WO1997040073A2 - BIOLOGISCH AKTIVER EIWEISSSTOFF - KOLLAGENFRAGMENT HF-COLL-18/514cf - ZUR HEMMUNG DES WACHSTUMS VON TUMOREN UND VON GEFÄSSWUCHERUNGEN - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Peptid aus menschlichem Blut, das HF-COLL-18/514cf, das zum Zwecke der diagnostischen, medizinischen und gewerblichen Verwendung als Arzneimittel in seiner Struktur aufgeklärt wurde. Die Isolierung dieses neuartigen Peptides HF-COLL-18/514cf beweist die Existenz des HF-COLL-18/514cf. Die Molekülform des HF-COLL-18/514cf wurde durch Massenspektrometrie und aminoterminale Sequenzierung bewiesen, und daß HF-COLL-18/514cf ein natürliches Peptid darstellt, welches zur Behandlung von zahlreichen Erkrankungen, die mit Störungen des Wachstums von Zellen, insbesondere von Endothelzellen und Gefäßen einhergehen und z.B. bei Krebs benutzt werden sollte. Weiter kann das HF-COLL-18/514cf in reiner Form oder als natürliches Rohextrakt für gewerbliche Zwecke in der Erforschung neuer Zellfunktionen benutzt werden.

Description

Biologisch aktiver Eiweißstoff - Kollagenfragment HF-COLL- 18/514cf - zur Hemmung des Wachstums von Tumoren und von Gefä߬ wucherungen

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Peptid (Eiwei߬ stoff) mit der Fähigkeit, das Wachstum von Zellen zu beeinflus¬ sen. Das Kollagenfragment HF-C0LL-18/514cf, sowie von ihm abgeleitete Fragmente und/oder Derivate sowie ein Arzneimittel das die natürlichen und synthetischen Peptide enthält kann zu diagnostischen oder therapeutischen Zwecken eingesetzt werden.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eineε Eiwei߬ stoffes in reiner oder partiell aufgereinigter Form aus mensch¬ lichen Körperflüssigkeiten, der die Fähigkeit besitzt, das Wachstum von Zellen erstaunlich zu beeinflussen und damit Gefäß- und Tumorwachstum zu hemmen. Ein ähnlicher Stoff konnte vor kurzem in der Maus nachgewiesen werden (O'Reilly et al . , 1997, Cell Vol.88, Seite 277) . Dieser Stoff ist dagegen dadurch gekennzeichnet, daß er insbesondere aus Hämofiltrat oder Hämo- dialysat, das aus menschlichem Blut abfiltriert wird, gewonnen werden kann. Der Stoff ist als HF-COLL-18/514cf bezeichnet und kann zum Zwecke (1) der Analyse von Erkrankungen, (2) zur medizinischen und gewerblichen Verwendung als Medikament benutzt werden.

Der Stoff HF-COLL-18/514cf wurde erstmals aus dem Hämofiltrat Nierenkranker nach Ultrafiltration am Hämodialyseapparat gewon¬ nen und wurde nach seiner molekularen Masse und den 60 Aminosäu- ren des N-Terminus charakterisiert. Zur Darstellung des HF-COLL- l8/514cf wurde ein patentiertes Verfahren (Forssmann, 1988; Offenlegungsschrift DE 36 33 707 AI) verfeinert, welches zuvor für Gewinnung von Eiweißstoffen aus Hemofiltrat erfunden wurde. Aus den mit diesem Verfahren gewonnenen Molekülen von einem Molukulargewicht unter 20 Kilodalton, die bei veno-venöser oder arterio-venöser Shuntverbindung abfiltriert werden, können die das HF-COLL-18/514cf enthaltende Fraktionen überraschenderweise durch Massenspektrometrie erkannt werden. Es wurde weiter fest¬ gestellt, daß bei speziellen weiteren Verfahren diese Substanz erstaunlicherweise derart aufgereinigt werden konnte, bis schließlich ein einheitlicher Eiweißstoff identifiziert und in seiner Struktur aufgeklärt wurde. Der Stoff iεt überraschender¬ weise ein Fragment von einem Protein, wobei das Protein bisher lediglich auf cDNA-Ebene bekannt ist (Oh et al . , 1994, Genomics Vol. 19, Seite 494) . Der Wert dieser Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß dieser Stoff aus dem bisher als wertlos betrachteten Hemofiltrat aufgereinigt werden kann, um als wirtschaftlich verwertbare Substanz benutzt zu werden.

Damit wurde eine Verbindung isoliert, deren Struktur bisher un¬ bekannt war und deren Bildungsstätte im Körper noch ungeklärt ist . Die therapeutische und wirtschaftliche Verwendung wurde geprüft und das HF-COLL-18/514cf wurde überraschenderweise als wichtiges zirkulierendes Peptid des menschlichen Blutes erkannt.

Der genannte Stoff HF-COLL-18/514cf kann durch chemische Syn¬ these und durch gentechnologische Produktion gewonnen werden und ist für zahlreiche weitere Belange nutzbar, unter anderem für die Analyse im menschlichen Blut als pathognomonisches Diagnosemerkmal von Erkrankungen des Gefäßwachstums, des Wachs¬ tums von Tumoren und von Metastasen.

Die vorliegende Erfindung betrifft also ein neues Peptid, das HF-COLL-18/514cf, seine Herstellung, dieses enthaltende Arznei¬ mittel sowie dieses enthaltende Aufbereitungen und seine Verwen¬ dung dafür, sowie seine natürlichen und pharmakologisch vertrag- 1 -

liehen Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, phosphory- lierte und glycosylierte HF-COLL-18/514cf-Derivate und Fragmente des Peptides. Durch Massenspektrometrie konnte ein mittlereε Molekulargewicht von 18494 u Dalton festgestellt werden.

Das Blutpeptid HF-COLL-18/514cf hat die Aminosäuresequenz: Val -Ala -Leu -Asn -Ser -Pro-Leu- Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly- Ile -Arg -Gly- Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala -Val -Gly-Leu-Ala-Gly- Thr- Phe- Arg- Ala- Phe - Leu - Ser -Ser- Ar Q- Leu-Gin -Asr>-Leu-Tyr- Ser -Ile - Val -Arg -Arg -Ala -Asp- Arg- Ala- Ala - Val - Pro- II e- Val -Asn-Leu-Lγs -Asp- Glu-Leu-Leu-Phe-Pro-Ser-Trv-Glu-Ala -Leu-Phe-Ser-Gly-Ser-Glu -Glv- Pro-Leu -Lys-Pro-Gly-Ala-Arg-Ile-Phe-Ser-Phe-Asp-Gly-Lys-Asv-Val- Leu-Arg-His-Pro-Thr-Try-Pro-Gln-Lys-Ser-Val -TriD-His-Gly-Ser-Asp- Pro-Asn-Glv-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-Ser-Tyr-Cvε-Glu -Thr-Try-Arg- Thr- Glu-Ala -Pro-Ser-Ala-Thr-Gly-Gln-Ala-Ser-Ser-Leu -Leu -Gly-Gl y-Arg- Leu-Leu-Glv-Gln-Ser-Ala-Ala -Ser-Cys-His-His-Ala - Tyr-Ile-Val -Leu - Cys -Il e -Gl u -Asn - Ser - Phe-Me t- Thr -AI a- Ser

Das durch die vorliegende Erfindung bereifgestellte Peptid, das HF-COLL-18/514cf, ist nunmehr ein gut zugängliches Arzneimittel mit biologischer und therapeutischer Aktivität eines natürlichen Analogons des im Blut vorkommenden Stoffes .

Die vorliegende Erfindung stellt ein Herstellungsverfahren für dieses HF-COLL-18/514cf sowie die Anwendung des HF-COLL-18/514cf als Arzneimittel für verschiedene therapeutische und diagnosti¬ sche Indikationen zur Verfügung. Dazu kann das HF-COLL-l8/514cf als hochreiner Stoff oder - wenn für die bestimmte Verwendung ausreichend - innerhalb eines teilweise aufgereinigten Peptid- gemischeε verwandt werden.

Das erfindungsgemäße Peptid, seine Derivate und Fragmente können durch verschiedene Verfahren hergestellt werden, z.B. über eine prokaryontische oder eine eukaryontische Expression und" gegebe¬ nenfalls chromatographische Reinigung. Des weiteren läßt es sich aus menschlichem Blut z.B. über an sich bekannte Chromatogra¬ phie-Verfahren isolieren. Schließlich sind HF-COLL-18/514cf oder seine Derivate oder Fragmente durch übliche Verfahren der Festphasen- und Flüssigphasen-Synthese aus den geschützten Aminosäuren, die in der angegebenen Sequenz enthalten sind, herstellbar. Nach Entfernung der Schutzgruppen kann es mit den gängigen Chromatographie-Verfahren gereinigt werden.

Die erfindungsgemäße Arzneimittelzubereitung enthält HF-COLL- 18/514cf oder ein physiologisch verträgliches Salz des HF-COLL- l8/514cf. Die Form und Zusammensetzung des Arzneimittels, welches das HF-COLL-18/514cf enthält, richtet sich nach der Art der Verabreichung. Das humane HF-COLL-18/514cf kann parenteral, intranasal, oral, intravenös, intramuskulär, intracutan, intra- thekal, lokal-topisch sowie transpulmonal verabreicht werden. Vorzugsweise wird HF-COLL-18/'514cf zu einem Injektionspräparat, entweder als Lösung oder als Lyophilisat zur Auflösung unmittel¬ bar vor Gebrauch, konfektioniert. Die Arzneimittelzubereitung kann außerdem Hilfsstoffe enthalten, die abfülltechnisch bedingt sind, einen Beitrag zur Löslichkeit, Stabilität oder Sterilität des Arzneimittels leisten oder den Wirkungsgrad der Aufnahme in den Körper erhöhen. Insbesondere die Verwendung der lyophili- sierten, mit Mannit aufgenommenen Form in sterilen Ampullen zur Auflösung in physiologischer Kochsalzlösung und/oder Infusions- lösungen zur wiederholten Einzelinjektion und/oder Dauerinfusion in Mengen von 30 Mikrogramm bis 30 Milligramm reines HF-COLL- 18/514cf pro Therapie-Einheit, ist vorteilhaft.

Die zu verabreichende Tagesdosis für HF-COLL-18/514cf hängt von der Indikation und der Anwendung bestimmter Derivate ab. Bei i.v./i.m. Injektion liegt sie im Bereich von 100 bis 1200 Einheiten (μg) /Tag, bei täglicher subcutaner Injektion vor¬ zugsweise bei 300 bis 2400 Einheiten (μg)/Tag.

Das erfindungsgemäße Peptid HF-COLL-18/514cf ist dadurch gekenn¬ zeichnet, daß es sich besonders auch für die Langzeit-JPherapie bei Tumorerkrankungen oder anderen Erkrankungen die durch ein unkontrolliertes Gefäßwachstum gekennzeichnet sind, eignet und bei Dauerbehandlung keine Immunreaktion auslöst. Das erfin- dungsgemäße Präparat ist insbesondere für die Kombinationsthera- pie mit Chemo- oder Strahlentherapie oder in Anschluß an Chemo- oder Strahlentherapie bei Krebs geeignet.

Das erfindungsgemäße Präparat ist weiter als Mittel zur Therapie und Diagnose bei Gefäßerkrankungen des Stütz- und Bindegewebes, der Atemwege, des Herz-KreislaufSystems und Urogenitalapparates, des Nervensystems und des Auges einzusetzen, da es zur Herstel¬ lung von human verträglichen Antikörpern verwandt werden kann die geeignet sind, Änderungen des Gefäßwachstums in diesen Organen festzustellen oder zu beeinflussen.

Solche Antikörper sind grundsätzlich erhältlich durch Immunisie¬ rung von Tieren mit dem erfindungsgemäßen Peptid und/oder seinen Fragmenten oder durch Anwendung der Hybridoma-Technologie.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Behandlung von Patienten, die HF-COLL-18/514cf oder seine Derivate oder Fragmente benötigen, durch Gabe therapeutischer Mengen von HF-COLL-18/514cf. Patienten, die unter einer überhöh¬ ten Produktion von HF-COLL-18/514cf oder seiner Derivate oder Fragmente leiden, benötigen die Gabe therapeutischer' Mengen eines Antagonisten/Inhibitorε des HF-COLL-18/514cf .

Das erfindungsgemäße Arzneimittel ist zur Behandlung von Erkran¬ kungen des menschlichen Organismus, insbesondere in Verbindung mit Gefäßwucherungen, Krebserkrankungen, Erkrankungen mit Beteiligung des Herzkreislauf- und Nervensystems, Erkrankungen mit Beteiligung des Intugementes und der Sinnesorgane, insbeson¬ dere des Auges, geeignet.

Erfindungsgemäß wird die Verwendung des Peptids oder seiner Derivate, der Fragmente oder des erfindungsgemaßen Antikörpers zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Störungen bei entzündlichen Prozessen, gestörten Entzündungsreaktionen, Proliferations- und Reifungsstörungen des blutbildenden Systems, von Systemerkrankungen bei Überproduktion oder Mangel von HF- COLL-18/514cf, insbesondere bei z.B. durch Anwendung gegen dieses gebildete Antikörper oder zur Verwendung von HF-COLL- 18/514cf zur Substitutionstherapie, chronischen Erkrankungen, teils vergesellschaftet mit den genannten Erkrankungen, indem es in geeigneter Form für die Behandlung für die Elektrolyt- Wirkung bei Tumor- und Gefäßerkrankungen benutzt wird, bean¬ sprucht .

Daε erfindungsgemäße Arzneimittel ist zur Behandlung von akuten Erkrankungen oben genannter Art geeignet, indem es in entspre¬ chender Form für die Behandlung in der Intensivpflege dieser Erkrankungen benutzt wird.

Eine weitere Verwendung des erfindungsgemäßen Peptids, seiner Fragmente oder des erfindungsgemäßen Antikörpers erfolgt zur Diagnose von Erkrankungen, indem spezifische Antikörper gegen synthetische Teilstücke oder das gesamte Peptid oder seiner Derivate und seiner Fragmente hergestellt werden und z.B. die Blutkonzentration des HF-COLL-18/514cf über Immuntests gemessen wird.

Ein Diagnostikmittel enthaltend das erfindungsgemäße Peptid, seine Fragmente oder erfindungsgemaße Antikörper für Testsysteme zur Kontrolle von Gewebe-, Plasma-, Urin- und Liquor cerebrospi- nalis-Spiegeln dieser Substanz sind somit auch Gegenstand der Erfindung. Das erfindungsgemaße Diagnostikmittel ist insbesonde¬ re als Marker für bestimmte Krebserkrankungen sowie für Funk¬ tionsstörungen von Blutgefäßen, Knochenmark, Lymphorganen, deε Magen-Darmtraktes, des Immunsystems und von inflammatorischen sowie neoplastischen Prozesεen, geeignet.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher er^¬ läutert . Beispiel 1 : Isolierung und Charakterisierung von zirkulierendem HF- COLL- 18 /514cf aus humanem Hämofiltrat

Als Ausgangsmaterial wurde Hemofiltrat verwendet , das in großen Mengen bei der Behandlung niereninsuf f izienter Patienten anfällt und alle Plasmabestandteile bis zu einer Molekülgröße von etwa 20 . 000 Dalton enthält .

I. Gewinnung des Rohpeptidmaterials

Das Hemofiltrat wurde mittels einer Hemofiltrationsanlage der Firma Sartorius unter Verwendung von Cellulosetriacetat-Filtern mit einer Auεschlußgröße von 20.000 Dalton (Typ SM 40042, Sartoriuε, Göttingen, BRD) gewonnen. Das Filtrat stammte von niereninsuffizienten Patienten, die sich durch Langzeit-Hemofil- tration in einer stabilen Stoffwechsellage befanden, und wurde unmittelbar nach der Gewinnung mittels Ansäuern und Abkühlung auf 4°C gegen proteolytischen Abbau geschützt. In vier Extrak¬ tionen mit einer Kationenaustauschersäule (TSK SP 650 (M) , Merck, Darmstadt, DE) wurden 2860 1 Hämofiltrat verarbeitet. 93% der gepoolten Extrakte wurden auf dem obengenannten Säulenmaterial nacheinander durch verschiedene Puffer mit unterschiedlichen pH-Werten eluiert. Die Rohfraktionen wurden anschließend ge¬ friergetrocknet .

II. Präparative RP-Chromatographie

500 mg von 2200 mg der letzten Rohfraktion wurden mittels präparativer RP-Chromatographie grob nach Hydrophobizität getrennt. Von einer PrepPak Cartridge mit den Dimensionen 47 x 300 mm der Firma Waters wurden Fraktionen abgesammelt. Die Fraktion 31, wurde für die weitere Aufreinigung benutzt.

Gerät: BioCad HPLC (Perseptive Biosystems, Freibύrg, DE)

Säule: Waters PrepPak Cartridge 47 x 300 mm

Material: Vydac, 300 Ä, 15 - 20 μm

Eluent A: Wasser mit lOmM HC1 Eluent B: Methanol mit lOmM HC1 Gradient: 0 - 50 % Eluent B 28,57 min 50 - 95 % Eluent B 61,43 min 95 % Eluent B 5,71 min Flußrate: 35 ml / min Fraktionen: 50 ml bzw. 1,43 min Detektion: 230 nm und 280 nm

III. Erste analytische RP-HPLC

UV-Absorption während der analytischen RP-Chromatographie der Fraktion 31, die aus der Auftrennung in Abbildung 1 gewonnen wurde. In einem Gradienten auf einer Vydac-Säule (10 x 250 mm Stahlmantel, Material: RP C18, 300 Ä, 5 μm) konnte eine weitere Auftrennung erzielt werden. Die Eluenten waren Wasser mit 0,1 Vol% Trifluoressigsäure und Acetonitril mit 0,1 Vol% Tri- fluoressigsäure .

Gerät : Kontron HPLC-Anlage Säule : Vydac, Stahlmantel 10 x 250 mm Material Vydac RP-C18, 300 Ä, 5 μm Eluent A Wasser mit 0,1 Vol% Trifluoressigsäure Eluent B Acetonitril mit 0,1 Vol% Trifluoressigsäure Gradient 0 - 60 % Eluent B 50 min

60 - 80 % Eluent B 5 min

80 - 0 % Eluent B 5 min

Flußrate : 2 ml / min Fraktionen 2 ml bzw. 1 min Detektion: 230 nm

IV. Entdeckung der molekularen Masse des HF-COLL-18/514cf mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Mit einem MALDI-Masenspekrometer RBT II (Vestec/Per-Septive, Houston, Texas, USA) wurden Massenspektren von dem nativen, gereinigten HF-COLL-18/514cf aus der Präparation im Schritt III mit alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure als Matrix gemessen. In den Fraktionen 45 und 46 zeigten sich Peaks von dem einfach, zwei¬ fach und dreifach protoniertem Molekül, mit einer molekularen Masse von etwa 18500 u. Verschiedene Nebenbestandteile waren außerdem sichtbar.

V. Zweite analytische RP-HPLC

In einer abschließenden analytischen RP-Chromatographie von den gepoolten Fraktionen 45 und 46, die aus der Auftrennung in Schritt III gewonnen wurden, konnte in der Fraktion 25 hochauf- gereinigtes HF-COLL-18/514cf isoliert werden.

Gerät : Kontron HPLC (Kontron, München, DE) Säule : YMC, Stahlmantel 4,6 x 250 mm Material YMC RP-C18, 300 Ä, 5 μm Eluent A Wasser mit 0,1 Vol% Trifluoressigsäure Eluent B 80 % Acetonitril, 20 % Wasser

(V : V) mit 0,1 Vol% Trifluoressigsäure

Gradient 0 - 30 % Eluent B 5 min

30 - 80 % Eluent B 150 min

80 - 100 % Eluent B 5 min

100 % Eluent B 5 min

Flußrate: 0,6 ml / min Fraktionen: manuell abgesammelt Detektion: 230 nm und 280 nm

VI. Reinheitsbestimmung mittels Kapillar-Zonen-Elektrophorese

5 μl der Fraktion 25 wurden direkt zur Messung in der Kapillar- Zonen-Elektrophorese verwendet . Das Elektropherogramm zeigt lediglich einen Peak und keine weiteren Peaks von Nebenbes¬ tandteilen. Dieses Ergebnis zeigt, daß in der Endreinigungsεtufe ein hochreines HF-COLL-18/514cf vorlag.

Gerät: P/ACE System 2000, Beckman Instruments GmbH,

München, DE Kapillare: Uncoated Fuεed Silica, 500 mm x 75 μm ID Puffer: 100 mM Natriumphosphat pH 2, 5

0,02 % Hydroxypropylmethylcellulose

Temperatur: 25°C

Injektion: 20 see entspricht 120 nl

Laufzeit: 25 Minuten

Strom: 80 μA, konstant

Detektion: 200 nm

VII. Bestimmung der molekularen Masse von HF-COLL-18/514cf

Mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie auf einem Vestec BT II des nativen, gereinigten HF-COLL-18/514cf aus Fraktion 25 im Schritt V konnten auf zwei Matrices (alpha-Cyano-4-hydroxy- zimtεäure und 2 , 5-Dihydroxybenzoesäure) Spektren erhalten werden. Eε zeigen sich Peaks von dem einfach, zweifach und dreifach protoniertem Molekül. Die molekulare Masse wird mit 18507 u ± 20 u bestimmt. Nebenbestandteile sind nicht sichtbar.

Für eine genauere Bestimmung der molekularen Masse des nativen, gereinigten HF-COLL-18/514cf wurde aus Fraktion 25 des Schrit¬ tes V zusätzlich ein Massenspektrum mit einem Elektrospray- Massenspektrometer (Sciex API III, Perkin-Elmer, Langen, DE) gemessen. Es zeigen sich Peaks von dem acht- bis elffach proto¬ niertem Molekül. Die mittlere molekulare Masse von HF-COLL- 18/514cf wird hier mit 18494 u + 3 u bestimmt, der theoretische Wert beträgt 18496 u (siehe VIII) .

VIII. Bestimmung der aminoterminalen Aminosäurensequenz

Mittels automatisierter Edman-Sequenzierung mit einem Gasphaεen- Aminosäure-Sequenator ABI 494 (Applied Biosystems, Perkin-Elmer, Weiterstadt, DE) wurden die ersten 60 Aminosäuren bestimmt. An 21. Stelle (Xxx) wurde keine Aminosäure detektiert, wie es für Cystein üblich iεt.

Val -Ala -Leu-Asn-Ser-Pro-Leu -Ser-Gl y-Gly-Met -Arg-Gl y- Ile-Arg-Gl y- Ala -Asp-Phe-Gln-Xxx-Phe-Gln-Gln-Ala -Arg-Ala -Val -Gl v-Leu -Al a -Gl y- Thr- Phe-Arg-Ala-Phe-Leu-Ser-Ser- Arg- Leu-Gin- Asu-Leu -Tyr -Ser- Ile - Val -Arg-Arg-Ala -Asp-Arg-Ala -Ala -Val -Pro-Il e-Val Damit wurde festgestellt, daß es sich um ein Fragment von Kollagen alpha 1 (XVIII) handelt, wobei dieses Protein bisher lediglich auf cDNA-Ebene bekannt ist (Oh et al . , 1994, Genomics Vol. 19, Seite 494) . Das Fragment beginnt an der Position 514 des Protein-Precursors und die molekulare Masse zeigt, daß es an vorletzter Stelle des Precursors mit der Aminosäure Serin endet, also C-terminal um ein Lysin verkürzt ist.

Beispiel 2 : Untersuchung der biologischen Wirksamkeit von HF- COLL-18/514cf

Anhand des in Beispiel 1 dargestellten Verfahrens wurde eine größere Materialmenge von mehr als 0, 1 mg HF-COLL-18/514cf aus humanem Hämofiltrat isoliert. Das hochreine HF-COLL-18/514cf wurde zur Bestimmung der biologischen Funktion in Endothelzell- Proliferationsassays eingesetzt. Für diesen Assay wurden bovine Kapillarendothelzellen aus der Nebennierenrinde von frisch geschlachteten Kälbern, wie in der Literatur beschrieben (Folk- man et al . , 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. Vol. 76, Seite 5217) , in Kultur genommen.

Die Ausführung des Proliferationsassays wurde, wie in der Literatur beschrieben (O'Reilly et al. , 1997, Cell Vol.88, Seite 277) , durchgeführt. Die bovinen Kapillarendothelzellen wurden dazu mit PBS (Phosphatpuffer mit Kochsalz, pH 7.4) gewaεchen und in einer 0,05 %igen Trypsinlösung suspendiert. Eine Zell- suspension mit 25000 Zellen pro ml in DMEM-Medium, enthaltend 10 % FKS (Fötales Kälberserum) und 1 % GPS (Glutamin-Penicillin- Streptomycin) , wurde in gelatine-beschichteten 24-Loch-Platten (0,5 ml pro Loch) bei 37°C und 10 % C0₂ inkubiert.

Nach 24 h wurde das Medium ersetzt durch 0.5 ml DMEM-Medium, enthaltend 5% FKS und 1% GPS sowie unterschiedlichen Konzen¬ trationen (von 0 bis 1000 ng/ml Endkonzentration) des isolier¬ ten, hochreinen HF-COLL-18/514cf, ersetzt. Nach weiteren 30 Minuten Inkubation wurde den Ansätzen bFGF (basischer Fibrobla- sten-Wachεtumsfaktor) in einer Endkonzentration von 1 ng/ml zugegeben. Nach 72 h wurde die Zellzahl in den Anεätzen durch eine Kristallviolettfärbung der Zellen und Messung der Absorp¬ tion bei 600 nm bestimmt. Das den bovinen Kapillarendothelzellen zugegebene HF-COLL-18/514cf hemmte in konzentrationsabhängiger- weiεe die mit bFGF stimulierte Proliferation dieser Zellen. Eine halbmaximale Hemmung der Proliferation in diesem Assay wurde bei einer Konzentration von 200 ng/ml HF-COLL-18/514cf erreicht.

Um die Spezifität des Wirkungsspektrums von HF-COLL-18/514cf und damit mögliche andere biologische Funktionen zu untersuchen, wurden Proliferationsassays mit nicht-endothelialen Zellen durchgeführt. In Tests mit Fibroblasten-Zellinien, nämlich NIH 3T3-Zellen und LMTK-Zellen, zeigte HF-COLL-18/514cf keine signifikante Wirkung und damit auch keine antiproliferative Wirkung.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER:

(A) NAME: Wolf-Georg Forssmann

(B) STRASSE: Feodor-Lynen-Str. 31

(C) ORT: Hannover

(E) LAND: Deutschland

(F) POSTLEITZAHL: 30625

(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Biologisch aktiver Eiweissstoff Kollagenfragment HF-COLL-l8/514cf - zur Hemmung des Wachstums von Tumoren und von Gefaesswucherungen liii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 1

(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:

(A) DATENTRÄGER: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 170 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (Üi) HYPOTHETISCH: NEIN

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly 1 5 10 15

Ala Asp Phe Gin Cys Phe Gin Gin Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly 20 25 30

Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gin Asp Leu Tyr Ser Ile 35 40 45

Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp 50 55 60

Glu Leu Leu Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly 65 70 75 80

Pro Leu Lys Pro Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val 85 90 95

Leu Arg His Pro Thr Trp Pro Gin Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp 100 105 110 Pro Asn Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr 115 120 125

Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gin Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg 130 135 140

Leu Leu Gly Gin Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val Leu 145 150 155 160

Cys Ile Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser

165 170

Claims

Ansprüche

Peptid mit der Aminoεäureεequenz

Val -Ala - Leu- Asn- Ser -Pro-Leu- Ser-Glγ-Gly-Met- Arg-Gly-Ile- Arg-

Gly-Ala -Asv-Phe-Gln -Cvs-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val -Gly-Leu-

Ala-Gly- Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Gln-Asp-Leu-

Tγr-Ser-Ile-Val -Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala -Val -Pro-Ile-Val -

Aεn-Leu-Lγs-Asp-Glu-Leu-Leu-Phe-Pro-Ser-Trp-Glu-Ala-Leu-Phe-

Ser-Gl y-Ser-Glu-Glγ-Pro-Leu-Lvs-Pro-Glv-Ala-Arg-Ile-Phe-Ser-

Phe-Asp-Gly-Lγs-Asp-Val -Leu-Arg-His-Pro-Thr-TrO-Pro-Gln-Lvs-

Ser-Val - Trv-His-Gly-Ser-Asp-Pro-Asn-Gly-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-

Ser-Tyr-Cyε-Glu-Thr-Trp-Arg-Thr-Glu-Ala-Pro-Ser-Ala-Thr-Gly-

Gln-Ala-Ser-Ser-Leu-Leu-Gly-Glγ-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Ser-Ala-

Ala-Ser-Cys-His-His-Ala-Tyr-Ile-Val -Leu-Cys-Ile-Glu-Asn-Ser-

Phe -Met - Thr -Ala -Ser (HF-COLL-18/514cf) sowie εeine natürlichen und pharmakologiεch verträglichen

Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, phosphory- lierte und glycosylierte Derivate.

Fragmente des Peptids nach Anspruch 1, die pharmakologisch aktiv sind.

Verfahren zur Herstellung des Peptids nach Anspruch 1 und/oder seiner Fragmente nach Anspruch 2, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß dieses über eine prokaryontische oder eine eukaryontische Expression hergestellt wird.

Verfahren zur Herεtellung des Peptidε nach Anspruch 1 und/oder seiner Fragmente nach Anspruch 2, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß man es aus menschlichem Blut über Chromatogra¬ phie-Verfahren isoliert. 5. Verfahren zur Herstellung des Peptids oder seiner Derivate nach Anspruch 2 und seiner Fragmente nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Peptid oder seine Derivate oder Fragmente durch übliche Verfahren der Festpha¬ sen- und Flüssigphasen-Synthese aus den geschützten Amino¬ säuren, die in der ausgegebenen Sequenz enthalten sind, herstellt, deblockiert und es mit an sich bekannten Chroma¬ tographie-Verfahren reinigt.

6. Arzneimittel, die das Peptid nach Anspruch 1 oder seine Fragmente nach Ansprüche 2 als aktiven Wirkstoff neben übli¬ chen Hilfs- und Zusatzεtoffen enthalten.

7. Arzneimittel nach Anspruch 6 zur oralen, parenteralen, intravenösen, intramuskulären, intracutanen, intrathekalen, intranasalen und lokal-topischen Anwendung sowie als Aerosol zur transpulmonalen Applikation.

8. Antikörper erhältlich durch Immunisierung von Tieren mit einem Peptid nach Anspruch 1 und/oder Fragmenten nach Anspruch 2 udn/oder durch Anwendung der Hybridoma-Technolo¬ gie .

9. Verfahren zur Behandlung von Patienten, die HF-COLL-18/514cf oder seine Derivate oder Fragmente nach Anspruch 1 benöti¬ gen, durch Gabe therapeutischer Mengen von HF-COLL-18/514cf.

10. Verfahren zur Behandlung von Patienten, die eine Inhibition von HF-COLL-18/514cf oder seiner Derivate oder Fragmente nach Anspruch 1 oder 2 benötigen durch Gabe therapeutischer Mengen eines Antagonisten/Inhibitors des HF-COLL-18/514cf .

11. Verwendung des Arzneimittels nach Ansprüchen 6 oder 7 zur Behandlung von Erkrankungen des menschlichen Organismus, insbesondere in Verbindung mit Gefäßwucherungen. 12. Verwendung des Arzneimittels nach Ansprüchen 6 oder 7 zur Behandlung von Erkrankungen des menschlichen Organismus, insbesondere bei Krebserkrankungen.

13. Verwendung des Arzneimittels nach Ansprüchen 6 oder 7 zur Behandlung von Erkrankungen des menschlichen Organismus, insbesondere mit Beteiligung des Herzkreislauf- und Ner¬ vensystems .

14. Verwendung der Arzneimittel nach Ansprüchen 6 oder 7 zur Behandlung von Erkrankungen des menschlichen Organismus, insbesondere mit Beteiligung des Intugementeε und der Sinneεorgane, insbesondere des Auges.

15. Verwendung des Peptids oder seiner Derivate nach Anspruch 1, der Fragmente nach Anspruch 2 oder des Antikörpers nach Anspruch 8 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behand¬ lung von Störungen bei entzündlichen Prozessen, gestörten Entzündungsreaktionen, Proliferations- und Reifungsstörungen des blutbildenden Systems.

16. Verwendung des Arzneimittels nach Ansprüchen 6 oder 7 oder des Antikörpers anch Anspruch 8 zur Behandlung von System- erkrankungen bei Überproduktion oder Mangel von HF-COLL- 18/514cf, insbesondere bei z.B. durch Anwendung gegen dieses gebildete Antikörper oder zur Verwendung von HF-COLL- 18/514cf zur Substitutionstherapie.

17. Verwendung des Arzneimittels nach Ansprüchen 6 oder 7 zur Behandlung von chronischen Erkrankungen, teils vergesell¬ schaftet mit den in den Ansprüchen 11 bis 16 genannten Erkrankungen, indem es in geeigneter Form für die Behandlung für die Elektrolytwirkung bei Tumor- und Gefäßerkrankungen benutzt wird.

18. Verwendung des Arzneimittels nach Anεprüchen 6 oder 7 oder des Antikörperε nach Anspruch 8 zur Behandlung von akuten Erkrankungen, gemäß Ansprüchen 11 biε 16, indem es in geeigneter Form für die Behandlung in der Intensivpflege dieser Erkrankungen benutzt wird.

19. Verwendung des Arzneimittels nach Ansprüchen 6 oder 7 oder des Antikörpers nach Anspruch 8 zur Diagnose von Erkrankun¬ gen, insbeεondere nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 16, indem spezifische Antikörper gegen synthetische Teilstücke oder das gesamte Peptid oder seiner Derivate und seiner Fragmente hergestellt werden und die Blutkonzentration HF- COLL-18/514cf über Immuntests gemessen wird.

20. Diagnostikmittel enthaltend das Peptid nach Anspruch 1, Fragmente nach Anspruch 2 oder Antikörper nach Anspruch 8 für Testsyεteme zur Kontrolle von Gewebe-, Plaεma-, Urin- und Liquor cerebrospinaliε-Spiegeln dieser Substanz.

21. Diagnostikmittel nach Anspruch 20 als Marker für bestimmte Krebserkrankungen sowie für Funktionsstörungen von Blutgefä¬ ßen, Knochenmark, Lymphorganen, des Magen-Darmtraktes, des Immunsystems und von inflammatoriεchen sowie neoplastischen Prozessen.