及變異。除非另有指明，否則部份係指依重量分開，溫度之單位爲。F且壓力爲或接近大氣壓。實例 1. 和四十一個新鮮產出之未受精Barre(j R〇ck難蛋以3%之過氧化氫擦拭其殼以消毒之並至於架上。 2. 於同一個清晨，於進行授精程序之1小時内，由*隻 barred rock公難取得精液並收集於vacutajner⑧試瓶中。 3. 由4隻公雞取得精液並與1毫升之AvidihentJD混合。 4_將與Avidiluent®混合之精液經由1”，22號針頭吸至1毫升之注射筒中以形成精子樣品。 5. 以針頭於蛋殼之較大，鈍端製造一開口，並以與殼成 15 °之角度插入該開口。 6. 使針頭穿過氣室直至.其前端正好穿透包圍卵黃及胚盤之膜。 7. 將一滴，0.05毫升，之精子樣品注射至相連於膜之卵黃表面。 8. 將連接於注射筒之針頭從卵中拔出。 9 ·將殼上由針頭製造出之開口以小一小片蛋殼貼起，並將 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1314163 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 A7 B7 五、發明說明（37) 該貼片以黏著劑，例如：Elmer,s glue⑧固定之。 10. 私卵置於商業級之定著器中，於培養之第丨至18天維持於99.5 F及8〇%濕度。根據此技藝中已知及使用於商業化定著器中之方法將卵旋轉。 11. 於第19天，將卵轉移至商業化孵化器中並維持於98.5下及80%濕度直至孵化爲止。經本發明之方法於43個蛋進行授精十天之後，將卵進行例行之對光檢查以確定哪些卵已成功地受精。43個卵中有二十五個受精。於35個受精卵中，有32個成功地孵化出來且除了隻外，其於之小鳥均健康。因此，43個被處理 4已產出卵經由本發明之授猜方法有72%可生成健康之活小鳥。實例2 於Hyline商業化褐色蛋產卵雞之數據： 1_於早晨6 : 30收集270個新鮮產出之蛋。 2. 互即由Black Giant雄禽收集精液並以5〇 : 5〇之比例稀釋之。 3. 於精液收集後20分鐘内將蛋及精液送至實驗室中。 4. 將蛋分爲兩組，實驗組及負控制組各135個。 5. 將實驗组之蛋同上述方法注入1〇微升之稀釋精子製劑。 6. 負控制組不加以注射。 7. 將注射後之蛋以矽樹脂封劑封口並置於前述之培養器中。 8. 5天後檢查受精情況並記錄之。 9. 測定出實驗組之135個蛋中，有33個受精（24%)。負控制本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ί請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1314163 38 五、發明說明（組之蛋並無顯示出發育跡象者。實例3:單性生殖 1. 於早晨收集27〇個新鮮產出之蛋。 2. 將蛋分爲兩組，實輅貫驗組及負控制組各135個。 3. 穿過蛋殼及殼膜，製— _ 黃。 ° 個2-3毫米之開口，使可見到纹 4. 將圍繞卵黃及胚盤夕0从±上 β輕輕，，戳洞，'及/或穿透，小心匆存卵賀破裂。（或者，可驻斤精由簡單地將25號針頭穿透卵殼j 進入卵黃中以使開口良&及卵頁膜之穿透同時進行）。 5. 再將經此處理之蛋以々丁）器中。蛋夕树脂封劑封口並置於前述之培| 6. 於5天後檢查蛋之發育並放回料料記錄其發育速率。 7. 使蛋發育至孵化爲止，* 並t孵化時記錄孵出率及健康狀 'JL 0 結果： 1. 將卵更破裂^蛋丟棄後，剩下131個實驗組蛋及⑴個自控制組蛋。 … 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2. :天後之發育檢查發現13 i個戳洞之蛋中有,⑽)具有明顧之胚胎發育跡象。. 3. 7個顯示胚胎發育之蛋中，有5個生產出正常之健康小鳥。 4. 負控制組中並無顯示出胚胎發育跡象者。有多篇參考文獻涉及此等應用。此等出版品及其指明之參考又獻之揭示以其整體併列於本文中作爲此等應用之參考，以便能更完整説明本發明相關技藝之狀況。 -41 1314163 A7 -------2L__-- 五、發明說明（39 ) 彼等熟習此技藝者明顯可知本發明可於不脱離本發明之範圍及精神下進行各種修改及變化。彼等熟習此技藝者明顯可知本發明之其他*體實施例彳由揭示於纟文中之説明及實施發展而得。説明及實例僅供爲示，範圍及精神指明於巾請專利範圍巾。 ❹义實際 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 42 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims

1314嫌(6S 〇34丨5號專利申請案中文申請專利範圍替換本(97年6月）六、申請專利範園 A8 B8 C8 D8 97. 6. 05 年月修正 β補充

1· 一種由已產出未受精之鳥類卵於殼中生產出活小鳥之方法，其中該卵含有一被膜包圍之卵黃及一卵母細胞，該方法包括活化該卵母細胞並將該卵培養至孵化為止，其中該活化係藉由單性生殖誘發或藉由將含於生理上可接文之載體中之含鳥類精子之精子樣品傳送入卵中達成。 2·如申請專利範圍第旧之方法，其中之鳥類印係來自雞。 3·如巾請專職圍第i項之方法，#中之鳥類印係來自火雞。 4. 5. 6 · 9. 如申請專利範圍第1項之方法化。如申請專利範圍第4項之方法如申請專利範圍第丨項之方法卵中單性生殖誘發。如申請專利範圍第6項之方法透卵膜誘發。如申請專利範圍第7項之方法成。如申請專利範圍第1項之方法將含於生理上可接受之载體傳送入卵中。，其中將多個卵連續同時活，其中至少活化20個印。，其中該活化係藉由於鳥類 ’其中該單性生殖係藉由穿，其中該穿透係藉由針頭達 ’其中該活化之達成係藉由 7之含鳥類精子之精子樣品其中該卵及精子係衍生自其中該載體為精液流體。其中該載體為經稀釋之精 10.如申請專利範圍第9項之方法同種之成員。 11.如申請專利範圍第9項之方法 12·如肀請專利範圍第9項之方法 69370-970605.doc

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液流體。其中該經稀釋之精液流其中該精子樣品係傳送其中g亥精子樣品係傳送其中該精子樣品係傳送 13. 如申請專利範圍第12項之方法體含卵稀釋劑（Avidiluent)。 14. 如申請專利範圍第10項之方法至包圍卵黃之膜附近。 15 ·如申睛專利範圍第14項之方法至相連於胚盤之膜之鄰近區域。 16.如申凊專利範圍第1 〇項之方法該臈之下方。 17. 如申凊專利範圍第10項之方法可使精子對印授精。其中該骐經此處理因此 18. 品種係選自及三趾鴕烏如申請專利範圍第10項之方法，其中該鳥類於由雞、鶴鶴、鴨、火雞、雉、銳烏、鱗、所組成之族群。 Γ!請專利範圍第18項之方法’其中該鳥類品種係為雞。 .口申凊專利範圍第1()項之方法，其中該精子樣品含有由於又鳥所得之精子混合物。 2ΐ.如申請專利範圍第10項之方法’其中該精子樣品傳送之達成係藉由穿透該殼以於殼上製造一開口並將精子樣品導入該卵中。 7 2·如申吻專利範圍第21項之方法，其中該穿透及導入之達成係藉由針。 23. 如申請專利範圍第21項之方法其中該開口係封住。 24. 如申請專利範圍第則之方法，其中該開口係以黏著劑 -2-

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封住。 25. 26. 專利範㈣1G項之方法，其47該多個卵係連續同 =申睛專利範圍第25項之方法，其中至少有2()個印被授精申明專利圍第25項之方法，其中至少有％個卵被授 28. 如申請專利範圍第1〇項之方法，其中該卵為雞印，且該即之培養持續21至23天。 29. 如中請專·圍⑽項之方法，其中該培養之進行係為約第1天至約第18天於溫度約99 5EF下培養且由約第19天至辉化於溫度約98.5卯下培養。 30·如^請專利範圍第1()項之方法，其中該培養係於第】天至岭化為止均於8 0 %澄度下進行。 31.如申請專利範圍第10項之方法，其進一步包括於培養期間將胚胎接種疫苗。. 3 2 · —種以產出之鳥類卵於殼中授精之方法，其中該卵含有包覆於膜中之卵黃，其包括： a) 取得含於生理上可接受之載體中之含鳥類精子之精子樣品；及 b) 將該精子樣品送入卵中，因而授精至卵。 33. 如申請專利範圍第32項之方法，其中該卵及精子係衍生自同種之成員。 34. 如申請專利範圍第32項之方法，其中該載體為精液流體。本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1314163 、申請專利範園 A8 B8 C8 D8 35.如申請專利範圍第32項之方法精液流體。其中該載體為經稀釋之 36. 37. 如申請專利範圍第35項之方法體含卵稀釋劑（Avidiluent)。如申請專利範圍第32項之方法至包圍卵黃之膜附近。其中該經稀釋之精液流其中該精子樣品係傳送 38. 39. 如申請專利範圍第37項之方法，至相連於胚盤之膜之鄰近區域。如申請專利範圍第32項之方法，該膜之下方。其中該精子樣品係傳送其中該精子樣品係傳送 40. 41. 如申請專利範圍第3 2項之方法可使精子對卵授精。如申睛專利範圍第3 3項之方法於由雞、鵪鶉、鴨、火雞、雉所組成之族群其中5玄膜經此處理因此其中該鳥類品種係選自鴕鳥、鵝、及三趾鴕鳥 42. 43. 44. 如申请專利範圍第41項之方法，如申睛專利範圍第32項之方法夕於又鳥所得之精子混合物。其中5亥鳥類品種係為雞。，其中該精子樣品含有由 11印專利範圍第32項之方法’其中該精子樣品傳送之成係藉由穿透該殼以於殼上製L並將精子樣品导入該卵中。 45.=申請專利範圍第44項之方法，其中該穿透及導入之達成係藉由針。 46·如申請專利範圍第44項之方法，其中該開口係封住。 -4- X 297 公釐)------- 1314163 園、申請專利範，其中該開口係以黏著劑 '其中該多個卵係連續同其中至少有2 0個卵被授其中至少有50個卵被授其中該卵係為雞卵，且 •如申睛專利範圍第46項之方法封住。 8·如申請專利範圍第32項之方法時授精。 .如申凊專利範圍第48項之方法精。〇·如申請專利範圍第48項之方法，精。 1.如申請專利範圍第32項之方法，該方法包括： :得含於生理上可接受之载體中之雞精子樣品；及 ^將該精子樣品送人”，因而授精㈣。 2·如申請專利範圍第51項之方法，其包括： a)取得經稀釋之雞精子樣品；及 53 /Π經稀釋之精子樣品送入印中，因而授精至印。 3·如申請專利範圍第52項之方法，其包括： a) 取得經稀釋之雞精子樣品；及 b) 將該經稀釋之精早媒σ έ 脸分& 樣〇〇藉由穿透該殼而送入卵中並將該經稀釋之精子導入卵中。 54·如申請專利範圍第53項之方法，其包括： a)取得經稀釋之雞精子樣品；及 =將^經稀釋之精子樣品藉由穿透該殼及將該經稀釋導人㈣’將祕稀釋之精子樣品送至連接於胚盤之膜之鄰近區域。 -5 本紙張尺度適財S S家標準(CNS) A4規----_:__ A8

1314163 .一種將已產出之雞㈣殼中授精並辉化出活小雞之於包覆於膜中之印黃，該方法包括將包含」生上可接受之載體之雞精子樣品送入卵中，因此 5亥卵受精並將該卵培養至孵化為止。 56·二申請專利範圍第55項之方法，該方法包括將稀釋之雞精子樣品送人"，因此使·受精並將”培養化為止。 A =請專利範圍第56項之方法，該方法包括藉由穿透該忒亚將該經稀釋之精子導入卵中而將稀釋之雞精子樣品送入卵中，因此使該卵受精並將該卵培養至醉化為.止。 58·，申請專利範圍第57項之方法，該方法包括藉由穿透該戒並將該經稀釋之精子導入卵中而將稀釋之雞精子樣品送至卵中連接於胚盤之膜之鄰近區域，因此使該卵受精並將該卵培養至孵化為止。 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準(CMS) A4規格(210X 297公釐)