CN115776880A

CN115776880A - 液体制剂

Info

Publication number: CN115776880A
Application number: CN202180047801.1A
Authority: CN
Inventors: 文志惠; 李知垠
Original assignee: Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2020-05-22
Filing date: 2021-05-24
Publication date: 2023-03-10
Also published as: WO2021235915A1; JP2023526555A; AU2021276071A1; BR112022023738A2; US20230210949A1; MX2022014670A; CA3179707A1; EP4154867A1; KR20210144608A; IL298428A

Abstract

本发明涉及具有胰高血糖素受体和GLP‑1受体活性的肽的长效缀合物的液体制剂及其制备方法。

Description

液体制剂

技术领域

本发明涉及对胰高血糖素受体和GLP-1受体具有活性的肽的长效缀合物的液体制剂，和制备该液体制剂的方法。

背景技术

由于近年来的经济增长和饮食习惯的改变等，包括各种疾病比如肥胖、高脂血症、高血压、动脉粥样硬化、高胰岛素血症、糖尿病或肝病的代谢综合征相关疾病的发病率正在迅速增加。这些疾病可能独立发生，但在一般情况下，它们大多彼此密切相关，并伴有各种症状。根据世界卫生组织(WHO)，全世界有超过10亿成年人超重，其中有300多万人被临床诊断为肥胖症，并且特别是欧洲每年有25万人，全世界有超过250万人死于超重或肥胖相关的疾病。肥胖症被认为是一种在全世界范围内流行的严重疾病，并且是各种疾病的原因之一，但人们相信通过依靠自身的努力可以克服它。然而，肥胖症并不容易治愈，因为它是一种与食欲控制和能量代谢机制相关的复杂疾病。因此，治疗肥胖症不仅需要患者自身的努力，而且还需要一种能够治疗与食欲控制和能量代谢相关的异常机制的方法。因此，人们一直在努力开发治疗异常机制的药物。

作为这些努力的结果，已经开发了抗肥胖药物，比如

(Sanofi-Aventis)、

(Abbott)、

(Takeda)、

(Roche)等，但它们具有严重不良反应或抗肥胖效果非常弱的缺点。因此，人们进行了许多广泛的研究来开发新型的肥胖症治疗药物，其可用于解决传统抗肥胖症药物的问题。最近，人们把更多注意力集中在胃泌酸调节素上，它对GLP-1受体和胰高血糖素受体中所有都具有活性。胃泌酸调节素是由胰高血糖素前体(前胰高血糖素)产生的肽，并且显示出作为抗肥胖治疗剂的效力，因为它像GLP-1一样抑制食物摄入，促进饱腹感，并像胰高血糖素一样具有脂肪分解活性。基于胃泌酸调节素肽的双重功能，它已被积极研究作为治疗肥胖症的药物。例如，韩国专利号925017公开了一种包括胃泌酸调节素作为活性成分的药物组合物，用于治疗超重的人类，它经由口服、肠胃外、粘膜、直肠、皮下或透皮途径施用。然而，据报道，包括胃泌酸调节素的这种抗肥胖药物具有短的体内半衰期，并且即使是以每天三次的大剂量施用治疗效力也很弱。因此，人们做出了许多努力来通过对胃泌酸调节素的改性来提高其体内半衰期或对肥胖症的治疗效果。同时，以前开发的胃泌酸调节素或其衍生物仍有两个主要缺点，即由于半衰期短和效力低，必须每天施用，而且必须施用过量药物。

发明内容

技术问题

有必要通过在溶液状态的蛋白质或肽中加入稳定剂来保持药物在体内的药效，同时抑制药物在长期储存期间的物理化学变化。

技术方案

本发明的一个目的是提供一种对胰高血糖素受体和GLP-1(胰高血糖素样肽-1)受体具有活性的肽的长效缀合物的液体制剂，其中对胰高血糖素受体和GLP-1受体具有活性的肽与免疫球蛋白Fc片段连接。

本发明的另一个目的是提供一种制备对胰高血糖素受体和GLP-1受体具有活性的肽的长效缀合物的液体制剂的方法。

有益效果

对胰高血糖素受体和GLP-1受体具有活性的肽的长效缀合物的液体制剂是一种新型组合物，其特征在于含有糖而没有糖醇，并在确定药物稳定性以及长期储存稳定性的压力和/或加速测试中具有优异的效果，并且因此可以用作一种可以稳定地储存而不分解药物的新型液体制剂。此外，由于本发明的液体制剂具有与血液相似的渗透压范围，因此在施用至患者时不会引起疼痛，从而提高患者施用的便利性。

具体实施方式

实施本发明的一个方面提供对胰高血糖素受体和GLP-1(胰高血糖素样肽-1)受体具有活性的肽的长效缀合物的液体制剂，其中对胰高血糖素受体和GLP-1受体具有活性的肽与免疫球蛋白Fc片段连接。长效缀合物可以指其中对胰高血糖素受体和GLP-1受体具有活性的肽与免疫球蛋白Fc片段通过接头共价结合的物质。

在一个实施方式中，液体制剂是肽缀合物的液体制剂，其包括下述化学式1的肽缀合物；缓冲剂；糖；和非离子表面活性剂：

[化学式1]

在上述化学式1中，

Q是下述通式1的肽；

Z是免疫球蛋白Fc片段；和

n为自然数，其中n值被确定为使得肽缀合物中[OCH₂CH₂]_n区的平均分子量为10kDa：

[通式1]

His–Xaa2–Gln–Gly–Thr–Phe–Thr–Ser–Asp–Tyr–Ser–Xaa12–Tyr–Leu–Asp–Xaa16–Lys–Arg–Ala–Xaa20–Glu–Phe–Val–Gln–Trp–Leu–Met–Asn–Thr–Cys(SEQ ID NO：1)，

在上述通式1中，

Xaa2是2-氨基异丁酸(Aib)，Xaa12是赖氨酸(K)，Xaa16是谷氨酸(E)，Xaa20是赖氨酸(K)；和

在Xaa12和Xaa16或Xaa16和Xaa20残基之间可以或可以不形成内酰胺环。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其为肽缀合物的液体制剂，其包括18nmol/mL至940nmol/mL的下述化学式1的肽缀合物；将液体制剂的pH维持在4.5至7.5的范围内的量的缓冲剂；1％(w/v)至20％(w/v)的糖；和0.001％(w/v)至0.2％(w/v)的非离子表面活性剂。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，肽的特征在于其包括SEQ ID NO：2、3或4的氨基酸序列。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，Q的特征在于其包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，Q的特征在于其在其C-末端被酰胺化。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，Q的特征在于其经由肽中半胱氨酸的硫原子被连接。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，免疫球蛋白Fc片段的特征在于其源自IgG4。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，Z的特征在于其为其中两条多肽链通过二硫键连接并且仅通过两条链中的一条中的氮原子连接的结构。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，Z的特征在于其包括SEQ ID NO：5的氨基酸序列的单体。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，Z的特征在于其经由在其N-末端的脯氨酸的氮原子连接。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，免疫球蛋白Fc片段和Q的特征在于其为非糖基化的。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其不包括糖醇。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂可以包括或可以不包括等渗剂。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，缓冲剂的特征在于其选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐以及其组合。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，缓冲剂的特征在于其是乙酸及其盐。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的pH的特征在于其为4.8至6.0。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的pH的特征在于其为4.9至5.3。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，缓冲剂的浓度的特征在于其为5mM至100mM，用于将液体制剂的pH维持在的范围内4.5至7.5。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，所述糖的特征在于其为葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或其组合。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，所述糖的特征在于其为蔗糖。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，所述糖的特征在于其以1％(w/v)至20％(w/v)的浓度存在于液体制剂中。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，非离子表面活性剂的特征在于其为泊洛沙姆、聚山梨醇酯或其组合。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，非离子表面活性剂的特征在于其选自泊洛沙姆188、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80，以及其组合。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，非离子表面活性剂的特征在于其以0.001％(w/v)至0.2％(w/v)的浓度存在于液体制剂中。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，上述化学式1的肽缀合物的特征在于其以18nmol/mL至940nmol/mL的浓度存在于液体制剂中。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其进一步包括选自精氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸以及其组合的稳定剂。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其包括：化学式1的肽缀合物；选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐以及其组合的缓冲剂；选自葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或其组合的糖；和选自泊洛沙姆、聚山梨醇酯以及其组合的非离子表面活性剂，其中液体制剂的pH为4.8至6.0。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其包括：化学式1的肽缀合物；5mM至100mM的选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐以及其组合的缓冲剂，用于将液体制剂的pH维持在4.8至6.0的范围内；1％(w/v)至20％(w/v)的选自葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或其组合的糖；和0.001％(w/v)至0.2％(w/v)的选自泊洛沙姆、聚山梨醇酯以及其组合的非离子表面活性剂。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其包括：化学式1的肽缀合物；5mM至100mM的缓冲剂，用于将液体制剂的pH维持在4.8至6.0的范围内；1％(w/v)至20％(w/v)的蔗糖；和0.001％(w/v)至0.2％(w/v)的聚山梨醇酯。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，免疫球蛋白Fc区的特征在于其为IgG-、IgA-、IgD-、IgE-或IgM-衍生的Fc片段。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，免疫球蛋白Fc区的特征在于其选自(a)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域；(b)CH1结构域和CH2结构域；(c)CH1结构域和CH3结构域；(d)CH2结构域和CH3结构域；(e)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域中的一个或两个或更多个结构域与免疫球蛋白铰链区或铰链区的一部分之间的组合；和(f)重链恒定区和轻链恒定区的每个结构域之间的二聚体。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，免疫球蛋白Fc片段的每个结构域的特征在于其为具有不同来源的结构域的杂合体，所述不同来源源自选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，免疫球蛋白Fc片段的特征在于其为由单链免疫球蛋白组成的二聚体或多聚体的形式，该单链免疫球蛋白由相同来源的结构域组成。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，免疫球蛋白Fc片段的特征在于其为IgG4 Fc片段。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，免疫球蛋白Fc片段的特征在于其为人无糖基化的IgG4 Fc片段。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，免疫球蛋白Fc片段的特征在于其为天然Fc衍生物，包括：其中除去能够形成分子间二硫键的位点的修饰；除去其中天然Fc的几个N-末端氨基酸的修饰；其中将甲硫氨酸残基添加到天然Fc的N-末端的修饰；其中除去补体结合位点的修饰；其中除去抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)位点的修饰，或其组合。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其包括：化学式1的肽缀合物，其包括由SEQ ID NO：2、3或4的氨基酸序列组成的Q；5mM至100mM的选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐以及其组合的缓冲剂，用于将液体制剂的pH维持在4.8至6.0的范围内；1％(w/v)至20％(w/v)的选自葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或其组合的糖；和0.001％(w/v)至0.2％(w/v)的选自泊洛沙姆、聚山梨醇酯以及其组合的非离子表面活性剂。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其包括：化学式1的肽缀合物，其包括由SEQ ID NO：2、3或4的氨基酸序列组成的Q；5mM至100mM的选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐以及其组合的缓冲剂，用于将液体制剂的pH维持在4.8至6.0的范围内；1％(w/v)至20％(w/v)的蔗糖；和0.001％(w/v)至0.2％(w/v)的选自泊洛沙姆、聚山梨醇酯以及其组合的非离子表面活性剂。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其包括：93nmol/mL至565nmol/mL的化学式1的肽缀合物，其中具有酰胺化的C-末端的Q经由半胱氨酸的硫原子连接；5mM至25mM的选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐以及其组合的缓冲剂，使得液体制剂的pH为4.8至5.5；4％(w/v)至10％(w/v)的糖；和0.01％(w/v)至0.1％(w/v)的选自泊洛沙姆、聚山梨醇酯或其组合的非离子表面活性剂。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于其包括：93nmol/mL至565nmol/mL的化学式1的肽缀合物，其中具有酰胺化的C-末端的Q经由半胱氨酸的硫原子连接和Z经由在其N-末端的脯氨酸的氮原子连接；5mM至25mM的选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐以及其组合的缓冲剂，使得液体制剂的pH为4.8至5.5；4％(w/v)至10％(w/v)的糖；和0.01％(w/v)至0.1％(w/v)的选自泊洛沙姆、聚山梨醇酯或其组合的非离子表面活性剂。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂中上述化学式1的肽缀合物的浓度的特征在于其为274nmol/mL至474nmol/mL。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂中上述化学式1的肽缀合物的浓度的特征在于其为320nmol/mL至430nmol/mL。

在根据前述任一个实施方式所述的液体制剂中，液体制剂的特征在于当在40℃±2℃和相对湿度75％±5％的应力测试条件下储存一周时其具有透明外观。

实施本发明的另一个方面提供了用于制备肽缀合物的液体制剂的方法，其为根据前述任一个实施方式所述的液体制剂，方法包括：混合(a)化学式1的肽缀合物与(b)i)缓冲剂，ii)糖，和iii)表面活性剂。

具体实施方式

下文将对本发明进行更详细的描述。

同时，本文公开的每个解释和示例性实施方式都可以适用于其他每个解释和示例性实施方式。即，本文公开的各种因素的所有组合属于本发明的范围。此外，本发明的范围不应受到下文提供的具体公开内容的限制。

此外，本领域普通技术人员只需使用常规实验就能认识或证实本文所述的本发明的许多特定方面的等效物。此外，还意欲将这些等效物包括在本发明中。

在本发明的整篇说明书中，不仅使用了天然存在的氨基酸的常规单字母和三字母编码，而且还使用了其他氨基酸通常允许的那些三字母编码，比如α-氨基异丁酸(Aib)等。此外，根据IUPAC-IUB命名规则，本文提到的氨基酸被缩写如下：

丙氨酸Ala、A 精氨酸Arg、R

天冬酰胺Asn、N 天冬氨酸Asp、D

半胱氨酸Cys、C 谷氨酸Glu、E

谷氨酰胺Gln、Q 甘氨酸Gly、G

组氨酸His、H 异亮氨酸Ile、I

亮氨酸Leu、L 赖氨酸Lys、K

甲硫氨酸Met、M 苯丙氨酸Phe、F

脯氨酸Pro、P 丝氨酸Ser、S

苏氨酸Thr、T 色氨酸Trp、W

酪氨酸Tyr、Y 缬氨酸Val、V

实施本发明的一个方面提供了对胰高血糖素受体和GLP-1(胰高血糖素样肽-1)受体具有活性的肽的长效缀合物的液体制剂，其中对胰高血糖素受体和GLP-1受体具有活性的肽与免疫球蛋白Fc片段连接。

具体地，本发明提供了一种液体制剂，其包括下述化学式1的肽缀合物；缓冲剂；糖；和非离子表面活性剂：

[化学式1]

在上述化学式1中，

Q是下述通式1的肽；

Z是免疫球蛋白Fc片段；和

[通式1]

在上述通式1中，

化学式1的肽缀合物具有其中SEQ ID NO：1的肽Q和人免疫球蛋白Fc片段Z通过乙二醇重复单元共价连接的结构，其中每个Q可以与化学式1的琥珀酰亚胺环连接，和Z可以与化学式1的氧丙烯基连接。

肽缀合物的Q可以是对胰高血糖素受体和GLP-1受体具有活性的肽。

在一个实施方式中，Q与化学式1的琥珀酰亚胺环连接的部分可以是Q的C-末端半胱氨酸的硫原子。

Z是人免疫球蛋白Fc片段，并且本说明书中的免疫球蛋白Fc区不仅包括由免疫球蛋白的木瓜蛋白酶消化获得的天然序列，而且还包括其衍生物，例如其中天然序列中的一个或多个氨基酸残基通过删除、插入、非保守或保守取代、或其组合被转化的序列，并且因此序列变得与天然序列不同，等等。

Z中与氧丙烯基连接的部分没有具体限制。在本发明的一个实施方式中，Z中与氧丙烯基连接的部分可以是Z中残基的N-末端氮或氮原子(例如，赖氨酸的ε氮)。在本发明的一个具体实施方式中，其中Z与化学式1的氧丙烯基连接的部分可以是Z的N-末端脯氨酸。

Z可以具有其中两条多肽链通过分子间二硫键连接的结构或其中两条多肽链通过两条链中的仅一条中的氮原子连接的结构，但不限于此。通过氮原子的连接可以经由还原胺化与赖氨酸的ε氨基原子或N-末端氨基连接。

还原胺化反应是指这样的反应，其中一种反应物的胺基或氨基与另一种反应物的醛(即，能够还原胺化的官能团)反应以产生胺，并且此后通过还原反应形成胺键。还原胺化反应是本领域广泛知晓的有机合成反应。

在一个实施方式中，Z可以通过其N-末端脯氨酸的氮原子连接，但不限于此。

在一个实施方式中，免疫球蛋白Fc片段和Q可以是无糖基化的，但不限于此。在本发明中，上述化学式1的肽缀合物被称为“长效缀合物”。在本发明中，长效缀合物可以与“长效胃泌酸调节素衍生物缀合物”或“肽缀合物”互换使用。

如在本文中使用的，术语“液体制剂”是指配制成液体形式的药物，并且旨在包括所有内部使用的液体制剂和外部使用的制剂。

本发明的液体制剂包括显示药理作用的化学式1的肽缀合物，和当其被配制为液体形式时能够将显示药理作用的肽缀合物稳定维持和/或储存一定时间段的物质。

在本发明的化学式1的肽缀合物的液体制剂中，储存稳定性对于确保精确的剂量很重要。

液体制剂可以包括缓冲剂、糖和非离子表面活性剂。这种液体制剂可以是能够稳定储存对胰高血糖素受体和GLP-1受体具有活性的肽的长效缀合物的溶液制剂。

此外，液体制剂可以进一步包括稳定剂，其为选自精氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸以及其组合的氨基酸，但不限于此。

例如，除了展现出药理作用的化学式1的肽缀合物外，液体制剂基本上可以包括缓冲剂、糖和非离子表面活性剂作为液体制剂的组分，或者基本上可以包括缓冲剂、糖和非离子表面活性剂，以及氨基酸稳定剂作为另外的组分，但不特别限于此。本发明人令人吃惊地发现，与含有缓冲剂、糖醇、非离子表面活性剂和氨基酸的常规制剂相比，当糖醇被糖取代时，该肽液体制剂的组成在没有氨基酸稳定剂的情况下显示出优异的稳定性。此外，在含有缓冲剂、糖醇、非离子表面活性剂和氨基酸的现有技术制剂的情况下，存在一个问题，即在能够保证制剂的稳定性的成分浓度下，制剂的渗透压高于血液的渗透压。相比之下，本发明的制剂具有以下优点：渗透压可以降低到与血液相似的水平，而且与现有技术的制剂相比，稳定性至少可以相当或有所提高。具体来说，通过将糖醇改为糖并部分调整现有技术制剂的pH，可以实现上述的稳定性和与血液相似的渗透压。

一般来说，在血液的情况下，渗透压约为300mOsm/kg。本发明的制剂可以具有类似于血液渗透压的范围，例如，300mOsm/kg±50mOsm/kg。如上所述，具有与血液的渗透压相似的本发明制剂在施用至患者时不会引起疼痛，从而提高了施用便利性。

同时，在甲硫氨酸(可以另外地包括在本发明的制剂中的氨基酸)的情况下，甲硫氨酸的存在或不存在不影响稳定性，因此其可以不包括在内。

根据本发明的一个具体实施方式，液体制剂甚至可以将上述长效缀合物稳定维持至多12个月，因此，即使在加速条件下，它也具有优异的长期稳定性和长达6个月的优良残留率，并在应力条件下维持透明外观，直到第4周。

在一个实施方式中，本发明的液体制剂可以不包括糖醇。

在一个实施方式中，本发明的液体制剂可以包括或可以不包括等渗剂。例如，本发明的液体制剂可以不包括氯化钠、硫酸钠或柠檬酸钠，但不限于此。

等渗剂是指可以控制渗透压的物质。当将根据本发明的液体制剂施用到身体时，等渗剂可用于适当地维持渗透压。

等渗剂的代表性实例可以包括作为水溶性无机盐的氯化钠、硫酸钠或柠檬酸钠，具体地氯化钠，但不特别限于此。

根据本发明的液体制剂中的等渗剂的浓度可以是0mM至200mM、0mM至150mM、0mM至100mM、10mM至200mM、10mM至150mM、10mM至100mM、10mM至50mM、20mM至100mM、20mM至80mM、20mM至50mM、20mM至30mM或40mM至50mM，但不特别限于此。这种等渗剂可以是另外包括在上述液体制剂中的任选的组分，并且不特别限于此。

具体而言，显而易见的是，下面描述的所有内容都适用于构成液体制剂的每种组分的类型、浓度或pH。

缓冲剂(其为包括在本发明的液体制剂中的一种组分)可以维持溶液的pH，使得液体制剂的pH不快速改变，以使化学式1的肽缀合物稳定。缓冲剂也可以被称为缓冲系统，并且缓冲剂或缓冲系统用于维持液体制剂的pH。可以没有限制地使用能够维持可以稳定化学式1的肽缀合物的pH的任何缓冲剂，该缀合物为稳定的目标材料。

缓冲剂可以是pH缓冲剂，包括磷酸和其共轭碱金属盐(例如，磷酸盐：磷酸钠、磷酸钾或其氢盐或二氢盐)、柠檬酸及其盐(例如，柠檬酸钠)、乙酸及其盐(例如，乙酸钠)或组氨酸及其盐、并且还可以使用这些缓冲液的混合物，但是缓冲剂不限于此。

本发明的液体制剂可以包括含有缓冲剂的缓冲溶液作为液体制剂的溶剂，并且具体地，缓冲溶液可以选自柠檬酸盐缓冲溶液(例如，柠檬酸钠缓冲溶液)、乙酸盐缓冲溶液(例如，乙酸钠缓冲溶液)、磷酸盐缓冲溶液(例如，磷酸钠缓冲溶液)、组氨酸缓冲溶液，以及其组合。此外，可以以足以维持液体制剂的目标pH的浓度包含液体制剂中的缓冲溶液或缓冲剂(柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐、或其组合)。

液体制剂的pH可以在约4.5至约7.5，例如约4.5至约7.0、约4.5至约6.5、约4.5至约6.3、约4.5至约6.0、约4.5至约5.9、约4.6至约5.8、约4.7至约5.8、约4.8至约6.0、约4.8至5.8、约4.8至约5.7、约4.8至5.6、约4.8至约5.5、约4.8至约5.4、约4.8至约5.3、约4.9至约5.3、约4.9至约5.2、约5.0至约5.2或约5.1的范围内，但不特别限于此。

达到目标pH的液体制剂的浓度可以为约1mM至约200mM、更具体地约5mM至约100mM、约5mM至约80mM、约5mM至约40mM、约8mM至约40mM、约5mM至约30mM或约5mM至约25mM，但不特别限于此。

糖(其为包括在本发明的液体制剂中的一种组分)指单糖、二糖、多糖、寡糖等，并且可以增加对胰高血糖素受体和GLP-1受体具有活性的肽的长效缀合物的稳定性。具体实例可以包括单糖比如甘露糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、岩藻糖和木糖；二糖比如乳糖、麦芽糖和蔗糖；和多糖比如棉子糖和葡聚糖，但不限于此。

相对于液体制剂的总溶液，糖可以以约1％(w/v)至约20％(w/v)、约1％(w/v)至15％(w/v)、约2％(w/v)至约15％(w/v)、约2％(w/v)至约12％(w/v)、约2％(w/v)至约12％(w/v)、约3％(w/v)至约10％(w/v)、约4％(w/v)至约10％(w/v)、约5％(w/v)至约10％(w/v)、约6％(w/v)至约10％(w/v)、约7％(w/v)至约10％(w/v)、约7％(w/v)至约9％(w/v)、约8％(w/v)至约9％(w/v)或约8.5％(w/v)的浓度存在，但不特别限于此。

尽管不特别限于此，非离子表面活性剂(其为包括在液体制剂中的一种组分)降低蛋白质溶液的表面张力，从而防止蛋白质在疏水表面的吸附或聚集。

可用于本发明的非离子表面活性剂的具体实例可以包括聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20(聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯)、聚山梨醇酯40(聚氧乙烯(20)失水山梨醇单棕榈酸酯)、聚山梨醇酯60(聚氧乙烯(20)失水山梨醇单硬脂酸酯)、聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯)；聚氧乙烯基团后面的数值20是指氧乙烯基团–(CH₂CH₂O)–的总数)，泊洛沙姆(PEO–PPO–PEO共聚物；PEO：聚(环氧乙烷)，PPO：聚(环氧丙烷))、聚乙二醇–聚丙二醇、聚氧乙烯化合物(例如，聚氧乙烯-硬脂酸酯、聚氧乙烯烷基醚(烷基：C₁–C₃₀)、聚氧乙烯单烯丙基醚、烷基苯基聚氧乙烯共聚物(烷基：C₁–C₃₀)等)、十二烷基硫酸钠(SDS)等、或聚山梨醇酯或泊洛沙姆。这些也可以单独使用或其两种或更多种组合使用。

具体地，非离子表面活性剂可以是聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯20或泊洛沙姆188，并且这些可以组合使用，但不特别限于此。

在本发明中，优选地不包含高浓度的非离子表面活性剂，并且具体地，所包含的非离子表面活性剂的浓度可以为约0.2％(w/v)或更低，例如约0.001％(w/v)至约0.2％(w/v)、约0.001％(w/v)至约0.1％(w/v)、约0.001％(w/v)至约0.05％(w/v)、约0.005％(w/v)至约0.08％(w/v)、约0.002％(w/v)至约0.05％(w/v)、约0.005％(w/v)至约0.05％(w/v)、约0.01％(w/v)至约0.05％(w/v)、约0.01％(w/v)至约0.04％(w/v)、约0.01％(w/v)至约0.03％(w/v)或约0.02％(w/v)，但是浓度不特别限于此。

氨基酸(作为可以添加到液体制剂的任选组分的稳定剂类型)可以是甲硫氨酸、精氨酸、甘氨酸或其组合，但不限于此。此外，氨基酸可以是L-形式，但不特别限于此。

氨基酸可以抑制由于蛋白质的氧化反应而可能发生的杂质生成，但不特别限于此。

氨基酸可以以约0.01mg/mL至约1mg/mL、约0.01mg/mL至约0.8mg/mL、约0.01mg/mL至约0.5mg/mL、约0.02mg/mL至约0.5mg/mL或约0.02mg/mL至约0.4mg/mL的浓度存在于制剂中，但不特别限于此。

同时，除了糖；缓冲剂；和非离子表面活性剂(其为上述液体制剂的必要组分)；和氨基酸(其为任选的组分)之外，本发明的液体制剂可以任选地进一步包括在不损害本发明的效果的范围内的本领域已知的其他组分或材料，但不限于此。

化学式1的肽缀合物可以以药学上有效的量存在。例如，化学式1的肽缀合物的浓度可以为约18nmol/mL至约940nmol/mL、约18.7nmol/mL至约935nmol/mL约18nmol/mL至约842nmol/mL、约18nmol/mL至约748nmol/mL、约18nmol/mL至约655nmol/mL、约18nmol/mL至约561nmol/mL、约18nmol/mL至约468nmol/mL、约18nmol/mL至约374nmol/mL、约93nmol/mL至约940nmol/mL、约93.5nmol/mL至约561nmol/mL、约93nmol/mL至约842nmol/mL、约93nmol/mL至约748nmol/mL、约93nmol/mL至约655nmol/mL、约93nmol/mL至约565nmol/mL、约93nmol/mL至约561nmol/mL、约93nmol/mL至约468nmol/mL、约150nmol/mL至约468nmol/mL、约200nmol/mL至约468nmol/mL、约250nmol/mL至约468nmol/mL、约274nmol/mL至约474nmol/mL、约280nmol/mL至约468nmol/mL、约300nmol/mL至约468nmol/mL、约300nmol/mL至约450nmol/mL、约320nmol/mL至约430nmol/mL、约320nmol/mL至约440nmol/mL、约340nmol/mL至约420nmol/mL、约340nmol/mL至约400nmol/mL、约350nmol/mL至约400nmol/mL、约360nmol/mL至约390nmol/mL、约365nmol/mL至约385nmol/mL、约370nmol/mL至约380nmol/mL约93nmol/mL至约374nmol/mL或约374nmol/mL，但不限于此。

如在本文中使用的，术语“约”是指包括所有的±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等的范围，并且包括与这些值后面的值相当或相似的所有值，但是范围不限于此。

在一个实施方式中，液体制剂可以包括化学式1的肽缀合物；选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐以及其组合的缓冲剂；选自葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或其组合的糖；和选自泊洛沙姆、聚山梨醇酯以及其组合的非离子表面活性剂，并且液体制剂的pH可以是4.8至6.0。

在一个实施方式中，液体制剂可以包括18nmol/mL至940nmol/mL的化学式1的肽缀合物；5mM至100mM的选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐以及其组合的缓冲剂，用于将液体制剂的pH维持在4.8至6.0的范围内；1％(w/v)至20％(w/v)的选自葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或其组合的糖；和0.001％(w/v)至0.2％(w/v)的选自泊洛沙姆、聚山梨醇酯以及其组合的非离子表面活性剂。

在一个实施方式中，液体制剂可以包括18nmol/mL至940nmol/mL的化学式1的肽缀合物；5mM至100mM的乙酸及其盐，用于将液体制剂的pH维持在4.8至6.0的范围内；1％(w/v)至20％(w/v)的蔗糖；和0.001％(w/v)至0.2％(w/v)的聚山梨醇酯，但不限于此。

在一个实施方式中，液体制剂可以是含有以下的液体制剂：93nmol/mL至565nmol/mL的化学式1的肽缀合物，其中具有酰胺化的C-末端的Q经由半胱氨酸的硫原子连接；5mM至25mM的选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐以及其组合的缓冲剂，使得液体制剂的pH为4.8至5.5；4％(w/v)至10％(w/v)的糖；和0.01％(w/v)至0.1％(w/v)的选自泊洛沙姆、聚山梨醇酯或其组合的非离子表面活性剂，但不限于此。

当在40℃±2℃和相对湿度75％±5％的应力测试条件下储存一周时，液体制剂可以具有透明的外观。

在一个实施方式中，当在40℃±2℃和相对湿度75％±5％的应力测试条件下储存约1周或更长、约2周或更长、约3周或更长、约4周或更长时，液体制剂可以具有透明的外观。

根据本发明的实施方式，证实了与由缓冲剂；糖醇；氨基酸；和非离子表面活性剂组成的液体制剂相比，除了化学式1的肽缀合物之外由缓冲剂；糖；和非离子表面活性剂组成的液体制剂在25℃±2℃和相对湿度60％±5％的加速条件具有长达6个月的高稳定性，并且当在40℃±2℃和相对湿度75％±5％的应力测试条件下储存一周时该液体制剂显示出透明的外观，并且甚至在4周之后仍显示出透明的外观(表6至9)。

如在本文中所使用的，术语“加速测试”是指通过采用药物产品的正式稳定性测试的一些过度储存条件，旨在增加药物物质或药物产品的化学降解或物理变化的测试。除长期稳定性测试外，加速测试利用加速测试数据评价非加速条件下的长期化学效应，并可评价当条件在短期内偏离指定储存条件时的效应，比如运输过程中可能出现的情况。此外，与正常储存条件相比，它是一种旨在提高原材料或药物在过高温度或湿度条件下的化学变性或物理变化速度的测试。

如在本文中所使用的，术语“应力测试”是指旨在确定药物稳定性的基本特征的测试。它在药物开发过程中进行，并在比加速测试更多的应力条件下进行，并且它有助于确定药物的预期降解产物和物理变化。

化学式1的肽缀合物的Q可以是对胰高血糖素受体和GLP-1(胰高血糖素样肽-1)受体具有活性的肽。“对胰高血糖素受体和GLP-1(胰高血糖素样肽-1)受体具有活性的肽”包括对胰高血糖素受体和GLP-1受体具有显著活性水平的各种物质，比如各种肽。

尽管其不特别限于此，对胰高血糖素受体和GLP-1受体具有显著活性水平的肽可以与“GCG/GLP-1受体双重激动剂”、“双重激动剂”、“胃泌酸调节素衍生物”互换使用。

更具体地，对胰高血糖素受体和GLP-1受体具有活性的肽可以是包括下述通式1的序列的对胰高血糖素受体和GLP-1受体具有活性的肽：

[通式1]

在上述通式1中，

在本说明书中，“Aib”可以与“2-氨基异丁酸”或“氨基异丁酸”互换使用，并且2-氨基异丁酸和氨基异丁酸可以彼此互换使用。

肽可以包括SEQ ID NO：2、3或4的氨基酸序列或(基本上)由选自SEQ ID NO：2、3或4的氨基酸序列组成，但不限于此。

此外，尽管在本发明中被描述为“由特定SEQ ID NO组成的肽”，但是不排除通过在相应的SEQ ID NO的氨基酸序列的上游或下游添加无意义的序列而可能发生的突变，或可能天然发生的突变，或其沉默突变，只要该肽具有与由相应SEQ ID NO的氨基酸序列组成的肽相同或相应的活性，并且即使在存在序列添加或突变时也显然属于本发明的范围。

同时，肽可以是非天然存在的。

肽的C-末端可以是酰胺化的肽或具有游离羧基(–COOH)的肽或可以包括具有未修饰的C-末端的肽，但不限于此。

在一个实施方式中，Q可以在C-末端被酰胺化，但不限于此。

在一个实施方式中，Q可以是非糖基化的，但不限于此。

此外，对胰高血糖素受体和GLP-1受体具有活性的肽可以包括分子内桥，例如，共价桥或非共价桥，并且具体地可以是包括环的形式。在第12位氨基酸和第16位氨基酸之间或第16位氨基酸和第20位氨基酸之间可以形成环，但不特别限于此。环的非限制性实例可以包括内酰胺桥(或内酰胺环)。

此外，根据本发明的肽可以包括肽本身、其盐(例如，肽的药学上可接受的盐)或其溶剂化物的形式的所有那些。此外，肽可以是任何药学上可接受的形式。

盐的种类没有特别限制。然而，盐优选地为对受试者(例如，哺乳动物)安全且有效的盐，但不特别限于此。

术语“药学上可接受的”是指在药物医学决策的范围内可有效地用于预定用途，而不会引起过度的毒性、刺激、过敏反应等的材料。

如在本文中使用的，术语“药学上可接受的盐”是指源自药学上可接受的无机酸、有机酸或碱的盐。合适的盐的实例可以包括盐酸、溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、甲苯-对-磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲烷磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。源自合适的碱的盐的实例可以包括碱金属比如钠、钾等；碱土金属比如镁；铵等。

如在本文中使用的，术语“溶剂化物”是指根据本发明的肽或其盐与溶剂分子之间形成的复合物。

如在本文中使用的，术语“化学式1的肽缀合物”，作为包括在本发明的液体制剂中的活性成分，可以以药理学有效的量包括在液体制剂中。具体地，缀合物是其中对胰高血糖素受体和GLP-1受体具有活性的肽与免疫球蛋白Fc区通过接头彼此连接的形式，并且可以展现出与没有与免疫球蛋白Fc区连接的对胰高血糖素受体和GLP-1受体具有活性的肽相比增强的药效持续时间。在本发明中，这种缀合物被称为“长效缀合物”。在本发明中，长效缀合物与“长效胃泌酸调节素衍生物缀合物”或“肽缀合物”互换使用。

同时，缀合物可以是非天然存在的。

此外，在化学式1的肽缀合物中，Q(对胰高血糖素受体和GLP-1受体具有活性的肽)和免疫球蛋白Fc片段之间的连接可以通过物理或化学键、非共价或共价键，并且具体地共价键来实现，但不限于此。

此外，在化学式1的肽缀合物中，连接Q(对胰高血糖素受体和GLP-1受体具有活性的肽)和免疫球蛋白Fc片段的方法没有特别限制，但是对胰高血糖素受体和GLP-1受体具有活性的肽和免疫球蛋白Fc片段可以通过接头彼此连接。

具体地，包括在本发明的液体制剂中的长效缀合物可以是由上述化学式1表示的缀合物。

制备肽缀合物的方法在韩国专利号10-725315中进行了描述，并且其整篇说明书通过引用并入本文。

如在本文中使用的，术语“免疫球蛋白Fc片段”是指不包括免疫球蛋白的重链和轻链可变区域的重链恒定区。具体地，免疫球蛋白Fc片段可以包括重链恒定区2(CH2)和/或重链恒定区3(CH3)部分，并且更具体地可以进一步包括铰链区(铰链区的全部或部分)。

免疫球蛋白Fc片段可以是构成本发明的化学式1的肽缀合物的部分的结构。具体地，它可以对应于上述化学式1中的Z。

这种免疫球蛋白Fc片段可以包括重链恒定区中的铰链区，但不限于此。

在本发明中，免疫球蛋白Fc片段可以在N-末端包括特定铰链序列。

如在本文中使用的，术语“铰链序列”是指位于重链中并通过分子间二硫键形成免疫球蛋白Fc片段的二聚体的区域。

在本发明中，铰链序列可以被修饰，使得具有下述氨基酸序列的铰链序列的一部分被删除，并且因此在该序列中只有一个半胱氨酸残基，但不限于此：

Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO：6)。

铰链序列可以是这样的序列，其中SEQ ID NO：6的铰链序列的第8个或第11个半胱氨酸残基被删除，并且因此在该序列中仅包括一个半胱氨酸残基。本发明的铰链序列可以由3至12个氨基酸(仅包括一个半胱氨酸残基)组成，但是铰链序列不限于此。更具体地，本发明的铰链序列可以具有下述序列：Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO：7)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Ser–Pro(SEQ ID NO：8)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Ser(SEQ ID NO：9)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Pro(SEQ ID NO：10)、Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Ser(SEQ ID NO：11)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys(SEQ ID NO：12)、Glu–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys(SEQ IDNO：13)、Glu–Ser–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO：14)、Glu–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO：15)、Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO：16)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQID NO：17)、Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO：18)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO：19)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys(SEQ ID NO：20)、Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro(SEQ ID NO：21)、Glu–Ser–Lys–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQID NO：22)、Glu–Ser–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO：23)、Glu–Pro–Ser–Cys(SEQ ID NO：24)，Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO：25)。更具体地，铰链序列可以包括SEQ ID NO：25(Ser–Cys–Pro)或SEQ ID NO：16(Pro–Ser–Cys–Pro)的氨基酸序列，但不限于此。

本发明的免疫球蛋白Fc片段可以是其中由于其中存在铰链序列而使免疫球蛋白Fc链的两个分子形成二聚体的形式，并且另外，本发明的化学式1的肽缀合物可以是其中接头的一端与二聚体免疫球蛋白Fc片段的一条链连接的形式，但是免疫球蛋白Fc片段和缀合物不限于此。

如在本文中使用的，术语“N-末端”是指蛋白质或多肽的氨基末端，并且它可以包括从最末端开始的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个氨基酸或氨基末端的最末端。本发明的免疫球蛋白Fc片段可以包括N-末端的铰链序列，但不限于此。

此外，本发明的免疫球蛋白Fc片段可以是扩展的Fc片段，其包括重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)的全部或部分，不包括免疫球蛋白的重链和轻链可变区，只要它与其天然类型相比具有基本上相当或改善的效果。此外，本发明的免疫球蛋白Fc片段可以是其中对应于CH2和/或CH3的一些相当长的氨基酸序列被移除的区域。

例如，本发明的免疫球蛋白Fc片段可以是：1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域；2)CH1结构域和CH2结构域；3)CH1结构域和CH3结构域；4)CH2结构域和CH3结构域；5)(i)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域中的一个或两个或更多个结构域和(ii)免疫球蛋白铰链区(或铰链区的一部分)的组合；或6)重链恒定区和轻链恒定区的每个结构域的二聚体，但是免疫球蛋白Fc区不限于此。

此外，在一个实施方式中，免疫球蛋白Fc片段可以具有二聚体形式，并且通式1的肽的一个分子可以与二聚体形式的一个Fc区共价连接，具体而言，免疫球蛋白Fc和通式1的肽可以通过聚乙二醇接头彼此共价连接。同时，还有可能将通式1的肽的两个分子与二聚体形式的一个Fc区对称连接。具体而言，免疫球蛋白Fc和通式1的肽可以通过聚乙二醇接头彼此连接，但不限于上述实施方式。

此外，本发明的免疫球蛋白Fc片段包括天然氨基酸序列以及其序列衍生物。氨基酸序列衍生物是指由于在天然氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基的删除、插入、非保守或保守取代、或其组合而使该序列与天然氨基酸序列不同。

例如，已知对连接很重要的IgG Fc中第214至238、297至299、318至322或327至331位的氨基酸残基可用作适合变异的位点。

此外，可以获得各种类型的衍生物，例如，其中去除能够形成分子间二硫键的位点的衍生物；其中从天然Fc去除几个N-末端氨基酸的衍生物；或其中将甲硫氨酸残基添加到天然Fc的N-末端的衍生物，等等。此外，可以去除补体结合位点(例如，C1q结合位点)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)位点以消除效应器功能。在国际公开号WO 97/34631、WO96/32478等中公开了用于制备这些免疫球蛋白Fc片段的序列衍生物的技术。

蛋白质或肽中不改变分子的整体活性的氨基酸取代在本领域是众所周知的(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常见的取代发生在以下的氨基酸残基之间：Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。在一些情况下，氨基酸可以通过磷酸化、硫酸盐化、丙烯酰化、糖基化、甲基化、法尼酰化、乙酰化、酰胺化等被修饰。

上述Fc衍生物可以是展现出与本发明的Fc片段相同的生物活性并具有增加的Fc片段对热、pH等的结构稳定性的那些。

此外，这种Fc片段可以获得自从人或动物(例如，母牛、山羊、猪、小鼠、兔子、仓鼠、大鼠、豚鼠等)分离的天然类型或可以是从转化的动物细胞或微生物获得的重组体或其衍生物。具体而言，Fc区可以通过从活人或动物分离出整个免疫球蛋白并用蛋白酶处理分离出的免疫球蛋白而从天然免疫球蛋白获得。当用木瓜蛋白酶处理整个免疫球蛋白时，它被裂解为Fab和Fc片段，而当用胃蛋白酶处理时，它被裂解为pF′c和F(ab)₂片段。Fc或pF′c可以使用尺寸排阻色谱法等分离。在更具体实施方式中，Fc片段可以是人免疫球蛋白Fc片段，其中人衍生的Fc片段从微生物中获得。

此外，免疫球蛋白Fc片段可以是天然聚糖的形式、与天然类型相比增加或减少的聚糖、或去糖基化形式。免疫球蛋白Fc聚糖的增加、减少或去除可以通过常规方法比如化学方法、酶法以及使用微生物的基因工程方法来实现。具体而言，其中从Fc中除去聚糖的免疫球蛋白Fc片段显示出对补体(C1q)的结合亲和力显著下降以及抗体依赖性细胞毒性或补体依赖性细胞毒性的降低或去除，并且因此它在体内不会诱发不必要的免疫反应。在这方面，去糖基化或无糖基化形式的免疫球蛋白Fc片段可能更适合满足本发明作为药物载体的初始目的。

如在本文中使用的，术语“去糖基化”是指其中用酶除去聚糖的Fc片段，和术语“无糖基化”是指在原核生物中产生的非糖基化的Fc片段，更具体地是大肠埃希杆菌。

同时，免疫球蛋白Fc片段可以源自人或动物(例如，母牛、山羊、猪、小鼠、兔子、仓鼠、大鼠、豚鼠等)，并且在更具体的实施方式中，它可以源自人。

此外，免疫球蛋白Fc片段可以源自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其组合或杂合体。在更具体实施方式中，免疫球蛋白Fc片段可以源自IgG或IgM，它们是人类血液中最丰富的蛋白质之一，并且在甚至更具体的实施方式中，它可以源自IgG，已知它能够提高配体结合蛋白的半衰期。在甚至更具体的实施方式中，免疫球蛋白Fc片段可以是IgG4 Fc片段，并且在最具体的实施方式中，它可以是源自人IgG4的无糖基化的Fc片段，但不限于此。

此外，在一个实施方式中，免疫球蛋白Fc片段(为人IgG4 Fc片段)可以是同源二聚体的形式，其中两个单体通过半胱氨酸(其为每个单体的第3个氨基酸)之间的分子间二硫键(链间形式)连接。具体而言，同源二聚体可以具有两个二硫键(链内形式)，即，在一个单体中第35和95位的半胱氨酸之间的分子内二硫键和在另一个单体中第141和199位的半胱氨酸之间的分子内二硫键；和/或每个单体可以由221个氨基酸组成，并且形成同源二聚体的氨基酸可以由总共442个氨基酸组成，但是氨基酸的数量不限于此。具体地，免疫球蛋白Fc片段可以是这样的片段，其中具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的两个单体(由221个氨基酸组成)通过半胱氨酸(其为每个单体的第3个氨基酸)之间的分子间二硫键形成同源二聚体，并且其中同源二聚体的单体独立地形成在第35和95位的半胱氨酸之间的分子内二硫键和在第141和199位的半胱氨酸之间的分子内二硫键，但是免疫球蛋白Fc片段不限于此。在一个实施例中，免疫球蛋白Fc片段可以是包括SEQ ID NO：26的氨基酸序列的同源二聚体(由442个氨基酸组成)，但不限于此。

同时，如在本文中使用的，术语“组合”是指编码同一来源的单链免疫球蛋白Fc片段的多肽与不同来源的单链多肽连接以形成二聚体或多聚体。

即，可以由选自IgG Fc片段、IgA Fc片段、IgM Fc片段、IgD Fc片段和IgE Fc片段的两个或更多个片段制备二聚体或多聚体。

如在本文中使用的，术语“杂合”是指在免疫球蛋白恒定区的一条链中存在对应于两个或多个不同来源的免疫球蛋白Fc片段的序列。在本发明中，各种杂合形式都是可能的。例如，杂合结构域可以由选自IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc和IgD Fc的CH1、CH2、CH3和CH4的1至4个结构域组成，并且可以进一步包括铰链区。

同时，IgG也可以划分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类，并且本发明可以包括其组合或杂合。优选的是IgG2和IgG4亚类，并且最优选的是IgG4的Fc片段，它很少具有效应功能，比如补体依赖性细胞毒性(CDC)。

实施本发明的另一个方面提供了用于制备化学式1的肽缀合物的液体制剂的方法，其包括：混合(a)化学式1的肽缀合物与(b)i)缓冲剂、ii)糖和iii)非离子表面活性剂。

缀合物、缓冲剂、糖、非离子表面活性剂和液体制剂如上所述。

本发明的仍另一个方面提供了用于预防或治疗肥胖或糖尿病的药物组合物，包括液体制剂。

如在本文中使用的，术语“预防”是指抑制或延迟目标疾病发展的所有行动。如在本文中使用的，术语“预防”是指施用本发明的缀合物以抑制或延迟糖尿病病症的发展，比如血糖水平异常或胰岛素分泌异常，或肥胖病症，比如体重或体脂增加。

如本文所使用的，术语“治疗”是指减轻、改善或缓解所患疾病的症状的所有行动。如在本文中使用的，术语“治疗”是指施用本发明的缀合物以减轻、改善或缓解上述糖尿病病症或肥胖病症，使血糖水平和胰岛素分泌正常化并减少体重或体脂。

如在本文中使用的，术语“肥胖症”是指体内脂肪组织量过多。体重指数(＝体重(kg)除以身高(m)²)达到或超过25被定义为肥胖症。肥胖症一般是由于能量不平衡造成的，即随着时间的推移，能量摄入超过了能量消耗。肥胖症是一种影响整个身体的代谢性疾病，并且极有可能导致糖尿病和高脂血症。此外，肥胖症与性功能障碍、关节炎和心血管疾病的发展的风险增加有关，并且在某些情况下还与癌症的发展有关。

如本文所使用的术语“糖尿病”是指一种代谢疾病，其中胰岛素分泌不足或不能发挥正常功能。糖尿病的特征在于高血糖，即血糖水平升高，从而引起各种症状，并且因此，葡萄糖会随尿液排出。

本发明的药物组合物可进一步包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。如在本文中使用的，术语“药学上可接受的”是指足以表现出治疗效果且不会引起副作用的量。本发明的药物组合物的活性成分的剂量可由本领域的技术人员根据疾病的类型、患者的年龄、体重、健康状况、性别和药物敏感性、施用途径、施用方式、施用频率、治疗时间、与该组合物联合使用或同时使用的药物以及医学领域已知的其他因素而容易确定。

然而，本发明的又另一个方面提供了一种预防或治疗肥胖症或糖尿病的方法，其包括向受试者施用该液体制剂。

液体制剂、肥胖和糖尿病如上所述。

如在本文中使用的，术语“受试者”是指怀疑患有肥胖症或糖尿病的受试者，并且是指哺乳动物，包括人类、大鼠和家畜，它们有或有患上述疾病的风险。然而，受试者可以是任何可由本发明的液体制剂治疗的受试者。

本发明的治疗方法可以包括以药学有效量施用包括该液体制剂的药物组合物。适当的每日总剂量可在执业医师正确的医疗判断范围内确定，并且可一次或多次分次施用。然而，出于本发明的目的，优选的是任何特定患者的具体治疗有效剂量根据要达到的反应的种类和程度、具体组合物(包括是否偶尔与其他药剂一起使用)、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、施用时间、施用途径、组合物的排泄率、治疗持续时间、包括药物与具体组合物联合或同时使用的各种因素以及在医学领域众所周知的类似因素而不同地应用。

下文将参照以下实施例对本发明进行更详细的描述。然而，这些实施例仅用于说明目的，并且本发明的范围不受这些实施例的限制。

实施例1：GLP-1/胰高血糖素受体双重激动剂的制备

为了测量对GLP-1受体和胰高血糖素受体都表现出活性的GLP-1/胰高血糖素受体双重激动剂的稳定性，在本发明的液体制剂中，合成了具有以下氨基酸序列的GLP-1/胰高血糖素受体双重激动剂(表1)。在本发明中，GLP-1/胰高血糖素受体双重激动剂可与胃泌酸调节素衍生物互换使用。

[表1]

表1中用粗体表示的氨基酸是指用粗体表示的氨基酸彼此形成环。此外，Aib表示氨基丁酸(一种非天然的氨基酸)。

实施例2：单-PEG化的免疫球蛋白Fc片段的制备

实施例2-1.单-PEG化的免疫球蛋白Fc片段的制备

为了制备具有其中免疫球蛋白Fc片段的两个N-末端中的一个被PEG化的结构的单-PEG化免疫球蛋白Fc片段，将N-末端具有Pro-Ser-Cys-Pro序列的铰链区的免疫球蛋白Fc区(49.8kDa，SEQ ID NO：5的同源二聚体)与化学式2的PEG接头(数均分子量为10kDa)以1：1(免疫球蛋白Fc区：PEG接头)的摩尔比在6℃±4℃下与浓度为50g/L的免疫球蛋白Fc区反应约4小时。

[化学式2]

具体来说，该反应是在包括5mM Bis-Tris缓冲液(pH 6.5)和磷酸钾的组合物中进行的，并在其中加入10mM NaCNBH₃(氰基硼氢化钠)作为还原剂。为了获得单-PEG化的免疫球蛋白Fc片段，用Bis-Tris缓冲液稀释反应液并进行纯化。

在此，使用含有Bis-Tris的缓冲液和氯化钠浓度梯度通过CaptoQ ImpRes柱(GEHealthcare，阴离子交换色谱法)纯化单-PEG化的免疫球蛋白Fc片段。

实施例2-2.单-PEG化的免疫球蛋白Fc片段的结构分析

通过MALDI-TOF和肽图对实施例2-1中制备的单-PEG化的免疫球蛋白Fc片段进行结构分析。作为MALDI-TOF的结果，结果与单-PEG化的免疫球蛋白Fc片段的预期分子量相同，并且作为肽图的结果，证实超过90％的PEG在免疫球蛋白Fc片段的N-末端被PEG化。

同时，作为使用SE-HPLC、RP-HPLC和IE-HPLC检测分析上述实施例2-1中制备的单-PEG化的免疫球蛋白Fc片段(化学式3)的结果，证实SE-HPLC中的纯度为90％或更高，RP-HPLC中的纯度为90％或更高，和IE-HPLC中的纯度为80％或更高。

[化学式3]

实施例3：通过将PEG化的免疫球蛋白Fc片段与胃泌酸调节素衍生物连接来制备缀合物

如下通过将实施例2-1中制备的单-PEG化免疫球蛋白Fc片段与选择作为代表性的胃泌酸调节素衍生物的SEQ ID NO：3的胃泌酸调节素衍生物(在C-末端酰胺化)连接来制备长效缀合物。

单-PEG化的免疫球蛋白Fc片段经由肽缀合(不进行超滤/透析过滤)与胃泌酸调节素衍生物反应。具体来说，在实施例2-1的离子交换色谱法(不进行超滤/透析过滤)之后，经由胃泌酸调节素衍生物(SEQ ID NO：3)(其为GLP-1/胰高血糖素受体双重激动剂)的肽缀合来制备长效缀合物(免疫球蛋白Fc片段–含PEG的接头–胃泌酸调节素衍生物)。在本发明中，术语“长效缀合物”可以与“长效胃泌酸调节素衍生物缀合物”互换使用。

在此，为了将单-PEG化的免疫球蛋白Fc片段的PEG的一个末端的马来酰亚胺反应性基团与胃泌酸调节素衍生物的半胱氨酸连接，单-PEG化的免疫球蛋白Fc片段与胃泌酸调节素衍生物以1：1的摩尔比在6℃±4℃下反应约2小时，其中胃泌酸调节素衍生物蛋白质浓度为0.2g/L。具体而言，将反应液维持在包括异丙醇的Tris-Cl缓冲液(6℃±4℃)中。作为使用SE-HPLC、RP-HPLC和IE-HPLC检测法分析反应后的所得物的结果，证实免疫球蛋白Fc片段-含PEG的接头-胃泌酸调节素衍生物(化学式4)的纯度，SE-HPLC中为90％或更高，RP-HPLC中为80％或更高，以及IE-HPLC中为80％或更高。

此后，使用Source 15ISO柱(GE Healthcare)对反应的所得物进行疏水相互作用色谱法。通过这一过程消除了副产品，并且获得了免疫球蛋白Fc片段-含PEG的接头-胃泌酸调节素衍生物缀合物。在此，使用含有柠檬酸钠和硫酸铵浓度梯度的缓冲液对该缀合物进行纯化。

通过MALDI-TOF、SE-HPLC、RP-HPLC和IE-HPLC测试分析洗脱的免疫球蛋白Fc片段-含PEG的接头-胃泌酸调节素衍生物缀合物(化学式4)。基于MALDI-TOF的分析结果，证实所得物与免疫球蛋白Fc片段-含PEG的接头-胃泌酸调节素衍生物缀合物的预期分子量相同。同时，证实该缀合物的制备纯度很高，SE-HPLC中90％或更高，RP-HPLC中为90％或更高，以及IE-HPLC中为90％或更高。

[化学式4]

实施例4：液体制剂的制备和渗透压的评估

为了证实液体制剂的稳定性(该液体制剂是在实施例3中制备的长效胃泌酸调节素衍生物缀合物的新制备的组合物)，作为比较例，根据下文表2中所示的组合物，制备了国际公开号WO 2014-073842中公开的组合物的液体制剂(比较例)和根据本发明的新组合物的液体制剂(实施例)。对于实施例的制剂，作为缓冲剂、糖和非离子表面活性剂的代表性实例，即本发明的稳定剂的组成，选择乙酸及其钠盐作为缓冲剂，蔗糖作为糖，聚山梨酯20作为非离子表面活性剂。

比较例的制剂(其为常规制剂)的渗透压比血液高，并且此外，为了进一步提高稳定性，还制备了新的制剂。将甘露糖醇改为蔗糖，同时降低常规制剂的pH以提高稳定性。因此，证实渗透压也降低到与血液相似的水平，并且甲硫氨酸的添加与否对稳定性没有影响，并且因此在本发明的实施例中省略。作为测量渗透压的结果，比较例的制剂的渗透压为494mOsm/kg，并且实施例的制剂的渗透压为305mOsm/kg，其处于与血液的渗透压(约300mOsm/kg)相似的水平。

[表2]

实施例5：实施例的液体制剂的长期稳定性评价

为了确认实施例4中制备的长效胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂组合物(实施例)的长期稳定性，将其在5℃±3℃下储存0至12个月，并且然后使用离子交换高效液相色谱法(IE-HPLC)、尺寸排阻法(SE-HPLC)和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)进行稳定性分析。在表3、4和5中，IE-HPLC(％)、RP-HPLC(％)和SE-HPLC(％)表示在每个分析点处对应于长效胃泌酸调节素衍生物缀合物的峰的面积％。

[表3]

[表4]

[表5]

从上述结果可以看出，证实本发明的液体制剂组合物在长达12个月内具有高稳定性，并且因此可以发现它是长期储存的最佳组合物。

实施例6：加速稳定性评价

为了确认实施例4中制备的实施例液体制剂和比较例的液体制剂的加速稳定性，将液体制剂在25℃±2℃和60％±5％的相对湿度下储存0至6个月，并且然后使用IE-HPLC、RP-HPLC和SE-HPLC分析其稳定性。加速稳定性测试是指通过采用过度的储存条件来增加药物物质或药物产品的化学降解或物理变化的测试。除长期稳定性测试外，加速稳定性测试通过加速稳定性评价在非加速条件下评价长时段的化学效应，并可评价当条件在短期内偏离指定储存条件时的效应，比如运输过程中可能出现的情况。在表6、7和8中，IE-HPLC(％)、RP-HPLC(％)和SE-HPLC(％)表示在每个分析点处对应于长效胃泌酸调节素衍生物缀合物的峰的面积％。

[表6]

[表7]

[表8]

从表6、7和8的结果可以看出，证实了与比较例相比，液体制剂组合物(其中不存在本发明的糖醇而存在蔗糖(一种糖))在加速条件下在长达6个月内显示出高稳定性。这些结果表明，本发明的液体制剂组合物具有高稳定性。

实施例7：应力稳定性评价

为了确认实施例4中制备的长效胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂(实施例)的应力稳定性，在40℃±2℃和75％±5％相对湿度的条件下储存0到4周，并将其外观与比较例的液体制剂分开分析。

应力稳定性测试是为了确定当产品暴露在所应用的储存条件以外的条件下，条件变化对产品的影响，并确定药物物质和/或药物产品的降解模式和理化稳定性。表9显示了比较例和实施例的液体制剂在应力条件下的外观。

[表9]

从表9的结果可以看出，在比较例的液体制剂组合物处于应力条件下的情况下，从第1周开始，长效胃泌酸调节素衍生物缀合物的外观变得不透明，并在第3周时发生沉淀；相反，实施例的组合物，其为其中不存在本发明的糖醇而存在蔗糖(一种糖)的液体制剂组合物，甚至直到第4周都保持透明的外观，证实了作为稳定目标的长效胃泌酸调节素衍生物缀合物是稳定的，没有沉淀。这些结果表明，本发明的液体制剂组合物比已知组合物具有更高的稳定性，并且因此可以作为药品的液体制剂提供。

从上述内容来看，本发明所涉及领域的技术人员能够理解，本发明可以在不修改本发明的技术概念或基本特征的情况下以其他具体形式体现出来。在这方面，本文公开的示例性实施方式仅用于说明目的，并且不应解释为限制本发明的范围。相反，本发明旨在不仅包括示例性实施方式，而且还包括可能包括在本发明的精神和范围内的各种替代方案、修改方案、等同方案和其他实施方式，如所附的权利要求书所限定。

<110> 韩美药品株式会社

<120> 液体制剂

<130> OPA21220-PCT

<150> KR 10-2020-0061879

<151> 2020-05-22

<160> 26

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胃泌酸调节素衍生物的式1

<220>

<221> 变体

<222> (2)

<223> Xaa=2-氨基异丁酸

<220>

<221> 变体

<222> (12)

<223> Xaa=赖氨酸

<220>

<221> 变体

<222> (16)

<223> Xaa=谷氨酸

<220>

<221> 变体

<222> (20)

<223> Xaa=赖氨酸

<400> 1

His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Xaa Tyr Leu Asp Xaa

1 5 10 15

Lys Arg Ala Xaa Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys

20 25 30

<210> 2

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胃泌酸调节素衍生物

<220>

<221> 变体

<222> (2)

<223> Xaa=2-氨基异丁酸

<400> 2

His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys

20 25 30

<210> 3

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胃泌酸调节素衍生物

<220>

<221> 变体

<222> (2)

<223> Xaa=2-氨基异丁酸

<220>

<221> 变体

<222> (16)..(20)

<223> 在第16位和第20位的氨基酸形成环

<400> 3

His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys

20 25 30

<210> 4

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胃泌酸调节素衍生物

<220>

<221> 变体

<222> (2)

<223> Xaa=2-氨基异丁酸

<220>

<221> 变体

<222> (12)..(16)

<223> 在第12位和第16位的氨基酸形成环

<400> 4

His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys

20 25 30

<210> 5

<211> 221

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

1 5 10 15

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

20 25 30

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

35 40 45

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

50 55 60

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

65 70 75 80

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

85 90 95

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

100 105 110

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

115 120 125

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

130 135 140

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

145 150 155 160

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

165 170 175

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

180 185 190

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

195 200 205

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215 220

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

1 5 10

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 7

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Pro Ser Cys Pro

1 5 10

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 8

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Pro

1 5 10

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 9

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser

1 5 10

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 10

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

1 5 10

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 11

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser

1 5

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 12

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

1 5

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 13

Glu Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

1 5

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 14

Glu Ser Pro Ser Cys Pro

1 5

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 15

Glu Pro Ser Cys Pro

1 5

<210> 16

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 16

Pro Ser Cys Pro

1

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 17

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ser Cys Pro

1 5 10

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 18

Lys Tyr Gly Pro Pro Pro Ser Cys Pro

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 19

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Ser Cys Pro

1 5

<210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 20

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

1 5

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 21

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

1 5

<210> 22

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 22

Glu Ser Lys Pro Ser Cys Pro

1 5

<210> 23

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 23

Glu Ser Pro Ser Cys Pro

1 5

<210> 24

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 24

Glu Pro Ser Cys

1

<210> 25

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区的变体

<400> 25

Ser Cys Pro

1

<210> 26

<211> 442

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(442)

<223> 在第1至442位的氨基酸形成人免疫球蛋白G4 Fc

片段(同源二聚体)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(221)

<223> 在第1至221位的氨基酸形成一个单体

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (222)..(442)

<223> 在第222至442位的氨基酸形成一个单体

<220>

<221> 二硫化物

<222> (3)..(224)

<223> 在第3位和第224位的氨基酸形成分子间二硫键

<220>

<221> 二硫化物

<222> (35)..(95)

<223> 在第35位和第95位的氨基酸形成链内二硫键

<220>

<221> 二硫化物

<222> (141)..(199)

<223> 在第141位和第199位的氨基酸形成链内二硫键

<220>

<221> 二硫化物

<222> (256)..(316)

<223> 在第256位和第316位的氨基酸形成链内二硫键

<220>

<221> 二硫化物

<222> (362)..(420)

<223> 在第362位和第420位的氨基酸形成链内二硫键

<400> 26

Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

1 5 10 15

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

20 25 30

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

35 40 45

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

50 55 60

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

65 70 75 80

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

85 90 95

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

100 105 110

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

115 120 125

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

130 135 140

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

145 150 155 160

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

165 170 175

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

180 185 190

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

195 200 205

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Pro Ser Cys

210 215 220

Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

225 230 235 240

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

245 250 255

Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp

260 265 270

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

275 280 285

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

290 295 300

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

305 310 315 320

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

325 330 335

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu

340 345 350

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

355 360 365

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

370 375 380

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

385 390 395 400

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

405 410 415

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

420 425 430

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

Claims

1.一种肽缀合物的液体制剂，其中所述液体制剂包括：

18nmol/mL至940nmol/mL的下述化学式1的肽缀合物；

将所述液体制剂的pH维持在4.5至7.5的范围内的量的缓冲剂；

1％(w/v)至20％(w/v)的糖；和

0.001％(w/v)至0.2％(w/v)的非离子表面活性剂：

[化学式1]

在上述化学式1中，

Q是下述通式1的肽；

Z是免疫球蛋白Fc片段；和

n为自然数，其中n值被确定为使得所述肽缀合物中[OCH₂CH₂]_n区的平均分子量为10kDa：

[通式1]

在上述通式1中，

2.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述肽由SEQ ID NO：2至4的任一种的氨基酸序列表示。

3.根据权利要求1所述的液体制剂，其中Q由表示SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的液体制剂，其中Q在其C-末端被酰胺化。

5.根据权利要求1所述的液体制剂，其中Q经由半胱氨酸的硫原子被连接。

6.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc片段源自IgG4。

7.根据权利要求1所述的液体制剂，其中Z是其中两条多肽链通过二硫键连接并且仅通过两条链中的一条中的氮原子连接的结构。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的液体制剂，其中Z包括SEQ ID NO：5的氨基酸序列的单体。

9.根据权利要求8所述的液体制剂，其中Z经由在其N-末端的脯氨酸的氮原子连接。

10.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc片段和Q是非糖基化的。

11.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述缓冲剂选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐以及其组合。

12.根据权利要求11所述的液体制剂，其中所述缓冲剂是乙酸及其盐。

13.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述液体制剂的pH为4.8至6.0。

14.根据权利要求13所述的液体制剂，其中所述液体制剂的pH为4.9至5.3。

15.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述液体制剂不包括糖醇。

16.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述糖是葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或其组合。

17.根据权利要求16所述的液体制剂，其中所述糖是蔗糖。

18.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述非离子表面活性剂是泊洛沙姆、聚山梨醇酯或其组合。

19.根据权利要求18所述的液体制剂，其中所述非离子表面活性剂选自泊洛沙姆188、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80，以及其组合。

20.根据权利要求1所述的液体制剂，所述液体制剂进一步包括选自精氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸以及其组合的稳定剂。

21.根据权利要求9所述的液体制剂，其中所述液体制剂包括：

93nmol/mL至565nmol/mL的下述化学式1的肽缀合物，其中具有酰胺化的C-末端的Q经由半胱氨酸的硫原子连接；

5mM至25mM的选自柠檬酸及其盐、乙酸及其盐、组氨酸及其盐、磷酸及其盐以及其组合的缓冲剂，使得所述液体制剂的pH为4.8至5.5；

4％(w/v)至10％(w/v)的糖；和

0.01％(w/v)至0.1％(w/v)的选自泊洛沙姆、聚山梨醇酯或其组合的非离子表面活性剂。

22.根据权利要求21所述的液体制剂，其中上述化学式1的肽缀合物的浓度为274nmol/mL至474nmol/mL。

23.根据权利要求21所述的液体制剂，其中当在40℃±2℃和相对湿度75％±5％的苛刻试验条件下储存一周时所述液体制剂具有透明外观。