KR101577734B1 - 옥신토모듈린과 면역글로불린 단편을 포함하는 결합체 및 그의 용도 - Google Patents

옥신토모듈린과 면역글로불린 단편을 포함하는 결합체 및 그의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101577734B1
KR101577734B1 KR1020120064110A KR20120064110A KR101577734B1 KR 101577734 B1 KR101577734 B1 KR 101577734B1 KR 1020120064110 A KR1020120064110 A KR 1020120064110A KR 20120064110 A KR20120064110 A KR 20120064110A KR 101577734 B1 KR101577734 B1 KR 101577734B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
immunoglobulin
derivative
conjugate
oxytomodulin
Prior art date
Application number
KR1020120064110A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20120139579A (ko
Inventor
정성엽
김대진
박성희
우영은
최인영
권세창
Original Assignee
한미사이언스 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47357296&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR101577734(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 한미사이언스 주식회사 filed Critical 한미사이언스 주식회사
Publication of KR20120139579A publication Critical patent/KR20120139579A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101577734B1 publication Critical patent/KR101577734B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 옥신토모듈린 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체를 통해 연결된 단백질 결합체 및 상기 결합체를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 옥신토모듈린과 면역글로불린 Fc를 포함하는 결합체는 옥신토모듈린과 마찬가지로 부작용을 나타내지 않으면서도, 상기 천연형 옥신토모듈린에서 나타나지 않는 음식물 섭취량의 감소, 위 배출 억제 및 지방분해 촉진 효과를 나타내고, 옥신토모듈린에 비하여 우월한 수용체 활성화 효과와 장기 지속력을 나타내므로, 안전하면서도 효과적인 비만치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

옥신토모듈린과 면역글로불린 단편을 포함하는 결합체 및 그의 용도{A conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof}
본 발명은 옥신토모듈린과 면역글로불린 단편을 포함하는 결합체 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 옥신토모듈린 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩티드성 중합체를 통해 연결된 결합체 및 상기 결합체를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
경제성장과 생활방식의 변화에 따라 식습관에도 최근 많은 변화가 있어 왔다. 특히, 바쁜 현대인들은 패스트푸드 등의 고열량 식이와 적은 운동량으로 인하여 과체중 및 비만이 증가하고 있다. 국제보건기구(World Health Organisation, WHO)에 따르면, 전세계적으로 10억 이상의 성인이 과체중이고, 그 중 적어도 300만 이상이 임상적으로 비만이며, 특히 유럽에서 매년 250,000명, 전세계에서 250만명 이상이 과체중과 관련되어 사망하였다고 밝힌 바 있다(World Health Organisation, Global Strategy on Diet, Physical Activity and Health, 2004).
과체중 및 비만은 혈압과 콜레스테롤 수치를 증가시켜서 심장 질환, 당뇨, 관절염 등의 각종 질환의 발병 또는 악화의 원인이 되고 있다. 또한, 과체중 및 비만은 성인뿐만 아니라, 어린이나 청소년들에서도 동맥경화, 고혈압, 고지혈증 또는 심장질환 등의 발병률을 증가시키는 주요한 요인이 되고 있다.
이와 같이, 비만은 전세계적인 질병으로서 각종 질환의 원인이 되기도 하는 심각한 질병이지만 개인의 자구적인 노력에 의하여 극복될 수 있다고 믿어지고 있어, 비만 환자는 환자 자신의 자제력이 약하기 때문인 것으로 평가되고 있다. 그러나, 비만은 의외로 치료가 용이하지 않은데, 그 이유는 비만이 식욕조절 및 에너지 대사의 작용기작이 관련된 복잡한 질환이기 때문이다. 따라서, 비만을 치료하기 위하여는, 환자 자신의 노력뿐만 아니라, 식욕조절 및 에너지 대사와 관련된 비정상적인 작용기작을 치료하는 방법이 동시에 수행되어야만 하므로, 상기 비정상적인 작용기작을 치료할 수 있는 의약을 개발하려는 노력이 계속되고 있다. 상술한 노력의 결과로서, Rimonabant(Sanofi-Aventis), Sibutramin(Abbott), Contrave(Takeda), Orlistat(Roche) 등의 의약이 개발되었으나, 이들은 치명적인 부작용을 나타내거나 비만치료효과가 미비하다는 단점이 있었다. 예를 들어, Rimonabant(Sanofi-Aventis)는 중추신경장애 부작용을 나타내고, Sibutramin(Abbott)과 Contrave(Takeda)는 심혈관 부작용을 나타내며, Orlistat(Roche)은 1년 복용시 약 4kg의 체중감소 효력이 나타내는 것에 불과하다고 보고되었다. 따라서, 현재 비만 환자에게 안전하게 처방될 수 있는 비만 치료제는 거의 없는 상태이다.
이처럼, 종래의 비만치료제의 문제점을 해소할 수 있는 비만치료제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있으며, 최근에는 글루카곤 유도체에 관심이 집중되고 있다. 글루카곤은 약물 치료 또는 질병, 호르몬이나 효소 결핍등의 원인으로 혈당이 떨어지기 시작하면 췌장에서 생산된다. 글루카곤은 간에 글리코겐을 분해하여 글루코오스를 방출하도록 신호하고, 혈당 수준을 정상 수준까지 높이는 역할을 한다. 뿐만 아니라, 글루카곤은 혈당 상승효과 이외에 식욕억제 및 지방세포의 호르몬 민감성 리파제(hormone sensitive lipase)를 활성화시켜 지방 분해를 촉진하여 항비만 효과를 나타냄이 보고되었다. 이러한 글루카곤의 유도체 중의 하나인 글루카곤-유사 펩티드-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)은 당뇨 환자의 고혈당증을 감소시키는 치료제로 개발 중인 물질로서, 인슐린 합성과 분비 촉진, 글루카곤의 분비 저해, 위공복 억제, 글루코오스 사용 증진과 더불어 음식물 섭취를 저해하는 기능을 가진다. GLP-1과 대략 50% 아미노산 상동성을 가지는 도마뱀 독액(lizard venom)으로부터 만들어지는 엑센딘-4(exendin-4) 또한 GLP-1 수용체를 활성화시켜 당뇨 환자의 고혈당증을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 그러나, 상기 GLP-1를 포함하는 비만 치료용 의약은 구토와 메스꺼움의 부작용을 발생시킨다는 문제점을 나타내는 것으로 보고되었다.
이에, 상기 GLP-1의 대안으로서, GLP-1과 글루카곤의 두 펩타이드의 수용체에 모두 결합할 수 있는 옥신토모듈린(oxyntomodulin)이 각광받고 있다. 상기 옥신토모듈린은 글루카곤의 전구체인 프리-글루카곤(pre-glucagon)으로부터 만들어지는 펩타이드로서, GLP-1의 음식물 섭취 저해, 포만감 증진 효력과 글루카곤의 지방분해 기능을 보여 항-비만 치료제로서의 가능성을 높이고 있다.
이러한 옥신토모듈린 펩타이드의 이중 기능성(dual fuction)에 기반하여 비만 치료 목적의 약제를 개발하기 위한 연구가 활발하게 진행 중에 있다. 예를 들어, 특허등록 제925017호에는 옥신토모듈린을 유효성분으로 포함하는, 인간에서 과체중을 치료하기 위한, 경구, 비경구, 점막(mucosal), 직장, 피하 또는 경피성 투여용 약학적 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 옥신토모듈린을 포함하는 비만치료제는 생체내에서 반감기가 짧고, 하루에 3번씩 고용량을 투여하여도 비만 치료효과 또한 낮은 수준을 나타내는 것으로 보고되고 있다. 따라서, 옥신토모듈린을 변형시켜서, 생체내 반감기를 증대시키거나 또는 비만 치료효과를 증대시키려는 노력이 계속되고 있다.
예를 들어, 듀얼 아고니스트 옥신토모듈린(Merck사)은 옥신토모듈린의 2번째 아미노산 L-세린을 D-세린으로 치환하여 디펩티딜 펩티다제 Ⅳ(dipeptidyl peptidase-Ⅳ, DPP-Ⅳ)에 대한 저항성을 높이는 동시에 C-말단에 콜레스테롤 모이어티를 붙여 혈중 반감기를 증가시킨 것이다. ZP2929(Zealand)는 옥신토모듈린의 2번째 아미노산 L-세린을 D-세린으로 치환하여 DPP-Ⅳ 저항성을 높이고, 17번째 아미노산인 아르기닌을 알라닌으로 치환하여 프로테아제에 대한 저항성을 높였으며, 27번째 아미노산인 메티오닌을 리신으로 치환하여 산화적 안정성을 증가시켰고, 20번째와 24번째 아미노산인 글루타민과 28번째 아미노산인 아스파라긴을 각각 아스파르트산, 알라닌 및 세린으로 치환하여 탈아미드화에 대한 안정성(deamidation stability)를 증가시킨 것이다. 그러나, 반감기를 증가시킨 듀얼 아고니스트 옥신토모듈린 (Merck 사)의 경우에도 천연형 옥신토모듈린의 반감기인 8~12분보다 길어졌지만 여전히 1.7시간으로 생체 내 반감기가 매우 짧으며 약물의 투여 용량 또한 수 mg/ kg으로 매우 높은 수준이다. 따라서, 옥신토모듈린 또는 그의 유도체는 여전히 짧은 반감기와 낮은 약효로 인해 매일 투여해야 하는 단점과 과량의 약물을 투여해야 하는 두 가지 커다란 단점을 가지고 있다.
이에, 본 발명자들은 생체내에서 옥신토모듈린의 활성을 유지하면서도, 그의 혈중반감기를 증가시키기 위한 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 비펩티드성 중합체를 이용하여, 상기 옥신토모듈린에 캐리어를 결합시켜서 제조한 결합체가 생체내에서 활성을 유지하면서도, 그의 혈중반감기를 증가시켜서, 보다 우수한 항 비만효과를 나타낼 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 옥신토모듈린 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩티드성 중합체를 통해 연결된 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 결합체를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 옥신토모듈린 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체를 통해 연결된 결합체를 제공한다.
본 발명의 용어 "결합체"는 옥신토모듈린과 다른 요소를 포함하는 결합체를 의미한다. 상기 다른 요소는 혈중 반감기를 증가시키거나 신장배출을 줄이는 등 어떠한 유리한 기능을 갖는 어떤 물질도 될 수 있다. 본 발명에서 상기 요소는 면역글로불린 Fc 영역이 될 수 있다. 바람직하게는 상기 결합체는 옥신토모듈린 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체를 통해 연결된 형태일 수 있다.
비펩타이드성 중합체는 각각 옥신토모듈린과 면역글로불린 Fc영역에 공유결합하여 둘을 연결시킬 수 있다. 비펩타이드성 중합체의 양 말단은 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 옥신토모듈린 유도체의 아민그룹 또는 티올 그룹(Thiol group)에 결합할 수 있다.
본 발명에서 결합체는 효력의 지속성이 천연형 옥신토모듈린에 비해 증가한 것을 의미하며, 상기 지속형 결합체는 천연형 옥신토모듈린의 아미노산이 수식, 치환, 추가 또는 제거된 형태, 폴리에틸렌글리콜 (PEG)과 같은 생분해성 중합체가 옥신토모듈린에 결합된 결합체, 알부민이나 면역글로불린과 같은 지속성이 뛰어난 단백질이 옥신토모듈린에 결합된 결합체, 생체 내 알부민과 결합력을 갖는 지방산이 옥신토모듈린에 결합된 결합체 또는 생분해성 나노파티클에 봉입된 형태의 옥신토모듈린을 포함할 수 있으나, 지속형 결합체의 종류는 본 발명에 제한을 두지 않는다.
본 발명의 용어 "옥신토모듈린"이란 글루카곤의 전구체인 프리-글루카곤(pre-glucagon)으로부터 만들어지는 펩티드를 의미하며, 천연형 옥신토모듈린, 전구물질 (precursor), 유도체 (derivatives), 단편 (fragments) 및 변이체 (variants) 등을 포함한다. 바람직하게는 서열번호 1(HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA)의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 용어 "옥신토모듈린 변이체"는, 옥신토모듈린과 아미노산서열이 하나 이상 다른 펩타이드로서, GLP-1과 글루카곤 수용체 활성화 기능을 보유한 펩타이드를 의미하며, 천연형 옥신토모듈린에서 일부 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion) 및 수식(modification) 중에 어느 하나의 방법 또는 이들의 방법의 조합을 통해 제조될 수 있다.
본 발명의 용어 "옥신토모듈린 유도체"란 상기 옥신토모듈린의 일부 아미노산을 부가, 결실 또는 치환의 형태로 변형시켜서, GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체를 모두 활성화 시킬 수 있고, 원래의 옥신토모듈린에 비하여 상기 각 수용체를 높은 수준으로 활성화시킬 수 있는 펩티드, 펩티드 유도체 또는 펩티드 모방체 등을 포함한다.
본 발명의 용어 "옥신토모듈린 단편"은 옥신토모듈린의 아미노말단 또는 카르복시말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 추가된 아미노산은 천연에 존재하지않는 아미노산 (예; D형 아미노산)도 가능할 수 있다. 이러한 옥신토모듈린 단편은 체내에서 혈당조절 기능을 보유한다.
옥신토모듈린 변이체, 유도체, 및 단편에서 각각 사용된 제조방법은 독립적으로 사용될 수 있고 조합도 가능하다. 예를 들어 아미노산 서열이 하나 이상 다르고, N-말단 아미노산 잔기에 탈아미노화 (deamination)된 GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체 둘 다에 대한 활성화 기능을 보유한 펩타이드도 포함된다.
본 명세서에서 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다.
알라닌A 아르기닌R
아스파라긴N 아스파르트 산D
시스테인C 글루타민 산E
글루타민Q 글리신G
히스티딘H 아이소루이신I
루이신L 리신K
메티오닌M 페닐알라닌F
프롤린P 세린S
트레오닌T 트립토판W
타이로신Y 발린V
본 명세서에서 상기 옥신토모듈린 유도체는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 아미노산의 치환, 부가 결실 또는 번역후 변형(예를 들어, 메틸화, 아실화, 유비퀴틴화, 분자내 공유결합)되어, 글루카곤과 GLP-1 수용체를 동시에 활성화시킬 수 있는 임의의 펩티드를 포괄한다. 상기 아미노산의 치환 또는 부가시에는 인간 단백질에서 통상적으로 관찰되는 20개의 아미노산뿐만 아니라 비정형 또는 비-자연적 발생 아미노산을 사용할 수 있다. 비정형 아미노산의 상업적 출처에는 Sigma-Aldrich, ChemPep과 Genzyme pharmaceuticals가 포함된다. 이러한 아미노산이 포함된 펩타이드와 정형적인 펩타이드 서열은 상업화된 펩타이드 합성 회사, 예를 들어 미국의 American peptide company나 Bachem, 또는 한국의 Anygen을 통해 합성 및 구매가능하다.
구체적인 일 양태에서, 본 발명의 옥신토모듈린 유도체는 하기 일반식 1의 아미노산을 포함하는 신규한 펩티드이다.
R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2(일반식 1)
상기 식에서,
R1은 히스티딘, 데스아미노-히스티딜 (desamino-histidyl), 디메틸-히스티딜 (N-dimethyl-histidyl), 베타-히드록시 이미다조프로피오닐 (beta-hydroxyimidazopropionyl), 4-이미다조아세틸(4-imidazoacetyl), 베타-카르복시 이미다조프로피오닐 (beta-carboxy imidazopropionyl) 또는 티로신이며;
X1은 Aib(aminoisobutyric acid), d-알라닌, 글리신, Sar(N-methylglycine), 세린 또는 d-세린이고;
X2는 글루탐산 또는 글루타민이며;
X3은 류신 또는 티로신이고;
X4는 세린 또는 알라닌이며;
X5는 리신 또는 아르기닌이며;
X6는 글루타민 또는 티로신이고;
X7은 류신 또는 메티오닌이며;
X8은 아스파르트산 또는 글루탐산이고;
X9은 글루탐산, 세린, 알파-메틸-글루탐산 또는 결실된 서열이며;
X10는 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌, 세린 또는 결실된 서열이고;
X11은 알라닌, 아르기닌, 발린 또는 결실된 서열이며;
X12은 알라닌, 아르기닌, 세린, 발린 또는 결실된 서열이고;
X13는 리신, 글루타민, 아르기닌, 알파-메틸-글루탐산 또는 결실된 서열이며;
X14은 아스파르트산, 글루탐산, 류신 또는 결실된 서열이고;
X15는 페닐알라닌 또는 결실된 서열이며;
X16는 이소류신, 발린 또는 결실된 서열이며;
X17는 알라닌, 시스테인, 글루탐산, 리신, 글루타민, 알파-메틸-글루탐산 또는 결실된 서열이고;
X18는 트립토판 또는 결실된 서열이며;
X19은 알라닌, 이소류신, 류신, 세린, 발린 또는 결실된 서열이며;
X20는 알라닌, 리신, 메티오닌, 글루타민, 아르기닌 또는 결실된 서열이고;
X21은 아스파라긴 또는 결실된 서열이며;
X22은 알라닌, 글리신, 트레오닌 또는 결실된 서열이며;
X23는 시스테인, 리신 또는 결실된 서열이고;
X24은 알라닌, 글리신 및 세린의 조합으로 구성된 2 내지 10개의 아미노산을 가지는 펩타이드 또는 결실된 서열이며; 및,
R2는 KRNRNNIA(서열번호 35), GPSSGAPPPS(서열번호 36), GPSSGAPPPSK(서열번호 37), HSQGTFTSDYSKYLD(서열번호 38), HSQGTFTSDYSRYLDK(서열번호 39), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(서열번호 40) 또는 결실된 서열이다(단, 상기 일반식 1의 아미노산 서열이 서열번호 1과 동일한 경우는 제외한다).
본 발명의 옥신토모듈린 유도체는 야생형의 옥신토모듈린의 글루카곤 수용체 및 GLP-1 수용체에 대한 활성을 높이기 위해 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번 아미노산인 히스티딘의 알파 카본을 결실시킨 4-이미다조아세틸(4-imidazoacetyl), N-말단 아미노기를 결실시킨 데스아미노-히스티딜 (desamino-histidyl), N-말단 아미노기를 2개의 메틸그룹으로 수식한 디메틸-히스티딜 (N-dimethyl-histidyl), N-말단 아미노기를 하이드록실 그룹으로 치환한 베타-히드록시 이미다조프로피오닐 (beta-hydroxyimidazopropionyl), 또는 N-말단 아미노기를 카르복실 그룹으로 치환한 베타-카르복시 이미다조프로피오닐 (beta-carboxy imidazopropionyl)로 치환할 수 있다. 또한, GLP-1 수용체와 결합하는 부위를 소수성 결합과 이온 결합을 강화시키는 아미노산으로 치환시키거나 또는 이들을 조합할 수 있다. 또한, 옥신토모듈린 서열의 일부 서열을 GLP-1의 아미노산 서열 또는 Exendin-4의 아미노산 서열로 치환하여 GLP-1 수용체의 활성을 높일 수 있다.
또한, 옥신토모듈린 서열의 일부 서열을 알파 헬릭스를 강화시키는 서열로 치환시킬 수 있다. 바람직하게는 상기 일반식 1의 아미노산 서열의 10, 14, 16, 20, 24 및 28번 아미노산이 알파 헬릭스에 도움을 주는 것으로 알려진 Tyr(4-Me), Phe, Phe(4-Me), Phe(4-Cl), Phe(4-CN), Phe(4-NO2), Phe(4-NH2), Phg, Pal, Nal, Ala(2-thienyl) 또는 Ala(benzothienyl)로 구성되는 아미노산 혹은 아미노산 유도체로 치환될 수 있으며, 삽입될 수 있는 알파 헬릭스에 도움을 주는 아미노산 혹은 아미노산 유도체의 종류 및 개수는 제한되지 않는다. 또한, 바람직하게는 10과 14번, 12와 16번, 16과 20번, 20과 24번 및 24와 28번은 각각 링을 형성할 수 있는 글루탐산 또는 리신으로 치환하여 링을 형성할 수 있으며, 삽입되는 링의 개수 역시 제한되지 않고, 가장 바람직하게는 하기의 일반식 1 내지 6으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 옥신토모듈린 유도체일 수 있다.
구체적인 일 양태에서, 본 발명의 옥신토모듈린 유도체는 옥신토모듈린의 아미노산 서열에 엑센딘 혹은 GLP-1의 서열로 치환한 하기 일반식 2의 아미노산을 포함하는 신규한 펩티드이다.
R1-A-R3(일반식 2)
다른 구체적인 일 양태에서, 본 발명의 옥신토모듈린 유도체는 옥신토모듈린의 아미노산 서열 일부와 엑센딘 또는 GLP-1의 서열 일부를 적당한 아미노산 링커로 연결한 하기 일반식 3의 아미노산을 포함하는 신규한 펩티드이다.
R1-B-C-R4(일반식 3)
다른 구체적인 일 양태에서, 본 발명의 옥신토모듈린 유도체는 옥신토모듈린의 아미노산 서열의 일부를 GLP-1 수용체와의 결합력을 높이는 아미노산으로 치환, 예컨대 26번째 Leu을 GLP-1 수용체와 소수성 결합을 하는 바 소수성을 증가시키는 아미노산인 Ile 혹은 Val으로 치환된 하기 일반식 4를 포함하는 신규한 펩티드이다.
R1-SQGTFTSDYSKYLD-D1-D2-D3-D4-D5-LFVQW-D6-D7-N-D8-R3(일반식 4)
다른 구체적인 일 양태에서, 본 발명의 옥신토모듈린 유도체는 고유 옥신토모듈린의 GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체의 활성을 높이기 위해 아미노산 서열 일부를 삭제하거나 아미노산 일부를 삽입하거나 아미노산 일부를 다른 아미노산으로 치환한 하기 일반식 5를 포함하는 신규한 펩티드이다.
R1-E1-QGTFTSDYSKYLD-E2-E3-RA-E4-E5-FV-E6-WLMNT-E7-R5(일반식 5)
상기 일반식 2 내지 5에 있어서,
R1은 상기 일반식 1에서 설명된 구성과 동일하고;
A는 SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(서열번호 41), SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT(서열번호 42), SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT(서열번호 43), GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG(서열번호 44), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG(서열번호 45), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA(서열번호 46) 및 SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG(서열번호 47)로 구성되는 군으로부터 선택되고;
B는 SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(서열번호 41), SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT(서열번호 42), SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT(서열번호 43), GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG(서열번호 44), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG(서열번호 45), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA(서열번호 46), SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG(서열번호 47), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEW(서열번호 48), 및 SQGTFTSDYSRYLD(서열번호 49)로 구성되는 군으로부터 선택되며;
C는 알라닌, 글리신 및 세린의 조합으로 구성된 2 내지 10개의 아미노산을 가지는 펩타이드이고;
D1은 세린, 글루탐산 또는 아르기닌이며;
D2는 아르기닌, 글루탐산 또는 세린이고;
D3은 아르기닌, 알라닌 또는 발린이며;
D4는 아르기닌, 발린 또는 세린이고;
D5는 글루타민, 아르기닌 또는 리신이며;
D6은 이소류신, 발린 또는 세린이고;
D7은 메티오닌, 아르기닌 또는 글루타민이며;
D8은 트레오닌, 글리신 또는 알라닌이고;
E1은 세린, Aib, Sar, d-알라닌 또는 d-세린이며;
E2는 세린 또는 글루탐산이고;
E3은 아르기닌 또는 리신이며;
E4는 글루타민 또는 리신이고;
E5는 아스파르트산 또는 글루탐산이며;
E6는 글루타민, 시스테인 또는 리신이고;
E7은 시스테인, 리신 또는 결실된 서열이며;
R3은 KRNRNNIA(서열번호 35), GPSSGAPPPS(서열번호 36) 또는 GPSSGAPPPSK(서열번호 37)이며;
R4는 HSQGTFTSDYSKYLD(서열번호 38), HSQGTFTSDYSRYLDK(서열번호 39) 또는 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(서열번호 40)이고; 및,
R5는 KRNRNNIA(서열번호 35), GPSSGAPPPS(서열번호 36), GPSSGAPPPSK(서열번호 37) 또는 결실된 서열이다(단, 상기 일반식 2 내지 5의 아미노산 서열이 서열번호 1과 동일한 경우는 제외한다).
바람직하게는, 본 발명의 옥신토모듈린 유도체는 하기 일반식 6의 신규한 펩티드일 수 있다.
R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2(일반식 6)
상기 일반식 6에 있어서,
R1은 히스티딘, 데스아미노-히스티딜 (desamino-histidyl), 4-이미다조아세틸(4-imidazoacetyl) 또는 티로신이며;
X1은 Aib(aminoisobutyric acid), 글리신, 세린 또는 d-세린이고;
X2는 글루탐산 또는 글루타민이며;
X3은 류신 또는 티로신이고;
X4는 세린 또는 알라닌이며;
X5는 리신 또는 아르기닌이며;
X6는 글루타민 또는 티로신이고;
X7은 류신 또는 메티오닌이며;
X8은 아스파르트산 또는 글루탐산이고;
X9은 글루탐산, 알파-메틸-글루탐산 또는 결실된 서열이며;
X10는 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌 또는 결실된 서열이고;
X11은 알라닌, 아르기닌 또는 결실된 서열이며;
X12은 알라닌, 발린 또는 결실된 서열이고;
X13는 리신, 글루타민, 아르기닌, 알파-메틸-글루탐산 또는 결실된 서열이며;
X14은 아스파르트산, 글루탐산, 류신 또는 결실된 서열이고;
X15는 페닐알라닌 또는 결실된 서열이며;
X16는 이소류신, 발린 또는 결실된 서열이며;
X17는 알라닌, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 알파-메틸-글루탐산 또는 결실된 서열이고;
X18는 트립토판 또는 결실된 서열이며;
X19은 알라닌, 이소류신, 류신, 발린 또는 결실된 서열이며;
X20는 알라닌, 리신, 메티오닌,아르기닌 또는 결실된 서열이고;
X21은 아스파라긴 또는 결실된 서열이며;
X22은 트레오닌 또는 결실된 서열이며;
X23는 시스테인, 리신 또는 결실된 서열이고;
X24은 글리신으로 구성된 2 내지 10개의 아미노산을 가지는 펩타이드 또는 결실된 서열이며; 및,
R2는 KRNRNNIA(서열번호 35), GPSSGAPPPS(서열번호 36), GPSSGAPPPSK(서열번호 37), HSQGTFTSDYSKYLD(서열번호 38), HSQGTFTSDYSRYLDK(서열번호 39), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(서열번호 40) 또는 결실된 서열이다(단, 상기 일반식 6의 아미노산 서열이 서열번호 1과 동일한 경우는 제외한다).
보다 바람직하게는 본 발명의 옥신토모듈린 유도체는 서열번호 2 내지 34의 펩티드로 구성된 그룹으로부터 선택된 것일 수 있다. 보다 더 바람직하게는 실시예 2-1의 표 1에 기재된 옥신토모듈린 유도체일 수 있다.
옥신토모둘린은 GLP-1과 글루카곤 두 개의 펩타이드 활성을 가지고 있으며 GLP-1은 인슐린 분비에 의한 혈당 강하효력이 있으나 글루카곤은 혈당증가 효력이 있으며, GLP-1은 음식물섭취억제와 위배출지연, 글루카곤은 지방분해 및 에너지 대사량 증가에 의한 체중감소 효력 등 서로 다른 생물학적 효능이 있어 하나의 펩타이드에 상기 두 펩타이드가 존재할 경우 어느 한 쪽의 효력이 클 경우 원치 않는 효력, 예를 들어 글루카곤의 효력이 GLP-1의 효력보다 클 경우 혈당이 올라갈 수 있으며, GLP-1의 효력이 클 경우 메스꺼음과 구토와 같은 부작용이 클 수도 있다. 또한 두 펩타이드의 활성비에 따라 전체 효력은 달라질 수 있다. 예를 들어 실시예 10과 12에서 제조된 옥신토모듈린 결합체는 실시예 10의 결합체가 GLP-1 수용체 결합력은 높으나 실시예 18에서 수행된 in vivo 효력에서 실시예 12의 결합체에 비해 효력이 낮음을 알 수 있다. 이는 실시예 12의 결합체가 GLP-1 수용체의 효력은 낮으나 글루카곤 수용체의 효력이 증가한 것에 기인한 것으로 여겨진다. 따라서 본 발명의 옥신토모듈린 유도체 및 이의 결합체는 무조건적인 활성의 증가를 위한 유도체만을 개시하고 있지 않으며, 예를 들어 옥신토모듈린의 첫 번째와 11번째 아미노산은 글루카곤 활성을 낮추는 것으로 알려져 있어 글루카곤과 GLP-1의 활성비를 조절할 때 상기 아미노산을 변경할 수 있다.
본 발명의 결합체는 옥신토모듈린에 공유결합하거나 봉입체(microsphere)를 형성하여 혈중안전성을 증가, 신장으로의 배출 지연, 수용체와의 결합력 변화등을 유도할 수 있다. 옥신토모듈린을 포함하는 결합체를 형성할 수 있는 캐리어는 결합 후 혈중 안전성을 높일 수 있는 알부민, 트랜스페린, 항체, 항체단편, 엘라스틴, 헤파린, chitin과 같은 당중합체 (polysaccharide), fibronectin등 중에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 면역글로불린 Fc 영역이다.
본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1)CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2)CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3)CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4)CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5)1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 6)중쇄 불변 영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC (antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내며 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 바람직하게는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간기원이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "비펩타이드성 중합체"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 본 발명에서 상기 비펩타이드성 중합체는 비펩타이드성 링커와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명에 사용가능한 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜이다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
기존 인프레임 퓨전(inframe fusion) 방법으로 제조된 융합단백질에서 사용된 펩타이드성 링커의 단점은 생체내에서 단백질분해효소에 의해 쉽게 절단되어 캐리어에 의한 활성약물의 혈중반감기 증가 효과를 기대만큼 얻을 수 없다는 것이다.그러나, 본 발명에서는 단백질분해효소에 저항성있는 중합체를 사용하여 캐리어와 유사하게 펩타이드의 혈중반감기를 유지할 수 있다. 그러므로, 본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 중합체는 상기와 같은 역할, 즉 생체 내 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체이면 제한없이 사용될 수 있다. 비펩타이드성 중합체의 분자량은 1 내지 100 kDa 범위, 바람직하게는 1 내지 20 kDa 범위이다. 또한, 상기 면역글로불린 Fc 영역과 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 중합체는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
본 발명에 사용되는 비펩타이드성 중합체는 면역글로불린 Fc 영역 및 단백질약물과 결합될 수 있는 반응기를 가질 수 있다. 상기 비 펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 반응 알데히드 그룹, 프로피온 알테히드 그룹, 부틸 알테히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다. 특히, 상기 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 양 말단에서 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린과 각각 결합하는데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.
상기 비펩타이드성 중합체인 링커의 양 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드 그룹을, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다. 양쪽 말단에 히드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 본 발명의 지속형 결합체를 제조할 수 있다.
본 발명의 결합체는 비펩타이드성 중합체의 양 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 옥신토모듈린 유도체의 아민그룹 또는 티올 그룹(Thiol group)에 결합하는 것등이 될 수 있다.
한편, 본 발명에서 상기 비펩티드성 중합체는 양쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역 및 단백질 약물과 결합될 수 있는 반응기를 포함하고, 상기 반응기는 특별히 이에 제한되지 않으나, 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹, 석시니미드(succinimide) 유도체(석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트) 등이 될 수 있다.
상기 비펩티드성 중합체의 양 말단 반응기는 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 예를 들어, 상기 비펩티드성 중합체의 한쪽 말단에는 반응기로서 말레이미드 그룹을 포함하고, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹 또는 부틸 알데히드 그룹 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 비펩티드성 중합체의 한쪽 말단이 알데히드 그룹의 반응기를 포함하고, 다른 한쪽 말단이 말레이미드 그룹의 반응기를 포함하는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩티드성 중합체의 양 말단에서 생리활성 폴리펩티드 및 면역글로불린과 각각 결합하는데 효과적일 수 있다. 본 발명의 실시예에 의하면, 프로피온 알데히드를 단독으로 포함하거나 또는 말레이미드 그룹과 알데히드 그룹을 동시에 포함하는 비펩티드성 중합체인 PEG를 사용하여, 옥신토모듈린 또는 그의 유도체와 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여, 결합체를 합성하였다.
본 발명의 결합체는 천연형 옥신토모듈린에 비하여 GLP-1 수용체 및 글루카곤 수용체에 우수한 활성을 가지며, Fc 영역을 결합시킴에 따라 체내에서 혈중 반감기를 증가시켜서, 오랜 시간 생체 내에서 활성을 유지시킬 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 결합체를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "예방"이란 목적하는 질환의 발명을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 "예방"이란 본 발명의 결합체를 투여함에 의하여 체중의 증가, 체지방 비율의 증가 등의 현상이 나타나는 비만증상의 발생을 억제하거나 지연되는 것을 의미한다.
본 발명의 용어, "치료"란 발생된 질병의 증상을 경감, 개선 또는 완화시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 "치료"란 본 발명의 결합체를 투여함에 의하여 상기 비만증상이 경감, 개선 또는 완화되어 체중의 감소, 체지방 비율의 감소 등의 현상이 나타나는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, "비만"은 체내에 지방조직이 과다한 상태로, 신체비만지수(체중(kg)을 신장(m)의 제곱으로 나눈 값)가 25 이상이면 비만으로 정의된다. 비만은 오랜 기간에 걸쳐 에너지 소비량에 비해 영양소를 과다하게 섭취할 경우 에너지 불균형에 의해 유발되는 것이 통상적이다. 비만은 신체 전체에 영향을 미치는 대사질환으로 당뇨병 및 고지혈증에 걸릴 가능성이 높아지고, 성기능 장애, 관절염, 심혈관계 질환의 발병 위험이 커지며 일부의 경우 암의 발생과도 연관이 있다.
옥신토모듈린 또는 그의 유도체에 면역글로불린 Fc 영역을 결합시킨 본 발명의 결합체는 글루카곤 및 GLP-1의 각 수용체에 대한 결합력이 우수하고(표 3), 생체 내에 존재하는 단백질 분해효소에 대한 저항성이 우수하여, 체내에서 오랜 시간 동안 활성을 나타낼 수 있고 이로 인하여, 체중감소 등의 항 비만활성이 우수함을 확인하였다(도 12).
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용"이란 치료효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용을 일으키지 않는 것을 의미하며, 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 결합체를 포함한 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 담체는 담체는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 경구투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있고, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화 할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
또한, 상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제, 바람직하게는 펩타이드 의약품의 투여에 유용한 제제 형태로 제형화시켜 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여 방법을 이용하여 경구, 또는 피부, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 수막강내, 심실내, 폐, 경피, 피하, 복내내, 비강내, 소화관내, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 비경구투여 경로에 의하여 투여될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 조성물은 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산 (ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제 (antioxidants), 킬레이팅 물질 (chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제 (stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 투여량과 횟수는 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.0001 ㎍ 내지 500 mg일 수 있다. 그러나 상기 조성물의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 조성물의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 생체 내 지속성 및 역가가 우수하므로, 본 발명의 약제학적 제제의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
아울러, 상기 약제학적 조성물은 단독 또는 다른 비만 예방 또는 치료효과를 나타내는 약학적 제제와 병용하여 투여될 수 있다. 상기 비만 예방 또는 치료효과를 나타내는 약학적 제제는 특별히 이에 제한되지 않으나, GLP-1 수용체 아고니스트, 렙틴(Leptin) 수용체 아고니스트, DPP-IV 저해제, Y5 수용체 안타고니스트, MCH (Melanin-concentrating hormone) 수용체 안타고니스트, Y2/3 수용체 아고니스트, MC3/4 수용체 아고니스트, 위/췌장 리파아제(gastric/pancreatic lipase) 저해제, 5HT2c 아고니스트, β3A 수용체 아고니스트, 아밀린(Amylin) 수용체 아고니스트, 그랠린 (Ghrelin) 안타고니스트, 그랠린 수용체 안타고니스트 등이 될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 결합체 또는 이를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 비만을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "투여"는, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 조성물이 생체내 표적에 도달할 수 있는 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 예를 들어 복강 내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여 등이 될 수 있다.
본 발명에서 상기 개체는 비만이 의심되는 개체로서, 상기 비만 의심 개체는 비만이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유 동물을 의미하나, 본 발명의 결합체로 치료 가능한 개체는 제한 없이 포함된다. 본 발명의 결합체를 포함하는 약학적 조성물을 비만 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 상기 비만에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 치료 방법은 결합체를 포함하는 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 비만의 예방 또는 치료용 의약의 제조에 있어서, 상기 결합체 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 옥신토모듈린과 면역글로불린 Fc를 포함하는 결합체는 옥신토모듈린과 마찬가지로 부작용을 나타내지 않으면서도, 상기 천연형 옥신토모듈린에서 나타나지 않는 음식물 섭취량의 감소, 위 배출 억제 및 지방분해 촉진 효과를 나타내고, 옥신토모듈린에 비하여 우월한 수용체 활성화 효과와 장기 지속력을 나타내므로, 안전하면서도 효과적인 비만치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 옥신토모듈린 또는 옥신토모듈린 유도체의 투여량에 따른 사료 섭취량의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 2a는 SOURCE S 정제컬럼을 통해 모노-페길화된 옥신토모듈린를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2b는 정제된 모노-페길화된 옥신토모듈린의 펩티드 매핑 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2c는 SOURCE 15Q 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린과 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 SOURCE S 정제컬럼을 통해 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 29)를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3b는 SOURCE 15Q 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 29)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 SOURCE S 정제컬럼을 통해 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 30)를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4b는 정제된 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 30)의 펩티드 매핑 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4c는 SOURCE 15Q 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 30)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5a는 SOURCE S 정제컬럼을 통해 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 31)를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 SOURCE 15Q 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 31)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 SOURCE S 정제컬럼을 통해 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 2)를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6b는 정제된 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 2)의 펩티드 매핑 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6c는 SOURCE 15Q 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 2)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6d는 Source ISO 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 2)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7a는 SOURCE S 정제컬럼을 통해 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 3)를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7b는 정제된 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 3)의 펩티드 매핑 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7c는 Butyl FF 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 3)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7d는 SOURCE 15Q 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 3)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 SOURCE S 정제컬럼을 통해 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 23)를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8b는 SOURCE 15Q 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 23)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8c는 Source ISO 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 23)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9a는 SOURCE S 정제컬럼을 통해 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 24)를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9b는 SOURCE 15Q 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 24)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9c는 Source ISO 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 24)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10a는 SOURCE S 정제컬럼을 통해 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 25)를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10b는 SOURCE 15Q 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 25)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10c는 Source ISO 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 25)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11a는 SOURCE S 정제컬럼을 통해 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 28)를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11b는 SOURCE 15Q 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 28)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11c는 Source ISO 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 28)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 옥신토모듈린 유도체-면역글로불린 Fc 결합체의 종류 및 투여량에 따른 마우스의 체중변화를 경시적으로 나타낸 그래프이다.
도 13은 옥신토모듈린 유도체-면역글로불린 Fc 결합체의 종류 및 투여량에 따른 마우스의 체중변화를 경시적으로 나타낸 그래프이다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. in vitro 활성용 세포주 생산
실시예 1-1: GLP -1에 대해 cAMP 반응을 보이는 세포주의 생산
인간 GLP-1 수용체 유전자의 cDNA(OriGene Technologies, Inc. USA)에서 ORF (open reading frame)에 해당하는 부분을 주형으로 하고, HindIII 절단부위와 EcoRI 절단부위를 각각 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여, PCR 산물을 수득하였다.
정방향 프라이머: 5'-CCCGGCCCCCGCGGCCGCTATTCGAAATAC-3'(서열번호 50)
역방향 프라이머: 5'-GAACGGTCCGGAGGACGTCGACTCTTAAGATAG-3'(서열번호 51)
상기 PCR 산물을 공지된 동물세포 발현벡터인 x0GC/dhfr에 클로닝하여 제조합 벡터 x0GC/GLP-1R를 제조하였다.
상기 제조한 재조합 벡터 x0GC/GLP-1R를 DMEM/F12 (10% FBS) 배지에서 배양한 CHO DG44 세포주에 리포펙타민(Lipofectamine, invitrogene, USA)을 이용한 방법으로 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체를 1mg/mL G418 및 10 nM 메토트락세이트(methotraxate)를 포함하는 선별배지에서 선별 배양한 다음, 이로부터 단일 클론 세포주를 선별하여, GLP-1에 대해 우수한 농도의존적 cAMP 반응을 보이는 세포주를 최종적으로 선별하였다.
실시예 1-2: 글루카곤에 대해 cAMP 반응을 보이는 세포주의 생산
인간 글루카곤 수용체 유전자의 cDNA(OriGene Technologies, Inc. USA)에서 ORF에 해당하는 부분을 주형으로 하고, EcoRI 절단부위와 XhoI 절단부위를 각각 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여, PCR 산물을 수득하였다.
HindIII 절단부위와 EcoRI 절단부위를 각각 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여, PCR 산물을 수득하였다.
정방향 프라이머: 5'-CAGCGACACCGACCGTCCCCCCGTACTTAAGGCC-3'(서열번호 52)
역방향 프라이머: 5'-CTAACCGACTCTCGGGGAAGACTGAGCTCGCC-3'(서열번호 53)
상기 PCR 산물을 공지된 동물세포 발현벡터인 x0GC/dhfr에 클로닝하여 제조합 벡터 x0GC/GCGR을 제조하였다.
상기 제조한 재조합 벡터 x0GC/GCGR를 DMEM/F12 (10% FBS) 배지에서 배양한 CHO DG44 세포주에 리포펙타민을 이용한 방법으로 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체를 1mg/mL G418 및 10 nM 메토트락세이트를 포함하는 선별배지에서 선별 배양한 다음, 이로부터 단일 클론 세포주를 선별하여, 글루카곤에 대해 우수한 농도의존적 cAMP 반응을 보이는 세포주를 최종적으로 선별하였다.
실시예 2. 옥신토모듈린 유도체 in vitro 활성
옥신토모듈린 유도체들의 in vitro 활성을 측정하기 위하여 하기의 아미노산 서열을 가지는 옥신토모듈린 유도체들을 합성하였다(표 1).
옥신토모듈린 및 옥신토모듈린 유도체
서열번호 서열
서열번호1 HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA
서열번호2 CA-SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNTKRNRNNIA
서열번호3 CA-SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNTGPSSGAPPPS
서열번호4 CA-GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS
서열번호5 CA-GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS
서열번호6 CA-GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAAHSQGTFTSDYSKYLD
서열번호7 CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIEWLMNTK
서열번호8 CA-SQGTFTSDLSRQLEEEAVRLFIEWLMNK
서열번호9 CA-GQGTFTSDYSRYLDEEAVXLFIEWLMNTKRNRNNIA
서열번호10 CA-SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNGGPSSGAPPPSK
서열번호11 CA-GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAAHSQGTFTSDYSRYLDK
서열번호12 CA-SQGTFTSDYSRYLDGGGHGEGTFTSDLSKQMEEEAVK
서열번호13 CA-SQGTFTSDYSRYLDXEAVXLFIEWLMNTK
서열번호14 CA-GQGTFTSDYSRYLDEEAVXLFIXWLMNTKRNRNNIA
서열번호15 CA-GQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIXWLMNTKRNRNNIA
서열번호16 CA-SQGTFTSDLSRQLEGGGHSQGTFTSDLSRQLEK
서열번호17 CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIEWIRNTKRNRNNIA
서열번호18 CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIEWIRNGGPSSGAPPPSK
서열번호19 CA-SQGTFTSDYSRYLD E EAV K LFIEWIRNTKRNRNNIA 링 형성
서열번호20 CA-SQGTFTSDYSRYLD E EAV K LFIEWIRNGGPSSGAPPPSK 링 형성
서열번호21 CA-SQGTFTSDYSRQLEEEAVRLFIEWVRNTKRNRNNIA
서열번호22 DA-SQGTFTSDYSKYLD E KRA K EFVQWLMNTK 링 형성
서열번호23 HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVCWLMNT
서열번호24 HAibQGTFTSDY SKYLDEKRAK EFVQWLMNTC
서열번호25 HAibQGTFTSDYSKYLD E KRA K EFVQWLMNTC 링 형성
서열번호26 HAibQGTFTSDYS K YLD E KRAKEFVQWLMNTC 링 형성
서열번호27 HAibQGTFTSDYSKYLD E QAA K EFICWLMNT 링 형성
서열번호28 HAibQGTFTSDY SKYLDEKRAK EFVQWLMNT
서열번호29 H(d)SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA
서열번호30 CA-SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA
서열번호31 CA-(d)SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA
서열번호32 CA-AibQGTFTSDYSKYLD E KRA K EFVQWLMNTC 링 형성
서열번호33 HAibQGTFTSDYAKYLD E KRA K EFVQWLMNTC 링 형성
서열번호34 YAibQGTFTSDYSKYLD E KRA K EFVQWLMNTC 링 형성
상기 표 1의 서열번호 19, 20, 22, 25, 26, 27, 32, 33 및 34 각각에서, 밑줄 및 볼드체로 표시된 아미노산들은, 함께 취해져, 링을 형성함을 의미하며, X로 표기된 아미노산은 비천연형 아미노산인 알파-메틸-글루탐산을 의미한다. 또한, CA는 4-이미다조아세틸(4-imidazoacetyl)을, DA는 데스아미노-히스티딜(desamino-histidyl)을, (d)S는 d-세린(d-serine)을 의미한다.
실시예 2-2: 옥신토모듈린 유도체의 in vitro 활성 측정
항 비만 펩타이드의 효력을 측정하기 위해 상기 실시예 1-1 및 1-2에서 제조한 형질전환체를 이용한 in vitro에서 세포 활성을 측정하는 방법을 이용하였다.
상기 각 형질전환체는 CHO (chinese hamster ovary)에 인간 GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체 유전자를 각각 발현하도록 형질전환된 것으로서, GLP-1과 글루카곤의 활성을 측정하기에 적합하므로, 각 옥신토모듈린 유도체의 활성을 각각의 형질전환체를 이용하여 측정하였다.
구체적으로, 상기 각 형질전환체를 1주일에 2 또는 3회 계대배양하고, 96웰 플레이트에 각 웰당 1 X 105개의 계대배양된 형질전환체를 분주하여 24시간 동안 배양하였다.
상기 배양된 세포를 KRB 완충액으로 세척하고, 1mM IBMX를 포함하는 KRB 완충액 40㎖에 현탁시킨 다음, 5분간 상온에 정치하였다. 옥신토모듈린(서열번호 1) 또는 옥신토모듈린 유도체들(서열번호 2-6, 8, 10-13, 17, 18, 23-25, 27, 28 및 32-34)을 1000 nM부터 5배씩 0.02 nM까지 연속적으로 희석하고, 이를 40㎖씩 상기 세포에 첨가한 다음, 1시간 동안 37℃의 온도조건으로 CO2 배양기에서 배양하였다. 그런 다음, 세포용해완충액(cell lysis buffer) 20㎖씩 가하여 세포를 용해시키고, 상기 세포용해물을 cAMP assay kit(Molecular Device, USA)에 적용하여 cAMP 농도를 측정하고, 이로부터 EC50값을 산출한 후, 상호 비교하였다(표 2).
옥신토모듈린 유도체의 GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체 in vitro 활성비교
서열번호 EC50 (nM)
CHO/GLP-1R CHO/GCGR
서열번호1 50 - 210 10 - 43
서열번호2 51.8 12.8
서열번호3 >1,000 637.7
서열번호4 5.5 >1000
서열번호5 5.9 >1000
서열번호6 500.1 >1000
서열번호8 419.6 >1000
서열번호10 >1,000 >1000
서열번호11 >1,000 >1000
서열번호12 >1,000 >1,000
서열번호13 >1,000 >1000
서열번호17 97.9 >1000
서열번호18 96.3 >1000
서열번호23 2.46 5.8
서열번호24 1.43 6.95
서열번호25 1.9 1.3
서열번호27 2.8-5.5 3.1-5.6
서열번호28 3.1 0.3
서열번호32 41.3 17.7
서열번호33 2.2 80.2
서열번호34 12.5 1.04
상기 표 2에서 보듯이, 서열번호 1인 고유 옥신토모듈린의 in vitro 활성에 비해 GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체 활성이 우수한 옥신토모듈린 유도체들이 확인되었다.
옥신토모듈린은 GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체의 활성화를 통해 식욕억제 및 포만감 증진, 지방세포 분해 촉진을 통해 비만치료효과가 있음이 알려져 있으며, 상기 유도체의 높은 in vitro 활성은 기존 옥신토모듈린에 비해 높은 효력의 비만치료제로 사용할 수 있음을 예측할 수 있다.
실시예 3. 옥신토모듈린 유도체 in vivo 활성
옥신토모듈린 유도체의 in vivo 활성을 측정하기 위하여 대조약물로 고유 옥신토모듈린을 사용하여 ob/ob 마우스에서 시험 물질 투여에 따른 in vivo 옥신토모듈린 유도체의 활성을 측정하였다.
구체적으로, 비만 당뇨제제 효능 시험 시 일반적으로 가장 많이 사용되는 모델 동물인 ob/ob 마우스를 16 시간 동안 절식 시킨 후, 1 또는 10mg/kg의 옥신토모듈린, 또는 0.02, 0.1, 1 또는 10mg/kg의 서열번호 2의 옥신토모듈린 유도체를 각각 투여하고, 2 시간 동안의 사료 섭취량을 측정하였다(도 1). 도 1은 옥신토모듈린 또는 옥신토모듈린 유도체의 투여량에 따른 사료 섭취량의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 1에서 보듯이, 1mg/kg의 옥신토모듈린 유도체를 투여할 경우, 10mg/kg의 옥신토모듈린을 투여할 경우보다도, 우수한 사료 섭취 억제 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 4: 옥신토모듈린과 면역글로블린 Fc 를 포함하는 결합체의 제조
우선, 3.4K PropionALD(2) PEG(프로피온알데히드기를 2개 가지고 있는 PEG, NOF.,일본)를 옥신토모듈린(서열번호 1)의 아미노산 서열 30번 라이신 잔기에 페길화시키기 위하여, 옥신토모듈린과 3.4K PropionALD(2) PEG의 몰비를 1:12, 단백질의 농도를 5㎎/㎖로 하여 4℃에서 4.5 시간동안 반응시켰다. 이때, 반응은 100mM Na-Borate 완충액(pH 9.0)과 45% 아이소프로판올의 혼합용매에 환원제인 20mM SCB(NaCNBH3)가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE S(XK16, 아머샴 바이오사이언스)에 적용하여 라이신에 모노-페길화된(Monopegylated) 옥신토모듈린을 정제하였다(Column : SOURCE S(XK16, 아머샴 바이오사이언스), 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 →3% 1분 B → 40% 222분 B(A: 20mM Na-citrate, pH 3.0 + 45% 에탄올, B: A + 1M KCl))(도 2a). 도 2a는 SOURCE S 정제컬럼을 통해 모노-페길화된 옥신토모듈린를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다. 상기 용출된 피크의 모노-페길화는 SDS-PAGE를 통하여 확인하였고 라이신 선택성은 Asp-N 단백질가수분해효소를 이용한 펩티드 매핑(peptide mapping) 법을 사용하여 확인하였다(도 2b). 도 2b는 정제된 모노-페길화된 옥신토모듈린의 펩티드 매핑 결과를 나타내는 그래프이다.
다음으로, 상기 정제된 모노-페길화된 옥신토모듈린과 면역글로블빈 Fc을 몰비가 1:10, 단백질의 농도를 20㎎/㎖로 하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응액은 100mM 인산칼륨 완충액(pH6.0)에 환원제인 20mM SCB가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE 15Q 정제컬럼에 적용하여, 옥신토모듈린과 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제하였다(Column : SOURCE 15Q(XK16, 아머샴 바이오사이언스), 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 → 20% 100분 B(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1M NaCl))(도 2c). 도 2c는 옥신토모듈린과 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
실시예 5: 옥신토모듈린 유도체(서열번호 29)와 면역글로블린 Fc 를 포함하는 결합체의 제조(면역글로불린 Fc 영역 결합 옥신토모듈린 유도체 29)
우선, 3.4K PropionALD(2) PEG를 옥신토모듈린 유도체(서열번호 29)의 아미노산 서열 30번 라이신 잔기에 페길화시키기 위하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 29)와 3.4K PropionALD(2) PEG의 몰비를 1:12, 단백질의 농도를 5㎎/㎖로 하여 4℃에서 4.5 시간동안 반응시켰다. 이때, 반응은 100mM Na-Borate 완충액(pH 9.0)과 45% 아이소프로판올의 혼합용매에 환원제인 20mM SCB가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE S에 적용하여 라이신에 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체를 정제하였다(Column : SOURCE S, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 →3% 1분 B → 40% 222분 B(A: 20mM Na-citrate, pH 3.0 + 45% 에탄올, B: A + 1M KCl))(도 3a). 도 3a는 SOURCE S 정제컬럼을 통해 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 29)를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
다음으로, 상기 정제된 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 29)와 면역글로블빈 Fc을 몰비가 1:10, 단백질의 농도를 20㎎/㎖로 하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응액은 100mM 인산칼륨 완충액(pH6.0)에 환원제인 20mM SCB가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE 15Q 정제컬럼에 적용하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 29)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제하였다(Column : SOURCE 15Q, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 → 20% 100분 B(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1M NaCl))(도 3b). 도 3b는 옥신토모듈린 유도체(서열번호 29)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
실시예 6: 옥신토모듈린 유도체(서열번호 30)와 면역글로블린 Fc 를 포함하는 결합체의 제조(면역글로불린 Fc 영역 결합 옥신토모듈린 유도체 30)
우선, 3.4K PropionALD(2) PEG를 옥신토모듈린 유도체(서열번호 30)의 아미노산 서열 30번 라이신 잔기에 페길화시키기 위하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 30)와 3.4K PropionALD(2) PEG의 몰비를 1:15, 단백질의 농도를 3㎎/㎖로 하여 4℃에서 4.5 시간동안 반응시켰다. 이때, 반응은 100mM HEPES 완충액(pH 7.5)과 45% 아이소프로판올의 혼합용매에 환원제인 20mM SCB가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE S에 적용하여 라이신에 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체를 정제하였다(Column : SOURCE S, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 →3% 1분 B → 40% 222분 B(A: 20mM Na-citrate, pH 3.0 + 45% 에탄올, B: A + 1M KCl))(도 4a). 도 4a는 SOURCE S 정제컬럼을 통해 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 30)를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다. 상기 용출된 피크의 모노-페길화는 SDS-PAGE를 통하여 확인하였고 라이신 선택성은 Asp-N 단백질가수분해효소를 이용한 펩티드 매핑 법을 사용하여 확인하였다(도 4b). 도 4b는 정제된 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 30)의 펩티드 매핑 결과를 나타내는 그래프이다.
다음으로, 상기 정제된 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 30)와 면역글로블빈 Fc을 몰비가 1:10, 단백질의 농도를 20㎎/㎖로 하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응액은 100mM 인산칼륨 완충액(pH6.0)에 환원제인 20mM SCB가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE 15Q 정제컬럼에 적용하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 30)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제하였다(Column : SOURCE 15Q, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 → 20% 100분 B(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1M NaCl))(도 4c). 도 4c는 옥신토모듈린 유도체(서열번호 30)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
실시예 7: 옥신토모듈린 유도체(서열번호 31)와 면역글로블린 Fc 를 포함하는 결합체의 제조(면역글로불린 Fc 영역 결합 옥신토모듈린 유도체 31)
우선, 3.4K PropionALD(2) PEG를 옥신토모듈린 유도체(서열번호 31)의 아미노산 서열 30번 라이신 잔기에 페길화시키기 위하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 31)와 3.4K PropionALD(2) PEG의 몰비를 1:15, 단백질의 농도를 3㎎/㎖로 하여 4℃에서 4.5 시간동안 반응시켰다. 이때, 반응은 100mM HEPES 완충액(pH 7.5)과 45% 아이소프로판올의 혼합용매에 환원제인 20mM SCB가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE S에 적용하여 라이신에 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체를 정제하였다(Column : SOURCE S, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 →3% 1분 B → 40% 222분 B(A: 20mM Na-citrate, pH 3.0 + 45% 에탄올, B: A + 1M KCl))(도 5a). 도 5a는 SOURCE S 정제컬럼을 통해 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 31)를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
다음으로, 상기 정제된 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 31)와 면역글로블빈 Fc을 몰비가 1:10, 단백질의 농도를 20㎎/㎖로 하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응액은 100mM 인산칼륨 완충액(pH6.0)에 환원제인 20mM SCB가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE 15Q 정제컬럼에 적용하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 31)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제하였다(Column : SOURCE 15Q, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 → 20% 100분 B(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1M NaCl))(도 5b). 도 5b는 옥신토모듈린 유도체(서열번호 31)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
실시예 8: 옥신토모듈린 유도체(서열번호 2)와 면역글로블린 Fc 를 포함하는 결합체의 제조(면역글로불린 Fc 영역 결합 옥신토모듈린 유도체 2)
우선, 3.4K PropionALD(2) PEG를 옥신토모듈린 유도체(서열번호 2)의 아미노산 서열 30번 라이신 잔기에 페길화시키기 위하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 2)와 3.4K PropionALD(2) PEG의 몰비를 1:10, 단백질의 농도를 3㎎/㎖로 하여 4℃에서 4 시간동안 반응시켰다. 이때, 반응은 100mM HEPES 완충액(pH 7.5)과 45% 아이소프로판올의 혼합용매에 환원제인 20mM SCB가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE S에 적용하여 라이신에 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체를 정제하였다(Column : SOURCE S, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 →3% 1분 B → 40% 222분 B(A: 20mM Na-citrate, pH 3.0 + 45% 에탄올, B: A + 1M KCl))(도 6a). 도 6a는 SOURCE S 정제컬럼을 통해 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 2)를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다. 상기 용출된 피크의 모노-페길화는 SDS-PAGE를 통하여 확인하였고 라이신 선택성은 Asp-N 단백질가수분해효소를 이용한 펩티드 매핑 법을 사용하여 확인하였다(도 6b). 도 6b는 정제된 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 2)의 펩티드 매핑 결과를 나타내는 그래프이다.
다음으로, 상기 정제된 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 2)와 면역글로블빈 Fc을 몰비가 1:8, 단백질의 농도를 20㎎/㎖로 하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응액은 100mM 인산칼륨 완충액(pH6.0)에 환원제인 20mM SCB가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE 15Q 정제컬럼(Column : SOURCE 15Q, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 → 4% 1분 B → 20% 80분 B(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1M NaCl))(도 6c)과 Source ISO 정제컬럼(Column : SOURCE ISO(XK16, 아머샴 바이오사이언스), 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 → 100% 100분 B,(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1.3M AS))(도 6d)에 적용하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 2)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제하였다. 도 6c는 SOURCE 15Q 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 2)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 6d는 Source ISO 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 2)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
실시예 9: 옥신토모듈린 유도체(서열번호 3)와 면역글로블린 Fc 를 포함하는 결합체의 제조(면역글로불린 Fc 영역 결합 옥신토모듈린 유도체 3)
우선, 3.4K PropionALD(2) PEG를 옥신토모듈린 유도체(서열번호 3)의 아미노산 서열 27번 라이신 잔기에 페길화시키기 위하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 3)와 3.4K PropionALD(2) PEG의 몰비를 1:10, 단백질의 농도를 3㎎/㎖로 하여 4℃에서 4 시간동안 반응시켰다. 이때, 반응은 100mM HEPES 완충액(pH 7.5)과 45% 아이소프로판올의 혼합용매에 환원제인 20mM SCB가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE S에 적용하여 라이신에 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체를 정제하였다(Column : SOURCE S, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 →3% 1분 B → 40% 222분 B(A: 20mM Na-citrate, pH 3.0 + 45% 에탄올, B: A + 1M KCl))(도 7a). 도 7a는 SOURCE S 정제컬럼을 통해 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 3)를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다. 상기 용출된 피크의 모노-페길화는 SDS-PAGE를 통하여 확인하였고 라이신 선택성은 Asp-N 단백질가수분해효소를 이용한 펩티드 매핑 법을 사용하여 확인하였다(도 7b). 도 7b는 정제된 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 3)의 펩티드 매핑 결과를 나타내는 그래프이다.
다음으로, 상기 정제된 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 3)와 면역글로블빈 Fc을 몰비가 1:8, 단백질의 농도를 20㎎/㎖로 하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응액은 100mM 인산칼륨 완충액(pH6.0)에 환원제인 20mM SCB가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 Butyl FF 정제컬럼(Column : Butyl FF(XK16, 아머샴 바이오사이언스), 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : B 0 → 100% 5분 A(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1.5M NaCl))(도 7c)과 SOURCE 15Q 정제컬럼(Column : SOURCE 15Q, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 → 4% 1분 B → 20% 80분 B(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1M NaCl))(도 7d)에 적용하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 3)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제하였다. 도 7c는 Butyl FF 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 3)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 7d는 SOURCE 15Q 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 3)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
실시예 10: 옥신토모듈린 유도체(서열번호 23)와 면역글로블린 Fc 를 포함하는 결합체의 제조(면역글로불린 Fc 영역 결합 옥신토모듈린 유도체 23)
우선, MAL-10K-ALD PEG(NOF.,일본)를 옥신토모듈린 유도체(서열번호 23)의 아미노산 서열 24번 시스테인 잔기에 페길화시키기 위하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 23)와 MAL-10K-ALD PEG의 몰비를 1:3, 단백질의 농도를 3㎎/㎖로 하여 상온에서 3 시간동안 반응시켰다. 이때, 반응은 50mM Tris 완충액(pH 8.0)에 1M 구아니딘이 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE S에 적용하여 시스테인에 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체를 정제하였다(Column : SOURCE S, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 →100% 50분 B(A: 20mM Na-citrate, pH 3.0 + 45% 에탄올, B: A + 1M KCl))(도 8a). 도 8a는 SOURCE S 정제컬럼을 통해 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 23)를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
다음으로, 상기 정제된 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 23)와 면역글로블빈 Fc을 몰비가 1:5, 단백질의 농도를 20㎎/㎖로 하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응액은 100mM 인산칼륨 완충액(pH6.0)에 환원제인 20mM SCB가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE 15Q 정제컬럼(Column : SOURCE 15Q, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 → 4% 1분 B → 20% 80분 B(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1M NaCl))(도 8b)과 Source ISO 정제컬럼(Column : SOURCE ISO, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : B 0 → 100% 100분 A,(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1.1M AS))(도 8c)에 적용하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 23)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제하였다. 도 8b는 SOURCE 15Q 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 23)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 8c는 Source ISO 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 23)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
실시예 11: 옥신토모듈린 유도체(서열번호 24)와 면역글로블린 Fc 를 포함하는 결합체의 제조(면역글로불린 Fc 영역 결합 옥신토모듈린 유도체 24)
우선, MAL-10K-ALD PEG를 옥신토모듈린 유도체(서열번호 24)의 아미노산 서열 30번 시스테인 잔기에 페길화시키기 위하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 24)와 MAL-10K-ALD PEG의 몰비를 1:3, 단백질의 농도를 3㎎/㎖로 하여 상온에서 3 시간동안 반응시켰다. 이때, 반응은 50mM Tris 완충액(pH 8.0)에 1M 구아니딘이 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE S에 적용하여 시스테인에 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체를 정제하였다(Column : SOURCE S, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 →100% 50분 B(A: 20mM Na-citrate, pH 3.0 + 45% 에탄올, B: A + 1M KCl))(도 9a). 도 9a는 SOURCE S 정제컬럼을 통해 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 24)를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
다음으로, 상기 정제된 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 24)와 면역글로블빈 Fc을 몰비가 1:5, 단백질의 농도를 20㎎/㎖로 하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응액은 100mM 인산칼륨 완충액(pH6.0)에 환원제인 20mM SCB가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE 15Q 정제컬럼(Column : SOURCE 15Q, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 → 4% 1분 B → 20% 80분 B(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1M NaCl))(도 9b)과 Source ISO 정제컬럼(Column : SOURCE ISO, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : B 0 → 100% 100분 A,(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1.1M AS))(도 9c)에 적용하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 24)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제하였다. 도 9b는 SOURCE 15Q 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 24)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 9c는 Source ISO 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 24)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
실시예 12: 옥신토모듈린 유도체(서열번호 25)와 면역글로블린 Fc 를 포함하는 결합체의 제조(면역글로불린 Fc 영역 결합 옥신토모듈린 유도체 25)
우선, MAL-10K-ALD PEG를 옥신토모듈린 유도체(서열번호 25)의 아미노산 서열 30번 시스테인 잔기에 페길화시키기 위하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 25)와 MAL-10K-ALD PEG의 몰비를 1:3, 단백질의 농도를 3㎎/㎖로 하여 상온에서 3 시간동안 반응시켰다. 이때, 반응은 50mM Tris 완충액(pH 8.0)에 1M 구아니딘이 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE S에 적용하여 시스테인에 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체를 정제하였다(Column : SOURCE S, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 →100% 50분 B(A: 20mM Na-citrate, pH 3.0 + 45% 에탄올, B: A + 1M KCl))(도 10a). 도 10a는 SOURCE S 정제컬럼을 통해 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 25)를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
다음으로, 상기 정제된 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 25)와 면역글로블빈 Fc을 몰비가 1:5, 단백질의 농도를 20㎎/㎖로 하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응액은 100mM 인산칼륨 완충액(pH6.0)에 환원제인 20mM SCB가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE 15Q 정제컬럼(Column : SOURCE 15Q, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 → 4% 1분 B → 20% 80분 B(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1M NaCl))(도 10b)과 Source ISO 정제컬럼(Column : SOURCE ISO, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : B 0 → 100% 100분 A,(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1.1M AS))(도 10c)에 적용하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 25)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제하였다. 도 10b는 SOURCE 15Q 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 25)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 10c는 Source ISO 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 25)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
실시예 13: 옥신토모듈린 유도체(서열번호 28)와 면역글로블린 Fc 를 포함하는 결합체의 제조(면역글로불린 Fc 영역 결합 옥신토모듈린 유도체 28)
우선, 3.4K PropionALD(2) PEG를 옥신토모듈린 유도체(서열번호 28)의 아미노산 서열 20번 라이신 잔기에 페길화시키기 위하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 28)와 MAL-10K-ALD PEG의 몰비를 1:5, 단백질의 농도를 3㎎/㎖로 하여 4℃에서 3 시간동안 반응시켰다. 이때, 반응은 50mM Na-Borate 완충액(pH 9.0)에 2M 구아니딘이 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE S에 적용하여 라이신에 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체를 정제하였다(Column : SOURCE S, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 →3% 1분 B → 40% 222분 B (A: 20mM Na-citrate, pH 3.0 + 45% 에탄올, B: A + 1M KCl))(도 11a). 도 11a는 SOURCE S 정제컬럼을 통해 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 28)를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
다음으로, 상기 정제된 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 28)와 면역글로블빈 Fc을 몰비가 1:10, 단백질의 농도를 20㎎/㎖로 하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응액은 100mM 인산칼륨 완충액(pH6.0)에 환원제인 20mM SCB가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE 15Q 정제컬럼(Column : SOURCE 15Q, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 → 4% 1분 B → 20% 80분 B(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1M NaCl))(도 11b)과 Source ISO 정제컬럼(Column : SOURCE ISO, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : B 0 → 100% 100분 A,(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1.1M AS))(도 11c)에 적용하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 28)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제하였다. 도 11b는 SOURCE 15Q 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 28)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 11c는 Source ISO 정제컬럼을 통해 옥신토모듈린 유도체(서열번호 28)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
실시예 14: 옥신토모듈린 유도체(서열번호 32)와 면역글로블린 Fc 를 포함하는 결합체의 제조 (면역글로불린 Fc 영역 결합 옥신토모듈린 유도체 32)
우선, MAL-10K-ALD PEG를 옥신토모듈린 유도체(서열번호 32)의 아미노산 서열 30번 시스테인 잔기에 페길화시키기 위하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 32)와 MAL-10K-ALD PEG의 몰비를 1:3, 단백질의 농도를 1㎎/㎖로 하여 상온에서 3 시간동안 반응시켰다. 이때, 반응은 50mM Tris 완충액(pH 8.0)에 2M 구아니딘이 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE S에 적용하여 시스테인에 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체를 정제하였다(Column : SOURCE S, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 →100% 50분 B(A: 20mM Na-citrate, pH 3.0 + 45% 에탄올, B: A + 1M KCl).
다음으로, 상기 정제된 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 32)와 면역글로블빈 Fc을 몰비가 1:8, 단백질의 농도를 20㎎/㎖로 하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응액은 100mM 인산칼륨 완충액(pH6.0)에 환원제인 20mM SCB가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE 15Q 정제컬럼(Column : SOURCE 15Q, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 → 4% 1분 B → 20% 80분 B(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1M NaCl)과 Source ISO 정제컬럼(Column : SOURCE ISO, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : B 0 → 100% 100분 A,(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1.1M AS))에 적용하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 32)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제하였다.
실시예 15: 옥신토모듈린 유도체(서열번호 33)와 면역글로블린 Fc 를 포함하는 결합체의 제조 (면역글로불린 Fc 영역 결합 옥신토모듈린 유도체 33)
우선, MAL-10K-ALD PEG를 옥신토모듈린 유도체(서열번호 33)의 아미노산 서열 30번 시스테인 잔기에 페길화시키기 위하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 33)와 MAL-10K-ALD PEG의 몰비를 1:1, 단백질의 농도를 1㎎/㎖로 하여 상온에서 3 시간동안 반응시켰다. 이때, 반응은 50mM Tris 완충액(pH 8.0)에 2M 구아니딘이 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE S에 적용하여 시스테인에 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체를 정제하였다(Column : SOURCE S, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 →100% 50분 B(A: 20mM Na-citrate, pH 3.0 + 45% 에탄올, B: A + 1M KCl).
다음으로, 상기 정제된 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 33)와 면역글로블빈 Fc을 몰비가 1:5, 단백질의 농도를 20㎎/㎖로 하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응액은 100mM 인산칼륨 완충액(pH6.0)에 환원제인 20mM SCB가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE 15Q 정제컬럼(Column : SOURCE 15Q, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 → 4% 1분 B → 20% 80분 B(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1M NaCl)과 Source ISO 정제컬럼(Column : SOURCE ISO, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : B 0 → 100% 100분 A,(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1.1M AS))에 적용하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 33)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제하였다.
실시예 16: 옥신토모듈린 유도체(서열번호 34)와 면역글로블린 Fc 를 포함하는 결합체의 제조 (면역글로불린 Fc 영역 결합 옥신토모듈린 유도체 34)
우선, MAL-10K-ALD PEG를 옥신토모듈린 유도체(서열번호 34)의 아미노산 서열 30번 시스테인 잔기에 페길화시키기 위하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 34)와 MAL-10K-ALD PEG의 몰비를 1:1, 단백질의 농도를 3㎎/㎖로 하여 상온에서 3 시간동안 반응시켰다. 이때, 반응은 50mM Tris 완충액(pH 8.0)에 1M 구아니딘이 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE S에 적용하여 시스테인에 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체를 정제하였다(Column : SOURCE S, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 →100% 50분 B(A: 20mM Na-citrate, pH 3.0 + 45% 에탄올, B: A + 1M KCl).
다음으로, 상기 정제된 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 34)와 면역글로블빈 Fc을 몰비가 1:5, 단백질의 농도를 20㎎/㎖로 하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응액은 100mM 인산칼륨 완충액(pH6.0)에 환원제인 20mM SCB가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE 15Q 정제컬럼(Column : SOURCE 15Q, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 → 4% 1분 B → 20% 80분 B(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1M NaCl)과 Source ISO 정제컬럼(Column : SOURCE ISO, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : B 0 → 100% 100분 A,(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1.1M AS))에 적용하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 34)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제하였다.
실시예 17: 옥신토모듈린 유도체-면역글로불린 Fc 결합체의 in vitro 활성
상기 실시예에서 제조된 옥신토모듈린 또는 옥신토모듈린 유도체와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체의 항 비만 효과를 측정하고자, 상기 실시예 2-2와 동일한 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1-1 및 1-2에서 제조한 각 형질전환체를 1주일에 2 또는 3회 계대배양하고, 96 웰 플레이트에 각 웰당 1 X 105개의 계대배양된 형질전환체를 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 각 형질전환체를 KRB 완충액으로 세척하고, 1mM IBMX를 포함하는 KRB 완충액 40㎖에 현탁시킨 다음, 5분간 상온에 정치하였다. GLP-1, 글루카곤 또는 옥신토모듈린 유도체(서열번호 23, 24, 25, 32, 33, 또는 34)-면역글로불린 Fc 결합체를 각각 1000 nM부터 5배씩 0.02 nM까지 연속적으로 희석하고, 이를 40㎖씩 상기 각 형질전환체에 첨가한 다음, 1시간 동안 37℃의 온도조건으로 CO2 배양기에서 배양하였다. 그런 다음, 세포용해완충액(cell lysis buffer) 20㎖씩 가하여 세포를 용해시키고, 상기 세포용해물을 cAMP assay kit(Molecular Device, USA)에 적용하여 cAMP 농도를 Victor(Perkin Elmer, USA)로 측정하고, 이로부터 EC50값을 산출한 후, 상호 비교하였다(표 3).
옥신토모듈린 유도체-면역글로불린 Fc 결합체 in vitro 활성
서열번호 EC50 (nM)
CHO/GLP-1R CHO/GCGR
GLP-1 1.7 ±0.82 > 1,000
Glucagon >1,000 1.7 ± 1.69
서열번호 23 - Fc 결합체 5.4 15.8
서열번호 24 - Fc 결합체 8.4 76.8
서열번호 25 - Fc 결합체 5.5 9.4
서열번호 32 - Fc 결합체 68.7 11.9
서열번호 33 - Fc 결합체 11.7 85.9
서열번호 34 - Fc 결합체 168.0 8.0
상기 표 3에서 보듯이, 옥신토모듈린 유도체-면역글로불린 Fc 결합체는 고유의 GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체에 대한 in vitro 활성을 유지함을 확인할 수 있었다.
실시예 18: 옥신토모듈린 유도체-면역글로불린 결합체의 in vivo 활성
상기 실시예 14의 결과로부터, 옥신토모듈린 유도체-면역글로불린 Fc 결합체가 옥신토모듈린 유도체 보다도 우수한 활성을 나타냄을 확인하였으므로, 상기 결합체가 우수한 체중감소 효과를 나타내는지의 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 약 6주령의 정상 C57BL/6 마우스에 60kcal의 고지방 사료를 24주 동안 급이시켜 평균적으로 체중을 약 50g씩 증가시켰다. 상기 마우스에 옥신토모듈린 유도체(서열번호 23, 24, 또는 25)-면역글로불린 Fc 결합체를 각각 0.03 또는 0.06 ㎎/㎏/주의 투여량으로 3주간 피하주사하고, 각 마우스의 체중변화를 측정하였다(도 12 및 도 13). 도 12 및 도 13은 옥신토모듈린 유도체-면역글로불린 Fc 결합체의 종류 및 투여량에 따른 마우스의 체중변화를 경시적으로 나타낸 그래프이다. 도 12 및 도 13에서 보듯이, 옥신토모듈린 유도체-면역글로불린 Fc 결합체의 종류에 따라, 다소 차이가 있으나, 상기 옥신토모듈린 유도체-면역글로불린 Fc 결합체의 투여량이 증가하면 이에 비례하여 체중감소 효과가 나타났으므로, 상기 옥신토모듈린 유도체-면역글로불린 Fc 결합체는 용량의존적으로 체중을 감소시키는 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
<110> HANMI SCIENCE CO., LTD. <120> A CONJUGATE COMPRISING OXYNTOMODULIN AND AN IMMUNOGLOBULIN FRAGMENT, AND USE THEREOF <130> PA120526/KR <150> KR 10-2011-0058852 <151> 2011-06-17 <160> 53 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> oxyntomodulin <400> 1 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35 <210> 2 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = 4-imidazoacetyl <400> 2 Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = 4-imidazoacetyl <400> 3 Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Ala Trp Leu Lys Asn Thr Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 4 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = 4-imidazoacetyl <400> 4 Xaa Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 5 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = 4-imidazoacetyl <400> 5 Xaa Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 6 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = 4-imidazoacetyl <400> 6 Xaa Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Ala Ala His Ser Gln Gly Thr 20 25 30 Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp 35 40 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = 4-imidazoacetyl <400> 7 Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys 20 25 30 <210> 8 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = 4-imidazoacetyl <400> 8 Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Lys 20 25 <210> 9 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = 4-imidazoacetyl <220> <221> VARIANT <222> (20) <223> Xaa = alpha-methyl-glutamic acid <400> 9 Xaa Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Xaa Leu Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35 <210> 10 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = 4-imidazoacetyl <400> 10 Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys 35 40 <210> 11 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = 4-imidazoacetyl <400> 11 Xaa Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Ala Ala His Ser Gln Gly Thr 20 25 30 Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Lys 35 40 <210> 12 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = 4-imidazoacetyl <400> 12 Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Gly His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met 20 25 30 Glu Glu Glu Ala Val Lys 35 <210> 13 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = 4-imidazoacetyl <220> <221> VARIANT <222> (16) <223> Xaa = alpha-methyl-glutamic acid <220> <221> VARIANT <222> (20) <223> Xaa = alpha-methyl-glutamic acid <400> 13 Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Glu Ala Val Xaa Leu Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys 20 25 30 <210> 14 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = 4-imidazoacetyl <220> <221> VARIANT <222> (20) <223> Xaa = alpha-methyl-glutamic acid <220> <221> VARIANT <222> (24) <223> Xaa = alpha-methyl-glutamic acid <400> 14 Xaa Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Xaa Leu Phe Ile Xaa Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35 <210> 15 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = 4-imidazoacetyl <220> <221> VARIANT <222> (24) <223> Xaa = alpha-methyl-glutamic acid <400> 15 Xaa Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Xaa Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35 <210> 16 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = 4-imidazoacetyl <400> 16 Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gly Gly His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Leu 20 25 30 Glu Lys <210> 17 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = 4-imidazoacetyl <400> 17 Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Ile Arg Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35 <210> 18 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = 4-imidazoacetyl <400> 18 Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Ile Arg Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys 35 40 <210> 19 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = 4-imidazoacetyl <220> <221> VARIANT <222> (16), (20) <223> amino acids at position 16 and position 20 form a ring <400> 19 Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Ile Arg Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35 <210> 20 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = 4-imidazoacetyl <220> <221> VARIANT <222> (16), (20) <223> amino acids at position 16 and position 20 form a ring <400> 20 Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Ile Arg Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys 35 40 <210> 21 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = 4-imidazoacetyl <400> 21 Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Val Arg Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35 <210> 22 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = desamino-histidyl <220> <221> VARIANT <222> (16), (20) <223> amino acids at position 16 and position 20 form a ring <400> 22 Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys 20 25 30 <210> 23 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = aminoisobutyric acid <400> 23 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Cys Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 24 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = aminoisobutyric acid <400> 24 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys 20 25 30 <210> 25 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = aminoisobutyric acid <220> <221> VARIANT <222> (16), (20) <223> amino acids at position 16 and position 20 form a ring <400> 25 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys 20 25 30 <210> 26 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = aminoisobutyric acid <220> <221> VARIANT <222> (12), (16) <223> amino acids at position 12 and position 16 form a ring <400> 26 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys 20 25 30 <210> 27 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative' <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = aminoisobutyric acid <220> <221> VARIANT <222> (16), (20) <223> amino acids at position 16 and position 20 form a ring <400> 27 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 28 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = aminoisobutyric acid <400> 28 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 29 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = d-serine <400> 29 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35 <210> 30 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = 4-imidazoacetyl <400> 30 Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35 <210> 31 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = 4-imidazoacetyl <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = d-serine <400> 31 Xaa Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35 <210> 32 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = 4-imidazoacetyl <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = aminoisobutyric acid <220> <221> VARIANT <222> (16), (20) <223> amino acids at position 16 and position 20 form a ring <400> 32 Xaa Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys 20 25 30 <210> 33 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = aminoisobutyric acid <220> <221> VARIANT <222> (16), (20) <223> amino acids at position 16 and position 20 form a ring <400> 33 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys 20 25 30 <210> 34 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = aminoisobutyric acid <220> <221> VARIANT <222> (16), (20) <223> amino acids at position 16 and position 20 form a ring <400> 34 Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys 20 25 30 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group R2 <400> 35 Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala 1 5 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group R2 <400> 36 Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 1 5 10 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group R2 <400> 37 Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys 1 5 10 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group R2 <400> 38 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp 1 5 10 15 <210> 39 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group R2 <400> 39 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Lys 1 5 10 15 <210> 40 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group R2 <400> 40 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Lys 20 <210> 41 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group A or B <400> 41 Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg 1 5 10 15 Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 42 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group A or B <400> 42 Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu Glu 1 5 10 15 Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 43 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group A or B <400> 43 Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu Arg 1 5 10 15 Arg Ala Gln Asp Phe Val Ala Trp Leu Lys Asn Thr 20 25 <210> 44 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group A or B <400> 44 Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Glu Glu Glu 1 5 10 15 Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly 20 25 <210> 45 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group A or B <400> 45 Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Gln Met Glu Glu Glu 1 5 10 15 Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly 20 25 <210> 46 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group A or B <400> 46 Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Met Glu Glu Glu 1 5 10 15 Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Ala Ala 20 25 <210> 47 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group A or B <400> 47 Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Gln Met Glu Glu Glu 1 5 10 15 Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Gly 20 25 <210> 48 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group B <400> 48 Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Met Glu Glu Glu 1 5 10 15 Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp 20 <210> 49 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group B <400> 49 Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp 1 5 10 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 cccggccccc gcggccgcta ttcgaaatac 30 <210> 51 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 gaacggtccg gaggacgtcg actcttaaga tag 33 <210> 52 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 cagcgacacc gaccgtcccc ccgtacttaa ggcc 34 <210> 53 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 ctaaccgact ctcggggaag actgagctcg cc 32

Claims (23)

  1. 옥신토모듈린 유도체 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩티드성 중합체를 통해 연결된 지속형 옥신토모듈린 결합체로서, 상기 옥신토모듈린 유도체가 일반식 1로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 지속형 옥신토모듈린 결합체:
    R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2(일반식 1)
    상기 식에서,
    R1은 히스티딘이며;
    X1은 Aib(aminoisobutyric acid)이고;
    X2는 글루탐산 또는 글루타민이며;
    X3은 류신 또는 티로신이고;
    X4는 세린 또는 알라닌이며;
    X5는 리신 또는 아르기닌이며;
    X6은 글루타민 또는 티로신이고;
    X7은 류신 또는 메티오닌이며;
    X8은 아스파르트산 또는 글루탐산이고;
    X9는 글루탐산, 세린, 알파-메틸-글루탐산 또는 결실된 서열이며;
    X10은 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌, 세린 또는 결실된 서열이고;
    X11은 알라닌, 아르기닌, 발린 또는 결실된 서열이며;
    X12는 알라닌, 아르기닌, 세린, 발린 또는 결실된 서열이고;
    X13은 리신, 글루타민, 아르기닌, 알파-메틸-글루탐산 또는 결실된 서열이며;
    X14는 아스파르트산, 글루탐산, 류신 또는 결실된 서열이고;
    X15는 페닐알라닌 또는 결실된 서열이며;
    X16은 이소류신, 발린 또는 결실된 서열이며;
    X17은 알라닌, 시스테인, 글루탐산, 리신, 글루타민, 알파-메틸-글루탐산 또는 결실된 서열이고;
    X18은 트립토판 또는 결실된 서열이며;
    X19는 알라닌, 이소류신, 류신, 세린, 발린 또는 결실된 서열이며;
    X20은 알라닌, 메티오닌, 글루타민, 아르기닌 또는 결실된 서열이고;
    X21은 아스파라긴 또는 결실된 서열이며;
    X22는 알라닌, 글리신, 트레오닌 또는 결실된 서열이며;
    X23은 시스테인, 리신 또는 결실된 서열이고;
    X24는 알라닌, 글리신 및 세린의 조합으로 구성된 2 내지 10개의 아미노산을 가지는 펩타이드 또는 결실된 서열이며; 및,
    R2는 KRNRNNIA(서열번호 32), HSQGTFTSDYSKYLD(서열번호 35), HSQGTFTSDYSRYLDK(서열번호 36), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(서열번호 37) 또는 결실된 서열임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 일반식 1의 아미노산 서열 중 X19는 류신이고, X20은 메티오닌이고, X21은 아스파라긴이고, X22는 트레오닌인 것인, 지속형 옥신토모듈린 결합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 일반식 1의 아미노산 서열 중 X2가 글루타민인 것인, 지속형 옥신토모듈린 결합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 일반식 1의 아미노산 서열 중 X24와 R2가 결실된 서열인 것인, 지속형 옥신토모듈린 결합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 옥신토모듈린 유도체는 서열번호 23 내지 28 및 33으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 것인, 지속형 옥신토모듈린 결합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 비펩티드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸에테르, PLA(polylactic acid), PLGA(polylactic-glycolic acid), 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산, 다당류 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 지속형 옥신토모듈린 결합체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 비펩티드성 중합체의 양 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 옥신토모듈린 유도체의 아민 그룹 또는 티올 그룹(Thiol group)에 결합하는 것인, 지속형 옥신토모듈린 결합체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 비펩티드성 중합체는 양쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역 및 단백질 약물과 결합될 수 있는 반응기를 포함하는 것인, 지속형 옥신토모듈린 결합체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 반응기는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 부틸 알데히드그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 지속형 옥신토모듈린 결합체.
  10. 제8항에 있어서, 상기 양쪽 말단의 반응기는 서로 동일하거나 또는 서로 상이한 것인, 지속형 옥신토모듈린 결합체.
  11. 제1항에 있어서, 상기 비펩티드성 중합체가 옥신토모듈린 유도체의 시스테인 잔기에 연결되는 것인, 지속형 옥신토모듈린 결합체.
  12. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 비당쇄화된 것인, 지속형 옥신토모듈린 결합체.
  13. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인; CH1 도메인 및 CH2 도메인; CH1 도메인 및 CH3 도메인; CH2 도메인 및 CH3 도메인; 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역 또는 그의 일부와의 조합; 및, 중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 지속형 옥신토모듈린 결합체.
  14. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 일부 아미노산이 제거되거나, 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가되거나, 보체결합부위가 제거되거나 또는 ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거된 유도체인 것인, 지속형 옥신토모듈린 결합체.
  15. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM로 구성되는 군으로부터 선택되는 면역글로불린에서 유래된 Fc 영역인 것인, 지속형 옥신토모듈린 결합체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역인 것인, 지속형 옥신토모듈린 결합체.
  17. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역인 것인, 지속형 옥신토모듈린 결합체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 지속형 옥신토모듈린 결합체를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것인 비만 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 단독 또는 다른 비만 예방 또는 치료효과를 나타내는 약학적 제제와 병용하여 투여되는 것인 비만 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 약학적 제제는 GLP-1 수용체 아고니스트, 렙틴(Leptin) 수용체 아고니스트, DPP-IV 저해제, Y5 수용체 안타고니스트, MCH (Melanin-concentrating hormone) 수용체 안타고니스트, Y2/3 수용체 아고니스트, MC3/4 수용체 아고니스트, 위/췌장 리파아제(gastric/pancreatic lipase) 저해제, 5HT2c 아고니스트, β3A 수용체 아고니스트, 아밀린(Amylin) 수용체 아고니스트, 그랠린 (Ghrelin) 안타고니스트 및 그랠린 수용체 안타고니스트로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 비만 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  22. 삭제
  23. 삭제
KR1020120064110A 2011-06-17 2012-06-15 옥신토모듈린과 면역글로불린 단편을 포함하는 결합체 및 그의 용도 KR101577734B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110058852 2011-06-17
KR20110058852 2011-06-17

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140143521A Division KR101591411B1 (ko) 2011-06-17 2014-10-22 옥신토모듈린과 면역글로불린 단편을 포함하는 결합체 및 그의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120139579A KR20120139579A (ko) 2012-12-27
KR101577734B1 true KR101577734B1 (ko) 2015-12-29

Family

ID=47357296

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120064110A KR101577734B1 (ko) 2011-06-17 2012-06-15 옥신토모듈린과 면역글로불린 단편을 포함하는 결합체 및 그의 용도
KR1020140143521A KR101591411B1 (ko) 2011-06-17 2014-10-22 옥신토모듈린과 면역글로불린 단편을 포함하는 결합체 및 그의 용도

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140143521A KR101591411B1 (ko) 2011-06-17 2014-10-22 옥신토모듈린과 면역글로불린 단편을 포함하는 결합체 및 그의 용도

Country Status (32)

Country Link
US (3) US9731031B2 (ko)
EP (2) EP3502129B1 (ko)
JP (2) JP6038905B2 (ko)
KR (2) KR101577734B1 (ko)
CN (2) CN103732616B (ko)
AR (2) AR086969A1 (ko)
AU (3) AU2012270366C1 (ko)
BR (1) BR112013032375B1 (ko)
CA (2) CA3080189C (ko)
CL (1) CL2013003619A1 (ko)
CY (1) CY1121255T1 (ko)
DK (2) DK3502129T3 (ko)
ES (2) ES2882520T3 (ko)
HR (1) HRP20190265T1 (ko)
HU (1) HUE042585T2 (ko)
IL (4) IL229759A (ko)
LT (1) LT2721062T (ko)
MX (1) MX353402B (ko)
MY (1) MY164680A (ko)
PE (3) PE20181268A1 (ko)
PH (1) PH12018501119A1 (ko)
PL (1) PL2721062T3 (ko)
PT (1) PT2721062T (ko)
RS (1) RS58606B1 (ko)
RU (2) RU2733544C2 (ko)
SG (2) SG195275A1 (ko)
SI (1) SI2721062T1 (ko)
TR (1) TR201901402T4 (ko)
TW (2) TWI601744B (ko)
UA (2) UA114709C2 (ko)
WO (1) WO2012173422A1 (ko)
ZA (1) ZA201309013B (ko)

Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150038413A1 (en) 2006-02-03 2015-02-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US8048849B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Modigene, Inc. Long-acting polypeptides and methods of producing same
US9249407B2 (en) 2006-02-03 2016-02-02 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US10221228B2 (en) 2006-02-03 2019-03-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US20140113860A1 (en) 2006-02-03 2014-04-24 Prolor Biotech Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US9663778B2 (en) 2009-07-09 2017-05-30 OPKO Biologies Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US10166295B2 (en) 2011-06-02 2019-01-01 Opko Biologics Ltd. Pegylated OXM variants
SG195258A1 (en) 2011-06-10 2013-12-30 Hanmi Science Co Ltd Novel oxyntomodulin derivatives and pharmaceutical composition for treating obesity comprising the same
PE20181268A1 (es) 2011-06-17 2018-08-03 Hanmi Science Co Ltd Un conjugado que comprende oxintomodulina y un fragmento de inmunoglobulina, y el uso del mismo
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
JP6290193B2 (ja) 2012-06-04 2018-03-07 オプコ バイオロジクス リミテッド ペグ化ｏｘｍ変異体
KR101968344B1 (ko) * 2012-07-25 2019-04-12 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 고지혈증 치료용 조성물
AR092873A1 (es) 2012-09-26 2015-05-06 Cadila Healthcare Ltd Peptidos como agonistas triples de los receptores de gip, glp-1 y glugagon
UA116217C2 (uk) 2012-10-09 2018-02-26 Санофі Пептидна сполука як подвійний агоніст рецепторів glp1-1 та глюкагону
AR093387A1 (es) * 2012-11-06 2015-06-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de un conjugado de proteina que comprende oxintomodulina y un fragmento de inmunoglobulina
KR101993393B1 (ko) * 2012-11-06 2019-10-01 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 당뇨병 또는 비만성 당뇨병 치료용 조성물
JP2016503771A (ja) 2012-12-21 2016-02-08 サノフイ エキセンジン−４誘導体
AR096890A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugando fc de inmunoglobulina, que mantiene la afinidad de unión del fragmento fc de la inmunoglobulina a fcrn
AR096891A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo
US20150158926A1 (en) 2013-10-21 2015-06-11 Opko Biologics, Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
EP3080150B1 (en) 2013-12-13 2018-08-01 Sanofi Exendin-4 peptide analogues as dual glp-1/gip receptor agonists
TW201609796A (zh) 2013-12-13 2016-03-16 賽諾菲公司 非醯化之艾塞那肽－４（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）胜肽類似物
EP3080149A1 (en) 2013-12-13 2016-10-19 Sanofi Dual glp-1/glucagon receptor agonists
WO2015086729A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Sanofi Dual glp-1/gip receptor agonists
MA39301A1 (fr) 2014-01-20 2018-01-31 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Insuline à action prolongée et utilisation associée
MY192248A (en) * 2014-03-31 2022-08-10 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Method for improving solubility of protein and peptide by using immunoglobulin fc fragment linkage
TW201625670A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自ｅｘｅｎｄｉｎ－４之雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑
TW201625669A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自艾塞那肽－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）之肽類雙重ＧＬＰ－１／升糖素受體促效劑
TW201625668A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 作為胜肽性雙重ｇｌｐ－１／昇糖素受體激動劑之艾塞那肽－４衍生物
AR100639A1 (es) 2014-05-29 2016-10-19 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Composición para tratar diabetes que comprende conjugados de análogos de insulina de acción prolongada y conjugados de péptidos insulinotrópicos de acción prolongada
AR100695A1 (es) * 2014-05-30 2016-10-26 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Composición para el tratamiento de diabetes mellitus que comprende insulina y un agonista dual glp-1 / glucagón
KR20150140177A (ko) 2014-06-05 2015-12-15 한미약품 주식회사 단백질 및 펩타이드의 면역원성을 감소시키는 방법
US9932381B2 (en) 2014-06-18 2018-04-03 Sanofi Exendin-4 derivatives as selective glucagon receptor agonists
TWI802396B (zh) 2014-09-16 2023-05-11 南韓商韓美藥品股份有限公司 長效glp-1/高血糖素受體雙促效劑治療非酒精性脂肝疾病之用途
KR102418477B1 (ko) 2014-12-30 2022-07-08 한미약품 주식회사 글루카곤 유도체
US11135271B2 (en) * 2014-12-30 2021-10-05 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Glucagon derivatives with improved stability
AR105319A1 (es) 2015-06-05 2017-09-27 Sanofi Sa Profármacos que comprenden un conjugado agonista dual de glp-1 / glucagón conector ácido hialurónico
EP3988113A1 (en) 2015-06-19 2022-04-27 OPKO Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US10696725B2 (en) 2015-06-30 2020-06-30 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Glucagon derivative and a composition comprising a long acting conjugate of the same
AR105284A1 (es) 2015-07-10 2017-09-20 Sanofi Sa Derivados de exendina-4 como agonistas peptídicos duales específicos de los receptores de glp-1 / glucagón
UY36870A (es) 2015-08-28 2017-03-31 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Análogos de insulina novedosos
EP3341025A4 (en) * 2015-09-24 2019-05-01 Hanmi Pharm. Co., Ltd. PROTEIN COMPLEX BY USING A SPECIFIC ROLE OF AN IMMUNOMOBILIN FRAGMENT FOR LINKING
MX2018008027A (es) 2015-12-31 2018-11-29 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Activador triple que activa receptor de glucagon, glp-1 y gip.
CA3029518A1 (en) * 2016-06-29 2018-01-04 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Glucagon derivative, conjugate thereof, composition comprising same, and therapeutic use thereof
BR112019000610A2 (pt) 2016-07-11 2019-07-02 Opko Biologics Ltd fator vii de coagulação de longa ação e métodos de produção do mesmo
JP7158378B2 (ja) 2016-09-23 2022-10-21 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド インスリン受容体との結合力が減少された、インスリンアナログ及びその用途
JOP20190095A1 (ar) * 2016-10-27 2019-04-28 Janssen Pharmaceutica Nv مركبات ببتيد تيروسين-تيروسين الحلقية كمعدلات لمستقبلات الببتيد العصبي y
AR110299A1 (es) 2016-12-02 2019-03-13 Sanofi Sa Conjugados que comprenden un agonista dual de glp-1 / glucagón, un conector y ácido hialurónico
CN108299553B (zh) * 2017-01-13 2021-07-16 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 胃泌酸调节素修饰物
AU2018215840A1 (en) 2017-02-03 2019-08-01 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Long-Acting Conjugate Of A Physiologically Active Material And Use Thereof
US11752216B2 (en) 2017-03-23 2023-09-12 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analog complex with reduced affinity for insulin receptor and use thereof
CN116854804A (zh) 2017-08-16 2023-10-10 东亚St株式会社 酰化胃泌酸调节素肽类似物
WO2019035672A1 (ko) 2017-08-16 2019-02-21 동아에스티 주식회사 아실화 옥신토모듈린 펩타이드 유사체
WO2019171352A2 (en) * 2018-03-08 2019-09-12 Janssen Pharmaceutica Nv Methods of treating severe non-diabetic obesity
UY38249A (es) 2018-05-30 2019-12-31 Sanofi Sa Productos conjugados que comprenden un agonista del receptor triple de glp-1/glucagón/gip, un conector y ácido hialurónico
KR20200135618A (ko) * 2019-05-23 2020-12-03 ㈜ 디앤디파마텍 폴리펩티드를 포함하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
US20210317178A1 (en) * 2018-07-19 2021-10-14 D&D Pharmatech Inc. Pharmaceutical composition comprising polypeptide
CN110964116A (zh) * 2018-09-26 2020-04-07 北京辅仁瑞辉生物医药研究院有限公司 GLP1-Fc融合蛋白及其缀合物
WO2020128967A2 (en) * 2018-12-19 2020-06-25 Janssen Pharmaceutica Nv Methods of treating severe non-diabetic obesity
CN114853908B (zh) * 2019-05-16 2024-06-07 浙江道尔生物科技有限公司 一种治疗代谢疾病的融合蛋白
AU2021276071A1 (en) * 2020-05-22 2023-02-02 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Liquid formulation

Family Cites Families (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
EP1952820A3 (en) 1998-03-06 2012-06-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Protein-free G-CSF formulations
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6677136B2 (en) 2000-05-03 2004-01-13 Amgen Inc. Glucagon antagonists
GB0121709D0 (en) * 2001-09-07 2001-10-31 Imp College Innovations Ltd Food inhibition agent
US7217845B2 (en) * 2002-11-25 2007-05-15 Sun Bio, Inc. Bifunctional polyethylene glycol derivatives
GB0300571D0 (en) 2003-01-10 2003-02-12 Imp College Innovations Ltd Modification of feeding behaviour
CA2513213C (en) 2003-01-22 2013-07-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US7772188B2 (en) * 2003-01-28 2010-08-10 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
WO2005035761A1 (en) 2003-10-16 2005-04-21 Compugen Ltd. Splice variants of preproglucagon, glucagon-like peptide-1 and oxyntomodulin
US8263084B2 (en) 2003-11-13 2012-09-11 Hanmi Science Co., Ltd Pharmaceutical composition for treating obesity-related disease comprising insulinotropic peptide conjugate
ATE522548T1 (de) * 2003-11-13 2011-09-15 Hanmi Holdings Co Ltd Verfahren zur massenproduktion der konstanten region von immunglobulin
US20090238838A1 (en) 2003-11-13 2009-09-24 Hanmi Pharm. Ind. Co. Ltd. Insulinotropic peptide conjugate using an immunoglobulin fc
KR101135244B1 (ko) * 2007-11-29 2012-04-24 한미사이언스 주식회사 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 비만 관련질환 치료용 조성물
US20090214534A1 (en) 2004-12-02 2009-08-27 Steve Holmes Bispecific Domain Antibodies Targeting Serum Albumin And GLP-1 Or PYY
AU2006213607A1 (en) 2005-02-11 2006-08-17 Amylin Pharmaceuticals, Llc GIP analog and hybrid polypeptides with selectable properties
EA013121B1 (ru) * 2005-03-31 2010-02-26 Амилин Фармасьютикалз, Инк. Амилин и агонисты амилина для лечения психиатрических заболеваний и расстройств
KR100754667B1 (ko) 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
GB0511986D0 (en) 2005-06-13 2005-07-20 Imp College Innovations Ltd Novel compounds and their effects on feeding behaviour
KR101349808B1 (ko) 2005-06-13 2014-02-13 임페리얼 이노베이션스 리미티드 섭취행동에 관한 신규 화합물들 및 이들의 효능
AU2006279680B2 (en) 2005-08-11 2012-12-06 Amylin Pharmaceuticals, Llc Hybrid polypeptides with selectable properties
WO2007030375A2 (en) 2005-09-08 2007-03-15 Children's Hospital Medical Center Lysosomal acid lipase therapy for nafld and related diseases
CN101389648B (zh) 2006-02-22 2013-07-17 默沙东公司 肽胃泌酸调节素衍生物
AU2007258609B2 (en) 2006-06-07 2013-01-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
KR100880509B1 (ko) 2006-10-16 2009-01-28 한미약품 주식회사 재조합 단백질의 대량 생산을 위한 신규한 벡터, 발현세포주 및 이를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법
GB0624868D0 (en) 2006-12-13 2007-01-24 Imp Innovations Ltd Novel compounds and their effects on feeding behaviour
TWI428346B (zh) 2006-12-13 2014-03-01 Imp Innovations Ltd 新穎化合物及其等對進食行為影響
JP2008169195A (ja) 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
US20090098130A1 (en) 2007-01-05 2009-04-16 Bradshaw Curt W Glucagon-like protein-1 receptor (glp-1r) agonist compounds
EP2111414B1 (en) 2007-02-15 2014-07-02 Indiana University Research and Technology Corporation Glucagon/glp-1 receptor co-agonists
EA201070121A1 (ru) 2007-07-10 2010-06-30 Эли Лилли Энд Компани Лекарственная форма, содержащая слитый белок glp-1-fc
KR101545181B1 (ko) 2007-07-27 2015-08-21 바이엘 크롭사이언스 아게 삼원 활성 화합물의 배합물
RU2010113997A (ru) 2007-09-11 2011-10-20 Мондобайотек Лабораториз Аг (Li) Тиролиберин для терапевтического применения
WO2009058734A1 (en) 2007-10-30 2009-05-07 Indiana University Research And Technology Corporation Compounds exhibiting glucagon antagonist and glp-1 agonist activity
WO2009099763A1 (en) 2008-01-30 2009-08-13 Indiana University Research And Technology Corporation Ester-based peptide prodrugs
KR20110039230A (ko) 2008-06-17 2011-04-15 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 생리학적 ｐＨ 완충액에서 강화된 용해도 및 안정성을 나타내는 글루카곤 유사체
EA019203B9 (ru) 2008-06-17 2014-03-31 Индиана Юниверсити Рисерч Энд Текнолоджи Корпорейшн Коагонисты глюкагонового рецептора/glp-1-рецептора
WO2010013012A2 (en) 2008-08-01 2010-02-04 Lund University Bioscience Ab Novel polypeptides and uses thereof
WO2010033207A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Nektar Therapeutics Polymer conjugates of therapeutic peptides
EP2344200A2 (en) 2008-09-19 2011-07-20 Nektar Therapeutics Modified therapeutics peptides, methods of their preparation and use
EP2370461B1 (en) 2008-12-15 2013-10-02 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
TWI489992B (zh) * 2008-12-19 2015-07-01 印地安那大學研究及技術公司 醯胺系胰高血糖素超級家族之胜肽前驅藥物
WO2010091122A1 (en) 2009-02-03 2010-08-12 Amunix, Inc. Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
WO2010096052A1 (en) 2009-02-19 2010-08-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Oxyntomodulin analogs
BRPI1013626B8 (pt) * 2009-03-20 2021-05-25 Hanmi Holdings Co Ltd método para preparar conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo em sítio específico
WO2010108153A2 (en) 2009-03-20 2010-09-23 Amgen Inc. Carrier immunoglobulins and uses thereof
MX2011013625A (es) 2009-06-16 2012-01-20 Univ Indiana Res & Tech Corp Compuestos glucagon activo de receptor de gip.
AU2010272944B2 (en) * 2009-07-13 2015-11-19 Zealand Pharma A/S Acylated glucagon analogues
EP2496249B1 (en) 2009-11-03 2016-03-09 Amylin Pharmaceuticals, LLC Glp-1 receptor agonist for use in treating obstructive sleep apnea
US20120269830A1 (en) 2009-12-07 2012-10-25 Lawrence Horowitz Conjugates with improved pharmacokinetic properties
EP2512503A4 (en) 2009-12-18 2013-08-21 Univ Indiana Res & Tech Corp COAGONISTS OF GLUCAGON / GLP-1 RECEPTOR
AR079345A1 (es) 2009-12-22 2012-01-18 Lilly Co Eli Analogo peptidico de oxintomodulina
AR079344A1 (es) 2009-12-22 2012-01-18 Lilly Co Eli Analogo peptidico de oxintomodulina, composicion farmaceutica que lo comprende y uso para preparar un medicamento util para tratar diabetes no insulinodependiente y/u obesidad
EP2552950A1 (en) 2010-03-26 2013-02-06 Novo Nordisk A/S Novel glucagon analogues
EP2568993A4 (en) 2010-05-13 2014-02-19 Univ Indiana Res & Tech Corp GLUCAGON SUPERFAMILY PEPTIDES EXPRESSING G PROTEIN-COUPLED RECEPTOR ACTIVITY
WO2011163012A2 (en) 2010-06-24 2011-12-29 Indiana University Research And Technology Corporation Amide based glucagon superfamily peptide prodrugs
KR101337797B1 (ko) 2010-07-14 2013-12-06 한미사이언스 주식회사 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 액상 제제
KR101382593B1 (ko) 2010-07-21 2014-04-10 한미사이언스 주식회사 신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물
JP5282146B2 (ja) 2010-09-06 2013-09-04 パナソニック株式会社 表示装置及びその制御方法
CN101974077A (zh) 2010-09-15 2011-02-16 南京瑞年天平医药科技有限公司 一种新颖的多肽化合物
KR101303388B1 (ko) 2010-10-26 2013-09-03 한미사이언스 주식회사 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제
KR101767570B1 (ko) 2010-10-26 2017-08-14 한미사이언스 주식회사 항 비만 펩타이드의 지속형 결합체
CN102010473A (zh) 2010-11-10 2011-04-13 曹鹏 重组胃泌酸调节素融合蛋白及其制备和应用
AR084558A1 (es) 2010-12-22 2013-05-22 Marcadia Biotech Metodos para tratar trastornos metabolicos y obesidad con peptidos basados en glucagon activos para el receptor de peptido insulinotropico dependiente de glucosa (gip)/peptido-1 similar al glucagon (glp-1)
JP6118500B2 (ja) 2011-02-28 2017-04-19 ローム アンド ハース エレクトロニック マテリアルズ エルエルシーＲｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ＬＬＣ フォトレジスト組成物、およびフォトリソグラフィパターンを形成する方法
KR101161526B1 (ko) 2011-05-16 2012-07-02 숭실대학교산학협력단 연료전지용 촉매전극을 위한 코어/쉘 구조의 나노 지지체 및 그 제조방법
SG195258A1 (en) 2011-06-10 2013-12-30 Hanmi Science Co Ltd Novel oxyntomodulin derivatives and pharmaceutical composition for treating obesity comprising the same
PE20181268A1 (es) 2011-06-17 2018-08-03 Hanmi Science Co Ltd Un conjugado que comprende oxintomodulina y un fragmento de inmunoglobulina, y el uso del mismo
MX2013015168A (es) 2011-06-22 2014-03-31 Univ Indiana Res & Tech Corp Co-agonista del receptor de glucagon/glp-1.
KR101665009B1 (ko) 2012-03-09 2016-10-11 한미사이언스 주식회사 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2013157002A1 (en) 2012-04-19 2013-10-24 Prolor Biotech Inc. Long-acting oxyntomodulin variants and methods of producing same
JP6311708B2 (ja) 2012-06-21 2018-04-18 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｇｉｐ受容体活性を示すグルカゴンアナローグ
KR101968344B1 (ko) 2012-07-25 2019-04-12 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 고지혈증 치료용 조성물
KR101373563B1 (ko) 2012-07-25 2014-03-12 전북대학교산학협력단 Ｔｏｆ-ｍｒａ를 이용한 혈류특성 및 ｍｒ-신호강도구배(전단율) 유도방법
AR092873A1 (es) 2012-09-26 2015-05-06 Cadila Healthcare Ltd Peptidos como agonistas triples de los receptores de gip, glp-1 y glugagon
AR093387A1 (es) 2012-11-06 2015-06-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de un conjugado de proteina que comprende oxintomodulina y un fragmento de inmunoglobulina
KR101993393B1 (ko) 2012-11-06 2019-10-01 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 당뇨병 또는 비만성 당뇨병 치료용 조성물
JP6137046B2 (ja) 2014-05-09 2017-05-31 信越化学工業株式会社 単量体、高分子化合物、レジスト材料及びパターン形成方法
TWI802396B (zh) 2014-09-16 2023-05-11 南韓商韓美藥品股份有限公司 長效glp-1/高血糖素受體雙促效劑治療非酒精性脂肝疾病之用途
WO2019171352A2 (en) 2018-03-08 2019-09-12 Janssen Pharmaceutica Nv Methods of treating severe non-diabetic obesity

Also Published As

Publication number Publication date
EP2721062B1 (en) 2018-11-14
NZ618811A (en) 2016-05-27
SI2721062T1 (sl) 2019-03-29
ES2710356T3 (es) 2019-04-24
CL2013003619A1 (es) 2014-05-30
ES2882520T3 (es) 2021-12-02
EP2721062A4 (en) 2014-11-12
HRP20190265T1 (hr) 2019-04-05
CA2838504C (en) 2020-07-21
WO2012173422A9 (en) 2013-03-14
US20170340753A1 (en) 2017-11-30
US20190321485A1 (en) 2019-10-24
CN109306015A (zh) 2019-02-05
NZ718999A (en) 2017-07-28
BR112013032375A2 (pt) 2016-11-22
RU2016147505A3 (ko) 2020-04-08
IL257928B (en) 2020-02-27
AU2018282298B2 (en) 2020-06-18
TW201305195A (zh) 2013-02-01
SG195275A1 (en) 2013-12-30
EP3502129A1 (en) 2019-06-26
PE20230404A1 (es) 2023-03-07
IL257928A (en) 2018-06-28
US10363320B2 (en) 2019-07-30
IL272345A (en) 2020-03-31
EP2721062A1 (en) 2014-04-23
CN109306015B (zh) 2022-04-26
PH12018501119A1 (en) 2019-02-04
PE20141178A1 (es) 2014-09-12
JP2014518209A (ja) 2014-07-28
CN103732616B (zh) 2018-08-17
AU2012270366A1 (en) 2014-01-16
IL229759A (en) 2017-08-31
SG10201605006XA (en) 2016-08-30
TR201901402T4 (tr) 2019-02-21
KR20120139579A (ko) 2012-12-27
DK2721062T3 (en) 2019-02-25
ZA201309013B (en) 2014-11-26
US11872283B2 (en) 2024-01-16
RU2013153198A (ru) 2015-07-27
AU2017202672A1 (en) 2017-05-11
NZ742400A (en) 2021-05-28
IL245556B (en) 2018-03-29
PE20181268A1 (es) 2018-08-03
AU2012270366C1 (en) 2017-07-13
KR101591411B1 (ko) 2016-02-05
RU2733544C2 (ru) 2020-10-05
AU2017202672B2 (en) 2019-01-17
CN103732616A (zh) 2014-04-16
UA114709C2 (uk) 2017-07-25
EP3502129B1 (en) 2021-04-07
PT2721062T (pt) 2019-02-12
US9731031B2 (en) 2017-08-15
TWI519541B (zh) 2016-02-01
TW201506037A (zh) 2015-02-16
MX353402B (es) 2018-01-11
NZ733478A (en) 2020-06-26
WO2012173422A1 (en) 2012-12-20
AR125914A2 (es) 2023-08-23
RS58606B1 (sr) 2019-05-31
TWI601744B (zh) 2017-10-11
JP6038905B2 (ja) 2016-12-07
MX2013014779A (es) 2014-06-23
JP6345216B2 (ja) 2018-06-20
LT2721062T (lt) 2019-02-11
AR086969A1 (es) 2014-02-05
AU2018282298A1 (en) 2019-01-17
RU2016147505A (ru) 2018-10-24
UA125895C2 (uk) 2022-07-06
BR112013032375B1 (pt) 2022-09-20
PL2721062T3 (pl) 2019-05-31
IL229759A0 (en) 2014-01-30
CA2838504A1 (en) 2012-12-20
KR20140133493A (ko) 2014-11-19
CA3080189A1 (en) 2012-12-20
DK3502129T3 (da) 2021-07-12
US20140212440A1 (en) 2014-07-31
CY1121255T1 (el) 2020-05-29
JP2017071609A (ja) 2017-04-13
HUE042585T2 (hu) 2019-07-29
IL245556A0 (en) 2016-06-30
IL272345B (en) 2021-01-31
RU2607365C2 (ru) 2017-01-10
MY164680A (en) 2018-01-30
AU2012270366B2 (en) 2017-02-02
CA3080189C (en) 2023-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101577734B1 (ko) 옥신토모듈린과 면역글로불린 단편을 포함하는 결합체 및 그의 용도
KR102395855B1 (ko) 신규 글루카곤 유도체 및 이의 지속형 결합체를 포함하는 조성물
JP7399212B2 (ja) グルカゴン誘導体、その結合体、及びそれを含む組成物、並びにその治療的用途
AU2013342324B2 (en) A composition for treating diabetes or diabesity comprising oxyntomodulin analog
KR101968344B1 (ko) 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 고지혈증 치료용 조성물
KR101767570B1 (ko) 항 비만 펩타이드의 지속형 결합체
NZ742400B2 (en) A conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
A107 Divisional application of patent
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180927

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190924

Year of fee payment: 5