BR112013032375B1 - Conjugado, composição farmacêutica e uso dos mesmos - Google Patents

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Abstract

CONJUGADO COMPREENDENDO OXINTOMODULINA E UM FRAGMENTO DE IMUNOGLOBULINA, E SEUS USOS. A presente invenção se refere a um conjugado compreendendo oxintomodulina, uma região Fc de imunoglobulina, e um polímero não peptídico em que o conjugado pode ser obtido por ligação covalente da oxintomodulina com a região Fc de imunoglobulina via polímero não peptídico, e uma composição farmacêutica para a prevenção ou tratamento de obesidade compreendendo os conjugados. O conjugado compreendendo a oxintomodulina e a Fc de imunoglobulina da presente invenção reduz a absorção de alimento, suprime o esvaziamento gástrico, e facilita a lipólise sem efeitos colaterais, ao contrário da oxintomodulina nativa, e também mostra excelentes efeitos de ativação de receptores e sustentabilidade a longo prazo, em comparação com a oxintomodulina nativa. Deste modo, pode ser amplamente utilizado no tratamento da obesidade com segurança e eficácia.

Description

Descrição Campo Técnico
[001] A presente invenção se refere a um conjugado compreendendo oxintomodulina e um fragmento de imunoglobulina, e seus usos. Mais particularmente, a presente invenção se refere a um conjugado compreendendo oxintomodulina, uma região Fc de imunoglobulina, e um polímero não peptídico em que o conjugado sendo capaz de ser obtido por ligação covalente da oxintomodulina com a região Fc de imunoglobulina via polímero não peptídico, e uma composição farmacêutica para a prevenção ou tratamento de obesidade compreendendo o conjugado.
Antecedentes do Estado da Técnica
[002] Recentemente, o crescimento econômico e as mudanças no estilo de vida estão levando a mudanças nos hábitos alimentares. As principais causas do aumento das taxas de sobrepeso e obesidade nas pessoas contemporâneas são o consumo de alimentos de alto teor calórico, tais como fast foods e a falta de exercício. A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que mais que mil milhões de pessoas em todo o mundo estão acima do peso e pelo menos 300 milhões deles estão clinicamente obesos. Em particular, 250.000 pessoas morrem a cada ano na Europa e mais de 2,5 milhões de pessoas em todo o mundo morrem a cada ano como um resultado de apresentarem excesso de peso (Organização Mundial de Saúde, Estratégia Global para Alimentação, Atividade Física e Saúde, 2004).
[003] O excesso de peso e a obesidade aumenta a pressão arterial e os níveis de colesterol causando a ocorrência ou a exacerbação de várias doenças, tais como doença cardiovascular, diabetes, e artrite, e também são as principais causas do aumento das taxas de incidência de arteriosclerose, hipertensão, hiperlipidemia ou doença cardiovascular em crianças ou adolescentes bem como em adultos.
[004] Obesidade é uma condição severa que causa várias doenças em todo o mundo. Pensa-se ser superado através de esforços individuais, e também se acredita que falta autocontrole aos pacientes obesos. Entretanto, é difícil tratar a obesidade, porque a obesidade é uma doença complexa envolvendo regulação de apetite e metabolismo de energia. Para o tratamento da obesidade, ações anormais associadas com a regulação de apetite e o metabolismo de energia devem ser tratados junto com os esforços dos pacientes obesos. Muitas tentativas foram feitas para desenvolver drogas capazes de tratar as ações anormais. Como o resultado destes esforços, drogas tais como Rimonabant (Sanofi-Aventis), Sibutramin (Abbott), Contrave (Takeda), e Orlistat (Roche) foram desenvolvidas, mas elas têm as desvantagens de sérios efeitos adversos ou efeitos antiobesidade muito fracos. Por exemplo, foi relatado que o Rimonabant (Sanofi-Aventis) mostra um efeito colateral de doença do sistema nervo central, Sibutramine (Abbott) e Contrave (Takeda) mostram efeitos colaterais cardiovasculares, e o Orlistat (Roche) mostra só 4 kg de perda de peso quando tomado por 1 ano. Infelizmente, não existem agentes terapêuticos para obesidade que possam ser prescritos de forma segura para pacientes obesos.
[005] Muitos estudos foram feitos para desenvolver agentes terapêuticos para obesidade que não tenham os problemas das drogas antiobesidade convencionais. Recentemente, derivados do glucagon têm recebido muita atenção. O glucagon é produzido pelo pâncreas quando o nível de glicose no sangue cai devido a outros medicamentos ou doenças, deficiências de hormônio ou enzimas. O glucagon estimula a quebra de glicogênio no fígado, e facilita a liberação de glicose para elevar os níveis de glicose no sangue a uma faixa normal. Adicionalmente ao efeito do aumento do nível de glicose no sangue, glucagon suprime o apetite e ativa a lipase sensível a hormônio (HSL) de adipócitos para facilitar a lipólise, mostrando assim os efeitos antiobesidade. Um dos derivados do glucagon, peptídeo 1 semelhante glucagon (GLP-1) está em desenvolvimento como um agente terapêutico para hiperglicemia em pacientes com diabetes, e funciona para estimular a síntese e secreção de insulina, para inibir a secreção de glucagon, para retardar o esvaziamento gástrico, para aumentar a utilização de glicose, e para inibir a ingestão de alimentos. A exendina-4 é isolada do veneno do lagarto que compartilha aproximadamente 50% de homologia de aminoácidos com GLP-1 e também é relatado que ativa o receptor de GLP-1, melhorando assim a hiperglicemia em pacientes com diabetes. Entretanto, drogas antiobesidade incluindo GLP-1 são relatadas em mostrar efeitos colaterais tais como vômitos e náuseas.
[006] Como uma alternativa ao GLP-1, portanto, muita atenção tem sido focada em oxintomodulina, um peptídeo derivado de um precursor de glucagon, pré-glucagon, que se liga aos receptores dos dois peptídeos, GLP-1 e glucagon. Oxintomodulina representa uma potente terapia antiobesidade, porque inibe a absorção de alimento como GLP-1, promove a saciedade, e tem uma atividade lipolítica como glucagon.
[007] Com base na dupla função do peptídeo oxintomodulina, foi ativamente estudado como uma droga para o tratamento da obesidade. Por exemplo, a patente coreana No. 925017 revela uma composição farmacêutica incluindo a oxintomodulina como um ingrediente ativo para o tratamento de humanos acima do peso, que é administrado por uma via oral, parenteral, mucosa, retal, subcutânea, ou transdérmica. Entretanto, foi relatado que esta droga antiobesidade incluindo oxintomodulina tem uma meia-vida curta in vivo e fraca eficácia terapêutica, mesmo que administrado em dose elevada três vezes por dia. Deste modo, muitos esforços foram feitos para melhorar a meia-vida in vivo ou efeito terapêutico da oxintomodulina na obesidade pela sua modificação.
[008] Por exemplo, uma oxintomodulina agonista dupla (Merck) é preparada substituindo L-serina com D-serina na posição 2 da oxintomodulina para aumentar a resistência a dipeptidil peptidase-IV (DPP-IV) e anexando uma porção de colesterol no C-terminal para aumentar a meia-vida no sangue ao mesmo tempo. ZP2929 (Zealand) é preparado substituindo L-serina com D-serina na posição 2 uma resistência melhorada a DPP-IV, substituindo arginina com alanina na posição 17 para melhorar a resistência a protease, substituindo metionina com lisina na posição 27 para melhorar estabilidade oxidativa, e substituindo glutamina com ácido aspártico e alanina nas posições 20 e 24 e asparagina com serina na posição 28 para melhorar estabilidade de desaminação. Entretanto, mesmo que a meia-vida da oxintomodulina agonista dupla (Merck) foi melhorada para mostrar uma meia-vida 8~12 minutos mais longa que a oxintomodulina nativa, ainda tem uma meia-vida muito curta in vivo de 1,7 h e a sua dose de administração também é tão alta quanto vários mg/kg. Infelizmente, oxintomodulina ou seus derivados têm as desvantagens de administração diária de uma dose elevada devido a meia-vida curta e baixa eficácia.
Divulgação Problema Técnico
[009] Consequentemente, os presentes inventores fizeram muitos esforços para desenvolver um método para aumentar a meia-vida no sangue da oxintomodulina enquanto mantém sua atividade in vivo. Como resultado, eles encontraram que um conjugado preparado ligando um carreador a oxintomodulina usando um polímero não peptídico mostra melhorada meia-vida no sangue, enquanto mantém a atividade in vivo de modo a exibir excelentes efeitos antiobesidade, assim completando a presente invenção.
Solução Técnica
[0010] Um objetivo da presente invenção é fornecer um conjugado compreendendo oxintomodulina, uma região Fc de imunoglobulina, e polímero não peptídico em que o conjugado sendo capaz de ser obtido por ligação covalente da oxintomodulina com a região Fc de imunoglobulina via polímero não peptídico.
[0011] Um outro objetivo da presente invenção é fornecer uma composição farmacêutica para a prevenção ou tratamento de obesidade, compreendendo os conjugados.
[0012] Ainda um outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para prevenção ou tratamento da obesidade, compreendendo a etapa de administração do conjugado ou da composição em um indivíduo.
[0013] Ainda um outro objetivo da presente invenção é fornecer o uso do conjugado ou da composição na preparação de fármacos para a prevenção ou tratamento de obesidade.
Efeitos Vantajosos
[0014] O conjugado compreendendo a oxintomodulina e a imunoglobulina Fc da presente invenção reduz a absorção de alimento, suprime o esvaziamento gástrico, e facilita a lipólise sem efeitos colaterais, ao contrário da oxintomodulina nativa, e também mostra os excelentes efeitos de ativação de receptores e sustentabilidade a longo prazo, em comparação com a oxintomodulina. Deste modo, pode ser amplamente utilizado no tratamento da obesidade com segurança e eficácia. Ao contrário da oxintomodulina nativa, o novo peptídeo da presente invenção reduz a absorção de alimento, suprime o esvaziamento gástrico, e facilita a lipólise sem efeitos colaterais, e também mostra os excelentes efeitos de ativação de receptores. Deste modo, pode ser amplamente utilizado no tratamento da obesidade com segurança e eficácia.
Descrição dos Desenhos
[0015] FIG. 1 é um gráfico mostrando mudanças na absorção de alimento de acordo com a dose de administração da oxintomodulina ou o derivado de oxintomodulina.
[0016] FIG. 2a é um gráfico mostrando o resultado da purificação da oxintomodulina monoPEGuilada através de uma coluna de purificação SOURCE S.
[0017] FIG. 2b é um gráfico mostrando o resultado do mapeamento de peptídeo de oxintomodulina monoPEGuilada purificada.
[0018] FIG. 2c é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo a oxintomodulina e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação SOURCE 15Q.
[0019] FIG. 3a é um gráfico mostrando o resultado da purificação de um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 29) através de uma coluna de purificação SOURCE S.
[0020] FIG. 3b é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 29) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação SOURCE 15Q.
[0021] FIG. 4a é um gráfico mostrando o resultado da purificação de um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 30) através de uma coluna de purificação SOURCE S.
[0022] FIG. 4b é um gráfico mostrando o resultado do mapeamento de peptídeo um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 30) purificado.
[0023] FIG. 4c é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 30) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação SOURCE 15Q.
[0024] FIG. 5a é um gráfico mostrando o resultado da purificação de um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 31) através de uma coluna de purificação SOURCE S.
[0025] FIG. 5b é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 31) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação SOURCE 15Q.
[0026] FIG. 6a é um gráfico mostrando o resultado da purificação de um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 2) através de uma coluna de purificação SOURCE S.
[0027] FIG. 6b é um gráfico mostrando o resultado do mapeamento de peptídeo um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 2) purificado.
[0028] FIG. 6c é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 2) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação SOURCE 15Q.
[0029] FIG. 6d é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 2) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação SOURCE ISO.
[0030] FIG. 7a é um gráfico mostrando o resultado da purificação de um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 3) através de uma coluna de purificação SOURCE S.
[0031] FIG. 7b é um gráfico mostrando o resultado do mapeamento de peptídeo um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 3) purificado.
[0032] FIG. 7c é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 3) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação Butil FF.
[0033] FIG. 7d é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 3) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação Source 15Q.
[0034] FIG. 8a é um gráfico mostrando o resultado da purificação de um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 23) através de uma coluna de purificação SOURCE S;
[0035] FIG. 8b é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 23) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação Source 15Q;
[0036] FIG. 8c é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 23) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação SOURCE ISO;
[0037] FIG. 9a é um gráfico mostrando o resultado da purificação de um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 24) através de uma coluna de purificação SOURCE S;
[0038] FIG. 9b é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 24) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação Source 15Q;
[0039] FIG. 9c é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 24) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação SOURCE ISO;
[0040] FIG. 10a é um gráfico mostrando o resultado da purificação de um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 25) através de uma coluna de purificação SOURCE S;
[0041] FIG. 10b é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 25) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação Source 15Q;
[0042] FIG. 10c é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 25) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação SOURCE ISO;
[0043] FIG. 11a é um gráfico mostrando o resultado da purificação de um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 28) através de uma coluna de purificação SOURCE S;
[0044] FIG. 11b é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 28) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação Source 15Q;
[0045] FIG. 11c é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 28) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação SOURCE ISO;
[0046] FIG. 12 é um gráfico mostrando mudanças em peso corporal de camundongos de acordo com o tipo e dose de administração do derivado de oxintomodulina-conjugados de imunoglobulina Fc.
[0047] FIG. 13 é um gráfico mostrando mudanças em peso corporal de camundongos de acordo com o tipo e dose de administração do derivado de oxintomodulina-conjugados de imunoglobulina Fc.
Melhor Modo
[0048] Em um aspecto para alcançar os objetivos acima, a presente invenção fornece um conjugado compreendendo oxintomodulina, uma região Fc de imunoglobulina, e polímero não peptídico em que o conjugado sendo capaz de ser obtido por ligação covalente da oxintomodulina com a região Fc de imunoglobulina via polímero não peptídico.
[0049] Como usado no presente documento, o termo "conjugado" significa um conjugado compreendendo oxintomodulina e outros fatores. Outros fatores pode ser qualquer substância que possa induzir o aumento da estabilidade no sangue, suspender a emissão através do rim, ou outros efeitos úteis. Na presente invenção, os fatores podem ser a região Fc de imunoglobulina. De preferência, o conjugado pode ser compreendido de uma oxintomodulina, e uma região Fc de imunoglobulina, que são ligadas por um polímero não peptídico. O polímero não peptídico pode ligar uma oxintomodulina e uma região Fc de imunoglobulina via ligação covalente. Duas extremidades terminais do polímero não peptídico podem ser ligadas a um grupo amina ou um grupo tiol da região Fc de imunoglobulina e derivados de oxintomodulina, respectivamente.
[0050] O conjugado da presente invenção significa tem uma melhor duração in vivo da eficácia, em comparação com a oxintomodulina nativa, e o conjugado de ação prolongada pode incluir oxintomodulina preparada modificando, substituindo, adicionando, ou deletando as sequências de aminoácidos da oxintomodulina nativa, oxintomodulina conjugada a um polímero biodegradável tal como polietilenoglicol (PEG), oxintomodulina conjugada a uma proteína de ação prolongada tal como albumina ou imunoglobulina, oxintomodulina conjugada a ácido graxo tendo a capacidade de se ligar a albumina no corpo, ou oxintomodulina encapsulada em nanopartículas biodegradáveis, mas o tipo do conjugado de ação prolongada não está limitado a ele.
[0051] Como usado no presente documento, o termo "oxintomodulina" significa um peptídeo derivado de um precursor de glucagon, pré-glucagon, e inclui a oxintomodulina nativa, precursores, derivados, seus fragmentos, e suas variantes. De preferência, pode ter a sequência de aminoácido de SEQ ID NO. 1 (HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA).
[0052] O termo “variante de oxintomodulina” é um peptídeo tendo uma ou mais sequências de aminoácidos diferentes daqueles da oxintomodulina nativa, e significa um peptídeo que retém a função de ativar os receptores GLP-1 e glucagon, e que pode ser preparado por qualquer substituição, adição, deleção, e modificação ou por uma combinação dos mesmos em uma parte das sequências de aminoácidos da oxintomodulina nativa.
[0053] O termo "derivado de oxintomodulina" inclui peptídeos, derivados de peptídeos ou miméticos peptídeos que são preparados pela adição, deleção ou substituição de aminoácidos da oxintomodulina de modo a ativar ambos o receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon em um nível alto, em comparação com a oxintomodulina nativa.
[0054] O termo "fragmento de oxintomodulina" significa um fragmento tendo um ou mais aminoácidos adicionados ou deletados no N-terminal ou no C-terminal da oxintomodulina nativa, em que aminoácidos que não ocorrem naturalmente (por exemplo, aminoácido do tipo D) podem ser adicionados, e têm uma função de ativação ambos o receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon.
[0055] Cada um dos métodos de preparação para as variantes, os derivados, e os fragmentos da oxintomodulina pode ser usado individualmente ou em combinação. Por exemplo, a presente invenção inclui um peptídeo que tem um ou mais aminoácidos diferentes daqueles do peptídeo nativo e desaminação do resíduo de aminoácido N-terminal, e tem uma função de ativação de ambos o receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon.
[0056] Os aminoácidos mencionados no presente documento estão abreviados de acordo com a regra de nomenclatura da IUPAC-IUB do seguinte modo:
Figure img0001
[0057] Na presente invenção, o derivado de oxintomodulina engloba qualquer peptídeo que é preparado por substituições, adições, deleções ou modificações pós translacionais (por exemplo, metilação, acilação, ubiquitinação, ligação covalente intramolecular) na sequência de aminoácidos da oxintomodulina(HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA, SEQ ID NO. 1) de modo a ativar os receptores glucagon e GLP-1 ao mesmo tempo. Mediante substituição ou adição de aminoácidos, qualquer um dos 20 aminoácidos comumente encontrados em proteínas humanas, bem como aminoácidos atípicos ou que não ocorrem naturalmente podem ser usados. Fontes comercialmente disponíveis de aminoácidos atípicos incluem Sigma-Aldrich, ChemPep Inc., e Genzyme Pharmaceuticals. Os peptídeos incluindo estes aminoácidos e sequências peptídicas atípicas podem ser sintetizadas e compradas a fornecedores comerciais, por exemplo, American Peptide Company ou Bachem (EUA) ou Anygen (Coreia).
[0058] Em uma modalidade específica, o derivado de oxintomodulina da presente invenção é um novo peptídeo incluindo o aminoácidos da seguinte Fórmula 1. R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X1 8-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2 (Fórmula 1) em que R1 é histidina, desamino histidil, dimetil-histidil (N-dimetil-histidil), beta-hidroxiimidazopropionil, 4-imidazoacetil, beta-carboxi imidazopropionil ou tirosina; X1 é Aib(ácido aminoisobutírico), d-alanina, glicina, Sar(N-metilglicina), serina, ou d-serina; X2 é ácido glutâmico ou glutamina; X3 é leucina ou tirosina; X4 é serina ou alanina; X5 é lisina ou arginina; X6 é glutamina ou tirosina; X7 é leucina ou metionina; X8 é ácido aspártico ou ácido glutâmico; X9 é ácido glutâmico, serina, alfa-metil-ácido glutâmico ou é deletado; X10 é glutamina, ácido glutâmico, lisina, arginina, serina ou é deletado; X11 é alanina, arginina, valina ou é deletado; X12 é alanina, arginina, serina, valina ou é deletado; X13 é lisina, glutamina, arginina, alfa-metil-ácido glutâmico ou é deletado; X14 é ácido aspártico, ácido glutâmico, leucina ou é deletado; X15 é fenilalanina ou é deletado; X16 é isoleucina, valina ou é deletado; X17 é alanina, cisteína, ácido glutâmico, lisina, glutamina, alfa-metil-ácido glutâmico ou é deletado; X18 é triptofano ou é deletado; X19 é alanina, isoleucina, leucina, serina, valina ou é deletado; X20 é alanina, lisina, metionina, glutamina, arginina ou é deletado; X21 é asparagina ou é deletado; X22 é alanina, glicina, treonina ou é deletado; X23 é cisteína, lisina ou é deletado; X24 é um peptídeo tendo 2 a 10 aminoácidos consistindo de combinações de alanina, glicina e serina, ou é deletado; e R2 é KRNRNNIA (SEQ ID NO. 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO. 36), GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO. 37), HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO. 38), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO. 39), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO. 40) ou é deletado (excluído se a sequência de aminoácidos da Fórmula 1 é idêntica àquela de SEQ ID NO. 1).
[0059] A fim de aumentar a atividade da oxintomodulina tipo selvagem para o receptor de glucagon e o receptor de GLP-1, o peptídeo da presente invenção pode ser substituído com 4-imidazoacetil onde o carbono alfa da histidina na posição 1 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1 é deletado, desamino histidil onde o grupo amino N-terminal é deletado, dimetil-histidil (N-dimetil-histidil) onde o grupo amino N-terminal é modificado com dois grupos metil, beta-hidroxi imidazopropionil onde o grupo amino N-terminal é substituído com um grupo hidroxila, ou beta-carboxi imidazopropionil onde o grupo amino N-terminal é substituído com um grupo carboxila. Além disso, a região de ligação ao receptor de GLP-1 pode ser substituída com aminoácidos que melhoram a ligação hidrofóbica e iônica ou suas combinações. Uma parte da sequência de oxintomodulina pode ser substituída com a sequência de aminoácidos de GLP-1 ou a exendina-4 para melhorar a atividade no receptor de GLP-1.
[0060] Além disso, uma parte da sequência de oxintomodulina pode ser substituída com uma sequência estabilizando a alfa hélice. De preferência, aminoácidos nas posições 10, 14, 16, 20, 24 e 28 da sequência de aminoácidos da Fórmula 1 podem ser substituídos com aminoácidos ou derivados de aminoácidos consistindo de Tyr(4-Me), Phe, Phe(4-Me), Phe(4-Cl), Phe(4-CN), Phe(4-NO2), Phe(4-NH2), Phg, Pal, Nal, Ala(2-tienil) e Ala(benzotienil) que são conhecidos por estabilizar a alfa hélice, e não existem limitações no tipo e número de alfa hélice estabilizando aminoácidos ou derivados de aminoácidos a serem inseridos. De preferência, aminoácidos nas posições 10 e 14, 12 e 16, 16 e 20, 20 e 24, e 24 e 28 podem ser também substituídos com ácido glutâmico ou lisina, respectivamente de modo a formar anéis, e não existem limitações no número de anéis a serem inseridos. Mais preferivelmente, o peptídeo pode ser um peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das seguintes Fórmulas 1 a 6.
[0061] Em uma modalidade específica, o derivado de oxintomodulina da presente invenção é um novo peptídeo incluindo a sequência de aminoácidos da seguinte Fórmula 2 onde a sequência de aminoácidos da oxintomodulina é substituída com aquela da exendina ou GLP-1.
[0062] R1-A-R3 (Fórmula 2)
[0063] Em uma outra modalidade específica, o derivado de oxintomodulina da presente invenção é um novo peptídeo incluindo a sequência de aminoácidos da seguinte Fórmula 3, que é preparado ligando uma parte da sequência de aminoácidos da oxintomodulina e uma parte da sequência de aminoácidos da exendina ou GLP-1 via um ligante de aminoácido apropriado.
[0064] R1-B-C-R4 (Fórmula 3)
[0065] Em ainda uma outra modalidade específica, o derivado de oxintomodulina da presente invenção é um novo peptídeo incluindo a sequência de aminoácidos da seguinte Fórmula 4, em que uma parte da sequência de aminoácidos da oxintomodulina é substituída com um aminoácido capaz de aumentar a afinidade de ligação com o receptor de GLP-1, por exemplo, Leu na posição 26 que se liga com o receptor de GLP-1 por interação hidrofóbica é substituída pelo resíduo hidrofóbico, Ile ou Val.
[0066] R1-SQGTFTSDYSKYLD-D1-D2-D3-D4-D5-LFVQW-D6-D7-N-D8-R3 (Fórmula 4)
[0067] Em ainda uma outra modalidade específica, o derivado de oxintomodulina da presente invenção é um novo peptídeo incluindo a seguinte Fórmula 5, em que uma parte da sequência de aminoácidos é deletada, adicionada, ou substituída com outro aminoácido a fim de aumentar as atividades de oxintomodulina nativa no receptor de GLP-1 e no receptor de glucagon .
[0068] R1-E1-QGTFTSDYSKYLD-E2-E3-RA-E4-E5-FV-E6-WLMNT-E7-R5 (Fórmula 5)
[0069] Nas Fórmulas 2 a 5, R1 é o mesmo que na descrição da Fórmula 1;
[0070] A é selecionado a partir do grupo consistindo de SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT (SEQ ID NO. 41), SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT (SEQ ID NO. 42), SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT (SEQ ID NO. 43), GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO. 44), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO. 45), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA (SEQ ID NO. 46), e SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG (SEQ ID NO. 47);
[0071] B é selecionado a partir do grupo consistindo de SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT (SEQ ID NO. 41), SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT (SEQ ID NO. 42), SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT (SEQ ID NO. 43), GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO. 44), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO. 45), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA (SEQ ID NO. 46), SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG (SEQ ID NO. 47), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEW (SEQ ID NO. 48), e SQGTFTSDYSRYLD (SEQ ID NO. 49);
[0072] C é um peptídeo tendo 2 a 10 aminoácidos consistindo de combinações de alanina, glicina e serina; D1 é serina, ácido glutâmico ou arginina; D2 é arginina, ácido glutâmico ou serina; D3 é arginina, alanina ou valina; D4 é arginina, valina ou serina; D5 é glutamina, arginina ou lisina; D6 é isoleucina, valina ou serina; D7 é metionina, arginina ou glutamina; D8 é treonina, glicina ou alanina; E1 é serina, Aib, Sar, d-alanina ou d-serina; E2 é serina ou ácido glutâmico; E3 é arginina ou lisina; E4 é glutamina ou lisina; E5 é ácido aspártico ou ácido glutâmico; E6 é glutamina, cisteína ou lisina; E7 é cisteína, lisina ou é deletado; R3 é KRNRNNIA (SEQ ID NO. 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO. 36) ou GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO. 37); R4 é HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO. 38), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO. 39) ou HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO. 40); e, R5 é KRNRNNIA (SEQ ID NO. 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO. 36), GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO. 37) ou é deletado (excluído se as sequências de aminoácidos de Fórmulas 2 a 5 são idênticas àquelas de SEQ ID NO. 1).
[0073] De preferência, o derivado de oxintomodulina da presente invenção pode ser um novo peptídeo da seguinte Fórmula 6. R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X1 8-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2 (Fórmula 6) em que R1 é histidina, desamino histidil, 4-imidazoacetil ou tirosina; X1 é Aib(ácido aminoisobutírico), glicina ou serina; X2 é ácido glutâmico ou glutamina; X3 é leucina ou tirosina; X4 é serina ou alanina; X5 é lisina ou arginina; X6 é glutamina ou tirosina; X7 é leucina ou metionina; X8 é ácido aspártico ou ácido glutâmico; X9 é ácido glutâmico, alfa-metil-ácido glutâmico ou é deletado; X10 é glutamina, ácido glutâmico, lisina, arginina ou é deletado; X11 é alanina, arginina ou é deletado; X12 é alanina, valina ou é deletado; X13 é lisina, glutamina, arginina, alfa-metil-ácido glutâmico ou é deletado; X14 é ácido aspártico, ácido glutâmico, leucina ou é deletado; X15 é fenilalanina ou é deletado; X16 é isoleucina, valina ou é deletado; X17 é alanina, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, alfa-metil-ácido glutâmico ou é deletado; X18 é triptofano ou é deletado; X19 é alanina, isoleucina, leucina, valina ou é deletado; X20 é alanina, lisina, metionina, arginina ou é deletado; X21 é asparagina ou é deletado; X22 é treonina ou é deletado; X23 é cisteína, lisina ou é deletado; X24 é um peptídeo tendo 2 a 10 aminoácidos consistindo de glicina ou é deletado; e R2 é KRNRNNIA (SEQ ID NO. 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO. 36), GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO. 37), HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO. 38), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO. 39), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO. 40) ou é deletado (excluído se a sequência de aminoácidos da Fórmula 6 é idêntica àquela de SEQ ID NO. 1)
[0074] Mais preferivelmente, o derivado de oxintomodulina da presente invenção pode ser selecionado a partir do grupo consistindo dos peptídeos de SEQ ID NOs. 2 a 34. Muito mais preferivelmente, o derivado de oxintomodulina da presente invenção pode ser um derivado de oxintomodulina descrito na Tabela 1 do Exemplo 2-1.
[0075] Oxintomodulina tem as atividades de dois peptídeos, GLP-1 e glucagon. GLP-1 diminui a glicose no sangue, reduz a absorção de alimento, e suprime o esvaziamento gástrico, e glucagon aumenta a glicose no sangue, facilitar a lipólise e diminui o peso corporal pelo aumento dos metabolismos de energia. Os diferentes efeitos biológicos dos dois peptídeos podem causar efeitos indesejados, como o aumento da glicose no sangue se o glucagon mostrar um efeito mais dominante que o GLP-1, ou causar náuseas e vômitos se o GLP-1 mostrar um efeito mais dominante que o glucagon. Por exemplo, o conjugado que foi produzido no Exemplo 10 abaixo mostrou maior afinidade com o receptor de GLP-1 que o produzido no Exemplo 12, mas a eficácia do primeiro era menor que do último, como mostrado no experimento in vivo no Exemplo 18. Isto pode ser devido ao aumento da eficácia dos conjugados em relação ao receptor de glucagon no Exemplo 12 apesar da sua baixa eficácia em relação ao receptor de GLP-1. Por isso, os derivados de oxintomodulina e seus conjugados da presente invenção não são limitados aos derivados que mostram para aumento incondicional de atividades. Por exemplo, os aminoácidos podem ser modificado nas posições 1 e 11 da oxintomodulina, que são conhecidas por suprimir a atividade do glucagon, para controlar a razão de atividade entre glucagon e GLP-1.
[0076] Os conjugados da presente invenção podem induzir o aumento da estabilidade no sangue, suspender a emissão através do rim, e mudar a afinidade aos receptores ligando um carreador a oxintomodulina via uma ligação covalente ou formação de microesfera. O carreador que pode formar um conjugado contendo oxintomodulina pode ser selecionado a partir do grupo consistindo de albumina, transferrina, anticorpos, fragmentos de anticorpos, elastina, heparina, polissacarídeos tais como quitina, fibronectina e mais favoravelmente a região Fc de imunoglobulina, todos os quais podem aumentar a meia-vida no sangue dos conjugados quando ligados a oxintomodulina.
[0077] O termo "região Fc de imunoglobulina" como usado no presente documento, se refere a uma proteína que contém a região constante da cadeia pesada 2 (CH2) e a região constante da cadeia pesada 3 (CH3) de uma imunoglobulina, excluindo as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves, a região constante da cadeia pesada 1 (CH1) e a região constante de cadeia leve 1 (CL1) da imunoglobulina. Pode ainda incluir uma região dobradiça na região constante da cadeia pesada. Além disso, a região Fc de imunoglobulina da presente invenção pode conter uma parte ou toda a região Fc incluindo a região constante da cadeia pesada 1 (CH1) e/ou a região constante de cadeia leve 1 (CL1), exceto pelas regiões variáveis das cadeias pesadas e leves, contanto que tenha uma função fisiológica substancialmente semelhante a ou melhor que a proteína nativa. Além disso, a região Fc de imunoglobulina pode ser um fragmento tendo uma deleção em uma porção relativamente longa da sequência de aminoácidos de CH2 e/ou CH3. Isto é, a região Fc de imunoglobulina da presente invenção pode compreender 1) um domínio CH1, um domínio CH2, um domínio CH3 e um domínio CH4, 2) um domínio CH1 e um domínio CH2, 3) um domínio CH1 e um domínio CH3, 4) um domínio CH2 e um domínio CH3, 5) uma combinação de um ou mais domínios e uma região dobradiça da imunoglobulina (ou uma porção da região dobradiça), e 6) um dímero de cada domínio das regiões constantes de cadeia pesada e a região constante de cadeia leve.
[0078] A região Fc de imunoglobulina da presente invenção inclui uma sequência de aminoácidos nativa, e um derivado seu da sequência (mutante). Um derivado da sequência de aminoácidos é uma sequência que é diferente da sequência de aminoácidos nativa devido a uma deleção, uma inserção, uma substituição não conservadora ou conservadora, ou suas combinações de um ou mais resíduos de aminoácidos. Por exemplo, em um IgG Fc, os resíduos de aminoácidos, conhecidos por serem importantes na ligação nas posições 214 a 238, 297 a 299, 318 a 322, ou 327 a 331, podem ser usados como um alvo adequado para a modificação.
[0079] Além disso, outros vários derivados são possíveis, incluindo um em que uma região capaz de formar uma ligação dissulfeto é deletada, ou certos resíduos de aminoácidos são eliminados na extremidade N-terminal de uma forma nativa de Fc ou um resíduo de metionina é adicionado ao mesmo. Além disso, para remover funções efetoras, uma deleção pode ocorrer em um sítio de ligação de complemento, tais como um sítio de ligação C1q e um sítio ADCC (citotoxicidade celular dependente de anticorpo). As técnicas de preparação de tais derivados de sequência da região Fc de imunoglobulina são revelados na WO 97/34631 e na WO 96/32478.
[0080] Trocas de aminoácidos em proteínas e peptídeos, que geralmente não altera a atividade das proteínas ou dos peptídeos, são conhecidas do estado da técnica (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). As trocas que ocorrem mais comumente são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly, em ambas as direções. Além disso, a região Fc, se desejado, pode ser modificada por fosforilação, sulfatação, acrilação, glicosilação, metilação, farnesilação, acetilação, amidação, e afins.
[0081] Os derivados de Fc acima mencionados são derivados que têm uma atividade biológica idêntica à região Fc da presente invenção ou uma estabilidade estrutural melhorada, por exemplo, contra o calor, pH, ou afins.
[0082] Além disso, estas regiões Fc podem ser obtidas a partir das formas nativas isoladas de humanos e outros animais incluindo vacas, cabras, porcos, camundongos, coelhos, hamsters, ratos e porquinhos da índia, ou podem ser recombinantes ou seus derivados, obtidos a partir de células de animais transformadas ou microrganismos. No presente documento, eles podem ser obtidos a partir de uma imunoglobulina nativa isolando as imunoglobulinas inteiras de organismos humanos ou animais e os tratando com uma enzima proteolítica. A papaína digere a imunoglobulina nativa nas regiões Fab e Fc, e o tratamento com pepsina resulta na produção dos fragmentos pF'c e F(ab)2. Estes fragmentos podem ser sujeitos, por exemplo, a cromatografia de exclusão por tamanho para isolar Fc ou pF'c. De preferência, uma região Fc derivada de humano é uma região Fc de imunoglobulina recombinante que é obtida a partir de um microrganismo.
[0083] Além disso, a região Fc de imunoglobulina da presente invenção pode estar sob a forma de ter cadeias de açúcar nativas, cadeias de açúcar aumentadas em comparação com uma forma nativa ou cadeias de açúcar reduzidas em comparação com uma forma nativa, ou pode ser em uma forma desglicosilada. O aumento, a redução ou a remoção das cadeias de açúcar da imunoglobulina Fc pode ser realizadas por métodos comuns do estado da técnica, tais como um método químico, um método enzimático e um método de engenharia genética usando um microrganismo. A remoção das cadeias de açúcar de uma região Fc resulta em uma diminuição acentuada na afinidade de ligação a parte C1q do primeiro componente do complemento C1 e uma diminuição ou perda na citotoxicidade celular dependente de anticorpo ou citotoxicidade dependente de complemento, assim não induzindo respostas imunes in vivo desnecessárias. A este respeito, uma região Fc de imunoglobulina em uma forma desglicosilada ou aglicosilada pode ser mais adequada para o objetivo da presente invenção como um carreador da droga.
[0084] Como usado no presente documento, o termo "deglicosilação" se refere enzimaticamente remover porções de açúcar de uma região Fc, e o termo "aglicosilação" significa que uma região Fc é produzida em uma forma não glicosilada por um procarionte, de preferência E. coli.
[0085] Entretanto, a região Fc de imunoglobulina pode ser derivada de humanos ou outros animais incluindo vacas, cabras, porcos, camundongos, coelhos, hamsters, ratos e porquinhos da índia, e de preferência de humanos.
[0086] Além disso, a região Fc de imunoglobulina pode ser uma região Fc que é derivada de IgG, IgA, IgD, IgE e IgM, ou que é feita por suas combinações ou seus híbridos. De preferência, é derivada de IgG ou IgM, que estão entre as proteínas mais abundantes no sangue humano, e mais preferivelmente de IgG, que é conhecido por aumentar as meias-vidas das proteínas se ligando aos ligantes.
[0087] Por outro lado, o termo "combinação", como usado no presente documento, significa que polipeptídeos codificando as regiões Fc de imunoglobulinas de cadeia simples de mesma origem estão ligados a um polipeptídeo de cadeia simples de uma origem diferente para formar um dímero ou um multímero. Isto é, um dímero ou um multímero pode ser formados de dois ou mais fragmentos selecionados a partir do grupo consistindo de IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc, e fragmentos IgE Fc.
[0088] O termo “polímero não peptídico” se refere um polímero biocompatível incluindo duas ou mais unidade repetitivas ligadas umas as outras por qualquer ligação covalente excluindo uma ligação peptídica. Na presente invenção, o polímero não peptídico pode ser usado de modo intercambiável com o ligante não peptidil.
[0089] O polímero não peptídico útil na presente invenção pode ser selecionado a partir do grupo consistindo de um polímero biodegradável, um polímero de lipídeo, uma quitina, um ácido hialurônico, e uma combinação dos mesmos, e de preferência, o polímero biodegradável pode ser polietilenoglicol, polipropilenoglicol, copolímero etileno glicol-propileno glicol, poliol polioxietilado, álcool polivinílico, polissacarídeo, dextrano, polivinil etil éter, ácido polilático (PLA) ou ácido poliláctico-glicólico (PLGA), e mais preferencialmente é polietilenoglicol (PEG). Além disso, seus derivados conhecidos do estado da técnica e derivados facilmente preparados por um método conhecido do estado da técnica pode ser incluído no escopo da presente invenção.
[0090] O ligante peptídico que é utilizado na proteína de fusão obtida por um método convencional de fusão estrutura interna tem desvantagens na medida em que é facilmente clivado in vivo por uma enzima proteolítica, e deste modo um efeito suficiente de aumento da meia-vida do soro da droga ativa por um carreador não pode ser obtido como esperado. Entretanto, na presente invenção, o polímero tendo resistência a enzima proteolítica pode ser usado para manter a meia-vida do soro do peptídeo sendo similar a do carreador. Por isso, qualquer polímero não peptídico pode ser usado sem limitação, contanto que seja um polímero tendo a função acima mencionada, isto é, a polímero tendo resistência a enzima proteolítica in vivo. O polímero não peptídico tem um peso molecular na faixa de 1 a 100 kDa, e de preferência de 1 a 20 kDa. O polímero não peptídico da presente invenção ligado a região Fc de imunoglobulina pode ser um polímero ou uma combinação de diferentes tipos de polímeros.
[0091] O polímero não peptídico usado na presente invenção tem um grupo reativo capaz de se ligar a região Fc de imunoglobulina e droga proteica. O polímero não peptídico tem um grupo reativo em ambas as extremidades, que é de preferência selecionado a partir do grupo consistindo de um aldeído reativo, um propionaldeído, um butiraldeído, uma maleimida e um derivado de succinimida. O derivado de succinimida pode ser propionato de succinimidil, hidroxi succinimidil, carboximetil-succinimidil ou succinimidil carbonato. Em particular, quando o polímero não peptídico tem um grupo aldeído reativo em ambas as suas extremidades, é eficaz ligar em ambas as extremidades com um polipeptídeo fisiologicamente ativo e uma imunoglobulina com as mínimas reações não específicas. Um produto final gerado por alquilação redutiva por uma ligação de aldeído é muito mais estável do que o ligado por uma ligação amida. O grupo aldeído reativo se liga seletivamente a um N-terminal em um pH baixo, e se liga a um resíduo de lisina para formar uma ligação covalente em um pH alto, tal como pH 9,0. Os grupos reativos em ambas as extremidades do polímero não peptídico podem ser as mesmas ou diferentes. Por exemplo, o polímero não peptídico pode possuir um grupo maleimida em uma extremidade, e um grupo aldeído, um grupo propionaldeído ou um grupo butiraldeído na outra extremidade. Quando um polietilenoglicol tendo um grupo hidroxi reativo em ambas as suas extremidades é usado como o polímero não peptídico, o grupo hidroxi pode ser ativado a vários grupos reativos por reações químicas conhecidas, ou um polietilenoglicol tendo um grupo reativo modificado comercialmente disponível pode ser usado de modo a prepare preparar o conjugado de ação prolongada da presente invenção.
[0092] O conjugado da presente invenção pode ser aquele que ambas as extremidades do polímero não peptídico tendo dois grupos terminais reativos estão ligadas a um grupo amina ou um grupo tiol da região Fc de imunoglobulina e derivados de oxintomodulina, respectivamente.
[0093] O polímero não peptídico tem um grupo reativo em ambas as extremidades, que é de preferência selecionado a partir do grupo consistindo de um grupo aldeído reativo, um grupo propionaldeído, um grupo butiraldeído, um grupo maleimida e um derivado de succinimida. O derivado de succinimida pode ser propionato de succinimidil, hidroxi succinimidil, carboximetil-succinimidil ou succinimidil carbonato.
[0094] Os dois grupos terminais reativos do polímero não peptídico podem ser os mesmos ou diferentes um do outro. Por exemplo, o do polímero não peptídico pode possuir um grupo maleimida em uma extremidade e um grupo aldeído, um grupo propionaldeído ou um grupo butiraldeído na outra extremidade. Por exemplo, quando o polímero não peptídico tem um grupo aldeído reativo em um grupo terminal, e um grupo maleimida em um outro grupo terminal, é eficaz ligar em ambas as extremidades com um polipeptídeo fisiologicamente ativo e uma imunoglobulina com as mínimas reações não específicas. De acordo com os Exemplos da presente invenção, os conjugados foram preparados ligando a oxintomodulina ou seu derivado e a região Fc de imunoglobulina via uma ligação covalente usando PEG que é a polímero não peptídico incluindo apenas o grupo propionaldeído ou ambos o grupo de maleimidas e o grupo aldeído.
[0095] Os conjugados da presente invenção mostram excelente atividade no receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon , em comparação com a oxintomodulina nativa, e a meia-vida no sangue é aumentada ligando com a região Fc de modo a manter a atividade in vivo por um longo período de tempo.
[0096] Em ainda um outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica para a prevenção ou tratamento de obesidade compreendendo o peptídeo.
[0097] Como usado no presente documento, o termo "prevenção" significa todas as ações pelas quais a ocorrência da doença é contida ou retardada. Na presente invenção, "prevenção" significa que a ocorrência de obesidade a partir de tais fatores como um aumento no peso do corpo ou gordura do corpo é contida ou retardada pela administração dos conjugados da presente invenção.
[0098] Como usado no presente documento, o termo "tratamento" significa todas as ações pelas quais os sintomas da doença foram aliviados ou melhorados. Na presente invenção, "tratamento" significa que os sintomas de obesidade são aliviados ou melhorados pela administração dos conjugados da presente invenção, resultando em uma redução no peso do corpo ou na gordura do corpo.
[0099] Como usado no presente documento, o termo "obesidade" implica no acúmulo de uma quantidade excessiva de tecido adiposo no corpo, e um índice de massa corporal (peso do corpo (kg) dividido pelo quadrado da altura (m)) acima de 25 é para ser considerado como obesidade. A obesidade é usualmente causada por um desequilíbrio energético, quando a quantidade de ingestão alimentar excede a quantidade de energia gasta por um longo período de tempo. A obesidade é uma doença metabólica que afeta todo o corpo, e aumenta o risco de diabetes, hiperlipidemia, disfunção sexual, artrite, e doenças cardiovasculares, e em alguns casos, está associada com a incidência de câncer.
[00100] Os conjugados da presente invenção, que são preparados ligando oxintomodulina ou um derivado da mesma com a região Fc de imunoglobulina, mostram excelente afinidade de ligação com os receptores glucagon e GLP-1 (Tabela 3) e excelente resistência a enzimas proteolíticas in vivo de modo a exibir a atividade in vivo por um longo período de tempo, mostrando assim excelentes efeitos antiobesidade tais como reduções no peso do corpo (FIG. 12).
[00101] A composição farmacêutica da presente invenção pode ainda incluir um veículo farmaceuticamente aceitável, excipiente, ou diluente. Como usado no presente documento, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa que a composição é suficiente para alcançar os efeitos terapêuticos sem efeitos colaterais deletérios, e pode ser prontamente determinada dependendo do tipo de doenças, a idade do paciente, o peso do corpo, as condições de saúde, o sexo, e a sensibilidade à droga, a via de administração, o modo de administração, a frequência de administração, duração do tratamento, as drogas usadas em combinação ou coincidente com a composição desta invenção, e outros fatores conhecidos na medicina.
[00102] A composição farmacêutica incluindo o derivado da presente invenção pode ainda incluir um veículo farmaceuticamente aceitável. Para administração oral, o veículo pode incluir, mas não está limitado a, um ligante, um lubrificante, um agente de desintegração, um excipiente, a um agente de solubilização, um agente de dispersão, um estabilizante, um agente de suspensão, um corante, e um aromatizante. Para as preparações injetáveis, o veículo pode incluir um agente de tamponamento, um agente de conservação, um analgésico, um agente de solubilização, um agente isotônico, e um estabilizante. Para as preparações para administração tópica, o veículo pode incluir uma base, um excipiente, um lubrificante, e um agente de conservação.
[00103] A composição da presente invenção pode ser formulada em uma variedade de formas de dosagem em combinação com os veículos farmaceuticamente aceitáveis acima mencionados. Por exemplo, para administração oral, a composição farmacêutica pode ser formulada em comprimidos, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes ou wafers. Para as preparações injetáveis, a composição farmacêutica pode ser formulada em uma ampola como uma forma de dosagem única ou um recipiente multidose. A composição farmacêutica pode também ser formulada em soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas e preparações de ação prolongada.
[00104] Por outro lado, exemplos do veículo, do excipiente, e do diluente adequados para as formulações farmacêuticas incluem lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, amido, borracha de acácia, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, celulose, metil celulose, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, água, metil hidroxibenzoato, propil hidroxibenzoato, talco, estearato de magnésio e óleos minerais. Além disso, as formulações farmacêuticas podem ainda incluir agentes de enchimento, agentes anticoagulantes, lubrificantes, umectantes, aromatizantes, e antissépticos.
[00105] Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode ter qualquer formulação selecionada a partir do grupo consistindo de comprimidos, pílulas, pós, granulados, cápsulas, suspensões, líquidos para uso interno, emulsões, xaropes, soluções aquosas estéreis, solventes não aquosos, formulações liofilizadas e supositórios.
[00106] Além disso, a composição pode ser formulada em uma forma de dosagem única adequada para o corpo do paciente, e de preferência é formulada em uma preparação útil para drogas peptídicas de acordo com o método típico no campo farmacêutico de modo a ser administrado por uma rota oral ou parenteral tais como a administração através da pele, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intraventricular, pulmonar, transdérmica, subcutânea, intraperitoneal, intranasal, intracolônica, tópica, sublingual, vaginal, ou retal, mas não está limitado a elas.
[00107] A composição pode ser usada por mistura com uma variedade de veículos farmaceuticamente aceitáveis tais como solução salina fisiológica ou solventes orgânicos. A fim de aumentar a estabilidade ou absortividade, carboidratos tais como glicose, sacarose ou dextranos, antioxidantes tais como ácido ascórbico ou glutationa, agentes quelantes, proteínas de baixo peso molecular ou outros estabilizantes podem ser usados.
[00108] A dose de administração e frequência da composição farmacêutica da presente invenção são determinadas pelo tipo do ingrediente ativo, junto com vários fatores tais como a doença a ser tratada, a via de administração, a idade do paciente, o sexo, e o peso do corpo, e a gravidade da doença.
[00109] A dose eficaz total da composição da presente invenção pode ser administrada a um paciente em uma dose única, ou pode ser administrada por um longo período de tempo em doses múltiplas de acordo com um protocolo de tratamento fracionado. Na composição farmacêutica da presente invenção, o teor de ingrediente ativo pode variar dependendo da gravidade da doença. De preferência, a dose diária total do peptídeo da presente invenção pode ser aproximadamente 0,0001 μg a 500 mg por 1 kg do peso do corpo de um paciente. Entretanto, a dose eficaz do peptídeo é determinada considerando vários fatores incluindo a idade do paciente, o peso do corpo, as condições de saúde, o sexo, a gravidade da doença, a dieta, e a taxa de secreção, além da via de administração e da frequência de tratamento da composição farmacêutica. Em vista disto, aqueles técnicos no estado da técnica podem facilmente determinar uma dose eficaz adequada para o uso particular da composição farmacêutica da presente invenção. A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção não é particularmente limitada à formulação, e à via e ao modo de administração, contanto que mostre os efeitos da presente invenção.
[00110] A composição farmacêutica da presente invenção mostra excelente duração in vivo de eficácia e titulação, assim reduzindo notavelmente o número e frequência de sua administração.
[00111] Além disso, a composição farmacêutica pode ser administrada sozinha ou em combinação ou coincidente com outras formulações farmacêuticas mostrando efeitos profiláticos e terapêuticos sobre a obesidade. As formulações farmacêuticas mostrando efeitos profiláticos e terapêuticos sobre a obesidade não são particularmente limitadas, e podem incluir um agonista do receptor de GLP-1, um agonista receptor da leptina, um inibidor de DPP-IV, um antagonista do receptor Y5, um antagonista do receptor de hormônio concentrador de melanina (MCH), um agonista do receptor Y2/3, um agonista do receptor MC3/4, um inibidor da lipase gástrica/pancreática, um agonista 5HT2c, um agonista do receptor β3A, um agonista do receptor amilina, um antagonista de Ghrelin, e/ou um antagonista do receptor Ghrelin.
[00112] Em ainda um outro aspecto, a presente invenção fornece um método para prevenção ou tratamento da obesidade, compreendendo a etapa de administração em um indivíduo do conjugado ou da composição farmacêutica incluindo a mesma.
[00113] Como usado no presente documento, o termo "administração" significa introdução de uma quantidade predeterminada de uma substância em um paciente através de certo método adequado. A composição da presente invenção pode ser administrada via qualquer uma das rotas comuns, contanto que seja capaz de alcançar um tecido desejado, por exemplo, mas não está limitado a administração intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica, oral, tópica, intranasal, intrapulmonar, ou intra-renal. Entretanto, uma vez que os peptídeos são digeridos mediante administração oral, os ingredientes ativos de uma composição para administração oral devem ser revestidos ou formulado para proteção contra a degradação no estômago.
[00114] Na presente invenção, o termo "indivíduo" é aquele suspeito de ter obesidade, que significa os mamíferos incluindo humano, rato, e gado tendo obesidade ou tendo a possibilidade de obesidade. Entretanto, qualquer indivíduo a ser tratado com o peptídeo ou com a composição farmacêutica da presente invenção está incluído sem limitação. A composição farmacêutica incluindo o peptídeo da presente invenção é administrada em um indivíduo suspeito de ter obesidade, tratando assim o indivíduo efetivamente. A obesidade é como descrito acima.
[00115] O método terapêutico da presente invenção pode incluir a etapa de administração da composição incluindo o peptídeo em uma quantidade farmaceuticamente eficaz. A dose diária total deve ser determinada através do julgamento médico apropriado por um médico, e administrada uma ou várias vezes. Com relação aos objetos da presente invenção, o nível específico da dose terapeuticamente eficaz para qualquer paciente em particular pode variar dependendo de vários fatores bem conhecidos no estado da técnica médico, incluindo o tipo e grau de resposta a ser alcançado, composições concretas de acordo com se outros agentes são usados com a mesma ou não, a idade do paciente, o peso do corpo, a condição de saúde, o sexo, e a dieta, o tempo e rota de administração, a taxa de secreção da composição , o período de tempo de terapia, outras drogas usadas em combinação ou coincidente com a composição desta invenção, e fatores afins bem conhecidos no estado da técnica médico.
[00116] Em ainda um outro aspecto, a presente invenção fornece a uso do conjugado ou a composição farmacêutica incluindo a mesma na preparação de fármacos para a prevenção ou tratamento de obesidade.
Modo de Invenção
[00117] No presente documento, a presente invenção será descrita em maior detalhe com referência aos seguintes Exemplos. Entretanto, estes Exemplos são apenas para fins ilustrativos, e a invenção não pretende ser limitada por estes Exemplos.
Exemplo 1. Produção de linhagem celular ativada in vitro Exemplo 1-1: Produção de linhagem celular mostrando resposta de cAMP ao GLP-1
[00118] A PCR foi realizada usando uma região correspondente aos ORF (quadros de leitura aberta) no cDNA (OriGene Technologies, Inc. EUA) do gene do receptor de GLP-1 humano como um template, e os seguintes primers senso e antissenso incluindo cada um dos sítios de restrição HindIII e EcoRI de modo a obter um produto de PCR.
[00119] Primer senso: 5'-CCCGGCCCCCGCGGCCGCTATTCGAAATAC-3'(SEQ ID NO. 47)
[00120] Primer antissenso: 5'-GAACGGTCCGGAGGACGTCGACTCTTAAGATAG-3'(SEQ ID NO. 48)
[00121] O produto de PCR foi clonado no conhecido vetor de expressão de célula animal x0GC/dhfr para preparar um vetor recombinante x0GC/GLP1R.
[00122] A linhagem celular CHO DG44 cultivada em Meio DMEM/F12 (10% SFB) foi transfectadas com o vetor recombinante x0GC/GLP1R usando Lipofectamine (Invitrogen, EUA), e cultivada em um meio de seleção contendo 1 mg/mL de G418 e 10 nM de metotraxato. Linhagens de células de clones individuais foram selecionadas da mesma através de uma técnica de diluição limite, e a linhagem celular mostrando excelente resposta de cAMP ao GLP-1 de um modo dependente de concentração foi finalmente daí selecionada.
Exemplo 1-2: Produção de linhagem celular mostrando resposta de cAMP ao glucagon
[00123] A PCR foi realizada usando uma região correspondente aos ORF no cDNA (OriGene Technologies, Inc. EUA) de gene do receptor do glucagon humano como um template, e os seguintes primers senso e antissenso incluindo cada um dos sítios de restrição EcoRI e XhoI de modo a obter um produto de PCR.
[00124] Primer senso: 5'-CAGCGACACCGACCGTCCCCCCGTACTTAAGGCC-3'(SEQ ID NO. 49)
[00125] Primer antissenso: 5'-CTAACCGACTCTCGGGGAAGACTGAGCTCGCC-3'(SEQ ID NO. 50)
[00126] O produto de PCR foi clonado no conhecido vetor de expressão de célula animal x0GC/dhfr para preparar um vetor recombinante x0GC/GCGR.
[00127] A linhagem celular CHO DG44 cultivada em Meio DMEM/F12 (10% SFB) foi transfectadas com o vetor recombinante x0GC/GCGR usando Lipofectamine, e cultivada em um meio de seleção contendo 1 mg/mL de G418 e 10 nM de metotraxato. Linhagens de células de clones individuais foram selecionadas da mesma através de uma técnica de diluição limite, e a linhagem celular mostrando excelente resposta de cAMP ao glucagon de um modo dependente de concentração foi finalmente daí selecionada.
Exemplo 2. Teste da atividade in vitro de derivados de oxintomodulina Exemplo 2-1: Síntese de derivados de oxintomodulina
[00128] A fim de medir atividade in vitro de derivados de oxintomodulina, derivados de oxintomodulina tendo as seguintes sequências de aminoácidos foram sintetizados (Tabela 1). Tabela 1: Oxintomodulina e derivados de oxintomodulina
Figure img0002
[00129] Na Tabela 1, os aminoácidos em negrito e sublinhados representam a formação de anel, e os aminoácidos representados por X significa um aminoácido não nativo, alfa-metil-ácido glutâmico. Além disso, CA representa 4-imidazoacetil, e DA representa desamino histidil.
Exemplo 2-2: Teste da atividade in vitro de derivados de oxintomodulina
[00130] A fim de medir a eficácia antiobesidade dos derivados de oxintomodulina sintetizados no Exemplo 2-1, a atividade celular foi medida in vitro usando as linhagens de células preparadas Exemplos 1-1 e 1-2.
[00131] As linhagens de células foram aquelas preparadas por transfecção de células CHO (células de ovário de hamster chinês) para expressar o gene do receptor de GLP-1 humano e gene do receptor de glucagon, respectivamente. Deste modo, são adequadas para medir as atividades de GLP-1 e de glucagon. Por isso, a atividade de cada derivado de oxintomodulina foi medida usando cada linhagem de célula transformada.
[00132] Especificamente, cada linhagem de células foi sub-cultivada duas ou três vezes por semana, e aliquotado em cada poço de uma placa de 96 poços com uma densidade de 1 X 105, seguido pelo cultivo por 24 horas.
[00133] As células cultivadas foram lavadas com tampão KRB e suspensas em 40 ml de tampão KRB contendo 1 mM IBMX, e deixadas à temperatura ambiente por 5 minutos. A oxintomodulina (SEQ ID NO. 1) e os derivados de oxintomodulina (representados pela SEQ ID NOs. 2-6, 8, 10-13, 17, 18, 23-25, 27, 28 e 32-34) foram diluídos a partir de 1000 nM a 0,02 nM por 5 vezes em série de diluição, e cada 40 mL dos mesmos foram adicionado às células, e cultivadas a 37°C por 1 hora em uma incubadora de CO2. Em seguida, 20 mL de tampão de lise celular foi adicionado para a lise celular, e os lisados de células foram aplicados a um kit de ensaio de cAMP (Molecular Device, EUA) para medir as concentrações de AMPc. Os valores EC50 das mesmas foram calculados, e em comparação uns com os outros. Os valores EC50 são mostrados a seguir na Tabela 2.
[00134] Tabela 2: Comparação das atividades in vitro para o receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon entre a oxintomodulina e os derivados de oxintomodulina
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[00135] Como mostrado na Tabela 2, existiam derivados de oxintomodulina mostrando excelentes atividades in vitro e diferentes razões de atividades no receptor de GLP-1 e no receptor de glucagon, em comparação com a oxintomodulina nativa de SEQ ID NO. 1.
[00136] É conhecido que oxintomodulina ativa ambos o receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon para suprimir o apetite, facilitar a lipólise, e promover a saciedade, mostrando assim efeitos antiobesidade. Os derivados de oxintomodulina de acordo com a presente invenção mostram atividades in vitro mais altas em ambos o receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon que na oxintomodulina tipo selvagem e, portanto podem ser usados como um agente terapêutico para obesidade com eficácias mais altas que as conhecidas para oxintomodulina.
Exemplo 3. Teste na atividade in vivo de derivados de oxintomodulina
[00137] A fim de medir a atividade terapêutica in vivo de derivados de oxintomodulina, mudanças na absorção de alimento pela administração de derivados de oxintomodulina foram examinadas em camundongo ob/ob usando oxintomodulina nativa como um controle.
[00138] Especificamente, camundongos ob/ob diabéticos obesos, comumente usados para testar a eficácia de agentes terapêuticos para obesidade e diabetes, foram mantidos em jejum por 16 horas, e administrados com 1 ou 10 mg/kg da oxintomodulina, ou 0,02, 0,1, 1 ou 10 mg/kg do derivado de oxintomodulina de SEQ ID NO. 2. Em seguida, a absorção de alimento foi examinada por 2 horas (FIG. 1). A FIG. 1 é um gráfico mostrando mudanças na absorção de alimento de acordo com a dose de administração da oxintomodulina ou o derivado de oxintomodulina. Como mostrado na FIG. 1, administração de 1 mg/kg de derivado de oxintomodulina mostrou mais efeitos inibidores excelentes de absorção de alimento que a administração de 10 mg/kg da oxintomodulina.
[00139] Tomados juntos, os derivados de oxintomodulina da presente invenção têm efeitos antiobesidade muito maiores que oxintomodulina tipo selvagem, mesmo que administrados em uma dose mais baixa, indicando melhoria nos problemas da oxintomodulina tipo selvagem que mostra efeitos antiobesidade menores e deve ser administrada em dose elevada três vezes por dia.
Exemplo 4: Preparação de conjugados incluindo a oxintomodulina e a imunoglobulina Fc
[00140] Em primeiro lugar, para PEGuilação do resíduo de lisina na posição 30 da sequência de aminoácidos da oxintomodulina (SEQ ID NO. 1) com 3,4 K PropionALD(2) PEG (PEG com dois grupos propilaldeído, NOF, Japão), a oxintomodulina e 3,4 K PropionALD(2) PEG foram reagidos em uma razão molar de 1:12 com a concentração de proteína de 5 mg/ml a 4°C por 4,5 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em uma mistura de solventes de 100 mM de tampão Na-borato (pH 9,0) e 45% de isopropanol, e 20 mM de cianoborohidreto de sódio (cianoborohidreto (SCB, NaCNBH3), NaCNBH3) foi adicionado a mesma como um agente redutor. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma SOURCE S (XK16, Amersham Biosciences) para purificar a oxintomodulina tendo lisina monopeguilada (coluna: SOURCE S (XK16, Amersham Biosciences), vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^3% 1 min B ^ 40% 222 min B (A: 20 mM citrato de Na, pH 3,0 + 45% etanol, B: A + 1M KCl)) (FIG. 2a). A FIG. 2a é um gráfico mostrando o resultado da purificação da oxintomodulina monoPEGuilada através de uma coluna de purificação SOURCE S. A monoPEGuilação dos picos eluídos foi examinada por SDS-PAGE, e a seletividade da lisina foi examinada por mapeamento de peptídeos usando a protease Asp-N (FIG. 2b). A FIG. 2b é um gráfico mostrando o resultado do mapeamento de peptídeo de oxintomodulina monoPEGuilada purificada.
[00141] Em seguida, a oxintomodulina monoPEGuilada purificada e a imunoglobulina Fc foram reagidas em uma razão molar de 1:10 com a concentração de proteína de 20 mg/ml a 4°C por 16 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 6,0) e 20 mM de SCB foi adicionado a mesma como um agente redutor. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação SOURCE 15Q para purificar conjugados incluindo a oxintomodulina e a imunoglobulina Fc (coluna: SOURCE 15Q (XK16, Amersham Biosciences), vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^ 20% 100 min B (A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1M NaCl)) (FIG. 2c). A FIG. 2c é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo a oxintomodulina e a imunoglobulina Fc.
Exemplo 5: Preparação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 29) e a imunoglobulina Fc
[00142] Em primeiro lugar, para PEGuilação do resíduo de lisina na posição 30 da sequência de aminoácidos de derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 29) com 3,4 K PropionALD(2) PEG, o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 29) e 3,4 K PropionALD(2) PEG foram reagidos em uma razão molar de 1:12 com a concentração de proteína de 5 mg/ml a 4°C por 4,5 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em uma mistura de solventes de 100 mM de tampão Na-borato (pH 9,0) e 45% de isopropanol, e 20 mM de SCB foi adicionado a mesma como um agente redutor. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma SOURCE S para purificar o derivado de oxintomodulina tendo lisina monopeguilada (Coluna: SOURCE S, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^3% 1 min B ^ 40% 222 min B (A: 20mM citrato de Na, pH 3,0 + 45% etanol, B: A + 1M KCl)) (FIG. 3a). A FIG. 3a é um gráfico mostrando o resultado da purificação de um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 29) através de uma coluna de purificação SOURCE S.
[00143] Em seguida, o derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 29) purificado e a imunoglobulina Fc foram reagidos em uma razão molar de 1:10 com a concentração de proteína de 20 mg/ml a 4°C por 16 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 6,0) e 20 mM de SCB foi adicionado a mesma como um agente redutor. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação SOURCE 15Q para purificar conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 29) e a imunoglobulina Fc (coluna: SOURCE 15Q, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^ 20% 100 min B (A: 20mM Tris-HCl, pH7,5, B: A + 1M NaCl)) (FIG. 3b). A FIG. 3b é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 29) e a imunoglobulina Fc.
Exemplo 6: Preparação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 30) e a imunoglobulina Fc
[00144] Em primeiro lugar, para PEGuilação do resíduo de lisina na posição 30 da sequência de aminoácidos de derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 30) com 3,4 K PropionALD(2) PEG, o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 30) e 3,4 K PropionALD(2) PEG foram reagidos em uma razão molar de 1:15 com a concentração de proteína de 3 mg/ml a 4°C por 4,5 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em uma mistura de solventes de 100 mM de tampão HEPES (pH 7,5) e 45% de isopropanol, e 20 mM de SCB foi adicionado a mesma como um agente redutor. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação SOURCE S para purificar o derivado de oxintomodulina tendo lisina monopeguilada (Coluna: SOURCE S, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^3% 1 min B ^ 40% 222 min B (A: 20mM citrato de Na, pH 3,0 + 45% etanol, B: A + 1M KCl)) (FIG. 4a). A FIG. 4a é um gráfico mostrando o resultado da purificação de um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 30) através de uma coluna de purificação SOURCE S. A monoPEGuilação dos picos eluídos foi examinada por SDS-PAGE, e a seletividade da lisina foi examinada por mapeamento de peptídeos usando a protease Asp-N (FIG. 4b). A FIG. 4b é um gráfico mostrando o resultado do mapeamento de peptídeo um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 30) purificado.
[00145] Em seguida, o derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 30) purificado e a imunoglobulina Fc foram reagidos em uma razão molar de 1:10 com a concentração de proteína de 20 mg/ml a 4°C por 16 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 6,0) e 20 mM de SCB foi adicionado a mesma como um agente redutor. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação SOURCE 15Q para purificar conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 30) e a imunoglobulina Fc (coluna: SOURCE 15Q, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^ 20% 100 min B (A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1M NaCl)) (FIG. 4c). A FIG. 4c é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 30) e a imunoglobulina Fc.
Exemplo 7: Preparação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 31) e a imunoglobulina Fc
[00146] Em primeiro lugar, para PEGuilação do resíduo de lisina na posição 30 da sequência de aminoácidos de derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 31) com 3,4 K PropionALD(2) PEG, o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 31) e 3,4 K PropionALD(2) PEG foram reagidos em uma razão molar de 1:15 com a concentração de proteína de 3 mg/ml a 4°C por 4,5 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em uma mistura de solventes de 100 mM de tampão HEPES (pH 7,5) e 45% de isopropanol, e 20 mM de SCB foi adicionado a mesma como um agente redutor. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação SOURCE S para purificar o derivado de oxintomodulina tendo lisina monopeguilada (Coluna: SOURCE S, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^3% 1 min B ^ 40% 222 min B (A: 20mM citrato de Na, pH 3,0 + 45% etanol, B: A + 1M KCl)) (FIG. 5a). A FIG. 5a é um gráfico mostrando o resultado da purificação de um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 31) através de uma coluna de purificação SOURCE S.
[00147] Em seguida, o derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 31) purificado e a imunoglobulina Fc foram reagidos em uma razão molar de 1:10 com a concentração de proteína de 20 mg/ml a 4°C por 16 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 6,0) e 20 mM de SCB foi adicionado a mesma como um agente redutor. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação SOURCE 15Q para purificar conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 31) e a imunoglobulina Fc (coluna: SOURCE 15Q, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^ 20% 100 min B (A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1M NaCl)) (FIG. 5b). A FIG. 5b é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 31) e a imunoglobulina Fc.
Exemplo 8: Preparação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 2) e a imunoglobulina Fc
[00148] Em primeiro lugar, para PEGuilação do resíduo de lisina na posição 30 da sequência de aminoácidos de derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 2) com 3,4 K PropionALD(2) PEG, o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 2) e 3,4 K PropionALD(2) PEG foram reagidos em uma razão molar de 1:10 com a concentração de proteína de 3 mg/ml a 4°C por 4 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em uma mistura de solventes de 100 mM de tampão HEPES (pH 7,5) e 45% de isopropanol, e 20 mM de SCB foi adicionado a mesma como um agente redutor. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação SOURCE S para purificar o derivado de oxintomodulina tendo lisina monopeguilada (Coluna: SOURCE S, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^3% 1 min B ^ 40% 222 min B (A: 20mM citrato de Na, pH 3,0 + 45% etanol, B: A + 1M KCl)) (FIG. 6a). A FIG. 6a é um gráfico mostrando o resultado da purificação de um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 2) através de uma coluna de purificação SOURCE S. A monoPEGuilação dos picos eluídos foi examinada por SDS-PAGE, e a seletividade da lisina foi examinada por mapeamento de peptídeos usando a protease Asp-N (FIG. 6b). A FIG. 6b é um gráfico mostrando o resultado do mapeamento de peptídeo um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 2) purificado.
[00149] Em seguida, o derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 2) purificado e a imunoglobulina Fc foram reagidos em uma razão molar de 1:8 com a concentração de proteína de 20 mg/ml a 4°C por 16 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 6,0) e 20 mM de SCB foi adicionado a mesma como um agente redutor. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação SOURCE 15Q (Coluna: SOURCE 15Q, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^ 4% 1 min B ^ 20% 80 min B (A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1M NaCl)) (FIG. 6c) e uma coluna de purificação SOURCE ISO (Coluna: SOURCE ISO (XK16, Amersham Biosciences), vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^ 100% 100 min B, (A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1,3M AS))(FIG. 6d) para purificar conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 2) e a imunoglobulina Fc. A FIG. 6c é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 2) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação SOURCE ISO, e a FIG. 6d é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 2) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação SOURCE ISO.
Exemplo 9: Preparação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 3) e a imunoglobulina Fc
[00150] Em primeiro lugar, para PEGuilação do resíduo de lisina na posição 27 da sequência de aminoácidos de derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 3) com 3,4 K PropionALD(2) PEG, o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 3) e 3,4 K PropionALD(2) PEG foram reagidos em uma razão molar de 1:10 com a concentração de proteína de 3 mg/ml a 4°C por 4 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em uma mistura de solventes de 100 mM de tampão HEPES (pH 7,5) e 45% de isopropanol, e 20 mM de SCB foi adicionado a mesma como um agente redutor. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação SOURCE S para purificar o derivado de oxintomodulina tendo lisina monopeguilada (Coluna: SOURCE S, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^3% 1 min B ^ 40% 222 min B (A: 20mM citrato de Na, pH 3,0 + 45% etanol, B: A + 1M KCl)) (FIG. 7a). A FIG. 7a é um gráfico mostrando o resultado da purificação de um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 3) através de uma coluna de purificação SOURCE S. A monoPEGuilação dos picos eluídos foi examinada por SDS-PAGE, e a seletividade da lisina foi examinada por mapeamento de peptídeos usando a protease Asp-N (FIG. 7b). A FIG. 7b é um gráfico mostrando o resultado do mapeamento de peptídeo um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 3) purificado.
[00151] Em seguida, o derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 3) purificado e a imunoglobulina Fc foram reagidos em uma razão molar de 1:8 com a concentração de proteína de 20 mg/ml a 4°C por 16 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 6,0) e 20 mM de SCB foi adicionado a mesma como um agente redutor. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação Butil FF (Coluna: Butil FF(XK16, Amersham Biosciences), vazão: 2,0 mL/min, gradiente: B 0 ^ 100% 5 min A(A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1,5M NaCl)) (FIG. 7c) e a coluna de purificação SOURCE 15Q (Coluna: SOURCE 15Q, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^ 4% 1 min B ^ 20% 80 min B(A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1M NaCl)) (FIG. 7d) para purificar conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 3) e a imunoglobulina Fc. A FIG. 7c é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 3) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação Butil FF, e a FIG. 7d é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 3) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação SOURCE 15Q.
Exemplo 10: Preparação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 23) e a imunoglobulina Fc
[00152] Em primeiro lugar, para PEGuilação do resíduo de cisteína na posição 24 da sequência de aminoácidos de derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 23) com MAL-10K-ALD PEG (NOF., Japão), o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 23) e MAL-10K-ALD PEG foram reagidos em uma razão molar de 1:3 com a concentração de proteína de 3 mg/ml à temperatura ambiente por 3 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em 50 mM de tampão Tris (pH 8,0) e 45% de isopropanol, e 1M guanidina foi adicionada a mesma. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação SOURCE S para purificar o derivado de oxintomodulina tendo cisteína monopeguilada (coluna: SOURCE S, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^100% 50 min B (A: 20mM citrato de Na, pH 3,0 + 45% etanol, B: A + 1M KCl)) (FIG. 8a). A FIG. 8a é um gráfico mostrando o resultado da purificação de um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 23) através de uma coluna de purificação SOURCE S.
[00153] Em seguida, o derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 23) purificado e a imunoglobulina Fc foram reagidos em uma razão molar de 1:5 com a concentração de proteína de 20 mg/ml a 4°C por 16 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 6,0) e 20 mM de SCB foi adicionado a mesma como um agente redutor. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação SOURCE 15Q (coluna: SOURCE 15Q, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^ 4% 1 min B ^ 20% 80 min B(A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1M NaCl)) (FIG. 8b) e uma coluna de purificação SOURCE ISO (coluna: SOURCE ISO, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: B 0 ^ 100% 100 min A, (A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1,1M AS)) (FIG. 8c) para purificar conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 23) e a imunoglobulina Fc. A FIG. 8b é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 23) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação SOURCE 15Q, e a FIG. 8c é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 23) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação SOURCE ISO.
Exemplo 11: Preparação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 24) e a imunoglobulina Fc
[00154] Em primeiro lugar, para PEGuilação do resíduo de cisteína na posição 30 da sequência de aminoácidos de derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 24) com MAL-10K-ALD PEG, o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 24) e MAL-10K-ALD PEG foram reagidos em uma razão molar de 1:3 com a concentração de proteína de 3 mg/ml à temperatura ambiente por 3 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em 50 mM de tampão Tris (pH 8,0) e 45% de isopropanol, e 1M guanidina foi adicionada a mesma. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação SOURCE S para purificar o derivado de oxintomodulina tendo cisteína monopeguilada (coluna: SOURCE S, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^100% 50 min B (A: 20mM citrato de Na, pH 3,0 + 45% etanol, B: A + 1M KCl)) (FIG. 9a). A FIG. 9a é um gráfico mostrando o resultado da purificação de um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 24) através de uma coluna de purificação SOURCE S.
[00155] Em seguida, o derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 24) purificado e a imunoglobulina Fc foram reagidos em uma razão molar de 1:5 com a concentração de proteína de 20 mg/ml a 4°C por 16 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 6,0) e 20 mM de SCB foi adicionado a mesma como um agente redutor. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação SOURCE 15Q (coluna: SOURCE 15Q, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^ 4% 1 min B ^ 20% 80 min B(A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1M NaCl)) (FIG. 9b) e uma coluna de purificação SOURCE ISO (coluna: SOURCE ISO, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: B 0 ^ 100% 100 min A, (A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1,1M AS)) (FIG. 9c) para purificar conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 24) e a imunoglobulina Fc. A FIG. 9b é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 24) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação SOURCE 15Q, e a FIG. 9c é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 24) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação SOURCE ISO.
Exemplo 12: Preparação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 25) e a imunoglobulina Fc
[00156] Em primeiro lugar, para PEGuilação do resíduo de cisteína na posição 30 da sequência de aminoácidos de derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 25) com MAL-10K-ALD PEG, o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 25) e MAL-10K-ALD PEG foram reagidos em uma razão molar de 1:3 com a concentração de proteína de 3 mg/ml à temperatura ambiente por 3 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em 50 mM de tampão Tris (pH 8,0) e 1M guanidina foi adicionada a mesma. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação SOURCE S para purificar o derivado de oxintomodulina tendo cisteína monopeguilada (coluna: SOURCE S, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^100% 50 min B (A: 20mM citrato de Na, pH 3,0 + 45% etanol, B: A + 1M KCl)) (FIG. 10a). A FIG. 10a é um gráfico mostrando o resultado da purificação de um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 25) através de uma coluna de purificação SOURCE S.
[00157] Em seguida, o derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 25) purificado e a imunoglobulina Fc foram reagidos em uma razão molar de 1:5 com a concentração de proteína de 20 mg/ml a 4°C por 16 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 6,0) e 20 mM de SCB foi adicionado a mesma como um agente redutor. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação SOURCE 15Q (coluna: SOURCE 15Q, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^ 4% 1 min B ^ 20% 80 min B(A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1M NaCl)) (FIG. 10b) e uma coluna de purificação SOURCE ISO (coluna: SOURCE ISO, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: B 0 ^ 100% 100 min A, (A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1,1M AS)) (FIG. 10c) para purificar conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 25) e a imunoglobulina Fc. A FIG. 10b é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 25) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação SOURCE 15Q, e a FIG. 10c é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 25) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação SOURCE ISO.
Exemplo 13: Preparação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 28) e a imunoglobulina Fc
[00158] Em primeiro lugar, para PEGuilação do resíduo de lisina na posição 20 da sequência de aminoácidos de derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 28) com 3,4 K PropionALD(2) PEG, o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 28) e MAL-10K-ALD PEG foram reagidos em uma razão molar de 1:5 com a concentração de proteína de 3 mg/ml a 4°C por 3 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em 50 mM de tampão Na-borato (pH 9,0) e 2M guanidina foi adicionada a mesma. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação SOURCE S para purificar o derivado de oxintomodulina tendo lisina monopeguilada (coluna: SOURCE S, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^3% 1 min B ^ 40% 222 min B (A: 20mM citrato de Na, pH 3,0 + 45% etanol, B: A + 1M KCl)) (FIG. 11a). A FIG. 11a é um gráfico mostrando o resultado da purificação de um derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 28) através de uma coluna de purificação SOURCE S.
[00159] Em seguida, o derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 28) purificado e a imunoglobulina Fc foram reagidos em uma razão molar de 1:10 com a concentração de proteína de 20 mg/ml a 4°C por 16 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 6,0) e 20 mM de SCB foi adicionado a mesma como um agente redutor. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação SOURCE 15Q (coluna: SOURCE 15Q, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^ 4% 1 min B ^ 20% 80 min B(A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1M NaCl)) (FIG. 11b) e uma coluna de purificação SOURCE ISO (coluna: SOURCE ISO, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: B 0 ^ 100% 100 min A, (A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1,1M AS)) (FIG. 11c) para purificar conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 28) e a imunoglobulina Fc. A FIG. 11b é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 28) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação SOURCE 15Q, e a FIG. 11c é um gráfico mostrando o resultado da purificação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 28) e a imunoglobulina Fc através de uma coluna de purificação SOURCE ISO.
Exemplo 14: Preparação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 32) e a imunoglobulina Fc
[00160] Em primeiro lugar, para PEGuilação do resíduo de cisteína na posição 30 da sequência de aminoácidos de derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 32) com MAL-10K-ALD PEG, o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 32) e MAL-10K-ALD PEG foram reagidos em uma razão molar de 1:3 com a concentração de proteína de 1 mg/ml à temperatura ambiente por 3 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em 50 mM de tampão Tris (pH 8,0) e 2M guanidina foi adicionada a mesma. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação SOURCE S para purificar o derivado de oxintomodulina tendo cisteína monopeguilada (coluna: SOURCE S, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^100% 50 min B (A: 20mM citrato de Na, pH 3,0 + 45% etanol, B: A + 1M KCl)).
[00161] Em seguida, o derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 32) purificado e a imunoglobulina Fc foram reagidos em uma razão molar de 1:8 com a concentração de proteína de 20 mg/ml a 4°C por 16 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 6,0) e 20 mM de SCB foi adicionado a mesma como um agente redutor. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação SOURCE 15Q (coluna: SOURCE 15Q, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^ 4% 1 min B ^ 20% 80 min B(A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1M NaCl)) e uma coluna de purificação SOURCE ISO (coluna: SOURCE ISO, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: B 0 ^ 100% 100 min A, (A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1,1M AS)) para purificar conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 32) e a imunoglobulina Fc.
Exemplo 15: Preparação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 33) e a imunoglobulina Fc
[00162] Em primeiro lugar, para PEGuilação do resíduo de cisteína na posição 30 da sequência de aminoácidos de derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 33) com MAL-10K-ALD PEG, o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 33) e MAL-10K-ALD PEG foram reagidos em uma razão molar de 1:1 com a concentração de proteína de 1 mg/ml à temperatura ambiente por 3 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em 50 mM de tampão Tris (pH 8,0) e 2M guanidina foi adicionada a mesma. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação SOURCE S para purificar o derivado de oxintomodulina tendo cisteína monopeguilada (coluna: SOURCE S, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^100% 50 min B (A: 20mM citrato de Na, pH 3,0 + 45% etanol, B: A + 1M KCl)).
[00163] Em seguida, o derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 33) purificado e a imunoglobulina Fc foram reagidos em uma razão molar de 1:5 com a concentração de proteína de 20 mg/ml a 4°C por 16 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 6,0) e 20 mM de SCB foi adicionado a mesma como um agente redutor. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação SOURCE 15Q (coluna: SOURCE 15Q, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^ 4% 1 min B ^ 20% 80 min B(A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1M NaCl)) e uma coluna de purificação SOURCE ISO (coluna: SOURCE ISO, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: B 0 ^ 100% 100 min A, (A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1,1M AS)) para purificar conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 33) e a imunoglobulina Fc.
Exemplo 16: Preparação de conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 34) e a imunoglobulina Fc
[00164] Em primeiro lugar, para PEGuilação do resíduo de cisteína na posição 30 da sequência de aminoácidos de derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 34) com MAL-10K-ALD PEG, o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 34) e MAL-10K-ALD PEG foram reagidos em uma razão molar de 1:1 com a concentração de proteína de 3 mg/ml à temperatura ambiente por 3 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em 50 mM de tampão Tris (pH 8,0) e 1M guanidina foi adicionada a mesma. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação SOURCE S para purificar o derivado de oxintomodulina tendo cisteína monopeguilada (coluna: SOURCE S, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^100% 50 min B (A: 20mM citrato de Na, pH 3,0 + 45% etanol, B: A + 1M KCl)).
[00165] Em seguida, o derivado de oxintomodulina monoPEGuilado (SEQ ID NO. 34) purificado e a imunoglobulina Fc foram reagidos em uma razão molar de 1:5 com a concentração de proteína de 20 mg/ml a 4°C por 16 horas. Neste momento, a reação foi conduzida em 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 6,0) e 20 mM de SCB foi adicionado a mesma como um agente redutor. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi aplicada a uma coluna de purificação SOURCE 15Q (coluna: SOURCE 15Q, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: A 0 ^ 4% 1 min B ^ 20% 80 min B(A: 20mM Tris-HCl, pH7,5, B: A + 1M NaCl)) e uma coluna de purificação SOURCE ISO (coluna: SOURCE ISO, vazão: 2,0 mL/min, gradiente: B 0 ^ 100% 100 min A, (A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1,1M AS)) para purificar conjugados incluindo o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 34) e a imunoglobulina Fc.
Exemplo 17: Atividade in vitro de derivado de oxintomodulina-conjugados de imunoglobulina Fc
[00166] A fim de medir a eficácia antiobesidade dos conjugados incluindo a oxintomodulina ou o derivado de oxintomodulina e a imunoglobulina Fc que foram preparados nos Exemplos acima, os experimentos foram realizados da mesma maneira como no Exemplo 2-2.
[00167] Especificamente, cada um dos transformantes preparados nos Exemplos 1-1 e 1-2 foi sub-cultivado duas ou três vezes por semana, e aliquotado em cada poço de uma placa de 96 poços com uma densidade de 1 X 105, seguido pelo cultivo por 24 horas. Cada um dos transformantes em cultura foi lavado com tampão KRB e suspenso em 40 ml de tampão KRB contendo 1 mM IBMX, e deixado à temperatura ambiente por 5 minutos. O GLP-1, glucagon, e o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 23, 24, 25, 32, 33 ou 34)-conjugados imunoglobulina Fc foram diluídos a partir de 1000 nM a 0,02 nM por 5 vezes em série de diluição, e cada 40 ml do mesmo foi adicionado a cada transformante, e cultivado a 37°C por 1 hora em uma incubadora de CO2, Em seguida, 20 mL de tampão de lise celular foram adicionados para a lise celular, e os lisados de células foram aplicados a um kit de ensaio de cAMP (Molecular Device, EUA) para medir as concentrações de AMPc usando um Victor (Perkin Elmer, EUA). Os valores EC50 valores das mesmas foram calculados, e em comparação uns com os outros (Tabela 3). Tabela 3: Atividade in vitro de derivado de oxintomodulina-conjugados de imunoglobulina Fc
Figure img0005
[00168] Como mostrado na Tabela 3, verificou-se que o derivado de oxintomodulina-conjugados de imunoglobulina Fc mostra a atividade in vitro para os receptores GLP-1 e glucagon.
Exemplo 18: Atividade in vivo de conjugados derivado de oxintomodulina-imunoglobulina
[00169] Foi examinado se o derivado de oxintomodulina-conjugados de imunoglobulina Fc mostra excelentes efeitos de redução de peso do corpo in vivo.
[00170] Especificamente, camundongos C57BL/6 normais de 6 semanas de idade foram alimentados com uma dieta rica em gordura de 60 kcal por 24 semanas para aumentar peso do corpo deles em aproximadamente 50 g em média, e administrados por via subcutânea com derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO. 23, 24 ou 25)-conjugados imunoglobulina Fc a uma dose de 0,03 ou 0,06 mg/kg/semana por 3 semanas. Depois disso, mudanças no peso do corpo dos camundongos foram medidas (FIG. 12 e FIG. 13). A FIG. 12 e a FIG. 13 são gráficos mostrando mudanças em peso corporal de camundongos de acordo com o tipo e dose de administração de derivado de oxintomodulina-conjugados de imunoglobulina Fc. Como mostrado na FIG. 12 e a FIG. 13, como a dose de administração do derivado de oxintomodulina-conjugados de imunoglobulina Fc foi aumentada, o peso do corpo foi reduzido em proporção direta, mesmo que existindo diferenças entre os tipos do derivado de oxintomodulina-conjugados de imunoglobulina Fc, sugerindo que o derivado de oxintomodulina-conjugados de imunoglobulina Fc reduz o peso do corpo em uma maneira dose-dependente.

Claims (21)

1. Conjugado caracterizado por compreender um derivado de oxintomodulina, compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 2 a 34, uma região Fc de imunoglobulina, e um polímero não peptídico, em que o polímero não peptídico se liga de covalentemente ao derivado de oxintomodulina e a região Fc de imunoglobulina.
2. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o derivado de oxintomodulina compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 24.
3. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por os aminoácidos nas posições 12 e 16 ou 16 e 20 do derivado de oxintomodulina formar um anel.
4. Conjugado, de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por o derivado de oxintomodulina compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25.
5. Conjugado, de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por o derivado de oxintomodulina compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
6. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o derivado de oxintomodulina ser capaz de ativar o receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon.
7. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o conjugado possuir efeitos anti-obesidade.
8. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o polímero não peptídico ser polietilenoglicol, polipropilenoglicol, copolímeros de etileno glicol e propileno glicol, polióis polioxietilados, álcool polivinílico, polissacarídeos, dextrano, poli éter vinil etílico, ácido polilático (PLA), ácido poliláctico-glicólico (PLGA), polímeros de lipídios, quitinas, ácido hialurônico, polissacarídeo ou uma de suas combinações.
9. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por uma extremidade do polímero não peptídico ser dobrado para um grupo amino ou um grupo tiol da região Fc de imunoglobulina e a outra extremidade do polímero não peptídico ser dobrado a um grupo amino ou um grupo tiol do derivado de oxintomodulina.
10. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o polímero não peptídico ter grupos reativos capazes de ligar com a região Fc de imunoglobulina e o derivado de oxintomodulina em ambas as extremidades.
11. Conjugado, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o grupo reativo ser selecionado a partir do grupo selecionado entre um grupo aldeído, um grupo propionaldeído, um grupo butiraldeído, um grupo maleimida ou um derivado de succinimida.
12. Conjugado, de acordo com a reivindicação 10 caracterizado por os grupos reativos em ambas as extremidades serem o mesmo ou diferentes um do outro.
13. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a região Fc de imunoglobulina ser uma região Fc não glicosilada.
14. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a região Fc de imunoglobulina ser um domínio CH1, um domínio CH2, um domínio CH3 e um domínio CH4; um domínio CH1 e um domínio CH2; um domínio CH1 e um domínio CH3; um domínio CH2 e um domínio CH3; uma combinação de um ou mais domínios e uma região dobradiça da imunoglobulina ou uma porção da região dobradiça; ou um dímero de cada domínio das regiões constantes da cadeia pesada e da região constante da cadeia leve.
15. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a região Fc de imunoglobulina ser um derivado em que uma região capaz de formar uma ligação dissulfeto é deletada, certos resíduos de aminoácidos serem eliminados na extremidade N-terminal de uma forma nativa de Fc, um resíduo de metionina ser adicionado na extremidade N-terminal de uma forma nativa de Fc, um sítio de ligação de complemento ser deletado, ou um sítio de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) ser deletado.
16. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a região Fc de imunoglobulina ser uma região Fc derivada de IgG, IgA, IgD, IgE ou IgM.
17. Conjugado, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a região Fc de imunoglobulina ser uma região Fc de IgG4.
18. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a região Fc de imunoglobulina ser uma região Fc não glicosilada derivada de IgG4 humana.
19. Composição farmacêutica para a prevenção ou tratamento de obesidade caracterizada por compreender o conjugado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.
20. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 19 caracterizada por ainda compreender um veículo farmaceuticamente aceitável.
21. Uso do conjugado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 ou da composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 19 ou 20, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de obesidade.
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Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9249407B2 (en) 2006-02-03 2016-02-02 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US10221228B2 (en) 2006-02-03 2019-03-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US8048849B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Modigene, Inc. Long-acting polypeptides and methods of producing same
US20140113860A1 (en) 2006-02-03 2014-04-24 Prolor Biotech Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US20150038413A1 (en) 2006-02-03 2015-02-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US9663778B2 (en) 2009-07-09 2017-05-30 OPKO Biologies Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US10166295B2 (en) 2011-06-02 2019-01-01 Opko Biologics Ltd. Pegylated OXM variants
ES2692187T3 (es) 2011-06-10 2018-11-30 Hanmi Science Co., Ltd. Nuevos derivados de oxintomodulina y composición farmacéutica para el tratamiento de obesidad que lo comprende
EP2721062B1 (en) 2011-06-17 2018-11-14 Hanmi Science Co., Ltd. A conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
CN109096387B (zh) 2012-06-04 2021-11-30 奥普科生物制品有限公司 聚乙二醇化的oxm变体
KR101968344B1 (ko) * 2012-07-25 2019-04-12 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 고지혈증 치료용 조성물
AR092873A1 (es) 2012-09-26 2015-05-06 Cadila Healthcare Ltd Peptidos como agonistas triples de los receptores de gip, glp-1 y glugagon
UA116217C2 (uk) 2012-10-09 2018-02-26 Санофі Пептидна сполука як подвійний агоніст рецепторів glp1-1 та глюкагону
ES2748158T3 (es) 2012-11-06 2020-03-13 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulación líquida de conjugado de proteínas que comprende la oxintomodulina y un fragmento de inmunoglobulina
KR101993393B1 (ko) * 2012-11-06 2019-10-01 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 당뇨병 또는 비만성 당뇨병 치료용 조성물
JP2016503771A (ja) 2012-12-21 2016-02-08 サノフイ エキセンジン−４誘導体
AR096890A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugando fc de inmunoglobulina, que mantiene la afinidad de unión del fragmento fc de la inmunoglobulina a fcrn
AR096891A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo
US20150158926A1 (en) 2013-10-21 2015-06-11 Opko Biologics, Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
WO2015086730A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Sanofi Non-acylated exendin-4 peptide analogues
EP3080150B1 (en) 2013-12-13 2018-08-01 Sanofi Exendin-4 peptide analogues as dual glp-1/gip receptor agonists
EP3080149A1 (en) 2013-12-13 2016-10-19 Sanofi Dual glp-1/glucagon receptor agonists
EP3080154B1 (en) 2013-12-13 2018-02-07 Sanofi Dual glp-1/gip receptor agonists
MA43289B1 (fr) 2014-01-20 2019-12-31 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Insuline à action prolongée et utilisation associée
CN117065044A (zh) * 2014-03-31 2023-11-17 韩美药品株式会社 通过使用免疫球蛋白Fc片段连接改善蛋白质和肽的溶解度的方法
TW201625669A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自艾塞那肽－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）之肽類雙重ＧＬＰ－１／升糖素受體促效劑
TW201625670A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自ｅｘｅｎｄｉｎ－４之雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑
TW201625668A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 作為胜肽性雙重ｇｌｐ－１／昇糖素受體激動劑之艾塞那肽－４衍生物
AR100639A1 (es) 2014-05-29 2016-10-19 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Composición para tratar diabetes que comprende conjugados de análogos de insulina de acción prolongada y conjugados de péptidos insulinotrópicos de acción prolongada
TWI684458B (zh) * 2014-05-30 2020-02-11 南韓商韓美藥品股份有限公司 包含胰島素及ｇｌｐ-１/昇糖素雙重促效劑之治療糖尿病之組成物
KR20150140177A (ko) 2014-06-05 2015-12-15 한미약품 주식회사 단백질 및 펩타이드의 면역원성을 감소시키는 방법
US9932381B2 (en) 2014-06-18 2018-04-03 Sanofi Exendin-4 derivatives as selective glucagon receptor agonists
TWI772252B (zh) 2014-09-16 2022-08-01 南韓商韓美藥品股份有限公司 長效glp-1/高血糖素受體雙促效劑治療非酒精性脂肝疾病之用途
CA2972748A1 (en) * 2014-12-30 2016-07-07 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Glucagon derivative having improved stability
KR102418477B1 (ko) * 2014-12-30 2022-07-08 한미약품 주식회사 글루카곤 유도체
AR105319A1 (es) 2015-06-05 2017-09-27 Sanofi Sa Profármacos que comprenden un conjugado agonista dual de glp-1 / glucagón conector ácido hialurónico
CN108289851B (zh) 2015-06-19 2021-06-01 Opko生物科学有限公司 长效凝固因子及其产生方法
DK3322437T3 (da) 2015-06-30 2024-03-25 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Glukagonderivat og en sammensætning omfattende et langtidsvirkende konjugat af samme
AR105284A1 (es) 2015-07-10 2017-09-20 Sanofi Sa Derivados de exendina-4 como agonistas peptídicos duales específicos de los receptores de glp-1 / glucagón
UY36870A (es) 2015-08-28 2017-03-31 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Análogos de insulina novedosos
EP3341025A4 (en) * 2015-09-24 2019-05-01 Hanmi Pharm. Co., Ltd. PROTEIN COMPLEX BY USING A SPECIFIC ROLE OF AN IMMUNOMOBILIN FRAGMENT FOR LINKING
EA038544B1 (ru) 2015-12-31 2021-09-13 Ханми Фарм. Ко., Лтд. Тройной агонист рецепторов глюкагона/glp-1/gip
IL263934B2 (en) 2016-06-29 2023-10-01 Hanmi Pharm Ind Co Ltd A derivative of glucagon, its conjugate, a preparation containing it and its medical use
KR20240006077A (ko) 2016-07-11 2024-01-12 옵코 바이오로직스 리미티드 지속성 응고 인자 vii 및 그 제조 방법
TWI774694B (zh) 2016-09-23 2022-08-21 南韓商韓美藥品股份有限公司 具有降低對胰島素受體之親和力之胰島素類似物及其用途
JOP20190095A1 (ar) * 2016-10-27 2019-04-28 Janssen Pharmaceutica Nv مركبات ببتيد تيروسين-تيروسين الحلقية كمعدلات لمستقبلات الببتيد العصبي y
AR110299A1 (es) 2016-12-02 2019-03-13 Sanofi Sa Conjugados que comprenden un agonista dual de glp-1 / glucagón, un conector y ácido hialurónico
CN108299553B (zh) * 2017-01-13 2021-07-16 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 胃泌酸调节素修饰物
AU2018215840A1 (en) 2017-02-03 2019-08-01 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Long-Acting Conjugate Of A Physiologically Active Material And Use Thereof
WO2018174668A2 (ko) 2017-03-23 2018-09-27 한미약품 주식회사 인슐린 수용체와의 결합력이 감소된 인슐린 아날로그의 결합체 및 이의 용도
KR102230363B1 (ko) * 2017-08-16 2021-03-22 동아에스티 주식회사 아실화 옥신토모듈린 펩타이드 유사체
WO2019035672A1 (ko) 2017-08-16 2019-02-21 동아에스티 주식회사 아실화 옥신토모듈린 펩타이드 유사체
WO2019171352A2 (en) * 2018-03-08 2019-09-12 Janssen Pharmaceutica Nv Methods of treating severe non-diabetic obesity
TW202015735A (zh) 2018-05-30 2020-05-01 法商賽諾菲公司 包含ｇｌｐ－１／升糖素／ｇｉｐ三重受體促效劑、連接子及透明質酸之接合物
EP3823659A4 (en) * 2018-07-19 2022-06-22 D&D Pharmatech Inc. PHARMACEUTICAL COMPOSITION WITH A POLYPEPTIDE
KR20200135618A (ko) * 2019-05-23 2020-12-03 ㈜ 디앤디파마텍 폴리펩티드를 포함하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
CN110964116A (zh) * 2018-09-26 2020-04-07 北京辅仁瑞辉生物医药研究院有限公司 GLP1-Fc融合蛋白及其缀合物
WO2020128967A2 (en) * 2018-12-19 2020-06-25 Janssen Pharmaceutica Nv Methods of treating severe non-diabetic obesity
CN111944055B (zh) * 2019-05-16 2022-08-02 浙江道尔生物科技有限公司 一种治疗代谢疾病的融合蛋白
IL298428A (en) * 2020-05-22 2023-01-01 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Liquid formulation

Family Cites Families (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
AU749815B2 (en) 1998-03-06 2002-07-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Protein-free preparations
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6677136B2 (en) * 2000-05-03 2004-01-13 Amgen Inc. Glucagon antagonists
GB0121709D0 (en) 2001-09-07 2001-10-31 Imp College Innovations Ltd Food inhibition agent
WO2005003296A2 (en) 2003-01-22 2005-01-13 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US7217845B2 (en) * 2002-11-25 2007-05-15 Sun Bio, Inc. Bifunctional polyethylene glycol derivatives
GB0300571D0 (en) 2003-01-10 2003-02-12 Imp College Innovations Ltd Modification of feeding behaviour
US7772188B2 (en) 2003-01-28 2010-08-10 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
WO2005035761A1 (en) 2003-10-16 2005-04-21 Compugen Ltd. Splice variants of preproglucagon, glucagon-like peptide-1 and oxyntomodulin
KR101135244B1 (ko) 2007-11-29 2012-04-24 한미사이언스 주식회사 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 비만 관련질환 치료용 조성물
US20090238838A1 (en) 2003-11-13 2009-09-24 Hanmi Pharm. Ind. Co. Ltd. Insulinotropic peptide conjugate using an immunoglobulin fc
AU2004282984B2 (en) * 2003-11-13 2011-07-14 Hanmi Science Co., Ltd. Protein complex using immunoglobulin fragment andmethod for the preparation thereof
US8263084B2 (en) 2003-11-13 2012-09-11 Hanmi Science Co., Ltd Pharmaceutical composition for treating obesity-related disease comprising insulinotropic peptide conjugate
AU2005311099B2 (en) 2004-12-02 2012-02-02 Domantis Limited Bispecific domain antibodies targeting serum albumin and GLP-1 or PYY
WO2007022123A2 (en) 2005-08-11 2007-02-22 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Hybrid polypeptides with selectable properties
EA011653B1 (ru) 2005-02-11 2009-04-28 Амилин Фармасьютикалз, Инк. Аналоги и гибридные полипептиды gip с избираемыми свойствами
ATE480255T1 (de) * 2005-03-31 2010-09-15 Amylin Pharmaceuticals Inc Zusammensetzungen und verfahren zur kontrolle, prävention und behandlung von essstörungen
KR100754667B1 (ko) 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
PT1891105E (pt) 2005-06-13 2012-06-27 Imp Innovations Ltd Análogos de oxintomodulina e seus efeitos sobre o comportamento da alimentação
GB0511986D0 (en) 2005-06-13 2005-07-20 Imp College Innovations Ltd Novel compounds and their effects on feeding behaviour
US20090297496A1 (en) 2005-09-08 2009-12-03 Childrens Hospital Medical Center Lysosomal Acid Lipase Therapy for NAFLD and Related Diseases
EP1991574B1 (en) * 2006-02-22 2016-10-12 Merck Sharp & Dohme Corp. Oxyntomodulin derivatives
WO2007146038A2 (en) 2006-06-07 2007-12-21 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
KR100880509B1 (ko) 2006-10-16 2009-01-28 한미약품 주식회사 재조합 단백질의 대량 생산을 위한 신규한 벡터, 발현세포주 및 이를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법
TWI428346B (zh) 2006-12-13 2014-03-01 Imp Innovations Ltd 新穎化合物及其等對進食行為影響
GB0624868D0 (en) 2006-12-13 2007-01-24 Imp Innovations Ltd Novel compounds and their effects on feeding behaviour
US20090098130A1 (en) 2007-01-05 2009-04-16 Bradshaw Curt W Glucagon-like protein-1 receptor (glp-1r) agonist compounds
JP2008169195A (ja) 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
MX2009008241A (es) 2007-02-15 2009-10-08 Univ Indiana Res & Tech Corp Co-agonistas de receptor de glucagon/glp-1.
WO2009009562A2 (en) 2007-07-10 2009-01-15 Eli Lilly And Company Glp-1-fc fusion protein formulation
CN106106497B (zh) 2007-07-27 2022-02-22 拜耳知识产权有限责任公司 三元活性化合物结合物
AU2008306190A1 (en) 2007-09-11 2009-04-09 Mondobiotech Laboratories Ag Use of bubuc and optionally EAA-MART1 (26-35) as a therapeutic agent for the treatment of HCMV infections
JP5771005B2 (ja) 2007-10-30 2015-08-26 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ グルカゴンアンタゴニスト及びｇｌｐ−１アゴニスト活性を示す化合物
WO2009099763A1 (en) 2008-01-30 2009-08-13 Indiana University Research And Technology Corporation Ester-based peptide prodrugs
JP5753779B2 (ja) 2008-06-17 2015-07-22 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 生理学的ｐＨの緩衝液中で向上した溶解性及び安定性を示すグルカゴン類縁体
EA019203B9 (ru) 2008-06-17 2014-03-31 Индиана Юниверсити Рисерч Энд Текнолоджи Корпорейшн Коагонисты глюкагонового рецептора/glp-1-рецептора
WO2010013012A2 (en) 2008-08-01 2010-02-04 Lund University Bioscience Ab Novel polypeptides and uses thereof
EP2341942A1 (en) 2008-09-19 2011-07-13 Nektar Therapeutics Polymer conjugates of therapeutic peptides
EP2344200A2 (en) 2008-09-19 2011-07-20 Nektar Therapeutics Modified therapeutics peptides, methods of their preparation and use
JP5635531B2 (ja) 2008-12-15 2014-12-03 ジーランド ファーマ アクティーゼルスカブ グルカゴン類似体
AR074811A1 (es) * 2008-12-19 2011-02-16 Univ Indiana Res & Tech Corp Profarmaco de peptido de la superfamilia de glucagon basados en amida
ES2730800T3 (es) 2009-02-03 2019-11-12 Amunix Pharmaceuticals Inc Polipéptidos recombinantes extendidos y composiciones que comprenden los mismos
WO2010096052A1 (en) 2009-02-19 2010-08-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Oxyntomodulin analogs
CA2755395C (en) 2009-03-20 2015-02-24 Hanmi Holdings Co., Ltd. Method for preparing a site-specific physiologically active polypeptide conjugate
US20120121591A1 (en) 2009-03-20 2012-05-17 Amgen Inc. SELECTIVE AND POTENT PEPTIDE INHIBITORS OF Kv1.3
CN102459325B (zh) 2009-06-16 2015-03-25 印第安纳大学科技研究有限公司 胃抑胜肽受体活化的胰高血糖素化合物
EA022816B1 (ru) 2009-07-13 2016-03-31 Зилэнд Фарма А/С Ацилированные аналоги глюкагона
US20120294855A1 (en) 2009-11-03 2012-11-22 Eli Lilly & Company Glp-1 receptor agonist compounds for obstructive sleep apnea
US20120269830A1 (en) 2009-12-07 2012-10-25 Lawrence Horowitz Conjugates with improved pharmacokinetic properties
EP2512503A4 (en) 2009-12-18 2013-08-21 Univ Indiana Res & Tech Corp COAGONISTS OF GLUCAGON / GLP-1 RECEPTOR
AR079344A1 (es) 2009-12-22 2012-01-18 Lilly Co Eli Analogo peptidico de oxintomodulina, composicion farmaceutica que lo comprende y uso para preparar un medicamento util para tratar diabetes no insulinodependiente y/u obesidad
JO2976B1 (en) 2009-12-22 2016-03-15 ايلي ليلي اند كومباني Axentomodulin polypeptide
RU2559320C2 (ru) 2010-03-26 2015-08-10 Ново Нордиск А/С Новые аналоги глюкагона
CN103179976A (zh) 2010-05-13 2013-06-26 印第安纳大学研究及科技有限公司 呈现g蛋白偶联受体活性的胰高血糖素超家族肽
KR20130102470A (ko) 2010-06-24 2013-09-17 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 아미드계 글루카곤 슈퍼패밀리 펩티드 프로드러그
KR101337797B1 (ko) 2010-07-14 2013-12-06 한미사이언스 주식회사 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 액상 제제
KR101382593B1 (ko) * 2010-07-21 2014-04-10 한미사이언스 주식회사 신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물
CN102576513B (zh) 2010-09-06 2014-11-12 松下电器产业株式会社 显示装置及其控制方法
CN101974077A (zh) 2010-09-15 2011-02-16 南京瑞年天平医药科技有限公司 一种新颖的多肽化合物
KR101303388B1 (ko) 2010-10-26 2013-09-03 한미사이언스 주식회사 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제
KR101767570B1 (ko) 2010-10-26 2017-08-14 한미사이언스 주식회사 항 비만 펩타이드의 지속형 결합체
CN102010473A (zh) 2010-11-10 2011-04-13 曹鹏 重组胃泌酸调节素融合蛋白及其制备和应用
JP2014501762A (ja) 2010-12-22 2014-01-23 マルケイディア バイオテック， インコーポレイテッド Ｇｉｐおよびｇｌｐ−１受容体活性グルカゴン系ペプチドにより代謝障害および肥満を治療するための方法
JP6118500B2 (ja) 2011-02-28 2017-04-19 ローム アンド ハース エレクトロニック マテリアルズ エルエルシーＲｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ＬＬＣ フォトレジスト組成物、およびフォトリソグラフィパターンを形成する方法
KR101161526B1 (ko) 2011-05-16 2012-07-02 숭실대학교산학협력단 연료전지용 촉매전극을 위한 코어/쉘 구조의 나노 지지체 및 그 제조방법
ES2692187T3 (es) 2011-06-10 2018-11-30 Hanmi Science Co., Ltd. Nuevos derivados de oxintomodulina y composición farmacéutica para el tratamiento de obesidad que lo comprende
EP2721062B1 (en) 2011-06-17 2018-11-14 Hanmi Science Co., Ltd. A conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof
BR112013032717A2 (pt) 2011-06-22 2017-01-24 Univ Indiana Res & Tech Corp coagonistas do receptor de glucagon/glp-1
KR101665009B1 (ko) 2012-03-09 2016-10-11 한미사이언스 주식회사 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
PE20142405A1 (es) 2012-04-19 2015-01-25 Opko Biolog Ltd Variantes de oxintomodulina de accion prolongada y metodos de produccion de las mismas
EP2864351B1 (en) 2012-06-21 2016-08-10 Indiana University Research and Technology Corporation Glucagon analogs exhibiting gip receptor activity
KR101373563B1 (ko) 2012-07-25 2014-03-12 전북대학교산학협력단 Ｔｏｆ-ｍｒａ를 이용한 혈류특성 및 ｍｒ-신호강도구배(전단율) 유도방법
KR101968344B1 (ko) 2012-07-25 2019-04-12 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 고지혈증 치료용 조성물
AR092873A1 (es) 2012-09-26 2015-05-06 Cadila Healthcare Ltd Peptidos como agonistas triples de los receptores de gip, glp-1 y glugagon
KR101993393B1 (ko) 2012-11-06 2019-10-01 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 당뇨병 또는 비만성 당뇨병 치료용 조성물
ES2748158T3 (es) 2012-11-06 2020-03-13 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulación líquida de conjugado de proteínas que comprende la oxintomodulina y un fragmento de inmunoglobulina
JP6137046B2 (ja) 2014-05-09 2017-05-31 信越化学工業株式会社 単量体、高分子化合物、レジスト材料及びパターン形成方法
TWI772252B (zh) 2014-09-16 2022-08-01 南韓商韓美藥品股份有限公司 長效glp-1/高血糖素受體雙促效劑治療非酒精性脂肝疾病之用途
WO2019171352A2 (en) 2018-03-08 2019-09-12 Janssen Pharmaceutica Nv Methods of treating severe non-diabetic obesity

Also Published As

Publication number Publication date
NZ742400A (en) 2021-05-28
US20170340753A1 (en) 2017-11-30
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TWI519541B (zh) 2016-02-01
AU2018282298A1 (en) 2019-01-17
UA114709C2 (uk) 2017-07-25
KR101591411B1 (ko) 2016-02-05
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MX353402B (es) 2018-01-11
NZ618811A (en) 2016-05-27
AU2012270366A1 (en) 2014-01-16
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CA2838504A1 (en) 2012-12-20
PE20141178A1 (es) 2014-09-12
CN109306015A (zh) 2019-02-05
US20140212440A1 (en) 2014-07-31
CY1121255T1 (el) 2020-05-29
RU2013153198A (ru) 2015-07-27
SI2721062T1 (sl) 2019-03-29
EP2721062A1 (en) 2014-04-23
MX2013014779A (es) 2014-06-23
IL257928B (en) 2020-02-27
US20190321485A1 (en) 2019-10-24
HRP20190265T1 (hr) 2019-04-05
IL229759A (en) 2017-08-31
JP2014518209A (ja) 2014-07-28
UA125895C2 (uk) 2022-07-06
AR086969A1 (es) 2014-02-05
AR125914A2 (es) 2023-08-23
SG10201605006XA (en) 2016-08-30
RU2016147505A (ru) 2018-10-24
EP2721062B1 (en) 2018-11-14
BR112013032375A2 (pt) 2016-11-22
PT2721062T (pt) 2019-02-12
RS58606B1 (sr) 2019-05-31
US11872283B2 (en) 2024-01-16
RU2016147505A3 (pt) 2020-04-08
AU2017202672A1 (en) 2017-05-11
JP6345216B2 (ja) 2018-06-20
CL2013003619A1 (es) 2014-05-30
CN103732616B (zh) 2018-08-17
KR20140133493A (ko) 2014-11-19
AU2012270366C1 (en) 2017-07-13
PE20230404A1 (es) 2023-03-07
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JP6038905B2 (ja) 2016-12-07
TWI601744B (zh) 2017-10-11
CN109306015B (zh) 2022-04-26
PH12018501119A1 (en) 2019-02-04
ES2882520T3 (es) 2021-12-02
EP3502129A1 (en) 2019-06-26
JP2017071609A (ja) 2017-04-13
DK2721062T3 (en) 2019-02-25
IL229759A0 (en) 2014-01-30
SG195275A1 (en) 2013-12-30
PL2721062T3 (pl) 2019-05-31
EP2721062A4 (en) 2014-11-12
ZA201309013B (en) 2014-11-26
MY164680A (en) 2018-01-30
KR20120139579A (ko) 2012-12-27
IL272345B (en) 2021-01-31
RU2607365C2 (ru) 2017-01-10
IL245556B (en) 2018-03-29
TW201506037A (zh) 2015-02-16
NZ733478A (en) 2020-06-26
IL272345A (en) 2020-03-31
WO2012173422A9 (en) 2013-03-14
NZ718999A (en) 2017-07-28

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Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 15/06/2012, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO.