JP6038905B2 - オキシントモジュリンと免疫グロブリン断片とを含む結合体及びその用途 - Google Patents

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Description

本発明は、オキシントモジュリンと免疫グロブリン断片とを含む結合体及びその用途に関する。より具体的に、本発明はオキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃ領域とが非ペプチド性重合体により共有結合で連結された結合体、並びに前記結合体を含む肥満予防又は治療用薬学的組成物に関する。
近年、経済成長やライフスタイルの変化により食習慣にも様々な変化が生じている。特に、多忙な現代人には、ファーストフードなどの高カロリー食品や運動不足による過体重及び肥満が増加している。世界保健機関（WHO）によれば、全世界的に１０億人以上の成人が過体重であり、そのうち少なくとも３００万人が臨床的に肥満であり、特にヨーロッパで毎年２５０，０００人、全世界で２５０万人以上が過体重に関連して死亡しているという（非特許文献１）。
過体重及び肥満は、血圧とコレステロール値を増加させて心臓疾患、糖尿、関節炎などの各種疾患の発病又は悪化の原因となっている。また、過体重及び肥満は、成人だけでなく、子供や青少年においても、動脈硬化、高血圧、脂質異常症、心臓疾患などの発病率を増加させる主要因となっている。
このように、肥満は全世界的な疾病であり、各種疾患の原因となり得る深刻な疾病であるが、個人の自主的な努力により克服できると信じられており、肥満患者は患者自身の自制力が弱いことによるものと評価されている。しかし、肥満は意外に治療が容易でなく、その理由は、肥満は食欲調節及びエネルギー代謝の官能メカニズムが関連する複雑な疾患であるからである。よって、肥満を治療するためには、患者自身の努力だけでなく、食欲調節及びエネルギー代謝に関する異常な官能メカニズムを治療する方法が同時に行われなければならないので、前記異常な官能メカニズムを治療する医薬を開発する努力が続けられている。そのような努力の結果として、Ｒｉｍｏｎａｂａｎｔ（Sanofi-Aventis）、Ｓｉｂｕｔｒａｍｉｎ（Abbott）、Ｃｏｎｔｒａｖｅ（Takeda）、Ｏｒｌｉｓｔａｔ（Roche）などの医薬が開発されているが、これらは致命的な副作用があったり、肥満治療効果が不十分であるという欠点がある。例えば、Ｒｉｍｏｎａｂａｎｔ（Sanofi-Aventis）は中枢神経障害の副作用があり、Ｓｉｂｕｔｒａｍｉｎ（Abbott）とＣｏｎｔｒａｖｅ（Takeda）は心血管副作用があり、Ｏｒｌｉｓｔａｔ（Roche）は服用１年で約４ｋｇの体重減少効果を示すにすぎないことが報告されている。よって、肥満患者に安全に処方できる肥満治療剤はほとんど存在しないのが現状である。
このように、従来の肥満治療剤の問題を解消し得る肥満治療剤を開発する研究が盛んに行われており、最近はグルカゴン誘導体に関心が集まっている。グルカゴンは、薬物治療、疾病、ホルモンや酵素の欠乏などの原因で血糖値が下がり始めると膵臓で産生される。グルカゴンは、肝臓にグリコーゲンを分解してグルコースを放出するように働きかけ、血糖レベルを正常レベルまで引き上げる役割を果たす。それだけでなく、グルカゴンは、血糖上昇効果以外に、食欲を抑制し、脂肪細胞のホルモン感受性リパーゼ（hormone sensitive lipase）を活性化して脂肪分解を促進することにより、抗肥満効果を示すことが報告されている。このようなグルカゴンの誘導体の１つであるグルカゴン様ペプチド−１（glucagon-like peptide-1, ＧＬＰ−１）は、糖尿患者の高血糖症を減少させる治療剤として開発中の物質であり、インスリンの合成と分泌を促進し、グルカゴンの分泌を阻害し、空腹を抑制し、グルコースの使用を増進すると共に、食物摂取を阻害する機能を有する。ＧＬＰ−１と約５０％のアミノ酸相同性を有するトカゲ毒（lizard venom）から作られるエキセンディン−４（exendin-4）も、ＧＬＰ−１受容体を活性化して糖尿患者の高血糖症を減少させることが知られている。しかし、前ＧＬＰ−１を含む肥満治療用医薬は、嘔吐と吐気の副作用を伴うという問題のあることが報告されている。
よって、前記ＧＬＰ−１の代案として、ＧＬＰ−１とグルカゴンの両ペプチドの受容体に結合するオキシントモジュリン（oxyntomodulin）が脚光を浴びている。前記オキシントモジュリンは、グルカゴンの前駆体であるプレグルカゴン（pre-glucagon）から作られるペプチドであり、ＧＬＰ−１の食物摂取阻害、満腹感増進の効能と、グルカゴンの脂肪分解機能を有することから、抗肥満治療剤としての可能性を高めている。
このようなオキシントモジュリンペプチドの二重機能（dual function）に基づき、肥満治療を目的とする薬剤を開発する研究が盛んに行われている。例えば、特許文献１には、オキシントモジュリンを有効成分として含む、ヒトの過体重を治療するための経口、非経口、粘膜（mucosal）、直腸、皮下又は経皮投与用薬学的組成物が開示されている。しかし、オキシントモジュリンを含む肥満治療剤は、生体内での半減期が短く、１日３回高用量を投与しても肥満治療効果は低レベルであることが報告されている。よって、オキシントモジュリンを修飾することにより、生体内での半減期を延長するか、又は肥満治療効果を高める努力が続けられている。
例えば、デュアルアゴニストオキシントモジュリン（Merck社）は、オキシントモジュリンの２番目のアミノ酸Ｌ−セリンをＤ−セリンに置換してジペプチジルペプチダーゼＩＶ（DPP-IV）に対する抵抗性を高めると共に、Ｃ末端にコレステロール部分を付着して血中半減期を延長させたものである。ＺＰ２９２９（Zealand）は、オキシントモジュリンの２番目のアミノ酸Ｌ−セリンをＤ−セリンに置換してＤＰＰ−ＩＶ抵抗性を高め、１７番目のアミノ酸であるアルギニンをアラニンに置換してプロテアーゼに対する抵抗性を高め、２７番目のアミノ酸であるメチオニンをリシンに置換して酸化的安定性を高め、２０番目と２４番目のアミノ酸であるグルタミンと２８番目のアミノ酸であるアスパラギンをそれぞれアスパラギン酸、アラニン及びセリンに置換して脱アミド化に対する安定性（deamidation stability）を高めたものである。しかし、半減期を延長させたデュアルアゴニストオキシントモジュリン（Merck社）の場合も、天然型オキシントモジュリンの半減期である８〜１２分より長くなったが、依然として１．７時間と生体内での半減期が非常に短く、薬物の投与用量も数ｍｇ／ｋｇと非常に高いレベルである。よって、オキシントモジュリン又はその誘導体は、依然として短い半減期と低い薬効により毎日投与しなければならず、過剰量の薬物を投与しなければならないという２つの大きな欠点がある。
韓国登録特許第９２５０１７号公報 国際公開第９７／３４６３１号 国際公開第９６／３２４７８号
World Health Organisation, Global Strategy on Diet, Physical Activity and Health, 2004 H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979
よって、本発明者らは、生体内でのオキシントモジュリンの活性を維持しつつ、その血中半減期を延長させる方法を開発すべく鋭意研究努力を重ねた結果、非ペプチド性重合体を用い、前記オキシントモジュリンにキャリアを結合させて製造した結合体が生体内での活性を維持しつつ、その血中半減期を増加させ、より優れた抗肥満効果を示すことを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明は、オキシントモジュリン、免疫グロブリンＦｃ領域及び非ペプチド性重合体を含む結合体であり、オキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃ領域とが非ペプチド性重合体により共有結合で連結された結合体を提供することを目的とする
また、本発明は、前記結合体を含む肥満予防又は治療用薬学的組成物を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記結合体又は組成物を個体に投与するステップを含む、肥満を予防又は治療する方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、肥満の予防又は治療用医薬の製造における前記結合体又は組成物の使用を提供することを目的とする。
本発明のオキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃとを含む結合体は天然型オキシントモジュリンとは異なり、副作用を示すことなく、食物摂取量の減少、胃排出抑制及び脂肪分解促進効果を示し、オキシントモジュリンに比べて優れた受容体活性化効果と長期持続力を示すので、安全かつ効果的な肥満治療に広く活用することができる。天然型オキシントモジュリンとは異なり、本発明の新規なペプチドは副作用がなく食物摂取量の減少、胃排出抑制及び脂肪分解促進効果を示し、また優れた受容体活性化効果を有するので安全面においても効果的な肥満治療剤に広く活用されるであろう。
オキシントモジュリン又はオキシントモジュリン誘導体の投与量による飼料摂取量の変化を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ Ｓ精製カラムによりモノペグ化オキシントモジュリンを精製した結果を示すグラフである。 精製したモノペグ化オキシントモジュリンのペプチドマッピングの結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラムによりオキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ Ｓ精製カラムによりモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２９）を精製した結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２９）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ Ｓ精製カラムによりモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号３０）を精製した結果を示すグラフである。 精製したモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号３０）のペプチドマッピングの結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号３０）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ Ｓ精製カラムによりモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号３１）を精製した結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号３１）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ Ｓ精製カラムによりモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２）を精製した結果を示すグラフである。 精製したモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２）のペプチドマッピングの結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ Ｓ精製カラムによりモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号３）を精製した結果を示すグラフである。 精製したモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号３）のペプチドマッピングの結果を示すグラフである。 Ｂｕｔｙｌ ＦＦ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号３）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号３）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ Ｓ精製カラムによりモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２３）を精製した結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２３）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２３）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ Ｓ精製カラムによりモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２４）を精製した結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２４）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２４）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ Ｓ精製カラムによりモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）を精製した結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ Ｓ精製カラムによりモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２８）を精製した結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２８）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。 ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２８）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。 オキシントモジュリン誘導体−免疫グロブリンＦｃ結合体の種類及び投与量によるマウスの体重の変化を経時的に示すグラフである。 オキシントモジュリン誘導体−免疫グロブリンＦｃ結合体の種類及び投与量に応じたマウスの体重の変化を経時的に示すグラフである。
本発明は上記目的を達成するためになされたものであり、本発明の一実施態様によれば、オキシントモジュリン、免疫グロブリンＦｃ領域及び非ペプチド性重合体を含む結合体であり、オキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃ領域とが非ペプチド性重合体により共有結合で連結された結合体を提供する。
本発明のおける用語、「結合体」とは、オキシントモジュリン及びオキシントモジュリンとは異なる要素を含む結合体を意味する。前記異なる要素は血中半減期を延長させたり腎排出を減らすなどの何らかの有利な機能を有する任意の物質であってもよい。本発明における前記要素とは、免疫グロブリンＦｃ領域であってもよい。前記結合体はオキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃ領域とが非ペプチド性重合体によって連結された形態であることが好ましい。非ペプチド性重合体はそれぞれオキシントモジュリン及び免疫グロブリンＦｃ領域に共有結合して両者を連結させることができる。非ペプチド性重合体の両末端はそれぞれ免疫グローブリンＦｃ領域及びオキシントモジュリン誘導体のアミン基又はチオール基に結合するのが好ましい。
本発明における結合体は 天然型オキシントモジュリンに比べ生体内効力持続性が向上したものであることを意味し、前記持続型結合体は天然型オキシントモジュリンのアミノ酸が修飾、置換、付加又は除去された形態、ポリエチレングリコール(PEG)のよな生分解性重合体がオキシントモジュリンに結合された結合体、アルブミンや免疫グロブリンのような持続性の優れたタンパク質がオキシントモジュリンに結合された結合体、生体内のアルブミンとの結合力を有する脂肪酸がオキシントモジュリンに結合した結合体又は生分解性ナノ粒子に封入された形態のオキシントモジュリンを含んでもよく、持続型結合体の種類は本発明において制限されるものではない。
本発明における用語「オキシントモジュリン」とは、グルカゴンの前駆体であるプレグルカゴン（pre-glucagon）から作られるペプチドを意味し、天然型オキシントモジュリン、前駆物質(precursor)、誘導体、断片(fragments)及び変異体(variants)などを含む。配列番号１（ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡ）のアミノ酸配列を有することが好ましい。
本発明における用語「オキシントモジュリン変異体」とは、オキシントモジュリンとアミノ酸配列が少なくとも一つ異なるペプチドであって、ＧＬＰ−１とグルカゴン受容体活性化機能を有するペプチドを意味し、天然型オキシントモジュリンにおいて一部アミノ酸が置換、付加、欠失及び修飾のうちいずれかの方法又はそれらの方法の組合せにより製造できる。
本発明における用語「オキシントモジュリン誘導体」とは、前記オキシントモジュリンの一部のアミノ酸を付加、欠失又は置換して修飾することにより、ＧＬＰ−１受容体とグルカゴン受容体の両方を活性化させることができ、本来のオキシントモジュリンに比べて前記各受容体を高いレベルで活性化し得るペプチド、ペプチド誘導体又はペプチド模倣体などを含む。
本発明における用語「オキシントモジュリン断片」とは、オキシントモジュリンのアミノ酸末端又はＣ末端に少なくとも一つ、又はそれ以上のアミノ酸が付加又は欠失した形態を意味し、付加されたアミノ酸は自然界に存在しないアミノ酸（例えば、Ｄ型アミノ酸）であってもよい。このようなオキシントモジュリン断片は体内において血糖調節機能を有する。
オキシントモジュリン変異体及び誘導体及び断片においてそれぞれ用いられた製造方法は独立して又は組合せて用いられてもよい。例えば、アミノ酸配列が少なくとも一つ異なり、Ｎ末端アミノ酸残基に脱アミノ化(deamination)されたＧＬＰ−１受容体とグルカゴン受容体の両方に対して活性化機能を有するペプチドも含まれる。
本明細書におけるアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ命名法に従って次のように略語で記載した。
アラニン Ａ アルギニン Ｒ
アスパラギン Ｎ アスパラギン酸 Ｄ
システイン Ｃ グルタミン酸 Ｅ
グルタミン Ｑ グリシン Ｇ
ヒスチジン Ｈ イソロイシン Ｉ
ロイシン Ｌ リシン Ｋ
メチオニン Ｍ フェニルアラニン Ｆ
プロリン Ｐ セリン Ｓ
トレオニン Ｔ トリプトファン Ｗ
チロシン Ｙ バリン Ｖ
本明細書における前記オキシントモジュリン誘導体は、オキシントモジュリンアミノ酸配列(HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA、配列番号１)の置換、付加、欠失又は翻訳後修飾（例えば、メチル化、アシル化、ユビキチン化、分子内の共有結合）され、グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体を同時に活性化し得る任意のペプチドを含む。前記アミノ酸の置換又は付加の際に、ヒトタンパク質において通常観察される２０種のアミノ酸だけでなく、異常又は非天然型アミノ酸を用いることができる。異常アミノ酸の商業的出所には、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣｈｅｍＰｅｐ、Ｇｅｎｚｙｍｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが含まれる。これらのアミノ酸が含まれるペプチドと異常ペプチド配列は、民間のペプチド合成会社、例えば米国のＡｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐａｎｙやＢａｃｈｅｍ、又は韓国のＡｎｙｇｅｎにおいて合成及び購入することができる。
具体的な一実施態様において、本発明のオキシントモジュリン誘導体は下記式１のアミノ酸を含む新規なペプチドである。
前記式において、
Ｒ１はヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジル（desamino-histidyl）、ジメチル−ヒスチジル（N-dimethyl-histidyl）、β−ヒドロキシイミダゾプロピオニル（beta-hydroxy imidazopropionyl）、４−イミダゾアセチル（4-imidazoacetyl）、β−カルボキシイミダゾプロピオニル（beta-carboxy imidazopropionyl）又はチロシンであり、
Ｘ１はＡｉｂ（アミノイソブチル酸、aminoisobutyric acid）、ｄ−アラニン、グリシン、Ｓａｒ（Ｎ−メチルグリシン、N-methylglycine）、セリン又はｄ−セリンであり、
Ｘ２はグルタミン酸又はグルタミンであり、
Ｘ３はロイシン又はチロシンであり、
Ｘ４はセリン又はアラニンであり、
Ｘ５はリシン又はアルギニンであり、
Ｘ６はグルタミン又はチロシンであり、
Ｘ７はロイシン又はメチオニンであり、
Ｘ８はアスパラギン酸又はグルタミン酸であり、
Ｘ９はグルタミン酸、セリン、α−メチルグルタミン酸又は欠失した配列であり、
Ｘ１０はグルタミン、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン又は欠失した配列であり、
Ｘ１１はアラニン、アルギニン、バリン又は欠失した配列であり、
Ｘ１２はアラニン、アルギニン、セリン、バリン又は欠失した配列であり、
Ｘ１３はリシン、グルタミン、アルギニン、α−メチルグルタミン酸又は欠失した配列であり、
Ｘ１４はアスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン又は欠失した配列であり、
Ｘ１５はフェニルアラニン又は欠失した配列であり、
Ｘ１６はイソロイシン、バリン又は欠失した配列であり、
Ｘ１７はアラニン、システイン、グルタミン酸、リシン、グルタミン、α−メチルグルタミン酸又は欠失した配列であり、
Ｘ１８はトリプトファン又は欠失した配列であり、
Ｘ１９はアラニン、イソロイシン、ロイシン、セリン、バリン又は欠失した配列であり、
Ｘ２０はアラニン、リシン、メチオニン、グルタミン、アルギニン又は欠失した配列であり、
Ｘ２１はアスパラギン又は欠失した配列であり、
Ｘ２２はアラニン、グリシン、トレオニン又は欠失した配列であり、
Ｘ２３はシステイン、リシン又は欠失した配列であり、
Ｘ２４はアラニン、グリシン及びセリンの組み合わせで構成された２〜１０個のアミノ酸を有するペプチド又は欠失した配列であり、
Ｒ２はＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号３５）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３６）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号３７）、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（配列番号３８）、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＤＫ（配列番号３９）、ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＫ（配列番号４０）又は欠失した配列である（ただし、式１のアミノ酸配列が配列番号１と同じ場合は除く）。
本発明のオキシントモジュリン誘導体は、野生型オキシントモジュリンのグルカゴン受容体及びＧＬＰ−１受容体に対する活性を向上させるために、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１番目のアミノ酸であるヒスチジンのα炭素を欠失させた４−イミダゾアセチル、Ｎ末端アミノ基を欠失させたデスアミノ−ヒスチジル（desamino-histidyl）、Ｎ末端アミノ基を２つのメチル基で修飾したジメチル−ヒスチジル、Ｎ末端アミノ基をヒドロキシ基に置換したβ−ヒドロキシイミダゾプロピオニル、又はＮ末端アミノ基をカルボキシ基に置換したβ−カルボキシイミダゾプロピオニルに置換することができる。また、ＧＬＰ−１受容体と結合する部位を、疎水性結合とイオン結合を強化するアミノ酸に置換するか、又はそれらを組み合わせることができる。また、オキシントモジュリン配列の一部の配列をＧＬＰ−１のアミノ酸配列又はＥｘｅｎｄｉｎ−４のアミノ酸配列に置換してＧＬＰ−１受容体の活性を向上させることができる。
また、オキシントモジュリン配列の一部の配列を、αへリックスを強化する配列に置換することができる。式１のアミノ酸配列の１０、１４、１６、２０、２４及び２８番目のアミノ酸を、αへリックスをサポートすることが知られているＴｙｒ（４−Ｍｅ）、Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（４−Ｍｅ）、Ｐｈｅ（４−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４−ＣＮ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ２）、Ｐｈｅ（４−ＮＨ２）、Ｐｈｇ、Ｐａｌ、Ｎａｌ、Ａｌａ（２−チエニル）又はＡｌａ（ベンゾチエニル）で構成されるアミノ酸又はアミノ酸誘導体に置換することができ、挿入されるαへリックスをサポートするアミノ酸又はアミノ酸誘導体の種類及び数は限定されないことが好ましい。また、１０番目と１４番目、１２番目と１６番目、１６番目と２０番目、２０番目と２４番目、及び２４番目と２８番目を、それぞれ環を形成し得るグルタミン酸又はリシンに置換して環を形成することができ、挿入される環の数も限定されないことが好ましく、式１〜６から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが最も好ましい。
具体的な一実施態様において、本発明のオキシントモジュリン誘導体は、オキシントモジュリンのアミノ酸配列に、エキセンディン又はＧＬＰ−１の配列に置換した式２のアミノ酸を含む新規なペプチドである。
本発明の他の実施態様において、本発明のオキシントモジュリン誘導体は、オキシントモジュリンのアミノ酸配列の一部とエキセンディン又はＧＬＰ−１の配列の一部を好ましいアミノ酸リンカーで連結した式３のアミノ酸を含む新規なペプチドである。
本発明のさらに他の実施態様において、本発明のオキシントモジュリン誘導体は、オキシントモジュリンのアミノ酸配列の一部を、ＧＬＰ−１受容体との結合力を向上させるアミノ酸に置換した、例えば２６番目のＬｅｕを、ＧＬＰ−１受容体との疎水性結合により疎水性を増加させるアミノ酸であるＩｌｅ又はＶａｌに置換した式４を含む新規なペプチドである。
本発明のさらに他の態様において、本発明のオキシントモジュリン誘導体は、固有のオキシントモジュリンＧＬＰ−１受容体及びグルカゴン受容体の活性を向上させるために、アミノ酸配列の一部を欠失させたり、アミノ酸の一部を挿入したり、アミノ酸の一部を他のアミノ酸に置換した下記式５を含む新規なペプチドである。
式２〜５において、Ｒ１は式１における構成と同一であり、 Ａは、ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号４１）、
ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＭＮＴ（配列番号４２）、
ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＱＤＦＶＡＷＬＫＮＴ（配列番号４３）、
ＧＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧ（配列番号４４）、
ＧＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧ（配列番号４５）、
ＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＡＡ（配列番号４６）及び
ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＭＮＧ（配列番号４７）からなる群から選択され、
Ｂは、ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号４１）、
ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＭＮＴ（配列番号４２）、
ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＱＤＦＶＡＷＬＫＮＴ（配列番号４３）、
ＧＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧ（配列番号４４）、
ＧＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧ（配列番号４５）、
ＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＡＡ（配列番号４６）、
ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＭＮＧ（配列番号４７）、
ＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷ（配列番号４８）及びＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＤ（配列番号４９）からなる群から選択され、
Ｃはアラニン、グリシン及びセリンの組み合わせで構成された２〜１０個のアミノ酸を有するペプチドであり、
Ｄ１はセリン、グルタミン酸又はアルギニンであり、
Ｄ２はアルギニン、グルタミン酸又はセリンであり、
Ｄ３はアルギニン、アラニン又はバリンであり、
Ｄ４はアルギニン、バリン又はセリンであり、
Ｄ５はグルタミン、アルギニン又はリシンであり、
Ｄ６はイソロイシン、バリン又はセリンであり、
Ｄ７はメチオニン、アルギニン又はグルタミンであり、
Ｄ８はトレオニン、グリシン又はアラニンであり、
Ｅ１はセリン、Ａｉｂ、Ｓａｒ、ｄ−アラニン又はｄ−セリンであり、Ｅ２はセリン又はグルタミン酸であり、
Ｅ３はアルギニン又はリシンであり、
Ｅ４はグルタミン又はリシンであり、
Ｅ５はアスパラギン酸又はグルタミン酸であり、
Ｅ６はグルタミン、システイン又はリシンであり、
Ｅ７はシステイン、リシン又は欠失した配列であり、
Ｒ３はＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号３５）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３６）又はＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号３７）であり、
Ｒ４はＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（配列番号３８）、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＤＫ（配列番号３９）又はＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＫ（配列番号４０）であり、
Ｒ５はＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号３５）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３６）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号３７）又は欠失した配列である（ただし、式２〜５のアミノ酸配列が配列番号１と同じ場合は除く）。
本発明のオキシントモジュリン誘導体は式６の新規なペプチドであることが好ましい。
式６において、Ｒ１はヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジル（desamino-histidyl）、４−イミダゾアセチル（4-imidazoacetyl）又はチロシンであり、
Ｘ１はＡｉｂ 、グリシン又はセリンであり、
Ｘ２はグルタミン酸又はグルタミンであり、
Ｘ３はロイシン又はチロシンであり、
Ｘ４はセリン又はアラニンであり、
Ｘ５はリシン又はアルギニンであり、
Ｘ６はグルタミン又はチロシンであり、
Ｘ７はロイシン又はメチオニンであり、
Ｘ８はアスパラギン酸又はグルタミン酸であり、
Ｘ９はグルタミン酸、α−メチルグルタミン酸又は欠失した配列であり、
Ｘ１０はグルタミン、グルタミン酸、リシン、アルギニン又は欠失した配列であり、
Ｘ１１はアラニン、アルギニン又は欠失した配列であり、
Ｘ１２はアラニン、バリン又は欠失した配列であり、
Ｘ１３はリシン、グルタミン、アルギニン、α−メチルグルタミン酸又は欠失した配列であり、
Ｘ１４はアスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン又は欠失した配列であり、
Ｘ１５はフェニルアラニン又は欠失した配列であり、
Ｘ１６はイソロイシン、バリン又は欠失した配列であり、
Ｘ１７はアラニン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、α−メチルグルタミン酸又は欠失した配列であり、
Ｘ１８はトリプトファン又は欠失した配列であり、
Ｘ１９はアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン又は欠失した配列であり、
Ｘ２０はアラニン、リシン、メチオニン、アルギニン又は欠失した配列であり、
Ｘ２１はアスパラギン又は欠失した配列であり、
Ｘ２２はトレオニン又は欠失した配列であり、
Ｘ２３はシステイン、リシン又は欠失した配列であり、
Ｘ２４はグリシンで構成された２〜１０個のアミノ酸を有するペプチド又は欠失した配列であり、
Ｒ２はＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号３５）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３６）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号３７）、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（配列番号３８）、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＤＫ（配列番号３９）、ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＫ（配列番号４０）又は欠失した配列である（ただし、式１のアミノ酸配列が配列番号１と同じ場合は除く）。
本発明のオキシントモジュリン誘導体は、配列番号２〜３４のペプチドからなる群から選択されるものであることが好ましい。実施例２−１の表１に示すオキシントモジュリン誘導体であることがさらに好ましい。
オキシントモジュリンは、ＧＬＰ−１とグルカゴンの二つのペプチド活性を有しており、ＧＬＰ−１がインスリン分泌による血糖降下効果があるのに対しグルカゴンは血糖上昇効果があり、また、ＧＬＰ−１は食物摂取の抑制と胃排出遅延効果があり、グルカゴンは脂肪分解及びエネルギー代謝量増加による体重減少効果があるなど、互いに異なる生物学的効能があので、一つのペプチドに前記の二つのペプチドが存在する場合、どちらか一方の効果が大きいと、望まざる効果が現れることがある。例えばグルカゴンの効果がＧＬＰ−１の効果よりも大きい場合、血糖値が上昇することがあり、ＧＬＰ−１の効果が大きい場合は吐き気や嘔吐などの副作用が強くなることがある。また、二つのペプチドの活性比によって効果全体が異なることもある。例えば、実施例１０と及び１２で製造されたオキシントモジュリン結合体は、実施例１０の結合体がＧＬＰ−１受容体の結合力においては効力が高いが、実施例１８で行われたin vivoの効力においては実施例１２の結合体に比べて効力が低いことが分かった。これは実施例１２の結合体がＧＬＰ−１受容体の効力は低いがグルカゴン受容体の効力が増加したことによるものと考えられる。したがって、本発明のオキシントモジュリン誘導体及びその結合体は、無条件的な活性増加のための誘導体のみを開示しているのではなく、例えば、オキシントモジュリンの１番目と１１番目のアミノ酸は、グルカゴン活性を低下させることが知られており、グルカゴンとＧＬＰ−１の活性比を調整する際に前記アミノ酸を変更することができる。
本発明の結合体はオキシントモジュリンに共有結合したり、小球体(microsphere)を形成し血中安定性の増加、腎臓への排出遅延、受容体との結合力の変化などを誘導することができる。オキシントモジュリンを含む結合体を形成し得るキャリアは結合後、血中半減期を延長することのできるアルブミン、トランスフェリン、抗体、抗体断片、エラスチン、ヘパリン、キチンなどのようなポリサッカライド、フィブリネクチンの中から選択することができるが、免疫グロブリンＦｃ領域が好ましい。
本発明における用語「免疫グロブリンＦｃ領域」は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域、重鎖不変領域１（ＣＨ１）及び軽鎖不変領域（ＣＬ１）を除いたものであり、重鎖不変領域２（ＣＨ２）及び重鎖不変領域３（ＣＨ３）部分を意味し、重鎖不変領域にヒンジ（hinge）部分を含むこともある。
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型と実質的に同等又は向上した効果を有するものであれば、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域を除き、一部又は全部の重鎖不変領域１（ＣＨ１）及び／又は軽鎖不変領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。また、ＣＨ２及び／又はＣＨ３に該当する非常に長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。すなわち、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）１つ又は２つの以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（又はヒンジ領域の一部）との組み合わせ、６）重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体であってもよい。
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体（mutant）をも含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより異なる配列を有するものを意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であることが知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２又は３２７〜３３１番目のアミノ酸残基が修飾に適した部位として用いられる。
また、ジスルフィド結合を形成する部位が除去されたり、天然型ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が除去されたり、天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されるなど、様々な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えばＣ１ｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ（antibody dependent cell mediated cytotoxicity、抗体依存性細胞介在性細部障害）部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリンFc領域の配列誘導体を製造する技術は特許文献３に開示されている。
分子の活性を全体的に変更しないタンパク質及びペプチドのアミノ酸交換は当該分野に公知となっている。(非特許文献２).最も一般的に起こる交換はアミノ酸残基Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly間の交換である。さらに、 リン酸化(phosphorylation), 硫酸化(sulfation), アクリル化(acrylation), グリコシル化(glycosylation), メチル化(methylation), ファネシル化(farnesylation), アセチル化(acetylation) 及び アミド化(amidation) などにより修飾(modification)され得る。
前述のＦｃ誘導体は本発明のＦｃ領域と同様の生物学的活性を示し、 Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を高める誘導体である。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を製造する技術は、特許文献２、特許文献３などに開示されている。
また、このようなＦｃ領域は、ヒト及びウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、又はモルモットなどの動物の生体内から分離した天然型から得てもよく、形質転換された動物細胞もしくは微生物から得られた組換え型又はその誘導体であってもよい。ここで、天然型から得る方法は、全免疫グロブリンをヒト又は動物の生体から分離し、その後タンパク質分解酵素で処理して獲得する方法であってもよい。パパインで処理するとＦａｂ及びＦｃに切断され、ペプシンで処理するとｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）２に切断される。これをサイズ排除クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography）などを用いてＦｃ又はｐＦ’ｃを分離することができる。ヒト由来のＦｃ領域を微生物から得られた組換え免疫グロブリンＦｃ領域であることが好ましい。
また、免疫グロブリンＦｃ領域は天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖又は糖鎖が欠失した形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減または欠失には化学的方法、酵素学的方法及び微生物を用いた遺伝子工学的方法のような通常の方法が用いられてもよい。ここで、Ｆｃから糖鎖が削除された免疫グロブリンＦｃ領域は補体（ｃｌｑ）との結合力が著しく低下し、抗体-依存性細胞毒性又は補体-依存性細胞毒性が減少又は削除され、生体内で不必要な免疫反応を誘発しない。このような点で薬物のキャリアとしての本来の目的により適した形態は糖鎖が削除されるか、又は非グリコシル免疫グロブリンＦｃ領域であろう。
本発明における「脱グリコシル(Deglycosylation)」は酵素で糖を削除したＦｃ領域を意味し、非グリコシル(Aglycosylation)は原核生物、好ましくは大腸菌で生産されるグリコシル化されていないＦｃ領域を意味する。
一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト又はウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であってもよく、好ましくはヒト起源である。
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＭ由来、又はそれらの組合せ又はそれらの混成(hybrid)によるＦｃ領域であってもよい。ヒトの血液に最も豊富に含まれているＩｇＧ又はＩｇＭ由来であることが好ましく、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させたことが公知となっているＩｇＧ由来であることが最も好ましい。
一方、本発明における「組合せ(combination)」とは、ニ量体又は多量体を形成する際に、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域をコードするポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。即ち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥ Ｆｃの断片からなる群れから選択される少なくとも二つの断片からニ量体又は多量体の製造が可能である。
本発明における用語「非ペプチド性重合体」とは、反復単位が２つ以上結合された生体適合性重合体を意味し、前記反復単位は、ペプチド結合を除く任意の共有結合により互いに連結される。本発明における前記非ペプチド性重合体は非ペプチド性リンカーと混用され得る。
本発明に使用可能な非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、（ポリ乳酸（ＰＬＡ）、 ポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）などの生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、好ましくはポリエチレングリコールである。当該分野に既に公知のそれらの誘導体及び当該分野の技術レベルにおいて容易に製造可能な誘導体も本発明に含まれる。
従来のインフレーム融合(inframe fusion)方法で製造された融合タンパク質において用いられたペプチド性リンカーの欠点は、生体内でタンパク質分解酵素によって容易に分解されるので、リンカーによる活性薬物の血中半減期の延長効果が期待したほど得られないということである。しかし、本発明ではタンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体を用いてキャリアと類似したペプチドの血中半減期が維持できる。したがって、本発明に用いられる非ペプチド性重合体は前記のような役割、即ち生体内のタンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体であれば制限なく使用できる。非ペプチド性重合体の分子量は１〜１００ｋＤａの範囲であるが、 １〜２０ｋＤａの範囲がより好ましい。また、前記免疫グロブリンＦｃ領域に結合する本発明の非ペプチド性重合体は一種類の重合体のみならず、異なる種類の重合体の組合せて用いることができる。
本発明に用いられる非ペプチド性重合体は免疫グロブリンＦｃ領域及びタンパク質薬物に結合し得る反応基を有してもよい。前記非ペプチド性重合体の両末端の反応基は反応アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド（maleimide）基及び、スクシンイミド誘導体からなる群から選択するのが好ましい。
前記において、スクシンイミド誘導体としてはスクシンイミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチル又はスクシンイミジルカーボネートを用いることができる。特に前記ペプチド性重合体が両末端に反応性アルデヒド基の反応基を持つ場合、非特異的反応を最小化し、非ペプチド性重合体の両末端で生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンとそれぞれ結合する際に効果的である。アルデヒド結合による還元性アルキル化として生成される最終産物はアミド結合で連結されたものよりもはるかに安定している。アルデヒド反応基は低いｐＨにおいてＮ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えばｐＨ９．０の条件下ではリシン残基に共有結合を形成し得る。
前記非ペプチド性重合体であるリンカーの両末端の反応基は同じものであってもよく、また異なるものであってもよい。例えば、一方の末端にはマレイミド基、他方の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、又はブチルアルデヒド基を有してもよい。両端にヒドロキシ反応基を有するポリエチレングリコールを非ペプチド性重合体として用いる場合には、公知の化学反応によって前記ヒドロキシ基を前記の様々な反応基で活性化させたり、市販で購入可能な修飾された反応基を有するポリエチレングリコールを用いて本発明の持続型結合体を製造することができる。
本本発明の結合体は、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及びオキシントモジュリン誘導体のアミン基又はチオール基に結合したものなどである。
一方、本発明における前記非ペプチド性重合体は、両末端に免疫グロブリンＦｃ領域及びタンパク質薬物に結合する反応基を含み、前記反応基は、特にこれらに限定されるものではないが、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、スクシンイミド誘導体（スクシンイミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチル又はスクシンイミジルカーボネート）などである。
前記非ペプチド性重合体の両末端の反応基は、同じものであってもよく、異なるものであってもよい。例えば、前記非ペプチド性重合体の一方の末端には反応基としてマレイミド基を含み、他の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基などを有してもよい。特に、前記非ペプチド性重合体の一末端がアルデヒド基の反応基を有し、他の末端がマレイミド基の反応基を有する場合、非特異的反応を最小限に抑え、非ペプチド性重合体の両末端で生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンとそれぞれ結合するのに効果的である。本発明の実施例によれば、プロピオンアルデヒドを単独で有するか、又はマレイミド基とアルデヒド基を同時に有する非ペプチド性重合体のＰＥＧを用い、オキシントモジュリン又はその誘導体と免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合により連結して結合体を合成した。
本発明の結合体は、天然型オキシントモジュリンに比べてＧＬＰ−１受容体及びグルカゴン受容体に優れた活性を有し、Ｆｃ領域を結合させることにより、体内での血中半減期を延長させ、生体内で活性を長時間維持することができる。
本発明のさらに他の実施態様において、本発明は、前記結合体を含む肥満の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
本発明における「予防」とは、当該疾患の発生を抑制又は遅延させるあらゆる行為を意味する。また、本発明における「予防」とは、本発明の結合体を投与することにより、体重の増加、体脂肪率の増加などの現象が現れる肥満症状の発生を抑制又は遅延させることを意味する。
本発明における「治療」とは、発生した疾病の症状を軽減、改善又は緩和するあらゆる行為を意味する。また、本発明における「治療」とは、本発明の結合体を投与することにより、前記肥満症状が軽減、改善又は緩和されて体重の減少、体脂肪比率の減少などの現象が現れることを意味する。
本発明における「肥満」とは、体内に脂肪組織が過剰に蓄積された状態であり、ボディマス指数（体重（ｋｇ））を身長（ｍ）の２乗で割った値）が２５以上であれば肥満と定義される。通常、肥満は、長期間にわたりエネルギー消費量より栄養素を過剰に摂取する場合にエネルギー不均衡により誘発される。肥満は、身体全体に影響を及ぼす代謝疾患であり、糖尿病や脂質異常症に罹患する可能性が高くなり、性機能障害、関節炎、心血管系疾患の発症リスクが高くなり、場合によっては癌の発生にも関連する。
オキシントモジュリン又はその誘導体に免疫グロブリンＦｃ領域を結合させた本発明の結合体は、グルカゴン及びＧＬＰ−１の各受容体に対する結合力に優れ（表３）、生体内に存在するタンパク質分解酵素に対する抵抗性に優れ、体内で長時間活性を示すことから、体重減少などの抗肥満活性に優れることが確認された（図１２）。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含んでもよい。本発明における「薬学的に許容」とは、治療効果を示す程度の十分な量と副作用を起こさないことを意味し、疾患の種類、患者の年齢、体重、健康状態、性別、薬物に対する感受性、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、配合又は同時に用いられる薬物などの医学分野における公知の要素により当業者が容易に決定することができる。
本発明の結合体を含む薬学的組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。前記担体は、特にこれらに限定されるものではないが、経口投与の場合は、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、賦形剤、溶解剤、分散剤、安定化剤、懸濁剤、色素、香料などを用いることができ、注射剤の場合は、緩衝剤、保存剤、鎮痛剤、溶解剤、等張化剤、安定化剤などを混合して用いることができ、局所投与の場合は、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを用いることができる。
本発明の組成物の剤形は、前述したような薬学的に許容される担体と混合して様々な形態に製造することができる。例えば、経口投与の場合は、錠剤、トローチ剤、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ、ウエハなどの形態に製造することができ、注射剤の場合は、使い捨てアンプル又は複数回投与形態に製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放型製剤などに剤形化することができる。
一方、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシア、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油などを用いてもよい。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、防腐剤などをさらに含んでもよい。
また、本発明の薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌水溶液剤、非水性溶剤、凍結乾燥剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれかの剤形を有する。
また、前記組成物は、薬学的分野における通常の方法による患者の体内投与に適した単回投与型の製剤、好ましくはペプチド医薬品の投与に有用な製剤形態に剤形化し、当業界で通常用いる投与方法を用いて経口、又は皮膚、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄膜腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、消化管内、局所、舌下、膣内、直腸経路を含む非経口投与経路で投与することができるが、これらに限定されるものではない。
また、前記組成物は、生理食塩水や有機溶媒のように薬剤に許容された様々な担体（carrier）と混合して用いることができ、安定性や吸収性を向上させるために、グルコース、スクロース、デキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸（ascorbic acid）、グルタチオンなどの抗酸化剤（antioxidants）、キレート剤（chelating agents）、低分子タンパク質、又は他の安定化剤（stabilizers）を薬剤として用いることができる。
本発明の薬学的組成物の投与量と回数は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別、体重、疾患の重症度などの様々な関連因子と共に、活性成分である薬物の種類により決定される。
本発明の組成物の総有効量は、単回投与量（single dose）で患者に投与してもよく、複数回投与量（multiple dose）で長期間投与される分割治療方法（fractionated treatment protocol）により投与してもよい。本発明の薬学的組成物は、疾患の程度に応じて有効成分の含有量を変えてもよい。本発明の薬学的組成物の総用量は、１日体重１ｋｇ当たり約０．０００１μｇ〜５００ｍｇであることが好ましい。しかし、前記組成物の用量は、薬学的組成物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食事、排泄率などの様々な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決定されるので、これらを考慮すると、当該分野における通常の知識を有する者であれば、前記本発明の組成物の特定の用途に応じた適切な有効投与量を決定することができるであろう。本発明による薬学的組成物は、本発明の効果を奏するものであれば、その剤形、投与経路及び投与方法が特に限定されるものではない。
本発明の薬学的組成物は、生体内持続性及び力価に優れるので、本発明の薬学的製剤の投与回数及び頻度を著しく減少させることができる。
また、前記薬学的組成物は、単独で又は他の肥満予防又は治療効果を示す薬学的製剤と併用して投与することができる。前記肥満予防又は治療効果を示す薬学的製剤は、特にこれらに限定されるものではないが、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト、レプチン（Leptin）受容体アゴニスト、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、Ｙ５受容体アンタゴニスト、ＭＣＨ（Melanin-concentrating hormone）受容体アンタゴニスト、Ｙ２／３受容体アゴニスト、ＭＣ３／４受容体アゴニスト、胃／膵臓リパーゼ（gastric/pancreatic lipase）阻害剤、５ＨＴ２ｃアゴニスト、β３Ａ受容体アゴニスト、アミリン（Amylin）受容体アゴニスト、グレリン（Ghrelin）アンタゴニスト、グレリン受容体アンタゴニストなどである。
本発明のさらに他の態様において、本発明は、前記結合体又はそれを含む肥満予防又は治療用薬学的組成物を個体に投与するステップを含む、肥満の予防又は治療方法を提供する。
本発明における「投与」とは、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記組成物の投与経路は、特にこれらに限定されるものではないが、前記組成物を生体内の標的に到達させ得るあらゆる一般的な経路で投与することができ、例えば腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与などが挙げられる。
本発明における「個体」とは、肥満が疑われる個体であり、前記肥満が疑われる個体は、肥満が発病しているか、発病する可能性のある、ヒトをはじめとするマウス、家畜などを含む哺乳動物を意味するが、本発明の結合体で治療可能な個体は限定されることなく含まれる。本発明の結合体を含む薬学的組成物を肥満が疑われる個体に投与することにより、個体を効率的に治療することができる。前記肥満については前述した通りである。
本発明の治療方法は、結合体を含む薬学的組成物を薬学的有効量で投与することを含んでもよい。好適な総１日用量は、正常な医学的判断の範囲内で担当医により決定され、１回又は数回に分けて投与することができる。しかし、発明の目的上、特定患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によっては他の製剤が用いられるか否かをはじめとする具体的な組成物、患者の年齢、体重、健康状態、性別、食餌、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間、具体的な組成物と併用又は同時投与される薬物をはじめとする様々な因子と医薬分野で周知の類似因子に応じて異なる量を適用することが好ましい。
本発明のさらに他の態様において、本発明は、肥満の予防又は治療用医薬の製造における前記結合体又は薬学的組成物の用途を提供する。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性用細胞株の作製
実施例１−１：ＧＬＰ−１に対してｃＡＭＰ反応を示す細胞株の作製
ヒトＧＬＰ−１受容体遺伝子のｃＤＮＡ（OriGene Technologies, Inc. USA）においてＯＲＦ（オープンリーデイングフレーム）に相当する部分を鋳型とし、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位をそれぞれ含む下記正方向及び逆方向プライマーを用いたＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得た。
正方向プライマー：５’−ＣＣＣＧＧＣＣＣＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＴＣＧＡＡＡＴＡＣ−３’（配列番号４７）
逆方向プライマー：５’−ＧＡＡＣＧＧＴＣＣＧＧＡＧＧＡＣＧＴＣＧＡＣＴＣＴＴＡＡＧＡＴＡＧ−３’（配列番号４８）
前記ＰＣＲ産物を公知の動物細胞発現ベクターであるｘ０ＧＣ／ｄｈｆｒにクローニングして組換えベクターｘ０ＧＣ／ＧＬＰ−１Ｒを製造した。
前記製造した組換えベクターｘ０ＧＣ／ＧＬＰ−１Ｒを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１０％ＦＢＳ）培地で培養したＣＨＯ ＤＧ４４細胞株にリポフェクタミン（Lipofectamine, invitrogene, USA）を用いた方法で導入して形質転換体を得て、前記形質転換体を１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８及び１０ｎＭのメトトラキサート（methotraxate）を含む選択培地で選択培養し、次いでそこから単一クローン細胞株を選別し、ＧＬＰ−１に対して優れた濃度依存的ｃＡＭＰ反応を示す細胞株を最終的に選別した。
実施例１−２：グルカゴンに対してｃＡＭＰ反応を示す細胞株の作製
ヒトグルカゴン受容体遺伝子のｃＤＮＡ（OriGene Technologies, Inc. USA）においてＯＲＦに相当する部分を鋳型とし、ＥｃｏＲＩ切断部位とＸｈｏＩ切断部位をそれぞれ含む正方向及び逆方向プライマーを用いたＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得た。
正方向プライマー：５’−ＣＡＧＣＧＡＣＡＣＣＧＡＣＣＧＴＣＣＣＣＣＣＧＴＡＣＴＴＡＡＧＧＣＣ−３’（配列番号４９）
逆方向プライマー：５’−ＣＴＡＡＣＣＧＡＣＴＣＴＣＧＧＧＧＡＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣ−３’（配列番号５０）
前記ＰＣＲ産物を公知の動物細胞発現ベクターであるｘ０ＧＣ／ｄｈｆｒにクローニングして組換えベクターｘ０ＧＣ／ＧＣＧＲを製造した。
前記製造した組換えベクターｘ０ＧＣ／ＧＣＧＲを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１０％ＦＢＳ）培地で培養したＣＨＯ ＤＧ４４細胞株にリポフェクタミンを用いた方法で導入して形質転換体を得て、前記形質転換体を１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８及び１０ｎＭのメトトラキサートを含む選択培地で選択培養し、次いでそこから単一クローン細胞株を選別し、グルカゴンに対して優れた濃度依存的ｃＡＭＰ反応を示す細胞株を最終的に選別した。
実施例２：オキシントモジュリン誘導体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
実施例２−１：オキシントモジュリン誘導体の合成
オキシントモジュリン誘導体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を測定するために、下記アミノ酸配列を有するオキシントモジュリン誘導体を合成した（表１）。
表１において、太字及び下線で示すアミノ酸は環形成を意味し、Ｘと表記されたアミノ酸は非天然型アミノ酸であるα−メチルグルタミン酸を意味する。また、ＣＡは４−イミダゾアセチル（4-imidazoacetyl）を意味し、ＤＡはデスアミノ−ヒスチジル（desamino-histidyl）を意味する。
実施例２−２：オキシントモジュリン誘導体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性の測定
実施例２−１で合成したオキシントモジュリン誘導体の抗肥満効能を測定するために、実施例１−１及び１−２で製造した形質転換体を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞活性を測定する方法を行った。
前記各形質転換体は、ＣＨＯ（チャイニーズハムスターの卵巣）にヒトＧＬＰ−１受容体及びグルカゴン受容体遺伝子をそれぞれ発現するように形質転換されたものであり、ＧＬＰ−１とグルカゴンの活性を測定するのに適しているので、それぞれの形質転換体を用いて各オキシントモジュリン誘導体の活性を測定した。
具体的には、前記各形質転換体を１週間に２又は３回継代培養し、９６ウェルプレートに各ウェル当たり１×１０５個の継代培養した形質転換体を分注して２４時間培養した。
前記培養した細胞をＫＲＢ緩衝液で洗浄し、１ｍＭのＩＢＭＸを含むＫＲＢ緩衝液４０ｍＬに懸濁させ、次いで５分間常温に静置した。オキシントモジュリン（配列番号１）又はオキシントモジュリン誘導体（配列番号２〜６、８、１０〜１３、１７、１８、２３〜２５、２７及び２８及び３２〜３４）を１０００ｎＭから０．０２ｎＭまで５倍ずつ連続的に希釈し、それを４０ｍＬずつ前記細胞に添加し、次いで３７℃の温度条件でＣＯ２培養器にて１時間培養した。次に、細胞溶解緩衝液（cell lysis buffer）を２０ｍＬずつ加えて細胞を溶解させ、前記細胞溶解物をｃＡＭＰアッセイキット（Molecular Device, USA）にかけてｃＡＭＰ濃度を測定し、そこからＥＣ５０値を算出して相互に比較した（表２）。ＥＣ５０値を表２に示す。
表２から分かるように、配列番号１の天然型オキシントモジュリンのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性に比べてＧＬＰ−１受容体及びグルカゴン受容体活性に優れたオキシントモジュリン誘導体が確認された。
オキシントモジュリンは、ＧＬＰ−１受容体及びグルカゴン受容体の活性化により、食欲抑制及び満腹感増進、脂肪細胞分解促進による肥満治療効果があることが知られている。本発明による前記誘導体は、ＧＬＰ−１受容体及びグルカゴン受容体の両方に対して天然型オキシントモジュリンより高いｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を有するので、従来のオキシントモジュリンに比べて優れた効能を有する肥満治療剤として用いることができる。
実施例３：オキシントモジュリン誘導体のｉｎ ｖｉｖｏ活性
オキシントモジュリン誘導体のｉｎ ｖｉｖｏ活性を測定するために、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、対照薬物として固有のオキシントモジュリンを用い、試験物質投与によるｉｎ ｖｉｖｏオキシントモジュリン誘導体の活性を測定した。
具体的には、肥満糖尿病製剤の効能試験に一般に最も多く用いられるモデル動物であるｏｂ／ｏｂマウスを１６時間絶食させ、１もしくは１０ｍｇ／ｋｇのオキシントモジュリン、又は０．０２、０．１、１もしくは１０ｍｇ／ｋｇの配列番号２のオキシントモジュリン誘導体をそれぞれ投与し、２時間の飼料摂取量を測定した（図１）。図１はオキシントモジュリン又はオキシントモジュリン誘導体の投与量による飼料摂取量の変化を示すグラフである。図１から分かるように、１ｍｇ／ｋｇのオキシントモジュリン誘導体を投与した場合、１０ｍｇ／ｋｇのオキシントモジュリンを投与した場合よりも優れた飼料摂取抑制効果を示すことが確認された。
すなわち、本発明のオキシントモジュリン誘導体は、従来の野生型オキシントモジュリンに比べて抗肥満効果が著しく高く、少量を投与しても肥満治療効果に優れるので、従来は抗肥満効能が低く、１日に３回高用量を投与しなければならなかった野生型オキシントモジュリンの問題が改善されたことが分かる。
実施例４：オキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃとを含む結合体の製造
まず、３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２） ＰＥＧ（プロピオンアルデヒド基を2つ有するＰＥＧ，NOF., 日本）をオキシントモジュリン（配列番号１）のアミノ酸配列の３０番目のリシン残基にペグ化するために、オキシントモジュリンと３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２） ＰＥＧのモル比を１：１２、タンパク質の濃度を５ｍｇ／ｍＬとし、４℃で４．５時間反応させた。ここで、反応は、１００ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）と４５％イソプロパノールの混合溶媒に還元剤である２０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウム(cyanoborohydride,ＳＣＢ（ＮａＣＮＢＨ３）が添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ Ｓ（XK16，アマシャムバイオサイエンス）にかけ、リシンにモノペグ化されたオキシントモジュリンを精製した（カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ（XK16，アマシャムバイオサイエンス），流速：２．０ｍＬ／分、勾配：Ａ０→３％１分Ｂ→４０％２２２分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのクエン酸ナトリウム，ｐＨ３．０＋４５％エタノール，Ｂ：Ａ＋１ＭのＫＣｌ））（図２ａ）。図２ａはＳＯＵＲＣＥ Ｓ精製カラムによりモノペグ化オキシントモジュリンを精製した結果を示すグラフである。前記溶出したピークのモノペグ化はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、リシン選択性はＡｓｐ−Ｎタンパク質加水分解酵素を用いたペプチドマッピング（peptide mapping）法を用いて確認した（図２ｂ）。図２ｂは精製したモノペグ化オキシントモジュリンのペプチドマッピングの結果を示すグラフである。
次に、前記精製したモノペグ化オキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃのモル比を１：１０、タンパク質の濃度を２０ｍｇ／ｍＬとし、４℃で１６時間反応させた。反応は、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に還元剤である２０ｍＭのＳＣＢが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラムにかけ、オキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した（カラム：ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ（XK16，アマシャムバイオサイエンス），流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→２０％１００分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１ＭのＮａＣｌ））（図２ｃ）。図２ｃはオキシントモジュリンと免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。
実施例５：オキシントモジュリン誘導体（配列番号２９）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体の製造
まず、３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２） ＰＥＧをオキシントモジュリン誘導体（配列番号２９）のアミノ酸配列の３０番目のリシン残基にペグ化するために、オキシントモジュリン誘導体（配列番号２９）と３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２） ＰＥＧのモル比を１：１２、タンパク質の濃度を５ｍｇ／ｍＬとし、４℃で４．５時間反応させた。ここで、反応は、１００ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）と４５％イソプロパノールの混合溶媒に還元剤である２０ｍＭのＳＣＢが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ Ｓにかけ、リシンにモノペグ化されたオキシントモジュリン誘導体を精製した（カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→３％１分Ｂ→４０％２２２分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのクエン酸ナトリウム，ｐＨ３．０＋４５％エタノール，Ｂ：Ａ＋１ＭのＫＣｌ））（図３ａ）。図３ａはＳＯＵＲＣＥ Ｓ精製カラムによりモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２９）を精製した結果を示すグラフである。
次に、前記精製したモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２９）と免疫グロブリンＦｃのモル比を１：１０、タンパク質の濃度を２０ｍｇ／ｍＬとし、４℃で１６時間反応させた。反応は、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に還元剤である２０ｍＭのＳＣＢが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラムにかけ、オキシントモジュリン誘導体（配列番号２９）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した（カラム：ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→２０％１００分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１ＭのＮａＣｌ））（図３ｂ）。図３ｂはオキシントモジュリン誘導体（配列番号２９）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。
実施例６：オキシントモジュリン誘導体（配列番号３０）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体の製造
まず、３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２） ＰＥＧをオキシントモジュリン誘導体（配列番号３０）のアミノ酸配列の３０番目のリシン残基にペグ化するために、オキシントモジュリン誘導体（配列番号３０）と３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２） ＰＥＧのモル比を１：１５、タンパク質の濃度を３ｍｇ／ｍＬとし、４℃で４．５時間反応させた。ここで、反応は、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）と４５％イソプロパノールの混合溶媒に還元剤である２０ｍＭのＳＣＢが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ Ｓにかけ、リシンにモノペグ化されたオキシントモジュリン誘導体を精製した（カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→３％１分Ｂ→４０％２２２分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのクエン酸ナトリウム，ｐＨ３．０＋４５％エタノール，Ｂ：Ａ＋１ＭのＫＣｌ））（図４ａ）。図４ａはＳＯＵＲＣＥ Ｓ精製カラムによりモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号３０）を精製した結果を示すグラフである。前記溶出したピークのモノペグ化はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、リシン選択性はＡｓｐ−Ｎタンパク質加水分解酵素を用いたペプチドマッピング法を用いて確認した（図４ｂ）。図４ｂは精製したモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号３０）のペプチドマッピングの結果を示すグラフである。
次に、前記精製したモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号３０）と免疫グロブリンＦｃのモル比を１：１０、タンパク質の濃度を２０ｍｇ／ｍＬとし、４℃で１６時間反応させた。反応は、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に還元剤である２０ｍＭのＳＣＢが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラムにかけ、オキシントモジュリン誘導体（配列番号３０）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した（カラム：ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→２０％１００分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１ＭのＮａＣｌ））（図４ｃ）。図４ｃはオキシントモジュリン誘導体（配列番号３０）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。
実施例７：オキシントモジュリン誘導体（配列番号３１）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体の製造
まず、３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２） ＰＥＧをオキシントモジュリン誘導体（配列番号３１）のアミノ酸配列の３０番目のリシン残基にペグ化するために、オキシントモジュリン誘導体（配列番号３１）と３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２） ＰＥＧのモル比を１：１５、タンパク質の濃度を３ｍｇ／ｍＬとし、４℃で４．５時間反応させた。ここで、反応は、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）と４５％イソプロパノールの混合溶媒に還元剤である２０ｍＭのＳＣＢが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ Ｓにかけ、リシンにモノペグ化されたオキシントモジュリン誘導体を精製した（カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→３％１分Ｂ→４０％２２２分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのクエン酸ナトリウム，ｐＨ３．０＋４５％エタノール，Ｂ：Ａ＋１ＭのＫＣｌ））（図５ａ）。図５ａはＳＯＵＲＣＥ Ｓ精製カラムによりモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号３１）を精製した結果を示すグラフである。
次に、前記精製したモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号３１）と免疫グロブリンＦｃのモル比を１：１０、タンパク質の濃度を２０ｍｇ／ｍＬとし、４℃で１６時間反応させた。反応は、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に還元剤である２０ｍＭのＳＣＢが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラムにかけ、オキシントモジュリン誘導体（配列番号３１）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した（カラム：ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→２０％１００分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１ＭのＮａＣｌ））（図５ｂ）。図５ｂはオキシントモジュリン誘導体（配列番号３１）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。
実施例８：オキシントモジュリン誘導体（配列番号２）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体の製造
まず、３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２） ＰＥＧをオキシントモジュリン誘導体（配列番号２）のアミノ酸配列の３０番目のリシン残基にペグ化するために、オキシントモジュリン誘導体（配列番号２）と３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２） ＰＥＧのモル比を１：１０、タンパク質の濃度を３ｍｇ／ｍＬとし、４℃で４時間反応させた。ここで、反応は、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）と４５％イソプロパノールの混合溶媒に還元剤である２０ｍＭのＳＣＢが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ Ｓにかけ、リシンにモノペグ化されたオキシントモジュリン誘導体を精製した（カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→３％１分Ｂ→４０％２２２分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのクエン酸ナトリウム，ｐＨ３．０＋４５％エタノール，Ｂ：Ａ＋１ＭのＫＣｌ））（図６ａ）。図６ａはＳＯＵＲＣＥ Ｓ精製カラムによりモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２）を精製した結果を示すグラフである。前記溶出したピークのモノペグ化はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、リシン選択性はＡｓｐ−Ｎタンパク質加水分解酵素を用いたペプチドマッピング法を用いて確認した（図６ｂ）。図６ｂは精製したモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２）のペプチドマッピングの結果を示すグラフである。
次に、前記精製したモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２）と免疫グロブリンＦｃのモル比を１：８、タンパク質の濃度を２０ｍｇ／ｍＬとし、４℃で１６時間反応させた。反応は、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に還元剤である２０ｍＭのＳＣＢが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラム（カラム：ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→４％１分Ｂ→２０％８０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１ＭのＮａＣｌ））（図６ｃ）とＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ精製カラム（カラム：ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ（XK16，アマシャムバイオサイエンス），流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→１００％１００分Ｂ,（Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１．３ＭのＡＳ））（図６ｄ）にかけ、オキシントモジュリン誘導体（配列番号２）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した。図６ｃはＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフであり、図６ｄはＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。
実施例９：オキシントモジュリン誘導体（配列番号３）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体の製造
まず、３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２） ＰＥＧをオキシントモジュリン誘導体（配列番号３）のアミノ酸配列の２７番目のリシン残基にペグ化するために、オキシントモジュリン誘導体（配列番号３）と３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２） ＰＥＧのモル比を１：１０、タンパク質の濃度を３ｍｇ／ｍＬとし、４℃で４時間反応させた。ここで、反応は、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）と４５％イソプロパノールの混合溶媒に還元剤である２０ｍＭのＳＣＢが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ Ｓにかけ、リシンにモノペグ化されたオキシントモジュリン誘導体を精製した（カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→３％１分Ｂ→４０％２２２分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのクエン酸ナトリウム，ｐＨ３．０＋４５％エタノール，Ｂ：Ａ＋１ＭのＫＣｌ））（図７ａ）。図７ａはＳＯＵＲＣＥ Ｓ精製カラムによりモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号３）を精製した結果を示すグラフである。前記溶出したピークのモノペグ化はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、リシン選択性はＡｓｐ−Ｎタンパク質加水分解酵素を用いたペプチドマッピング法を用いて確認した（図７ｂ）。図７ｂは精製したモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号３）のペプチドマッピングの結果を示すグラフである。
次に、前記精製したモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号３）と免疫グロブリンＦｃのモル比を１：８、タンパク質の濃度を２０ｍｇ／ｍＬとし、４℃で１６時間反応させた。反応は、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に還元剤である２０ｍＭのＳＣＢが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＢｕｔｙｌ ＦＦ精製カラム（カラム：Ｂｕｔｙｌ ＦＦ（XK16，アマシャムバイオサイエンス），流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ｂ０→１００％５分Ａ（Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１．５ＭのＮａＣｌ））（図７ｃ）とＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラム（カラム：ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→４％１分Ｂ→２０％８０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１ＭのＮａＣｌ））（図７ｄ）にかけ、オキシントモジュリン誘導体（配列番号３）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した。図７ｃはＢｕｔｙｌ ＦＦ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号３）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフであり、図７ｄはＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号３）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。
実施例１０：オキシントモジュリン誘導体（配列番号２３）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体の製造
まず、ＭＡＬ−１０Ｋ−ＡＬＤ ＰＥＧ（NOF., 日本）をオキシントモジュリン誘導体（配列番号２３）のアミノ酸配列の２４番目のシステイン残基にペグ化するために、オキシントモジュリン誘導体（配列番号２３）とＭＡＬ−１０Ｋ−ＡＬＤ ＰＥＧのモル比を１：３、タンパク質の濃度を３ｍｇ／ｍＬとし、常温で３時間反応させた。ここで、反応は、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に１Ｍのグアニジンが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ Ｓにかけ、システインにモノペグ化されたオキシントモジュリン誘導体を精製した（カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→１００％５０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのクエン酸ナトリウム，ｐＨ３．０＋４５％エタノール，Ｂ：Ａ＋１ＭのＫＣｌ））（図８ａ）。図８ａはＳＯＵＲＣＥ Ｓ精製カラムによりモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２３）を精製した結果を示すグラフである。
次に、前記精製したモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２３）と免疫グロブリンＦｃのモル比を１：５、タンパク質の濃度を２０ｍｇ／ｍＬとし、４℃で１６時間反応させた。反応は、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に還元剤である２０ｍＭのＳＣＢが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラム（カラム：ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→４％１分Ｂ→２０％８０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１ＭのＮａＣｌ））（図８ｂ）とＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ精製カラム（カラム：ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ｂ０→１００％１００分Ａ,（Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１．１ＭのＡＳ））（図８ｃ）にかけ、オキシントモジュリン誘導体（配列番号２３）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した。図８ｂはＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２３）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフであり、図８ｃはＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２３）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。
実施例１１：オキシントモジュリン誘導体（配列番号２４）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体の製造
まず、ＭＡＬ−１０Ｋ−ＡＬＤ ＰＥＧをオキシントモジュリン誘導体（配列番号２４）のアミノ酸配列の３０番目のシステイン残基にペグ化するために、オキシントモジュリン誘導体（配列番号２４）とＭＡＬ−１０Ｋ−ＡＬＤ ＰＥＧのモル比を１：３、タンパク質の濃度を３ｍｇ／ｍＬとし、常温で３時間反応させた。ここで、反応は、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に１Ｍのグアニジンが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ Ｓにかけ、システインにモノペグ化されたオキシントモジュリン誘導体を精製した（カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→１００％５０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのクエン酸ナトリウム，ｐＨ３．０＋４５％エタノール，Ｂ：Ａ＋１ＭのＫＣｌ））（図９ａ）。図９ａはＳＯＵＲＣＥ Ｓ精製カラムによりモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２４）を精製した結果を示すグラフである。
次に、前記精製したモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２４）と免疫グロブリンＦｃのモル比を１：５、タンパク質の濃度を２０ｍｇ／ｍＬとし、４℃で１６時間反応させた。反応は、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に還元剤である２０ｍＭのＳＣＢが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラム（カラム：ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→４％１分Ｂ→２０％８０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１ＭのＮａＣｌ））（図９ｂ）とＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ精製カラム（カラム：ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ｂ０→１００％１００分Ａ,（Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１．１ＭのＡＳ））（図９ｃ）にかけ、オキシントモジュリン誘導体（配列番号２４）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した。図９ｂはＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２４）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフであり、図９ｃはＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２４）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。
実施例１２：オキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体の製造
まず、ＭＡＬ−１０Ｋ−ＡＬＤ ＰＥＧをオキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）のアミノ酸配列の３０番目のシステイン残基にペグ化するために、オキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）とＭＡＬ−１０Ｋ−ＡＬＤ ＰＥＧのモル比を１：３、タンパク質の濃度を３ｍｇ／ｍＬとし、常温で３時間反応させた。ここで、反応は、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に１Ｍのグアニジンが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ Ｓにかけ、システインにモノペグ化されたオキシントモジュリン誘導体を精製した（カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→１００％５０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのクエン酸ナトリウム，ｐＨ３．０＋４５％エタノール，Ｂ：Ａ＋１ＭのＫＣｌ））（図１０ａ）。図１０ａはＳＯＵＲＣＥ Ｓ精製カラムによりモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）を精製した結果を示すグラフである。
次に、前記精製したモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）と免疫グロブリンＦｃのモル比を１：５、タンパク質の濃度を２０ｍｇ／ｍＬとし、４℃で１６時間反応させた。反応は、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に還元剤である２０ｍＭのＳＣＢが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラム（カラム：ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→４％１分Ｂ→２０％８０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１ＭのＮａＣｌ））（図１０ｂ）とＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ精製カラム（カラム：ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ｂ０→１００％１００分Ａ,（Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１．１ＭのＡＳ））（図１０ｃ）にかけ、オキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した。図１０ｂはＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフであり、図１０ｃはＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。
実施例１３：オキシントモジュリン誘導体（配列番号２８）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体の製造
まず、３．４Ｋ ＰｒｏｐｉｏｎＡＬＤ（２） ＰＥＧをオキシントモジュリン誘導体（配列番号２８）のアミノ酸配列の２０番目のリシン残基にペグ化するために、オキシントモジュリン誘導体（配列番号２８）とＭＡＬ−１０Ｋ−ＡＬＤ ＰＥＧのモル比を１：５、タンパク質の濃度を３ｍｇ／ｍＬとし、４℃で３時間反応させた。ここで、反応は、５０ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）に２Ｍのグアニジンが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ Ｓにかけ、リシンにモノペグ化されたオキシントモジュリン誘導体を精製した（カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→３％１分Ｂ→４０％２２２分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのクエン酸ナトリウム，ｐＨ３．０＋４５％エタノール，Ｂ：Ａ＋１ＭのＫＣｌ））（図１１ａ）。図１１ａはＳＯＵＲＣＥ Ｓ精製カラムによりモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２８）を精製した結果を示すグラフである。
次に、前記精製したモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２８）と免疫グロブリンＦｃのモル比を１：１０、タンパク質の濃度を２０ｍｇ／ｍＬとし、４℃で１６時間反応させた。１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に還元剤である２０ｍＭのＳＣＢが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラム（カラム：ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→４％１分Ｂ→２０％８０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１ＭのＮａＣｌ））（図１１ｂ）とＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ精製カラム（カラム：ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ｂ０→１００％１００分Ａ,（Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１．１ＭのＡＳ））（図１１ｃ）にかけ、オキシントモジュリン誘導体（配列番号２８）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した。図１１ｂはＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２８）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフであり、図１１ｃはＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ精製カラムによりオキシントモジュリン誘導体（配列番号２８）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した結果を示すグラフである。
実施例１４：オキシントモジュリン誘導体（配列番号３２）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体の製造
まず、MAL-10K-ALD PEGをオキシントモジュリン誘導体(配列番号３２)のアミノ酸配列番号３０番目のシステイン残基にベグ化するためオキシントモジュリン誘導体(配列番号３２)とMAL-10K-ALD PEGのモル比を１：３、タンパク質の濃度を１ｍｇ／ｍＬとし、常温で３時間反応させた。 ここで、反応は、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に２Ｍのグアニジンが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ Ｓにかけ、システインにモノペグ化されたオキシントモジュリン誘導体を精製した（カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→１００％５０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのクエン酸ナトリウム，ｐＨ３．０＋４５％エタノール，Ｂ：Ａ＋１ＭのＫＣｌ）。
次に、前記精製したモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号３２）と免疫グロブリンＦｃのモル比を１：８、タンパク質の濃度を２０ｍｇ／ｍＬとし、４℃で１６時間反応させた。反応は、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に還元剤である２０ｍＭのＳＣＢが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラム（カラム：ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→４％１分Ｂ→２０％８０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１ＭのＮａＣｌ））（図１０ｂ）とＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ精製カラム（カラム：ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ｂ０→１００％１００分Ａ,（Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１．１ＭのＡＳ））にかけ、オキシントモジュリン誘導体（配列番号３２）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した。
実施例１５：オキシントモジュリン誘導体（配列番号３３）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体の製造（免疫グロブリンＦｃ領域結合オキシントモジュリン誘導体３３）
まず、MAL-10K-ALD PEGをオキシントモジュリン誘導体(配列番号３３)のアミノ酸配列番号３０番目のシステイン残基にベグ化するためオキシントモジュリン誘導体(配列番号３３)とMAL-10K-ALD PEGのモル比を１：１、タンパク質の濃度を１ｍｇ／ｍＬとし、常温で３時間反応させた。 ここで、反応は、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に２Ｍのグアニジンが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ Ｓにかけ、システインにモノペグ化されたオキシントモジュリン誘導体を精製した（カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→１００％５０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのクエン酸ナトリウム，ｐＨ３．０＋４５％エタノール，Ｂ：Ａ＋１ＭのＫＣｌ）。
次に、前記精製したモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号３３）と免疫グロブリンＦｃのモル比を１：５、タンパク質の濃度を２０ｍｇ／ｍＬとし、４℃で１６時間反応させた。反応は、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に還元剤である２０ｍＭのＳＣＢが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラム（カラム：ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→４％１分Ｂ→２０％８０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１ＭのＮａＣｌ））とＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ精製カラム（カラム：ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ｂ０→１００％１００分Ａ,（Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１．１ＭのＡＳ））にかけ、オキシントモジュリン誘導体（配列番号３３）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した。
実施例１６：オキシントモジュリン誘導体（配列番号３４）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体の製造（免疫グロブリンＦｃ領域結合オキシントモジュリン誘導体３４）
まず、MAL-10K-ALD PEGをオキシントモジュリン誘導体(配列番号３４)のアミノ酸配列番号３０番目のシステイン残基にベグ化するためオキシントモジュリン誘導体(配列番号３４)とMAL-10K-ALD PEGのモル比を１：１、タンパク質の濃度を３ｍｇ／ｍＬとし、常温で３時間反応させた。 ここで、反応は、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に１Ｍのグアニジンが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ Ｓにかけ、システインにモノペグ化されたオキシントモジュリン誘導体を精製した（カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→１００％５０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのクエン酸ナトリウム，ｐＨ３．０＋４５％エタノール，Ｂ：Ａ＋１ＭのＫＣｌ）。
次に、前記精製したモノペグ化オキシントモジュリン誘導体（配列番号３４）と免疫グロブリンＦｃのモル比を１：５、タンパク質の濃度を２０ｍｇ／ｍＬとし、４℃で１６時間反応させた。反応は、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に還元剤である２０ｍＭのＳＣＢが添加された環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラム（カラム：ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ａ０→４％１分Ｂ→２０％８０分Ｂ（Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１ＭのＮａＣｌ））とＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ精製カラム（カラム：ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ，流速：２．０ｍＬ／分，勾配：Ｂ０→１００％１００分Ａ,（Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，Ｂ：Ａ＋１．１ＭのＡＳ））にかけ、オキシントモジュリン誘導体（配列番号３４）と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した。
実施例１７：オキシントモジュリン誘導体−免疫グロブリンＦｃ結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
上記実施例で製造されたオキシントモジュリン又はオキシントモジュリン誘導体と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体の抗肥満効果を測定するために実施例２−２と同様の方法を行った。
具体的には、実施例１−１及び１−２で製造した各形質転換体を１週間に２又は３回継代培養し、９６ウェルプレートに各ウェル当たり１×１０５個の継代培養した形質転換体を分注して２４時間培養した。前記培養した各形質転換体をＫＲＢ緩衝液で洗浄し、１ｍＭのＩＢＭＸを含むＫＲＢ緩衝液４０ｍＬに懸濁させ、次いで５分間常温で静置した。ＧＬＰ−１、グルカゴン、又はオキシントモジュリン誘導体（配列番号２３、２４、２５、３２，３３又は３４）−免疫グロブリンＦｃ結合体をそれぞれ１０００ｎＭから０．０２ｎＭまで５倍ずつ連続的に希釈し、それを４０ｍＬずつ前記各形質転換体に添加し、次いで３７℃の温度条件でＣＯ２培養器にて１時間培養した。次に、細胞溶解緩衝液（cell lysis buffer）を２０ｍＬずつ加えて細胞を溶解させ、前記細胞溶解物をｃＡＭＰ アッセイキット（Molecular Device, USA）にかけてｃＡＭＰ濃度をＶｉｃｔｏｒ（Perkin Elmer, USA）で測定し、そこからＥＣ５０値を算出して相互に比較した（表３）。
表３から分かるように、オキシントモジュリン誘導体−免疫グロブリンＦｃ結合体は、固有のＧＬＰ−１受容体とグルカゴン受容体に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を 維持することが確認された。
実施例１８：オキシントモジュリン誘導体−免疫グロブリン結合体のｉｎ ｖｉｖｏ活性
前記実施例１４の結果から、オキシントモジュリン誘導体−免疫グロブリンＦｃ結合体が オキシントモジュリン誘導体よりも優れた活性を示すことが確認されたので、前記結合体が優れた体重減少効果を示すか否かの確認を試みた。
具体的には、約６週齢の正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに６０ｋｃａｌの高脂肪飼料を２４週間給餌して体重を平均約５０ｇずつ増加させた。前記マウスにオキシントモジュリン誘導体（配列番号２４又は２５）−免疫グロブリンＦｃ結合体をそれぞれ０．０３又は０．０６ｍｇ／ｋｇ／週の投与量で３週間皮下注射し、各マウスの体重の変化を測定した（図１２及び図１３）。図１２及び図１３はオキシントモジュリン誘導体−免疫グロブリンＦｃ結合体の種類及び投与量によるマウスの体重の変化を経時的に示すグラフである。図１２及び図１３から分かるように、オキシントモジュリン誘導体−免疫グロブリンＦｃ結合体の種類によって多少差があるが、前記オキシントモジュリン誘導体−免疫グロブリンＦｃ結合体の投与量が増加すると、それに比例して体重減少効果が現れたので、前記オキシントモジュリン誘導体−免疫グロブリンＦｃ結合体は用量依存的に体重を減少させる効果を示すことが確認された。

Claims (20)

  1. オキシントモジュリン誘導体、免疫グロブリンＦｃ領域及びポリエチレングリコールを含む結合体であり、オキシントモジュリン誘導体と免疫グロブリンＦｃ領域とがポリエチレングリコールにより共有結合で連結され、オキシントモジュリン誘導体が配列番号２３、２４、２５、３２、３３及び３４から選ばれるアミノ酸配列を有するものである結合体。
  2. 前記オキシントモジュリン誘導体が配列番号２４のアミノ酸配列を有する請求項１に記載の結合体。
  3. 前記オキシントモジュリン誘導体が配列番号２５のアミノ酸配列を有する請求項１に記載の結合体。
  4. 前記オキシントモジュリン誘導体が、ＧＬＰ−１受容体及びグルカゴン受容体を活性化し得るものである請求項１〜３のいずれかに記載の結合体。
  5. 前記結合体が抗肥満効果を有する請求項１〜３のいずれかに記載の結合体。
  6. 配列番号２５、３２、３３又は３４のアミノ酸配列の１６番目と２０番目のアミノ酸対が、環を形成したものである、請求項１〜５のいずれかに記載の結合体。
  7. 前記ポリエチレングリコールの両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及び前記オキシントモジュリン誘導体のアミン基又はチオール基に結合する請求項１〜６のいずれかに記載の結合体。
  8. 前記ポリエチレングリコールの両末端に免疫グロブリンＦｃ領域及び前記オキシントモジュリン誘導体と結合し得る反応基を含む請求項１〜７のいずれかに記載の結合体。
  9. 前記免疫グロブリンＦｃ領域が非グリコシル化Ｆｃ領域である請求項１〜８のいずれかに記載の結合体。
  10. 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、
    ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、１つ又は２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（又はヒンジ領域の一部）との組み合わせ、及び重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体からなる群から選択される請求項１〜８のいずれかに記載の結合体。
  11. 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ジスルフィド結合を形成する部位が除去されるか、天然型ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が除去されるか、天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されるか、補体結合部位が除去されるか、又は抗体依存性細胞介在性細胞障害（ＡＤＣＣ）部位が除去された誘導体である、請求項１〜８のいずれかに記載の結合体。
  12. 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来するＦｃ領域である請求項１〜８のいずれかに記載の結合体。
  13. 前記免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ４Ｆｃ領域である請求項１２に記載の結合体。
  14. 前記免疫グロブリンＦｃ領域がヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化Ｆｃ領域である請求項１〜１３のいずれかに記載の結合体。
  15. 請求項１〜１４のいずれかの結合体を含む肥満予防又は治療用薬学的組成物。
  16. 薬学的に許容される担体をさらに含む請求項１５に記載の薬学的組成物。
  17. 前記組成物が、単独で又は他の肥満予防又は治療効果を示す薬学的製剤と併用して投与される請求項１５に記載の薬学的組成物。
  18. 前記薬学的製剤が、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト、レプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）受容体アゴニスト、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、Ｙ５受容体アンタゴニスト、 メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）受容体アンタゴニスト、Ｙ２／３受容体アゴニスト、ＭＣ３／４受容体アゴニスト、胃／膵臓リパーゼ（ｇａｓｔｒｉｃ／ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｌｉｐａｓｅ）阻害剤、５ＨＴ２ｃアゴニスト、β３Ａ受容体アゴニスト、アミリン（Ａｍｙｌｉｎ）受容体アゴニスト、グレリン（Ｇｈｒｅｌｉｎ）アンタゴニスト及びグレリン受容体アンタゴニストからなる群から選択される、請求項１７に記載の薬学的組成物。
  19. 請求項１〜１４のいずれかの結合体又は請求項１５〜１８のいずれかの組成物をヒト以外の個体に投与するステップを含む肥満を予防又は治療する方法。
  20. 肥満の予防又は治療用医薬の製造における請求項１〜１４のいずれかの結合体又は請求項１５〜１８のいずれかの組成物の使用。
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