KR20030005194A

KR20030005194A - 난각내 조류 알의 알내 활성화

Info

Publication number: KR20030005194A
Application number: KR1020027010679A
Authority: KR
Inventors: 우텐앤드류; 캔트렐티모시
Original assignee: 오보 바이오사이언시즈 인코포레이티드
Priority date: 2000-02-15
Filing date: 2001-02-15
Publication date: 2003-01-17
Also published as: US20070261128A1; US7481179B2; DE60118535T2; US7237505B2; US6573097B2; TWI314163B; CN1423521A; EP1265984A2; US20010027569A1; CA2400399C; PT1265984E; CN1240272C; MXPA02007913A; MY119970A; WO2001060978A3; ES2258074T3; US20010039668A1; DE60118535D1; EP1129617A1; AU3841301A

Abstract

본 발명은 조류 번식 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 난각내 알을 활성화시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 난각내 알을 활성화시켜 살아있는 새끼새로 부화시키는 방법을 제공한다.

Description

난각내 조류 알의 알내 활성화{IN OVO ACTIVATION OF AN AVIAN EGG IN THE SHELL}

전형적으로 가금 산업에서의 사육은 하기 2가지 시스템 중 어느 하나에 의해 수행된다:

바닥 사육 프로그램:제 1 시스템은 "바닥 사육(floor breeding)"이라 불리고, 시판되는 모든 부화용 알의 대부분을 생산하는데 이용된다. 이 시스템에서는 수컷을 단순히 10 내지 15%의 전형적인 비율로 암컷 무리안에 집어 넣는다. 바닥 사육 시스템은 그의 비효율성에도 불구하고 경쟁 시스템보다 적은 노동력을 필요로 하기 때문에 현재 부화용 알을 생산하는 저가 시스템이다. 평균 부화율은 약 83%(구이용 영계 사육자의 경우) 내지 92%(알을 낳는 닭 사육자의 경우)의 범위이다. 이 시스템은 다년간 가금 산업의 분수령이 되어 왔지만 많은 한계가 있다.

크기 대비 번식능력(Size Versus Reproductive Capacity):바닥 사육은 시판되는 칠면조 품종을 자연적으로 교미할 수 없게 하는, 살코기 수량 증가를 위한 극도의 선별 때문에 칠면조에 대해서는 더 이상 전혀 실용적이지 못하다. 구이용 영계에서도 동일한 경향이 보이고 있다. 구이용 영계의 크기 증가를 위한 선별은 수정능력 및 교미능력을 떨어뜨려 왔고, 수정능력은 체중이 증가함에 따라 계속 감소할 것으로 예상된다. 이는 가금 생산업자를 궁지에 빠지게 하는데, 수정능력의 감소는 가금 생산업자의 하한선에 직접적으로 부정적인 영향을 미치기 때문이다.

비효과적인 폐기물 제거:자연적 교미는 새의 손상을 피하기 위해 고른 바닥 상에서 수행되어야 한다. 이러한 설계 요건은 자동화된 폐기물 제거 시스템을 사용하지 못하게 하고 대대의 새떼 사이에서 수동 세척을 필요로 한다. 이는 설비의 생산적 사용을 감소시키면서 노동력 및 총 경비를 부가시킨다.

알 생산 및 품질:알은 수거 시간까지 새떼와 함께 하우스내에 있기 때문에 더러운 대소변 물질로 자주 오염되는데, 이는 부화율을 감소시킬 수 있다. 또한, 전형적으로 바닥 하우스에서 생산된 알의 3 내지 5%는 구비된 산란 상자에 놓이기 보다는 바닥에 직접 놓여서 폐기해야 한다.

비효과적인 공간 및 장치 이용성:암수컷을 함께 바닥 하우스에 두는 것은 각 성별에 대한 상이한 영양 및 생산 요건 때문에 상이한 2가지의 독립적 사료공급 및 급수 시스템의 설치를 필요로 한다. 상기 장치는 모두 하우스내에서 한정된 바닥 공간을 차지한다. 이러한 이유로 바닥 사육은 적층식 우리 시스템에 비해 하우스 공간 및 장치의 효과적인 사용이 아니다.

사망률 및 수정능력:공격적인 수컷들은 싸우는 경향이 있기 때문에 수컷 사망률이 높게 된다. 수컷 사망률은 우리 하우스에서는 평균 2%인데 대해 바닥 하우스에서는 평균 13%이다. 교미 동안의 암컷에 대한 수컷의 공격성은 암컷 사망률의 증가, 수정능력의 감소 및 알 생산 주기 길이의 감소의 형태로 점차 손실을 낸다. 한 무리중의 수컷이 늙어감에 따라 수정능력이 감퇴하기 시작한다. 표준적인 해결책은 늙은 무리를 어린 수컷으로 "스파이크(spike)"하여 산란능력을 향상시키는 것이다. 그러나, 이는 수정능력의 단기간 감소 및 사망률의 증가와 함께 또 한 차례의 공격을 재개시킨다. 병원성 유기체가 잠복해 있는 짚 및 폐기물질과 새의 일정한 접촉 때문에 질병은 바닥 하우스에서 더 널리 퍼진다.

사료 전환율 감소:사료 비용을 조절하는 것은 경쟁적인 가금 사업을 경영하는데 중요하다. 사료 비용은 예를 들어 구이용 새끼새를 사육하는 비용의 60% 이하를 차지할 수 있다. 한 연구에서, 바닥에서 사육되는 새는 우리에서 사육되는 새와 비교할 때 동일한 양의 생산에 대해 음식물을 20% 더 많이 소비하였다. 이러한 차이는 사회적 상호작용 수준이 증가될 뿐만 아니라 바닥 하우스에서 보이는 신체적 활동 수준이 일반적으로 더 높은 것에 기인한다. 수컷은 암컷보다 많은 사료를 소비하고, 이 때문에 바닥 사육 시스템은 유지되어야 하는 수컷의 수가 많으므로 사료 소비에 있어서 비효과적이다.

사육 전략에서의 융통성 제한:암수컷을 바닥 사육 하우스 설비내에 하나의 큰 군으로 수용하기 때문에, 사육자가 사육 가축에 대해 진보된 이종교배 및 선별을 수행하는 능력이 매우 제한된다. 이러한 이유로 바닥 하우스는 상업적인 최종이종교배물을 생산하기 위해, 예비선별된 유전적 가축의 증식을 위한 수단으로서 주로 이용된다.

인공수정 사육 프로그램:부화용 알을 생성하는데 사용되는 또다른 시스템은 인공수정(AI)으로 불린다. AI는 사육 피라미드의 상부에서 "1차 사육자"에 의해 널리 실시되고 있지만, 사육 피라미드의 하부에서는 상업적 생산업자에 의해 일반적으로 사용되고 있지 않다. 1차 사육자는 이종교배되어 상업적인 최종 제품, 즉 구이용 영계, 알을 낳는 닭 및 칠면조를 생산하는 최상급 순혈종의 유전 혈통을 소유하고 개량시키는 회사이다. 순혈종 혈통으로부터 조부모 가축, 부모 가축을 거쳐 최종적으로 실제 시판되는 새까지 사육 피라미드 아래쪽으로 이동함에 따라 새의 양은 지수 함수적으로 증가한다. 피라미드 상부의 유전자 조작된 최상급 새는 매우 고가이며 하부의 새는 저렴하다. 이러한 이유로 다양한 레벨의 번식을 위해 다양한 조작 모델이 이용된다.

AI 시스템에서는 암수컷을 동일한 하우스에 수용하지만 분리하여 가둔다. 암컷 우리는 전형적으로 2 내지 5마리의 암탉을 가두는 반면, 수컷 우리는 단 한 마리의 수컷을 가둔다. AI 프로그램은 상기 열거된 바닥 사육 하우스의 한계중 다수를 없앤다. 예를 들어, 우리 하우스를 사용하기 때문에 폐기물 제거를 자동적으로 수행할 수 있다. 하우스가 일반적으로 훨씬 더 깨끗하기 때문에 질병 문제가 적게 된다. 알이 우리 밖으로 굴러 나와서 더러운 바닥에 놓이지 않기 때문에 알 생산이 개선된다. 장치 및 하우스 공간이 보다 효율적으로 이용된다. 사회적 공격 및 질병의 감소로 인해 사망률이 최소화된다. 번식 과정으로부터 사회적 및 신체적 상호작용이 제거되기 때문에 수정능력 수준이 보다 일정하게 유지된다. 사료 전환율이 증가된다. 그리고 결과적으로 이 생산 시스템은 진보된 이종교배 및 선별을 하기 위한 융통성이 증가된다. 1차 사육자는 그의 유전적 가축을 개량하고 판매시장에서 경쟁 상태로 남기 위해서 이러한 능력을 절대적으로 필요로 한다. 상기 열거된 이점중 대부분은 또한 상업적 수준의 증식 사육자에게도 중요하지만, 이들은 한가지 결정적인 단점, 즉 AI 프로그램과 관련된 높은 노동 비용에 의해 상쇄된다.

AI 프로그램은 가금의 선척적인 성욕을 인력에 의해 바꾼다. 작업자가 우리내의 수컷으로부터 정액을 수동으로 채취하고 우리내의 암컷을 7일 교대로 수정시켜야 한다. 이들 프로그램에 필요한 정교함은 전종업원에게 위임된다. 이러한 이유로 약 30% 더 적은 사료 소비량을 갖는 유사한 알 생산을 허용하는 혁신은 상업적 수준의 증식 사육자를 위한 AI 프로그램의 노동 비용 증가를 정당화시킬 수 없다.

번식 공정

배란시, 조류 난모세포는 암컷 전핵을 함유하는 배반 또는 배아판, 및 난황 덩어리를 포함한다. 배아판 및 난황 덩어리는 난황막으로 지칭되는 난자 세포막으로 싸여있다. 내부 난황주위 층(IPL)으로도 지칭되는 난황주위 층(PL)이 난황막을 싸고 있다. 난황막과 IPL 사이의 공간은 난황주위 공간으로 지칭되고, 이것은 과립막 세포에 의해 횡단된다. 난모세포가 이들의 난포로부터 방출되는 경우, 이것을 난자라고 지칭한다. 난자는 누두에 의해 흡입되는 난관으로 이동하고, 여기서정자가 존재하는 경우 수정된다.

난자가 후방 누두를 통과하는 경우, 다른 층, 외부 난황주위 층(OPL)이 난자를 둘러싼다. 상기 난황막은 배반 영역에서 다수의 정자가 난자에 결합하여 침투하는 경우 발생하는 치명적인 상황인 다정자진입을 방지하는 작용을 한다. 그다음, 알은 부가층인 난삭 및 진하고 얇은 층인 난백으로 둘러싸인다. 난자가 협부로 이동하는 경우, 난각 막 위에 미결정의 탄산칼륨이 침적되어 2개의 난각 막이 침적되어 난각이 형성되기 시작한다.

전술한 과정은 모두 수정후 몇 시간내에 발생한다. 그다음, 난자는 자궁으로 이동하고, 여기서 18 내지 20 시간 경과후, 칼슘 난각이 완성된다. 그다음, 알은 수분 동안 질로 이동하고, 그다음 질로부터 배출되거나 산란된다(즉, 알을 낳는다). 이 시점에서, 알이 수정된 경우, 그 내부에 함유된 배아는 40,000 내지 70,000개의 세포를 포함한다(문헌[Johnston, "In Vitro Sperm Binding, Penetration, and Fertilization of Recently Oviposited Chicken Eggs", December, 1998, Clemson University; Olsen, M. W., J. Morph. 70:413-533(1942); Etches et al., in Methods in Molecular Biology vol. 62 Recombinant Gene Expression Protocols, Ed. R. Tuan, Humana Press, Inc. Totowa, NJ, pp. 433-450(1997); Petties et al, in Manipulation of the Avian Genome, Ed. Etches et al., CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 81-101(1993) 참고).

유전자변형(Transgenesis)

조류 배선에 직접적으로 바람직한 유전자를 삽입함으로써 통상적인 선택 공정을 보충하는 것이 조류 유전학의 오랜 목적이었다. 포유동물 종에 대해서는 상기 선상의 실질적인 진보가 진행되었는 바, 초기 배아가 입수가능해지고 외인성 DNA의 삽입을 위한 전핵을 가시화할 수 있다. 돌연변이 마우스, 소, 양 및 염소의 생산은 대규모의 상업적인 공정에서는 일상적인 과정이 되었다. 대조적으로, 조류 종에 있어서, 초기 배아가 용이하게 입수되지 못하며, 전핵을 가시화하지 못해서 알내에서(in ovo) 초기 배아에서의 조류 게놈의 조작은 거의 극복불가능한 목적으로 여겨졌다.

유전적으로 개조된 조류의 개발은 주로 초기 단계, 다능성 배아 세포의 입수를 요구한다. 배아 발생의 초기 단계가 암컷의 자궁내에서 일어나기 때문에, 초기 배아로 이형 DNA를 도입하는 것은, 암컷을 죽여서 암컷으로부터 배아를 빼냄으로써 가능하다. 또한, 초기 단계 배아로부터 부화될 때까지 완전히 배양되는 경우에도, 상기 방법은 매우 노동집약적이고 부화 후 생존율이 단지 약 10%이다. 상(Sang) 등의 문헌[in Manipulation of the Avian Genome, Ed. Etches et al, CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 121-133(1993)] 참조.

본 발명은 산란된 난각내 알을 활성화시키고 난각으로부터 살아있는 조류를 부화함으로써(본원에서는 알내 활성화로 지칭함) 조류 생물학을 급격히 향상시킨다. 이러한 방법은, 가금류 생산의 효율을 매우 증가시킬 수 있는, 작업장 사육 및 인공 수정에 대한 대체방법을 제공한다. 이러한 방법은 또한 초기 조류 배아의 입수를 가능하게 하여 돌연변이 조류 종을 보다 용이하게 개발할 수 있다.

본 발명은 조류 알의 활성화 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 난각내 알을 활성화시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 난각내 알을 활성화시켜 살아 있는 새끼새를 부화시키는 방법에 관한 것이다.

발명의 요약

본 발명의 조류 번식 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 난각내 알을 활성화시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 난각내 알을 활성화시켜 살아있는 병아리를 부화시키는 방법을 제공한다.

또한, 발생상 초기 단계의 산란된 조류 알이 본 발명에 의해 제공된다.

본원에서 사용되는 경우, 명사의 개수를 명시하지 않은 명사는 하나 이상을 의미할 수 있다. 예를 들어, "알"이란 하나 이상의 알을 의미할 수 있다.

본원에서 사용되는 경우, "활성화"란 산란된 조류의 미수정란 또는 난포세포의 배아 발생의 개시를 의미한다. 활성화의 다양한 형태는 하기와 같다. 난각내 산란된 알의 활성화 방법은, 본원에서 "알내 활성화(IOA)"로 지칭한다.

본 발명은 난황막으로 둘러싸인 난황 및 난자를 포함하는, 난각내 조류 알을 활성화시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 난자를 활성화시킴을 포함한다. 본 발명은 조류의 산란된 미수정란을 난각내에서 활성화시켜 살아있는 병아리가 태어날 수 있다는 예상치못한 놀라운 발견과 관련된다. 본원에서 사용되는 경우, 난각내 조류 알은 산란된 알, 즉 조류의 질로부터 배출된 것으로 탄산칼슘 난각이 있는 알을 지칭한다. 알이 배출되는 것은 "산란"으로 지칭한다. 따라서, 본원에서 "난각내 알" 또는 "산란된 알"이라 함은 의미상 동일한 것으로 이해되어야 한다.

조류의 알은, 알이 산란되는 경우, 경질의 석회화 난각을 포함한다. 난각내에는 배아의 성장 및 발생을 지원하기 위한 영양소를 함유하는 난황이 있다. 본원에서 사용되는 경우, "배아"란 알 수정 과정에서 암컷의 전핵과 숫컷의 전핵의 결합으로 유발되는 발생중인 생명체이다. 따라서, 수정된(단세포) 난자를 배아라고 지칭하는 반면, 또한 단세포 배아는 접합체로서 구체화하여 지칭할 수 있다.

알이 상온에서 보관된 경우 알내 활성화가 2주령 알에서 수행될 수 있지만, 최선의 결과를 위해서는 이상적으로는 새롭게 산란된 알을 사용한다. 바람직한 실시양태에서, 활성화는 산란후 0 내지 96 시간 동안 수행된다. 보다 바람직한 실시양태에서, 활성화는 산란후 0 내지 72 시간 동안 수행된다. 더욱 보다 바람직한 실시양태에서, 활성화는 산란후 0 내지 48 시간 동안 수행된다. 보다 바람직한 실시양태에서, 활성화는 산란후 0 내지 24 시간 동안 수행한다. 따라서, 활성화 과정이 산란후 가능한 조속히 수행되는 것이 바람직하다. 그러나, 정확한 시간 조절은 산란된 알을 보관한 방법, 예를 들어 온도, 습도 등에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 산란된 미수정란이 냉각되기 전에 활성화되는 것이 활성화를 개선시킬 수 있다.

본 발명의 방법에서, 난각내 조류 알의 활성화는 난자를 기계적으로 파열하거나 산란된 알에 예를 들어 하나 이상의 정자, 세포 또는 핵을 포함하는 시료와 같은 생물학적 시료를 수송함으로써 달성된다. 파열 또는 생물학적 시료의 수송은, 이로서 한정하는 것은 아니지만, 천공법을 사용하여, 예를 들어 산 용액에 의해 난각의 영역을 용해시키는 것 또는 예를 들어 바늘 또는 외과용 매스와 같은 기구를 사용하여 난각의 영역을 뚫거나 깨는 것과 같은 시료를 난각 내부로 수송할 수 있는 임의의 방법으로 달성할 수 있다.

바람직하게는, 시료를 수송하거나 난자를 파열하기 위해서 뚫리는 난각의 영역의 표면은, 시료를 내부로 수송하기 전에, 알이 오염되는 것을 예방하기 위해서 살균된다. 수송법과 상용가능한 임의의 방법은, 이로서 한정하는 것은 아니지만 소독약 IOFEC-20(등록상표) 및 3% 과산화수소 등을 사용하여 난각을 살균하는 방법을 사용할 수 있다. 의도한 뚫린 부분에서 알의 표면을 소독약으로 닦거나 상기 표면에 소독약을 분사할 수 있거나, 알을 선택된 소독약이 함유된 용기내에 침지시킬 수 있다.

전술한 바와 같이, 난각내 개구부는 나이프 또는 바늘과 같은 도구를 사용하여 형성될 수 있다. 바람직하게는, 상기 도구는 살균된 것이다. 예를 들어, 두 단계 과정에서, 우선 난각내 개구부가 나이프 또는 기타 날카로운 기구를 사용하여 형성될 수 있다. 제 2 단계에서, 시료를 함유하는 주사기에 부착된 바늘이 개구부를 통과하여 상기 시료를 알내로 전달할 수 있다. 또한, 시료를 난각내 개구부에 도입하는 것은 마이크로피펫과 같은 피펫의 사용을 포함하나 이로 제한되지 않는 다른 수단에 의해서도 성취될 수 있다. 다르게는, 하나의 단계로, 시료를 함유하는 주사기에 부착된 바늘을 사용하여 난각을 관통시켜 난각내 개구부를 생성시키고 주사에 의해 상기 시료를 알내로 전달할 수 있다. 따라서, "개구부"는 바늘에 의해 생성된 구멍을 포함할 수 있다. 물론, 당해 분야의 숙련자라면 시료가 바늘을 통해 이동하도록 충분히 큰 게이지를 갖는 바늘을 선택할 수 있을 것이다. 한 양태에 있어서, 바늘은 난각내로 그대로 전달될 수 있는 최소 게이지를 갖고, 또는 칼슘 난각을 관통하기에 충분히 강성일 수 있다. 다르게는, 별개의 바늘 또는 다른 장치를 사용하여 난각내에 개구부를 형성할 수 있다. 전형적으로, 30게이지 내지 16게이지의 다양한 바늘을 사용할 수 있다. 한 양태에서는 22게이지 바늘이 사용된다.

개구부는 생존가능한 활성을 나타내는 난각내 임의의 지점에서 형성될 수 있지만, 전형적으로 배아판 근처 난각 영역에서 형성될 수 있다. 알은 그의 상이한 구역에 배아판이 위치되도록 조종될 수 있지만, 새롭게 산란된 알내 배아판은 전형적으로 난황에 인접한 기실위에 위치하는 난각의 거대 말단에 위치된다. 난각내에 개구부가 생성되면, 시료는 기실을 통해 상기 기실 아래에 위치하는 막(난각 내막) 밑으로 바늘, 피펫 등을 도입시킴으로써 바람직하게 전달된다.

바람직하게는, 알의 오염 및 배아 사망을 방지하기 위해, 난각내 개구부는 밀봉된다. 비독성 접착제를 난각내 개구부에 직접 도포하여 밀봉할 수 있다. 다르게는, 한편의 난각은 패취(patch)로서 사용되어 개구부를 밀봉할 수 있고, 비독성 접착제에 의해 난각에 부착될 수 있다. 한 양태에 있어서, 비독성 접착제는 엘머(Elmer, 등록상표) 아교이다. 다른 양태에서, 접착제는 실리콘 밀봉제이다. 더욱이, 임의의 "조직 아교(tissue glue)"를 사용하여 난각을 밀봉할 수도 있다. "조직 아교"란 조직들을 함께 결합시키기 위해 외과 수술 과정 동안 사용되는 살균된 비독성 접착제이다.

본 발명의 방법은 닭, 메추라기, 오리, 칠면조, 꿩, 타조, 에뮤, 거위, 공작, 뇌조, 레아, 앵무새, 코카틸 앵무새(cockatiel), 카카투 앵무새(cockatoo), 잉꼬 및 기타 상업적으로 가치있는 새로 이루어진 군으로부터 선택된 조류 종으로부터 산란된 알을 활성화시키는데 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 난황막으로 둘러싸인 난황을 포함하는 난각내 조류 알을 활성화시키고, 살아있는 병아리를 부화하는 방법을 제공한다.

전술한 바와 같이 본 발명의 방법에 따라 활성화시킨 후, 살아있는 병아리가 부화될 때까지 알을 항온처리한다. 당해 분야의 숙련자라면 특정한 종에 속하는 수정된 알을 항온처리하는 시간 및 바람직한 조건을 인지하고 있을 것이다. 다양한 종의 새를 위한 항온처리 기간은 다음과 같다: 닭 21일, 메추라기 23일, 코루닉스 메추라기(Corunix quail) 17일 내지 18일, 꿩 23일, 칠면조 28일, 오리 28일 내지 33일, 거위 28일 내지 30일, 잉꼬 18일, 앵무새 28일, 비둘기 14일, 찌르레기 14일, 되새류 14일, 세가락 메추라기(Button Quail) 16일, 밸리 메추라기(Valley Quail) 21일 내지 22일, 백조 30일 내지 37일. 자연 수정된 알과 비교하여 본 발명의 방법에 의해 수정된 알의 항온처리는, 수정된 알이 산란 전에 암컷의 신체내에서 보낸 시간을 포함하도록 항온처리 시간의 길이가 길어질 수 있다는 점에서만 상이할 수 있다. 바람직한 양태에서, 항온처리 기간은 달걀에 대해 21일 내지 23일 지속된다. 당해 분야의 숙련자라면 특정 종의 새로부터의 알을 항온처리하는 최적의 온도를 쉽게 결정할 수 있겠지만, 전형적으로 항온처리 온도는 95℉ 내지 100℉이다. 달걀은 약 99.5℉에서 항온처리된다. 보다 바람직한 양태에서, 달걀이 항온처리되는 온도는 알이 부화점에 근접할 때 저하된다. 따라서, 일반적으로 바람직한 양태에서, 달걀은 항온처리의 1일째부터 약 18일째까지는 99.5℉에서, 19일째부터 부화때까지는 98.5℉에서 항온처리된다.

당해 분야에 널리 공지된 바와 같이, 알이 항온처리되는 습도는 알을 부화시키는데 있어 중요할 수 있다. 따라서, 전형적으로 알은 75% 내지 90% 습도에서 항온처리된다. 바람직하게는, 알은 약 80% 습도에서 항온처리된다. 보다 바람직하게는, 알이 항온처리되는 습도는 알이 부화점에 근접할 때 상승한다. 따라서, 바람직한 양태에서, 달걀은 항온처리의 1일째부터 약 18일째까지는 80% 습도에서, 19일째부터 부화때까지는 85% 습도에서 항온처리된다. 특정의 바람직한 양태에서, 알은 항온처리의 1일째부터 약 18일째까지는 99.5℉ 및 80% 습도에서, 19일째부터 부화때까지는 98.5℉ 및 85% 습도에서 항온처리된다. 당해 분야에 널리 공지된 바와 같이, 항온처리 도중 알을 방향 전환시키는 것은 배아의 성장을 촉진하는데 유용하다.

또한, 알의 항온처리는 시판중인 항온기에서 바람직하게 수행된다. 시판중인 인공부화기 및 세터(setter)는 PAS 리폼(Reform), 제임스웨이(Jamesway), 치크마스터(Chickmaster), 버크아이(Buckeye), 쿰버랜드(Cumberland), 피터심(Petersime), 후미데어 인큐베이터 캄파니(Humidaire Incubator Co.) 등을 포함하는 많은 회사에 의해 제조된다. 바람직하게는, 알은 부화하기 약 3일전에 세터 항온기에서 부화 항온기로 이동된다. 인공부화기 바구니는 병아리가 보다 쉽게 난각을 깨고 나올 수 있는 쪽으로 알을 위치시킨다. 상기 바구니는 또한 부화 후 거의 즉시 병아리가 걸을 수 있게 하고, 이는 병아리의 발생 및 생존력을 위해 필요하다.

다른 양태에서, 본 발명은 40,000개 미만의 세포를 갖는 자생 배아를 포함하는 산란된 조류 알을 제공하며, 여기서 상기 배아는 살아있는 병아리로 발생할 수 있다. "자생"이란 원래 위치에서 성장, 생활 또는 생성되는 것을 의미한다. 따라서, 자생 배아는 암컷 전핵이 형성되는 동일 난각내에서 발생 및 부화하는 배아이다. 따라서, 자생 배아는 자생 난자의 자손이다. 자연적으로 수정되는 난자가 산란될 때까지, 발생하는 배아는 전형적으로 40,000 내지 70,000개의 세포를 갖는다. 그러나, 본 발명의 알은 난각내에서 산란된 후 수정되고, 따라서 본 발명의 알내에서 발생하는 배아는 항온처리 도중 임의의 시간에서 40,000개 미만의 세포를 갖는다. 실제로, 활성화 순간 본 발명의 알내 배아는 하나의 세포를 가지며 접합체이다. 배아가 알내에서 성장하므로, 정상 세포 분할이 일어나며 세포의 수가 증가한다. 따라서, 본 발명의 활성화된 산란된 알은 항온처리 도중 임의의 시간에서 예를 들어 1,100, 1,000, 10,000, 20,000, 30,000 또는 40,000개의 세포를 갖는 배아를 포함한다. 2개의 상업적으로 바람직한 조류 알은 닭 및 칠면조이다.

다른 양태에서, 본 발명은 배아가 살아있는 병아리로 발생할 수 있고, 난각이 4cm 미만의 개구부를 갖는, 40,000개 미만(예를 들어, 30,000, 20,000, 10,000, 1,000, 100 및 1(접합체))의 세포를 갖는 배아를 포함하는 난각내 조류 알을 제공한다. 다른 양태에서, 난각내 개구부는 2cm 미만이다. 또 다른 양태에서, 난각내 개구부는 1cm 미만 또는 0.5cm이다. 한 양태에서, 난각내 개구부는 22게이지 바늘을 수용하기에 충분히 크다. 따라서, 개구부는 시료의 주사 또는 난자를 분열시키는 수단을 허용하는 최소 개구부 내지 생체외 수정된(즉, 난각 외부에서 수정된) 난자를 다시 난각내로 위치시키는데 요구되는 구멍보다 작은 구멍까지의 임의의 크기일 수 있다. "개구"란 산란 후 임의의 지점에서 구멍이 알내에 형성되는 것을 의미한다. "개구부"는 구멍이 후속적으로 밀봉되는 알을 포함한다. 예를 들어, 시료를 주사하는데 사용되는 바늘에 의해 생성되고 이어서 밀봉되는 구멍을 갖는 알은 심지어 밀봉 후에도 개구부를 갖는 조류 알의 정의내에 속한다. 배아는 알에 대해 자생 또는 비-자생일 수 있다. "비-자생"이란 산란된 난각에 대해 자생적이지 않은 난자로부터 발생된 배아를 포함한다. 2개의 상업적으로 바람직한 알은 닭 및 칠면조이다. 추가로, 본 발명은 1 내지 40,000의 수를 포함하는 40,000개 미만, 30,000, 20,000, 10,000, 5,000, 1,000 또는 100개의 세포를 가지는 배아 및 자연 난황을 포함하는 산란된 조류 알을 제공한다. 이러한 알로부터 부화되는 병아리는 정상 핵형을 가지며 정상적으로 발생할 수 있다.

본 발명의 알은 예를 들면 닭, 메추라기, 오리, 칠면조, 꿩, 타조, 에뮤, 거위, 공작, 뇌조, 아메리카 타조, 앵무새, 코카틸 앵무새, 카케투, 잉꼬, 백조, 비둘기 및 기타 상업적으로 가치있는 새들로 구성된 그룹으로부터 선택된 조류 종으로부터 유래될 수 있다. 상업적으로 바람직한 양태에서, 알은 본 발명의 방법에 사용되는 조류 종으로부터 유래되고 닭, 칠면조, 거위, 오리, 메추라기 및 꿩으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 보다 바람직한 상업적인 양태에서, 알은 닭으로부터 유래된다. 방법은 또한 예를 들면 멸종 종을 보전하는 것을 돕기 위해 동물원에서 조류 종에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 방법은 또한 파충류 알의 알내 활성화에 사용될 수 있다. 조류 알과 유사한 파충류 알은 난황 및 암 전핵을 포함하고 이들이 낳아진 경우 난각에의해 보호된다. 비수정되어 산란된 파충류 알은 본 발명의 방법에 따라 난각에서 활성화될 수 있다.

본원에 기술한 알내 활성화 방법은 또는 알 과정에서 다른 방법과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 배아는 활성화 후 백신접종될 수 있다. 이러한 백신접종 과정은 당해 분야의 숙련자에게 익히 공지되어 있다. 다르게는, 백신접종이 배아의 성장을 막지 않는 한 이러한 백신접종은 알내 활성화와 동시에 일어날 수 있다.

또한, 알내 활성화는 다수의 알이 예를 들면 주사 기법에 의해 동시에 활성화되도록 자동화될 수 있다. 따라서, 50개, 100개, 200개, 300개 또는 그 이상의 알이 동시에 활성화될 수 있다.

비수정되어 산란된 알은 이하 개시되는 다양한 특정 활성화 방법에 의해 활성화될 수 있다. 상기 활성화 방법은 예를 들면, 수정, 단성생식 및 핵 전달로 달성될 수 있다. 따라서 예를 들면 이하 기술한 바와 같이, 비수정되어 산란된 알의 활성화를 위해 전달된 시료는 정자 함유 시료일 수 있다.

수정

본 발명은 생리학적으로 허용가능한 담체에서 조류 정자를 포함하는 정자 시료를 수득하는 단계 및 상기 정자 시료를 알로 전달하여 알을 수정하는 단계를 포함하는, 난각에서 난황막에 의해 싸여진 난황을 포함하는 조류 알의 수정방법을 제공한다.

정자 시료중의 정자는 당해 분야의 숙련자에게 익히 공지되어 있는 복부 마사지법과 같은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 방법에 의해 새로부터 수득될 수 있다. 이 방법을 통해 정자, 정액 및 투명 유체를 포함하는 사정물(정액)을 수거한다. 투명 유체는 음경 팽창동안 림프관으로부터 음경의 표면으로 나오는 림프상 유체이다. 조류 정자는 또한 당해 분야의 숙련자에게 익히 공지되어 있는 상업적인 공급원으로부터 수득될 수 있다.

한 양태에서, 정자 시료 중의 정자는 1마리의 새로부터 얻은 것이다. 다른 양태에서, 정자 시료 중의 정자는 1마리 이상의 새로부터 수득된 정자의 혼합물이다. 1마리 이상의 새로부터의 정자의 혼합물이 본 발명의 방법에 사용되는 경우, 정자가 수거된 새 중 1마리가 생식능력이 없는 경우 다른 새로부터 수거된 정자가 알을 수정할 수 있으므로 알의 수정 성공 확률은 증가할 수 있다.

바람직한 양태에서, 정자 시료는 동일한 종에 속하는 새로부터 얻어진 정자를 포함하고, 정자 시료는 정자 공여체로서 동일한 종에 속하는 암탉에 의해 산란된 알을 수정하는데 사용된다. 본 발명은 또한 정자가 알을 수정할 수 있는 경우 하나의 종으로부터 얻어진 정자 및 다른 종으로부터 얻어진 알의 사용을 고려한다.

수거한 지 30분내에 정자를 사용하는 것이 전형적으로 바람직하고, 오래된 정자 및 심지어는 이전에 냉동 또는 냉동 건조된 정자도 난자를 수정할 수 있는 능력을 보유하기만 하면 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 정자가 수거 후 30분 이상에 사용되는 경우, 이들이 이하 기술한 바와 같이 정자 연장제와 조합되는 것이 바람직하다.

위에서 언급한 바와 같이, 정자 시료는 또한 생리학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본원에 사용되는 "생리학적으로 허용가능한 담체"란 정자가 이동성 및 생존성을 보유하는 유체이다. 생리학적으로 허용가능한 담체는 비개질 정액, 정액(정자에 대해 원래 상태 또는 첨가된), 투명 유체(정자에 대해 원래 상태 또는 첨가된), 완충 염수 용액, 정자 연장제 및 이들의 조합물을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 담체는 당해 분야에서 희석제로 지칭되는 정자 연장제를 포함한다. 위에서 언급한 바와 같이, 수거된 정자가 수거 후 30분 이내에 수정하는데 사용되지 않는 경우 정자 연장제의 사용은 특히 바람직하다(문헌[M.R. Bakst,In Manipulation of the Avian Genome, R.J. Etches and AM. Verrinder Gibbons, eds., CRC Press, Boca Raton, FL, pp.1528(1993)]). 본원에 사용되는 "정자 연장제"란 정자 시료를 희석시켜 정자가 덜 농축된 더 큰 부피의 정자 시료를 제조하는데 사용되는 생리학적으로 허용가능한 담체이다. 바람직하게는, 정자 연장제의 조성물은 정자의 수명을 연장시킬 뿐만 아니라 정자를 희석시켜 수거되는 정자의 양에 의해 수정될 수 있는 알의 수를 증가시킨다. 정자 연장제 조성물, 제안된 희석률, 최적 저장 시간 및 조건 및 연장의 상업적인 공급원의 예는 문헌[Bakst("Preservation of Avian Cells:In: Poultry breeding and Genetics, R.D. Crawford(ed.) Elsevier, New York, pp91-108(1990)")]에서 찾을 수 있다. 가금 산업에 통상적으로 사용되는 다른 희석제는 하이지아 바이올로지칼 래보러토리즈(Hygeia Biological Laboratories)의 라고 포뮬레이션 아비안 시멘 익스텐더(Lago Formulation Avian Semen Extender), 캘리포니아주 데이비스 소재의 포울트리 헬쓰 래보러토리즈(Poultry Health Laboratories)의 시메이드 터키 익스텐더(Semaid Turkey Extender) 및 펜실베니아주 스테이트 컬리지 소재의 트리 바이오 래보러토리즈(Tri Bio Laboratories)의 벨츠빌 포울트리 시멘 익스텐더(Beltsville Poultry Semen Extender)이다. 바람직한 양태에서, 정자 연장제는 아비딜루언트(Avidiluent)이다. 따라서, 한 양태에서, 정자 시료는 정자 및 정액 유체, 즉 정액을 포함할 수 있다. 더구나, 정자 시료는 정자, 및 완충 염수 용액 및 정자 연장제를 포함하나 이들로 제한되지 않는 생리학적으로 허용가능한 담체로 희석된 정액 유체를 포함할 수 있다.

정자 시료는 또한 당해 분야의 숙련자에게 분명한 방법, 예컨대 완충 염수 용액 또는 정자 증량제와 같은 용액을 사용하여 하나 이상의 조류로부터의 정액을 세척하고, 생성된 용액을 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세척된 정자를 완충 염수 또는 정액 증량제와 같은 일정량의 용액중에 재현탁시키는 방법으로 준비될 수 있다. 당해 분야의 숙련자라면 정자를 적절한 부피의 용액중에 재현탁시킴으로써 정자를 목적하는 농도로 달성하는 방법을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들면, 원심분리하고 상청액을 제거한 후, 충전(packed) 정자를 칭량하고, 그 다음 조류 정자의 중량에 대한 공지된 값을 사용하여 정자수를 예측할 수 있다. 그 다음, 정자는 목적하는 정자 농도를 얻는데 필요한 부피로 재현탁될 수 있다. 다르게는, 원심분리된 정자는 상청액을 제거한 후 재현탁되고, 그 다음 다시 원심분리되어 충전 정자 부피가 측정될 수 있다(존스톤(Johnston), 1998). 후속적으로, 정자의 농도는 마에자(Maeza) 및 부스(Buss)의 식을 사용하여 계산될 수 있다[문헌 "Poultry Sci. 55:2059(1976)"].

전형적으로, 닭 정액중의 정자의 농도는 ㎖당 300,000,000 내지 800,000,000이고, 칠면조 정액의 경우 ㎖당 800,000,000 내지 1,500,000,000이고, 서아프리카산 뿔닭(Guinea fowl)의 경우 ㎖당 400,000,000 내지 800,000,000이고, 북경오리(Pekin duck)의 경우 ㎖당 20,000,000 내지 600,000,000이다. 인공 수정에 사용되는 평균 정자수는 총 부피 50㎕당 100,000,000이다. 본 발명의 방법에서, 정자를 암컷 전핵에 인접하게 직접 위치시키기 때문에, 알을 수정시키는데 더욱 적은 수의 정자가 필요하게 된다. 따라서, 하나의 정자 만큼 적은 수의 정자가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 사실상, 광범위한 정자 농도가 본 발명에 사용될 수 있다. 한 양태에서, 닭 정액은 동일 부피의 아비딜루언트로 희석되며, 이 정자 시료 약 0.01㎖가 알에 주입된다. 따라서, 약 1,000,000개의 정자가 암컷 전핵에 인접하게 축적된다.

본 발명의 한 방법에서, 난각내에서의 조류 알의 수정은 정자 시료를 알로 전달시킴으로써 달성된다. 정자 시료의 전달은 전술된 바와 같이 달성될 수 있다. 정자는 약 0.5㎛ 폭 및 100㎛ 길이이다. 따라서, 바람직한 양태에서, 주입을 위해서는 10㎛ 이상의 내부 직경을 갖는 침이 사용될 수 있다. 한 양태에서, 침은 주입 후에 난각내에 남아 있을 수 있다. 백신을 알에 주입하기 위해 현재 사용되는 다양한 침 및 방법들이 정자의 전달을 위해 사용 또는 채택될 수 있었다.

난각내의 임의의 장소에서 생존가능한 수정을 달성하게 하는 개구부가 형성될 수 있지만, 전형적으로 배아판 근처의 난각 영역내에 형성된다. 배아판을 알의 상이한 부위에 위치시키도록 알을 조작할 수 있지만, 새로이 산란된 알내의 배아판은 전형적으로 난각의 큰 단부에 위치하며, 이는 난황에 인접한 봉소(蜂巢, air cell) 위에 중첩된다. 개구부가 일단 난각내에 생성되었으면, 정자 시료는 봉소를 통해 그 아래의 난황막(내부 난각 난황막) 아래로 침, 피펫 등을 도입함으로써 전달되는 것이 바람직하다. 정자수는 관리하는 정자를 형성하는 장소에 따라 증가 또는 감소될 수 있다. 또다른 바람직한 양태에서, 정자 시료는 침을 사용하여 알로 전달된다. 본래, 정자 세포는 성공적인 수정을 위해 내부 난황주위막 (perivitelline membrane)을 관통하여 투명대(oolemma)와 융합되어야 한다. IOF로, 정자 세포는 또한 성공적인 수정이 일어나기 전에 외부 난황주위막을 관통해야 한다. 수정의 효율을 증가시키기 위해, OPL 또는 난황막을 처리할 수 있다. OPL 또는 난황막이 정자에 대해 더욱 투과적이게 하는 임의의 처리방법, 예컨대 비독성 산, 단백질가수분해 효소 또는 물리적 마찰을 이용할 수 있었다.

한 양태에서, 약 15°의 각으로 침, 피펫 등이 난각을 통해 전진하여 상기 난각과 나란히 존재하는 난황막을 관통한다. 본 발명의 방법에서, 침, 피펫 등은 내부 난각 난황막과 마주칠 때까지 봉소를 통해 전진될 수 있다. 본 발명의 방법의 실시자는 침, 피펫 등의 팁이 그의 추가 전진에 대한 약한 저항이 느껴지는 경우 난황막에 맞닿았다는 것을 알 것이다. 팁이 천천히 전진됨에 따라, 난황막으로부터의 저항력이 주어지며, 팁은 난황막을 간신히 관통하게 된다. 그 다음, 정자 시료는 난황막의 부위에 인접하며 배아판에 인접하게 존재하는 알로 전달될 수 있다. 따라서, 정자는 난황막 바로 아래에 전달될 수 있으며, 이 절차는 세포질내 정자 주입법(ICSI, intracytoplasmic sperm injection)이라 일컫는다. 정자 시료의 전형적인 부피는 0.005㎖ 정도로 적거나 또는 0.10㎖ 정도로 크다. 주입된 정자 시료의 전형적인 부피는 약 0.01㎖이다.

바람직하게는, 알의 오염 및 배아의 사망을 방지하기 위해, 난각내의 개구부는 전술된 바와 같이 밀봉된다. 전술된 바와 같이, 본 발명의 방법은 닭, 메추라기, 오리, 칠면조, 꿩, 타조, 에뮤, 거위, 공작, 뇌조, 아메리카 타조(rhea), 앵무새, 왕관앵무새(cockatiel), 관앵무새(cockatoo), 잉꼬 및 기타 상업적으로 가치있는 조류로 이루어진 군으로부터 선택된 조류 종으로부터의 산란된 알을 수정하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 생리학적으로 허용가능한 캐리어내에서 조류 정자를 포함하는 정자 시료를 얻고, 상기 정자 시료를 알로 전달하여 상기 알을 수정시키고, 상기 알을 항온처리하고, 알로부터 살아있는 닭으로 부화시키는 것을 포함하는, 알이 난황막에 의해 감싸인 난황을 포함하며 살아있는 닭으로 부화되는, 난각내에서 조류 알을 수정하는 방법을 제공한다. 본원에 사용되는 "얻는" 또는 "수득하는"이라는 것은 미리 만들거나 미리 전달된 정자 시료를 이용하는 것을 포함한다.

정자 시료가 전술된 바와 같이 본 발명의 방법에 따라 알로 전달된 후, 알은 전술된 바와 같이 살아있는 닭으로 부화될 때까지 항온처리된다.

전술된 바와 같이, 본 발명의 방법은 또한 파충류 알의 알내 수정을 위해 사용될 수 있다. 조류 알과 유사한 파충류 알은 난황 및 암컷 전핵을 포함하며, 알을 낳는 경우 난각에 의해 보호된다. 비수정 산란된 파충류 알은 본 발명의 방법에 따라 난각내에서 수정될 수 있다. 특히, 동일 종의 하나 이상의 파충류로부터의 정자를 포함하는 정자 시료은, 난각내에 생성된 개구부를 통해 수정이 일어나는 암컷 전핵에 인접한 난황 상으로 비수정 산란된 알로 전달된다.

전술된 바와 같이, 본원에 기술되는 알내 수정 방법은 또한 알내 절차에서 다른 방법과 함께 이용될 수 있다. 예를 들면, 배아는 수정 후 백신투여될 수 있다. 이러한 백신투여 절차는 당해 분야의 숙련자에게 잘 공지되어 있다. 다르게는, 이러한 백신투여는 알내 수정과 동시에 이루어지되, 단 상기 백신은 배아의 발생을 방해하지 않았다.

추가로, 알내 수정은 다수의 알이 주입 기술과 같은 방법에 의해 동시에 수정되도록 자동화될 수 있다. 따라서, 50, 100, 200, 300개 이상의 알이 동시에 주입될 수 있었다.

단성생식

본 발명의 한 실시태양에서, 산란된 비수정된 알의 활성화는 단성생식에 의해 유도된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "단성생식"은 수컷 가메트의 어떠한 기여 없이 암컷 가메트로부터 배아 세포를 생산하는 것이다.

바람직한 실시태양에서, 비수정된 산란된 조류의 알의 단성생식에 의한 활성화는 난황을 둘러싸고 있는 막(난황막) 및 배아판을 관통시킴으로써, 예를 들어 25 게이지 바늘을 난각을 통해 알까지 지향시켜 난황을 둘러싸고 있는 난황막을 관통시킴으로써 유도될 수 있다. 바람직하게는, 난황의 파괴는 제의된다. 따라서, 난황을 둘러싸고 있는 난황막의 관통 및 파열은 난자의 활성화를 개시할 수 있다. 난황을 둘러싸고 있는 난황막을 파열시키는 다른 기계적인 수단을 사용할 수 있을것으로 고려된다. 상기 과정에서 바늘을 사용하는 대신, 예를 들어, 비-열 YAG(이트륨-알루미늄-가닛) 레이저를 비롯한 레이저를 난황을 둘러싸고 있는 난황막을 파열시키는데 사용할 수 있다.

알 발생의 프로그램을 개시하는 것이 시토졸성 Ca²⁺의 일시적인 증가라는 증거가 있다. 시토졸 중 Ca²⁺의 농도는 Ca²⁺를 알에 직접 주입하거나 A23187과 같은 Ca²⁺운반 이온운반체를 사용함으로써 인위적으로 증가시킬 수 있다. 이는 지금까지 시험된 모든 동물의 알을 활성화시킨다(알버츠(Alberts)의 문헌(1983)). Ca²⁺킬레이트제 EGTA를 주입함으로써 Ca²⁺의 증가를 방해하면 수정 후 알내 활성화가 억제된다. 시토졸 중 Ca²⁺농도의 증가는 일시적으로, 수정 후 2 내지 3 분동안만 지속되기 때문에, DNA 및 단백질 합성을 포함한 알내 활성화의 후기 단계 동안에 관찰되는 상황을 직접 조정할 수 없음은 분명하다. 그 대신, Ca²⁺농도의 증가는 발생 상황의 전체 순서를 개시하는 기능만 하고; 몇몇 보다 영구적인 변화는 Ca²⁺수치는 높지만 알에서 일어나야 한다.

활성화 메커니즘이 완전히 이해된 것은 아니지만, 정자가 알에서 미리 조절된 프로그램을 개시하는 기능만을 하는 것은 분명하다. 정자 자체가 필요한 것은 아니다. 알은 다양한 비특이적 화학적 또는 물리적 처리법에 의해 활성화될 수 있다. 이들 방법은 또한 일반적으로 세포내 Ca²⁺를 증가시키는 것으로 생각된다(리코드(Rickord) 및 화이트(White)의 문헌(1992)). 예를 들어, 바늘로 찌르는 것은 개구리 알을 활성화할 수 있다(알버츠의 문헌(1983)). 마우스 난모세포는 Ca²⁺, Mg²⁺유리 배지(수라니(Surani) 및 카우프만(Kaufman)의 문헌(1977)), 히알루로니다제를 함유한 배지(그라함(Graham)의 문헌(1970)), 에탄올(쿠트베르손(Cuthbertson)의 문헌(1983)), Ca²⁺이온운반체 또는 킬레이트제(스타인하르트(Steinhardt) 등의 문헌(1974); 클린(Kline)의 문헌(1992)), 단백질 합성 억제제(시라쿠사(Siracusa) 등의 문헌(1978))에의 노출 및 전기 자극(타르코우스키(Tarkowski) 등의 문헌(1970))에 의해 활성화되었다. 에탄올(나가이(Nagai)의 문헌(1987)), 전기 자극(웨어(Ware) 등의 문헌(1989)), 실온에서의 노출(스티스(Stice) 및 키퍼(Keefer)의 문헌(1992)), 및 전기 자극 및 사이클로헥스이미드의 조합(퍼스트(First) 등의 문헌(1992); 양(Yang) 등의 문헌(1992))에 의한 소의 난모세포의 활성화는 보고되었다. 이들 방법은 비수정된 산란된 조류의 알에 적용시킬 수 있다.

단성생식에 의한 알내 활성화를 적용하여 가축을 번식시키는 순종 근교계를 급속하게 생산한다. 현재의 산업적 관행은 독특한 상업적 새 제품을 생산하기 위해 동종접합성 모계의 상이한 조합의 사용을 포함한다. 이러한 순종 가계를 수득하고, 개선하고, 유지하는데 많은 노력이 행해졌다. 단성생식으로, 암컷 가메트를 유도하여 수컷으로부터의 유전자의 기여없이 살아있는 새끼새로 발생시킬 수 있다. 그 결과 수득되는 새끼새는 모든 대립유전자에서 완전히 동종접합성이다. 따라서,동종접합성 순종 가계는 오늘날 요구되는 다회 동계교배 대신 1 세대에서 생성될 수 있다. 또한, 동종접합성 가계를 유발하기 위해 새의 집단을 사용하는 대신, 하나의 우수한 개체를 사용할 수 있다. 가계 집단에서 평균치를 훨씬 능가하는 개개의 새가 있기 때문에, 이 방법은 가장 이용가능한 유전자 특징을 최종 상업적 제품에 신속하게 도입하는 방법이다.

핵 전달

핵 전달/세포성 현미조작 기술을 이용하여 비수정된 산란된 조류 알을 활성화할 수 있다. 따라서, 개별적으로 고려된 본 발명의 실시태양은 세포성 핵 또는 "핵질체(nucleoplast)"를 함유한 유체 현탁액의 전달을 포함한다. 핵질체는 특정 향상된 원심분리 방법을 이용하여 대규모로 생성될 수 있다. 양, 암소 및 마우스와 같은 많은 종에서, 한 세포로부터 단리된 핵질체를 동일한 클로닝된 개체를 생성하기 위한 목적으로 또다른 적출된 세포로 삽입할 수 있음이 확인되었다. 본원에서 사용된 바와 같이, "핵 전달"은 (세포에서 또는 세포로부터 독립적인 핵으로서) 핵(핵질체로도 공지됨)을 본래의 핵이 예를 들어 제거술 또는 절제술에 의해 무능하게 된 또다른 세포로 삽입하는 것을 의미한다. 본원에 기술된 방법은 제작자가 우량 유전자 혈통을 상업적 무리로 유효하게 번식시키게 하고 자동화된 핵 전달 기기 기반의 개발을 위한 기초로서의 기능을 하게 한다.

이러한 전략의 실행을 위해 요구되는 주요 단계들은 (1) 핵질체 도너의 배양을 위한 적합한 세포계 및 조건의 개발; (2) 조류 난자 및/또는 접합체 내에서 핵 구조물의 가시화 및 제거 또는 절제; (3) 도너 핵의 단리; (4) 도너 핵의 난자(세포질체)로의 전달이다. 재구성된 난자를 활성화시켜 배아 발생에 이르게 하는 것도 달성될 수 있다.

핵질체 도너 세포

배아 간세포 및 시원 생식세포는 새끼새에서 전능성으로 존재하고 조류의 NT 방법에 이용될 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 방식으로 생성된 클로닝된 새끼새는 특정 가금류 가계 개요에 적용하기에 유용할 수 있다.

또다르게는, 체세포계는 다른 가금류 가계 개요에 유리할 수 있다. 체세포 유형의 선택시 인자는 "리프로그래밍(reprogramming)"을 수행하는 능력이다. 리프로그래밍은 핵질체가 모든 배아 세포계에 기여하여 정상적인 배아 발생에 이르게 하기 위해 이용될 수 있다.

배양된 배아 섬유아세포(CEF)는 배양 및 유전자 조작의 용이함으로 인해 우수한 결과로써 포유동물에서 널리 이용될 수 있다. 조류계에서 체세포 핵 전달을 위해 CEF가 사용될 수 있다. 또다르게는, 배아-유도된 배엽 세포(BC)를 배양하여 사용할 수 있다. 조류의 핵 전달 플랫폼과 함께 사용될 수 있는 또다른 세포 유형으로는 조류 B 세포가 있다.

조류 B 세포를 사용하는 이점은 그의 높은 수준의 재결합을 수행할 수 있는 능력이다. 이 능력은 외인성 DNA를 조류 게놈에 혼입시키는 과정을 훨씬 효율적으로 만들기 때문에 중요할 수 있다. 생체 내에서 상기 임의의 공여 세포계에 행하여진 변성은 이후 결과적인 새의 게놈에 혼입된다. 가장 유리한 세포 유형을 확인하기 위해 시험을 수행할 수 있다. 예를 들어, 핵질체는 상기 세포 유형으로부터생성되어 조류 세포질체(수용 세포)로 전달될 수 있다. 가장 높은 배아 생존율을 유도하는 이러한 세포 유형은 표준 기술 플랫폼에 혼입될 수 있다.

포유류의 핵 전달은 비록 이 목적을 위해 난자가 주로 사용되기는 하지만 난자 및 접합자 둘 다를 사용하여 성공적으로 수행되어 왔다. 표준 핵 전달 절차는 전형적으로, 존재하는 세포핵을 바람직하게는 공여 핵의 도입 이전에 제거하거나 절제함을 필요로 한다. 조류의 알은 크고 공여 핵과 수용 세포의 핵 사이의 거리가 충분히 멀어서 수용 세포의 핵을 꼭 제거할 필요는 없다. 그러나, 세포핵을 제거하는 것이 현재 바람직하다.

조류 알의 세포 핵은 진한 난황 과립에 의해 가려져 시각화를 위한 전통적인 광학 현미경은 매우 비효율적이다. 이러한 이유로 조류 난자의 세포핵을 제거하기 위해 현재 선택되는 방법은 형광 핵 표지의 사용을 포함한다. 획스트(Hoescht) 33342(비스-벤즈아미드) 및 DAPI(4'6'-디아미디노-2-페닐인돌, 하이드로클로라이드)와 같은 공지된 형광 핵 염료는 핵 및 관련 DNA의 최대한의 시각화를 수행할 수 있기 때문에 사용될 수 있다.

세포핵 제거를 위해 두 가지 표준 전략을 사용할 수 있다: (1) 유리 마이크로피펫을 통한 제거, 또는 (2) 레이저 절제. 세포 미세조작을 위해 두 전략 모두가 현재 사용된다. 레이저 유형 및 파장은 실험적으로 결정할 수 있다. 세포질 내의 형광 영역을 상기 방법으로 제거하는 것은 핵의 제거를 지시할 것이다. 이 시기에서 핵 DNA뿐만 아니라 스핀들 형성 기구도 제거하는 것이 바람직하다.

개조된 배아가 정규 배수성을 유지해야 한다는 요건을 포함하는 다수의 인자가 핵 전달 이후의 전개에 영향을 미친다. 핵이 분화하기 시작한 세포로부터 전달될 때, 유전자 발현의 패턴은 분화된 세포 유형의 것으로부터 초기 배아의 것까지 "재프로그래밍"될 수 있다. 세포 주기를 변화시키는 실험은 상기 과정의 효율이 공여 및 수용 세포 둘 다의 주기 단계에 영향받는다는 것을 시사하였다.

포유류로부터, 공여 및 수용 세포 둘 다의 세포 주기 단계가 개조된 배아에서 DNA 복제가 일어나는 시기에 영향을 미치는 것으로 보인다. 세포질중의 감수분열 촉진 인자(MPF)의 영향으로 인해, 수용 세포는 더 큰 영향력을 가질 수 있다(바네스(Barnes) 등, 1993; 캠벨(Campbell) 등, 1993). 복제 동안의 MPF 활성은 스핀들의 형성시에 증가할 수 있고 중기 II 동안 높게 유지될 수 있다. 고함량의 MPF를 갖는 세포질체에 핵을 전달한 후, 공여 핵의 세포 주기 단계에 상관없이 핵 난황막의 파손, 염색체 응축, 핵 난황막의 재형성 및 DNA 복제가 일어날 수 있다. 대조적으로, 핵은 낮은 수준의 MPF 활성을 갖는 난모 세포로의 전달 후에 DNA 복제가 일어나는가 여부를 결정한다(캠벨 등, 1993, 1994). 상기 연구로부터 두 가지 효과가 있는 것으로 생각된다: (1) 세포 주기의 특정한 시기 동안 유전자 발현이 재프로그래밍될 더 많은 기회; 및 (2) 세포 주기의 유사한 시기로의 전달로부터의 이점.

공여 핵들이 세포 주기의 G0 또는 G1 시기일 경우 배아 발생이 개선될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 양 돌리(Dolly)는 G0에 있다고 추정되는 유방-유도된 세포와 융합된 세포핵 제거된 난모세포로부터 발생하였다. 마찬가지로, G0 및 G1 상태에 있는 구(Cumulus) 세포가 생쥐의 체강 세포 핵 전달을 달성하는데 사용되어 왔다(와카야마(Wakayama) 등, 1998). 그러나, 클로닝된 송아지는 비휴지기 공여 세포로부터의 핵을 사용하여 생성되었다(시벨리(Cibelli) 등, 1998). 이는 가금류의 성공적인 핵 전달을 위한 요건이 실험적으로 결정되어야 할 것임을 시사한다. 최적의 프로토콜을 결정하기 위해 다양한 세포 주기 단계에 있는 세포를 사용할 수 있다. 공여 핵의 전달은, 공여 세포를 세포핵 제거된 난자/접합자에 전기융합시켜 수행하거나 공여 핵을 세포핵 제거된 난자에 직접 주입하여 수행하여 왔다. 조류 알은 크기가 크고 주입이 용이하므로, 공여 핵을 직접 주입하는 것이 전달의 최적 방법일 수 있다. 핵 전달이 중기 II로 정지된 난자에 수행되는 경우, 전형적으로 난자를 인공적으로 활성화시키는 것이 필요하다. 이는 핵 전달과 동시부터 핵 전달 수시간 후에 이르는 다양한 시간 간격으로 수행될 수 있다. 상기 동일한 매개변수를 최적의 활성화 시간에 대해 시험할 수 있다.

상기 과정을 수행하기 위한 자동화된 고-스루풋 시스템을 설계할 수 있다. 이는 "증식 부화(multiplication breeding)"라 불리는 가금 산업의 전체 층을 제거할 가능성이 있다. 전형적으로 증식 부화에서는 가계 선으로부터 조부모 선, 부모 선을 거쳐 최종적으로 시판용 새로 가는데는 몇 세대가 필요하다. 상기 과정이 진행되는데는 많은 개체수의 새가 필요하다. 핵 전달과 함께한 IOA는 단일한 우수한 새로부터 최종 시판용 제품을 제조할 수 있다. 순 효과는 유전적으로 우수한 새의 무리를 극히 효율적인 부화 조작에서 제조할 수 있다는 것이다. 게다가, 핵 또는 세포 전달에 이용되는 세포는 최종 사용자가 특정한 시판용 제품을 요구할 때까지 무기한으로 저장될 수 있다. 동등하게 중요한 이점은 전체가 단일성(unisex)인 새무리를 생산할 수 있다는 것이다. 예를 들어, 브로일러 생산자는 성장 효율을 증가시키기 위해 모두 수컷인 무리를 요구할 수 있고, 알 생산자는 모두 암컷인 무리를 명백히 선호할 것이다.

유전자변형

또한, 본 발명은 활성화, 예컨대 조류 알을 본원에 개시된 본 발명의 방법으로 수정시키는 단계, 및 이질구조의 핵산을 조류 알에 도입하는 단계를 포함하는, 이종구조의 핵산을 함유하는 조류 배아를 생산하는 방법을 제공한다. 본원에서, "핵산"이란 DNA, cDNA, RNA, mRNA 및 안티센스(antisense) RNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 핵산은 단일 가닥이거나, 이중 가닥이거나, 다중 가닥일 수 있다. 이종구조 핵산은 조류 종에 고유하지 않은 핵산, 및 조류 종의 세포 또는 핵에 도입된 위치에서 정규적으로 발현하지 않는 핵산을 포함할 수 있다.

조류의 알을 IOA에 의해 활성화시킨 후, 일부 또는 모든 세포의 유전자 구성을 조작하기 위해 임의의 발생 단계에서 발생성 배아를 도입할 수 있다. 초기 배아는 형질전환 조류를 생산하는데 가장 중요하다. IOA는 이종 핵산을 조류의 초기 배아내로 가장 초기에 도입할 수 있도록 허용한 바와 같이 이종 핵산의 배선 전달을 고려한다. 발생성 배아를 이와 같이 유전자 조작함으로써, 예를 들어 내생성 DNA 및 그의 발현을 조절하여 상업적 용도를 위해 상업적으로 가치 있는 단백질을 제조할 수 있는 세포를 생산하는데 사용될 수 있는 유전 물질을 포함하는 형질전환 조류를 생산할 수 있다.

몇 가지 공지된 방법에 따라 당해 분야의 숙련자에 의해 핵산을 조류의 게놈내로 도입할 수 있다(문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988]; [Lennette et al., Manual of Clinical Microbiology, 14th Ed., Amer. Soc. for Microbiology, Washington, D. C., 1985]; [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989]; [Antisense RNA and DNA, D. A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988]; [Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, 2nd Ed. Alan R. Liss, Inc., New York, 1987]; [Centers for Disease Control Laboratory Manual, U. S. Department of Health, Education, and Welfare Pub. No. 79-8375, p.75, Centers for Disease Control, Atlanta, GA]; 및 [Fundamental Virology, 2nd Ed. Bernard N. Fields and David M. Knipe, Chief Eds., Raven Press, New York, 1990] 참조). 유전 물질을 조류의 게놈내로 도입하는 방법의 예로는 조류 백혈증 바이러스(ALV) 형질도입 매개 형질전환, 전이성 유전자(transposon) 매개 형질전환, 포배막 세포 매개 형질전환, 원시 배아 세포 매개 형질전환 및 핵 도입이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 활성화 사건이 발생하는 동일시간, 예를 들어 정자 시료가 알로 도입되는 동일시간, 또는 배아 발생의 말기 단계에서 이종 핵산을 배아내로 도입할 수 있다.

형질전환 조류를 생산하는데 사용되는 표준 방법은 이종 DNA 삽입을 포함하는 복제 결함 ALV-유도된 형질도입성 입자를 생산하는 것이다. 이러한 입자는 조류에서 복제될 수 없기 때문에, 바이러스 감염 및 조류 또는 인간의 질병을 일으킬 위험성이 없다. 본원에 기재된 방법을 사용하여 조류의 초기 배아를 포함하는 산란된 알에 형질도입성 입자를 직접 투여할 수 있다. 예를 들어, 배아 바로 위에 창을 형성하고 형질도입성 입자를 배아의 배하강내로 도입할 수 있다. 이어서 창을 밀폐하고 발생을 위해 알을 항온기내에 넣는다.

이종 핵산을 조류의 게놈내로 운반하는데 사용되는 다른 방법으로는 전이성 유전자 매개 형질전환이 있다. 전이성 유전자는 숙주 종의 게놈 내에서 전위하거나 주위로 이동할 수 있는 유전자 성분이다. 조류 종에서 발생하는 전이성 유전자는 공지되어 있지 않다. 그러나, 다른 종으로부터 재구성된 특정 전이성 유전자가 조류의 게놈내에서 작용할 수 있음이 밝혀졌다. 상기 전이성 유전자는 유전자를 조류의 게놈내로 삽입하는데 유용한 핵산 벡터 시스템으로서 역할을 하도록 설계될 수 있다.

또한, 이종 DNA를 조류의 배아내로 도입하기 위한 다른 방법으로는 포배막 세포 형질전환이 있다. 단계 X의 배아(수정된 알에서 생성되는 배아 단계)로부터 수득될 수 있는 포배막 또는 기타 초기 세포를 콜로니를 형성하여 성장하는 피이식 배아내로 역주입하여 키메라(chimera)성 새끼새를 생산한다. "키메라성" 새끼새는 2개의 상이한 유전자 계통에서 유래한 세포로 구성된다. 단리한 후 곧바로 조사된 숙주의 배아내로 주입된 포배막 세포는 배선(정자 및 알을 생성하여 모두 다음 세대로 전해지는 세포)을 포함하는 생성된 조류의 모든 조직에 기여하는 능력을 갖는다. 형질전환 가금을 생산하기 위해 당해 분야의 숙련자에게 공지된 다양한 방법에 의해 포배막 세포를 배양하고 DNA로 감염시킨다.

그러므로, 포배막 세포 또는 배아간(ES; embryonic stem) 세포를 난에서 수정된 배아내로 주입하여 키메라성 가금을 생산할 수 있다. 이어서 키메라성 가금을 교배시키고 포배막 또는 ES 세포의 배선 전달을 가질 경우에는 최초 주입된 세포의 클론을 생산할 수 있다.

또한, 원시 배아 세포 매개 형질전환은 형질전환 조류를 생산하는데 사용될 수 있다. 발생성 배아가 성장함에 따라 특정 세포가 배선에 도입되어 정자 및 알을 생성한다. 상기 원시 배아 세포(PGC)는 조류가 성적으로 성숙될 때까지 휴면 상태에 있는 발생성 생식선의 생식 융선으로 이동한다. 조류 형질전환에 대한 하나의 접근 방법은 상기 PGC를 단리하고, 이를 유전자 조작하고 연속적으로 발생시키기 위해 발생성 배아내로 다시 도입한다. 이러한 기술적 접근 방법은 발생되는 정도 및 그의 잠재적인 적용 모두에서 포배막 세포 접근 방법과 비교된다. 원시 배아 세포는 포배막 세포에서와 같이 피이식 배아내로 주입시 배선에 기여하는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 또 다른 양태는 조류 각각의 유전자 형질 또는 구성에 대한 중요 정보를 제공하는 조류의 알로 액체 제제를 도입함을 포함한다. 이를테면, DNA 및/또는 DNA 탐침은 성 또는 임의의 기타 유전자형에 의해 배아를 감별할 목적으로 조류의 알내로 도입될 수 있었다. 상기 탐침은 표적 서열에 특이적으로 결합하고 조류의 유전자 구성에 대한 특정 정보를 제공한다. 다양한 형광성, 방사성 또는 화학 발광성 분자에 의한 탐침의 표지는 유전자 형질을 측정하기 위한 고도-신뢰성기술을 제공한다. 다른 방법으로는 항체 또는 기타 단백질이 정보제공 분자로서 유사한 방식으로 사용될 수 있다.

본 발명의 용도는 핵산을 단세포성 난모 세포로 혼입하고 외인성 DNA를 생성된 조류의 모든 또는 대부분의 세포내로 혼입하기 위해 초기 배아를 고려한다. 그러나, 다른 태양으로, 본 발명은 상기 핵산 및 핵산 벡터를 말기 단계의 배아로 도입하기 위해 변경될 수 있다. 형질전환 가금을 생산하기 위한 하나의 통상적인 프로토콜은 바이러스성 입자를 발생성 조류 배아의 배하강내로 주입함을 포함한다. 다른 적용은 조류 배아에서 특정 유전자 산물의 일시 발현 때문일 것이다. 알 및/또는 동물계 생물 반응기 시스템을 생산할 특정 목적으로 핵산 제제를 도입할 수 있었다. 또한, 유전자 발현에 영향을 미치기 위해 단백질, 항원 및 항체를 배아내로 도입될 수 있었다.

또한, 본원에 기술된 알내 활성화 방법은 기타 알내 처리와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 수정 후 배아에 백신을 접종할 수 있다. 다르게는, 알내 수정과 동시에 백신을 접종할 수 있지만, 이러한 경우 태아의 성장을 저해하지 않는 백신을 제공한다.

자동 조작

다량의 알이 동시에 수정되도록, 예를 들어 주입술을 이용하여 IOA를 자동화할 수 있다. 따라서, 50, 100, 200, 300 또는 그 이상의 알을 동시에 주입할 수 있다. 새로 낳은 알을 활성화시키는 자동화에 의해, 본 발명의 방법이 대량의 산업적 실행에 용이하게 적용될 수 있음은 당해 분야의 숙련자들에게 명백할 것이다.따라서, IOA 공정을 자동화하기 위해, 예를 들어 낳은 수정란을 면역시키는데 사용되었던 종래 기구를 정자 시료 및 세포핵을 주입시키는 데 적용하거나 단성생식에 적용할 수 있다.

당해 분야의 숙련자들이 인식하고 있는 바와 같이, 자동화된 알 취급 기술은 전 세계적으로 많은 독립적 발명가들에 의해 동시에 개발되어 왔다. 오늘날 존재하는 기술은, 액체 기질을 조류의 자충포장란(embryonated egg)에 주입시키기 위한 고-처리량 시스템이다. 예로는 결과적으로 새끼새의 면역 상태를 개선시키기 위한 백신 주입, 인간 및 동물 백신의 생산을 위한 바이러스 주입, 및 새끼새의 건강 상태 및 성장 등에 영향을 끼치는 단백질 주입을 들 수 있다. 가금 생산에 유용한 또다른 자동화 시스템은, 다양한 광원을 사용한 캔들링 또는 알 플랫의 주변 알들 간의 온도차를 근거로 하는, 생존하는 새끼새의 배아 대 사망한 새끼새의 배아를 검출할 수 있다. 이러한 기술은 모두 당해 분야의 현재 개발 상태를 대표한다. 그러나, 조류 양육자의 요구에 따라 개조된, 보다 개선된 플랫폼이 여전히 요구되며, 이 요구는 본 발명이 제기하고 만족시킨다.

IOF 기술의 출현과 함께, 정자 보존 분야에서의 최근의 발전은 가금류 배양 작업을 보다 효율적인 관리 모델로 발전시킬 수 있게 하였다. 이하에 기술될 여러 개의 중요한 유전자 기술은 서로 결합되어 가금류 배양 기술의 자동화를 위한 실로 다양한 플랫폼을 형성할 수 있다.

자동화 경향의 IOA, 예를 들어 IOF를 수행하기 위해서는, 2가지 단계가 고려된다. 제 1 단계는 정자 시료, 또는 전이, 즉 기계 위에 올려놓을 물질을 전달한세포 또는 핵을 함유하는 시료내의 정자 세포의 수를 계산하는 것이다. 이러한 과제는, 캘리포니아주 치노 소재의 애니멀 리프로덕션 시스템스(Animal Reproduction Systems) 등에 의해 시판되는 것과 유사한 내장형 분광계 단위(덴시미터(densimeter)라 치징될 수 있음)를 사용함으로써 수행될 수 있다. 또한, 상기 과제는 유세포 분석기에 의해 수행될 수 있다. 상기 분석으로부터 수득된 정보는 중심 처리 단위 또는 기타 분석 시스템에 전달되고, 여기서 정자 및 정액 희석제(희석액), 또는 세포 또는 핵 물질의 최적 부피를 측정한다. 이어서, 상기 정보를 유체 분산 메커니즘으로 전달하여, 정확한 부피의 유체를 알 주입 메커니즘 또는 이와 유사한 시스템의 중심 유체 저장고 속으로 분산시킨다.

중심 처리 단위가 상기 알 주입 메커니즘을 활성화시키는 제 2 단계에서는, 물질 제제를 함유하는 적당한 양의 희석된 정자 시료 또는 세포 또는 핵을, IOA, 예를 들어 IOF를 수행하기 위한 특정 깊이 및 적절한 각도로 비수정된 알에 전달한다. 상기 주입 처리는 관식 펀치에 의한 난각막의 천공, 및 난각막 및 난황막을 통해 시료 제제를 전달할 주입 니들의 삽입을 포함한다.

알 주입 메커니즘은 당해 분야의 엠브렉스, 인코포레이티드(Embrex, Inc.), 메르크 인코포레이티드(Merck Inc.) 및 기타 회사에 의해 제조 및 시판중인 것과 유사한 설계일 수 있다. 예를 들어, 한가지 설계는 "조류 배아를 위한 고속 자동 주입 시스템(High Speed Automation Injection System for Avian Embryos)"의 제목으로 미국 특허 제 4,903,635 호에 기술되었고, 이는 본원의 참조문헌에 포함된다. 상기 특허에 기술된 바와 같이, 개시된 장치는 유체 기질, 특히 접종용 유체를 알에 주입할 수 있는, 조류 배아를 위한 고속 자동화 주입 시스템이다. 상기 기계는, 주입 전 표면에 연결되어 알을 밀지 않고 들어올리는 흡입 장치를 포함한다. 따라서, 기계는, 난각에 구멍을 내고 알 내부에 유체 기질을 전달하기 위한 단일 니들 또는 펀치를 사용하지 않고, 먼저 난각내 개구부를 형성한 다음, 유체 기질을 조류 배아 또는 주변 환경에 주입하는 개별 메커니즘 및 장치를 제공한다. 또한, 당해 분야에 공지된 바와 같이, 본 발명은 알에 구멍을 내고 유체 기질을 전달하기 위한 단일 니들의 사용을 고려한다. 알 속에 유체의 주입을 기술하는 기타 관련 특허는 미국 특허 제 5,900,929 호(제목: 가금류 알의 선택적 주입을 위한 방법 및 기구(Method and Apparatus for Selectively Injecting Poultry Eggs)); 제 5,722,342 호(제목: 조류의 살모넬라 집단을 축소하기 위한 알의 항생 처리 및 미생물 처리(Ovo Antibiotic and Microbial Treatment to Diminish Salonellae Population in Avians)); 제 5,699,751 호(제목: 알내의 주입을 위한 방법 및 기구(Method and Apparatus for in Ovo Injection)); 제 5,438,954 호(제목: 초기 배아의 알 내 주입을 위한 방법 및 기구(Method and Apparatus for Early Embryonic Development)); 제 5,339,766 호(제목: 초기 배아의 발현 도중 알속에 물질을 도입하는 방법(Method Introducing Material into Eggs During Early Embryonic Development); 제 5,176,101 호(제목: 조류 배아를 위한 모듈 주입 시스템(Modular Injection System for Avian Embryos)); 제 5,158,038 호(제목: 부화가능성 및 질병의 개선을 위한 알 주입 방법, 기구 및 담체 용액(Egg Injection Method, Apparatus and Carrier Solution for Improving Hatchability andDiease); 및 제 5,136,979 호(제목: 조류 배아를 위한 모듈 주입 시스템 (Modular Injection system for avian embryos))를 포함하며, 이들 모두 본원의 참고문헌에 포함된다. IOF의 가장 간단한 실시양태에서는, 상기 기계에서 정자를 항원으로 치환하고 주입 깊이를 조정하여 IOF를 수행한다.

IOA 처리, 예를 들어 IOF를 통해, 해처리가 된 후에 조류 알을 활성화, 예를 들어 수정하기 위한 고-처리량 실행이 가능한 시스템을 설계할 수 있다. 유리하게도, IOF를 위한 본 발명은, 이들의 직접적인 수정 접근을 위해 보다 적은 양의 정자를 요구함으로써, 상기 배양 계획에서의 수컷의 수를 극적으로 감소시킬 수 있어, 보다 능률적인 실행을 가능하게 한다. 잔여 수컷은 매년 당해 산업에서 부화된 수십억개의 알을 수정하기 위해 직접 해처리로 전달되는 충분한 양의 신선한 정자와 함께 중심적으로 하우징될 수 있다. 보다 적은 양의 수컷을 사용함으로써, 양육자로 하여금 수정하기에 매우 뛰어난 수행자만을 사용하여 라인을 개선하는데 보다 신속한 유전자 발현을 가능하게 한다. 또한, 수컷의 제거 또는 상당한 감소에 근거하여 당해 산업의 인프라스트럭쳐를 재조정할 수 있다. 이러한 경우, 비수정란만이 요구되기 때문에, 존재하는 부화 알의 설비에서는 보다 효율적인 상업적 알이 직접 치환될 수 있다. 무리 내 암컷이 약 95 내지 98%인 인공 수정 프로그램에서는, 수동 수정에 대한 요구를 제거할 수 있고, 따라서 상기 프로그램과 관련된 현재 작업 요건의 약 95% 이상을 제거할 수 있다.

핵 이동에 의한 자동 활성화를 위하여, 본래의 핵을 무력하게 만드는 수단을 포함하도록 알 주입 메카니즘을 추가로 개조시킬 수 있다. 예컨대 이 메카니즘은본래의 핵을 제거하거나 무력하게 만들기 위하여 마이크로피펫 또는 레이저를 포함할 수 있다.

예컨대 수정을 통한 활성화 외에, 또한 본 발명에 유전자 분석, 조작 및 증식의 과정을 포함시키는 것도 시도해 볼 수 있다. 당해 분야의 숙련자들이 인지하고 있는 바와 같이, 이러한 수단은 현재 고도의 숙련된 기술을 요구하는 실험실에서의 사용을 위해서 설계되기 때문에 저이윤의 가금류 산업에서 일상적으로 사용하기에는 아직까지 비실용적이었다. 본 발명에서 시도하는 바와 같이, 이들 기술의 대부분은 유전학자와 연구원뿐만 아니라 생산자에 의한 사용을 위하여 총체적으로 자동화된 전형(platform) 내로 도입시킬 수 있다.

본 발명은 (a) 알에서의 활성화(IOF)와 동시에 및/또는 이후에 조류 배아에서 유전자 발현을 촉발시키고/시키거나 (b) 배아의 유전자형 상태에 대한 생명 정보를 제공하도록 계획되는 다양한 액체 배합물을 전달하는 추가의 메카니즘 및 단계를 포함하도록 설계할 수 있다. 전달 장치는 위에서 고찰한 정자 전달을 위한 알 주입 메카니즘에 유사할 수 있다. 본 발명은 정자를 갖는 통상의 유체 저장기 또는 정자와는 독립된 별도의 저장기를 사용할 수 있으며, 이 때 각 유체마다 별도의 바늘이 알 내로 삽입되거나, 알 내로 삽입된 하나의 바늘을 통하여 유체를 순차적으로 주입한다.

또한 본 발명은 다양한 유전자 분석 및 단백질에 기초한 분석에 도움이 되는 검출 메카니즘의 도입을 시도한다. 이 메카니즘의 한 가지 실시태양에서는, 예컨대 레이저와 같은 적절한 파장의 광원, 및 소정의 유전자형 또는 생리학적 상태의지표로서 조류 알에서 차별적으로 발현되는 상응하는 염료 세트의 사용이 포함된다. 이를테면, 이 실시태양에서는 성별 이용 형광 표지 성감별 탐침, 반성(sex-linked) 촉진자 및 발현 시스템, 형광 표지 성감별 항체 등에 의해 알을 분류할 수 있다.

검출 메카니즘으로는, 예컨대 CCD 카메라, 또는 분류 및/또는 동정 메카니즘을 활성화시키는 기타의 적합한 형광 신호 검출기를 사용할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 검출 메카니즘으로는 전술한 바와 동일한 일반적 용도로서 방사능 및/또는 화학발광에 기초한 검출 방법을 위한 섬광 계수기를 사용할 수 있다. 추가의 또 다른 실시태양에서의 시스템은 검출 용도로 "유전자 칩", 유전자 마이크로어레이(microarray) 및/또는 유전자 매크로어레이 기술을 사용할 수 있으며, 그 예로는 아피메트릭스(Affymetrix)사의 제품이 있다.

당해 분야의 숙련자들이 인지하고 있는 바와 같이, 유전자형에 따른 조류의 분류는 생산 작업시 사용될 수 있다. 조류의 성별 분류는 생산 능력의 최적화를 가능케 한다. 즉, 육계 산업에서는 수컷이 바람직한 반면, 산란계로는 암컷이 바람직하다. 또한 본 발명은, 유전학자에게 알의 자동화 고속 동정 및 유전자형 구분에 기초한 유전자 선별을 수행하는 증강된 능력을 제공함으로써, 개선된 가금류 계열의 발전을 향하여 더욱 급속한 유전학적 진보를 낳는다.

유전자형 분류에 어떠한 유형의 검출법을 사용하느냐와는 독립적으로, 또 다르게 시도되는 설계는 개개의 알을 "생존(live)" 또는 "사망(dead)"으로 분류하는 것을 포함한다. 또한 파스 리폼(PAS Reform), 브뢰이유(Breuil) 및엠브렉스(Embrex)의 기존 시스템에 도입된 바와 같은 단순한 광 및/또는 온도 메카니즘이 이 방법을 위해 시도된다. 본 발명의 이 측면을 위하여 엠브렉스에게 양도된 미국 특허 제 5,900,929 호가 본원에 참조로서 인용된다.

이하에 기술하는 분류 장치와 결부시켜, 예정된 지시 및 그의 검출 결과를 제공하는 액체 배합물을 주입함으로써 본 발명은 모든 방식의 분자 검출 응용을 위한 융통성있는 전형을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시태양에서는 조류 알로부터 액체 시료를 얻기 위한 액체 시료채취 장치를 도입한다. 이 설계는 시료채취 바늘과 통하는 진공 배관을 이용하며, 이 시료 채취 바늘의 첨단은 왕복운동을 하여 각 조류 알의 액체 부분에 의해 포위되어 있다가 다시 그로부터 제거된다. 또 다르게는, 이 설계는 유체 시료를 시료채취 모세관 내로 흡인하는, 피이 바이오시스템즈(PE Biosystems) 310 유전자 분석기에 사용된 것과 유사한 전기 삼투압 경사를 이용할 수 있다.

전술한 검출 메카니즘을 최대로 이용하기 위해서는, 소정의 시간에 다양한 기술로 신호를 증폭시키는 것이 필요할 수 있다. 검출 신호의 증폭에 대한 한 가지 실시태양에서는 피이 바이오시스템즈, 하이베이드 엠제이 리서치(Hybaid MJ Research) 등에 의해 생산된 것과 같은 DNA 증폭용 통합식 열순환 유니트를 도입한다. 이 장치는 필수적이지는 않지만 전술한 바의 유전자 칩, 마이크로어레이 및 매크로어레이에 기초한 유전자형 구분 장치를 사용하는 경우에 중요하다.

또한 분석 시료에 관하여 더욱 상세한 정보를 얻기 위하여 크기, 분자량, 전하 또는 기타의 화학적/물리학적 특성들에 기초하여 시료 분자의 분리를 시도한다.이러한 분리 메카니즘의 한 가지 실시태양은 전기영동 유니트이다. 예컨대, 피이 바이오시스템즈에 의해 제작된 310 유전자 분석기와 같거나 그와 유사한 통합식 모세관 전기영동 유니트를 사용하여 핵산 및 단백질을 둘 다 분리할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시태양은, 이를테면 가금류의 1배차 번식 순종계로부터의 대규모 처리량의 알의 유전자형 구분에 유용할 것이다.

궁극적으로, 전술한 실시태양으로부터 얻은 자료는 단독으로 또는 집합적으로, 알이 가공선(processing line)에 도달할 때 알의 가치 및 상태를 평가하는 중앙 처리 유니트 또는 기타 장치 내의 소프트웨어에 의해 처리될 수 있다. 평가된 알은 표지를 붙이고, 분류하고 적절히 부화 바구니 또는 알판으로 이송한다. 휴렛 패커드(Hewlet Packard) 및 엡손(Epson) 프린터에 현재 사용되는 잉크젯 메카니즘에 의해 표지될 수 있다. 알의 분류 및 이송은 기계 몸체를 통하여 대기중인 알 운반차로 알판을 이송시키는 자동화 흡인컵 및 가동 벨트에 의해 수행될 수 있다. 이러한 장치 부분을 위한 메카니즘으로는 브레이유, 쿨 코포레이션(Kuhl Corporation), 파스 리폼 및 엠브렉스에 의해 제작 및 판매되는 시스템과 유사한 구성을 사용할 수 있다.

또한 본원에 기술한 수단의 전형은 소정의 기존의 유전자/단백질 분석 능력을 유익하게 이용한다. 기존의 분석 능력을 본 발명에 따른 전형에 직접 도입시킴으로써 이들 방법은 고속으로 산업적 규모로 수행될 수 있을 것이다. 이러한 분석 능력이 상업적 가금류 산업에 직접 응용될 수 있는 예를 기술한다.

하기 실시예는 당해 기술분야의 일반적인 숙련자에게 본원에 청구된 수행 방법의 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 출발하며, 이는 순전히 본 발명의 예가 되도록 한 것이지 본 발명의 범주를 제한하려는 것은 아니다. 수(예: 양, 온도 등)에 관하여 정확하게 하려는 노력은 했지만 약간의 오류 및 오차가 존재할 것이다. 달리 언급하지 않는 한, 부는 중량을 기준으로 하고 온도의 단위는 ℉이며, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.

실시예 1

1. 43개의 갓 산란된 비수정된 바드 락(Barred Rock) 달걀을 3% 과산화수소로 난각을 닦아냄으로써 살균하여 랙(rack)에 넣었다.

2. 동일한 아침에 4마리의 바드 락 수탉으로부터 정자를 수득하여 수정 단계가 수행되기 1시간 미만 전 배큐테이너(Vacutainer, 등록상표) 바이얼에 수집하였다.

3. 정자를 4마리의 수탉으로부터 모아서 1 ml의 아비딜루언트와 혼합하였다.

4. 아비딜루언트와 혼합된 정자를 1", 22 게이지 바늘을 통해 1 ml 주사기로 뽑아내어 정자 시료를 형성하였다.

5. 바늘로 달걀 난각의 크고 뭉툭한 말단에 개구부를 만들어 난각 표면에 대해 15°각도로 이 개구부를 통과시켰다.

6. 바늘을 그 끝이 난황 및 배아판을 둘러싸고 있는 난황막을 간신히 관통할 때까지 공기 세포를 통과시켰다.

7. 0.05 ml의 정자 시료 1방울을 난황막에 인접한 난황 표면에 주사하였다.

8. 주사기에 부착된 바늘을 달걀에서 뽑아냈다.

9. 바늘에 의해 난각에 만들어진 개구부를 작은 난각 조각으로 대고, 이 패치를 엘머 글루(Elmer's glue, 등록상표)와 같은 접착제로 난각에 붙였다.

10. 상기 달걀을 99.5 ℉ 및 80% 습도로 1 내지 약 18일의 항온처리를 유지하는 시판용 등급의 세터에 넣었다. 이 달걀을 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 마무리하여 시판용 설정기에 사용하였다.

11. 19일째 되는 날, 상기 달걀을 시판용 인공부화기로 옮기고 부화될 때까지 98.5 ℉ 및 80% 습도로 유지하였다.

본 발명의 수정 방법을 43개의 달걀에 수행한지 10일 후, 어떤 달걀이 성공적으로 수정되었는지 측정하기 위해 일상적으로 알을 불빛에 비추어 보았다. 43개의 달걀 중 35개의 달걀이 수정되었다. 35개의 수정된 달걀 중 32개가 성공적으로 부화하였고 1마리의 병아리 외에는 모두 건강하였다. 따라서, 본 발명의 수정 방법에 의해 처리된 43개의 산란된 달걀 중 72%가 건강하게 생존한 병아리를 생산하였다.

실시예 2

암탉이 산란한 시판용 갈색 달걀, "하이-라인 버라이어티 브라운"(Hy-Line Variety Brown)에 대한 데이터:

1. 270개의 갓 산란된 달걀을 아침 6시 30분에 수집하였다.

2. 블랙 자이언트(Black Giant) 수컷으로부터의 정액을 50:50 비율로 즉시 희석제에 수집하였다.

3. 달걀 및 정액을 정액 수집 20분 이내에 실험실로 옮겼다.

4. 달걀을 실험용 대조군 및 반증용 대조군의 2군으로 135개씩 나누었다.

5. 실험용 달걀에 상기 기술된 희석된 정액 제제 10 ul를 주사하였다.

6. 반증용 대조군에는 주사하지 않았다.

7. 주사된 달걀을 실리콘 밀봉기로 밀봉하여 상기 기술된 인공부화기에 넣었다.

8. 5일 후 수정률을 측정하여 기록하였다.

9. 실험용 군에서 135개의 달걀 중 33개(24%)가 수정되었다. 반증용 대조군 달걀은 발생 징후가 나타나지 않았다.

실시예 3: 단성생식

1. 270개의 갓 산란된 달걀을 아침에 수집하였다.

2. 달걀을 실험용 대조군 및 반증용 대조군으로 135개씩 나누었다.

3. 난황이 눈에 보이도록 2 내지 3 mm의 개구부를 달걀 난각 및 난각 난황막을 통해 만들었다.

4. 난황 및 배아판을 둘러싸고 있는 난황막을 난황이 파열되지 않도록 조심하면서 부드럽게 "찌르고"/거나 관통시켰다(또는, 개구부의 형성 및 난황막의 관통을, 25 게이지 주사기 바늘을 난각 및 난황을 통해 간단히 삽입함으로써 동시에 수행할 수도 있다).

5. 이어서, 이렇게 처리된 달걀을 실리콘 밀봉기로 밀봉시키고 인공부화기에 넣었다.

6. 달걀 발생은 5일째 되는 날 측정하고, 인공부화기로 반송하기 전에 발생 비율을 기록하였다.

7. 부화 비율 및 건강 상태를 기록하는 경우 달걀은 부화될 때까지 발생되게 한다.

결과

1. 난황이 파열된 달걀은 버리고, 131개의 실험용 달걀 및 135개의 반증용 대조군은 그대로 두었다.

2. 5일 후 발생을 측정하였는데 131개의 찔린 달걀 중 7개(5%)가 명백한 태생 발생 징후를 나타내었다.

3. 태생 발생을 나타내는 7개의 달걀 중 5개가 부화하여 정상적으로 건강한 병아리를 생산하였다.

4. 반증용 대조군은 태생 발생 징후가 나타나지 않았다.

본원 전체에 걸쳐 다양한 공개공보를 참고로 하였다. 본 발명이 속한 기술분야를 좀더 완전히 기술하기 위하여, 이들 공개공보의 개시 및 본원에 언급한 참조문헌을 본원에 전체적으로 참고로 인용하였다.

당해 기술분야의 숙련자들에게는 본 발명의 범주 또는 요지에서 벗어나지 않으면서 본 발명에 다양한 개질 및 변화가 만들어질 수 있음이 명백할 것이다. 본 발명의 기타 양태는, 명세서를 숙지하고 본원에 개시된 발명을 실행함으로써 당해기술분야의 숙련자에게 명백해질 것이다. 본 명세서 및 실시예는 하기 청구의 범위에 의해 나타낸 본 발명의 정확한 범주 및 요지내에 있는 예로서 여겨져야 한다.

Claims

난황막에 둘러싸인 난황 및 난자를 포함하는 비수정된 조류 알에서 난자를 활성화시키고 부화될 때까지 조류 알을 항온처리함을 포함하는, 비수정되어 산란된 난각내 조류 알로부터 살아있는 새끼새를 부화시키는 방법.
제 1 항에 있어서,

조류 알로서 달걀을 사용하는 방법.
제 1 항에 있어서,

조류 알로서 칠면조 알을 사용하는 방법.
제 1 항에 있어서,

다수의 알들을 실질적으로 동시에 활성화시키는 방법.
제 4 항에 있어서,

20개 이상의 알들을 활성화시키는 방법.
제 1 항에 있어서,

조류 알에서 단성생식을 유도하여 활성화시키는 방법.
제 6 항에 있어서,

난황막을 관통시킴으로써 단성생식을 유도하는 방법.
제 7 항에 있어서,

바늘을 사용하여 관통시키는 방법.
제 1 항에 있어서,

생리학적으로 허용가능한 담체중의 조류 정자를 포함하는 정자 시료를 조류 알에 전달시킴으로써 활성화시키는 방법.
제 9 항에 있어서,

동일 종의 일원으로부터 유래한 알 및 정자를 사용하는 방법.
제 9 항에 있어서,

담체로서 정액을 사용하는 방법.
제 9 항에 있어서,

담체로서 희석된 정액을 사용하는 방법.
제 12 항에 있어서,

희석된 정액이 아비딜루언트를 포함하는 방법.
제 10 항에 있어서,

정자 시료를 난황을 둘러싼 난황막에 인접하게 전달시키는 방법.
제 14 항에 있어서,

정자 시료를 배아판(germinal disc)에 인접한 난황막 영역에 인접하게 전달시키는 방법.
제 10 항에 있어서,

정자 시료를 난황막 안쪽으로 전달시키는 방법.
제 10 항에 있어서,

정자가 알을 수정시킬 수 있도록 난황막을 처리하는 방법.
제 10 항에 있어서,

조류 종이 닭, 메추라기, 오리, 칠면조, 꿩, 타조, 거위 및 레아로 구성된 군에서 선택되는 방법.
제 18 항에 있어서,

조류 종이 닭인 방법.
제 10 항에 있어서,

정자 시료가 하나 이상의 새로부터 수득된 정자의 혼합물을 포함하는 방법.
제 10 항에 있어서,

난각을 관통시켜 난각중에 기공을 형성하고, 정자 시료를 조류 알에 도입시킴으로써 정자 시료를 전달시키는 방법.
제 21 항에 있어서,

바늘을 사용하여 관통시키고 도입시키는 방법.
제 21 항에 있어서,

개구부를 밀봉하는 방법.
제 23 항에 있어서,

개구부를 접착제로 밀봉하는 방법.
제 10 항에 있어서,

다수의 알들을 실질적으로 동시에 수정시키는 방법.
제 25 항에 있어서,

20개 이상의 알들을 수정시키는 방법.
제 25 항에 있어서,

50개 이상의 알들을 수정시키는 방법.
제 10 항에 있어서,

조류 알로서 달걀을 사용하고, 21 내지 23일간 항온처리하는 방법.
제 10 항에 있어서,

1일째부터 약 18일째까지 약 99.5℉의 온도에서 항온처리하고, 약 19일째부터 부화할 때까지 약 98.5℉의 온도에서 항온처리하는 방법.
제 10 항에 있어서,

1일째부터 부화할 때까지 80% 습도에서 항온처리하는 방법.
제 10 항에 있어서,

항온처리 기간 동안 배아에게 백신접종을 실시함을 추가로 포함하는 방법.
(a) 생리학적으로 허용가능한 담체중의 조류 정자를 포함하는 정자 시료를 수득하는 단계; 및

(b) 난황막에 둘러싸인 난황을 포함하는 조류 알에 상기 정자 시료를 전달시켜 알을 수정시키는 단계

를 포함하는, 산란된 난각내 조류 알을 수정시키는 방법.
제 32 항에 있어서,

동일 종의 일원으로부터 유래한 알 및 정자를 사용하는 방법.
제 32 항에 있어서,

담체로서 정액을 사용하는 방법.
제 32 항에 있어서,

담체로서 희석된 정액을 사용하는 방법.
제 35 항에 있어서,

희석된 정액이 아비딜루언트를 포함하는 방법.
제 32 항에 있어서,

정자 시료를 난황을 둘러싼 난황막에 인접하게 전달시키는 방법.
제 37 항에 있어서,

정자 시료를 배아판에 인접한 난황막 영역에 인접하게 전달시키는 방법.
제 32 항에 있어서,

정자 시료를 난황막 안쪽으로 전달시키는 방법.
제 32 항에 있어서,

수정이 촉진되도록 난황막을 처리하는 방법.
제 33 항에 있어서,

조류 종이 닭, 메추라기, 오리, 칠면조, 꿩, 타조, 거위 및 레아로 구성된 군에서 선택되는 방법.
제 41 항에 있어서,

조류 종이 닭인 방법.
제 32 항에 있어서,

정자 시료가 하나 이상의 새로부터 수득된 정자의 혼합물을 포함하는 방법.
제 32 항에 있어서,

난각을 관통시켜 난각중에 기공을 형성하고, 정자 시료를 조류 알에 도입시킴으로써 정자 시료를 전달시키는 방법.
제 44 항에 있어서,

바늘을 사용하여 관통시키고 도입시키는 방법.
제 44 항에 있어서,

개구부를 밀봉하는 방법.
제 46 항에 있어서,

개구부를 접착제로 밀봉하는 방법.
제 32 항에 있어서,

다수의 알들을 실질적으로 동시에 수정시키는 방법.
제 48 항에 있어서,

20개 이상의 알들을 수정시키는 방법.
제 48 항에 있어서,

50개 이상의 알들을 수정시키는 방법.
(a) 생리학적으로 허용가능한 담체중의 닭의 정자 시료를 수득하는 단계; 및

(b) 난황막에 둘러싸인 난황을 포함하는 달걀에 상기 정자 시료를 전달시켜 달걀을 수정시키는 단계

를 포함하는, 난각내 달걀을 수정시키는 방법.
(a) 희석된 닭의 정자를 수득하는 단계; 및

(b) 난황막에 둘러싸인 난황을 포함하는 달걀에 상기 희석된 정자를 전달시켜 달걀을 수정시키는 단계

를 포함하는, 난각내 달걀을 수정시키는 방법.
(a) 희석된 닭의 정자를 수득하는 단계; 및

(b) 난각을 관통시켜 난황막에 둘러싸인 난황을 포함하는 달걀에 상기 희석된 정자를 도입시킴으로써 달걀에 상기 희석된 정자를 전달시키는 단계

를 포함하는, 난각내 달걀을 수정시키는 방법.
(a) 희석된 닭의 정자를 수득하는 단계; 및

(b) 난각을 관통시켜 난황막에 둘러싸인 난황을 포함하는 달걀에 상기 희석된 정자를 도입시킴으로써 배아판에 인접한 난황막 영역에 인접하게 상기 희석된 정자를 달걀에 전달시키는 단계

를 포함하는, 난각내 달걀을 수정시키는 방법.
생리학적으로 허용가능한 담체중의 닭의 정자 시료를 난황막에 둘러싸인 난황을 포함하는 달걀에 전달시켜 달걀을 수정시키고, 이 달걀을 부화될 때까지 항온처리함을 포함하는, 산란된 난각내 달걀을 수정시켜 살아있는 병아리를 부화시키는 방법.
희석된 닭의 정자를 난황막에 둘러싸인 난황을 포함하는 달걀에 전달시켜 달걀을 수정시키고, 이 달걀을 부화될 때까지 항온처리함을 포함하는, 산란된 난각내 달걀을 수정시켜 살아있는 병아리를 부화시키는 방법.
난각을 관통시켜 난황막에 둘러싸인 난황을 포함하는 달걀에 희석된 닭의 정자를 도입시킴으로써 희석된 닭의 정자를 달걀에 전달시켜 달걀을 수정시키고, 이 달걀을 부화될 때까지 항온처리함을 포함하는, 산란된 난각내 달걀을 수정시켜 살아있는 병아리를 부화시키는 방법.
난각을 관통시켜 난황막에 둘러싸인 난황을 포함하는 달걀에 희석된 닭의 정자를 도입시킴으로써 배아판에 인접한 난황막 영역에 인접하게 희석된 정자를 달걀에 전달시켜 달걀을 수정시키고, 이 달걀을 부화될 때까지 항온처리함을 포함하는, 산란된 난각내 달걀을 수정시켜 살아있는 병아리를 부화시키는 방법.
30,000개보다 적은 수의 세포를 갖고 살아있는 새끼새로 발생할 수 있는 자생 배아를 포함하는 산란된 조류 알.
제 59 항에 있어서,

배아가 20,000개보다 적은 수의 세포를 갖는 알.
제 59 항에 있어서,

배아가 10,000개보다 적은 수의 세포를 갖는 알.
제 59 항에 있어서,

배아가 접합체인 알.
제 59 항에 있어서,

달걀인 알.
30,000개보다 적은 수의 세포를 갖고 살아있는 병아리로 발생할 수 있는 배아를 포함하는 산란된 달걀.
자생 접합체를 포함하는 산란된 달걀.
30,000개보다 적은 수의 세포를 갖고 살아있는 새끼새로 발생할 수 있는 자생 배아를 포함하며, 난각에 4cm 미만의 개구부를 갖는 산란된 조류 알.
제 66 항에 있어서,

배아가 20,000개보다 적은 수의 세포를 갖는 알.
제 66 항에 있어서,

배아가 10,000개보다 적은 수의 세포를 갖는 알.
제 66 항에 있어서,

배아가 접합체인 알.
제 67 항에 있어서,

밀봉된 개구부를 갖는 알.
제 67 항에 있어서,

1cm 미만의 개구부를 갖는 알.
제 67 항에 있어서,

5mm 미만의 개구부를 갖는 알.
30,000개보다 적은 수의 세포를 갖고 살아있는 병아리로 발생할 수 있는 배아를 포함하며, 난각에 4cm 미만의 개구부를 갖는 산란된 달걀.
20,000개보다 적은 수의 세포를 갖고 살아있는 병아리로 발생할 수 있는 배아를 포함하며, 난각에 1cm 미만의 개구부를 갖는 산란된 달걀.
살아있는 병아리로 발생할 수 있는 접합체를 포함하며, 난각에 4cm 미만의 개구부를 갖는 산란된 달걀.
살아있는 병아리로 발생할 수 있는 접합체를 포함하며, 난각에 1cm 미만의 개구부를 갖는 산란된 달걀.
접합체를 포함하는, 제 9 항의 방법에 의해 생산된 알.
자생 난황, 및 30,000개보다 적은 수의 세포를 갖고 살아있는 병아리로 발생할 수 있는 배아를 포함하는 산란된 달걀.
자생 난황, 및 20,000개보다 적은 수의 세포를 갖고 살아있는 병아리로 발생할 수 있는 배아를 포함하는 산란된 달걀.
자생 난황, 및 10,000개보다 적은 수의 세포를 갖고 살아있는 병아리로 발생할 수 있는 배아를 포함하는 산란된 달걀.
제 1 항의 방법에 의해 생산된 조류 알에 이종 핵산을 도입시킴을 포함하는, 이종 핵산을 함유하는 조류 배아의 생산 방법.
제 9 항의 방법에 의해 생산된 조류 알에 이종 핵산을 도입시킴을 포함하는, 이종 핵산을 함유하는 조류 배아의 생산 방법.
제 81 항에 있어서,

약제 단백질, 항원, 호르몬 또는 항체를 암호화하는 이종 핵산을 도입시키는 방법.
제 82 항에 있어서,

약제 단백질, 항원, 호르몬 또는 항체를 암호화하는 이종 핵산을 도입시키는 방법.
제 81 항에 있어서,

이종 핵산이 조류 백혈병 바이러스-유래 형질도입성 입자를 포함하는 방법.
제 81 항에 있어서,

단백질을 암호화하는 이종 핵산을 도입시키는 방법.
제 81 항에 있어서,

이종 핵산이 조류 게놈에 안정하게 삽입되는 방법.