BR122021003984B1 - Composição para a prevenção ou tratamento de diabetes, complicações diabéticas ou diabesidade, uso da composição para a preparação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de diabetes, complicações diabéticas ou diabesidade - Google Patents
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Abstract
A presente invenção se refere a uma composição para a prevenção ou tratamento de diabetes, complicações diabéticas ou diabesidade, compreendendo um análogo da oxintomodulina como um ingrediente ativo. A invenção também se refere a um método para o tratamento de diabetes, complicações diabéticas ou diabesidade, compreendendo administrar uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um análogo da oxintomodulina a um paciente. O análogo da oxintomodulina tem uma alta capacidade de ativar o receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon, comparado com a oxintomodulina nativa. O análogo de oxintomodulina induz a expansão das células beta e aumenta a secreção de insulina, reduzindo, assim, os níveis de glicose no sangue que foram aumentados devido a uma dieta com alto teor calórico e rica em gordura. O análogo de oxintomodulina induz a diminuição do peso corporal e da ingestão da dieta para aumentar a sensibilidade à insulina e permitir que níveis de glicose no sangue, os quais não são controlados devido à resistência à insulina, sejam mantidos em níveis normais. Assim, o análogo da oxintomodulina pode ser eficazmente usado para prevenir ou tratar a diabetes e doenças afins.
Description
[001] A presente invenção se refere a uma composição para a prevenção ou tratamento de diabetes, complicações diabéticas ou diabesidade, compreendendo um análogo da oxintomodulina como um ingrediente ativo. A invenção também se refere a um método para o tratamento de diabetes, complicações diabéticas ou diabesidade, compreendendo administrar uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um análogo da oxintomodulina a um paciente.
[002] Nos últimos anos, na Coréia, a ingestão de gorduras dos alimentos tem aumentado devido ao crescimento econômico e à ocidentalização de hábitos alimentares e aumentaram as doenças metabólicas tais como hiperlipidemia, obesidade, diabetes, hipertensão, arteriosclerose, e doença do fígado gorduroso, que são causadas pela falta de exercício.
[003] A diabetes é um tipo de doença metabólica em que a secreção de insulina é insuficiente ou funções normais não são realizadas (DeFronzo, 1988). A diabetes é caracterizada pelo aumento dos níveis de glicose no sangue que causa várias condições patológicas e síndromes. No caso da diabetes, a glicose é excretada pela urina. Nos últimos anos, devido a um aumento da obesidade, particularmente obesidade abdominal, a incidência de diabetes aumentou explosivamente.
[004] Em todo o mundo, o número de pacientes diabéticos foi estimado em 170 milhões em 2000 e deve chegar a 370 milhões no ano de 2030. No entanto, um relatório recente mostrou que o número de diabetes já atingiu cerca de 350 milhões em todo o mundo no ano de 2008 (Danaei et al., 2011), e portanto, é muito maior do que o esperado. Foi relatado que aproximadamente 80% ou mais dos doentes diabéticos do tipo 2 eram obesos, ao passo que apenas menos de 10% dos pacientes eram diabéticos obesos (Harris et al,. 1987). Esta relação entre a diabetes e a obesidade se dá porque os ácidos graxos são acumulados em células beta ou tecidos sensíveis a insulina, tais como os rins, o fígado ou o coração, devido à secreção irregular de adipocinas e ácidos graxos livres, resultando em lipotoxicidade.
[005] Se uma condição hiperglicêmica crônica não é adequadamente tratada, ela conduz a várias condições patológicas no organismo. Normalmente, ela aumenta o risco de retinopatia, insuficiência renal, neuropatia, acidente vascular cerebral causada pelo distúrbio vascular, doenças renais ou cardíacas, úlcera do pé diabético, e doenças cardiovasculares. Tais complicações reduzem a qualidade de vida, e eventualmente, reduzem a expectativa de vida de pacientes diabéticos. Assim, para evitar complicações diabéticas, o controle eficaz dos níveis de glicose no sangue é essencial.
[006] Os métodos atuais que são usados para controlar os níveis de glicose no sangue incluem a modificação de estilo de vida (terapia com dieta ou terapia com exercícios) e terapia com medicamentos. No entanto, a terapia com dieta ou terapia com exercício é difícil de controlar e aplicar com rigor, e o efeito terapêutico destas também é insuficiente. Assim, a maioria dos pacientes diabéticos depende da modificação do estilo de vida, juntamente com o controle do nível de glicose no sangue através de fármacos tais como a insulina, estimuladores da secreção de insulina, potenciadores da sensibilidade à insulina, e agentes redutores do nível de glicose no sangue.
[007] A insulina produzida por processos de recombinação é um medicamento essencial para pacientes diabéticos tipo 1 e pacientes diabéticos tipo 2 cujos níveis de glicose no sangue não são controlados, e é vantajoso para controlar os níveis de glicose no sangue. No entanto, ela tem falhas, incluindo um sentimento de temor por agulhas hipodérmicas, dificuldade de administração, risco de hipoglicemia, e um aumento de peso.
[008] Meglitinidas que são estimuladores de secreção de insulina, são fármacos que possuem um efeito muito rápido, são ingeridos antes das refeições, e incluem NovoNorm (repaglinida), Fastic (nateglinida), Glufast (mitiglinida), etc. Os potenciadores da sensibilidade à insulina são caracterizados pelo fato de provocar pouca ou nenhuma hipoglicemia quando são ingeridos sozinhos, e os exemplos destes incluem metformina, o qual é um fármaco de biguanida, fármacos de tiazolidinodiona tais como AVANDIA (rosiglitazona), Actos (pioglitazona), etc.
[009] Os fármacos que foram recentemente desenvolvidos incluem agonistas GLP-1 desenvolvidos com base na ação do peptídeo 1 semelhante ao glucagon, um hormônio que estimula a secreção de insulina, e exemplos de agonistas GLP-1 incluem exenatida e liraglutida. Além disso, os inibidores de DPP-4 são também novos fármacos recentemente desenvolvidos que inibem a atividade da DPP-4 (dipeptidil-peptidase-4), uma enzima que inativa rapidamente GLP-1, e um exemplo típico destes fármacos inclui Januvia (sitagliptina).
[010] No entanto, estes fármacos foram relatados como apresentando efeitos colaterais, incluindo hepatotoxicidade, distúrbio gastrointestinal, doença cardiovascular e carcinogênese, e o custo anual para o tratamento de diabetes também é elevado e, portanto, é um obstáculo no tratamento de diabetes. Na verdade, o custo associado ao pré-diabetes e diabetes atingiu aproximadamente 200 trilhões de Wons (Wons = unidade monetária da Coreia do Sul) nos EUA no ano de 2007 (Dall et al., 2010), e os custos associados à obesidade também atingiram 150 trilhões de Wons (Wons = unidade monetária da Coreia do Sul) nos EUA no ano de 2008 (Finkelstein et al., 2009).
[011] Assim, há uma necessidade urgente pelo desenvolvimento de fármacos que possam ser usados para tratar diabetes e diabesidade através da redução do peso e redução eficaz dos níveis de glicose no sangue e, ao mesmo tempo, possuir menos efeitos colaterais.
[012] Como uma candidata para tais fármacos, a oxintomodulina recebeu recentemente atenção. A oxintomodulina é produzida a partir do pré-glucagon, um precursor, e é um peptídeo que pode se ligar ao peptídeo 1 semelhante ao glucagon (GLP-1) e ao receptor de glucagon para executar uma função dupla. Devido a estas características, a oxintomodulina foi estudada para diversos fins, incluindo o tratamento da obesidade, diabetes, hiperlipidemia e doença do fígado gorduroso.
[013] No entanto, a oxintomodulina tem um problema na medida em que deve ser administrada em uma dose elevada, porque tem um tempo de meia- vida curto in vivo e a sua atividade não é suficiente para o uso no tratamento da obesidade, diabetes, hiperlipidemia e doença do fígado gorduroso.
[014] Os presentes inventores desenvolveram um análogo da oxintomodulina apresentando um aumento da atividade em comparação com a oxintomodulina nativa e descobriram que o análogo da oxintomodulina reduz os níveis de glicose no sangue, melhora a tolerância à glicose e aumenta a proporção da hemoglobina glicosilada (HbA1c) em um modelo de camundongo induzido por dieta de alta caloria (HF DIO) e um modelo de camundongo diabético (db / db) induzido por uma mutação no receptor da leptina, indicando que o análogo da oxintomodulina pode ser eficazmente usado para o tratamento de diabetes, complicações diabéticas e diabesidade, completando assim a presente invenção.
[015] É um objetivo da presente invenção fornecer uma composição para a prevenção ou tratamento de diabetes, complicações diabéticas e diabesidade, compreendendo um análogo da oxintomodulina como um ingrediente ativo.
[016] Outro objetivo da presente invenção consiste em fornecer um método para a prevenção ou tratamento de diabetes, complicações diabéticas e diabesidade, compreendendo administrar uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um análogo da oxintomodulina a um paciente.
[017] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer o uso do análogo da oxintomodulina da presente invenção na preparação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de diabetes, complicações diabéticas e diabesidade.
[018] O análogo da oxintomodulina da presente invenção tem uma elevada atividade para ativar o receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon comparado com a oxintomodulina nativa. Além disso, o análogo da oxintomodulina da presente invenção induz a expansão das células beta e aumenta a secreção de insulina, reduzindo assim os níveis de glicose no sangue que foram aumentados por um alto teor calórico e dieta rica em gorduras. Além disso, o análogo da oxintomodulina induz reduções no peso corporal e ingestão de dieta para melhorar a sensibilidade à insulina e permitir que os níveis de glicose no sangue, que não são controlados devido à resistência à insulina, sejam mantidos em níveis normais. Assim, o análogo da oxintomodulina pode ser usado eficazmente para a prevenção ou tratamento de diabetes e doenças afins.
[019] A FIG. 1 é um diagrama gráfico mostrando a alteração no peso corporal causado pela administração de um análogo da oxintomodulina de ação prolongada em camundongos com obesidade induzida por dieta rica em gorduras durante um longo período de tempo (26 semanas). A alteração no peso corporal foi expressa como uma porcentagem relativa ao peso do corpo medido no dia 0.
[020] FIG. 2 é um diagrama gráfico mostrando uma AUC (área sob a curva -area under curve) para a mudança no nível de glicose no sangue causado pela administração de um análogo da oxintomodulina de ação prolongada em camundongos com obesidade induzida por dieta rica em gorduras durante um longo período de tempo (26 semanas).
[021] A FIG. 3 é um diagrama gráfico mostrando a variação de 4 semanas no peso corporal causada pela administração de 4 semanas de um análogo da oxintomodulina de ação prolongada em um modelo de camundongo com diabetes induzida por uma mutação no receptor da leptina.
[022] A FIG. 4 é um diagrama gráfico mostrando uma AUC (área sob a curva-area under curve) para a mudança no nível da glicose no sangue causado pela administração de 4 semanas de um análogo da oxintomodulina de ação prolongada em um modelo de camundongo com diabetes induzida por uma mutação no receptor da leptina.
[023] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma composição para a prevenção ou tratamento de diabetes, complicações diabéticas e diabesidade compreendendo um análogo da oxintomodulina como um ingrediente ativo.
[024] Tal como aqui utilizado, o termo "oxintomodulina" se refere a um peptídeo produzido a partir do pré-glucagon o qual é um precursor do glucagon. Na presente invenção, a oxintomodulina pretende incluir a oxintomodulina nativa e seus precursores, análogos, fragmentos e variantes. De um modo preferido, a oxintomodulina possui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA).
[025] Tal como aqui utilizado, o termo "variante da oxintomodulina" é um peptídeo que tem um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes daqueles da sequência de aminoácidos da oxintomodulina nativa e possui uma função de ativação de receptores do GLP-1 e glucagon. A variante da oxintomodulina pode ser preparada por qualquer um dentre a substituição, adição, deleção, alteração, ou uma combinação destas de alguns aminoácidos da oxintomodulina nativa.
[026] Tal como aqui utilizado, o termo "análogo da oxintomodulina" se refere a um peptídeo, derivado de peptídeo ou peptídeo mimético, sendo preparado através da adição, deleção ou substituição de alguns aminoácidos da oxintomodulina nativa e pode ativar altamente o receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon, em comparação com a oxintomodulina nativa.
[027] Tal como aqui utilizado, o termo "fragmento da oxintomodulina" se refere a um fragmento possuindo uma adição ou deleção de um ou mais aminoácidos na extremidade do terminal amino ou carboxila da oxintomodulina nativa, em que os aminoácidos adicionados podem também ser aminoácidos de ocorrência não natural (por ex., aminoácido do tipo D). Estes fragmentos da oxintomodulina tem a função de regular os níveis de glicose no sangue in vivo.
[028] Os métodos para a preparação da variante da oxintomodulina, análogo e o fragmento podem ser usados sozinhos ou em combinação. Por exemplo, a presente invenção inclui um peptídeo que possui um ou mais aminoácidos diferentes daqueles do peptídeo nativo, possui resíduos de aminoácidos desaminados na extremidade N-terminal e possui uma função de ativação do receptor de GLP-1 e do receptor de glucagon.
[029] Os aminoácidos mencionados aqui são abreviados de acordo com as regras de nomenclatura da IUPAC-IUB como a seguir: Alanina A; Arginina R; Asparagina N; Ácido aspártico D; Cisteína C; Ácido glutâmico E; Glutamina Q; Glicina G; Histidina H; Isoleucina I; Leucina L; Lisina K; Metionina M; Fenilalanina F Prolina P; Serina S; Treonina T; Triptofano W; Tirosina Y; Valina V.
[030] Na presente invenção, o análogo da oxintomodulina engloba qualquer peptídeo que é preparado por substituição, adição, deleção ou modificação pós-tradução (por exemplo, a metilação, acilação, ubiquitinação, ou ligação covalente intramolecular) de aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e pode ativar os receptores de GLP-1 e de glucagon. Após a substituição ou adição de aminoácidos, podem ser usados não apenas 20 aminoácidos normalmente encontrados em proteínas humanas, mas também aminoácidos atípicos ou de ocorrência não natural. As fontes comerciais de aminoácidos atípicos incluem Sigma-Aldrich, ChemPep Inc., e Genzyme Pharmaceuticals. Os peptídeos incluindo estas sequências de aminoácidos e de peptídeos atípicos podem ser sintetizados e adquiridos de fornecedores comerciais, por exemplo, American Peptide Company ou Bachem (USA) ou Anygen (Coreia).
[031] Em uma modalidade específica da presente invenção, o análogo da oxintomodulina da presente invenção é um novo peptídeo incluindo a sequência de aminoácidos da seguinte fórmula 1:
[032] R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14- X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2 (SEQ ID NO: 54)
[033] onde
[034] R1 é histidina, desamino-histidil, dimetil-histidil (N-dimetil-histidil), beta-hidróxi-imidazopropionil, 4-imidazoacetil, beta-carbóxi-imidazopropionil ou tirosina;
[035] X1 é Aib (ácido amino-isobutírico), d-alanina, glicina, Sar (N-metil- glicina), serina ou d-serina;
[036] X2 é ácido glutâmico ou glutamina;
[037] X3 é leucina ou tirosina;
[038] X4 é serina ou alanina;
[039] X5 é lisina ou arginina;
[040] X6 é glutamina ou tirosina;
[041] X7 é leucina ou metionina;
[042] X8 é ácido aspártico ou ácido glutâmico;
[043] X9 é ácido glutâmico, serina ou alfa-metil-ácido glutâmico ou é deletado;
[044] X10 é glutamina, ácido glutâmico, lisina, arginina ou serina ou é deletado;
[045] X11 é alanina, arginina ou valina ou é deletado;
[046] X12 é alanina, arginina, serina ou valina ou é deletado;
[047] X13 é lisina, glutamina, arginina ou alfa-metil-ácido glutâmico ou é deletado;
[048] X14 é ácido aspártico, ácido glutâmico ou leucina ou é deletado;
[049] X15 é fenilalanina ou é deletado;
[050] X16 é isoleucina ou valina ou é deletado;
[051] X17 é alanina, cisteína, ácido glutâmico, lisina, glutamina ou alfa- metil-ácido glutâmico ou é deletado;
[052] X18 é triptofano ou é deletado;
[053] X19 é alanina, isoleucina, leucina, serina ou valina ou é deletado;
[054] X20 é alanina, lisina, metionina, glutamina ou arginina ou é deletado;
[055] X21 é asparagina ou é deletado;
[056] X22 é alanina, glicina ou treonina ou é deletado;
[057] X23 é cisteína ou lisina ou é deletado;
[058] X24 é um peptídeo possuindo 2 a 10 aminoácidos consistindo em uma combinação de alanina, glicina e serina ou é deletado; e
[059] R2 é KRNRNNIA (SEQ ID NO: 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 36), GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 37), HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO: 38), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO: 39), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO: 40) ou é deletado (com a exceção do caso em que a sequência de aminoácidos da fórmula 1 é idêntica à da SEQ ID NO: 1).
[060] A fim de aumentar a atividade da oxintomodulina do tipo selvagem para o receptor do glucagon e o receptor de GLP-1, o análogo da oxintomodulina da presente invenção pode ser substituído por 4-imidazoacetil obtido por deleção do carbono alfa da histidina na posição 1 da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, desamino-histidil obtido por deleção do grupo amino N-terminal, dimetil-histidil (N-dimetil-histidil) obtido por modificação do grupo amino N-terminal por dois grupos metil, beta-hidróxi-imidazopropionil obtido por substituição do grupo amino N-terminal pelo grupo hidroxila, ou grupo beta-carbóxi imidazopropionila obtido pela substituição do grupo amino N-terminal pelo grupo carboxila. Além disso, a região de ligação ao receptor de GLP-1 pode ser substituída por aminoácidos que melhoram as ligações hidrofóbicas e iônicas ou uma combinação destes. Além disso, uma porção da sequência da oxintomodulina pode ser substituída pela sequência de aminoácidos da GLP-1 ou Exendina-4 para aumentar a atividade do receptor de GLP-1.
[061] Além disso, uma porção da sequência da oxintomodulina pode ser substituída por uma sequência que aumenta a hélice alfa. Preferencialmente, os aminoácidos nas posições 10, 14, 16, 20, 24 e 28 da sequência de aminoácidos da fórmula 1 podem ser substituídos pelos aminoácidos ou derivados de aminoácidos consistindo em Tyr(4-Me), Phe, Phe(4-Me), Phe(4- Cl), Phe(4-CN), Phe(4-NO2), Phe(4-NH2), Phg, Pal, Nal, Ala(2-tienil) e Ala(benzotienil) que são conhecidos por estabilizar a hélice alfa, e o tipo e número de aminoácidos de estabilização da hélice alfa ou derivados de aminoácidos a serem inseridos não estão limitados. Preferencialmente, os aminoácidos nas posições 10 e 14, 12 e 16, 16 e 20, 20 e 24, e 24 e 28 da sequência de aminoácidos podem também ser substituídos pelo ácido glutâmico ou lisina, de modo a formar anéis, e o número de anéis a ser inserido não está limitado. Mais preferencialmente, o análogo da oxintomodulina pode ter uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das seguintes fórmulas 2 a 6.
[062] Em uma modalidade específica, o análogo da oxintomodulina da presente invenção é um novo peptídeo incluindo a sequência de aminoácidos da seguinte fórmula 2, obtido por substituição da sequência de aminoácidos da oxintomodulina pela sequência da exendina ou GLP-1:
[063] R1-A-R3 (SEQ ID NO: 55)
[064] Em outra modalidade específica, o análogo da oxintomodulina da presente invenção é um novo peptídeo incluindo a sequência de aminoácidos da seguinte fórmula 3, o qual é preparado por ligação de uma porção da sequência de aminoácidos da oxintomodulina e uma porção da sequência de aminoácidos da exendina ou de GLP-1 através de um ligando de aminoácido adequado:
[065] R1-B-C-R4 (SEQ ID NO: 56)
[066] Em ainda outra modalidade específica, o análogo da oxintomodulina da presente invenção é um novo peptídeo incluindo a sequência de aminoácidos da seguinte fórmula 4, em que uma porção da sequência de aminoácidos da oxintomodulina é substituída por um aminoácido que melhora a ligação hidrofóbica ao receptor de GLP-1. Por exemplo, é um peptídeo em que Leu na posição 26 é substituído pelo aminoácido lle ou Val, que aumenta a hidrofobicidade.
[067] R1-SQGTFTSDYSKYLD-D1-D2-D3-D4-D5-LFVQW-D6-D7-N-D8-R3 (SEQ ID NO: 57)
[068] Em ainda outra modalidade específica, o análogo da oxintomodulina da presente invenção é um novo peptídeo incluindo a sequência de aminoácidos da seguinte fórmula 5, em que uma porção da sequência de aminoácidos da oxintomodulina nativa é deletada, adicionada ou substituída por outros aminoácidos a fim de aumentar as capacidades da oxintomodulina nativa para ativar o receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon:
[069] R1-E1-QGTFTSDYSKYLD-E2-E3-RA-E4-E5-FV-E6-WLMNT-E7-R5 (SEQ ID NO: 58)
[070] Nas fórmulas 2 a 5, R1 é como descrito na fórmula 1;
[071] A é selecionado a partir do grupo consistindo em SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT (SEQ ID NO: 41), SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT (SEQ ID NO: 42), SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT (SEQ ID NO: 43), GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 44), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 45), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA (SEQ ID NO: 46), e SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG (SEQ ID NO: 47);
[072] B é selecionado a partir do grupo consistindo em SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT (SEQ ID NO: 41), SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT (SEQ ID NO: 42), SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT (SEQ ID NO: 43), GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 44), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 45), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA (SEQ ID NO: 46), SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG (SEQ ID NO: 47), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEW (SEQ ID NO: 48), e SQGTFTSDYSRYLD (SEQ ID NO: 49);
[073] C é um peptídeo possuindo 2 a 10 aminoácidos consistindo em uma combinação de alanina, glicina e serina;
[074] D1 é serina, ácido glutâmico ou arginina;
[075] D2 é arginina, ácido glutâmico ou serina;
[076] D3 é arginina, alanina ou valina;
[077] D4 é arginina, valina ou serina;
[078] D5 é glutamina, arginina ou lisina;
[079] D6 é isoleucina, valina ou serina;
[080] D7 é metionina, arginina ou glutamina;
[081] D8 é treonina, glicina ou alanina;
[082] E1 é serina, Aib, Sar, d-alanina ou d-serina;
[083] E2 é serina ou ácido glutâmico;
[084] E3 é arginina ou lisina;
[085] E4 é glutamina ou lisina;
[086] E5 é ácido aspártico ou ácido glutâmico;
[087] E6 é glutamina, cisteína ou lisina;
[088] E7 é cisteína ou lisina ou é deletado;
[089] R3 é KRNRNNIA (SEQ ID NO: 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 36) ou GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 37);
[090] R4 é HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO: 38), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO: 39) ou HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO: 40); e
[091] R5 é KRNRNNIA (SEQ ID NO: 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 36) ou GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 37) ou é deletado (com a exceção do caso em que as sequências de aminoácidos das fórmulas 2 a 5 são idênticas às da SEQ ID NO: 1).
[092] Preferencialmente, o análogo da oxintomodulina da presente invenção pode ser um novo peptídeo com a seguinte fórmula 6:
[093] R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14- X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2 (SEQ ID NO: 59)
[094] onde R1 é histidina, desamino-histidil, 4-imidazoacetil ou tirosina;
[095] X1 é Aib (ácido aminoisobutírico), glicina, serina ou d-serina;
[096] X2 é ácido glutâmico ou glutamina;
[097] X3 é leucina ou tirosina;
[098] X4 é serina ou alanina;
[099] X5 é lisina ou arginina;
[100] X6 é glutamina ou tirosina;
[101] X7 é leucina ou metionina;
[102] X8 é ácido aspártico ou ácido glutâmico;
[103] X9 é ácido glutâmico ou alfa-metil-ácido glutâmico ou é deletado;
[104] X10 é glutamina, ácido glutâmico, lisina ou arginina ou é deletado;
[105] X11 é alanina ou arginina ou é deletado;
[106] X12 é alanina ou valina ou é deletado;
[107] X13 é lisina, glutamina, arginina ou alfa-metil-ácido glutâmico ou é deletado;
[108] X14 é ácido aspártico, ácido glutâmico ou leucina ou é deletado;
[109] X15 é fenilalanina ou é deletado;
[110] X16 é isoleucina ou valina ou é deletado;
[111] X17 é alanina, cisteína, ácido glutâmico, glutamina ou alfa-metil- ácido glutâmico ou é deletado;
[112] X18 é triptofano ou é deletado;
[113] X19 é alanina, isoleucina, leucina ou valina ou é deletado;
[114] X20 é alanina, lisina, metionina ou arginina ou é deletado;
[115] X21 é asparagina ou é deletado;
[116] X22 é treonina ou é deletado;
[117] X23 é cisteína, lisina ou é deletado;
[118] X24 é um peptídeo com 2 a 10 aminoácidos consistindo de glicina ou é deletado; e
[119] R2 é KRNRNNIA (SEQ ID NO: 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 36), GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 37), HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO: 38), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO: 39) ou HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO: 40) ou é deletado (com a exceção do caso em que a sequência de aminoácidos da fórmula 6 é idêntica à da SEQ ID NO: 1).
[120] Mais preferencialmente, o análogo da oxintomodulina da presente invenção pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em peptídeos da SEQ ID Nos: 2 a 34. Ainda mais preferencialmente, o análogo da oxintomodulina da presente invenção pode ser um análogo da oxintomodulina descrito na Tabela 1 do Exemplo 2-1.
[121] Em um exemplo da presente invenção, os análogos da oxintomodulina possuindo as sequências de aminoácidos da SEQ ID Nos: 2 a 34, respectivamente, foram preparados e foi verificado que os análogos da oxintomodulina mostraram uma excelente capacidade em ativar o receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon em comparação com a oxintomodulina nativa (Exemplo 2). Em outras palavras, pode ser observado a partir dos resultados acima que o análogo da oxintomodulina da presente invenção exibiu excelentes efeitos de prevenção ou tratamento de diabetes, diabesidade e/ou complicações diabéticas em comparação com a oxintomodulina convencional através da ativação do receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon.
[122] Os análogos da oxintomodulina da presente invenção estão presentes sob a forma de conjugados compreendendo vários polímeros a fim de melhorar o efeito terapêutico e tempo de meia-vida in vivo dos análogos.
[123] Os conjugados da presente invenção possuem efeitos de ação mais longa do que a oxintomodulina nativa, e os conjugados de ação prolongada incluem uma oxintomodulina preparada pela modificação, substituição, adição ou deleção de aminoácidos da oxintomodulina nativa, uma oxintomodulina conjugada com um polímero biodegradável, tal como polietilenoglicol (PEG), uma oxintomodulina conjugada com uma albumina, anticorpo, elastina, fibronectina ou polissacarídeo tal como quitina ou a uma proteína de longa duração tal como um fragmento de imunoglobulina, uma oxintomodulina conjugada com um ácido graxo possuindo a habilidade de se ligar à albumina in vivo, ou uma oxintomodulina encapsulada em nanopartículas biodegradáveis, e o tipo de conjugado de ação prolongada o qual é usado na presente invenção não está limitado.
[124] Preferencialmente, o conjugado é um conjugado em que um análogo da oxintomodulina possuindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em sequências de aminoácidos da SEQ ID NOS: 2 a 34 é ligada a uma região Fc da imunoglobulina através de um polímero não- peptidil.
[125] A região Fc da imunoglobulina é um polipeptídeo biodegradável o qual é metabolizado in vivo, e assim, é seguro como um veículo para um fármaco. A região Fc da imunoglobulina tem um peso molecular baixo em relação à molécula de imunoglobulina inteira, e assim é vantajosa em termos de preparação, purificação e o rendimento de conjugados. Além disso, uma vez que a sequência de aminoácidos difere entre os anticorpos, a porção Fab mostrando grande não homogeneidade é removida, e assim, a homogeneidade do material pode ser aumentada e a possibilidade de induzir a antigenicidade do sangue também pode ser reduzida.
[126] Tal como aqui utilizado, o termo "região Fc da imunoglobulina" se refere a uma proteína que contém a região constante de cadeia pesada 2 (CH2) e região constante de cadeia pesada 3 (CH3) de uma imunoglobulina, excluindo as regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve, a região constante de cadeia pesada 1 (CH1) e a região constante de cadeia leve 1 (CL1) da imunoglobulina. Pode ainda incluir uma região de dobra na região constante de cadeia pesada. Além disso, a região Fc da imunoglobulina da presente invenção pode ser uma região Fc expandida incluindo parte ou a totalidade da região constante de cadeia pesada (CH1) e/ou a região constante de cadeia leve 1 (CL1), exceto para as regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada, uma vez que tem um efeito que é substancialmente igual ou melhor do que a proteína nativa. Além disso, a região Fc da imunoglobulina pode ser uma região que tem uma deleção de uma porção de uma sequência de aminoácidos relativamente longa correspondente ao CH2 e/ou CH3. Especificamente, a região Fc da imunoglobulina da presente invenção pode compreender 1) um domínio CH1, um domínio CH2, um domínio CH3 e um domínio CH4, 2) um domínio CH1 e um domínio CH2, 3) um domínio CH1 e um domínio CH3, 4) um domínio CH2 e um domínio CH3, 5) uma combinação de um ou mais domínios e uma região de dobra da imunoglobulina (ou uma porção da região de dobra), ou 6) um dímero de cada domínio das regiões constantes de cadeia pesada e a região constante de cadeia leve.
[127] A região Fc da imunoglobulina da presente invenção inclui uma sequência de aminoácidos nativa, e um derivado de sequência (mutante) da mesma. Tal como aqui utilizado, o termo "derivado de sequência de aminoácidos" se refere a uma sequência diferente da sequência de aminoácidos nativa, devido à deleção, inserção, substituição não conservadora ou conservadora ou uma combinação de um ou mais resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos nativa. Por exemplo, no caso de um IgG Fc, resíduos de aminoácidos nas posições 214 a 238, 297 a 299, 318 a 322, ou 327 a 331, que são conhecidos por serem importantes na ligação, podem ser usados como sítios adequados para modificação.
[128] Além disso, outros derivados são possíveis, incluindo aquele que tem uma deleção de uma região capaz de formar uma ligação dissulfeto, ou uma deleção de alguns resíduos de aminoácidos na extremidade N-terminal de Fc nativa ou uma adição de um resíduo de metionina na extremidade N- terminal de Fc nativa. Além disso, para remover funções efetoras, uma deleção pode ocorrer em um sítio de ligação ao complemento, tal como um sítio de ligação C1q e um sítio ADCC (citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos). As técnicas de preparação de tais derivados de sequência da região Fc da imunoglobulina são descritas nas Publicações de Patente Internacional Nos. WO 97/34631, WO 96/32478, etc.
[129] Trocas de aminoácidos em proteínas e peptídeos, as quais geralmente não alteram a atividade de proteínas ou peptídeos, são conhecidas no estado da técnica (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). As trocas que ocorrem mais comumente são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly, em ambas as direções. Além disso, a região Fc pode, se necessário, ser modificada pela fosforilação, sulfatação, acrilação, glicosilação, metilação, farnesilação, acetilação, amidação e afins.
[130] Os derivados de Fc acima descritos mostram atividade biológica idêntica àquela da região Fc da presente invenção ou que tenham uma maior estabilidade estrutural contra o calor, pH ou afins.
[131] Além disso, esta região Fc pode ser obtida a partir de formas nativas isoladas a partir de seres humanos e outros animais, incluindo vacas, cabras, porcos, ratos, coelhos, hamsters, ratos e cobaias, ou podem ser recombinantes ou derivados destes obtidos a partir de células animais transformados ou microrganismos. Aqui, a região Fc pode ser obtida a partir de uma imunoglobulina nativa isolando uma imunoglobulina inteira a partir de um corpo humano ou animal vivo e tratando a imunoglobulina isolada com proteinase. Quando toda a imunoglobulina é tratada com papaína, é clivada em regiões Fab e Fc, e quando toda a imunoglobulina é tratada com pepsina, é clivada em fragmentos pF'c e F(ab)2. Fc ou pF'c pode ser isolada utilizando cromatografia de exclusão por tamanho ou afins. De um modo preferido, uma região Fc de origem humana é uma região Fc da imunoglobulina recombinante obtida a partir de um microrganismo.
[132] Além disso, a região Fc da imunoglobulina pode estar na forma de cadeias de açúcar possuindo cadeias de açúcar nativas ou aumentada ou diminuída em comparação com uma forma nativa, ou podem estar em uma forma desglicosilada. O aumento, diminuição ou remoção das cadeias de açúcar de Fc da imunoglobulina pode ser conseguido por métodos convencionais, tais como um método químico, um método enzimático e um método de engenharia genética usando um microrganismo. A região Fc obtida pela remoção de cadeias de açúcar a partir de Fc mostra uma diminuição significativa na afinidade de ligação à parte C1q e uma diminuição ou perda de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos ou citotoxicidade dependente do complemento, e, portanto, não induz respostas imunes desnecessárias in vivo. A este respeito, uma região Fc da imunoglobulina em uma forma desglicosilada ou aglicosilada pode ser mais adequada para o objetivo da presente invenção, tal como um transportador de fármaco.
[133] Tal como aqui utilizado, o termo "desglicosilação" se refere a remoção de porções de açúcar enzimaticamente a partir de uma região Fc, e o termo "aglicosilação" se refere a uma região Fc não glicosilada produzida em um procarioto, de preferência E. coli.
[134] Enquanto isso, a região Fc da imunoglobulina pode ser derivada de seres humanos ou outros animais, incluindo vacas, cabras, porcos, ratos, coelhos, hamsters, ratos e porquinhos da índia. De preferência, ela é derivada de seres humanos.
[135] Além disso, a região Fc da imunoglobulina pode ser derivada de IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, ou uma combinação ou híbrido destes. Preferencialmente, ela é derivada de IgG ou de IgM, que se encontram entre as proteínas mais abundantes no sangue humano, e mais preferencialmente de IgG conhecido por aumentar a meia-vida de proteínas de ligação ao ligante.
[136] Tal como aqui utilizado, o termo "combinação" significa que os polipeptídeos que codificam regiões Fc de cadeia simples da imunoglobulina da mesma origem são ligados a um polipeptídeo de cadeia simples de uma origem diferente para formar um dímero ou multímero. Especificamente, um dímero ou multímero pode ser formado por dois ou mais fragmentos selecionados a partir do grupo constituído em fragmentos IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc, e IgE Fc.
[137] Tal como aqui utilizado, o termo "híbrido" significa que as sequências correspondendo a dois ou mais fragmentos Fc da imunoglobulina de diferentes origens estão presentes em uma região Fc de cadeia simples da imunoglobulina. Na presente invenção, várias formas de híbridos são possíveis. Em outras palavras, um híbrido constituído por 1 a 4 domínios selecionados a partir do grupo que consiste em CH1, CH2, CH3 e CH4 de IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc e IgD Fc é possível, e pode incluir uma dobra.
[138] Enquanto isso, IgG também pode ser sub-classificado em IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, e na presente invenção, ou uma combinação híbrida destas subclasses também é possível. Preferencialmente, IgG é as subclasses IgG2 e IgG4, e mais preferencialmente, é a região Fc de IgG4 onde faltam substancialmente as funções efetoras, tais como citotoxicidade dependente do complemento (CDC).
[139] Em outras palavras, a região Fc da imunoglobulina mais preferida que é usada como um veículo de fármaco na presente invenção é uma região Fc derivada de IgG4 humana. A região Fc de origem humana é mais preferida do que uma região Fc derivada não-humana, que pode atuar como um antígeno no corpo humano e provocar respostas imunes indesejáveis, tais como a produção de um novo anticorpo contra o antígeno.
[140] Tal como aqui utilizado, o termo polímero não-peptidil se refere a um polímero biocompatível, incluindo duas ou mais unidades de repetição ligadas entre si por qualquer ligação covalente no lugar de uma ligação peptídica. Na presente invenção, o polímero não peptidil pode ser usado intercambiavelmente com o ligante não peptidil.
[141] O polímero não peptidil que pode ser usado na presente invenção pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em polietilenoglicol, polipropilenoglicol, um copolímero de etilenoglicol / propilenoglicol, poliol polioxietilado, poli (álcool vinílico), polissacarídeos, dextrano, poli (vinil-etil-éter), PLA (poli(ácido lático)), PLGA (poli(ácido lático-glicólico), polímeros lipídicos, quitinas, ácido hialurônico, e combinações destes. De preferência, o polímero não peptidil é o polietilenoglicol. Além disso, os seus derivados conhecidos no estado da técnica e derivados que podem ser facilmente preparados por um método conhecido no estado da técnica também são abrangidos pelo escopo da presente invenção.
[142] O ligante peptídico que é usado em uma proteína de fusão obtida por um método de fusão convencional inframe tem desvantagens a medida em que é facilmente clivado pela proteinase in vivo, e assim, um efeito suficiente de aumentar a meia-vida do soro do fármaco ativo por um transportador não pode ser obtido como esperado. No entanto, na presente invenção, o polímero com resistência à proteinase pode ser usado para manter a sua meia-vida no soro do peptídeo, semelhante ao transportador. Portanto, qualquer polímero não peptidil pode ser usado sem limitação na presente invenção, contanto que seja um polímero com a função acima mencionada, isto é, um polímero que possui resistência à proteinase in vivo. O polímero não peptidil tem um peso molecular na faixa de 1 a 100 kDa, e preferencialmente 1 a 20 kDa. O polímero não peptidil da presente invenção, que está ligado à região Fc da imunoglobulina, pode ser um tipo de polímero ou uma combinação de polímeros diferentes.
[143] O polímero não peptidil que é usado na presente invenção pode ter um grupo reativo capaz de se ligar à região Fc da imunoglobulina e a proteína do fármaco. O grupo reativo em ambas as extremidades do polímero não peptidil é preferencialmente selecionado a partir do grupo consistindo em um grupo de aldeído reativo, um grupo de propionaldeído, um grupo de butiraldeído, um grupo de maleimida e um derivado de succinimida.
[144] O derivado de succinimida pode ser propionato de succinimidila, hidróxi-succinimidil, succinimidil-carbóxi-metil, ou carbonato de succinimidila. Em particular, quando o polímero não peptidil possui um grupo aldeído reativo em ambas as extremidades deste, as reações não específicas podem ser minimizadas, e um polipeptídeo fisiologicamente ativo e uma imunoglobulina podem ser eficazmente ligados à ambas as extremidades do polímero não- peptidil, respectivamente. Um produto final gerado por alquilação redutora com uma ligação de aldeído é muito mais estável do que aquele ligado por uma ligação de amida. O grupo aldeído reativo se liga seletivamente a um terminal N a um pH baixo e pode formar uma ligação covalente com um resíduo de lisina a um pH elevado, tal como pH 9,0.
[145] Os grupos reativos em ambas as extremidades do ligante o qual é o polímero não peptidil, podem ser iguais ou diferentes. Por exemplo, o polímero não peptidil pode possuir um grupo maleimida em uma extremidade, e um grupo aldeído, um grupo propionaldeído ou um grupo butiraldeído em outra extremidade. Quando um polietilenoglicol com um grupo hidróxi reativo em ambas as extremidades destes é usado como o polímero não peptidil, o grupo hidróxi pode ser ativado por vários grupos reativos através de reações químicas conhecidas, ou um polietilenoglicol possuindo um grupo reativo modificado disponível comercialmente pode ser usado de modo a preparar o conjugado de longa duração da presente invenção.
[146] O conjugado da presente invenção pode ser aquele em que cada extremidade do polímero não peptidil está ligado à região Fc da imunoglobulina e o grupo amina ou tiol do análogo da oxintomodulina, respectivamente.
[147] Entretanto, na presente invenção, ambas as extremidades do polímero não peptidil incluem grupos reativos aos quais uma região Fc da imunoglobulina e um fármaco de proteína pode ligar. Exemplos dos grupos reativos incluem, mas não estão limitados a um grupo aldeído, um grupo propionaldeído ou um grupo butiraldeído, um grupo maleimida, um derivado de succinimida (propionato de succinimidila, hidroxil-succinimidil, propionato de succinimidila carbóxi-metila ou carbonato de succinimidila) e afins.
[148] Os grupos reativos em ambas as extremidades do ligante o qual é o polímero não peptidil podem ser os mesmos ou diferentes. Por exemplo, o polímero não peptidil pode ter um grupo maleimida em uma extremidade e um grupo aldeído, um grupo propionaldeído ou um grupo butiraldeído na outra extremidade. Por exemplo, quando o polímero não peptidil possui um grupo aldeído reativo em uma extremidade e um grupo maleimida reativa na outra extremidade, as reações não específicas podem ser minimizadas, e um polipeptídeo fisiologicamente ativo e uma imunoglobulina podem ser eficazmente ligados a ambas as extremidades do polímero não peptidil. Em um exemplo da presente invenção, um conjugado foi sintetizado ligando a oxintomodulina ou seu análogo à região Fc da imunoglobulina por meio de uma ligação covalente com o polímero PEG não-peptidil incluindo um grupo propionaldeído sozinho ou um grupo maleimida e um grupo aldeído.
[149] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser usada para a prevenção ou tratamento de diabetes, diabesidade e/ou complicações diabéticas.
[150] Tal como aqui utilizado, o termo "prevenção" se refere a todas as ações que inibem ou retardam o desenvolvimento de uma doença alvo. Especificamente, o termo "prevenção" significa a administração do análogo da oxintomodulina da presente invenção para controlar os níveis de glicose no sangue a níveis normais para assim inibir ou retardar o desenvolvimento da diabetes, complicações diabéticas ou diabesidade.
[151] Tal como aqui utilizado, o termo "tratamento" se refere a todas as ações que aliviam, melhoram ou abrandam os sintomas da doença desenvolvida. Especificamente, o termo "tratamento" significa a administração do análogo da oxintomodulina da presente invenção para manter os níveis de glicose no sangue de forma estável em níveis normais, para assim, aliviar, melhorar ou abrandar as condições de diabetes, diabesidade ou complicações diabéticas.
[152] Tal como aqui utilizado, o termo "diabetes" é um tipo de doença metabólica em que a secreção de insulina é insuficiente ou as funções normais não são realizadas. A diabetes é caracterizada pelo aumento dos níveis de glicose no sangue que causam várias enfermidades e síndromes. No caso da diabetes, a glicose é excretada pela urina.
[153] Tal como aqui utilizado, o termo "diabesidade" se refere a diabetes dependente de condições de obesidade, em especial diabetes do tipo 2, obesidade ou condições que aparecem geralmente em pacientes diabéticos tipo 2. Aproximadamente 80-90% dos pacientes diabéticos tipo 2 tem enfermidades de obesidade e são caracterizados por resistências a insulina. Um exercício adequado, uma terapia de dieta e terapia de fármaco podem impedir a diabesidade e aliviar as condições da diabesidade. Na presente invenção, a diabesidade pode significar um resultado da obesidade.
[154] Tal como aqui utilizado, o termo complicações diabéticas se refere a várias condições patológicas que ocorrem no corpo, devido a condições hiperglicêmicas mantidas por um longo período de tempo. Exemplos de complicações diabéticas incluem, mas não estão limitadas a retinopatia, insuficiência renal, neuropatia, acidente vascular cerebral causado pelo distúrbio vascular, doenças renais ou cardíacas, úlcera do pé diabético, e doenças cardiovasculares. Se uma condição hiperglicêmica é mantida por um longo período de tempo, resulta em várias condições patológicas no organismo. Normalmente, ela aumenta o risco de retinopatia, insuficiência renal, neuropatia, acidente vascular cerebral causado pelo distúrbio vascular, doenças renais ou cardíacas, úlcera do pé diabético, e doenças cardiovasculares. Assim, para evitar complicações diabéticas, o controle eficaz dos níveis de glicose no sangue é essencial.
[155] Consequentemente, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser usada para a prevenção ou tratamento de diabetes, complicações diabéticas ou diabesidade.
[156] Em um exemplo da presente invenção, um conjugado análogo da oxintomodulina de ação prolongada da presente invenção foi preparado por ligação covalente do análogo da oxintomodulina da presente invenção a uma região Fc da imunoglobulina por polietilenoglicol, e o conjugado preparado foi administrado a um modelo de camundongo com obesidade induzida por dieta com alta caloria e um modelo de camundongo com diabetes induzida por uma mutação no receptor da leptina. Como resultado, foi demonstrado que o peso corporal e a ingestão de alimentos do grupo administrado com o conjugado do análogo da oxintomodulina de ação prolongada da presente invenção reduziram significativamente aqueles do modelo animal induzido por obesidade (Fig. 1) e que o nível de glicose no sangue diminuiu significativamente (Fig. 2). Além disso, um conjugado do análogo da oxintomodulina de ação prolongada da presente invenção mostrou um efeito de redução da glicose no sangue igual ou maior do que VICTOZA® comercialmente disponível de ação prolongada do análogo de GLP-1 (FIG. 2).
[157] Em um exemplo da presente invenção, um conjugado do análogo da oxintomodulina de ação prolongada foi preparado por ligação covalente do análogo da oxintomodulina da presente invenção a uma região Fc da imunoglobulina, e o conjugado preparado foi administrado a um modelo de camundongo com diabetes induzida por uma mutação no receptor da leptina. Como resultado, foi verificado que no grupo administrado com o conjugado do análogo da oxintomodulina de ação prolongada, um aumento do peso corporal foi inibido de forma significativa em comparação com o do grupo de controle (FIG. 3), e o nível de glicose no sangue diminuiu significativamente (FIG. 4), e também o conjugado mostrou um efeito de diminuição da glicose no sangue superior em comparação com VICTOZA® comercialmente disponível de ação prolongada do análogo de GLP-1 (FIG. 4).
[158] Em outras palavras, o análogo da oxintomodulina de acordo com a presente invenção funciona para induzir a expansão de células beta in vivo para aumentar a secreção de insulina, melhorando assim a capacidade de controlar os níveis de glicose no sangue. Além disso, o análogo da oxintomodulina de acordo com a presente invenção induz uma diminuição no peso corporal para melhorar a sensibilidade à insulina e impedir o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, incluindo aterosclerose, hiperlipidemia e hipertensão, que podem ser desenvolvidas devido a resistência à insulina. Consequentemente, o análogo da oxintomodulina da presente invenção pode ser eficazmente utilizado como um agente para o tratamento de diabetes, complicações diabéticas e diabesidade. Além disso, o conjugado da presente invenção tem uma elevada capacidade para ativar o receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon, em comparação com a oxintomodulina nativa, e mostra um aumento da meia-vida no sangue in vivo devido à região Fc ligada a este, e assim, a sua atividade pode ser mantida in vivo por um período de tempo prolongado.
[159] A composição da presente invenção pode ser uma composição farmacêutica.
[160] A composição farmacêutica da presente invenção pode ainda compreender um agente farmacêutico que mostra um efeito preventivo ou terapêutico contra a diabetes, complicações diabéticas ou diabesidade. À fim de administrar o análogo da oxintomodulina da presente invenção em combinação com um agente farmacêutico conhecido como um agente terapêutico contra a diabetes, complicações diabéticas ou diabesidade, a composição da presente invenção pode ainda compreender este agente farmacêutico conhecido.
[161] Assim, a composição da presente invenção pode ser usada sozinha ou administrada em combinação com outros fármacos, a fim de prevenir ou tratar a diabetes, complicações diabéticas ou diabesidade.
[162] Tal como aqui utilizado, o termo "administração" significa a introdução de um determinado material em um paciente por qualquer método adequado. O análogo da presente invenção pode ser administrado por qualquer via geral, contanto que possa alcançar um tecido alvo. Especificamente, o análogo da presente invenção pode ser administrado por via intraperitoneal, por via intravenosa, por via intramuscular, por via subcutânea, intradérmica, oral, local, intranasal, intrapulmonar ou intra-retal, mas não está limitado a elas. No entanto, uma vez que o peptídeo é digerido quando é administrado por via oral, a composição oral é preferencialmente formulada de modo a que o ingrediente ativo é revestido ou protegido contra a degradação no estômago. Preferencialmente, a composição da presente invenção pode ser administrada em uma forma injetável. Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada usando qualquer sistema capaz de transportar o ingrediente ativo para as células alvo.
[163] A composição farmacêutica compreendendo o análogo da oxintomodulina da presente invenção pode compreender ainda um veículo farmaceuticamente aceitável. Para a administração oral, os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem um aglutinante, um lubrificante, um desintegrante, um excipiente, um solubilizante, um agente dispersante, um estabilizador, um agente de suspensão, um corante e um agente aromatizante. Para as preparações injetáveis, os transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem um tampão, um conservante, um analgésico, um solubilizante, um agente isotônico, e um estabilizador. Para administração tópica, veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem uma base, um excipiente, um lubrificante, e um conservante. A composição farmacêutica da presente invenção pode ser formulada em várias formas de dosagem usando os transportadores farmaceuticamente aceitáveis acima mencionados. Por exemplo, para administração oral, a composição farmacêutica pode ser formulada na forma de comprimidos, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, wafer ou afins. Para as preparações injetáveis, a composição farmacêutica pode ser fornecida sob a forma de uma ampola de dose unitária ou um recipiente de dosagem múltipla. Além disso, a composição farmacêutica pode também ser formulada em soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas e preparações de liberação sustentada.
[164] Enquanto isso, os exemplos do transportador, excipiente e diluente apropriados para formulação incluem lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, amido, borracha de acácia, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, celulose, metil-celulose, celulose microcristalina, poli(vinil-pirrolidona), água, hidróxi-benzoato de metila, hidróxi- benzoato de propila, talco, estearato de magnésio e óleos minerais. Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode ainda incluir agentes de preenchimento, agentes anti-coagulantes, lubrificantes, agentes molháveis, aromatizantes, conservantes e afins.
[165] A dose da composição farmacêutica da presente invenção é determinada de acordo com o tipo de ingrediente ativo em conjunto com vários fatores, tais como a doença a ser tratada, a via de administração, idade, sexo e peso do paciente, e a gravidade da doença. A composição farmacêutica da presente invenção tem uma meia-vida longa e excelente biodisponibilidade in vivo, e assim, o número e frequência de administração da composição farmacêutica pode ser significativamente reduzida.
[166] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para a prevenção ou tratamento de diabetes, complicações diabéticas ou diabesidade, o método compreendendo a administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz do análogo da oxintomodulina a um paciente.
[167] Aqui, o análogo da oxintomodulina, diabetes, complicações diabéticas e diabesidade são como definidos acima.
[168] Tal como aqui utilizado, o termo "paciente" se refere a um indivíduo com suspeita de ter diabetes, diabesidade ou complicações diabéticas. Especificamente, o termo significa mamíferos, incluindo seres humanos, ratos e animais domésticos, os quais têm ou estão em risco de desenvolver a doença acima. Além disso, o paciente pode ser qualquer paciente que possa ser tratado pelo análogo da oxintomodulina da presente invenção.
[169] O método terapêutico da presente invenção pode compreender a administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz da composição farmacêutica compreendendo o conjugado. A dose diária total da composição pode ser determinada através de uma avaliação médica apropriada por um médico, e a composição pode ser administrada uma vez ou várias vezes. No entanto, tendo em vista a finalidade da presente invenção, a dose terapeuticamente eficaz da composição específica para qualquer doente particular pode variar dependendo de vários fatores bem conhecidos no campo da medicina, incluindo o tipo e grau de resposta a ser alcançado, composições concretas de acordo com a hipótese de outros agentes serem usados com o mesmo ou não, a idade, peso corporal, estado de saúde, do sexo do paciente e da dieta, o tempo e a via de administração, a taxa de secreção da composição, a duração do tratamento, outros fármacos usados em combinação ou coincidente com a composição da presente invenção, e outros fatores conhecidos na área médica.
[170] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece o uso do análogo da oxintomodulina da presente invenção na preparação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de diabetes, complicações diabéticas ou diabesidade.
[171] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método para a preparação do conjugado do análogo da oxintomodulina.
[172] O método de preparação da presente invenção pode compreender as etapas de: (1) ligar covalentemente um polímero não peptidil possuindo um grupo de aldeído, maleimida ou succinimida reativo em ambas as extremidades a um grupo amina ou tiol de um peptídeo do análogo da oxintomodulina (2) separar um conjugado que compreende o peptídeo do análogo da oxintomodulina, possuindo o polímero não peptidil covalentemente ligado a este, em posições diferentes da extremidade do terminal amino, a partir da mistura de reação da etapa (1); e (3) ligação covalente de uma região Fc da imunoglobulina à outra extremidade do polímero não peptidil ligado do conjugado separado, produzindo assim um conjugado peptídico compreendendo a região Fc da imunoglobulina e o peptídeo do análogo da oxintomodulina, ligado a ambas as extremidades do polímero não-peptidil, respectivamente.
[173] Mais especificamente, o método de preparação pode compreender as etapas de: (1) ligar covalentemente um polímero não peptidil, possuindo um grupo de aldeído reativo e um grupo de maleimida reativa em cada extremidade do mesmo, ao resíduo de cisteína de um análogo da oxintomodulina; (2) separar um conjugado compreendendo o análogo da oxintomodulina, possuindo o polímero não peptidil ligado covalentemente ao resíduo de cisteína, a partir da mistura de reação da etapa (1); e (3) ligar covalente uma região Fc da imunoglobulina a outra extremidade do polímero não peptidil ligado do conjugado separado, produzindo assim um conjugado peptídico compreendendo a região Fc da imunoglobulina e o análogo da oxintomodulina, ligado a ambas as extremidades do polímero não-peptidil, respectivamente.
[174] Daqui em diante, a presente invenção será descrita em maior detalhe com referência aos exemplos. Deve ser compreendido, contudo, que estes exemplos são apenas para fins ilustrativos e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção.
[175] Usando uma porção correspondente à ORF (grelha de leitura aberta, open reading frame) do cDNA (OriGene Technologies, Inc. USA) do gene receptor de GLP-1 humano como um modelo, PCR foi realizado utilizando “primers” “reverse e foward”, incluindo um sítio de clivagem HindIII e um sítio de clivagem EcoRI, respectivamente, obtendo assim um produto do PCR.
[176] Forward primer: 5'-CCCGGCCCCCGCGGCCGCTATTCGAAATAC- 3' (SEQ ID NO: 50)
[177] Reverse primer: 5'- GAACGGTCCGGAGGACGTCGACTCTTAAGATAG-3' SEQ ID NO: 51)
[178] O produto de PCR foi clonado no vetor de expressão de célula animal conhecido x0GC/dhfr, construindo assim o vetor recombinante x0GC/GLP-1R.
[179] O vetor recombinante x0GC/GLP-1R foi introduzido em uma linhagem celular CHO DG44, cultivada em meio DMEM/F12 (10% FBS), usando lipofectamina (Invitrogene, USA), para obter um transformante. O transformante foi incubado em um meio seletivo contendo 1 mg/ml de G418 e 10 nM metotraxato, e linhagens de células monoclonais foram selecionadas a partir daí. A seguir, uma linhagem de células mostrando uma boa resposta de cAMP dependente de concentração a GLP-1 foi finalmente selecionada a partir das linhagens celulares monoclonais.
[180] Usando uma porção correspondente à ORF (open reading frame) do cDNA (OriGene Technologies, Inc. USA) do gene receptor de glucagon humano como um modelo, o PCR foi realizado usando primers reverse e foward, incluindo um sítio de clivagem EcoRI e um sítio de clivagem XhoI, respectivamente, obtendo assim um produto do PCR.
[181] Forward primer: 5'- CAGCGACACCGACCGTCCCCCCGTACTTAAGGCC-3' (SEQ ID NO: 52)
[182] Reverse Primer: 5'- CTAACCGACTCTCGGGGAAGACTGAGCTCGCC-3' (SEQ ID NO: 53)
[183] O produto de PCR foi clonado no vetor de expressão de célula animal conhecido x0GC/dhfr, construindo assim o vetor recombinante x0GC/GCGR.
[184] O vetor recombinante x0GC/GCGR foi introduzido em uma linhagem celular CHO DG44, cultivada em meio DMEM/F12 (10% FBS), usando lipofectamina (Invitrogene, USA), para obter um transformante. O transformante foi incubado em um meio seletivo contendo 1 mg/ml de G418 e 10 nM metotraxato, e linhagens de células monoclonais foram selecionadas a partir daí. A seguir, uma linhagem de células mostrando uma boa resposta de cAMP dependente de concentração ao glucagon foi finalmente selecionada a partir das linhagens celulares monoclonais.
[185] A fim de medir as atividades in vitro de análogos da oxintomodulina, os análogos da oxintomodulina possuindo as sequências de aminoácidos mostradas na Tabela 1 abaixo foram sintetizadas. Tabela 1 Análogos da oxintomodulina e oxintomodulina
[186] Na Tabela 1 acima, os aminoácidos indicados pelas letras em negrito indicam a formação do anel, e os aminoácidos indicados por X indicam metil-alfa-ácidos glutâmico que são aminoácidos não nativos. Além disso, CA indica 4-imidazoacetil, DA indica desamino-histidil, e (d)S indica d-serina.
[187] A fim de medir os efeitos dos peptídeos preparados nos Exemplo 2-1 acima, as atividades in vitro dos peptídeos nas células foram medidas usando os transformantes preparados nos Exemplos 1-1 e 1-2.
[188] Cada um dos transformantes foi transformado de modo a expressar cada um dos genes receptores de GLP-1 e receptores do glucagon humano em CHO (ovário de hamster chinês) e foi adequado para medir as atividades de GLP-1 e glucagon. Assim, a atividade de cada um dos análogos da oxintomodulina foi medida usando cada um dos transformantes.
[189] Especificamente, cada um dos transformantes foi subcultivado duas vezes ou três vezes por semana, e as células foram colocadas em cada poço de uma placa de 96 poços a uma densidade de 1 X 105 células/poço e cultivadas por 24 horas.
[190] As células cultivadas foram lavadas com tampão KRB, suspensas em 40 ml de tampão KRB 1 mM contendo IBMX, e em seguida, deixadas em repouso à temperatura ambiente durante 5 minutos. Cada oxintomodulina (SEQ ID NO: 1) e os análogos da oxintomodulina (SEQ ID NOS: 2-6, 8, 10-13, 17, 18, 23-25, 27, 28 e 32-34) foram intensamente diluídos cinco vezes de 1000 nM a 0,02 nM, e 40 ml de cada uma das diluições foram adicionadas às células, que foram depois incubadas em incubadora de CO2 a 37 °C por 1 hora. Em seguida, 20 ml de tampão de lise celular foi adicionado para lisar as células, e a concentração de cAMP em cada um dos lisados celulares foi medida usando um kit de ensaio de cAMP (Molecular Device, USA). A partir dos resultados das medições, os valores EC50 foram calculados e comparados entre si (Tabela 2).
[191] Comparação de atividades in vitro do receptor de GLP-1 e receptor de glucagon entre análogos da oxintomodulina
[192] Como pode ser visto na Tabela 2 acima, os análogos da oxintomodulina mostraram atividades in vitro excelentes do receptor de GLP-1 e do receptor de glucagon em comparação com a oxintomodulina da SEQ ID NO: 1.
[193] A oxintomodulina é conhecida por ter o efeito no tratamento da obesidade, hiperlipidemia, doença do fígado gorduroso ou arteriosclerose através da ativação do receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon. Os análogos da oxintomodulina de acordo com a presente invenção têm uma elevada capacidade para ativar o receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon in vitro, em comparação com a oxintomodulina nativa, sugerindo que estes análogos da oxintomodulina são altamente eficazes no tratamento de diabetes, diabesidade ou complicações diabéticas, em comparação com a oxintomodulina nativa.
[194] De forma a PEGuilar MAL-10K-ALD PEG (NOF., Japão) em um resíduo de cisteína na posição 24 do aminoácido do análogo da oxintomodulina (SEQ ID NO: 23), o análogo da oxintomodulina (SEQ ID NO: 23) e MAL-10K- ALD PEG foram deixados reagir entre si em uma proporção molar de 1: 3 a uma concentração de proteína de 3 mg/ml à temperatura ambiente durante 3 horas. A reação foi realizada em tampão Tris 50 mM (pH 8,0) contendo 1 M de guanidina. Depois de completada a reação, a solução reacional foi aplicada a SOURCE S sob as seguintes condições, purificando assim um análogo da oxintomodulina mono-PEGuilado na cisteína: coluna: SOURCE S, taxa de fluxo: 2,0 ml/min, gradiente: A 0 ->100% 50 min B (A: 20 mM Na-citrato (pH 3,0) + 45% etanol, B: A + 1M KCl).
[195] Em seguida, o análogo da oxintomodulina mono-peguilado purificado (SEQ ID NO: 23) e uma imunoglobulina Fc foram deixados reagir entre si em uma proporção molar de 1: 5 a uma concentração de proteína de 20 mg/ml a 4 °C por 16 horas. A reação foi realizada em tampão de fosfato de potássio 100 mM (pH 6,0) contendo 20 mM de SCB como um agente redutor. Depois de completada a reação, a solução reacional foi aplicada em uma coluna de purificação SOURCE (coluna: SOURCE 15Q, taxa de fluxo: 2,0 ml/min, gradiente: A 0 -> 4% 1 min, B -> 20% 80 min B (A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1M NaCl)) e uma coluna Source ISO (coluna: SOURCE ISO, taxa de fluxo: 2,0 ml/min, gradiente: B 0 -> 100% 100 min A, (A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1,1M AS)), purificando assim um conjugado compreendendo o análogo da oxintomodulina (SEQ ID NO: 23) e a imunoglobulina Fc.
[196] De forma a PEGuilar MAL-10K-ALD PEG em um resíduo de cisteína na posição 30 da sequência de aminoácido do análogo da oxintomodulina (SEQ ID NO: 25), o análogo da oxintomodulina (SEQ ID NO: 25) e MAL-10K- ALD PEG foram deixados reagir entre si em uma proporção molar de 1:3 a uma concentração de proteína de 3 mg/ml à temperatura ambiente durante 3 horas. A reação foi realizada em tampão Tris 50 mM (pH 8,0) contendo 1 M de guanidina. Depois de completada a reação, a solução reacional foi aplicada a SOURCE S sob as seguintes condições, purificando assim um análogo da oxintomodulina mono-PEGuilado na cisteína: coluna: SOURCE S, taxa de fluxo: 2,0 ml/min, gradiente: A 0 ->100% 50 min B (A: 20 mM Na-citrato (pH 3,0) + 45% etanol, B: A + 1M KCl).
[197] Em seguida, o análogo da oxintomodulina mono-peguilado purificado (SEQ ID NO: 25) e uma imunoglobulina Fc foram deixados reagir entre si em uma proporção molar de 1: 5 a uma concentração de proteína de 20 mg/ml a 4 °C por 16 horas. A reação foi realizada em tampão de fosfato de potássio 100 mM (pH 6,0) contendo 20 mM de SCB como um agente redutor. Depois de completada a reação, a solução reacional foi aplicada em uma coluna de purificação SOURCE 15Q (coluna: SOURCE 15Q, taxa de fluxo: 2,0 ml/min, gradiente: A 0 -> 4% 1 min, B -> 20% 80 min B (A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1M NaCl)) e uma coluna Source ISO (coluna: SOURCE ISO, taxa de fluxo: 2,0 ml/min, gradiente: B 0 -> 100% 100 min A, (A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1,1M AS)), purificando assim um conjugado compreendendo o análogo da oxintomodulina (SEQ ID NO: 25) e a imunoglobulina Fc.
[198] De forma a PEGuilar MAL-10K-ALD PEG em um resíduo de cisteína na posição 30 da sequência de aminoácido do análogo da oxintomodulina (SEQ ID NO: 27), o análogo da oxintomodulina (SEQ ID NO: 27) e MAL-10K- ALD PEG foram deixados reagir entre si em uma proporção molar de 1:3 a uma concentração de proteína de 3 mg/ml à temperatura ambiente durante 3 horas. A reação foi realizada em tampão Tris 50 mM (pH 8,0) contendo 1 M de guanidina. Depois de completada a reação, a solução reacional foi aplicada a SOURCE S sob as seguintes condições, obtendo assim um análogo da oxintomodulina mono-PEGuilado na cisteína: coluna: SOURCE S, taxa de fluxo: 2,0 ml/min, gradiente: A 0 ->100% 50 min B (A: 20 mM Na-citrato (pH 3,0) + 45% etanol, B: A + 1M KCl).
[199] Em seguida, o análogo da oxintomodulina mono-peguilado purificado (SEQ ID NO: 27) e uma imunoglobulina Fc foram deixados reagir entre si em uma proporção molar de 1: 5 a uma concentração de proteína de 20 mg/ml a 4 °C por 16 horas. A reação foi realizada em tampão de fosfato de potássio 100 mM (pH 6,0) contendo 20 mM de SCB como um agente redutor. Depois de completada a reação, a solução reacional foi aplicada em uma coluna de purificação SOURCE 15Q (coluna: SOURCE 15Q, taxa de fluxo: 2,0 ml/min, gradiente: A 0 -> 4% 1 min, B -> 20% 80 min B (A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1M NaCl)) e uma coluna Source ISO (coluna: SOURCE ISO, taxa de fluxo: 2,0 ml/min, gradiente: B 0 -> 100% 100 min A, (A: 20mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A + 1,1M AS)), purificando assim um conjugado compreendendo o análogo da oxintomodulina (SEQ ID NO: 27) e a imunoglobulina Fc..
[200] Camundongos com 6 semanas (C57BL/6, 120-130g) foram comprados da OrientBIO (Korea). Os camundongos comprados C57BL/ 6 são animais amplamente usados em estudos sobre a obesidade e a diabetes, a obesidade, porque pode ser relativamente facilmente induzida por dieta de elevado teor de gordura. Camundongos HF DIO são roedores frequentemente usados em estudos de diabetes, e naturalmente mostram a obesidade e as condições diabéticas semelhantes às dos seres humanos como resultado de transplante de uma dieta de elevado teor de gordura no órgão sem manipulação genética, ao contrário de camundongos db/ db com diabetes induzida por uma mutação no receptor da leptina. Por este motivo, na presente invenção, estes animais foram usados para examinar os efeitos da composição da presente invenção sobre a redução no peso corporal e níveis de glicose no sangue em diabesidade.
[201] Os animais tiveram acesso a uma dieta rica em gordura (60% Kcal da dieta rica em gordura, D12492; Research Diets Inc.) esterilizada por irradiação UV. Além disso, os animais foram permitidos ter acesso às garrafas de água filtrada e água da torneira esterilizada usando UV. Os animais foram mantidos em uma câmara de criação que satisfazem as normas de GLP sob um ciclo de 12 horas de luz / 12 horas de escuro (luminosidade: 6 da manhã as 6 da tarde), e todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com a diretriz padrão para experiências com animais. A administração do medicamento foi iniciada depois de 26 semanas de indução da obesidade, e os animais foram divididos em cinco grupos (n=6) como mostrado na Tabela 3 abaixo. Tabela 3
[202] Especificamente, o grupo 1 (grupo induzido- HF DIO, grupo controle) foi alimentado com ração rica em gordura e administrada por via subcutânea com 5 ml/ kg (volume da injeção) de solução salina tamponada em fosfato de Dulbecco (DPBS, Sigma), uma vez ou mais por semana. Para um teste de tolerância à glicose no sangue, um grupo foi administrado por via subcutânea com a solução salina tamponada em fosfato de Dulbecco (DPBS, Sigma) 24 horas antes do ensaio e mantidos em jejum durante 16 horas. O sangue foi coletado da porção da cauda para medir o nível de glicose em jejum e os níveis de glicose no sangue aos 15 min, 30 min, 60 min, 90 min e 120 min após a administração intra-abdominal de 1 g/ kg de glicose foram medidos.
[203] O grupo 2 (grupo induzido com HF DIO e administrado com 100 nmol/kg de VICTOZA®) foi alimentado com uma dieta rica em gorduras para induzir a obesidade e hiperglicemia, e em seguida, administrado uma vez por dia por via subcutânea com 5 ml/kg (volume da injeção) de VICTOZA®(GSK) disponível comercialmente. Para um teste de tolerância à glicose no sangue, o grupo 2 foi deixado em jejum durante 16 horas antes do teste e administrado por via subcutânea com 100 nmol/ kg de VICTOZA® 4 horas antes do teste. O sangue foi coletado a partir da porção da cauda para medir o nível de glicose em jejum e os níveis de glicose no sangue aos 15 min, 30 min, 60 min, 90 min e 120 min após a administração intra-abdominal de 1 g/kg de glicose foram medidos.
[204] O grupo 3 (grupo induzido-HF DIO e grupo administrado com 1 nmol/kg de SEQ ID NO: 25-conjugado Fc) foi alimentado com ração rica em gordura para induzir obesidade e hiperglicemia, e em seguida administrado por via subcutânea uma vez por semana com 1 nmol/kg (volume de injeção de 5 ml/kg) da SEQ ID NO: 25-conjugado Fc preparado no Exemplo 4. Para um teste de tolerância à glucose no sangue, grupo 3 foram mantidos em jejum durante 24 horas antes do teste e administrado por via subcutânea com 1 nmol/kg da SEQ ID NO: 25-conjugado Fc 24 horas antes do ensaio e mantidos em jejum durante 16 horas. O sangue foi recolhido a partir da porção da cauda para medir o nível de glicose em jejum e os níveis de glicose no sangue aos 15 min, 30 min, 60 min, 90 min e 120 min após a administração intra-abdominal de 1 g/kg de glicose foram medidos.
[205] O grupo 4 (grupo induzido - HF DIO e grupo administrado com 1 nmol/kg de SEQ ID NO: 25-conjugado Fc) foi alimentado com ração rica em gordura para induzir obesidade e hiperglicemia, e em seguida administrado por via subcutânea uma vez por semana com 3 nmol/kg (volume de injeção de 5 ml/kg) da SEQ ID NO: 25-conjugado Fc preparado no Exemplo 4. Para um teste de tolerância à glicose no sangue, o grupo 3 foi mantido em jejum durante 24 horas antes do teste e administrado por via subcutânea com 3 nmol/kg da SEQ ID NO: 25-conjugado Fc 24 horas antes do ensaio e mantidos em jejum durante 16 horas. O sangue foi recolhido a partir da porção da cauda para medir o nível de glicose em jejum e os níveis de glicose no sangue aos 15 min, 30 min, 60 min, 90 min e 120 min após a administração intra-abdominal de 1 g/kg de glicose foram medidos.
[206] O grupo 5 (grupo induzido HF DIO e grupo administrado com 5 nmol/kg de SEQ ID NO: 25-conjugado Fc) foi alimentado com ração rica em gordura para induzir obesidade e hiperglicemia, e em seguida administrado por via subcutânea uma vez por semana com 5 nmol/kg (volume de injeção de 5 ml/kg) da SEQ ID NO: 25-conjugado Fc preparado no Exemplo 4. Para um teste de tolerância à glicose no sangue, grupo 3 foram mantidos em jejum durante 24 horas antes do teste e administrado por via subcutânea com 5 nmol/kg da SEQ ID NO: 25-conjugado Fc 24 horas antes do ensaio e mantidos em jejum durante 16 horas. O sangue foi recolhido a partir da porção da cauda para medir o nível de glicose em jejum e os níveis de glicose no sangue aos 15 min, 30 min, 60 min, 90 min e 120 min após a administração intra-abdominal de 1 g/kg de glicose foram medidos.
[207] Para todos os grupos (n = 6), solução salina ou cada fármaco foi administrado durante 2 semanas, e em seguida os seus efeitos na redução do peso corporal e o nível de glicose no sangue foram analisados.
[208] A fim de examinar o efeito do análogo da oxintomodulina de ação prolongada da presente invenção na redução do nível de glicose no sangue de camundongos com obesidade induzida por dieta (HF DIO) de elevado teor de gordura (durante 26 semanas) que são modelos de obesidade estáveis, os camundongos DIO classificado no Exemplo 6-1 foram administrados por via subcutânea com o análogo da oxintomodulina de ação prolongada uma vez por semana durante 2 semanas. O peso corporal e o consumo de ração foram medidos todos os dias, e o sangue foi recolhido a partir da porção da cauda dos camundongos DIO em dias 0, 3, 7, 10 e 14, e a mudança nos níveis de glicose no sangue foi analisada usando HITACHI 7020. As alterações no peso corporal e o nível de glicose no sangue são mostrados nas FIGS. 1 e 2.
[209] A FIG. 1 mostra a alteração no peso corporal, e a FIG. 2 mostra a glicose no sangue AUC (area abaixo da curva). Os resultados obtidos foram processados estatisticamente, e os valores médios e os desvios-padrão dos valores médios foram calculados.
[210] Na verificação de significância entre os grupos (n=6), dados foram processados estatisticamente por meio do teste de Dunnett de ANOVA one- way, e um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
[211] Especificamente, os resultados da medição da mudança no peso corporal indicam que o peso corporal dos camundongos com obesidade induzida por dieta rica em gordura durante 26 semanas não diminuiu, ao passo que, quando os camundongos com obesidade foram administrados com o análogo da oxintomodulina de ação prolongada (SEQ ID NO: 25- conjugado Fc), o peso corporal destes diminuiu de um modo dependente da dose (FIG. 1).
[212] Os resultados da medição do nível de glicose no sangue indicaram que o nível de glicose no sangue dos camundongos com obesidade diminuiu de uma forma dependente da dose, quando os camundongos foram administrados com o análogo da oxintomodulina de ação prolongada (SEQ ID NO: 25- conjugado Fc). Particularmente, quando os camundongos com obesidade foram administrados com 5 nmol/ kg do análogo da oxintomodulina de ação prolongada (SEQ ID NO: 25- conjugado Fc), o nível de glicose no sangue diminuiu significativamente em comparação com o dos camundongos DIO induzidos por dieta rica em gordura, e o efeito de redução do nível de glicose no sangue de 5 nmol/kg do análogo da oxintomodulina de ação prolongada (SEQ ID NO: 25- conjugado Fc) foi igual ou melhor do que a de VICTOZA® que é uma droga disponível comercialmente para o tratamento da diabetes (FIG. 2).
[213] A partir dos resultados do Exemplo 6-2, foi verificado que o conjugado do análogo da oxintomodulina de ação prolongada da presente invenção, que compreende o análogo da oxintomodulina ligado covalentemente à região Fc da imunoglobulina por PEG, reduziu o peso corporal e o nível de glicose no sangue de camundongos com obesidade induzida por dieta de elevado teor de gordura (HF DIO), sugerindo que pode ser eficazmente usado para o tratamento de diabetes, diabesidade ou doenças relacionadas.
[214] Um camundongo macho com 7 semanas BKS.Cg -+ Leprdb/+Leprdb/OlaHsd (25 ± 3 g, Harlan U.S.A) foram comprados da Doo Yeol Biotech (Coreia). Os camundongos BKS.Cg -+ Leprdb/+Leprdb/OlaHsd (aqui a seguir referidos como camundongo db/ db) são os roedores que são mais frequentemente utilizados em estudos de diabetes, em conjunto com camundongos ob/ob, e estes camundongos diabéticos mostram condições naturalmente semelhantes às dos seres humanos através de uma mutação no receptor da leptina. Por este motivo, na presente invenção, estes animais foram utilizados para examinar o efeito de diminuição de glicose no sangue do agente da presente invenção no desenvolvimento de um agente para o tratamento da diabetes.
[215] Os animais comprados foram aclimatados e adaptados ao ambiente experimental por uma semana, e em seguida, distribuídos aleatoriamente em grupos de acordo com seus níveis de glicose.
[216] Os animais tinham acesso a alimentos sólidos (Picolab Roedor dieta 5053) esterilizados por irradiação UV. Além disso, os animais foram permitidos ter o acesso à água da torneira filtrada e esterilizada por UV usando garrafas de água. Os animais foram mantidos em uma câmara de criação que satisfazem as normas de GLP sob um ciclo de 12 horas de luz/12 horas de escuro (luminosidade: 6 da manhã às 6 da tarde), e todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com a diretriz padrão para experiências com animais. Os animais foram divididos em quatro grupos (n = 7) e administrados com fármacos como mostrado na Tabela 4 abaixo. Tabela 4
[217] Especificamente, o grupo 1 (veículo), um grupo de controle, foi administrado por via subcutânea com 5 ml/ kg de solução salina tamponada em fosfato de Dulbecco (DPBS, Sigma), uma vez por semana.
[218] O grupo 2 (administrado com 60 nmol/kg de VICTOZA®, um grupo administrado com fármaco, foi administrado por via subcutânea uma vez por dia com 60 nmol/kg (dose para a diabetes; volume de injeção de 5 ml/kg) de VICTOZA® (GSK) comercialmente disponível.
[219] Grupo (administrado com 100 nmol/kg de VICTOZA®, um grupo administrado com fármaco, foi administrado por via subcutânea uma vez por dia com 100 nmol/kg (dose para obesidade; volume da injeção de 5 ml/kg) de Victoza® (GSK) comercialmente disponível.
[220] O grupo 4 (15 nmol/kg de SEQ ID NO: 23- conjugado Fc), um grupo administrado com fármaco, foi administrado por via subcutânea uma vez por semana com 15 nmol/kg (volume de injeção de 5 ml/kg) da SEQ ID NO: 23- conjugado Fc preparado no Exemplo 4.
[221] O grupo 5 (6 nmol/kg de SEQ ID NO: 25- conjugado Fc), um grupo administrado com fármaco, foi administrado por via subcutânea uma vez por semana com 6 nmol/kg (volume de injeção de 5 ml/kg) de SEQ ID NO: 25- conjugado Fc preparado no Exemplo 4.
[222] Para todos os grupos (n = 7), solução salina ou cada fármaco foi administrado durante 4 semanas, e em seguida os seus efeitos na redução do peso corporal e o nível de glicose no sangue foram analisados.
[223] A fim de examinar o efeito do análogo da oxintomodulina de ação prolongada da presente invenção na redução do nível de glicose no sangue de camundongos db/db com diabetes induzida por uma mutação no receptor da leptina, os camundongos db/db classificados no Exemplo 7-1 foram administrados por via subcutânea com o análogo da oxintomodulina com ação prolongada uma vez por semana durante 4 semanas. A alteração no peso corporal dos camundongos foi medida duas vezes por semana, e o sangue foi coletado da porção da cauda dos camundongos db/db (diariamente nas semanas 1 e 4, e duas vezes por semana nas semanas 2 e 3), e a alteração no nível de glicose no sangue foi analisada usando HITACHI 7020.
[224] A FIG. 3 mostra a alteração no peso corporal, e a FIG. 4 mostra a glicose no sangue AUC (área sob a curva). Os resultados obtidos foram processados estatisticamente, e os valores médios e os desvios-padrão dos valores médios foram calculados. Na verificação de significância entre os grupos (n=6), dados foram processados estatisticamente pelo teste de Dunnett da ANOVA one-way, e o valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
[225] Especificamente, os resultados da medição da mudança no peso corporal indica que o peso corporal do grupo de controle de camundongos db/db aumentaram continuamente a partir do dia de início da administração, ao passo que, quando os camundongos foram administrados com o análogo da oxintomodulina de ação prolongada (SEQ ID NO: 23- conjugado Fc ou a SEQ ID NO: 25- conjugado Fc), o peso corporal não alterou substancialmente a partir do peso corporal medido no dia de administração indicada, o que sugere que o conjugado mostrou um efeito significativo de inibição do aumento no peso corporal (FIG. 3).
[226] Os resultados da medição do nível de glicose no sangue indicaram que, quando os camundongos foram administrados com o análogo da oxintomodulina de ação prolongada (SEQ ID NO: 23- conjugado Fc ou a SEQ ID NO: 25- conjugado Fc), o nível de glicose no sangue diminuiu significativamente comparado com a do grupo de controle. Em particular, a administração de 6 nmol/ kg do análogo da oxintomodulina de ação prolongada (SEQ ID NO: 25- conjugado Fc) mostrou um efeito de redução de glicose no sangue em comparação com o da VICTOZA® que é um fármaco comercialmente disponível para o tratamento da diabetes (FIG. 4).
[227] A partir dos resultados do Exemplo 7, foi verificado que o análogo da oxintomodulina de ação prolongada da presente invenção, que compreende o análogo da oxintomodulina covalentemente ligado à região Fc da imunoglobulina por PEG, reduziu significativamente o nível de glicose no sangue (índice de diabetes) nos camundongos db/db com diabetes induzida pela mutação no receptor da leptina, em comparação com o veículo e VICTOZA® que está sendo usado como um fármaco para o tratamento de diabetes, o que sugere que o análogo da oxintomodulina de ação prolongada da presente invenção pode ser usado de forma muito eficaz para o tratamento de diabetes. Além disso, um análogo da oxintomodulina de ação prolongada da presente invenção mostrou um efeito significativo de inibição do aumento do peso corporal, o que sugere que este pode reduzir as complicações cardiovasculares diabéticas.
[228] A partir dos resultados dos Exemplos 6 e 7, foi verificado que o conjugado do análogo da oxintomodulina de ação prolongada da presente invenção mostrou um efeito de diminuição da glicose no sangue excelente igual ou melhor do que VICTOZA® conhecida por ter um efeito de redução da glicose no sangue, assim como um excelente efeito de redução do peso corporal, o que sugere que o conjugado do análogo da oxintomodulina de ação prolongada da presente invenção pode ser eficazmente usado como um agente para o tratamento de diabetes, diabesidade e complicações diabéticas em virtude do seu efeito de redução do nível sanguíneo.
[229] Os técnicos no assunto reconhecerão que a presente invenção pode ser concretizada em outras formas específicas sem se afastar do seu espírito ou características essenciais. As modalidades descritas devem ser consideradas em todos os aspectos apenas como ilustrativas e não restritivas. O escopo da presente invenção é, portanto, indicado pelas reivindicações anexas e não pela descrição anterior. Todas as alterações que estejam no âmbito do significado e na taxa de equivalência das reivindicações devem ser incluídas no escopo da presente invenção.
Claims (7)
1. Composição para a prevenção ou tratamento de diabetes, complicações diabéticas ou diabesidade, caracterizada pelo fato de que compreende um conjugado análogo da oxintomodulina como um ingrediente ativo, em que o conjugado análogo da oxintomodulina compreende: - um análogo da oxintomodulina compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 2 a 22, e 27 a 34; - uma região Fc da imunoglobulina; e - um polímero não peptídico, em que o polímero não peptídico é covalentemente ligado ao análogo da oxintomodulina e à região Fc da imunoglobulina.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polímero não peptídico é selecionado do grupo que consiste em polietilenoglicol, polipropilenoglicol, um copolímero de etilenoglicol / propilenoglicol, poliol polioxietilado, poli(álcool vinílico), polissacarídeos, dextrano, poli(vinil-etil- éter), PLA (poli(ácido lático), PLGA (poli(ácido lático-glicólico), polímeros lipídicos, quitinas, ácido hialurônico, e combinações destes.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que cada extremidade do polímero não peptídico está ligada à região Fc da imunoglobulina e ao grupo amina ou grupo tiol da oxintomodulina, respectivamente.
4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um agente farmacêutico apresentando os efeitos preventivos ou terapêuticos contra diabetes, complicações diabéticas ou diabesidade.
5. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a diabetes é diabetes tipo 1 dependente de insulina ou diabetes tipo 2 não dependente de insulina.
6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a diabesidade resulta da obesidade.
7. Uso da composição caracterizada por ser para a preparação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de diabetes, complicações diabéticas ou diabesidade, compreendeendo um conjugado análogo da oxintomodulina como um ingrediente ativo, em que o conjugado análogo da oxintomodulina compreende: - um análogo da oxintomodulina compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 2 a 22, e 27 a 34; - uma região Fc da imunoglobulina; e - um polímero não peptídico, em que o polímero não peptídico é covalentemente ligado ao análogo da oxintomodulina e à região Fc da imunoglobulina.
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