DE4106570A1 - Neue inhibitoren der endothelzell-proliferation - Google Patents
Neue inhibitoren der endothelzell-proliferationInfo
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Description
Die Bildung neuer Blutkapillaren (Angiogenese) läuft in einer
geordneten Folge von Schritten ab: an einem Punkt, an dem ein
neuer Gefäßsproß auszuwachsen beginnt (meist im Bereich post
kapillarer Venulen), bauen Endothelzellen lokal die Basalmem
bran ab, wandern in Richtung auf die Quelle eines die Angio
genese stimulierenden Faktors, wachsen und teilen sich, bil
den ein Gefäßlumen und treffen auf andere Gefäßsprosse oder
bestehende Kapillaren, so daß ein neuer Kapillarabschnitt
entsteht, der sich schließlich mit einer neu gebildeten Ba
salmembran umgibt.
Bei erwachsenen Individuen ist im Normalfall die angiogeneti
sche Aktivität fast vollständig gehemmt. Lediglich bei der
Wundheilung und beim weiblichen Geschlecht im Zusammenhang
mit dem ovariellen Zyklus laufen intensivere Angiogenese-Vorgänge
ab. Im allgemeinen ist jedoch die Umsatzrate der
Endothelzellen im Organismus gering. Die vollständige Er
neuerung einer bestehenden Endothelzellen-Population dauert
Jahre, wobei jedoch ausgeprägte organ- und gewebespezifische
Unterschiede vorkommen (Folkman, Medicine 29 (1985), 10-36).
Die strenge Kontrolle, unter der die Angiogenese normalerwei
se steht, ist beim Wachstum von soliden Tumoren aufgehoben.
Für das Wachstum von Tumoren bei einem Durchmesser von über 1
bis 2 mm ist eine starke Angiogenese absolut erforderlich.
Avaskuläre Tumoren bleiben nämlich durch die beschränkte
Diffusion bei der Zufuhr von Gasen und Nährstoffen und bei
der Entfernung von Abfallstoffen auf eine sehr geringe Größe
beschränkt. Die mangelnde Fähigkeit von festen Tumoren, in
Abwesenheit einer erfolgreichen Induktion der Angiogenese auf
eine klinisch signifikante Größe zu wachsen oder Metastasen
zu bilden, hat ein großes Interesse bei der Erforschung von
Verbindungen hervorgerufen, welche die Angiogenese inhibie
ren.
Die gewerbliche Anwendbarkeit solcher Inhibitoren liegt bei
der Hemmung des Tumorwachstums im allgemeinen, insbesondere
bei der Hemmung von auf Endothelzellen basierenden Tumoren
wie Kaposi-Sarkom und Hämangiomen. Darüber hinaus ist auch
eine therapeutische Anwendbarkeit bei sonstigen Krankheiten
gegeben, die auf einem übermäßigen Kapillarwachstum beruhen.
Insbesondere zu nennen sind hierbei die diabetische Retinopa
thie und retrolentale Fibroplasie, beides Augenerkrankungen.
Eine weitere Anwendungsmöglichkeit besteht bei der Wundbe
handlung, wobei ein Inhibitor der Angiogenese zur Regelung
der Wundheilung eingesetzt werden kann, d. h. bei der Verzöge
rung der Neubildung von Blutgefäßen. Weiterhin besteht auch
die Möglichkeit, einen Angiogenese-Inhibitor im Rahmen der
Behandlung der rheumatoiden Arthritis einzusetzen. Bei dieser
Erkrankung wird eine Vaskularisierung der Knorpel (wie gene
rell bei jeder Entzündung in diesem Bereich) beobachtet, die
mit einem Angiogenese-Inhibitor unterdrückt werden könnte.
Es wurde aus avaskulären Geweben eine Reihe von die Angioge
nese hemmenden Extrakten hergestellt (siehe D′Amore und
Braunhut, in Endothelial Cells, Vol. II, herausgegeben von
U.S. Ryan, CRC Press, Boca Raton, Florida, 13-37). Auch ent
zündungshemmende Wirkstoffe unterdrücken die Angiogenese
(Robin et al., Arch. Ophthamol. 103 (1985), 284-287;
Polverini und Novak, Biochem. Biophys. Res. Comm. 140 (1986),
901-907), wie z. B. Protamin (Taylor und Folkman, Nature 297
(1982), 307-312), angiostatische Steroide (Crum et al.,
Science 230 (1985), 1375-1378), ein plazentaler RNAse-Inhibi
tor (Shapiro und Vallee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84
(1987), 2238-2241) und eine Reihe von Verbindungen, welche
die Matrixsynthese und Beständigkeit beeinflussen (siehe z. B.
Ingber und Folkman, Lab. Invest. 59 (1988), 44-51). Bei eini
gen dieser Inhibitoren wurde eine Hemmung des Tumorwachstums
oder eine Rückbildung in vivo festgestellt, jedoch nicht bei
allen Tumoren. Weiterhin bleibt auch die Toxizität dieser
Angiogenese-Inhibitoren ein Problem.
Von Rastinejad et al. (Cell 56 (1989), 345-355) wurde ein
Angiogenese-Inhibitor in einem Medium mit Hamsterzellen und
Hamster-menschlichen Hybridzellen gefunden, der die Neovasku
larisation in vivo unterdrückt. Bei dieser Verbindung handelt
es sich offenbar um ein Glykoprotein mit 140 kDa Molekularge
wicht. Allerdings zeigt dieser Inhibitor nur eine geringe
Stabilität, insbesondere ist er nicht hitzestabil.
Die DE 40 06 609 offenbart ein Protein, das als Inhibitor der
Proliferation von Endothelzellen wirkt, erhältlich aus Baby
hamster-Kidney-Zellen, das bei Gelfiltration unter nativen
Bedingungen ein Molekulargewicht von ca. 60 bis 100 kDa be
sitzt und eine größere Hitzestabilität zeigt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, weitere Angiogene
se-Inhibitoren bereitzustellen, die als Alternative und Er
gänzung von bereits bekannten Inhibitoren therapeutisch ein
gesetzt werden können.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren
zur Anreicherung von Inhibitoren der Proliferation von Endo
thelzellen aus dem Gewebe von Wirbeltieren, welches dadurch
gekennzeichnet ist, daß man
- a) das als Ausgangsmaterial gewählte Gewebe homogenisiert und anschließend zentrifugiert,
- b) den Gewebeextrakt auf einen Kationenaustauscher gibt und die an den Kationenaustauscher bindenden Substanzen einer Fraktionierung unterwirft,
- c) die aktiven Fraktionen aus Schritt (b) gelfiltrations chromatographisch auftrennt, und
- d) die aktiven Fraktionen aus Schritt (c) über HPLC-Reverse Phase reinigt.
Das als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren
gewählte Gewebe von Wirbeltieren kann sowohl embryonalen als
auch adulten Ursprungs sein. Vorzugsweise verwendet man em
bryonales Gewebe aus Vögeln oder Säugern, besonders bevorzugt
Gewebe aus Hühnerembryonen als Ausgangsmaterial. Weiterhin
ist es bevorzugt, adultes Hirngewebe aus Vögeln oder Säugern,
insbesondere adultes Rinderhirn als Ausgangsmaterial zu ver
wenden. Es soll jedoch darauf hingewiesen werden, daß das
erfindungsgemäße Verfahren auch auf menschliches Gewebe (so
wohl embryonalen als auch adulten Ursprungs) übertragbar
ist.
Verwendet man Hühnerembryonen als Ausgangsmaterial für das
erfindungsgemäße Verfahren, so lassen sich dadurch zwei Sub
stanzen anreichern, die als Inhibitor der Proliferation von
Endothelzellen wirksam sind. Diese beiden Substanzen werden
als EMBIN I und ANEMIN bezeichnet. Verwendet man adultes
Rinderhirn als Ausgangsmaterial, so erhält man bei analoger
Durchführung des Anreicherungsverfahrens ebenfalls zwei inhi
bitorisch wirksame Substanzen, die in ihrem biochemischen
Charakter und ihrem Molekulargewicht nach SDS-Gelelektropho
rese den beiden Inhibitoren aus Hühnerembryonen entsprechen.
Es konnte bisher noch nicht geklärt werden, ob die Substanzen
aus den verschiedenen Ausgangsmaterialien miteinander iden
tisch sind, oder ob sie nur sehr nahe chemisch miteinander
verwandt sind. Es soll jedoch klargestellt werden, daß diese
Substanzen bzw. deren jeweilige speziesspezifische Analoga
auch aus anderen Wirbeltieren, insbesondere Vögeln und Säu
gern erhältlich sind.
Der als EMBIN I bezeichnete Inhibitor der Proliferation von
Endothelzellen, der durch das erfindungsgemäße Verfahren
erhältlich ist, zeichnet sich dadurch aus, daß er bei Gel
elektrophorese im SDS-Polyacrylamidgel eine Bande mit einem
scheinbaren Molekulargewicht im Bereich von 2,5 bis 6,2 kDa
ergibt.
EMBIN I zeigt auch nach einer 60-minütigen Inkubation bei
90°C eine unverminderte Inhibition der Endothelzell-Prolife
ration. Somit erweist sich EMBIN I als eine sehr hitzeresi
stente Verbindung, wenn man zugrundelegt, daß nur sehr wenige
Proteine eine derartige Behandlung unter Beibehaltung ihrer
Aktivität überstehen können.
Weiterhin wurde festgestellt, daß EMBIN I gegen eine Reihe
von verschiedenen Proteasen resistent ist. Dabei wurden fol
gende Proteasen getestet: Trypsin, S. aureus V8 Protease,
Clostripain, Thermolysin, Subtilisin, Pronase E, Proteinase
K, Carboxypeptidase Y, Papain, Pepsin (Sigma), Chymotrypsin,
Pyroglutamat-Aminopeptidase, Endoproteinase Arg-C, Endopro
teinase Lys-C (Boehringer Mannheim), Prolin spezifische Endo
peptidase (Seikagaku Kogyo, Japan). Bei diesen Versuchen
wurden die getesteten Proteasen in den jeweils für sie erfor
derlichen Puffern gelöst und mit einem Aliquot von EMBIN I
unter den für das betreffende Enzym vom Hersteller angegebe
nen Bedingungen inkubiert. In keinem der Experimente ergab
sich eine Veränderung der inhibitorischen Aktivität oder des
Wanderungsverhaltens von EMBIN I im Gel.
Um die Möglichkeit zu überprüfen, ob EMBIN I als ein mit
Nukleinsäuremolekülen assoziiertes Peptid vorliegt, was z. B.
für den Angiogenesefaktor "Angiotropin" zutrifft (Wissler et
al., Protides Bio. Fluids. 34 (1986), 525-536), wurde EMBIN I
sowohl mit DNAse als auch mit RNAse inkubiert. Es wurde keine
Veränderung im Wanderungsverhalten während der Gelelektropho
rese gefunden.
Aufgrund der Überlegung, daß es sich bei EMBIN I um ein Gly
copeptid handeln könnte, wurden Verdauungen mit glycolyti
schen Enzymen durchgeführt. Hierfür wurde EMBIN I einer
sequenziellen Verdauung zuerst mit Neuraminidase und danach
mit β-Galactosidase unterworfen. Weiterhin wurde EMBIN I mit
Glycopeptidase F behandelt. Weiterhin wurde untersucht, ob
EMBIN I eine Reaktion mit dem "Glycan Detection Kit" der
Firma Boehringer Mannheim zeigt. Bei keinem dieser Experimen
te konnte jedoch das Vorhandensein einer Glycosylierung nach
gewiesen werden.
Lipidextraktionen von EMBIN I und ANEMIN brachten bislang
auch keine Hinweise auf das Vorhandensein von Lipidanteilen.
Zur Prüfung der Frage, ob es sich bei AMBIN I um eine Sub
stanz mit Proteincharakter handelt, wurde eine Inkubation mit
Diethylpyrocarbonat durchgeführt. Diethylpyrocarbonat rea
giert mit freien α-Aminogruppen oder mit den ε-Aminogruppen
von Lysin unter Bildung eines N-Carboxyderivats. Bei Behand
lung von EMBIN I mit Diethylpyrocarbonat wurde festgestellt,
daß die inhibitorische Aktivität vollständig aufgehoben wird.
Dies spricht dafür, daß die inhibitorische Aktivität von
EMBIN I auf einer oder auf mehreren funktionell wichtigen
Aminogruppen beruht. Die Tatsache, daß auch bei einer Behand
lung mit Phenol die inhibitorische Aktivität von EMBIN I
aufgehoben werden kann, ist ein weiterer Hinweis auf den
Peptid-Charakter dieser Substanz. Weiterhin wurde auch fest
gestellt, daß EMBIN I mit dem Ninhydrinsprühreagenz (das zum
Nachweis von Aminogruppen dient) angefärbt werden kann.
Einen weiteren Hinweis darauf, daß es sich bei EMBIN I um ein
Peptid handeln kann, ist, daß eine Proteinbestimmung nach der
Methode von Lowry (Lowry et al., J. Biol. Chem. 193 (1951),
265-275) möglich ist.
Durch eine Aminosäureanalyse von EMBIN I (Hydrolyse mit 6N
HCl und anschließende Derivatisierung mit 4-Dimethylaminoazo
benzol-4′-sulfonylchlorid nach Knecht und Chang, Anal.Chem.
58 (1986), 2375-2379) konnten die Aminosäuren ASX (Asn
oder/und Asp), GSX (GIn oder/und Glu), Pro, Val, Leu, Lys und
His nachgewiesen werden. Ebenso wurden charakteristische
Peaks von Ser, Thr, Arg- Gly, Ala, Ile, Phe und Tyr gefunden,
wobei die gefundenen Mengen zu gering waren, so daß ihr Vor
handensein nicht eindeutig bestätigt werden konnte.
Die bisherigen Ergebnisse der Charakterisierung von EMBIN I
weisen darauf hin, daß es sich um ein kleines basisches Pep
tid handelt, wobei aber andere Möglichkeiten noch nicht aus
geschlossen werden können. Setzt man voraus, daß EMBIN I ein
Peptid ist, so scheint der N-Terminus des Moleküls blockiert
zu sein, denn eine Sequenzierung von EMBIN I nach der Methode
von Edman, für die eine freie α-Aminogruppe des Peptids not
wendig ist, war bisher nicht möglich.
Eine weitere ungewöhnliche Eigenschaft von EMBIN I ist der
Unterschied im Wanderungsverhalten während der Gelfiltration
einerseits und der SDS-PAGE andererseits. Die EMBIN I-Aktivi
tät wird auf einer Gelfiltrationssäule an einer Position
eluiert, die einem Molekulargewicht von etwa 500 bis 1000 Da
entspricht. Bei Untersuchung der aktiven Fraktionen durch
SDS-PAGE findet man jedoch die Bande von EMBIN I im Bereich
zwischen etwa 2,5 und 6,5 kDa, unabhängig vom verwendeten
Elektrophorese-System.
Auch der andere durch das erfindungsgemäße Verfahren erhält
liche Inhibitor ANEMIN zeigt diesen Unterschied im Wande
rungsverhalten während der Gelfiltration und der SDS-PAGE.
Bei ANEMIN wird in der SDS-PAGE eine Bande etwa im Bereich
von 16 bis 20 kDa gefunden, während nach Gelfiltration das
Molekulargewicht weniger als 1000 Da betragen sollte. Wie
EMBIN I weist auch ANEMIN eine sehr hohe Stabilität und eine
Resistenz gegen Proteasen auf.
Obwohl weder die Struktur von EMBIN I noch von ANEMIN im
Detail aufgeklärt ist, können sie durch das erfindungsgemäße
Verfahren nacharbeitbar als Reinsubstanzen hergestellt wer
den, da beide Inhibitoren im SDS-Gel als Einzelbanden ohne
nennenswerte Verunreinigungen nachgewiesen werden können.
Im weiteren sollen die einzelnen Schritte des erfindungsge
mäßen Verfahrens näher erläutert werden. Schritt (a) ist die
Homogenisierung und Zentrifugation des als Ausgangsmaterial
gewählten Gewebes. Vorzugsweise verwendet man als Ausgangsma
terial adultes Rinderhirn oder 4 bis 10 Tage alte Hühnerem
bryonen. Es sind jedoch auch andere Gewebearten, insbesondere
Embryonalgewebe oder Hirngewebe von anderen Spezies geeignet.
Durch Homogenisierung des Gewebes und anschließende Zentrifu
gation erhält man einen Gewebeextrakt, welcher den weiteren
Verfahrensstufen zugeführt werden kann. Die Schritte der
Homogenisierung und Zentrifugation können nach üblichen, dem
Fachmann bekannten Methoden durchgeführt werden und sind für
das erfindungsgemäße Verfahren nicht besonders kritisch.
Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin,
daß man den Gewebeextrakt auf einen Kationenaustauscher gibt
und die an den Kationenaustauscher bindenden Substanzen einer
Fraktionierung unterwirft. Die erfindungsgemäßen Inhibitoren
sind in der Lage, bei etwa neutralen pH-Bedingungen und Salz
konzentrationen von bis zu 100 mmol/l an einen Kationenaus
tauscher zu binden, während ein Großteil der im Gewebeextrakt
enthaltenen Substanzen nicht dazu in der Lage ist. Die Elu
tion der erfindungsgemäßen Substanzen von der Austauschersäu
le kann z. B. durch Erhöhung der Salzkonzentration auf
700 mmol/l erfolgen. Als geeigneter Kationenaustauscher hat
sich etwa eine CM-Sepharose-Matrix (Pharmacia/LKB) erwiesen.
Es können jedoch auch andere Kationenaustauscher verwendet
werden.
Fraktionen aus dem Kationenaustauscher-Eluat, die bei einem
in vitro-Aktivitätstest (infra) eine Inhibition der Prolife
ration von Endothel-Zellen zeigen, können gemäß Schritt (c)
des erfindungsgemäßen Verfahrens gelchromatographisch aufge
trennt werden. Es ist jedoch bevorzugt, daß man nach der
Fraktionierung über den Kationenaustauscher die aktiven Frak
tionen zuerst noch über eine Hydroxylapatitsäule gibt und
dann den Durchlauf der Hydroxylapatitsäule einer Ultrafiltra
tion unterwirft. Bei der Chromatographie an Hydroxylapatit
wird nur ein sehr kleiner Proteinanteil nicht von der Hydro
xylapatitmatrix gebunden. Da sich die erfindungsgemäßen Inhi
bitoren im Durchlauf der Säule befinden (d. h. sie binden
nicht), wird ein guter Reinigungseffekt durch diesen Schritt
erreicht.
Um das Volumen der nach der Hydroxylapatitchromatographie
vorliegenden aktiven Proteinfraktion vor dem Gelfiltrations
schritt zu verringern, wurde eine Ultrafiltration durchge
führt. Die Konzentrierung erfolgt aufgrund des geringen
Molekulargewichts der Inhibitoren über einer 500 Da-Membran.
Man findet danach die inhibitorisch wirkenden Substanzen im
Retentat wieder, das Filtrat hat keinerlei inhibierende Wir
kung auf die Endothelzellen-Proliferation.
Die Ultrafiltration kann darüber hinaus zur weitgehenden
Entsalzung der Probe mittels zweier Diafiltrationsschritte
benutzt werden. Das Volumen der Probe beträgt danach etwa 1/6
bis 1/10 des Ausgangsvolumens. Eine weitere Konzentrierung
kann durch anschließende Lyophilisation der Probe und Aufnah
me des Lyophilisats in einem minimalen Volumen 0,2 M Essig
säure erzielt werden. Mit diesem Puffer kann auch die Gelfil
trationssäule, auf die die Probe anschließend aufgetragen
wird, äquilibriert werden.
Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens ist eine gel
chromatographische Auftrennung der bisher erhaltenen aktiven
Fraktionen. Als geeignetes Material für die Gelfiltration hat
sich Biogel P2 erwiesen, das eine nominelle Ausschlußgröße
von etwa 1,8 kDa aufweist. Die inhibitorisch wirksamen Sub
stanzen werden unter den gewählten Bedingungen nicht im Aus
schlußvolumen der Säule eluiert. Folglich sollten die inhibi
torisch wirksamen Substanzen ein Molekulargewicht von weniger
als 1800 Da aufweisen. Andererseits besteht die Möglichkeit,
daß starke spezifische Wechselwirkungen mit der Matrix zu
einer ungewöhnlich starken Retardierung der Substanzen und
damit zur Vortäuschung eines zu geringen Molekulargewichts
führen. Nach Auftrennung von Aliquots aus aktiven Fraktionen
der Gelfiltration durch SDS-PAGE und anschließender Silber
färbung konnten mehrere Banden sichtbar gemacht werden, deren
Molekulargewichte zwischen 2,5 und 20 kDa liegen. Anhand
dieses Bandenmusters werden für den weiteren Gang der Isolie
rung die Fraktionen zusammengefaßt, die eine breite Bande
zwischen 2 und 6 kDa - auf die der Begriff EMBIN I fortan
bezogen wurde - aufweisen. Ebenso wurden die Fraktionen zu
sammengefaßt, die eine breite Bande im Bereich zwischen 14
und 20 kDa zeigten. Die mit diesen Fraktionen verbundene
Inhibitionswirkung wurde mit der Bezeichnung ANEMIN belegt
und im folgenden getrennt von EMBIN I aufgereinigt.
Schritt (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Anreicherung
der inhibitorisch wirksamen Substanzen ist eine Reinigung
über Reverse-Phase-HPLC. Dafür wurden unterschiedlich belegte
Säulenmatrizes verschiedener Hersteller für die
Reverse-Phase-HPLC und ein Trifluoressigsäure/Acetonitrilgradient als
Elutionsmittel eingesetzt. Die inhibitorisch wirksamen Sub
stanzen konnten jedoch bei dieser Verfahrensweise nicht an
die Säule gebunden werden, sondern fanden sich regelmäßig im
Anteil der ungebundenen Substanzen. Aus gelelektrophoreti
schen Analyse der einzelnen Fraktionen wurde ersichtlich, daß
in der inhibitorisch wirksamen Fraktion eine breite Bande mit
einem Molekulargewicht im Bereich von 2,5 bis 6,5 kDa
(EMBIN I) vorhanden war.
Aufgrund der guten pH-Stabilität der Polyvinylmatrix der
Asahipak ODP50 Säule konnte eine Chromatographie im alkali
schen Milieu ohne den bei Verwendung von anderen Silicamate
rialien notwendigen Zusatz von Alkylammoniumionen durchge
führt werden. Bei Durchführung der Reverse-Phase-HPLC bei
einem pH-Wert von 12,5 wurde eine Bindung von EMBIN I an die
Säulenmatrix gefunden. Bei Analyse der inhibitorisch wirksa
men Fraktionen im Polyacrylamidgel wurde gefunden, daß eine
breite Bande im Molekulargewichtsbereich von 2,5 bis 6,2 kDa
vorhanden ist.
Weiterhin hat es sich auch als günstig erwiesen, die HPLC-Reinigung
in Gegenwart eines sauren Ionenpaarbildners durch
zuführen. Als saure Ionenpaarbildner sind organische Sulfon
säuren, insbesondere Alkyl- oder Arylsulfonsäuren geeignet.
Diese Sulfonsäuremoleküle können einerseits über ihren hydro
phoben Alkylanteil mit den hydrophoben Gruppen der Säulen
matrix wechselwirken, während sie gleichzeitig über ihre
Sulfonsäuregruppierung positiv geladene Substanzen binden
können. Die Konzentration der Sulfonsäure beträgt günstiger
weise zwischen 0,1 und 50 mmol/l, besonders bevorzugt zwi
schen 1 und 10 mmol/l.
Tatsächlich wurde festgestellt, daß EMBIN I an eine mit
5 mmol/l Heptansulfonsäure, pH 3,5 äquilibrierte Asahipak ODP50
Säule bindet und sich in einem linearen Gradienten wieder
eluieren läßt.
Auch die ANEMIN-enthaltenden Fraktionen der Gelchromatogra
phie können durch Reverse-Phase-HPLC, z. B. in Gegenwart von
Heptansulfonsäure als Ionenpaarbildner analog zu EMBIN I
weiter aufgereinigt werden. Bei Elektrophorese in Polyacryl
amidgel findet man die Bande für ANEMIN im Bereich zwischen
16 und 20 kDa.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren lassen sich die als
EMBIN I bzw. ANEMIN bezeichneten Inhibitoren für die Prolife
ration von Endothelzellen als Reinsubstanzen herstellen,
wobei Gewebe aus Hühnerembryonen als Ausgangsmaterial verwen
det wurde. Verwendet man adultes Rinderhirn als Ausgangsmate
rial, so gelingt es mit identischen Verfahrensschritten zwei
entsprechende Substanzen zu erhalten, die bei Elektrophorese
im Polyacrylamidgel die Mobilitätseigenschaften von EMBIN I
und ANEMIN aufweisen.
Die Aktivität der inhibitorisch wirksamen Substanzen wurde
in vitro durch den BAEC-Test und in vivo durch den CAM-Test
analysiert, die im folgenden Beispiel 1 detailliert darge
stellt sind.
Die erfindungsgemäßen Substanzen können bei der Behandlung
aller Krankheiten, bei denen eine gesteigerte Angiogenese
stattfindet und die oben bereits erwähnt wurden, verwendet
werden. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Substanzen
zur Hemmung des Tumorwachstums, wie von Kaposi-Sarcomen oder
Hämangiomen, zur Behandlung von Augenerkrankungen, bei wel
chem gesteigertes Kapillarwachstum auftritt, insbesondere der
diabetischen Retinopathie und der retrolentalen Fibroplasie,
sowie bei der rheumatoiden Arthritis oder zur Regelung der
Wundheilung eingesetzt werden.
Die vorzugsweise verwendete Dosis des erfindungsgemäßen Sub
stanzen pro kg Körpergewicht dürfte in der Größenordnung µg
bis maximal mg liegen.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung in Verbindung mit
der Zeichnung verdeutlichen. In der Zeichnung zeigen:
Abb. 1 eine Gelfiltrationschromatographie des Gewebeex
trakts aus Hühnerembryonen,
Abb. 2 die Hemmung der Endothelzellproliferation der Frak
tionen aus der Gelchromatographie,
Abb. 3 das Proteinmuster der Fraktionen 11-17 aus der
Gelfiltration,
Abb. 4 das Elutionsprofil von EMBIN I bei RP-HPLC in
TFA/Acetonitril,
Abb. 5 das Elutionsprofil von EMBIN I bei RP-HPLC bei pH
12,5,
Abb. 6 das Elutionsprofil von EMBIN I in Gegenwart von
Heptansulfonsäure,
Abb. 7 das Elutionsprofil von ANEMIN bei der RP-HPLC in
Gegenwart von Heptansulfonsäure,
Abb. 8 eine SDS-PAGE von ANEMIN.
Retinafaktor ist ein wäßriger Extrakt aus Rinderretinae, der
als Endothelzellmitogen im wesentlichen bFGF enthält (basic
fibroblast growth factor; Mascarelle et al. 1987).
Die Retinae aus 25-50 Rinderaugen wurden herauspräpariert
und mit dem gleichen Volumen an PBS (Phosphat gepufferte
Kochsalzlösung) bis zum nächsten Tag bei 4°C inkubiert
(D′Amore et al., J. Cell. Biol. 99 (1984), 1545-1549). Die
Präparation wurde mehrmals vorsichtig aufgerührt. Die festen
Bestandteile wurden zuerst durch eine zehnminütige Zentrifu
gation bei 1000 Upm (Heraeus) entfernt, der Überstand wurde
anschließend nochmals 30 min lang bei 45 000 g zentrifugiert
(Sorvall, SS34). Der Überstand der zweiten Zentrifugation
wurde aliquotiert und bei -20°C eingefroren. Vor Gebrauch
wurden die Aliquots sterilfiltriert (0,2 oder 0,45 µm Poren
größe).
Für den Nachweis der Hemmung der Endothelzellproliferation
wurden Endothelzellkulturen verwendet, die aus Rinderaorten
gewonnen worden waren (BAEC; bovine aortic endothelial cells;
Passage 6-17). Für den Aktivitätstest wurden zu Beginn (Tag
1) in einer Zellkulturschale mit 24 Vertiefungen (Costar)
10-15 000 BAEC pro Vertiefung in Dulbecco′s modifiziertem
Minimalmedium (DMEM), das 5% fötales Kälberserum (FCS) ent
hielt, ausgesät, die sich innerhalb der nächsten 6-8 h auf
der Plastikunterlage anhefteten.
Am darauffolgenden Tag (Tag 2) wurden nicht adhärierende
Zellen zusammen mit dem alten Nährmedium entfernt und gegen
DMEM mit 5% FCS und 40 µl/ml Retinafaktor ausgetauscht.
Durch den Zusatz von Retinafaktor zum Medium wird die Proli
feration der Endothelzellen stark simuliert. Nach dem Wechsel
des Mediums erfolgte die Zugabe der auszutestenden Proben
(bis zu 40 µl/well). Die Zellen wurden weitere 3 Tage bei
7,5% CO2 und bei 37°C inkubiert, danach (Tag 5) wurde die
Zellzahl im Coulter Counter bestimmt. Durch diese Konzeption
der Versuche wurden die untersuchten Proben auf den Gehalt an
Substanzen überprüft, die die Proliferation von Endothelzel
len, sogar in Gegenwart von Mitogenen, hemmen können.
Nach der 72-stündigen Inkubationsperiode wurden die Zellen
mit Ca- und Mg-freiem PBS gewaschen, durch Trypsinierung von
der Unterlage abgelöst (0,5 ml 0,05% Trypsin/0,02% EDTA-
Lösung, Gibco) und in 9,5 ml Isoton-Lösung überführt. Die
Bestimmung der Zellzahl erfolgte in einem Coulter Counter,
Industrial D (Attenuation: 2; Aperture Currend: 0,0093;
Threshold: 12; Kapillarbohrung: 200 µm). Die graphische Aus
wertung der gewonnenen Daten wurde mit den Programmen
"Cricket Graph" und "Kaleidagraph" auf Computern der Fa.
Apple durchgeführt.
Die Proliferationstests mit glatten Muskelzellen (SMC; smooth
muscle cells) und NIH 3T3-Fibroblasten wurden nach der glei
chen Methode durchgeführt. Im Gegensatz zu BAEC ist die Sti
mulation der Proliferation von SMC und 3T3-Fibroblasten in
Gegenwart von 10% FCS im Kulturmedium ausreichend und der
Zusatz von Retinafaktor erübrigt sich.
Bruteier der Fa. Hölzl (Wasserburg am Inn) wurden in einem
Eierinkubator mit automatischer Wendung der Eier nach jeweils
6 h bei 37°C und 70-80% Luftfeuchtigkeit bebrütet.
Am Tag E3 wurden Fenster mit einem Durchmesser von ca. 1 cm
in die Schale befruchteter, drei Tage alter Hühnereier ge
schnitten, damit später die in Methylcellulose eingebetteten
Faktoren auf die CAM appliziert werden konnten. Hierzu wurde
auf die Oberseite der Eierschale zunächst ein Stück
Scotch-Klebestreifen aufgeklebt. An der spitzen Seite des Eies wur
den dann mit Hilfe einer 10 ml-Spritze und einer kräftigen
Kanüle 2-3 ml Eiweiß entnommen, um den Embryo, der oben auf
dem Eidotter schwimmt, etwas abzusenken. Nun wurde mit einer
spitzen Schere in der Mitte des Klebestreifens ein Loch in
die Eierschale geschnitten. Auf diese Weise wird das Herab
fallen von Eierschalenbruchstücken auf die CAM weitgehend
vermieden. Diese Schalenbruchstücke können selbst eine der
Angiogenese ähnliche Reaktion hervorrufen. Das Loch in der
Eierschale wurde daraufhin mit einem zweiten Streifen
Scotch-Klebeband verschlossen und die Eier weitere 3-4 Tage unter
denselben Bedingungen bebrütet.
Die zu testenden Fraktionen wurden mit dem gleichen Volumen
einer sterilen 1%igen Methylcellulose-Lösung (4000 cpi;
Sigma) im Verhältnis 1 : 1 gemischt. Jeweils 10 µl wurden auf
die geglättete Schnittfläche von Teflonstäbchen (d = 3 mm)
pipettiert und unter der Sterilhaube getrocknet. Mit einer
feinen Pinzette konnten die Methylcellulose-Scheibchen von
den Teflonstäbchen abgezogen und vorsichtig am Entwicklungs
tag E6 oder E7 auf die CAM aufgelegt werden. Nach 48 oder 72
h wurden die Bereiche der CAM in der Umgebung der Methylcel
lulose-Scheibchen unter dem Binokular auf Angiogeneseinhibi
tion untersucht. Zur Kontrastierung des Gefäßnetzes wurde den
Embryonen mittels einer Glaskapillare etwa 20 µl einer Lösung
von 40% Luconyl-Blau (Hoechst) in PBS in eine Allantoisvene
injiziert.
Pro Methylcelluloseplättchen (n = 39) wurden ∼240 ng EMBIN I
eingesetzt. Am Rand von 4 Plättchen konnte eine avaskuläre
Zone beobachtet werden, unter 6 Plättchen war eine nur schwa
che Blutgefäßneubildung zu erkennen. Bei den restlichen Em
bryonen konnte keine Veränderung im Gefäßmuster beobachtet
werden.
Als Ausgangsmaterial wurden Bruteier der Fa. Hölzl (Wasser
burg am Inn) eingesetzt. 4-10 Tage nach Beginn der Bebrütung
der Eier wurden diese über einer großen Petrischalge geöffnet
und die Embryonen entnommen. Von den Embryonen wurde die
Amnionhaut und vor allem die Allantois möglichst vollständig
abpräpariert, um Einflüsse aus der Allantoisflüssigkeit, die
den embryonalen Harn darstellt, auszuschalten. Die Embryonen
wurden bis zur Extraktion bei -20°C eingefroren aufbewahrt
und vor Beginn der Präparation über Nacht bei 4°C angetaut.
2500-3500 Hühnerembryonen der Entwicklungstage E4 bis E10,
entsprechend einem Naßgewicht von 1,8 bis 3 kg wurden in
Portionen von 300 g mit insgesamt 1,5 bis 2 l Extraktionspuf
fer (20 mM MOPS pH 6,8/100 mM NaCl/2 mM PMSF) in einem Kü
chenmixer der Fa. Braun homogenisiert. Das Homogenat wurde
anschließend 30 min bei 4°C unter Rühren extrahiert und die
unlöslichen Bestandteile durch 90-minütige Zentrifugation bei
22 000 g abgetrennt (Sorvall, GSA-Rotor).
Der im ersten Schritt gewonnene Extrakt wurde auf eine
CM-Sepharose-Säule (Pharmacia/LKB, Freiburg; 50·250 mm) ge
pumpt, die mit Auftragspuffer (20 mM MOPS pH 6,8/100 mM NaCl)
äquilibriert worden war. Die Flußrate lag bei 500 ml/h. Nach
dem Auftragen des Extraktes wurde die Säule mit Auftragspuf
fer so lange gewaschen, bis die Absorption bei 280 nm ein
Minimum erreicht hatte. 86% des gesamten Proteins befanden
sich im Durchlauf. Die an die Säule gebundenen Proteine,
darunter auch die inhibitorisch wirksamen Substanzen EMBIN I
bzw. ANEMIN, wurden daraufhin in einer Stufe mit 700 mM NaCl
in 20 mM MOPS pH 6,8 eluiert.
Das Gelbett hierfür wurde mit einer Flußrate von 50 ml/h
gepackt, nachdem das trockene Hydroxylapatitpulver (Bio-Gel
HTP, Fa BioRad, München) im Auftragspuffer (20 mM MOPS, pH
6,8) genügend gequollen war. Das Eluat aus der Kationenaus
tauschchromatographie wurde dann direkt in 2-3 Portionen mit
40 ml/h auf die in 20 mM MOPS pH 6,8 äquilibrierte Hydroxyl
apatit-Säule (25·100 mm) aufgetragen, die anschließend so
lange mit dem Äquilibrierungspuffer gewaschen wurde, bis die
Absorption bei 280 nm minimal war. Nur ein sehr kleiner Pro
teinanteil (darunter die inhibitorisch wirksamen Substanzen)
wurde von der Hydroxylapatit-Matrix nicht gebunden und befand
sich im Durchlauf der Säule.
Das reversibel an die Hydroxlapatit-Matrix gebundene Material
konnte durch 0,4 M Kaliumphosphat-Puffer pH 6,8 eluiert wer
den. Dieses Eluat wurde anschließend gegen 2·5 l 20 mM
MOPS-Puffer pH 6,8 oder gegen 0,5·PBS pH 7,2 dialysiert.
Dabei wurden in der Regel Visking-Dialyseschläuche verwendet,
die eine nominelle Trenngrenze von 10-15 kDa haben.
Das nicht an Hydroxylapatit gebundene Material wurde über
einer YC05-Ultrafiltrationsmembran (Amicon GmbH, Witten,
nominelle Ausschlußgrenze: 500 Da) in einer Ultrafiltra
tionszelle (Amicon GmbH, Witten; Typ 8400) auf ca. ein Zehn
tel des Ausgangsvolumens eingeengt. Die Entsalzung der Lösung
erfolgte in der gleichen Kammer durch Diafiltration mit dest.
Wasser.
Das weitgehend entsalzte Konzentrat aus der Ultrafiltration
wurde zur weiteren Reduktion des Lösungsvolumens lyophili
siert. Für die Gelfiltration der in jeweils ca. 4-6 ml 0,2 M
Essigsäure aufgenommenen Lyophilisate wurde eine Bio-Gel P2
Säule (Fa. BioRad, München; 200-400 mesh; nominelles Aus
schlußgewicht: 1800 Da) verwendet, die in 0,2 M Essigsäure
äquilibriert worden war. Die Probe wurde mittels einer Peri
staltikpumpe (LKB/Pharmacia) auf die Säule aufgetragen und
die Gelfiltration durch Aufpumpen des Laufmittels auf die
Säule bewerkstelligt. Die Flußrate während der Gelfiltration
betrug 6 ml/h, die Detektion der aufgetrennten Proteine und
Peptide erfolgte bei 280 nm. Der Säulendurchlauf wurde frak
tioniert gesammelt (UltroRac; LKB; 40 min/Fraktion).
Abb. 1 zeigt die Gelfiltrationschromatographie auf einer
Biogel P2-Säule. Der größte Teil der aufgetragenen Proteine
und Peptide wird im Ausschlußvolumen der Säule eluiert (Frak
tionen 5-10). Die Fraktionen 17-20 enthalten das noch vor
handene Salz und markieren zugleich die untere Ausschlußgren
ze der Säule. Die Fraktionen der Gelfiltration wurden zur
Entfernung der Essigsäure lyophilisiert und in jeweils 4 ml
H2O bidest. aufgenommen.
Abb. 2 zeigt die Hemmung der Endo
thelzellproliferation in den Fraktionen nach der Gelfiltra
tion. (S) und (H) geben die Zellzahlen zum Zeitpunkt des
Probenauftrags und nach der maximalen Proliferation wieder.
Die durch Aliquots aus den Fraktionen 5-24 ausgelöste Wir
kung auf die Endothelzellproliferation ist durch die entspre
chende Säulenhöhe dargestellt.
Abb. 3 zeigt eine Auftrennung von Aliquots aus den Fraktionen
11-17 durch SDS-PAGE und anschließende Silberfärbung. Es
sind mehrere Banden sichtbar, deren Molekulargewichte zwi
schen 2,5 und 20 kDa liegen. Anhand des Bandenmusters werden
für den weiteren Gang der Isolierung die Fraktionen 11-13
zusammengefaßt, die neben einer breiten Bande zwischen 2 und
6 kDa (EMBIN I) eine prominente Bande bei 13 kDa und mehrere
schwächere Banden aufwiesen. Ebenso wurde mit den Fraktionen
14 und 15 verfahren, die neben einer Bande bei 13 kDa eine
breite Bande im Bereich zwischen 14 und 20 kDa (ANEMIN) zeig
ten.
Sämtliche Reversed Phase Chromatographieschritte wurden auf
einer HPLC-Anlage der Fa. Kontron (Eching) mit 2 HPLC-Pumpen
vom Typ 420, einem Detektor 430 und dem Datensystem 450
durchgeführt. Das Datensystem 450 besteht aus einem AT-Rech
ner mit implementierter Steuerungssoftware, sowie Software
zur Aufnahme und Verarbeitung der registrierten Daten. Die
Detektion der aufgetrennten Substanzen erfolgte in der Regel
simultan bei zwei Wellenlängen (im Bereich der Absorption der
Peptidbindung bei einer Wellenlänge zwischen 214 und 220 nm,
sowie bei 280 nm, dem Absorptionsmaximum von Tyrosin).
Fertig gepackte RP-Säulen mehrerer Herteller wurden hinsicht
lich ihrer Eignung für die weitere Reinigung von EMBIN I
unter Verwendung des TFA/Acetonitril-Lösungsmittelsystems
untersucht. Die Säulen wurden in Puffer A (0,1% TFA;
Rathburn, Schottland) äquilibriert und durch lineare Gradien
ten mit ansteigender Konzentration von Lösung B (0,09% TFA
in 95% Acetonitril; Rathburn, Schottland) eluiert. Eine
Zusammenfassung der Experimente ist in Tabelle I gegeben.
Zusammenfassung der Chromatographie im Reversed Phase Modus
zur Isolierung von EMBIN I. Die Flußrate betrug 1 ml/min, die
Fraktionsgröße 1 min. Die Absorption wurde bei 214 und 280 nm
registriert.
Abb. 4 zeigt das Elutionsprofil einer RP-HPLC am Beispiel der
Asahipak ODP50-Säule (C18-Belegung). Aus der gelelektrophore
tischen Analyse der einzelnen Fraktionen wurde ersichtlich,
daß die inhibitorisch wirksame Aktivität sich in Fraktion 3
(schraffiert dargestellt) befindet. Eine gelelektrophoreti
sche Analyse zeigt eine Bande mit einem Molekulargewicht von
2,5 bis 6,5 kDa, bei der es sich um EMBIN I handelt.
Puffer A: 10 mM Tris, mit 5N NaOH auf pH 12,5 eingestellt.
Puffer B: 10 mM Tris pH 10/80 % Acetonitril.
Nachdem die Asahipak ODP50-Säule in 5% Puffer B äquilibriert
worden war, wurden 500 µl des YC05-Konzentrats von EMBIN I
mit dem gleichen Volumen des Äquilibrierungspuffers versetzt
und auf die Säule aufgebracht (1 ml/min; 1 min/Fraktion;
Detektion bei 220 und 280 nm). Die Elution der unter diesen
Bedingungen gebundenen Substanzen erfolgte innerhalb von 25
min mit einem linearen Gradienten von 0 bis 100% Puffer B.
Die Fraktionen wurden im Vakuumkonzentrator vom Lösungsmittel
befreit und in jeweils 250 µl H2O bidest. aufgenommen.
Abb. 5 zeigt die Elution einer EMBIN I-haltigen Probe bei pH
12,5. Die aktive Fraktion (Bestimmung durch den BAEC-Test)
ist schraffiert dargestellt. Bei Elektrophorese im Polyacryl
amidgel zeigte die inhibierende Fraktion die EMBIN I-Bande im
Molekulargewichtsbereich von 2,5 bis 6,2 kDa.
Der letzte Reinigungsschritt von EMBIN I wurde auf einer
6·150 mm großen Asahipak ODP C18-Säule durchgeführt (Asahi
Chemical Industry, Japan). EMBIN I-haltige Fraktionen aus der
Gelfiltration wurden in einem Vakuum-Konzentrator getrocknet
und in 5 mM Heptansulfonsäure pH 2,5 aufgenommen (Regis
Chemical Company, Morton Grove, Illinois, oder Fluka Chemika
lien, Ulm). 1 ml-Aliquots wurden auf die Säule (in 5 mM Hep
tansulfonsäure pH 2,5 äquilibriert) aufgetragen, die Elution
erfolgte mit einem linearen Gradienten von 0 bis 100% 5 mM
Heptansulfonsäure pH 2,5 in 90% Acetonitril während 35 min.
Das fraktionierte Eluat wurde in einem Vakuum-Konzentrator
vom Lösungsmittel befreit und die Rückstände wurden in bi
dest. Wasser für die weitere Analyse aufgenommen.
Abb. 6 zeigt das Elutionsprofil einer EMBIN I-haltigen Probe
bei der RP-HPLC in Gegenwart von Heptansulfonsäure als Ionen
paarbilder. Die im Aktivitätstest positiven Fraktionen (als
schraffierte Fläche dargestellt) zeigten bei gelelektrophore
tischer Auftrennung die EMBIN I-Bande.
Abb. 7 zeigt das Elutionsprofil von ANEMIN bei der RP-HPLC
mit Heptansulfonsäure. Die im BAEC-Aktivitätstest positiven
Fraktionen sind als schraffierte Fläche dargestellt. Dazu
wurden die lyophilisierten Fraktionen 14 und 15 aus der Gel
filtration in 2 ml des Äquilibrierungspuffers aufgenommen und
unter den gleichen Bedingungen wie oben aufgetrennt. In die
sen Fraktionen waren neben ANEMIN auch noch EMBIN I vorhan
den.
Abb. 8 zeigt ein SDS-Polyacrylamidgel der Fraktionen 22-37
aus der RP-HPLC von ANEMIN. Aliquots aus jeder Fraktion wur
den auf einem Gel aufgetrennt und die Peptidbanden durch
Silberfärbung sichtbar gemacht. Die ANEMIN-Bande im Bereich
zwischen 16 und 20 kDa war demnach in den Fraktionen 25 bis
29 enthalten, während EMBIN I noch in den Fraktionen 31 und
32 sichtbar war.
Jeweils 100 µl eines Kationenaustauschereluates mit inhibie
render Wirkung auf die Proliferation von Endothelzellen wur
den 2, 5, 10 und 60 min lang in einem Wasserbad auf 90°C
erhitzt. Danach wurden die Proben auf Eis gestellt und nach
Sterilisation im Proliferationstest auf ihre noch verbliebene
hemmende Eigenschaft untersucht.
Für die Untersuchung der Inaktivierbarkeit von EMBIN I durch
die Behandlung mit verschiedenen Proteasen wurde als Substrat
das diafiltrierte YC05-Retentat vor oder nach der Gelfiltra
tionschromatographie auf Bio-Gel P2 eingesetzt. Mit folgenden
Proteasen wurde die Inaktivierung der inhibitorischen Aktivi
tät von EMBIN I versucht:
Trypsin, S. aureus V8 Protease, Clostripain, Thermolysin, Subtilisin, Pronase E, Proteinase K, Carboxypeptidase Y, Papain, Pepsin (Sigma); Chymotrypsin, Pyroglutamat-Aminopep tidase, Endoproteinase Arg-C, Endoproteinase Lys-C (Boehrin ger); Prolin spezifische Endopeptidase (Seikagaku Kogyo, Japan).
Trypsin, S. aureus V8 Protease, Clostripain, Thermolysin, Subtilisin, Pronase E, Proteinase K, Carboxypeptidase Y, Papain, Pepsin (Sigma); Chymotrypsin, Pyroglutamat-Aminopep tidase, Endoproteinase Arg-C, Endoproteinase Lys-C (Boehrin ger); Prolin spezifische Endopeptidase (Seikagaku Kogyo, Japan).
Die Proteasen wurden in den für die jeweils erforderlichen
Puffern gelöst und in einem Aliquot des EMBIN I-Substrats
unter den für das betreffende Enzym angegebenen Bedingungen
inkubiert. Zur Kontrolle der Proteaseaktivität wurden BSA
oder Lysozym in Parallelversuchen mit den Proteasen inkubiert
und die Degradation der Proteine durch SDS PAGE überprüft. Am
Ende der Inkubationszeit wurden die Proteasen durch Erhitzen
des Ansatzes für 5 min auf 95°C inaktiviert, dieser steril
filtriert und auf die Inaktivierung von EMBIN I im BAEC-Test
überprüft.
Als Positivkontrolle wurde ein entsprechendes Aliquot an
EMBIN I ohne Enzym, aber mit den in den verschiedenen Ansät
zen verwendeten Volumen an Verdaupuffer unter den gleichen
Bedingungen inkubiert und im BAEC-Test getestet.
Je 20 µl des diafiltrierten YC05-Retentats wurden zunächst
mit 1 µl einer 1 M Tris/HCl-Lösung pH 7,5 versetzt, der
DNase-Ansatz zusätzlich mit 1 µl einer 0,1 M Magnesiumchlo
rid-Lösung. Nach der Zugabe von jeweils 1 µl des Enzyms
(Boehringer Mannheim) wurde 30 min bei 37°C inkubiert, der
Verdau anschließend durch Zugabe von 10 µl Probenpuffer abge
brochen und die Gemische gelelektrophoretisch untersucht.
500 µl des entsalzten YC05-Retentats wurden mit 29 µl eines
700 mM Natriumacetat-Puffers auf pH 5,0 eingestellt und mit
1 U Neuraminidase (Typ X; Sigma) 24 h bei 37°C verdaut. Nach
Lyophilisation in der "Speedvac" wurde der Rückstand in
500 µl 50 mM Tris/HCl-Puffer pH 7,3 aufgenommen und mit Mag
nesiumchlorid versetzt (10 mM Endkonzentration).
250 µl davon wurden für die gelelektrophoretische Analyse und den Proliferationstest entnommen, der Rest wurde mit 10 U β-Galactosidase (Sigma) 18 h lang bei 37°C inkubiert. Nach der Lyophilisation erfolgte die Aufnahme in 250 µl dest. Wasser und die Überprüfung der Probe im Proliferationstest.
250 µl davon wurden für die gelelektrophoretische Analyse und den Proliferationstest entnommen, der Rest wurde mit 10 U β-Galactosidase (Sigma) 18 h lang bei 37°C inkubiert. Nach der Lyophilisation erfolgte die Aufnahme in 250 µl dest. Wasser und die Überprüfung der Probe im Proliferationstest.
20 µl eines YC05-Retentats wurden in der "Speedvac" getrock
net, danach in dem gleichen Volumen des Verdaupuffers aufge
nommen (20 mM Kaliumphosphat pH 6,8; 10 mM EDTA pH 8; 0,2%
Triton X 114; 0,1% SDS und 1% Mercaptoethanol). Zu diesem
Ansatz wurden 3 µl einer Glycopeptidase F-Lösung (Glycopepti
de-N-glycosidase; Boehringer Mannheim) pipettiert und über
Nacht bei 37°C inkubiert. Der Verdau wurde durch die Zugabe
von SDS-Probenpuffer abgebrochen und mit Hilfe der SDS-PAGE
analysiert.
Als alternatives Nachweissystem für den Nachweis von N- oder
O-glycosidisch gebundenen Glycanresten im EMBIN I-Molekül
wurde das von der Fa. Boehringer (Mannheim) vertriebene "Gly
can Detection Kit" eingesetzt, das die Detektion von bis zu
1 ng Glycoprotein erlaubt.
10 und 20 µl einer durch RP-HPLC gereinigten EMBIN I-Probe
wurden nach den Angaben des Herstellers für die Derivatisie
rung und den Immunoblot-Nachweis eingesetzt, ebenso 10 Mg
Transferrin als Kontrollprotein. Die Auftrennung der Digoxi
geninderivate erfolgte in einem 1,5% SDS-Gel nach der
Laemmli-Methode. Der Transfer auf Nitrocellulose (0,45 µm;
Schleicher und Schuell) wurde nach der Methode von Bjerrum et
al. (in: Electrophoresis, S. 315 ff (1986), Weinheim, Verlag
Chemie) durchgeführt. Der Teil des SDS-Gels, in dem die Mar
kerproteine und die unbehandelte EMBIN I-Probe aufgetrennt
worden waren, wurde mit Silber angefärbt.
1 ml einer inhibitorisch aktiven Fraktion nach Chromatogra
phie an Hydroxylapatit wurde mit dem gleichen Volumen einer
mit Wasser gesättigten und mit Tris/HCl-Puffer auf pH 7,5
eingestellten Phenollösung versetzt, gründlich gemischt und
zur vollständigen Phasentrennung kurz zentrifugiert. Die
wäßrige Phase wurde daraufhin dreimal mit dem gleichen Volu
men Chloroform ausgeschüttelt, um Reste von Phenol zu entfer
nen und zur Phasentrennung wiederum kurz zentrifugiert. Alle
drei Phasen (Wasser, Phenol, Chloroform) wurden in der
"Speedvac" getrocknet und für den BAEC-Test in jeweils 1 ml
20 mM MOPS-Puffer pH 6,8 aufgenommen.
20 µl einer nach der Gelfiltration auf Bio-Gel P2 inhibito
risch wirksamen Fraktion wurden mit einem Gemisch aus 50 µl
Methanol und 25 µl Chloroform versetzt, gründlich gemischt
und über Nacht bei 4°C extrahiert. Am nächsten Tag erfolgte
zur Einleitung der Phasentrennung die Zugabe von 40 µl eines
Wasser/Chloroform-Gemisches (1 : 1, v : v). Nach kurzer Zentrifu
gation wurden beide Phasen getrennt, in der "Speedvac" einro
tiert und für die Gelelektrophorese im Ausgangsvolumen
aufgenommen.
100 µl des diafiltrierten YC05-Retentats wurden mit 1 µl
Diethylpyrocarbonat (Sigma) versetzt, gründlich gemischt und
über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde im
Vakuumkonzentrator getrocknet und der Rückstand im ursprüng
lichen Volumen dest. Wasser aufgenommen. Ein unlösliches
Präzipitat wurde durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand
der Zentrifugation wurde sterilfiltriert und im Prolifera
tionstest getestet.
Als Kontrollansatz wurden 100 µl PBS genauso behandelt und
ebenfalls auf den BAE-Zellen ausgetestet.
Die Analyse der Aminosäurezusammensetzung wurde mit einigen
Modifikationen nach der von Knecht und Chang beschriebenen
Methode durch Vorsäulenderivatisierung der Aminosäuren im
Hydrolysat mit 4-Dimethylaminoazobenzol-4′-sulfonylchlorid
(Dabsylchlorid) durchgeführt (Chang et al., Biochem. J. 199
(1981), 547-555; Knecht und Chang, Anal.Chem. 58 (1986),
2375-2379).
Dabsylchorid der Fa. Pierce wurde mit einer Konzentration von
1,3 mg/ml in Acetonitril gelöst, aliquotiert und bei -20°C
gelagert. Dabei kristallisierte ein Teil des bei RT gelösten
Dabsylchorids aus, der durch vorsichtiges Erwärmen kurz vor
Gebrauch wieder in Lösung gebracht werden konnte.
Hierfür wurden jeweils 40 µl der zu bestimmenden Proben in
eine ausgeglühte Glasampulle der Fa. Wheaton (Whetaon,
Millville, New Jersey) mit 2 ml Fassungsvermögen pipettiert
und im Vakuumkonzentrator getrocknet.
Nach der Zugabe von jeweils 200 µl 6N HCl (Sigma; constant
boiling) in jede Ampulle wurden diese im Wasserstrahlvakuum
zugeschmolzen. Die Hydrolyse der Proben fand in einem Ölbad
bei 110°C statt. In der Regel wurde 24-60 Stunden hydroly
siert. Zur Berücksichtigung der Verluste bei einzelnen Amino
säuren, die während der Hydrolyse teilweise zerstört werden,
wurden in jedem Experiment 5 µl eines standardisierten Amino
säuregemisches (Sigma) unter den gleichen Bedingungen hydro
lysiert und derivatisiert.
Nach dem Abkühlen wurden die Hydrolysate in 1,5 ml Eppendorf
gefäße überführt und im Vakuumkonzentrator getrocknet. Die
Rückstände wurden in 100 µl 0,1 M Natriumhydrogencarbonat-
Puffer pH 8,3 aufgenommen. Zu jedem Derivatisierungsansatz
wurden nun 250 µl der Dabsylchlorid-Lösung pipettiert, wobei
ein hellroter Niederschlag auftritt. Bei der darauffolgenden
Erwärmung auf 70°C im Wasserbad (12 min) geht dieses Präzipi
tat wieder in Lösung, und es ist ein Farbumschlag von hellrot
über orange nach gelb zu beobachten. Im Anschluß an diese
eigentliche Kopplungsreaktion, nach der die Aminosäuren in
den Hydrolysaten als chromogene Derivate vorliegen, wurden
die Proben auf Raumtemperatur abgekühlt und anschließend
durch Zugabe von 650 µl 50 mM Kaliumphosphat/Ethanol-Puffer
pH 7,0 (1 : 1, v : v) auf ein Endvolumen von 1 ml eingestellt.
Kleinere, flockige Präzipitate, die in einzelnen Proben vor
handen waren, wurden durch 5-minütige Zentrifugation in einer
Beckmann-Tischzentrifuge entfernt.
Die chromatographische Auftrennung der derivatisierten Amino
säuren wurde auf einer HPLC-Anlage der Firma Kontron mit 2
HPLC-Pumpen vom Typ 420, einem Detektor 430 und dem Datenver
arbeitungssystem 450 durchgeführt. Die Detektion der Amino
säurederivate erfolgte bei 436 nm. Das Volumen der instal
lierten Probenschleife betrug 75 µl. Als Trennsäule fand eine
C18 Ultrasphere ODS-Säule (4,6·250 mm oder 4,6·150 mm)
der Fa. Beckmann Verwendung, die mit 5 µ-Partikeln gepackt
ist.
Die Zusammensetzung der mobilen Phasen A und B erfolgte in
Anlehnung an die von der Fa. Beckmann für ihr "Dabs-Amino
Acid Kit" herausgegebene Arbeitsvorschrift. Ausgehend von
einer Zitronensäure-Stammlösung mit 1 Mol/l wurde zunächst
eine 0,1 M Stammlösung hergestellt, der pH-Wert mit 5 N NaOH
auf 6,5 eingestellt wurde.
Die Puffer wurden wie folgt angesetzt:
A: | |
150 ml 0,1 M Natriumcitrat pH 6,5 | |
40 ml Dimethylformamid (DMF) | |
810 H₂O | |
B: | zu 300 ml von Puffer A wurden langsam und unter ständigem Rühren 700 ml einer 4%igen Lösung von DMF in Acetonitril gegeben. |
Die Auftrennung der Aminosäuren erfolgte durch Elution der
Trennsäule mit einem multilinearen Gradienten bei einer Flußrate
von 1,4 ml/min:
Von jeder zu analysierenden Probe wurden 10 µl eingesetzt.
Die quantitative Auswertung erfolgte nach Kalibrierung mit
dem gleichen Volumen des Aminosäurestandards automatisch
durch das Datensystem 450.
Das Ergebnis der Aminosäureanalyse der EMBIN I-Probe wurde
mit dem einer Kontrollprobe verglichen, die nur den zur
RP-HPLC eingesetzten Puffer (5 mM Heptansulfonsäure; 0,04% TFA)
enthielt. Diese Kontrollprobe sollte eine eventuelle Kontami
nation des Laufpuffers mit Aminosäuren aufzeigen.
Die gefundenen Mengen an Aminosäuren liegen an der Erfas
sungsgrenze dieser Methode. Beispielsweise sind die charakte
ristischen Peaks von Serin, Threonin, Arginin, Glycin und
Alanin im Chromatogramm vorhanden, ebenso die Peaks von Iso
leucin, Phenylalanin und Tyrosin. Dennoch wurden sie vom
Integrator aus dem oben erwähnten Grund nicht identifiziert.
Aus den vorhandenen Chromatogrammen konnten darüber hinaus
keine Hinweise auf das Vorkommen seltener Aminosäuren gewon
nen werden.
Claims (20)
1. Verfahren zur Anreicherung eines Inhibitors der Prolife
ration von Endothelzellen aus dem Gewebe von Wirbeltie
ren,
dadurch gekennzeichnet,
daß man
- a) das als Ausgangsmaterial gewählte Gewebe homogeni siert und anschließend zentrifugiert,
- b) den Gewebeextrakt auf einen Kationenaustauscher gibt und die an den Kationenaustauscher bindenden Substanzen einer Fraktionierung unterwirft,
- c) die aktiven Fraktionen aus Schritt (b) gelfiltrationschromatographisch auftrennt, und
- d) die aktiven Fraktionen aus Schritt (c) über HPLC-Reverse Phase reinigt.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man embryonales Gewebe aus Vögeln oder Säugern als
Ausgangsmaterial verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Hühnerembryonen als Ausgangsmaterial verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man adultes Hirngewebe aus Vögeln oder Säugern als
Ausgangsmaterial verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet,
daß man adultes Rinderhirn als Ausgangsmaterial verwen
det.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß man nach der Fraktionierung über den Kationenaustau
scher die aktiven Fraktionen über eine Hydroxylapatit
säule gibt und den Durchlauf der Hydroxylapatitsäule
einer Ultrafiltration unterwirft.
7. Verfahren nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,
daß man bei der Ultrafiltration eine Membran mit einer
Trenngrenze von 500 Da verwendet und das Retentat der
Ultrafiltration weiter verarbeitet.
8. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die gelfiltrationschromatographische Auftrennung
mit einem Material durchführt, das eine nominale
Ausschlußgrenze von etwa 1 bis 2 kDa aufweist.
9. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die HPLC-Reinigung bei einem alkalischen pH-Wert
von mehr als 8 durchführt.
10. Verfahren nach Anspruch 8,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die HPLC-Reinigung bei einem pH-Wert zwischen 10
und 13,5 durchführt.
11. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die HPLC-Reinigung in Gegenwart eines sauren
Ionenpaarbildners durchführt.
12. Verfahren nach Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die HPLC-Reinigung in Gegenwart von 0,1 bis
50 mmol/l einer Alkyl- oder Arylsulfonsäure durchführt.
13. Inhibitor der Proliferation von Endothelzellen, erhält
lich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis
12,
dadurch gekennzeichnet,
daß er bei Gelelektrophorese im SDS-Polyacrylamidgel
eine Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht im
Bereich von 2,5 bis 6,2 kDa ergibt.
14. Inhibitor nach Anspruch 13,
dadurch gekennzeichnet,
daß er gegen 60-minütiges Erhitzen auf 90°C, Nukleasen
und Proteasen resistent ist und keine nachweisbaren
Zucker- und Lipidanteile enthält, aber daß seine Aktivi
tät durch Zugabe von Diethylpyrocarbonat hemmbar ist.
15. Inhibitor der Proliferation von Endothelzellen, erhält
lich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis
12,
dadurch gekennzeichnet,
daß er bei Gelelektrophorese im SDS-Polyacrylamidgel
eine Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 16
bis 20 kDa ergibt.
16. Arzneimittel,
gekennzeichnet durch
einen Inhibitor nach Anspruch 13, 14 oder 15 als Wirk
stoff, gegebenenfalls mit üblichen Träger-, Hilfs-
oder/und Füllstoffen.
17. Verwendung eines Inhibitors nach Anspruch 13, 14 oder 15
zur Behandlung von Krankheitszuständen, bei denen eine
Inhibierung des Kapillarwachstums erforderlich ist.
18. Verwendung eines Inhibitors nach Anspruch 13, 14 oder 15
zur Behandlung von Tumoren, rheumatoider Arthritis,
diabetischer Retinopathie und retrolentaler Fibropla
sie.
19. Verwendung eines Inhibitors nach Anspruch 13, 14 oder 15
zur Wundbehandlung, um die Neubildung von Blutgefäßen zu
regulieren.
20. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Be
handlung von Krankheitszuständen, bei denen eine Inhi
bierung des Kapillarwachstums erforderlich ist,
dadurch gekennzeichnet,
daß man einen oder mehrere Inhibitoren nach Anspruch 13,
14 oder 15 in pharmazeutisch verträglicher Form formu
liert.
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