CN103732616A - 包括泌酸调节肽和免疫球蛋白片段的结合物以及其应用 - Google Patents

包括泌酸调节肽和免疫球蛋白片段的结合物以及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN103732616A
CN103732616A CN201280039781.4A CN201280039781A CN103732616A CN 103732616 A CN103732616 A CN 103732616A CN 201280039781 A CN201280039781 A CN 201280039781A CN 103732616 A CN103732616 A CN 103732616A
Authority
CN
China
Prior art keywords
acid
peptide
seq
immunoglobulin
deleted
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201280039781.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103732616B (zh
Inventor
郑圣烨
金大振
朴晟喜
禹姈银
崔仁荣
权世昌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hanmi Science Co Ltd
Hanmi Holdings Co Ltd
Original Assignee
Hanmi Holdings Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47357296&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN103732616(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Hanmi Holdings Co Ltd filed Critical Hanmi Holdings Co Ltd
Priority to CN201810801214.7A priority Critical patent/CN109306015B/zh
Publication of CN103732616A publication Critical patent/CN103732616A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103732616B publication Critical patent/CN103732616B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及包括泌酸调节肽、免疫球蛋白Fc区和非肽基聚合物的结合物，其中结合物通过非肽基聚合物共价连接泌酸调节肽与免疫球蛋白Fc区而获得，和用于预防或治疗肥胖的包括该结合物的药物组合物。本发明的包括泌酸调节肽和免疫球蛋白Fc的结合物减少食物摄入，抑制胃排空和促进脂解作用而没有副作用，与天然泌酸调节肽不同，并且与天然泌酸调节肽相比还显示优异的受体活化作用和长期可持续性。因此，它可广泛用于肥胖的治疗，具有安全性和有效性。

Description

包括泌酸调节肽和免疫球蛋白片段的结合物以及其应用
技术领域
本发明涉及包括泌酸调节肽和免疫球蛋白片段的结合物以及其应用。更具体地，本发明涉及包括泌酸调节肽、免疫球蛋白Fc区和非肽基聚合物的结合物，其中结合物可通过非肽基聚合物共价连接泌酸调节肽与免疫球蛋白Fc区而获得，和用于预防或治疗肥胖的包括该结合物的药物组合物。
背景技术
近来，经济的增长和生活方式的变化导致饮食习惯改变。当代人超重和肥胖率升高的主要原因是食用高卡路里食品如快餐食品和缺乏锻炼。世界卫生组织（WHO）估测，世界上10亿以上人超重，并且其中至少3亿是临床上的肥胖。具体地，在欧洲每年250,000人并且在世界上每年250万以上人因超重而死亡（世界卫生组织，Global Strategy on Diet，Physical Activity and Health，2004）。
超重和肥胖使血压和胆固醇水平升高，从而引起多种疾病如心血管疾病、糖尿病和关节炎发生或恶化，并且也是儿童或青少年以及成年人动脉硬化、高血压、高脂血或心血管疾病发病率升高的主要原因。
肥胖是引起世界上多种疾病的严重病症。据认为其通过个人努力克服，并且还认为肥胖患者缺乏自制。但是，肥胖难以治疗，因为肥胖是涉及食欲调节和能量代谢的复杂病症。就肥胖治疗而言，应当结合肥胖患者的努力治疗与食欲调节和能量代谢有关的异常表现。已经做出多种尝试以开发能够治疗异常表现的药物。基于这些努力，药物如利莫那班（Rimonabant，Sanofi-Aventis）、西布曲明（Sibutramin，Abbott）、Contrave（Takeda）和奥利司他（Orlistat，Roche）已被开发，但其具有严重副作用或极微弱抗肥胖效果的缺陷。例如，据报告，利莫那班（Sanofi-Aventis）显示中枢神经病症的副作用，西布曲明（Abbott）和Contrave（Takeda）显示心血管副作用，和奥利司他（Roche）显示服用1年仅减重4kg。不幸地，没有可为肥胖患者安全配药的肥胖治疗剂。
已进行多项研究以开发不具有常规抗肥胖药物问题的肥胖治疗剂。近来，胰高血糖素衍生物已经受到大量关注。当血液中的葡萄糖水平由于其他药物或疾病、激素或酶缺乏而下降时，胰腺产生胰高血糖素。胰高血糖素刺激糖原在肝脏中分解，并且促进葡萄糖释放，以使血糖水平升高至正常范围。除增加血糖水平的作用以外，胰高血糖素还抑制食欲和激活脂肪细胞的激素敏感性脂酶（HSL），以促进脂解，从而显示抗肥胖作用。胰高血糖素衍生物之一，类胰高血糖素肽-1（GLP-1），正被开发为糖尿病患者的高血糖治疗剂，并且其发挥作用以刺激胰岛素合成和分泌，抑制胰高血糖素分泌，减缓胃排空，增加葡萄糖利用率，和抑制食物摄入。艾塞那肽-4（Exendin-4）从蜥蜴的毒素中分离，其与GLP-1共有约50%的氨基酸同源性，并且也被报告为激活GLP-1受体，从而缓解糖尿病患者的高血糖。但是，据报告包括GLP-1的抗肥胖药物显示副作用，如呕吐和恶心。
因此，作为GLP-1的替代选择，大量关注已集中于泌酸调节肽——衍生自胰高血糖素前体即前胰高血糖素的肽，其与两种肽——GLP-1和胰高血糖素的受体——结合。泌酸调节肽是有效的抗肥胖治疗手段，因为其如同GLP-1抑制食物摄入，促进饱足感，并且如同胰高血糖素具有脂解活性。
基于泌酸调节肽的双功能，其已被积极地研究作为治疗肥胖的药物。例如，韩国专利号925017公开了包括泌酸调节肽作为治疗超重人的活性成分的药物组合物，其通过口服、胃肠外、粘膜、直肠、皮下或经皮途径给予。但是，已经报告，包括泌酸调节肽的这种抗肥胖药物的体内半衰期短并且治疗效力微弱——即使以高剂量一日三次给予。因此，已经做出多种努力以通过对其修饰提高泌酸调节肽的体内半衰期或对肥胖的治疗作用。
例如，双重激动剂泌酸调节肽（Merck）通过如下制备：用D-丝氨酸替代泌酸调节肽位置2的L-丝氨酸，以增加对二肽基肽酶-IV（DPP-IV）的耐受性；同时在C端连接胆固醇部分，以增加血液半衰期。ZP2929（Zealand）通过如下制备：用D-丝氨酸替代位置2的L-丝氨酸，以增强对DPP-IV的耐受性；用丙氨酸替代位置17的精氨酸，以增强对蛋白酶的耐受性；用赖氨酸替代位置27的蛋氨酸，以增强氧化稳定性；和用天冬氨酸和丙氨酸替代位置20和24的谷氨酰胺并且用丝氨酸替代位置28的天冬酰胺，以增强脱酰胺稳定性。但是，即使增加双重激动剂泌酸调节肽（Merck）的半衰期至显示半衰期比天然泌酸调节肽长8～12分钟，其仍具有很短的体内半衰期1.7hr，并且其给予剂量还高达若干mg/kg。不幸地，由于半衰期短和效力低，泌酸调节肽或其衍生物具有每日高剂量给予的缺陷。
发明内容
技术问题
相应地，本发明人已进行了许多努力来发展增加泌酸调节肽的血液半衰期同时保持其体内活性的方法。因此，发明人发现通过利用非肽基聚合物连接载体与泌酸调节肽而制备的结合物显示提高的血液半衰期同时保持体内活性从而显示极好的抗肥胖作用，由此完成本发明。
技术方案
本发明的目的是提供包括泌酸调节肽、免疫球蛋白Fc区和非肽基聚合物的结合物，其中结合物可通过非肽基聚合物共价连接泌酸调节肽与免疫球蛋白Fc区而获得。
本发明的另一个目的是提供用于肥胖的预防或治疗的包括结合物的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供预防或治疗肥胖的方法，包括将结合物或组合物施用给对象的步骤。
本发明的另一个目的是提供结合物或组合物在制备用于肥胖预防或治疗的药物中的应用。
有益效果
本发明的包括泌酸调节肽和免疫球蛋白Fc的结合物减少食物摄入，抑制胃排空和促进脂解作用而没有副作用，与天然泌酸调节肽不同，并且与泌酸调节肽相比还显示极好的受体活化作用和长期可持续性。因此，它可广泛用于肥胖的治疗，具有安全性和有效性。与天然泌酸调节肽不同，本发明的新的肽减少食物摄入，抑制胃排空和促进脂解作用而没有副作用，并且还显示极好的受体活化作用。因此，它可广泛用于肥胖的治疗，具有安全性和有效性。
附图简述
图1是显示根据泌酸调节肽或泌酸调节肽衍生物的施用剂量的食物摄入变化的图。
图2a是显示通过SOURCE S纯化柱纯化单聚乙二醇化泌酸调节肽的结果的图。
图2b是显示纯化的单聚乙二醇化泌酸调节肽的肽作图结果的图。
图2c是显示通过SOURCE15Q纯化柱纯化包括泌酸调节肽和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图。
图3a是显示通过SOURCE S纯化柱纯化单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQID NO.29)的结果的图。
图3b是显示通过SOURCE15Q纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ IDNO.29)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图。
图4a是显示通过SOURCE S纯化柱纯化单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQID NO.30)的结果的图。
图4b是显示纯化的单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.30)的肽作图结果的图。
图4c是显示通过SOURCE15Q纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ IDNO.30)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图。
图5a是显示通过SOURCE S纯化柱纯化单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQID NO.31)的结果的图。
图5b是显示通过SOURCE15Q纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ IDNO.31)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图。
图6a是显示通过SOURCE S纯化柱纯化单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQID NO.2)的结果的图。
图6b是显示纯化的单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.2)的肽作图结果的图。
图6c是显示通过SOURCE15Q纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ IDNO.2)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图。
图6d是显示通过Source ISO纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.2)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图。
图7a是显示通过SOURCE S纯化柱纯化单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQID NO.3)的结果的图。
图7b是显示纯化的单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.3)的肽作图结果的图。
图7c是显示通过Butyl FF纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.3)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图。
图7d是显示通过Source15Q纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.3)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图。
图8a是显示通过SOURCE S纯化柱纯化单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQID NO.23)的结果的图；
图8b是显示通过Source15Q纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.23)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图；
图8c是显示通过SOURCE ISO纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ IDNO.23)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图；
图9a是显示通过SOURCE S纯化柱纯化单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQID NO.24)的结果的图；
图9b是显示通过Source15Q纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.24)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图；
图9c是显示通过SOURCE ISO纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ IDNO.24)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图；
图10a是显示通过SOURCE S纯化柱纯化单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQID NO.25)的结果的图；
图10b是显示通过Source15Q纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ IDNO.25)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图；
图10c是显示通过SOURCE ISO纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ IDNO.25)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图；
图11a是显示通过SOURCE S纯化柱纯化单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQID NO.28)的结果的图；
图11b是显示通过Source15Q纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ IDNO.28)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图；
图11c是显示通过SOURCE ISO纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ IDNO.28)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图；
图12是显示根据泌酸调节肽衍生物-免疫球蛋白Fc结合物的类型和施用剂量的小鼠体重变化的图。
图13是显示根据泌酸调节肽衍生物-免疫球蛋白Fc结合物的类型和施用剂量的小鼠体重变化的图。
实施本发明的最佳方式
一方面，为了达到以上目的，本发明提供包括泌酸调节肽、免疫球蛋白Fc区和非肽基聚合物的结合物，其中结合物可通过非肽基聚合物共价连接泌酸调节肽与免疫球蛋白Fc区而获得。
如本文所用，术语“结合物”指包括泌酸调节肽和其它因子的结合物。其它因子可以是可引起血液中增加的稳定性、推迟通过肾的排出或其它有用效果的任何物质。在本发明中，因子可以是免疫球蛋白Fc区。优选，结合物可由通过非肽基聚合物连接的泌酸调节肽和免疫球蛋白Fc区组成。非肽基聚合物可通过共价键连接泌酸调节肽和免疫球蛋白Fc区。非肽基聚合物的两个末端可分别连接到免疫球蛋白Fc区的氨基或巯基和泌酸调节肽衍生物。
本发明的结合物指与天然泌酸调节肽相比具有提高的体内效力持续时间，并且长效结合物可包括通过天然泌酸调节肽氨基酸序列的修饰、置换、添加或缺失而制备的泌酸调节肽、结合到可生物降解的聚合物如聚乙二醇(PEG)的泌酸调节肽、结合到长效蛋白如白蛋白或免疫球蛋白的泌酸调节肽、结合到具有结合身体中白蛋白能力的脂肪酸的泌酸调节肽、或包封在可生物降解的纳米颗粒中的泌酸调节肽，但是长效结合物的类型不限于此。
如本文所用，术语“泌酸调节肽”指衍生自胰高血糖素前体、前胰高血糖素的肽，并包括天然泌酸调节肽、前体、衍生物、其片段和其变体。优选，它可具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列(HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA)。
术语“泌酸调节肽变体”是具有一种或多种不同于天然泌酸调节肽序列的氨基酸序列的肽，和指保持活化GLP-1和胰高血糖素受体功能的肽，并且它可通过天然泌酸调节肽部分氨基酸序列中的置换、添加、缺失和修饰中任何一种或通过其组合而制备。
术语“泌酸调节肽衍生物”包括肽、肽衍生物或肽模拟物，其通过泌酸调节肽氨基酸的添加、缺失或置换而制备，与天然泌酸调节肽相比，以高水平活化GLP-1受体和胰高血糖素受体。
术语“泌酸调节肽片段”指在天然泌酸调节肽的N端或C端添加或缺失一个或多个氨基酸的片段，其中非天然存在的氨基酸(例如，D-型氨基酸)可被添加，并且具有活化GLP-1受体和胰高血糖素受体的功能。
泌酸调节肽变体、衍生物和片段的制备方法中的每个可单独或组合使用。例如，本发明包括这样的肽，其具有与天然肽不同的一个或多个氨基酸和N-端氨基酸残基的脱氨基，并且具有活化GLP-1受体和胰高血糖素受体的功能。
本文提到的氨基酸根据IUPAC-IUB的命名规则被如下缩写：
丙氨酸        A      精氨酸      R
天冬酰胺      N      天冬氨酸    D
半胱氨酸      C      谷氨酸      E
谷氨酰胺      Q      甘氨酸      G
组氨酸        H      异亮氨酸    I
亮氨酸        L      赖氨酸      K
甲硫氨酸      M      苯丙氨酸    F
脯氨酸        P      丝氨酸      S
苏氨酸        T      色氨酸      W
酪氨酸        Y      缬氨酸      V
在本发明中，泌酸调节肽衍生物包括任何肽——其通过在泌酸调节肽氨基酸序列(HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA,SEQ ID NO.1)中置换、添加、缺失或翻译后修饰(例如，甲基化、酰化、泛素化、分子内共价结合)而制备以同时活化胰高血糖素和GLP-1受体。氨基酸的置换或添加之后，可使用人类蛋白中通常发现的20种氨基酸中任何一种，以及非典型的或非天然存在的氨基酸。商业上可获得的非典型的氨基酸的来源包括Sigma-Aldrich、ChemPep Inc.和GenzymePharmaceuticals。包括这些氨基酸的肽和非典型的肽序列可被合成和购自商业供应者，例如，American Peptide Company或Bachem(USA)或Anygen(韩国)。
在一个具体实施方式中，本发明的泌酸调节肽衍生物是包括以下式1的氨基酸的新的肽。
R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2(式1)
其中R1是组氨酸、脱氨基-组氨酰、二甲基-组氨酰(N-二甲基-组氨酰)、β-羟基咪唑丙酰基（hydroxyimidazopropionyl）、4-咪唑乙酰基、β-羧基咪唑丙酰基或酪氨酸；
X1是Aib(氨基异丁酸)、d-丙氨酸、甘氨酸、Sar(N-甲基甘氨酸)、丝氨酸或d-丝氨酸；
X2是谷氨酸或谷氨酰胺；
X3是亮氨酸或酪氨酸；
X4是丝氨酸或丙氨酸；
X5是赖氨酸或精氨酸；
X6是谷氨酰胺或酪氨酸；
X7是亮氨酸或甲硫氨酸；
X8是天冬氨酸或谷氨酸；
X9是谷氨酸、丝氨酸、α-甲基-谷氨酸或被删除；
X10是谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸或被删除；
X11是丙氨酸、精氨酸、缬氨酸或被删除；
X12是丙氨酸、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸或被删除；
X13是赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、α-甲基-谷氨酸或被删除；
X14是天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸或被删除；
X15是苯丙氨酸或被删除；
X16是异亮氨酸、缬氨酸或被删除；
X17是丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、α-甲基-谷氨酸或被删除；
X18是色氨酸或被删除；
X19是丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丝氨酸、缬氨酸或被删除；
X20是丙氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或被删除；
X21是天冬酰胺或被删除；
X22是丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸或被删除；
X23是半胱氨酸、赖氨酸或被删除；
X24是具有2至10个氨基酸——由丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的组合组成——的肽，或被删除；和
R2是KRNRNNIA(SEQ ID NO.35)、GPSSGAPPPS(SEQ ID NO.36)、GPSSGAPPPSK(SEQ ID NO.37)、HSQGTFTSDYSKYLD(SEQ ID NO.38)、HSQGTFTSDYSRYLDK(SEQ ID NO.39)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(SEQ IDNO.40)或被删除(如果式1的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同就排除)。
为了提高野生型泌酸调节肽对胰高血糖素受体和GLP-1受体的活性，本发明的肽可用以下置换：4-咪唑乙酰基——其中在SEQ ID NO.1表示的氨基酸序列位置1的组氨酸的α碳被删除；脱氨基-组氨酰——其中N-端氨基被删除；二甲基-组氨酰(N-二甲基-组氨酰)——其中N-端氨基用两个甲基修饰；β-羟基咪唑丙酰基——其中N-端氨基用羟基置换；或β-羧基咪唑丙酰基——其中N-端氨基用羧基置换。此外，GLP-1受体-结合区可用提高疏水和离子键或其组合的氨基酸置换。部分泌酸调节肽序列可用GLP-1或艾塞那肽-4的氨基酸序列置换以提高对GLP-1受体的活性。
进一步，部分泌酸调节肽序列可用稳定α螺旋的序列置换。优选，在式1的氨基酸序列的位置10、14、16、20、24和28的氨基酸可用氨基酸或氨基酸衍生物——由已知稳定α螺旋的Tyr(4-Me)、Phe、Phe(4-Me)、Phe(4-Cl)、Phe(4-CN)、Phe(4-NO2)、Phe(4-NH2)、Phg、Pal、Nal、Ala(2-噻吩基)和Ala(苯并噻吩基)组成——置换，并且对将被插入的稳定α螺旋的氨基酸或氨基酸衍生物的类型和数目没有限制。优选，在位置10和14、12和16、16和20、20和24以及24和28的氨基酸可分别用谷氨酸或赖氨酸置换以形成环，并且对将被插入的数目没有限制。最优选，肽可以是具有选自以下式1至6的氨基酸序列的肽。
在一个具体实施方式中，本发明的泌酸调节肽衍生物是包括以下式2的氨基酸序列的新的肽，其中泌酸调节肽的氨基酸序列用艾塞那肽或GLP-1的氨基酸序列置换。
R1-A-R3(式2)
在另一个具体实施方式中，本发明的泌酸调节肽衍生物是包括以下式3的氨基酸序列的新的肽，其通过适当的氨基酸连接体连接泌酸调节肽的部分氨基酸序列和艾塞那肽或GLP-1的部分氨基酸序列而制备。
R1-B-C-R4(式3)
仍在另一个具体实施方式中，本发明的泌酸调节肽衍生物是包括以下式4的氨基酸序列的新的肽，其中泌酸调节肽的部分氨基酸序列用能提高与GLP-1受体的结合亲和性的氨基酸置换，例如，在位置26的Leu——其通过疏水相互作用与GLP-1受体结合——用疏水残基，Ile或Val置换。
R1-SQGTFTSDYSKYLD-D1-D2-D3-D4-D5-LFVQW-D6-D7-N-D8-R3(式4)
仍在另一个具体实施方式中，本发明的泌酸调节肽衍生物是包括以下式5的新的肽，其中部分氨基酸序列被删除、添加或用其它氨基酸置换以提高天然泌酸调节肽对GLP-1受体和胰高血糖素受体的活性。
R1-E1-QGTFTSDYSKYLD-E2-E3-RA-E4-E5-FV-E6-WLMNT-E7-R5(式5)
在式2至5中，R1与式1的描述中相同；
A选自SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQ ID NO.41)、SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT(SEQ ID NO.42)、SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT(SEQ ID NO.43)、GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG(SEQ ID NO.44)、GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG(SEQ ID NO.45)、GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA(SEQ ID NO.46)和SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG(SEQ ID NO.47)；
B选自SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQ ID NO.41)、SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT(SEQ ID NO.42)、SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT(SEQ ID NO.43)、GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG(SEQ ID NO.44)、GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG(SEQ ID NO.45)、GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA(SEQ ID NO.46)、SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG(SEQ ID NO.47)、GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEW(SEQ ID NO.48)和SQGTFTSDYSRYLD(SEQ IDNO.49)；
C是具有2至10个氨基酸——由丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的组合组成——的肽；
D1是丝氨酸、谷氨酸或精氨酸；
D2是精氨酸、谷氨酸或丝氨酸；
D3是精氨酸、丙氨酸或缬氨酸；
D4是精氨酸、缬氨酸或丝氨酸；
D5是谷氨酰胺、精氨酸或赖氨酸；
D6是异亮氨酸、缬氨酸或丝氨酸；
D7是甲硫氨酸、精氨酸或谷氨酰胺；
D8是苏氨酸、甘氨酸或丙氨酸；
E1是丝氨酸、Aib、Sar、d-丙氨酸或d-丝氨酸；
E2是丝氨酸或谷氨酸；
E3是精氨酸或赖氨酸；
E4是谷氨酰胺或赖氨酸；
E5是天冬氨酸或谷氨酸；
E6是谷氨酰胺、半胱氨酸或赖氨酸；
E7是半胱氨酸、赖氨酸或被删除；
R3是KRNRNNIA(SEQ ID NO.35)、GPSSGAPPPS(SEQ ID NO.36)或GPSSGAPPPSK(SEQ ID NO.37)；
R4是HSQGTFTSDYSKYLD(SEQ ID NO.38)、HSQGTFTSDYSRYLDK(SEQ IDNO.39)或HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(SEQ ID NO.40)；和，
R5是KRNRNNIA(SEQ ID NO.35)、GPSSGAPPPS(SEQ ID NO.36)、GPSSGAPPPSK(SEQ ID NO.37)或被删除(如果式2至5的氨基酸序列与SEQ IDNO.1的氨基酸序列相同则排除)。
优选，本发明的泌酸调节肽衍生物可以是以下式6的新的肽。
R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2(式6)
其中R1是组氨酸、脱氨基-组氨酰、4-咪唑乙酰基或酪氨酸；
X1是Aib(氨基异丁酸)、甘氨酸或丝氨酸；
X2是谷氨酸或谷氨酰胺；
X3是亮氨酸或酪氨酸；
X4是丝氨酸或丙氨酸；
X5是赖氨酸或精氨酸；
X6是谷氨酰胺或酪氨酸；
X7是亮氨酸或甲硫氨酸；
X8是天冬氨酸或谷氨酸；
X9是谷氨酸、α-甲基-谷氨酸或被删除；
X10是谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或被删除；
X11是丙氨酸、精氨酸或被删除；
X12是丙氨酸、缬氨酸或被删除；
X13是赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、α-甲基-谷氨酸或被删除；
X14是天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸或被删除；
X15是苯丙氨酸或被删除；
X16是异亮氨酸、缬氨酸或被删除；
X17是丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、α-甲基-谷氨酸或被删除；
X18是色氨酸或被删除；
X19是丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或被删除；
X20是丙氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、精氨酸或被删除；
X21是天冬酰胺或被删除；
X22是苏氨酸或被删除；
X23是半胱氨酸、赖氨酸或被删除；
X24是具有2至10个氨基酸——由甘氨酸组成——的肽，或被删除；和
R2是KRNRNNIA(SEQ ID NO.35)、GPSSGAPPPS(SEQ ID NO.36)、GPSSGAPPPSK(SEQ ID NO.37)、HSQGTFTSDYSKYLD(SEQ ID NO.38)、HSQGTFTSDYSRYLDK(SEQ ID NO.39)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(SEQ IDNO.40)或被删除(如果式6的氨基酸序列与SEQ ID NO.1的氨基酸序列相同就排除)。
更优选，本发明的泌酸调节肽衍生物可以选自SEQ ID NOs.2至34的肽。更优选，本发明的泌酸调节肽衍生物可以是实施例2-1的表1中描述的泌酸调节肽衍生物。
泌酸调节肽具有两种肽——GLP-1和胰高血糖素——的活性。GLP-1降低血糖，减少食物摄入和抑制胃排空，胰高血糖素增加血糖，促进脂解作用和通过增加能量代谢而降低体重。两种肽的不同生物学效应可引起不希望有的效应，例如，在胰高血糖素显示较GLP-1更占优势的效应的情况下，增加血糖，或者在GLP-1显示较胰高血糖素更占优势的效应的情况下，引起恶心和呕吐。例如，下面的实施例10中产生的结合物较实施例12中产生的结合物对GLP-1受体显示更大的亲和性，但是前者的效力较后者低，如实施例18中体内试验中所显示的。这可能由于与实施例12中胰高血糖素受体有关的结合物的增加的效力，尽管其低的效力与GLP-1受体有关。因此，本发明的泌酸调节肽衍生物和它们的结合物不限于显示活性无条件增加的那些衍生物。例如，氨基酸可在泌酸调节肽的位置1和11被修饰，已知其抑制胰高血糖素的活性，以控制胰高血糖素和GLP-1之间的活性比。
本发明的结合物可引起血液中增加的稳定性，推迟通过肾的排出，并通过共价键连接载体与泌酸调节肽或形成微球而改变对受体的亲和性。可形成含有泌酸调节肽的结合物的载体可选自白蛋白、转铁蛋白、抗体、抗体片段、弹性蛋白、肝素、多糖如壳多糖、纤连蛋白和最有利地免疫球蛋白Fc区，当结合泌酸调节肽时，所有这些可增加结合物的血液半衰期。
术语“免疫球蛋白Fc区”如本文所用，指含有免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)的蛋白，排除免疫球蛋白的重链和轻链可变区、重链恒定区1(CH1)和轻链恒定区1(CL1)。它可进一步包括在重链恒定区的铰链区。并且，本发明的免疫球蛋白Fc区可含有部分或全部Fc区——包括重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)，除重链和轻链可变区外，只要它具有与天然蛋白基本相似或比天然蛋白更好的生理功能。并且，免疫球蛋白Fc区可以是在CH2和/或CH3氨基酸序列的相对长的部分具有缺失的片段。即，本发明的免疫球蛋白Fc区可包括1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域；2)CH1结构域和CH2结构域；3)CH1结构域和CH3结构域；4)CH2结构域和CH3结构域；5)一个或多个结构域和免疫球蛋白铰链区(或部分铰链区)的组合；和6)重链恒定区与轻链恒定区中的每个结构域的二聚体。
本发明的免疫球蛋白Fc区包括天然氨基酸序列和其序列衍生物(突变体)。氨基酸序列衍生物是由于一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、非保守的或保守的置换或其组合而不同于天然氨基酸序列的序列。例如，在IgG Fc中，已知在结合中重要的在位置214至238、297至299、318至322或327至331的氨基酸残基可用作合适的修饰靶标。
并且，其它多种衍生物是可能的，包括一种衍生物，其中能形成二硫键的区域被缺失，或某些氨基酸残基在天然Fc形式的N-末端被除去或甲硫氨酸残基被添加到那里。进一步，为了去除效应子作用，缺失可发生在互补-结合位点，如C1q-结合位点和ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)位点。制备这样的免疫球蛋白Fc区的序列衍生物的技术在WO97/34631和WO96/32478中被公开。
蛋白和肽中氨基酸交换——这通常不改变蛋白或肽的活性——在现有技术中已知(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最通常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly，以双方向进行。此外，Fc区，如果期望，可通过磷酸化、硫酸化、丙烯酰化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等而被修饰。
前面提到的Fc衍生物是这样的衍生物，其具有与本发明的Fc区相同的生物学活性或提高的结构稳定性，例如，抵抗热、pH等。
此外，这些Fc区可获自从人和其它动物包括母牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠分离的天然形式，或可以是其重组体或衍生物，获自转化的动物细胞或微生物。这里，它们可通过从人或动物机体分离所有的免疫球蛋白和用蛋白水解酶处理它们而从天然的免疫球蛋白获得。木瓜蛋白酶将天然的免疫球蛋白消化成Fab和Fc区，胃蛋白酶处理导致pF'c和F(ab)2片段的产生。可将这些片段进行，例如，尺寸排阻层析以分离Fc或pF'c。优选，人-来源的Fc区是获自微生物的重组免疫球蛋白Fc区。
此外，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是具有天然糖链、与天然形式相比增加的糖链或与天然形式相比减少的糖链的形式，或可以是去糖基化形式。免疫球蛋白Fc糖链的增加、减少或去除可通过本领域通常的方法获得，如化学方法、酶法和利用微生物的基因工程方法。糖链从Fc区的去除导致对第一补体成分C1的C1q部分的结合亲和性急剧降低以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性的降低或丧失，由此不引起体内不必要的免疫应答。从这一点上，去糖基化或无糖基化形式的免疫球蛋白Fc区作为药物载体可更适合本发明的目的。
如本文所用，术语“去糖基化”指从Fc区酶促去除糖部分，术语“无糖基化”指Fc区通过原核生物，优选大肠杆菌（E.coli）以未糖基化的形式产生。
同时，免疫球蛋白Fc区可源自人或其它动物——包括母牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠，优选源自人。
此外，免疫球蛋白Fc区可以是衍生自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc区，或由其组合或其杂合物制成的Fc区。优选，它衍生自IgG或IgM，其在人血液中最丰富的蛋白之中，并且最优选衍生自IgG，已知其提高配体-结合蛋白的半衰期。
另一方面，术语“组合”，如本文所用，指将编码相同起源的单链免疫球蛋白Fc区的多肽与不同起源的单链多肽连接以形成二聚体或多聚体。即，二聚体或多聚体可以从选自IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc和IgE Fc片段的两个或多个片段形成。
术语“非肽基聚合物”指包括两个或多个重复单位的生物相容性聚合物，该重复单位通过除肽键外的任何共价键彼此连接。在本发明中，非肽基聚合物可以与非肽基连接体可互换地使用。
用于本发明的非肽基聚合物可以选自可生物降解的聚合物、脂质聚合物、壳多糖、透明质酸和其组合，优选，可生物降解的聚合物可以是聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯多化元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、聚乳酸(PLA)或聚乳酸乙醇酸(PLGA)，更优选，是聚乙二醇(PEG)。此外，本领域已知的其衍生物和容易通过本领域已知的方法制备的衍生物可包括在本发明的范围中。
用于通过常规的框内融合方法获得的融合蛋白的肽连接体具有这样的缺点：它容易在体内被蛋白水解酶切割，并因此不能如期望的获得通过载体增加活性药物血清半衰期的充分作用。然而，在本发明中，对蛋白水解酶具有抵抗的聚合物可用于保持与载体相似的肽的血清半衰期。因此，任何非肽基聚合物可以没有限制地使用，只要它是具有前面提到的功能的聚合物，即，对体内蛋白水解酶具有抵抗的聚合物。非肽基聚合物具有1至100kDa和优选1至20kDa的分子量。本发明的非肽基聚合物——与免疫球蛋白Fc区连接——可以是一种聚合物或不同类型聚合物的组合。
用于本发明的非肽基聚合物具有能结合免疫球蛋白Fc区和蛋白质药物的反应基团。非肽基聚合物在两端都具有反应基团，其优选选自反应性醛、丙醛、丁醛、马来酰亚胺和琥珀酰亚胺衍生物。琥珀酰亚胺衍生物可以是琥珀酰亚胺丙酸盐、羟基琥珀酰亚胺、琥珀酰亚胺羧甲基或琥珀酰亚胺碳酸盐。特别地，当非肽基聚合物在其两端都具有反应性醛基时，它有效地在两端用最小非特异性反应连接生理学上有活性的多肽和免疫球蛋白。由通过醛键的还原烷基化产生的最终产物较通过酰胺键连接的产物稳定的多。醛反应基团选择性地在低pH结合N端和在高pH，如pH9.0结合赖氨酸残基以形成共价键。在非肽基聚合物两端的反应基团可以相同或不同。例如，非肽基聚合物可以在一端具有马来酰亚胺基团和在另外一端具有醛基、丙醛基或丁醛基。当在其两端都具有反应性羟基的聚乙二醇用作非肽基聚合物时，羟基可通过已知的化学反应被活化成多种反应基团，或具有商业上可获得的修饰的反应基团的聚乙二醇可被利用以制备本发明的长效结合物。
本发明的结合物可以是这样的，其具有两个反应性端基的非肽基聚合物的两端分别与免疫球蛋白Fc区和泌酸调节肽衍生物的胺基或巯基连接。
非肽基聚合物在两端具有反应基团，其优选选自反应性醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物。琥珀酰亚胺衍生物可以是琥珀酰亚胺丙酸盐、羟基琥珀酰亚胺、琥珀酰亚胺羧甲基或琥珀酰亚胺碳酸盐。
非肽基聚合物的两个反应性端基可以彼此相同或不同。例如，非肽聚合物可在一端具有马来酰亚胺基，在另外一端具有醛基、丙醛基或丁醛基。例如，当非肽基聚合物在一个端基具有反应性醛基和在另一个端基具有马来酰亚胺时，它有效地在两端以最小非特异性反应连接生理学上有活性的多肽和免疫球蛋白。根据本发明的实施例，结合物通过利用PEG通过共价键连接泌酸调节肽或其衍生物和免疫球蛋白Fc区而制备，PEG是非肽基聚合物，包括单独的丙醛基或马来酰亚胺基和醛基。
本发明的结合物与天然泌酸调节肽相比对GLP-1受体和胰高血糖素受体显示优异的活性，并且血液半衰期由于与Fc区连接而增加，从而长时期保持体内活性。
仍在另一方面，本发明提供用于肥胖的预防或治疗的包括肽的药物组合物。
如本文所用，术语“预防”指疾病出现被抑制或阻止的所有作用。在本发明中，“预防”指来自体重或体脂增加这样的因素的肥胖出现通过本发明的结合物的施用被抑制或阻止。
如本文所用，术语“治疗”指疾病症状已被缓和、改善或减轻的所有作用。在本发明中，“治疗”指肥胖症状通过本发明的结合物的施用而被缓和、改善或减轻，导致体重或体脂的减少。
如本文所用，术语“肥胖”意味着过量脂肪组织在身体中积累，并且身体质量指数（体重（kg）除以身高的平方（m））在25以上被认为是肥胖。肥胖通常由能量失衡引起——当饮食摄入量长期超过能量消耗量时。肥胖是影响全身的代谢疾病，并且增加糖尿病、高脂血、性功能障碍、关节炎和心血管疾病的风险，而且在一些情况下与癌症发生有关。
本发明的结合物——其通过将泌酸调节肽或其衍生物与免疫球蛋白Fc区连接而制备——显示对胰高血糖素和GLP-1受体的优异的结合亲和性(表3)和对体内蛋白水解酶的优异的抵抗从而展示了长期的体内活性，由此显示优异的抗肥胖作用如体重减少(图12)。
本发明的药物组合物可进一步包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。如本文所用，术语“药学上可接受的”意为组合物足以实现治疗作用，而无有害副作用，并且可容易根据以下确定：疾病类型、患者年龄，体重、健康状况、性别和药物敏感性、给予途径、给予模式、给予频率、治疗持续时间、与本发明组合物组合或同时服用的药物以及药物已知的其他因素。
包括本发明的衍生物的药物组合物可进一步包括药学上可接受的载体。对于口服给予而言，载体可包括，但不限于、粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂和调味剂。对于注射制剂而言，载体可包括缓冲剂、防腐剂、止痛剂、增溶剂、等渗剂和稳定剂。对于局部给予制剂而言，载体可包括基质、赋形剂、润滑剂和防腐剂。
本发明的组合物可与上述药学上可接受的载体组合配制成多种剂型。例如，对于口服给予而言，药物组合物可被配制成片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆或糯米纸嚢剂。对于注射制剂而言，药物组合物可被配制在安瓿瓶中作为单剂型或被配制在多剂量容器中。药物组合物还可被配制成溶液、悬浮剂、片剂、丸剂、胶囊和长效制剂。
另一方面，适于药物制剂的载体、赋形剂和稀释剂的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶橡胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。此外，药物制剂可进一步包括填充剂、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、调味剂和抗菌剂。
进一步，本发明的药物组合物可以具有选自下列的任何制剂：片剂、丸剂、粉末、颗粒、胶囊、悬浮剂、内用液体（liquids for internal use）、乳剂、糖浆、无菌水溶液、非水性溶剂、冻干制剂和栓剂。
进一步，组合物可被配制成适于患者身体的单剂型，并且优选被配制成根据制药领域的一般方法可用于肽药物的制剂，从而通过口服或胃肠外途径给予，如通过皮肤、静脉内、肌内、动脉内、髓内、髓内、心室内、肺部、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、结肠内、局部、舌下、阴道或直肠给予，但不限于此。
组合物可通过与多种药学上可接受的载体如生理盐水或有机溶剂混合被应用。为增加稳定性或吸收性，可应用碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖、抗氧化剂如抗坏血酸或谷胱甘肽、螯合剂、低分子量蛋白质、或其他稳定剂。
本发明药物组合物的给予剂量和频率由活性成分类型连同各种因素如所治疗疾病、给予途径、患者年龄、性别和体重以及疾病严重程度确定。
根据分级治疗方案，有效总剂量的本发明组合物可被以单剂量给予至患者，或可被以多剂量长期给予。在本发明的药物组合物中，活性成分的含量可根据疾病严重程度而不同。优选地，本发明的肽的总日剂量可以为每1kg患者体重约0.0001μg至500mg。但是，除药物组合物的给予途径和治疗频率以外，肽的有效剂量还考虑多种因素而确定：包括患者年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重程度、饮食和分泌速率。鉴于此，本领域技术人员可容易确定适于本发明药物组合物的具体应用的有效剂量。根据本发明的药物组合物不具体地限于该制剂和给予途径和模式，只要其显示本发明的作用。
本发明的药物组合物显示优异的体内效力持续时间和滴度，从而显著减少其给予数量和频率。
此外，药物组合物可被单独或与对肥胖显示预防或治疗作用的其他药物制剂组合或同时给予。对肥胖显示预防或治疗作用的药物制剂不被具体限制，并且可包括GLP-1受体激动剂、瘦蛋白受体激动剂、DPP-IV抑制剂、Y5受体拮抗剂、黑素集中激素（MCH）受体拮抗剂、Y2/3受体激动剂、MC3/4受体激动剂、胃/胰脂酶抑制剂、5HT2c激动剂、β3A受体激动剂、支链淀粉受体激动剂、生长素释放钛拮抗剂和/或生长素释放钛受体拮抗剂。
再一方面，本发明提供预防或治疗肥胖的方法，包括步骤：给予对象所述结合物或包括所述结合物的药物组合物。
如本文所用，术语“施用”指通过某个合适的方法将预定量的物质引入患者。本发明的组合物可通过任何通常的途径施用，只要它能到达期望的组织，例如，但不限于，腹膜内、静脉内、肌肉内、皮下、真皮内、经口、局部、鼻内、肺内或直肠内施用。然而，由于肽在口服给药之后被消化，用于口服给药的组合物的活性成份应被包被或配制，以抵抗在胃中分解。
在本发明中，术语“对象”是疑患肥胖的对象，意为患有肥胖或有肥胖可能性的哺乳动物，包括人、鼠和家畜。但是，任何用本发明的肽或药物组合物治疗的对象被无限制地包括在内。包括本发明的肽的药物组合物被给予疑患肥胖的对象，从而有效地治疗对象。肥胖如上所述。
本发明的治疗方法可包括步骤：以药学上有效的量给予包括所述肽的组合物。总日剂量应当通过医师做出的适当医学判断被确定，并且被给予一次或数次。在本发明的目标方面，针对任何具体患者的具体治疗有效剂量水平可取决于医药领域公知的各种因素而不同，包括所要实现的响应种类和程度、具体组合物——根据是否有其他试剂与之一起被应用、患者年龄、体重、健康状况、性别和饮食、给予次数和途径、组合物的分泌速率、治疗时间段、与本发明的组合物组合或同时应用的其他药物等本领域公知的类似因素。
再一方面，本发明提供所述结合物或包括所述结合物的药物组合物在制备用于预防或治疗肥胖的药物中的应用。
发明实施方式
在下文中，将参考下列实施例更详细地描述本发明。但是，这些实施例仅以示例为目的，本发明不意图被这些实施例限制。
实施例1.体外激活的细胞系的制备
实施例1-1：对GLP-1显示cAMP响应的细胞系的制备
利用相应于人GLP-1受体基因的cDNA（OriGene Technologies，Inc.USA）的ORF（开放阅读框）的区域作为模板，和下列包括各HindIII和EcoRI限制性位点的正向和反向引物，进行PCR，从而获得PCR产物。
正向引物：5'-CCCGGCCCCCGCGGCCGCTATTCGAAATAC-3'（SEQ ID NO.47）
反向引物：5'-GAACGGTCCGGAGGACGTCGACTCTTAAGATAG-3'（SEQ ID NO.48）
将PCR产物克隆到已知的动物细胞表达载体x0GC/dhfr中，以制备重组载体x0GC/GLP1R。
利用Lipofectamine（Invitrogen，USA），将在DMEM/F12（10%FBS）培养基中培养的CHO DG44细胞系用重组载体x0GC/GLP1R转染，并在包含1mg/mL G418和10nM氨甲蝶呤的选择培养基中培养。通过限制稀释技术从中选择单克隆细胞系，并且最终从中选择以浓度依赖性方式对GLP-1显示优异cAMP响应的细胞系。
实施例1-2：对胰高血糖素显示cAMP响应的细胞系的制备
利用相应于人胰高血糖素受体基因的cDNA（OriGene Technologies，Inc.USA）的ORF的区域作为模板，和下列包括各EcoRI和XhoI限制性位点的正向和反向引物，进行PCR，从而获得PCR产物。
正向引物：5'-CAGCGACACCGACCGTCCCCCCGTACTTAAGGCC-3'（SEQ IDNO.49）
反向引物：5'-CTAACCGACTCTCGGGGAAGACTGAGCTCGCC-3'（SEQ ID NO.50）
将PCR产物克隆到已知的动物细胞表达载体x0GC/dhfr中，以制备重组载体x0GC/GCGR。
利用Lipofectamine，将在DMEM/F12（10%FBS）培养基中培养的CHO DG44细胞系用重组载体x0GC/GCGR转染，并在包含1mg/mL G418和10nM氨甲蝶呤的选择培养基中培养。通过限制稀释技术从中选择单克隆细胞系，并且最终从中选择以浓度依赖性方式对胰高血糖素显示优异的cAMP响应的细胞系。
实施例2.泌酸调节肽衍生物的体外活性的测试
实施例2-1：泌酸调节肽衍生物的合成
为测量泌酸调节肽衍生物的体外活性，合成具有下列氨基酸序列的泌酸调节肽衍生物（表1）。
表1
泌酸调节肽和泌酸调节肽衍生物
SEQ ID NO. 氨基酸序列
SEQ ID NO.1 HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA
SEQ ID NO.2 CA-SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNTKRNRNNIA
SEQ ID NO.3 CA-SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNTGPSSGAPPPS
SEQ ID NO.4 CA-GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS
SEQ ID NO.5 CA-GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS
SEQ ID NO.6 CA-GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAAHSQGTFTSDYSKYLD
SEQ ID NO.7 CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIEWLMNTK
SEQ ID NO.8 CA-SQGTFTSDLSRQLEEEAVRLFIEWLMNK
SEQ ID NO.9 CA-GQGTFTSDYSRYLDEEAVXLFIEWLMNTKRNRNNIA
SEQ ID NO.10 CA-SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNGGPSSGAPPPSK
SEQ ID NO.11 CA-GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAAHSQGTFTSDYSRYLDK
SEQ ID NO.12 CA-SQGTFTSDYSRYLDGGGHGEGTFTSDLSKQMEEEAVK
SEQ ID NO.13 CA-SQGTFTSDYSRYLDXEAVXLFIEWLMNTK
SEQ ID NO.14 CA-GQGTFTSDYSRYLDEEAVXLFIXWLMNTKRNRNNIA
SEQ ID NO.15 CA-GQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIXWLMNTKRNRNNIA
SEQ ID NO.16 CA-SQGTFTSDLSRQLEGGGHSQGTFTSDLSRQLEK
SEQ ID NO.17 CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIEWIRNTKRNRNNIA
SEQ ID NO.18 CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIEWIRNGGPSSGAPPPSK
SEQ ID NO.19 CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVKLFIEWIRNTKRNRNNIA
SEQ ID NO.20 CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVKLFIEWIRNGGPSSGAPPPSK
SEQ ID NO.21 CA-SQGTFTSDYSRQLEEEAVRLFIEWVRNTKRNRNNIA
SEQ ID NO.22 DA-SQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTK
SEQ ID NO.23 HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVCWLMNT
SEQ ID NO.24 HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC
SEQ ID NO.25 HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC
SEQ ID NO.26 HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC
SEQ ID NO.27 HAibQGTFTSDYSKYLDEQAAKEFICWLMNT
SEQ ID NO.28 HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNT
SEQ ID NO.29 H(d)SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA
SEQ ID NO.30 CA-SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA
SEQ ID NO.31 CA-(d)SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA
SEQ ID NO.32 CA-AibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC
SEQ ID NO.33 HAibQGTFTSDYAKYLDEKRAKEFVQWLMNTC
SEQ ID NO.34 YAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC
在表1中，粗体和下划线的氨基酸表示环形成，X表示的氨基酸意为非天然氨基酸，α-甲基-谷氨酸。此外，CA表示4-咪唑基乙酰基，和DA表示脱氨基-组氨酰基。
实施例2-2：体泌酸调节肽衍生物的外活性测试
为测量实施例2-1中合成的泌酸调节肽衍生物的抗肥胖效力，利用实施例1-1和1-2中制备的细胞系体外测量细胞活性。
该细胞系是通过转染CHO（中国仓鼠卵巢）以分别表达人GLP-1受体基因和胰高血糖素受体基因而制备的细胞系。因此，其适于测量GLP-1和胰高血糖素活性。因此，各泌酸调节肽衍生物的活性利用各转化细胞系测量。
具体地，各细胞系一周传代培养两次或三次，并且以1×105的密度等分在96孔板的各孔中，然后培养24小时。
将培养的细胞用KRB缓冲液洗涤，并悬浮在包含1mM IBMX的40ml KRB缓冲液中，在室温下留置5分钟。通过5倍连续稀释将泌酸调节肽（SEQ ID NO.1）和泌酸调节肽衍生物（由SEQ ID NOs.2-6、8、10-13、17、18、23-25、27、28和32-34表示）从1000nM稀释至0.02nM，并将其每种40mL加入细胞，在37℃下、CO2培育箱中培养1小时。然后，添加20mL细胞裂解缓冲液以进行细胞裂解，并将细胞裂解物用于cAMP分析试剂盒（Molecular Device，USA）以测量cAMP浓度。由此计算EC50值，并相互比较。EC50值显示在下表2中。
表2
泌酸调节肽和泌酸调节肽衍生物之间的对GLP-1受体和胰高血糖素受体的体外活性的比较
Figure BDA0000466027580000191
如表2所示，与SEQ ID NO.1的天然泌酸调节肽相比，泌酸调节肽衍生物显示优异的体外活性和对GLP-1受体和胰高血糖素受体不同的活性比。
已知泌酸调节肽激活GLP-1受体和胰高血糖素受体以抑制食欲，促进脂解，和促进饱足感，从而显示抗肥胖作用。根据本发明的泌酸调节肽衍生物显示对GLP-1受体和胰高血糖素受体的体外活性均高于野生型泌酸调节肽，因此可用作肥胖治疗剂，并且效力高于已知泌酸调节肽。
实施例3.泌酸调节肽衍生物的体内活性测试
为测量泌酸调节肽衍生物的体内治疗活性，考察通过给予泌酸调节肽衍生物的ob/ob小鼠食物摄入的变化——利用天然泌酸调节肽作为对照。
具体地，肥胖型糖尿病ob/ob小鼠——常用于测试治疗剂对于肥胖和糖尿病的效力，被禁食16小时，并被给予1或10mg/kg泌酸调节肽或0.02、0.1、1或10mg/kgSEQ ID NO.2的泌酸调节肽衍生物。然后，观察食物摄入2小时（图1）。图1是显示根据泌酸调节肽或泌酸调节肽衍生物给予剂量的食物摄入变化的图。如图1所示，给予1mg/kg泌酸调节肽衍生物对食物摄入显示出比给予10mg/kg泌酸调节肽更优异的抑制作用。
总之，本发明的泌酸调节肽衍生物具有远高于野生型泌酸调节肽的抗肥胖作用——即使以较低剂量被给予，这表明野生型泌酸调节肽显示较低抗肥胖作用并且应当被一日三次以高剂量给予的问题得到改善。
实施例4：包括泌酸调节肽和免疫球蛋白Fc的结合物的制备
首先，为了用3.4K PropionALD(2)PEG(具有两个丙醛基团的PEG，NOF，日本)进行泌酸调节肽(SEQ ID NO.1)氨基酸序列位置30的赖氨酸残基的聚乙二醇化，将泌酸调节肽和3.4K PropionALD(2)PEG以1：12的摩尔比、5mg/ml的蛋白浓度在4℃反应4.5小时。这时，反应在100mM硼酸钠缓冲剂(pH9.0)和45%异丙醇的溶剂混合物中进行，并向其中加入20mM氰基硼氢钠(氰基硼氢化物(SCB,NaCNBH3)，NaCNBH3)作为还原剂。反应完成之后，将反应混合物应用于SOURCE S(XK16,Amersham Biosciences)以纯化具有单聚乙二醇化赖氨酸的泌酸调节肽(柱：SOURCES(XK16,Amersham Biosciences)，流速：2.0ml/min，梯度：A0→3%1min B→40%222min B(A：20mM柠檬酸钠，pH3.0+45%乙醇，B：A+1M KCl))(图2a)。图2a是显示通过SOURCE S纯化柱纯化单聚乙二醇化泌酸调节肽的结果的图。洗脱峰的单聚乙二醇化通过SDS-PAGE检测，赖氨酸选择性通过利用Asp-N蛋白酶的肽作图检测(图2b)。图2b是显示纯化的单聚乙二醇化泌酸调节肽的肽作图结果的图。
接下来，将纯化的单聚乙二醇化泌酸调节肽和免疫球蛋白Fc以1：10的摩尔比、20mg/ml的蛋白浓度在4℃反应16小时。这时，将反应在100mM磷酸钾缓冲剂(pH6.0)中进行，并向其中加入20mM SCB作为还原剂。反应完成之后，将反应混合物应用于SOURCE15Q纯化柱以纯化包括泌酸调节肽和免疫球蛋白Fc的结合物(柱：SOURCE15Q(XK16,Amersham Biosciences)，流速：2.0ml/min，梯度：A0→20%100min B(A：20mM Tris-HCl,pH7.5,B：A+1M NaCl))(图2c)。图2c是显示纯化包括泌酸调节肽和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图。
实施例5：包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.29)和免疫球蛋白Fc的结合物的制备
首先，为了用3.4K PropionALD(2)PEG进行泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.29)氨基酸序列位置30的赖氨酸残基的聚乙二醇化，将泌酸调节肽(SEQ ID NO.29)和3.4K PropionALD(2)PEG以1：12的摩尔比、5mg/ml的蛋白浓度在4℃反应4.5小时。这时，反应在100mM硼酸钠缓冲剂(pH9.0)和45%异丙醇的溶剂混合物中进行，并向其中加入20mM SCB作为还原剂。反应完成之后，将反应混合物应用于SOURCES以纯化具有单聚乙二醇化赖氨酸的泌酸调节肽衍生物(柱：SOURCE S(XK16,Amersham Biosciences)，流速：2.0ml/min，梯度：A0→3%1min B→40%222min B(A：20mM柠檬酸钠，pH3.0+45%乙醇，B：A+1M KCl))(图3a)。图3a是显示通过SOURCE S纯化柱纯化单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.29)的结果的图。
接下来，将纯化的单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.29)和免疫球蛋白Fc以1：10的摩尔比、20mg/ml的蛋白浓度在4℃反应16小时。这时，将反应在100mM磷酸钾缓冲剂(pH6.0)中进行，并向其中加入20mM SCB作为还原剂。反应完成之后，将反应混合物应用于SOURCE15Q纯化柱以纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.29)和免疫球蛋白Fc的结合物(柱：SOURCE15Q，流速：2.0ml/min，梯度：A0→20%100min B(A：20mM Tris-HCl,pH7.5,B：A+1M NaCl))(图3b)。图3b是显示纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.29)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图。
实施例6：包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.30)和免疫球蛋白Fc的结合物的制备
首先，为了用3.4K PropionALD(2)PEG进行泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.30)氨基酸序列位置30的赖氨酸残基的聚乙二醇化，将泌酸调节肽(SEQ ID NO.30)和3.4K PropionALD(2)PEG以1：15的摩尔比、3mg/ml的蛋白浓度在4℃反应4.5小时。这时，反应在100mM HEPES缓冲剂(pH7.5)和45%异丙醇的溶剂混合物中进行，并向其中加入20mM SCB作为还原剂。反应完成之后，将反应混合物应用于SOURCES纯化柱以纯化具有单聚乙二醇化赖氨酸的泌酸调节肽衍生物(柱：SOURCE S，流速：2.0ml/min，梯度：A0→3%1min B→40%222min B(A：20mM柠檬酸钠，pH3.0+45%乙醇，B：A+1M KCl))(图4a)。图4a是显示通过SOURCE S纯化柱纯化单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.30)的结果的图。洗脱峰的单聚乙二醇化通过SDS-PAGE检测，赖氨酸选择性通过利用Asp-N蛋白酶的肽作图检测(图4b)。图4b是显示纯化的单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.30)的肽作图结果的图。
接下来，将纯化的单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.30)和免疫球蛋白Fc以1：10的摩尔比、20mg/ml的蛋白浓度在4℃反应16小时。这时，将反应在100mM磷酸钾缓冲剂(pH6.0)中进行，并向其中加入20mM SCB作为还原剂。反应完成之后，将反应混合物应用于SOURCE15Q纯化柱以纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.30)和免疫球蛋白Fc的结合物(柱：SOURCE15Q，流速：2.0ml/min，梯度：A0→20%100min B(A：20mM Tris-HCl,pH7.5,B：A+1M NaCl))(图4c)。图4c是显示纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.30)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图。
实施例7：包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.31)和免疫球蛋白Fc的结合物的制备
首先，为了用3.4K PropionALD(2)PEG进行泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.31)氨基酸序列位置30的赖氨酸残基的聚乙二醇化，将泌酸调节肽(SEQ ID NO.31)和3.4K PropionALD(2)PEG以1：15的摩尔比、3mg/ml的蛋白浓度在4℃反应4.5小时。这时，反应在100mM HEPES缓冲剂(pH7.5)和45%异丙醇的溶剂混合物中进行，并向其中加入20mM SCB作为还原剂。反应完成之后，将反应混合物应用于SOURCES纯化柱以纯化具有单聚乙二醇化赖氨酸的泌酸调节肽衍生物(柱：SOURCE S，流速：2.0ml/min，梯度：A0→3%1min B→40%222min B(A：20mM柠檬酸钠，pH3.0+45%乙醇，B：A+1M KCl))(图5a)。图5a是显示通过SOURCE S纯化柱纯化单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.31)的结果的图。
接下来，将纯化的单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.31)和免疫球蛋白Fc以1：10的摩尔比、20mg/ml的蛋白浓度在4℃反应16小时。这时，将反应在100mM磷酸钾缓冲剂(pH6.0)中进行，并向其中加入20mM SCB作为还原剂。反应完成之后，将反应混合物应用于SOURCE15Q纯化柱以纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.31)和免疫球蛋白Fc的结合物(柱：SOURCE15Q，流速：2.0ml/min，梯度：A0→20%100min B(A：20mM Tris-HCl,pH7.5,B：A+1M NaCl))(图5b)。图5b是显示纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.31)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图。
实施例8：包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.2)和免疫球蛋白Fc的结合物的制备
首先，为了用3.4K PropionALD(2)PEG进行泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.2)氨基酸序列位置30的赖氨酸残基的聚乙二醇化，将泌酸调节肽(SEQ ID NO.2)和3.4KPropionALD(2)PEG以1：10的摩尔比、3mg/ml的蛋白浓度在4℃反应4小时。这时，反应在100mM HEPES缓冲剂(pH7.5)和45%异丙醇的溶剂混合物中进行，并向其中加入20mM SCB作为还原剂。反应完成之后，将反应混合物应用于SOURCE S纯化柱以纯化具有单聚乙二醇化赖氨酸的泌酸调节肽衍生物(柱：SOURCE S，流速：2.0ml/min，梯度：A0→3%1min B→40%222min B(A：20mM柠檬酸钠，pH3.0+45%乙醇，B：A+1M KCl))(图6a)。图6a是显示通过SOURCE S纯化柱纯化单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.2)的结果的图。洗脱峰的单聚乙二醇化通过SDS-PAGE检测，赖氨酸选择性通过利用Asp-N蛋白酶的肽作图检测(图6b)。图6b是显示纯化的单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.2)的肽作图结果的图。
接下来，将纯化的单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.2)和免疫球蛋白Fc以1：8的摩尔比、20mg/ml的蛋白浓度在4℃反应16小时。这时，将反应在100mM磷酸钾缓冲剂(pH6.0)中进行，并向其中加入20mM SCB作为还原剂。反应完成之后，将反应混合物应用于SOURCE15Q纯化柱(柱：SOURCE15Q，流速：2.0ml/min，梯度：A0→4%1min B→20%80min B(A：20mM Tris-HCl,pH7.5,B：A+1M NaCl))(图6c)和Source ISO纯化柱(柱：SOURCE ISO(XK16,Amersham Biosciences)，流速：2.0ml/min，梯度：A0→100%100min B，(A：20mM Tris-HCl,pH7.5,B：A+1.3MAS))(图6d)，以纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.2)和免疫球蛋白Fc的结合物。图6c是显示通过Source ISO纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.2)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图，图6d是显示通过Source ISO纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.2)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图。
实施例9：包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.3)和免疫球蛋白Fc的结合物的制备
首先，为了用3.4K PropionALD(2)PEG进行泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.3)氨基酸序列位置27的赖氨酸残基的聚乙二醇化，将泌酸调节肽(SEQ ID NO.3)和3.4KPropionALD(2)PEG以1：10的摩尔比、3mg/ml的蛋白浓度在4℃反应4小时。这时，反应在100mM HEPES缓冲剂(pH7.5)和45%异丙醇的溶剂混合物中进行，并向其中加入20mM SCB作为还原剂。反应完成之后，将反应混合物应用于SOURCE S纯化柱以纯化具有单聚乙二醇化赖氨酸的泌酸调节肽衍生物(柱：SOURCE S，流速：2.0ml/min，梯度：A0→3%1min B→40%222min B(A：20mM柠檬酸钠，pH3.0+45%乙醇，B：A+1M KCl))(图7a)。图7a是显示通过SOURCE S纯化柱纯化单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.3)的结果的图。洗脱峰的单聚乙二醇化通过SDS-PAGE检测，赖氨酸选择性通过利用Asp-N蛋白酶的肽作图检测(图7b)。图7b是显示纯化的单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.3)的肽作图结果的图。
接下来，将纯化的单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.3)和免疫球蛋白Fc以1：8的摩尔比、20mg/ml的蛋白浓度在4℃反应16小时。这时，将反应在100mM磷酸钾缓冲剂(pH6.0)中进行，并向其中加入20mM SCB作为还原剂。反应完成之后，将反应混合物应用于Butyl FF纯化柱(柱：Butyl FF(XK16,AmershamBiosciences)，流速：2.0ml/min，梯度：B0→100%5min A(A：20mM Tris-HCl,pH7.5,B：A+1.5M NaCl))(图7c)和SOURCE15Q纯化柱(柱：SOURCE15Q，流速：2.0ml/min，梯度：A0→4%1min B→20%80min B(A：20mM Tris-HCl,pH7.5,B：A+1M NaCl))(图7d)以纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.3)和免疫球蛋白Fc的结合物。图7c是显示通过Butyl FF纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.3)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图，图7d是显示通过SOURCE15Q纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.3)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图。
实施例10：包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.23)和免疫球蛋白Fc的结合物的制备
首先，为了用MAL-10K-ALD PEG(NOF.,日本)进行泌酸调节肽衍生物(SEQ IDNO.23)氨基酸序列位置24的半胱氨酸残基的聚乙二醇化，将泌酸调节肽(SEQ IDNO.3)和MAL-10K-ALD PEG以1：3的摩尔比、3mg/ml的蛋白浓度在室温反应3小时。这时，反应在50mM Tris缓冲剂(pH8.0)和45%异丙醇中进行，并向其中加入1M胍。反应完成之后，将反应混合物应用于SOURCE S纯化柱以纯化具有单聚乙二醇化半胱氨酸的泌酸调节肽衍生物(柱：SOURCE S，流速：2.0ml/min，梯度：A0→100%50min B(A：20mM柠檬酸钠，pH3.0+45%乙醇，B：A+1M KCl))(图8a)。图8a是显示通过SOURCE S纯化柱纯化单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ IDNO.23)的结果的图。
接下来，将纯化的单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.23)和免疫球蛋白Fc以1：5的摩尔比、20mg/ml的蛋白浓度在4℃反应16小时。这时，将反应在100mM磷酸钾缓冲剂(pH6.0)中进行，并向其中加入20mM SCB作为还原剂。反应完成之后，将反应混合物应用于SOURCE15Q纯化柱(柱：SOURCE15Q，流速：2.0ml/min，梯度：A0→4%1min B→20%80min B(A：20mM Tris-HCl,pH7.5,B：A+1M NaCl))(图8b)和Source ISO纯化柱(柱：SOURCE ISO，流速：2.0ml/min，梯度：B0→100%100min A，(A：20mM Tris-HCl,pH7.5,B：A+1.1M AS))(图8c)以纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.23)和免疫球蛋白Fc的结合物。图8b是显示通过SOURCE15Q纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.23)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图，图8c是显示通过Source ISO纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.23)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图。
实施例11：包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.24)和免疫球蛋白Fc的结合物的制备
首先，为了用MAL-10K-ALD PEG进行泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.24)氨基酸序列位置30的半胱氨酸残基的聚乙二醇化，将泌酸调节肽(SEQ ID NO.24)和MAL-10K-ALD PEG以1：3的摩尔比、3mg/ml的蛋白浓度在室温反应3小时。这时，反应在50mM Tris缓冲剂(pH8.0)和45%异丙醇中进行，并向其中加入1M胍。反应完成之后，将反应混合物应用于SOURCE S纯化柱以纯化具有单聚乙二醇化半胱氨酸的泌酸调节肽衍生物(柱：SOURCE S，流速：2.0ml/min，梯度：A0→100%50min B(A：20mM柠檬酸钠，pH3.0+45%乙醇，B：A+1M KCl))(图9a)。图9a是显示通过SOURCE S纯化柱纯化单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.24)的结果的图。
接下来，将纯化的单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.24)和免疫球蛋白Fc以1：5的摩尔比、20mg/ml的蛋白浓度在4℃反应16小时。这时，将反应在100mM磷酸钾缓冲剂(pH6.0)中进行，并向其中加入20mM SCB作为还原剂。反应完成之后，将反应混合物应用于和SOURCE15Q纯化柱(柱：SOURCE15Q，流速：2.0ml/min，梯度：A0→4%1min B→20%80min B(A：20mM Tris-HCl,pH7.5,B：A+1M NaCl))(图9b)和Source ISO纯化柱(柱：SOURCE ISO，流速：2.0ml/min，梯度：B0→100%100min A，(A：20mM Tris-HCl,pH7.5,B：A+1.1M AS))(图9c)以纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.24)和免疫球蛋白Fc的结合物。图9b是显示通过SOURCE15Q纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.24)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图，图9c是显示通过Source ISO纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.24)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图。
实施例12：包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.25)和免疫球蛋白Fc的结合物的制备
首先，为了用MAL-10K-ALD PEG进行泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.25)氨基酸序列位置30的半胱氨酸残基的聚乙二醇化，将泌酸调节肽(SEQ ID NO.25)和MAL-10K-ALD PEG以1：3的摩尔比、3mg/ml的蛋白浓度在室温反应3小时。这时，反应在50mM Tris缓冲剂(pH8.0)中进行，并向其中加入1M胍。反应完成之后，将反应混合物应用于SOURCE S纯化柱以纯化具有单聚乙二醇化半胱氨酸的泌酸调节肽衍生物(柱：SOURCE S，流速：2.0ml/min，梯度：A0→100%50min B(A：20mM柠檬酸钠，pH3.0+45%乙醇，B：A+1M KCl))(图10a)。图10a是显示通过SOURCES纯化柱纯化单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.25)的结果的图。
接下来，将纯化的单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.25)和免疫球蛋白Fc以1：5的摩尔比、20mg/ml的蛋白浓度在4℃反应16小时。这时，将反应在100mM磷酸钾缓冲剂(pH6.0)中进行，并向其中加入20mM SCB作为还原剂。反应完成之后，将反应混合物应用于SOURCE15Q纯化柱(柱：SOURCE15Q，流速：2.0ml/min，梯度：A0→4%1min B→20%80min B(A：20mM Tris-HCl,pH7.5,B：A+1M NaCl))(图10b)和Source ISO纯化柱(柱：SOURCE ISO，流速：2.0ml/min，梯度：B0→100%100min A，(A：20mM Tris-HCl,pH7.5,B：A+1.1M AS))(图10c)以纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.25)和免疫球蛋白Fc的结合物。图10b是显示通过SOURCE15Q纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.25)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图，图10c是显示通过Source ISO纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.25)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图。
实施例13：包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.28)和免疫球蛋白Fc的结合物的制备
首先，为了用3.4K PropionALD(2)PEG进行泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.28)氨基酸序列位置20的赖氨酸残基的聚乙二醇化，将泌酸调节肽(SEQ ID NO.28)和MAL-10K-ALD PEG以1：5的摩尔比、3mg/ml的蛋白浓度在4℃反应3小时。这时，反应在50mM硼酸钠缓冲剂(pH9.0)中进行，并向其中加入2M胍。反应完成之后，将反应混合物应用于SOURCE S纯化柱以纯化具有单聚乙二醇化赖氨酸的泌酸调节肽衍生物(柱：SOURCE S，流速：2.0ml/min，梯度：A0→3%1min B→40%222min B(A：20mM柠檬酸钠，pH3.0+45%乙醇，B：A+1M KCl))(图11a)。图11a是显示通过SOURCE S纯化柱纯化单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ IDNO.28)的结果的图。
接下来，将纯化的单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.28)和免疫球蛋白Fc以1：10的摩尔比、20mg/ml的蛋白浓度在4℃反应16小时。这时，将反应在100mM磷酸钾缓冲剂(pH6.0)中进行，并向其中加入20mM SCB作为还原剂。反应完成之后，将反应混合物应用于SOURCE15Q纯化柱(柱：SOURCE15Q，流速：2.0ml/min，梯度：A0→4%1min B→20%80min B(A：20mM Tris-HCl,pH7.5,B：A+1M NaCl))(图11b)和Source ISO纯化柱(柱：SOURCE ISO，流速：2.0ml/min，梯度：B0→100%100min A，(A：20mM Tris-HCl,pH7.5,B：A+1.1M AS))(图11c)以纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.28)和免疫球蛋白Fc的结合物。图11b是显示通过SOURCE15Q纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.28)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图，图11c是显示通过Source ISO纯化柱纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.28)和免疫球蛋白Fc的结合物的结果的图。
实施例14：包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.32)和免疫球蛋白Fc的结合物的制备
首先，为了用MAL-10K-ALD PEG进行泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.32)氨基酸序列位置30的半胱氨酸残基的聚乙二醇化，将泌酸调节肽(SEQ ID NO.32)和MAL-10K-ALD PEG以1：3的摩尔比、1mg/ml的蛋白浓度在室温反应3小时。这时，反应在50mM Tris缓冲剂(pH8.0)中进行，并向其中加入2M胍。反应完成之后，将反应混合物应用于SOURCE S纯化柱以纯化具有单聚乙二醇化半胱氨酸的泌酸调节肽衍生物(柱：SOURCE S，流速：2.0ml/min，梯度：A0→100%50min B(A：20mM柠檬酸钠，pH3.0+45%乙醇，B：A+1M KCl))。
接下来，将纯化的单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.32)和免疫球蛋白Fc以1：8的摩尔比、20mg/ml的蛋白浓度在4℃反应16小时。这时，将反应在100mM磷酸钾缓冲剂(pH6.0)中进行，并向其中加入20mM SCB作为还原剂。反应完成之后，将反应混合物应用于和SOURCE15Q纯化柱(柱：SOURCE15Q，流速：2.0ml/min，梯度：A0→4%1min B→20%80min B(A：20mM Tris-HCl,pH7.5,B：A+1M NaCl))和Source ISO纯化柱(柱：SOURCE ISO，流速：2.0ml/min，梯度：B0→100%100min A，(A：20mM Tris-HCl,pH7.5,B：A+1.1M AS))以纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.32)和免疫球蛋白Fc的结合物。
实施例15：包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.33)和免疫球蛋白Fc的结合物的制备
首先，为了用MAL-10K-ALD PEG进行泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.33)氨基酸序列位置30的半胱氨酸残基的聚乙二醇化，将泌酸调节肽(SEQ ID NO.33)和MAL-10K-ALD PEG以1：1的摩尔比、1mg/ml的蛋白浓度在室温反应3小时。这时，反应在50mM Tris缓冲剂(pH8.0)中进行，并向其中加入2M胍。反应完成之后，将反应混合物应用于SOURCE S纯化柱以纯化具有单聚乙二醇化半胱氨酸的泌酸调节肽衍生物(柱：SOURCE S，流速：2.0ml/min，梯度：A0→100%50min B(A：20mM柠檬酸钠，pH3.0+45%乙醇，B：A+1M KCl))。
接下来，将纯化的单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.33)和免疫球蛋白Fc以1：5的摩尔比、20mg/ml的蛋白浓度在4℃反应16小时。这时，将反应在100mM磷酸钾缓冲剂(pH6.0)中进行，并向其中加入20mM SCB作为还原剂。反应完成之后，将反应混合物应用于SOURCE15Q纯化柱(柱：SOURCE15Q，流速：2.0ml/min，梯度：A0→4%1min B→20%80min B(A：20mM Tris-HCl,pH7.5,B：A+1M NaCl))和Source ISO纯化柱(柱：SOURCE ISO，流速：2.0ml/min，梯度：B0→100%100min A，(A：20mM Tris-HCl,pH7.5,B：A+1.1M AS))以纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.33)和免疫球蛋白Fc的结合物。
实施例16：包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.34)和免疫球蛋白Fc的结合物的制备
首先，为了用MAL-10K-ALD PEG进行泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.34)氨基酸序列位置30的半胱氨酸残基的聚乙二醇化，将泌酸调节肽(SEQ ID NO.34)和MAL-10K-ALD PEG以1：1的摩尔比、3mg/ml的蛋白浓度在室温反应3小时。这时，反应在50mM Tris缓冲剂(pH8.0)中进行，并向其中加入1M胍。反应完成之后，将反应混合物应用于SOURCE S纯化柱以纯化具有单聚乙二醇化半胱氨酸的泌酸调节肽衍生物(柱：SOURCE S，流速：2.0ml/min，梯度：A0→100%50min B(A：20mM柠檬酸钠，pH3.0+45%乙醇，B：A+1M KCl))。
接下来，将纯化的单聚乙二醇化泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.34)和免疫球蛋白Fc以1：5的摩尔比、20mg/ml的蛋白浓度在4℃反应16小时。这时，将反应在100mM磷酸钾缓冲剂(pH6.0)中进行，并向其中加入20mM SCB作为还原剂。反应完成之后，将反应混合物应用于SOURCE15Q纯化柱(柱：SOURCE15Q，流速：2.0ml/min，梯度：A0→4%1min B→20%80min B(A：20mM Tris-HCl,pH7.5,B：A+1M NaCl))和Source ISO纯化柱(柱：SOURCE ISO，流速：2.0ml/min，梯度：B0→100%100min A，(A：20mM Tris-HCl,pH7.5,B：A+1.1M AS))以纯化包括泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.34)和免疫球蛋白Fc的结合物。
实施例17：泌酸调节肽衍生物-免疫球蛋白Fc结合物的体外活性
为了测量上面实施例中制备的包括泌酸调节肽或泌酸调节肽衍生物和免疫球蛋白Fc的结合物的抗肥胖效力，以与实施例2-2相同的方式进行实验。
具体地，将实施例1-1和1-2中制备的每种转化体一周亚培养两次或三次，并在96孔板的每孔中以1×105的密度进行等分，之后培养24小时。将培养的每个转化体用KRB缓冲剂洗并悬浮在40ml含有1mM IBMX的KRB缓冲剂中，并留在室温5分钟。通过5倍连续稀释将GLP-1、胰高血糖素和泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.23、24、25、32、33或34)-免疫球蛋白Fc结合物从1000nM稀释到0.02nM，并将其每种40mL加到各转化体中，并在CO2温育箱中在37℃培养1小时。然后，加入20mL细胞裂解缓冲剂用于细胞裂解，并将细胞裂解物应用到cAMP测定试剂盒(MolecularDevice,USA)以利用Victor(Perkin Elmer,USA)测量cAMP浓度。从中计算EC50值，并且互相比较(表3)。
表3
泌酸调节肽衍生物-免疫球蛋白Fc结合物的体外活性
Figure BDA0000466027580000291
如表3所示，发现泌酸调节肽衍生物-免疫球蛋白Fc结合物显示对GLP-1和胰高血糖素受体的体外活性。
实施例18：泌酸调节肽衍生物-免疫球蛋白结合物的体内活性
检测泌酸调节肽衍生物-免疫球蛋白Fc结合物是否显示优异的体内体重减轻作用。
具体地，喂给6周龄的正常C57BL/6小鼠以60kcal的高脂肪饮食24周以增加它们的体重平均大约50g，并以0.03或0.06mg/kg/周的剂量皮下施用泌酸调节肽衍生物(SEQ ID NO.23、24或25)-免疫球蛋白Fc结合物3周。此后，测量小鼠体重的变化(图12和图13)。图12和图13是显示根据泌酸调节肽衍生物-免疫球蛋白Fc结合物的种类和施用剂量小鼠体重变化的图。如图12和图13所示，当泌酸调节肽衍生物-免疫球蛋白Fc结合物的施用剂量增加时，体重以正比减少，即使泌酸调节肽衍生物-免疫球蛋白Fc结合物的种类之间存在差异，这表示泌酸调节肽衍生物-免疫球蛋白Fc结合物以剂量依赖性方式减轻体重。
Figure IDA0000466027640000011
Figure IDA0000466027640000031
Figure IDA0000466027640000041
Figure IDA0000466027640000051
Figure IDA0000466027640000061
Figure IDA0000466027640000071
Figure IDA0000466027640000081
Figure IDA0000466027640000091
Figure IDA0000466027640000101
Figure IDA0000466027640000111
Figure IDA0000466027640000121
Figure IDA0000466027640000151
Figure IDA0000466027640000161
Figure IDA0000466027640000171
Figure IDA0000466027640000181
Figure IDA0000466027640000191
Figure IDA0000466027640000201
Figure IDA0000466027640000211
Figure IDA0000466027640000221

Claims (27)

1.包括泌酸调节肽、免疫球蛋白Fc区和非肽基聚合物的结合物，其中所述结合物可通过非肽基聚合物共价连接泌酸调节肽与免疫球蛋白Fc区而获得。
2.根据权利要求1所述的结合物，其中所述泌酸调节肽具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的结合物，其中所述泌酸调节肽是通过天然泌酸调节肽氨基酸的添加、缺失或置换而制备的泌酸调节肽衍生物。
4.根据权利要求3所述的结合物，其中所述泌酸调节肽衍生物包括下面式1的氨基酸序列：
R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2(式1)
其中R1是组氨酸、脱氨基-组氨酰、二甲基-组氨酰(N-二甲基-组氨酰)、β-羟基咪唑丙酰基、4-咪唑乙酰基、β-羧基咪唑丙酰基或酪氨酸；
X1是Aib(氨基异丁酸)、d-丙氨酸、甘氨酸、Sar(N-甲基甘氨酸)、丝氨酸或d-丝氨酸；
X2是谷氨酸或谷氨酰胺；
X3是亮氨酸或酪氨酸；
X4是丝氨酸或丙氨酸；
X5是赖氨酸或精氨酸；
X6是谷氨酰胺或酪氨酸；
X7是亮氨酸或甲硫氨酸；
X8是天冬氨酸或谷氨酸；
X9是谷氨酸、丝氨酸、α-甲基-谷氨酸或被删除；
X10是谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸或被删除；
X11是丙氨酸、精氨酸、缬氨酸或被删除；
X12是丙氨酸、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸或被删除；
X13是赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、α-甲基-谷氨酸或被删除；
X14是天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸或被删除；
X15是苯丙氨酸或被删除；
X16是异亮氨酸、缬氨酸或被删除；
X17是丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、α-甲基-谷氨酸或被删除；
X18是色氨酸或被删除；
X19是丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丝氨酸、缬氨酸或被删除；
X20是丙氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或被删除；
X21是天冬酰胺或被删除；
X22是丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸或被删除；
X23是半胱氨酸、赖氨酸或被删除；
X24是具有2至10个氨基酸——由丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的组合组成——的肽，或被删除；和
R2是KRNRNNIA(SEQ ID NO.35)、GPSSGAPPPS(SEQ ID NO.36)、GPSSGAPPPSK(SEQ ID NO.37)、HSQGTFTSDYSKYLD(SEQ ID NO.38)、HSQGTFTSDYSRYLDK(SEQ ID NO.39)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(SEQ IDNO.40)或被删除(如果式1的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同就排除)。
5.根据权利要求4所述的结合物，其中所述泌酸调节肽衍生物能活化GLP-1受体和胰高血糖素受体。
6.根据权利要求4所述的结合物，其中所述结合物具有抗肥胖作用。
7.根据权利要求4所述的结合物，其中在所述式1氨基酸序列的位置10、14、16、20、24和28的一个或多个氨基酸用选自以下的氨基酸或氨基酸衍生物置换：Tyr(4-Me)、Phe、Phe(4-Me)、Phe(4-Cl)、Phe(4-CN)、Phe(4-NO2)、Phe(4-NH2)、Phg、Pal、Nal、Ala(2-噻吩基)和Ala(苯并噻吩基)。
8.根据权利要求4所述的结合物，其中在所述式1氨基酸序列的位置10和14、12和16、16和20、20和24以及24和28的一个或多个氨基酸对用谷氨酸或赖氨酸置换以形成环。
9.根据权利要求4所述的结合物，其中在所述式1氨基酸序列的位置10和14、12和16、16和20、20和24以及24和28的一个或多个氨基酸对形成环。
10.根据权利要求4所述的结合物，其中所述泌酸调节肽衍生物选自SEQ ID NOs.2至34的肽。
11.根据权利要求1所述的结合物，其中所述非肽基聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、聚乳酸(PLA)、聚乳酸乙醇酸(PLGA)、脂质聚合物、壳多糖、透明质酸、多糖和其组合。
12.根据权利要求1所述的结合物，其中所述免疫球蛋白Fc区和泌酸调节肽的氨基和巯基分别连接在所述非肽基聚合物的两端。
13.根据权利要求1所述的结合物，其中所述非肽基聚合物在两端具有能结合所述免疫球蛋白Fc区和所述蛋白质药物的反应基团。
14.根据权利要求13所述的结合物，其中所述反应基团选自醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基团和琥珀酰亚胺衍生物。
15.根据权利要求13所述的结合物，其中在两端的所述反应基团彼此相同或不同。
16.根据权利要求1所述的结合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是非糖基化的Fc区。
17.根据权利要求1所述的结合物，其中所述免疫球蛋白Fc区选自CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域；CH1结构域和CH2结构域；CH1结构域和CH3结构域；CH2结构域和CH3结构域；一种或多种结构域和免疫球蛋白铰链区(或部分铰链区)的组合；以及重链恒定区和轻链恒定区的每个结构域的二聚体。
18.根据权利要求1所述的结合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是这样的衍生物，其中能形成二硫键的区域被删除，某些氨基酸残基在天然Fc形式的N-末端被除去，甲硫氨酸残基被添加到天然Fc形式的N-末端，互补-结合位点被删除，或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）位点被删除。
19.根据权利要求1所述的结合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是衍生自选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白的Fc区。
20.根据权利要求19所述的结合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是IgG4Fc区。
21.根据权利要求1所述的结合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是人IgG4衍生的非糖基化的Fc区。
22.用于肥胖预防或治疗的药物组合物，包括权利要求1至21中任一项所述的结合物。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，进一步包括药学上可接受的载体。
24.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述组合物单独或与显示肥胖预防或治疗效果的其它药物制剂组合施用。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述药物制剂选自GLP-1受体激动剂、瘦蛋白受体激动剂、DPP-IV抑制剂、Y5受体拮抗剂、黑素-集中激素(MCH)受体拮抗剂、Y2/3受体激动剂、MC3/4受体激动剂、胃/胰脂肪酶抑制剂、5HT2c激动剂、β3A受体激动剂、糊精受体激动剂、生长素释放钛拮抗剂和生长素释放钛受体拮抗剂。
26.预防或治疗肥胖的方法，包括将权利要求1至21中任一项所述的结合物或权利要求22至25中任一项所述的组合物施用给对象的步骤。
27.权利要求1至21中任一项所述的结合物或权利要求22至25中任一项所述的组合物在制备用于肥胖预防或治疗的药物中的应用。
CN201280039781.4A 2011-06-17 2012-06-15 包括泌酸调节肽和免疫球蛋白片段的结合物以及其应用 Active CN103732616B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810801214.7A CN109306015B (zh) 2011-06-17 2012-06-15 包括泌酸调节肽和免疫球蛋白片段的结合物以及其应用

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20110058852 2011-06-17
KR10-2011-0058852 2011-06-17
PCT/KR2012/004722 WO2012173422A1 (en) 2011-06-17 2012-06-15 A conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810801214.7A Division CN109306015B (zh) 2011-06-17 2012-06-15 包括泌酸调节肽和免疫球蛋白片段的结合物以及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103732616A true CN103732616A (zh) 2014-04-16
CN103732616B CN103732616B (zh) 2018-08-17

Family

ID=47357296

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810801214.7A Active CN109306015B (zh) 2011-06-17 2012-06-15 包括泌酸调节肽和免疫球蛋白片段的结合物以及其应用
CN201280039781.4A Active CN103732616B (zh) 2011-06-17 2012-06-15 包括泌酸调节肽和免疫球蛋白片段的结合物以及其应用

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810801214.7A Active CN109306015B (zh) 2011-06-17 2012-06-15 包括泌酸调节肽和免疫球蛋白片段的结合物以及其应用

Country Status (32)

Country Link
US (3) US9731031B2 (zh)
EP (2) EP3502129B1 (zh)
JP (2) JP6038905B2 (zh)
KR (2) KR101577734B1 (zh)
CN (2) CN109306015B (zh)
AR (2) AR086969A1 (zh)
AU (3) AU2012270366C1 (zh)
BR (1) BR112013032375B1 (zh)
CA (2) CA2838504C (zh)
CL (1) CL2013003619A1 (zh)
CY (1) CY1121255T1 (zh)
DK (2) DK3502129T3 (zh)
ES (2) ES2882520T3 (zh)
HR (1) HRP20190265T1 (zh)
HU (1) HUE042585T2 (zh)
IL (4) IL229759A (zh)
LT (1) LT2721062T (zh)
MX (1) MX353402B (zh)
MY (1) MY164680A (zh)
PE (3) PE20141178A1 (zh)
PH (1) PH12018501119A1 (zh)
PL (1) PL2721062T3 (zh)
PT (1) PT2721062T (zh)
RS (1) RS58606B1 (zh)
RU (2) RU2607365C2 (zh)
SG (2) SG195275A1 (zh)
SI (1) SI2721062T1 (zh)
TR (1) TR201901402T4 (zh)
TW (2) TWI519541B (zh)
UA (2) UA125895C2 (zh)
WO (1) WO2012173422A1 (zh)
ZA (1) ZA201309013B (zh)

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104507492A (zh) * 2012-07-25 2015-04-08 韩美药品株式会社 治疗高脂血症的包含泌酸调节肽衍生物的组合物
CN104918632A (zh) * 2012-11-06 2015-09-16 韩美药品株式会社 治疗糖尿病或糖胖病的包括胃泌酸调节素类似物的组合物
US9522946B2 (en) 2011-06-10 2016-12-20 Hanmi Science Co., Ltd. Oxyntomodulin derivatives and pharmaceutical composition for treating obesity comprising the same
CN106604739A (zh) * 2014-05-30 2017-04-26 韩美药品株式会社 包括胰岛素和glp‑1/胰高血糖素双重激动剂的用于治疗糖尿病的组合物
US9724420B2 (en) 2012-11-06 2017-08-08 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Liquid formulation of protein conjugate comprising an oxyntomodulin derivative covalently linked to a non-peptidyl polymer to an immunoglobulin FC region
US9731031B2 (en) 2011-06-17 2017-08-15 Hanmi Science Co., Ltd. Conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof
CN108136276A (zh) * 2015-09-24 2018-06-08 韩美药品株式会社 通过使用免疫球蛋白片段的特异性位点进行连接的蛋白质复合物
CN108299553A (zh) * 2017-01-13 2018-07-20 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 胃泌酸调节素修饰物
US10233230B2 (en) 2014-09-16 2019-03-19 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Use of a long acting GLP-1/glucagon receptor dual agonist for the treatment of non-alcoholic fatty liver disease
US10513550B2 (en) 2014-12-30 2019-12-24 Hanmi Pharm Co., Ltd Glucagon derivatives
US10647753B2 (en) 2015-08-28 2020-05-12 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analogs and use thereof
CN112912095A (zh) * 2018-07-19 2021-06-04 D&D制药技术股份有限公司 包括多肽的药物组合物
US11396534B2 (en) 2016-09-23 2022-07-26 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analogs with reduced affinity to insulin receptor and use thereof
US11752216B2 (en) 2017-03-23 2023-09-12 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analog complex with reduced affinity for insulin receptor and use thereof

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140113860A1 (en) 2006-02-03 2014-04-24 Prolor Biotech Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US8048849B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Modigene, Inc. Long-acting polypeptides and methods of producing same
US20150038413A1 (en) 2006-02-03 2015-02-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US9249407B2 (en) 2006-02-03 2016-02-02 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US10221228B2 (en) 2006-02-03 2019-03-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US9663778B2 (en) 2009-07-09 2017-05-30 OPKO Biologies Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US10166295B2 (en) 2011-06-02 2019-01-01 Opko Biologics Ltd. Pegylated OXM variants
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
MX362432B (es) 2012-06-04 2019-01-17 Opko Biologics Ltd Variantes de oxm pegilada.
WO2014049610A2 (en) 2012-09-26 2014-04-03 Cadila Healthcare Limited Peptides as gip, glp-1 and glucagon receptors triple-agonist
UA116217C2 (uk) 2012-10-09 2018-02-26 Санофі Пептидна сполука як подвійний агоніст рецепторів glp1-1 та глюкагону
CN104902920A (zh) 2012-12-21 2015-09-09 赛诺菲 作为glp1/gip双重激动剂或glp1/gip/胰高血糖素三重激动剂的毒蜥外泌肽-4衍生物
AR096891A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo
AR096890A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugando fc de inmunoglobulina, que mantiene la afinidad de unión del fragmento fc de la inmunoglobulina a fcrn
US20150158926A1 (en) 2013-10-21 2015-06-11 Opko Biologics, Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
TW201609795A (zh) 2013-12-13 2016-03-16 賽諾菲公司 作為雙重ｇｌｐ－１／ｇｉｐ受體促效劑的艾塞那肽－４（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）胜肽類似物
WO2015086730A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Sanofi Non-acylated exendin-4 peptide analogues
EP3080149A1 (en) 2013-12-13 2016-10-19 Sanofi Dual glp-1/glucagon receptor agonists
WO2015086729A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Sanofi Dual glp-1/gip receptor agonists
BR112016016578A2 (pt) 2014-01-20 2017-10-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Insulina de ação prolongada e uso daanálogo de insulina, polinucleotídeo, vetor de expressão, transformante, insulina de ação prolongada bem como seu método de preparação e formulação da mesma, conjugado, e uso do mesmo mesma
CA2944138C (en) * 2014-03-31 2023-06-20 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Method for improving solubility of protein and peptide by using immunoglobulin fc fragment linkage
TW201625668A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 作為胜肽性雙重ｇｌｐ－１／昇糖素受體激動劑之艾塞那肽－４衍生物
TW201625669A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自艾塞那肽－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）之肽類雙重ＧＬＰ－１／升糖素受體促效劑
TW201625670A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自ｅｘｅｎｄｉｎ－４之雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑
AR100639A1 (es) 2014-05-29 2016-10-19 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Composición para tratar diabetes que comprende conjugados de análogos de insulina de acción prolongada y conjugados de péptidos insulinotrópicos de acción prolongada
KR20150140177A (ko) 2014-06-05 2015-12-15 한미약품 주식회사 단백질 및 펩타이드의 면역원성을 감소시키는 방법
US9932381B2 (en) 2014-06-18 2018-04-03 Sanofi Exendin-4 derivatives as selective glucagon receptor agonists
EA035527B1 (ru) * 2014-12-30 2020-06-30 Ханми Фарм. Ко., Лтд. Производные глюкагона с улучшенной стабильностью
AR105319A1 (es) 2015-06-05 2017-09-27 Sanofi Sa Profármacos que comprenden un conjugado agonista dual de glp-1 / glucagón conector ácido hialurónico
KR102662956B1 (ko) 2015-06-19 2024-05-03 옵코 바이오로직스 리미티드 장기-작용성 응고 인자 및 그의 제조 방법
PE20240215A1 (es) 2015-06-30 2024-02-16 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Derivado de glucagon y una composicion que comprende un conjugado de accion prolongada del mismo
AR105284A1 (es) 2015-07-10 2017-09-20 Sanofi Sa Derivados de exendina-4 como agonistas peptídicos duales específicos de los receptores de glp-1 / glucagón
KR20170080521A (ko) 2015-12-31 2017-07-10 한미약품 주식회사 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체
IL263934B2 (en) 2016-06-29 2023-10-01 Hanmi Pharm Ind Co Ltd A derivative of glucagon, its conjugate, a preparation containing it and its medical use
EA201990255A1 (ru) 2016-07-11 2019-07-31 Опко Байолоджикс Лтд Фактор свертывания крови vii пролонгированного действия и способы его получения
JOP20190097A1 (ar) 2016-10-27 2019-04-28 Janssen Pharmaceutica Nv الجلوبولينات المناعية واستخداماتها
TW201832783A (zh) 2016-12-02 2018-09-16 法商賽諾菲公司 包含ｇｌｐ－１／胰高血糖素雙重激動劑、連接子和透明質酸的接合物
BR112019016077A2 (pt) 2017-02-03 2020-03-31 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Conjugado da fórmula 1, método para preparar o conjugado, preparação de atuação longa, preparação para prevenir ou tratar diabetes e método para tratar diabetes
WO2019035672A1 (ko) 2017-08-16 2019-02-21 동아에스티 주식회사 아실화 옥신토모듈린 펩타이드 유사체
HUE065912T2 (hu) 2017-08-16 2024-06-28 Dong A St Co Ltd Acilezett oxintomodulin peptid analóg
WO2019171352A2 (en) * 2018-03-08 2019-09-12 Janssen Pharmaceutica Nv Methods of treating severe non-diabetic obesity
TW202015735A (zh) 2018-05-30 2020-05-01 法商賽諾菲公司 包含ｇｌｐ－１／升糖素／ｇｉｐ三重受體促效劑、連接子及透明質酸之接合物
KR20200135618A (ko) * 2019-05-23 2020-12-03 ㈜ 디앤디파마텍 폴리펩티드를 포함하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
CN110964116A (zh) * 2018-09-26 2020-04-07 北京辅仁瑞辉生物医药研究院有限公司 GLP1-Fc融合蛋白及其缀合物
WO2020128967A2 (en) * 2018-12-19 2020-06-25 Janssen Pharmaceutica Nv Methods of treating severe non-diabetic obesity
CN114853908B (zh) * 2019-05-16 2024-06-07 浙江道尔生物科技有限公司 一种治疗代谢疾病的融合蛋白
KR20210144608A (ko) * 2020-05-22 2021-11-30 한미약품 주식회사 액상 제제
WO2024155591A1 (en) * 2023-01-17 2024-07-25 Eli Lilly And Company Novel linkers for sustained delivery of therapeutics

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101389648A (zh) * 2006-02-22 2009-03-18 默克公司 肽胃泌酸调节素衍生物
CN101578107A (zh) * 2006-12-13 2009-11-11 皇家创新有限公司 新颖化合物及其对进食行为的影响
WO2010107256A2 (en) * 2009-03-20 2010-09-23 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Method for preparing a site-specific physiologically active polypeptide conjugate

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
AU728657B2 (en) 1996-03-18 2001-01-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
EP1060746A4 (en) 1998-03-06 2002-06-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd PROTEIN-FREE PREPARATIONS
US6660843B1 (en) * 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6677136B2 (en) 2000-05-03 2004-01-13 Amgen Inc. Glucagon antagonists
GB0121709D0 (en) 2001-09-07 2001-10-31 Imp College Innovations Ltd Food inhibition agent
US7217845B2 (en) * 2002-11-25 2007-05-15 Sun Bio, Inc. Bifunctional polyethylene glycol derivatives
GB0300571D0 (en) 2003-01-10 2003-02-12 Imp College Innovations Ltd Modification of feeding behaviour
EP1594530A4 (en) 2003-01-22 2006-10-11 Human Genome Sciences Inc HYBRID PROTEINS OF ALBUMIN
US7772188B2 (en) * 2003-01-28 2010-08-10 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
WO2005035761A1 (en) 2003-10-16 2005-04-21 Compugen Ltd. Splice variants of preproglucagon, glucagon-like peptide-1 and oxyntomodulin
US8263084B2 (en) 2003-11-13 2012-09-11 Hanmi Science Co., Ltd Pharmaceutical composition for treating obesity-related disease comprising insulinotropic peptide conjugate
KR101135244B1 (ko) * 2007-11-29 2012-04-24 한미사이언스 주식회사 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 비만 관련질환 치료용 조성물
JP4870569B2 (ja) * 2003-11-13 2012-02-08 ハンミ ホールディングス カンパニー リミテッド 免疫グロブリン断片を用いた蛋白質結合体およびその製造方法
US20090238838A1 (en) 2003-11-13 2009-09-24 Hanmi Pharm. Ind. Co. Ltd. Insulinotropic peptide conjugate using an immunoglobulin fc
CN101128487B (zh) 2004-12-02 2012-10-10 杜门蒂斯有限公司 靶向血清白蛋白和glp-1或pyy的双特异性结构域抗体
AU2006213607A1 (en) 2005-02-11 2006-08-17 Amylin Pharmaceuticals, Llc GIP analog and hybrid polypeptides with selectable properties
WO2007022123A2 (en) 2005-08-11 2007-02-22 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Hybrid polypeptides with selectable properties
JP5114381B2 (ja) * 2005-03-31 2013-01-09 アミリン・ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 精神疾患および障害治療用アミリンおよびアミリンアゴニスト
KR100754667B1 (ko) 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
GB0511986D0 (en) 2005-06-13 2005-07-20 Imp College Innovations Ltd Novel compounds and their effects on feeding behaviour
PT1891105E (pt) 2005-06-13 2012-06-27 Imp Innovations Ltd Análogos de oxintomodulina e seus efeitos sobre o comportamento da alimentação
WO2007030375A2 (en) 2005-09-08 2007-03-15 Children's Hospital Medical Center Lysosomal acid lipase therapy for nafld and related diseases
BRPI0712383A2 (pt) 2006-06-07 2012-07-10 Human Genome Sciences Inc proteìnas de fusão da albumina
KR100880509B1 (ko) 2006-10-16 2009-01-28 한미약품 주식회사 재조합 단백질의 대량 생산을 위한 신규한 벡터, 발현세포주 및 이를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법
TWI428346B (zh) 2006-12-13 2014-03-01 Imp Innovations Ltd 新穎化合物及其等對進食行為影響
JP2008169195A (ja) 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
US20090098130A1 (en) 2007-01-05 2009-04-16 Bradshaw Curt W Glucagon-like protein-1 receptor (glp-1r) agonist compounds
CA2677932A1 (en) 2007-02-15 2008-08-21 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/glp-1 receptor co-agonists
UA97673C2 (ru) 2007-07-10 2012-03-12 Эли Лилли Энд Компани КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ ГИБРИДНОГО БЕЛКА GLP-1Fc
CN103416421B (zh) 2007-07-27 2016-07-27 拜尔农作物科学股份公司 三元活性化合物结合物
WO2009040068A2 (en) 2007-09-11 2009-04-02 Mondobiotech Laboratories Ag Use of a peptide as a therapeutic agent
JP5771005B2 (ja) 2007-10-30 2015-08-26 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ グルカゴンアンタゴニスト及びｇｌｐ−１アゴニスト活性を示す化合物
US20110065633A1 (en) 2008-01-30 2011-03-17 Indiana University Research And Technology Corporation Ester-based peptide prodrugs
CA2727161A1 (en) * 2008-06-17 2009-12-23 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon analogs exhibiting enhanced solubility and stability physiological ph buffers
CL2009001424A1 (es) 2008-06-17 2010-04-30 Univ Indiana Res & Tech Corp Peptido tipo glucagon; dimero que comprende dos de dichos peptidos; composicion farmaceutica que lo comprende; y su uso para tratar diabetes o inducir perdida de peso.
WO2010013012A2 (en) 2008-08-01 2010-02-04 Lund University Bioscience Ab Novel polypeptides and uses thereof
EP2350118B1 (en) 2008-09-19 2016-03-30 Nektar Therapeutics Carbohydrate-based drug delivery polymers and conjugates thereof
US20110171312A1 (en) 2008-09-19 2011-07-14 Nektar Therapeutics Modified therapeutic peptides, methods of their preparation and use
JP5635531B2 (ja) 2008-12-15 2014-12-03 ジーランド ファーマ アクティーゼルスカブ グルカゴン類似体
AU2009327418A1 (en) 2008-12-19 2010-06-24 Indiana University Research And Technology Corporation Amide based glucagon superfamily peptide prodrugs
CN102348715B (zh) 2009-02-03 2017-12-08 阿穆尼克斯运营公司 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物
WO2010096052A1 (en) 2009-02-19 2010-08-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Oxyntomodulin analogs
CA2889453C (en) 2009-03-20 2018-11-06 Amgen Inc. Carrier immunoglobulins and uses thereof
IN2012DN00377A (zh) 2009-06-16 2015-08-21 Univ Indiana Res & Tech Corp
ES2537287T3 (es) 2009-07-13 2015-06-05 Zealand Pharma A/S Análogos de glucagón acilados
US20120294855A1 (en) 2009-11-03 2012-11-22 Eli Lilly & Company Glp-1 receptor agonist compounds for obstructive sleep apnea
US20120269830A1 (en) 2009-12-07 2012-10-25 Lawrence Horowitz Conjugates with improved pharmacokinetic properties
US8703701B2 (en) 2009-12-18 2014-04-22 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists
AR079344A1 (es) 2009-12-22 2012-01-18 Lilly Co Eli Analogo peptidico de oxintomodulina, composicion farmaceutica que lo comprende y uso para preparar un medicamento util para tratar diabetes no insulinodependiente y/u obesidad
AR079345A1 (es) 2009-12-22 2012-01-18 Lilly Co Eli Analogo peptidico de oxintomodulina
RU2559320C2 (ru) 2010-03-26 2015-08-10 Ново Нордиск А/С Новые аналоги глюкагона
MX2012013005A (es) 2010-05-13 2013-02-26 Univ Indiana Res & Tech Corp Peptidos de la superfamilia de glucagon que presentan actividad del receptor acoplado a proteinas g.
CA2796894A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 Indiana University Research And Technology Corporation Amide based glucagon superfamily peptide prodrugs
KR101337797B1 (ko) 2010-07-14 2013-12-06 한미사이언스 주식회사 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 액상 제제
KR101382593B1 (ko) * 2010-07-21 2014-04-10 한미사이언스 주식회사 신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물
KR101383976B1 (ko) 2010-09-06 2014-04-10 파나소닉 주식회사 표시 장치 및 그 제어 방법
CN101974077A (zh) 2010-09-15 2011-02-16 南京瑞年天平医药科技有限公司 一种新颖的多肽化合物
KR101303388B1 (ko) 2010-10-26 2013-09-03 한미사이언스 주식회사 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제
KR101767570B1 (ko) 2010-10-26 2017-08-14 한미사이언스 주식회사 항 비만 펩타이드의 지속형 결합체
CN102010473A (zh) 2010-11-10 2011-04-13 曹鹏 重组胃泌酸调节素融合蛋白及其制备和应用
AR084558A1 (es) 2010-12-22 2013-05-22 Marcadia Biotech Metodos para tratar trastornos metabolicos y obesidad con peptidos basados en glucagon activos para el receptor de peptido insulinotropico dependiente de glucosa (gip)/peptido-1 similar al glucagon (glp-1)
EP2492749A1 (en) 2011-02-28 2012-08-29 Rohm and Haas Electronic Materials LLC Photoresist compositions and methods of forming photolithographic patterns
KR101161526B1 (ko) 2011-05-16 2012-07-02 숭실대학교산학협력단 연료전지용 촉매전극을 위한 코어/쉘 구조의 나노 지지체 및 그 제조방법
ES2692187T3 (es) * 2011-06-10 2018-11-30 Hanmi Science Co., Ltd. Nuevos derivados de oxintomodulina y composición farmacéutica para el tratamiento de obesidad que lo comprende
KR101577734B1 (ko) 2011-06-17 2015-12-29 한미사이언스 주식회사 옥신토모듈린과 면역글로불린 단편을 포함하는 결합체 및 그의 용도
MX2013015168A (es) 2011-06-22 2014-03-31 Univ Indiana Res & Tech Corp Co-agonista del receptor de glucagon/glp-1.
KR101665009B1 (ko) 2012-03-09 2016-10-11 한미사이언스 주식회사 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
EP2838552A4 (en) 2012-04-19 2016-05-18 Opko Biolog Ltd OXYNTOMODULIN VARIANTS WITH EXTENDED ACTION AND PROCESSES FOR PRODUCING SAME
KR20150023013A (ko) 2012-06-21 2015-03-04 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 수용체 활성을 나타내는 글루카곤 유사체
KR101968344B1 (ko) 2012-07-25 2019-04-12 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 고지혈증 치료용 조성물
KR101373563B1 (ko) 2012-07-25 2014-03-12 전북대학교산학협력단 Ｔｏｆ-ｍｒａ를 이용한 혈류특성 및 ｍｒ-신호강도구배(전단율) 유도방법
WO2014049610A2 (en) 2012-09-26 2014-04-03 Cadila Healthcare Limited Peptides as gip, glp-1 and glucagon receptors triple-agonist
WO2014073842A1 (en) 2012-11-06 2014-05-15 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Liquid formulation of protein conjugate comprising the oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment
KR101993393B1 (ko) 2012-11-06 2019-10-01 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 당뇨병 또는 비만성 당뇨병 치료용 조성물
JP6137046B2 (ja) 2014-05-09 2017-05-31 信越化学工業株式会社 単量体、高分子化合物、レジスト材料及びパターン形成方法
TWI802396B (zh) 2014-09-16 2023-05-11 南韓商韓美藥品股份有限公司 長效glp-1/高血糖素受體雙促效劑治療非酒精性脂肝疾病之用途
WO2019171352A2 (en) 2018-03-08 2019-09-12 Janssen Pharmaceutica Nv Methods of treating severe non-diabetic obesity

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101389648A (zh) * 2006-02-22 2009-03-18 默克公司 肽胃泌酸调节素衍生物
CN101578107A (zh) * 2006-12-13 2009-11-11 皇家创新有限公司 新颖化合物及其对进食行为的影响
WO2010107256A2 (en) * 2009-03-20 2010-09-23 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Method for preparing a site-specific physiologically active polypeptide conjugate

Cited By (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9522946B2 (en) 2011-06-10 2016-12-20 Hanmi Science Co., Ltd. Oxyntomodulin derivatives and pharmaceutical composition for treating obesity comprising the same
US9527898B2 (en) 2011-06-10 2016-12-27 Hanmi Science Co., Ltd. Oxyntomodulin derivatives and pharmaceutical composition for treating obesity comprising the same
US10442848B2 (en) 2011-06-10 2019-10-15 Hanmi Science Co., Ltd. Oxyntomodulin derivatives and pharmaceutical composition for treating obesity comprising the same
US9765131B2 (en) 2011-06-10 2017-09-19 Hanmi Science Co., Ltd. Oxyntomodulin derivatives and pharmaceutical composition for treating obesity comprising the same
US11872283B2 (en) 2011-06-17 2024-01-16 Hanmi Science Co., Ltd Conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof
US9731031B2 (en) 2011-06-17 2017-08-15 Hanmi Science Co., Ltd. Conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof
US10363320B2 (en) 2011-06-17 2019-07-30 Hanmi Science Co., Ltd. Conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof
CN104507492A (zh) * 2012-07-25 2015-04-08 韩美药品株式会社 治疗高脂血症的包含泌酸调节肽衍生物的组合物
US10493132B2 (en) 2012-07-25 2019-12-03 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Composition for treating hyperlipidemia comprising oxyntomodulin derivative
CN104507492B (zh) * 2012-07-25 2017-11-24 韩美药品株式会社 治疗高脂血症的包含泌酸调节肽衍生物的组合物
US9901621B2 (en) 2012-07-25 2018-02-27 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Composition for treating hyperlipidemia comprising oxyntomodulin derivative
CN107854691A (zh) * 2012-07-25 2018-03-30 韩美药品株式会社 治疗高脂血症的包含泌酸调节肽衍生物的组合物
US10279041B2 (en) 2012-11-06 2019-05-07 Hanmi Pharm Co. Ltd. Liquid formulation of long-lasting protein conjugate comprising the oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment
US11071785B2 (en) 2012-11-06 2021-07-27 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Liquid formulation of long-lasting protein conjugate comprising the oxyntomodulin and an immunoglobulin Fc region
CN104918632A (zh) * 2012-11-06 2015-09-16 韩美药品株式会社 治疗糖尿病或糖胖病的包括胃泌酸调节素类似物的组合物
US9724420B2 (en) 2012-11-06 2017-08-08 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Liquid formulation of protein conjugate comprising an oxyntomodulin derivative covalently linked to a non-peptidyl polymer to an immunoglobulin FC region
US10550168B2 (en) 2012-11-06 2020-02-04 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Composition for treating diabetes or diabesity comprising oxyntomodulin analog
CN106604739A (zh) * 2014-05-30 2017-04-26 韩美药品株式会社 包括胰岛素和glp‑1/胰高血糖素双重激动剂的用于治疗糖尿病的组合物
US10435459B2 (en) 2014-09-16 2019-10-08 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Use of a long acting GLP-1/glucagon receptor dual agonist for the treatment of non-alcoholic fatty liver disease
US10233230B2 (en) 2014-09-16 2019-03-19 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Use of a long acting GLP-1/glucagon receptor dual agonist for the treatment of non-alcoholic fatty liver disease
US12018060B2 (en) 2014-12-30 2024-06-25 Hanmi Pharm Co., Ltd. Glucagon derivatives
US10513550B2 (en) 2014-12-30 2019-12-24 Hanmi Pharm Co., Ltd Glucagon derivatives
US11254724B2 (en) 2014-12-30 2022-02-22 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Glucagon derivatives
US10647753B2 (en) 2015-08-28 2020-05-12 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analogs and use thereof
CN108136276B (zh) * 2015-09-24 2023-02-28 韩美药品株式会社 通过使用免疫球蛋白片段的特异性位点进行连接的蛋白质复合物
CN108136276A (zh) * 2015-09-24 2018-06-08 韩美药品株式会社 通过使用免疫球蛋白片段的特异性位点进行连接的蛋白质复合物
US11396534B2 (en) 2016-09-23 2022-07-26 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analogs with reduced affinity to insulin receptor and use thereof
CN108299553A (zh) * 2017-01-13 2018-07-20 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 胃泌酸调节素修饰物
US11752216B2 (en) 2017-03-23 2023-09-12 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analog complex with reduced affinity for insulin receptor and use thereof
CN112912095A (zh) * 2018-07-19 2021-06-04 D&D制药技术股份有限公司 包括多肽的药物组合物

Also Published As

Publication number Publication date
AU2012270366B2 (en) 2017-02-02
TW201305195A (zh) 2013-02-01
JP6038905B2 (ja) 2016-12-07
TR201901402T4 (tr) 2019-02-21
CA3080189C (en) 2023-01-17
LT2721062T (lt) 2019-02-11
RU2013153198A (ru) 2015-07-27
JP2017071609A (ja) 2017-04-13
RU2733544C2 (ru) 2020-10-05
AU2018282298B2 (en) 2020-06-18
CN103732616B (zh) 2018-08-17
BR112013032375B1 (pt) 2022-09-20
TWI601744B (zh) 2017-10-11
IL272345B (en) 2021-01-31
SG10201605006XA (en) 2016-08-30
JP2014518209A (ja) 2014-07-28
CN109306015A (zh) 2019-02-05
EP3502129B1 (en) 2021-04-07
KR20120139579A (ko) 2012-12-27
AR125914A2 (es) 2023-08-23
NZ742400A (en) 2021-05-28
AU2018282298A1 (en) 2019-01-17
IL229759A (en) 2017-08-31
EP3502129A1 (en) 2019-06-26
NZ733478A (en) 2020-06-26
US20170340753A1 (en) 2017-11-30
BR112013032375A2 (pt) 2016-11-22
IL257928B (en) 2020-02-27
PH12018501119A1 (en) 2019-02-04
PE20141178A1 (es) 2014-09-12
TW201506037A (zh) 2015-02-16
UA114709C2 (uk) 2017-07-25
PL2721062T3 (pl) 2019-05-31
MX353402B (es) 2018-01-11
PE20230404A1 (es) 2023-03-07
WO2012173422A1 (en) 2012-12-20
JP6345216B2 (ja) 2018-06-20
RS58606B1 (sr) 2019-05-31
US9731031B2 (en) 2017-08-15
CL2013003619A1 (es) 2014-05-30
RU2016147505A3 (zh) 2020-04-08
EP2721062B1 (en) 2018-11-14
HRP20190265T1 (hr) 2019-04-05
ES2882520T3 (es) 2021-12-02
CN109306015B (zh) 2022-04-26
NZ618811A (en) 2016-05-27
SI2721062T1 (sl) 2019-03-29
MX2013014779A (es) 2014-06-23
KR20140133493A (ko) 2014-11-19
AU2017202672A1 (en) 2017-05-11
AU2012270366A1 (en) 2014-01-16
CA3080189A1 (en) 2012-12-20
RU2016147505A (ru) 2018-10-24
AU2017202672B2 (en) 2019-01-17
CA2838504C (en) 2020-07-21
US20190321485A1 (en) 2019-10-24
PE20181268A1 (es) 2018-08-03
IL245556B (en) 2018-03-29
CY1121255T1 (el) 2020-05-29
IL272345A (en) 2020-03-31
TWI519541B (zh) 2016-02-01
EP2721062A1 (en) 2014-04-23
DK3502129T3 (da) 2021-07-12
DK2721062T3 (en) 2019-02-25
IL229759A0 (en) 2014-01-30
NZ718999A (en) 2017-07-28
CA2838504A1 (en) 2012-12-20
KR101591411B1 (ko) 2016-02-05
ES2710356T3 (es) 2019-04-24
KR101577734B1 (ko) 2015-12-29
RU2607365C2 (ru) 2017-01-10
US20140212440A1 (en) 2014-07-31
WO2012173422A9 (en) 2013-03-14
HUE042585T2 (hu) 2019-07-29
AU2012270366C1 (en) 2017-07-13
ZA201309013B (en) 2014-11-26
EP2721062A4 (en) 2014-11-12
MY164680A (en) 2018-01-30
IL245556A0 (en) 2016-06-30
US10363320B2 (en) 2019-07-30
UA125895C2 (uk) 2022-07-06
US11872283B2 (en) 2024-01-16
IL257928A (en) 2018-06-28
PT2721062T (pt) 2019-02-12
AR086969A1 (es) 2014-02-05
SG195275A1 (en) 2013-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103732616A (zh) 包括泌酸调节肽和免疫球蛋白片段的结合物以及其应用
AU2019275590B2 (en) A Composition For Treating Diabetes Or Diabesity Comprising Oxyntomudulin Analog
TWI708614B (zh) 包含調酸素衍生物之治療高血脂症的組成物
CN104884045B (zh) 包括胃泌酸调节素和免疫球蛋白片段的蛋白质缀合物的液体制剂
CN103732618A (zh) 新型泌酸调节肽衍生物和包含该泌酸调节肽衍生物的用于治疗肥胖的药物组合物
TW201803894A (zh) 升糖素衍生物、其接合物、及包含其之組成物、及其醫療用途
CN105229025A (zh) 位点特异性胰岛素缀合物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1193828

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant