TWI645856B - 治療糖尿病或糖胖症之包括調酸素類似物之組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明係有關一種預防或治療糖尿病、糖胖症或糖尿病性併發症之組成物，其包含調酸素類似物作為活性成份。本發明亦有關一種治療糖尿病、糖胖症或糖尿病性併發症之方法，其包括對個體投與醫藥有效量之調酸素類似物。相較於天然調酸素，調酸素類似物具有活化GLP-1受體及升糖素受體之高度能力。調酸素類似物可誘發β-細胞擴大及提高胰島素分泌，藉以降低由高熱量與高脂肪膳食所提高之血糖濃度。調酸素類似物會誘發減少體重及膳食攝取量，以改善胰島素敏感度並讓因胰島素抗性而無法控制之血糖濃度維持在正常濃度。因此，調酸素類似物可以有效用於預防或治療糖尿病及相關疾病。

Description

治療糖尿病或糖胖症之包括調酸素類似物之組成物
本發明係有關一種預防或治療糖尿病、糖胖症或糖尿病性併發症之組成物，該組成物包含調酸素類似物作為活性成份。此外，本發明係有關一種預防或治療糖尿病、糖胖症或糖尿病性併發症之方法，該方法包括對個體投與醫藥有效量之調酸素類似物。
近年來，韓國由於經濟成長及飲食習慣西化之故，膳食脂肪之攝取逐漸增加，因缺乏運動所引起之代謝疾病，如：高血脂症、肥胖、糖尿病、高血壓、動脈硬化與脂肪肝疾病亦增加。
糖尿病係一種胰島素分泌不足或無法運作正常功能之代謝性疾病(DeFronzo,1988)。糖尿病之特徵在於血糖濃度上升，造成各種不同病症與症狀。在糖尿病例中，會在尿中排出葡萄糖。近年來，由於肥胖症增加，特別指腹部肥胖，糖尿病之發生率亦爆炸性增加。
2000年，全球糖尿病患者估計有1億7千萬人，預計在2030年將達到3億7千萬人。然而，最近的 報告顯示，全球糖尿病病例在2008年已達到約3億5千萬人(Danaei等人，2011)，因此遠高於預估數量。報告中指出，約80%或更多的第2型糖尿病患者為肥胖，而僅有10%以下之肥胖患者罹患糖尿病(Harris等人，1987)。這種糖尿病與肥胖之間之關係歸因於脂肪激素及游離脂肪酸之分泌失常，導致脂肪酸累積在β-細胞或胰島素敏感性組織中，如：腎臟、肝臟或心臟，造成脂肪毒性。
若慢性高血糖症未經過適當治療，其將造成身體各種不同病理症狀。通常，其會提高視網膜病變、腎功能障礙、神經病變、由血管病變造成之中風、腎臟或心臟疾病、糖尿病足部潰瘍、及心血管疾病之風險。此等併發症會降低生活品質，最後將縮短糖尿病患者之預期壽命。因此，為了預防糖尿病性併發症，必需有效控制血糖濃度。
目前用於控制血糖濃度之方法包括改變生活型態(膳食療法或運動療法)及藥物療法。然而，膳食療法或運動療法很難嚴格控制及執行，其醫療效果亦不足。因此，大多數糖尿病患者仍靠改變生活型態合併使用藥物控制血糖濃度，如：胰島素、胰島素分泌刺激劑、胰島素敏感度加強劑、及降血糖劑。
採用重組方法製造之胰島素係針對無法控制血糖濃度之第1型糖尿病患者及第2型糖尿病患者之基本藥物，其有利於控制血糖濃度。然而，其亦有缺點，包括對皮下針刺的恐懼感、不方便投藥、低血糖風險、及體 重增加。
美格替耐類(Meglitinides)係胰島素分泌刺激劑，其為一種在餐前服用之極快速作用型藥物，且包括NovoNorm(瑞格列奈(repaglinide))、Fastic(納格列奈(nateglinide))、Glufast(美格列奈(mitiglinide))等等。胰島素敏感度加強劑之特徵在於當單獨服用時之降血糖效力很小或沒有，其實例包括二甲雙胍(metformin)(其係雙胍類藥物)、噻唑啶二酮類藥物，如：Avandia(羅格列酮(rosiglitazone))、Actos(皮格列酮(pioglitazone))等等。
最近開發之藥物包括以類升糖素肽-1(其係一種刺激胰島素分泌之激素)之作用為基礎所開發之GLP-1促效劑，且GLP-1促效劑實例包括艾塞那肽(exenatide)及利拉鲁肽(liraglutide)。此外，最近亦發展DPP-4抑制劑成為新藥，其會抑制DPP-4(二肽基肽酶-4，其係一種讓GLP-1快速失活之酵素)之活性，其典型實例包括Januvia(西他列汀(sitagliptin))。
然而，此等藥物被指稱具有副作用，包括肝毒性、胃腸病變、心血管疾病及致癌性，且其治療糖尿病之全年費用亦很高，因此會阻礙糖尿病之治療。事實上，2007年，在美國，與糖尿病前期及糖尿病相關之費用達約200兆韓元(Dall等人，2010)，而在2008年，美國與肥胖相關之費用亦達150兆韓元(Finkelstein等人，2009)。
因此極需要發展一種可藉由降低體重及有效降低血糖濃度，同時副作用較低之可用於治療糖尿病與 糖胖症兩種疾病之藥物。
作為此等藥物候選者之調酸素近來已受到重視。調酸素係由前升糖素(係一種前體)產生，其為一種可與類升糖素肽-1(GLP-1)及升糖素受體結合而進行雙重功能之肽。基於此等特性，已針對各種不同目的來探討調酸素，包括治療肥胖、糖尿病、高血脂症及脂肪肝疾病，然而，調酸素之問題在於其需要投與高劑量，因為其在活體內之半衰期短，其活性將不足以用於肥胖、糖尿病、高血脂症及脂肪肝疾病。
本發明者已發展一種比天然調酸素更提高活性之調酸素類似物，且已在高脂肪膳食誘發(HF DIO)小鼠模式及由瘦體素受體突變所誘發之糖尿病小鼠(db/db)模式中發現，該調酸素類似物可降低血糖濃度、改善葡萄糖耐受性及提高糖化血紅素(HbA1c)比例，此表示調酸素類似物可有效用於治療糖尿病、糖胖症及糖尿病性併發症，因而完成本發明。
本發明之目的在於提供一種預防或治療糖尿病、糖胖症及糖尿病性併發症之組成物，其包含調酸素類似物作為活性成份。
本發明另一個目的在於提供一種預防或治療糖尿病、糖胖症及糖尿病性併發症之方法，其包括對個體投與醫藥有效量之調酸素類似物。
本發明另一個目的在於提供一種以本發明調酸素類似物於製備供預防或治療糖尿病、糖胖症及糖尿病性併發症之醫藥上之用途。
本發明調酸素類似物活化GLP-1受體及升糖素受體之能力高於天然調酸素。此外，本發明調酸素類似物可誘發β-細胞擴大及提高胰島素分泌，藉以降低由高熱量與高脂肪膳食所提高之血糖濃度。此外，調酸素類似物會誘發減少體重及膳食攝取量，以改善胰島素敏感度並讓因胰島素抗性而無法控制之血糖濃度維持在正常濃度。因此，調酸素類似物可以用於有效預防或治療糖尿病及相關疾病。
第1圖為顯示說明在經過高脂肪膳食長期(26週)誘發肥胖之小鼠中投與長效性調酸素類似物後所造成之體重變化圖。體重變化係以相對於第0天所量測體重之百分比表示。
第2圖為顯示在經過高脂肪膳食長期(26週)誘發肥胖之小鼠中投與長效性調酸素類似物後所造成血糖濃度變化之AUC(曲線下面積)圖。
第3圖為顯示在瘦體素受體突變誘發糖尿病之小鼠模式中投與長效性調酸素類似物4週時所造成4-週體重變化圖。
第4圖為顯示說明在瘦體素受體突變誘發糖尿病之小鼠模式中投與長效性調酸素類似物4週時所造成血糖濃度變化之AUC(曲線下面積)圖。
本發明在一項態樣中提供一種預防或治療糖尿病、糖胖症及糖尿病性併發症之組成物，其包含調酸素類似物作為活性成份。
本文所採用術語"調酸素"係指由前升糖素(其係升糖素前體)產生之肽。本發明中，調酸素包括天然調酸素與其前體、類似物、片段與變異體。調酸素較佳具有胺基酸序列SEQ ID NO：1(HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA)。
本文所採用術語“調酸素變異體”為其中一個或多個胺基酸殘基不同於天然調酸素胺基酸序列中之殘基且保留活化GLP-1與升糖素受體之功能之肽。調酸素變異體可由天然調酸素之部份胺基酸經過取代、增加、刪除、修飾或其組合中任一種處理製成。
本文所採用術語“調酸素類似物”係指由天然調酸素之部份胺基酸經過增加、刪除或取代所製成之肽、肽衍生物或肽擬似物，且相較於天然調酸素，其可以同時高度活化GLP-1受體與升糖素受體。
本文所採用術語“調酸素片段”係指在天然調酸素胺基末端或羧基末端增加或刪除一個或多個胺基酸後之片段，其中所增加之胺基酸亦可能為非天然胺基酸 (例如：D-型胺基酸)。此等調酸素片段具有活體內調節血糖濃度之功能。
製備調酸素之變異體、類似物與片段之方法可以分開或組合進行。例如：本發明包括具有一個或多個不同於天然肽之胺基酸且N-末端胺基酸殘基已脫胺基化，並具有同時活化GLP-1受體與升糖素受體之功能之肽。
本文所提及之胺基酸係依據IUPAC-IUB之命名規則縮寫如下：
本發明中，調酸素類似物包括任何由SEQ ID NO：1之胺基酸序列中之胺基酸經過取代、增加、刪除或轉譯後修飾(例如：甲基化、醯化、泛素化或分子內共價鍵結)所製成且可同時活化升糖素與GLP-1受體之肽。當要取代或增加胺基酸時，不僅可使用人類蛋白質中常見之20種胺基酸，亦可使用非典型或非天然胺基酸。非典型胺基酸之商品來源包括Sigma-Aldrich、ChemPep Inc.、及Genzyme Pharmaceuticals。包括此等胺基酸與非典型肽序列之肽可由商品供應商合成及出售，例如：American Peptide Company或Bachem(美國)或Anygen(韓國)。
本發明明確具體實施例中，本發明調酸素類似物為一種包括如下式1之胺基酸序列之新穎肽：式1 R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2(SEQ ID NO：54)其中R1為組胺酸、脫胺基-組胺醯基、二甲基-組胺醯基(N-二甲基-組胺醯基)、β-羥基咪唑丙醯基、4-咪唑乙醯基、β-羧基咪唑丙醯基或酪胺酸；X1為Aib(胺基異丁酸)、d-丙胺酸、甘胺酸、Sar(N-甲基甘胺酸)、絲胺酸、或d-絲胺酸；X2為麩胺酸或麩醯胺；X3為白胺酸或酪胺酸；X4為絲胺酸或丙胺酸；X5為離胺酸或精胺酸；X6為麩醯胺或酪胺酸；X7為白胺酸或甲硫胺酸；X8為天冬胺酸或麩胺酸；X9為麩胺酸、絲胺酸或α-甲基-麩胺酸或已刪除； X10為麩醯胺、麩胺酸、離胺酸、精胺酸或絲胺酸或已刪除；X11為丙胺酸、精胺酸或纈胺酸或已刪除；X12為丙胺酸、精胺酸、絲胺酸或纈胺酸或已刪除；X13為離胺酸、麩醯胺、精胺酸或α-甲基-麩胺酸或已刪除；X14為天冬胺酸、麩胺酸或白胺酸或已刪除；X15為苯基丙胺酸或已刪除；X16為異白胺酸或纈胺酸或已刪除；X17為丙胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、離胺酸、麩醯胺或α-甲基-麩胺酸或已刪除；X18為色胺酸或已刪除；X19為丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、絲胺酸或纈胺酸或已刪除；X20為丙胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、麩醯胺或精胺酸或已刪除；X21為天冬醯胺或已刪除；X22為丙胺酸、甘胺酸或蘇胺酸或已刪除；X23為半胱胺酸或離胺酸或已刪除；X24為由丙胺酸、甘胺酸與絲胺酸之組合所組成具有2至10個胺基酸之肽，或已刪除；及R2為KRNRNNIA(SEQ ID NO：35)、GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：36)、GPSSGAPPPSK(SEQ ID NO：37)、HSQGTFTSDYSKYLD(SEQ ID NO：38)、 HSQGTFTSDYSRYLDK(SEQ ID NO：39)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(SEQ ID NO：40)或已刪除(但不包括式1之胺基酸序列與SEQ ID NO：1相同時之例子)。
為了提高野生型調酸素對升糖素受體與GLP-1受體之活性，本發明之調酸素類似物可經4-咪唑乙醯基取代(其係刪除SEQ ID NO：1之胺基酸序列之1-位置組胺酸上α碳所製得)、經脫胺基-組胺醯基取代(其係刪除N-末端胺基所製得)、經二甲基-組胺醯基(N-二甲基-組胺醯基)取代(其係由兩個甲基修飾N-末端胺基所製得)、經β-羥基咪唑丙醯基取代(其係由羥基取代N-末端胺基所製得)、或經β-羧基咪唑丙醯基取代(其係由羧基取代N-末端胺基所製得)。此外，GLP-1受體-結合區可被加強疏水性之胺基酸與離子鍵或其組合取代。再者，有一部份調酸素序列可經GLP-1或腸促胰島素肽(Exendin)-4之胺基酸序列取代，以提高GLP-1受體之活性。
此外，有一部份調酸素序列可經加強α螺旋之序列取代。較佳為式1胺基酸序列之10、14、16、20、24與28-位置之胺基酸可經已知可穩定α螺旋之下列各物所成群組中之胺基酸或胺基酸衍生物取代：Tyr(4-Me)、Phe、Phe(4-Me)、Phe(4-Cl)、Phe(4-CN)、Phe(4-NO2)、Phe(4-NH2)、Phg、Pal、Nal、Ala(2-噻吩基)與Ala(苯并噻吩基)，且對要穩定α螺旋而插入之胺基酸或胺基酸衍生物之型態與數量沒有限制。較佳為該胺基酸序列之10與14、12與16、16與20、20與24、及24與28-位置之胺基酸亦可經麩胺酸或離胺酸取代，以形成環，要插入之環之數量沒有限制。最佳為該調酸素類似物可具有選自下式2至6之胺基酸序列。
在一項明確具體實施例中，本發明調酸素類似物為包括下式2胺基酸序列之新穎肽，其係由調酸素之胺基酸序列被腸促胰島素肽或GLP-1取代所製得：式2 R1-A-R3(SEQ ID NO：55)
另一項明確具體實施例中，本發明之調酸素類似物為包括下式3胺基酸序列之新穎肽，其係由調酸素之一部份胺基酸序列利用適當胺基酸連接子連接腸促胰島素肽或GLP-1之一部份胺基酸序列而製成：式3 R1-B-C-R4(SEQ ID NO：56)
再一項明確具體實施例中，本發明之調酸素類似物為包括如下式4胺基酸序列之新穎肽，其中調酸素之一部份胺基酸序列被可以加強對GLP-1受體之疏水性結合力之胺基酸取代。例如：其係一種在26-位置之Leu被可加強疏水性之胺基酸Ile或Val取代之肽。
式4 R1-SQGTFTSDYSKYLD-D1-D2-D3-D4-D5-LFVQW-D6-D7-N-D8-R3(SEQ ID NO：57)
再一項明確具體實施例中，本發明之調酸素類似物為包括下式5胺基酸序列之新穎肽，其中天然調酸素之一部 份胺基酸序列已刪除、增加或被其他胺基酸取代，以提高天然調酸素活化GLP-1受體與升糖素受體之能力：式5 R1-E1-QGTFTSDYSKYLD-E2-E3-RA-E4-E5-FV-E6-WLMNT-E7-R5(SEQ ID NO：58)
式2至5中，R1係如式1之說明；A係選自下列各物所成群組中：SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQ ID NO：41)、SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT(SEQ ID NO：42)、SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT(SEQ ID NO：43)、GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG(SEQ ID NO：44)、GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG(SEQ ID NO：45)、GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA(SEQ ID NO：46)、及SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG(SEQ ID NO：47)；B係選自下列各物所成群組中：SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQ ID NO：41)、SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT(SEQ ID NO：42)、SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT(SEQ ID NO：43)、GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG(SEQ ID NO：44)、GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG(SEQ ID NO：45)、GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA(SEQ ID NO：46)、SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG(SEQ ID NO：47)、GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEW(SEQ ID NO：48)、及SQGTFTSDYSRYLD(SEQ ID NO：49)； C為由丙胺酸、甘胺酸與絲胺酸之組合所組成具有2至10個胺基酸之肽；D1為絲胺酸、麩胺酸或精胺酸；D2為精胺酸、麩胺酸或絲胺酸；D3為精胺酸、丙胺酸或纈胺酸；D4為精胺酸、纈胺酸或絲胺酸；D5為麩醯胺、精胺酸或離胺酸；D6為異白胺酸、纈胺酸或絲胺酸；D7為甲硫胺酸、精胺酸或麩醯胺；D8為蘇胺酸、甘胺酸或丙胺酸；E1為絲胺酸、Aib、Sar、d-丙胺酸或d-絲胺酸；E2為絲胺酸或麩胺酸；E3為精胺酸或離胺酸；E4為麩醯胺或離胺酸；E5為天冬胺酸或麩胺酸；E6為麩醯胺、半胱胺酸或離胺酸；E7為半胱胺酸或離胺酸或已刪除；R3為KRNRNNIA(SEQ ID NO：35)、GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：36)或GPSSGAPPPSK(SEQ ID NO：37)；R4為HSQGTFTSDYSKYLD(SEQ ID NO：38)、HSQGTFTSDYSRYLDK(SEQ ID NO：39)或HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(SEQ ID NO：40)；及R5為KRNRNNIA(SEQ ID NO：35)、GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：36)或GPSSGAPPPSK(SEQ ID NO：37)或已刪除(但 不包括式2至5之胺基酸序列與SEQIDNO：1相同時之例子)。
較佳為本發明調酸素類似物可為如下式6之新穎肽：式6 R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2(SEQ ID NO：59)
其中R1為組胺酸、脫胺基-組胺醯基、4-咪唑乙醯基或酪胺酸；X1為Aib(胺基異丁酸)、甘胺酸、絲胺酸或d-絲胺酸；X2為麩胺酸或麩醯胺；X3為白胺酸或酪胺酸；X4為絲胺酸或丙胺酸；X5為離胺酸或精胺酸；X6為麩醯胺或酪胺酸；X7為白胺酸或甲硫胺酸；X8為天冬胺酸或麩胺酸；X9為麩胺酸或α-甲基-麩胺酸或已刪除；X10為麩醯胺、麩胺酸、離胺酸或精胺酸或已刪除；X11為丙胺酸或精胺酸或已刪除；X12為丙胺酸或纈胺酸或已刪除；X13為離胺酸、麩醯胺、精胺酸或α-甲基-麩胺酸或已刪除； X14為天冬胺酸、麩胺酸或白胺酸或已刪除；X15為苯基丙胺酸或已刪除；X16為異白胺酸或纈胺酸或已刪除；X17為丙胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺或α-甲基-麩胺酸或已刪除；X18為色胺酸或已刪除；X19為丙胺酸、異白胺酸、白胺酸或纈胺酸或已刪除；X20為丙胺酸、離胺酸、甲硫胺酸或精胺酸或已刪除；X21為天冬醯胺或已刪除；X22為蘇胺酸或已刪除；X23為半胱胺酸或離胺酸或已刪除；X24為由甘胺酸組成之具有2至10個胺基酸之肽或已刪除；及R2為KRNRNNIA(SEQ ID NO：35)、GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：36)、GPSSGAPPPSK(SEQ ID NO：37)、HSQGTFTSDYSKYLD(SEQ ID NO：38)、HSQGTFTSDYSRYLDK(SEQ ID NO：39)或HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(SEQ ID NO：40)或已刪除(但不包括式6之胺基酸序列與SEQ ID NO：1相同時之例子)。
更佳為本發明調酸素類似物可選自由SEQ ID NO：2至34之肽所成群組中。甚至更佳為本發明之調酸素類似物可為如實例2-1之表1中所說明之調酸素類似物。
本發明實例中，製備分別具有SEQ ID NO： 2至34之胺基酸序列之調酸素類似物，且發現該等調酸素類似物顯示比天然調酸素更優異之活化GLP-1受體與升糖素受體之能力(實例2)。換言之，由上述結果可見，相較於傳統調酸素，本發明調酸素類似物藉由活化GLP-1受體與升糖素受體而對預防或治療糖尿病、糖胖症及/或糖尿病性併發症具有優異之效果。
本發明調酸素類似物係呈包含各種不同聚合物之結合物型式，以改善該類似物之醫療效果與活體內半衰期。
本發明結合物顯示比天然調酸素延長之作用效果，且長效性結合物包括由天然調酸素胺基酸經過修飾、取代、增加或刪除所製成之調酸素；與生物降解性聚合物(如：聚乙二醇(PEG))結合之調酸素；與白蛋白、抗體、彈性蛋白、纖維網蛋白或多醣(如：幾丁質)結合或與長效性蛋白質(如：免疫球蛋白片段)結合之調酸素；與有能力於活體內結合白蛋白之脂肪酸結合之調酸素；或包埋在生物降解性奈米粒子中之調酸素；且本發明所使用之長效性結合物型態並沒有限制。
較佳結合物為其中由具有選自SEQ ID NO：2至34所成群組中之胺基酸序列之調酸素類似物利用非肽基聚合物連接免疫球蛋白Fc區之結合物。
免疫球蛋白Fc區為一種可於活體內代謝之生物降解性多肽，因此可安全用為藥物之載劑。免疫球蛋白Fc區具有低於完整免疫球蛋白分子之分子量，因此有利 於製備、純化與產生結合物。此外，由於抗體之間之胺基酸序列不同，展現高度非均質性之Fab部份已移除，因此亦可大幅提高物質之均質性，亦可降低誘發血液抗原性之機率。
本文所採用術語“免疫球蛋白Fc區”係指包含免疫球蛋白之重鏈恆定區2(CH2)及重鏈恆定區3(CH3)(但不包括重鏈及輕鏈可變區)、免疫球蛋白之重鏈恆定區1(CH1)及輕鏈恆定區1(CL1)之蛋白質。其可進一步包括重鏈恆定區之樞紐區。此外，本發明免疫球蛋白Fc區可為包含一部份或所有重鏈恆定區1(CH1)與/或輕鏈恆定區1(CL1)，但不包括重鏈及輕鏈可變區之擴大Fc區，只要其具有實質上等於或優於天然蛋白質之效果即可。此外，免疫球蛋白Fc區可為已刪除對應於CH2與/或CH3之相當長胺基酸序列部份之區段。明確言之，本發明免疫球蛋白Fc區可包含1)CH1功能部位、CH2功能部位、CH3功能部位與CH4功能部位，2)CH1功能部位與CH2功能部位，3)CH1功能部位與CH3功能部位，4)CH2功能部位與CH3功能部位，5)一個或多個功能部位與免疫球蛋白樞紐區(或一部份樞紐區)之組合，或6)重鏈恆定區與輕鏈恆定區之各功能部位之二聚體。
本發明免疫球蛋白Fc區包括天然胺基酸序列與其序列衍生物(突變體)。本文所採用術語”胺基酸序列衍生物”係指因為天然胺基酸序列中一個或多個胺基酸殘基經過刪除、嵌插、非保留性或保留性取代或其組合而 不同於天然胺基酸序列之序列。例如：在IgG Fc中，已知對結合性具有重要性之位置214至238、297至299、318至322、或327至331之胺基酸殘基可作為適合修飾之位點。
此外，可能有其他各種不同衍生物，包括其中已刪除可以形成二硫鍵之區域，或已在天然Fc之N-末端刪除某些胺基酸殘基或在天然Fc之N-末端增加甲硫胺酸殘基之區域。此外，為了排除效應子功能，可刪除補體結合位置，如：C1q-結合位置及ADCC(抗體依賴性細胞介導之細胞毒性)位置。製備此等免疫球蛋白Fc區之序列衍生物之技術揭示於國際專利公告案案號WO 97/34631、WO 96/32478等等。
相關技藝上已知通常不會改變蛋白質或肽之活性之蛋白質與肽中胺基酸交換法(H.Neurath,R.L.Hill,“The Proteins”,Academic Press,New York,1979)。最常發生之交換法為Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu及Asp/Gly，兩個方向均可。此外，若需要時，Fc區可經過磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法呢基化、乙醯基化、醯胺化等等方式修飾。
上述Fc衍生物顯示與本發明Fc區相同之生物活性或對熱、pH等等具有改良之結構安定性。
此外，此Fc區可得自從人類及其他動物(包 括牛、羊、豬、小鼠、兔子、倉鼠、大鼠及天竺鼠)單離之天然型，或可為由轉形動物細胞或微生物得到之重組體或其衍生物。本文中，Fc區可得自天然免疫球蛋白，其係從活的人類或動物生物體單離出完整免疫球蛋白，並以蛋白酶處理所單離之免疫球蛋白。當使用木瓜酵素處理完整免疫球蛋白時，其可消解形成Fab及Fc區，且當使用胃蛋白酶處理完整免疫球蛋白時，其可消解產生pF’c及F(ab)2片段。可採用分子大小篩選層析法等等單離出Fc或pF’c。該衍生自人類之Fc區較佳為得自微生物之重組免疫球蛋白Fc區。
此外，本發明免疫球蛋白Fc區可呈具有天然糖鏈之形式、比天然型增加或減少糖鏈之形式，或可呈脫糖基化之形式。可採用習知方法增加、減少或移除免疫球蛋白Fc糖鏈，如：化學法、酵素法與使用微生物之基因工程法。移除Fc區之糖鏈後所得到Fc區顯示顯著降低與C1q部份之結合親和力，並降低或喪失抗體依賴性細胞介導細胞毒性或補體依賴性細胞毒性，因此不會在活體內誘發不必要之免疫反應。基於此點，脫糖基化或非糖基化型中之免疫球蛋白Fc區可能更適合在本發明目的中作為藥物載劑。
本文所採用術語“脫糖基化”係指經過酵素排除Fc區之糖部份基團，且術語“非糖基化”係指由原核細胞生物(較佳為大腸桿菌(E.coli))製造之未糖基化Fc區。
同時，該免疫球蛋白Fc區可衍生自人類或其他動物，包括牛、羊、豬、小鼠、兔子、倉鼠、大鼠及天竺鼠。以源自人類較佳。
此外，免疫球蛋白Fc區可衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM，或其組合或雜合體。較佳係衍生自IgG或IgM，其係人類血液中含量最高之蛋白質，最佳係衍生自IgG，已知其可加強配體結合性蛋白質之半衰期。
本文所採用術語“組合”係指由編碼相同來源之單鏈免疫球蛋白Fc區之多肽連接不同來源之單鏈多肽，形成二聚體或多聚體。明確言之，該二聚體或多聚體可由兩個或更多個選自IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc、及IgE Fc片段所成群組中之片段形成。
本文所採用術語“雜合體”係指單鏈免疫球蛋白Fc區中出現對應於二個或更多個不同來源之免疫球蛋白Fc片段之序列。本發明中，可能有各種不同型式之雜合體。換言之，雜合體可能由1至4個選自IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc及IgD Fc之CH1、CH2、CH3及CH4所成群組中之功能部位組成，且其可能包括樞紐。
同時，IgG亦可能再分成IgG1、IgG2、IgG3與IgG4，本發明中，亦可能為此等子群之組合或雜合體。IgG為IgG2與IgG4子群較佳，以實質上缺乏效應子功能(如：補體依賴性細胞毒性(CDC))之IgG4之Fc區最佳。
換言之，用為本發明之藥物載劑之最佳免疫球蛋白Fc區為衍生自人類IgG4之Fc區。衍生自人類之 Fc區優於衍生自非人類之Fc區，後者可能成為人體之抗原並引起不期望之免疫反應，如：產生針對抗原之新抗體。
本文所採用術語“非肽基聚合物”係指包括兩個或更多個重複單位利用任何共價鍵替代肽鍵相互連接所形成之生物可相容性聚合物。本發明中，該非肽基聚合物可與非肽基連接子交換使用。
可用於本發明之非肽基聚合物選自下列各物所成群組中：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯基醇、多醣、葡聚醣、聚乙烯基乙基醚、生物可降解性聚合物(如：PLA(聚(乳酸))與PLGA(聚乳酸-乙醇酸))、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸及其組合。較佳者，該非肽基聚合物為聚乙二醇。此外，本發明範圍內可包括相關技藝上已知之衍生物與容易採用相關技藝上已知之方法製備之衍生物。
採用習知讀碼框內融合法所製得融合蛋白質中所利用之肽連接子之缺點在於其容易在活體內被蛋白酶降解，因此無法利用載劑達到充份延長活性藥物之血清半衰期之預期效果。然而，本發明中，可使用對蛋白酶具有抗性之聚合物來維持肽之血清半衰期達到類似載劑之半衰期。因此，任何非肽基聚合物只要其係具有上述功能之聚合物即沒有限制均可使用，亦即該聚合物應對活體內蛋白酶具有抗性。該非肽基聚合物之分子量在1至100kDa之範圍內，較佳1至20kDa。本發明連接免疫球蛋白Fc區之非肽基聚合物可為一種聚合物或為多種不同聚合物之 組合。
本發明所使用非肽基聚合物可具有能與免疫球蛋白Fc區及蛋白質藥物結合之反應性基團。該非肽基聚合物兩端之反應性基團較佳係選自下列各物所成群組中：反應性醛基、丙醛基、丁醛基、馬來醯亞胺基與琥珀醯亞胺衍生物。
琥珀醯亞胺衍生物可為丙酸琥珀醯亞胺基酯、羥基琥珀醯亞胺基、琥珀醯亞胺基羧甲基或碳酸琥珀醯亞胺基酯。特定言之，當非肽基聚合物之兩端具有反應性醛基時，可使非特異性反應降至最低，並使生理活性多肽與免疫球蛋白分別有效連接該非肽基聚合物之兩端。由醛鍵之還原性烷化反應產生之終產物遠比醯胺鍵連接產生之終產物更穩定。該醛反應性基團可在低pH下選擇性結合N-末端，及在高pH(如：pH 9.0)下結合離胺酸殘基，形成共價鍵。
作為連接子之非肽基聚合物之兩端之反應性基團可相同或相異。例如：該非肽基聚合物可在一個末端具有馬來醯亞胺基，及在另一端具有醛基、丙醛基或丁醛基。當使用兩端均具有反應性羥基之聚乙二醇作為非肽基聚合物時，該羥基可經過已知化學反應活化成各種不同反應性基團，或可採用具有可自商品取得之經修飾反應性基團之聚乙二醇來製備本發明長效結合物。
本發明結合物可為其中之非肽基聚合物之各端分別連接免疫球蛋白Fc區及調酸素類似物之胺基或 硫醇基者。
同時，本發明中，非肽基聚合物之兩端包括可結合免疫球蛋白Fc區與蛋白質藥物之反應性基團。該等反應性基團實例可為(但不限於)：醛基、丙醛基或丁醛基、馬來醯亞胺基、琥珀醯亞胺衍生物(丙酸琥珀醯亞胺基酯、羥基琥珀醯亞胺基、琥珀醯亞胺基羧甲基或碳酸琥珀醯亞胺基酯)等等。
作為連接子之非肽基聚合物之兩端之反應性基團可相同或相異。例如：該非肽基聚合物可在一個末端具有馬來醯亞胺基，及在另一端具有醛基、丙醛基或丁醛基。例如，當該非肽基聚合物在一個末端具有反應性醛基，及在另一端具有反應性馬來醯亞胺基時，可使非特異性反應降至最低，並在非肽基聚合物兩端有效連接生理活性多肽與免疫球蛋白。本發明實例中，該結合物係由調酸素或其類似物利用非肽基聚合物PEG(其係僅包括丙醛基或同時包括馬來醯亞胺基與醛基之非肽基聚合物)共價鍵連接免疫球蛋白Fc區後製成。
本發明醫藥組成物可用於預防或治療糖尿病、糖胖症及/或糖尿病性併發症。
本文所採用術語“預防”係指抑制或延緩目標疾病發展之所有作用。明確言之，術語“預防”係指投與本發明調酸素類似物來控制血糖濃度至正常濃度，以抑制或延緩發展出糖尿病、糖胖症或糖尿病性併發症。
本文所採用術語“處理”係指減輕、改善 或緩解疾病所發展症狀之所有作用。明確言之，術語“處理”係指投與本發明調酸素類似物來維持穩定血糖濃度在正常濃度，以減輕、改善或緩解糖尿病、糖胖症或糖尿病性併發症症狀。
本文所採用術語“糖尿病”為一種胰島素分泌不足或其功能無法正常運作之代謝疾病。糖尿病之特徵在於血糖濃度上升，造成各種不同病症及症候群。糖尿病病例中，會從尿液中排出葡萄糖。
本文所採用術語“糖胖症”係指伴隨出現肥胖病症之糖尿病(尤其指第2型糖尿病)或通常發生在第2型糖尿病患者之肥胖病症。約80至90%的第2型糖尿病患者患有肥胖症狀，其特徵為胰島素抗性。適當運動、膳食療法及藥物療法可以預防糖胖症及減輕糖胖症症狀。本發明中，糖胖症可能指由肥胖引起之病症。
本文所採用術語“糖尿病性併發症”係指身體因長期維持高血糖症狀所發生之各種不同病理病症。糖尿病性併發症實例包括(但不限於)：腎病變、腎功能障礙、神經病變、因各種不同病變引起之中風、腎臟或心臟疾病、糖尿病足部潰瘍、及心血管疾病。若長期維持在高血糖症狀下，會在體內造成各種不同病理症狀。通常，會提高腎病變、腎功能障礙、神經病變、因各種不同病變引起之中風、腎臟或心臟疾病、糖尿病足部潰瘍、及心血管疾病之風險。因此，為了預防糖尿病性併發症，必需有效控制血糖濃度。
因此，本發明醫藥組成物可用於預防或治療糖尿病、糖胖症或糖尿病性併發症。
本發明實例中，利用聚乙二醇共價連接本發明調酸素類似物與免疫球蛋白Fc區，製備本發明長效性調酸素類似物結合物，並將所製備結合物投與罹患高脂肪膳食所誘發肥胖之小鼠模式及因瘦體素受體突變所誘發糖尿病之小鼠模式。結果顯示，本發明長效性調酸素類似物結合物投藥組在誘發肥胖之動物模式中之體重及飼料攝取量顯著降低(第1圖)，且血糖濃度亦顯著降低(第2圖)。此外，本發明長效性調酸素類似物結合物所顯示之降血糖效應等於或高於VICTOZA®(其係市售商品長效性GLP-1類似物)(第2圖)。
本發明實例中，由本發明調酸素類似物共價連接免疫球蛋白Fc區，製備長效性調酸素類似物結合物，並將所製備結合物投與因瘦體素受體突變所誘發糖尿病之小鼠模式。結果顯示，相較於對照組，長效性調酸素類似物結合物投藥組之體重增加量顯著受到抑制(第3圖)，且血糖濃度顯著下降(第4圖)，而且該結合物顯示比VICTOZA®(其係一種市售商品長效性GLP-1類似物)更優異之降血糖效應(第4圖)。
換言之，根據本發明調酸素類似物之功能在於活體內誘發擴大β-細胞，以增加胰島素分泌，藉以改善控制血糖濃度之能力。此外，根據本發明調酸素類似物可以誘發減輕體重，以改善胰島素敏感度及預防發展出 心血管疾病，包括動脈粥樣硬化、高血脂症及高血壓，其可能因胰島素抗性而造成死亡。因此，本發明調酸素類似物可有效用為治療糖尿病、糖胖症及糖尿病性併發症之藥劑。此外，本發明結合物比天然調酸素更具有活化GLP-1受體及升糖素受體之高度能力，並基於與Fc區結合，而於活體內顯示延長之血液半衰期，因此可在活體內長期維持活性。
本發明組成物可為醫藥組成物。
本發明醫藥組成物可進一步包含對糖尿病、糖胖症或糖尿病性併發症展現預防或醫療效果之藥劑。為了由本發明調酸素類似物與已知作為糖尿病、糖胖症或糖尿病性併發症醫療劑之藥劑組合投藥，本發明組成物可進一步包含此已知藥劑。
因此，本發明組成物可單獨投藥或與其他藥物組合投藥，供預防或治療糖尿病、糖胖症或糖尿病性併發症。
本文所採用術語“投藥”意指採用任何適當方法將指定物質引進患者體內。本發明類似物可利用任何常用途徑投藥，只要其可以到達目標組織即可。明確言之，本發明類似物可經腹膜內、靜脈內、肌內、皮下、皮內、經口、局部表面、鼻內、肺內或直腸內投藥，但不受此限制。然而，由於肽在經口投藥時會被消化，因此調配口服組成物時較佳係讓活性成份包覆包衣或加以保護防止在胃中降解。本發明組成物較佳係呈注射型式投藥。此外， 本發明醫藥組成物可採用任何可傳送活性成份至目標細胞之系統。
包含本發明調酸素類似物之醫藥組成物可進一步包含醫藥上可接受之載劑。經口投藥時，醫藥上可接受之載劑包括結合劑、潤滑劑、崩解劑、賦形劑、溶解劑、勻散劑、安定劑、懸浮劑、著色劑、與調味劑。注射劑中，醫藥上可接受之載劑包括緩衝劑、防腐劑、止痛劑、溶解劑、等滲劑、與安定劑。供局部表面投藥時，醫藥上可接受之載劑包括基質、賦形劑、潤滑劑與防腐劑。本發明醫藥組成物可使用上述醫藥上可接受之載劑調配成各種不同劑型。例如：經口投藥時，該醫藥組成物可調配成錠劑、口含錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿或粉片等等。用於注射劑時，該醫藥組成物可調配成單位劑量之安瓿或多劑量容器之形式。此外，該醫藥組成物亦可調配成溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊與持續釋放製劑。
同時，適用於該調配物之載劑、賦形劑與稀釋劑實例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤糖醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯基吡咯啶酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂與礦物油。此外，本發明醫藥調配物可進一步包括填料、抗凝集劑、潤滑劑、保濕劑、香料、防腐劑等等。
本發明醫藥組成物之劑量係依據活性成份 型態配合各種不同因素決定，如：所處理之疾病、投藥途徑、患者年齡、性別與體重、及疾病嚴重性。本發明醫藥組成物具有長的活體內半衰期與優異效果，因此可藉以顯著減少醫藥組成物之投藥數量與頻率。
另一態樣中，本發明提供一種預防或治療糖尿病、糖胖症或糖尿病性併發症之方法，該方法包括對個體投與醫藥有效量之調酸素類似物。
本文中，調酸素類似物、糖尿病、糖胖症及糖尿病性併發症係如上述定義。
本文所採用術語“個體”係指彼等疑似患有糖尿病、糖胖症或糖尿病性併發症者。明確言之，該術語係指已患有上述疾病或有發展出上述疾病風險之哺乳動物，包括人類、小鼠與家畜。此外，該個體可為任何可接受本發明調酸素類似物處理之個體。
本發明醫療方法可包括投與醫藥有效量之包含該結合物之醫藥組成物之步驟。組成物之總日劑量可由醫師透過適當醫學判斷來決定，並投與該組成物一次或數次。然而基於本發明之目的，針對任何特定患者之組成物之明確醫療有效劑量可隨醫學領域中習知之各種不同因素變化，包括所要達成效果之型態與程度、是否併用其他藥劑之具體組成物、患者之年齡、體重、健康狀態、性別與膳食、投藥時間與途徑、組成物之分泌速率、治療時間期、與本發明組成物組合或併用之其他藥物，及醫學領域上習知之其他因素。
另一態樣中，本發明提供一種以本發明調酸素類似物於製備供預防或治療糖尿病、糖胖症或糖尿病性併發症之醫藥上之用途。
另一態樣中，本發明提供一種製備調酸素類似物結合物之方法。
本發明之製法可包括下列步驟：(1)由兩端具有反應性醛基、馬來醯亞胺基或琥珀醯亞胺基之非肽基聚合物共價連接至調酸素類似物肽之胺基或硫醇基；(2)從步驟(1)之反應混合物中分離出該包含調酸素類似物肽之結合物，其在非胺基末端之位置與非肽基聚合物共價連接；及(3)由免疫球蛋白Fc區共價連接至所分離結合物已連接之非肽基聚合物之另一端，藉以產生在非肽基聚合物之兩端分別包含免疫球蛋白Fc區與調酸素類似物肽之肽結合物。
更明確言之，該製法可包括下列步驟：(1)由在其各末端分別具有反應性醛基與馬來醯亞胺基之非肽基聚合物共價連接至調酸素類似物之半胱胺酸殘基；(2)從步驟(1)之反應混合物中分離出該包含調酸素類似物之結合物，其非肽基聚合物已共價連接至半胱胺酸殘基；及(3)由免疫球蛋白Fc區共價連接至所分離結合物上已連接非肽基聚合物之另一端，藉以產生包含分別在非肽基聚合物兩端連接免疫球蛋白Fc區與調酸素類似物之肽結合物。
下文中，本發明將參考下列實例更詳細說明。然而，咸了解此等實例僅供說明用，且無意限制本發 明範圍。
實例1：活體外活化細胞株製法
實例1-1：對GLP-1展現cAMP效應之細胞株之製法
使用相當於人類GLP-1受體基因之cDNA(OriGene Technologies,Inc.USA)之ORF(開放讀碼框)部份作為模板，及使用分別包括HindIII裂解位點與EcoRI裂解位點之逆向與正向引子進行PCR，得到PCR產物。
正向引子：5'-CCCGGCCCCCGCGGCCGCTATTCGAAATAC-3'(SEQ ID NO：50)
逆向引子：5'-GAACGGTCCGGAGGACGTCGACTCTTAAGATAG-3'(SEQ ID NO：51)
選殖該PCR產物至已知之動物細胞表現載體x0GC/dhfr中，構築成重組體載體x0GC/GLP-1R。
取重組體載體x0GC/GLP-1R，利用轉染胺(lipofectamine)(Invitrogen,USA)引至於DMEM/F12(10% FBS)培養基中培養之CHO DG44細胞株中，得到轉形株。該轉形株於包含1mg/mL G418與10nM胺甲蝶呤之選擇性培養基中培養，自其中選擇單株細胞株。然後，最後自單株細胞株中選擇可以隨濃度變化對GLP-1展現良好cAMP效應之細胞株。
實例1-2：對升糖素展現cAMP效應之細胞株之製法
使用相當於人類升糖素受體基因之cDNA(OriGene Technologies,Inc.USA)中之ORF(開放讀碼框)部份作為模板，及使用分別包括EcoRI裂解位點與XhoI裂解位點之逆向與正向引子進行PCR，得到PCR產物。
正向引子：5'-CAGCGACACCGACCGTCCCCCCGTACTTAAGGCC-3'(SEQ ID NO：52)
逆向引子：5'-CTAACCGACTCTCGGGGAAGACTGAGCTCGCC-3'(SEQ ID NO：53)
選殖該PCR產物至已知之動物細胞表現載體x0GC/dhfr中，構築成重組體載體x0GC/GCGR。
取重組體載體x0GC/GCGR，利用轉染胺(Invitrogen,USA)引至於DMEM/F12(10% FBS)培養基中培養之CHO DG44細胞株中，得到轉形株。該轉形株於包含1mg/mL G418與10nM胺甲蝶呤之選擇性培養基中培養，自其中選擇單株細胞株。然後，最後自單株細胞株中選擇可以隨濃度變化對升糖素展現良好cAMP效應之細胞株。
實例2：調酸素類似物之活體外活性
實例2-1：調酸素類似物合成法
為了測定調酸素類似物活體外活性，合成具有下表1所示胺基酸序列之調酸素類似物。
上表1中，由粗字體表示之胺基酸係指形成環，由X表示之胺基酸係指非天然胺基酸之α-甲基-麩胺酸。此外，CA表示4-咪唑乙醯基，DA表示脫胺基-組胺醯基，及(d)S表示d-絲胺酸。
實例2-2：調酸素類似物之活體外活性測定法
為了測定上述實例2-1所製備肽之效果，採用實例1-1與1-2製備之轉形株，測定肽於細胞中之活體外活性。
各該轉形株係經過轉形以便分別在CHO(中國倉鼠卵巢)中表現人類GLP-1受體基因與升糖素受體基因，因此其適合測定GLP-1與升糖素活性。因此，分別使用各轉形體測定各調酸素類似物之活性。
明確言之，每週次培養各轉形株2次或3次，並依1× 105個細胞/孔之密度分配至96孔盤之各孔中，然後培養24小時所培養之細胞經過KRB緩衝液洗滌，懸浮於含1mM IBMX之40ml KRB緩衝液中，靜置於室溫下5分鐘。取各調酸素((SEQ ID NO：1)與調酸素類似物(SEQ ID NO：2至6、8、10至13、17、18、23至25、27、28及32至34)從1000nM經過5倍連續稀釋至0.02nM，各取40ml稀釋液加至細胞中，於37℃及CO2培養箱中培養1小時。然後添加20ml溶胞緩衝液溶解細胞，使用cAMP分析套組(Molecular Device,USA)測定各溶胞物中cAMP濃度。由測定結果計算EC50值，並相互比較(表2)。
如上表2所示，相較於SEQ ID NO.1之調酸素，調酸素類似物展現優異之活體外GLP-1與升糖素受體活性。
已知調酸素藉由活化GLP-1受體與升糖素受體而具有治療肥胖、高血脂症、脂肪肝疾病或動脈粥樣硬化之活性。相較於天然調酸素，根據本發明調酸素類似物具有活化GLP-1受體與升糖素受體之高度能力，其表示相較於天然調酸素，此等調酸素類似物可高度有效於治療糖尿病、糖胖症或糖尿病性併發症。
實例3：包含調酸素類似物(SEQ ID NO：23)與免疫球蛋白Fc之結合物(免疫球蛋白Fc-結合調酸素類似物23)製法
為了使用MAL-10K-ALD PEG(日本NOF.)在調酸素類似物之胺基酸序列(SEQ ID NO：23)之位置24半胱胺酸殘基上進行PEG基化，由調酸素類似物(SEQ ID NO：23)與MAL-10K-ALD PEG依1：3莫耳比，在蛋白質濃度3mg/ml，於室溫反應3小時。於含1M胍之50mM Tris緩衝液(pH 8.0)中進行反應。反應完成後，施加反應溶液至下列條件之SOURCE S，藉以純化在半胱胺酸上單-PEG基化之調酸素類似物：管柱：SOURCE S，流速：2.0ml/min，梯度：A 0→100% 50min B(A：20mM檸檬酸鈉(pH 3.0)+45%乙醇，B：A+1M KCl)。
然後，由純化之單-PEG基化調酸素類似物(SEQ ID NO：23)與免疫球蛋白Fc彼此依1：5之莫耳比，在蛋白質濃度20mg/ml，於4℃反應16小時。該反應係在含20mM SCB 作為還原劑之100mM磷酸鉀緩衝液(pH 6.0)中進行。反應完成後，施加反應溶液至SOURCE純化管柱(管柱：SOURCE 15Q，流速：2.0ml/min，梯度：A 0→4% 1min，B→20% 80min B(A：20mM Tris-HCl，pH 7.5，B：A+1M NaCl))與SOURCE ISO管柱(管柱：SOURCE ISO，流速：2.0ml/min，梯度：B 0→100% 100min A(A：20mM Tris-HCl，pH 7.5，B：A+1.1M AS))，藉以純化包含調酸素類似物(SEQ ID NO：23)與免疫球蛋白Fc之結合物。
實例4：包含調酸素類似物(SEQ ID NO：25)與免疫球蛋白Fc之結合物(免疫球蛋白Fc-結合調酸素類似物25)製法
為了使用MAL-10K-ALD PEG在調酸素類似物之胺基酸序列(SEQ ID NO：25)之位置30半胱胺酸殘基上進行PEG基化，由調酸素類似物(SEQ ID NO：25)與MAL-10K-ALD PEG依1：3莫耳比，在蛋白質濃度3mg/ml，於室溫反應3小時。於含1M胍之50mM Tris緩衝液(pH 8.0)中進行反應。反應完成後，施加反應溶液至下列條件之SOURCE S，藉以純化在半胱胺酸上單-PEG基化之調酸素類似物：管柱：SOURCE S，流速：2.0ml/min，流速：A 0→100% 50min B(A：20mM檸檬酸鈉(pH 3.0)+45%乙醇，B：A+1M KCl)。
然後，由純化之單-PEG基化調酸素類似物(SEQ ID NO：25)與免疫球蛋白Fc彼此依1：5之莫耳比，在蛋白質濃度20mg/ml，於4℃反應16小時。該反應係在含20mM SCB作為還原劑之100mM磷酸鉀緩衝液(pH 6.0)中進行。反應 完成後，施加反應溶液至下列條件之SOURCE 15Q管柱(管柱：SOURCE 15Q，流速：2.0ml/min，梯度：A 0→4% 1min B→20% 80min B(A：20mM Tris-HCl(pH 7.5)，B：A+1M NaCl))及Source ISO管柱(管柱：SOURCE ISO，流速：2.0ml/min，流速：B 0→100% 100min A(A：20mM Tris-HCl(pH 7.5)，B：A+1.1M AS))，藉以純化包含調酸素類似物(SEQ ID NO：25)與免疫球蛋白Fc之結合物。
實例5：包含調酸素類似物(SEQ ID NO：27)與免疫球蛋白Fc之結合物(免疫球蛋白Fc-結合調酸素類似物27)製法
為了使用MAL-10K-ALD PEG在調酸素類似物之胺基酸序列(SEQ ID NO：27)之位置30半胱胺酸殘基上進行PEG基化，由調酸素類似物(SEQ ID NO：27與MAL-10K-ALD PEG依1：3莫耳比，在蛋白質濃度3mg/ml，於室溫反應3小時。於含1M胍之50mM Tris緩衝液(pH 8.0)中進行反應。反應完成後，施加反應溶液至下列條件之SOURCE S，藉以得到在半胱胺酸上單-PEG基化之調酸素類似物：管柱：SOURCE S，流速：2.0ml/min，流速：A 0→100% 50min B(A：20mM檸檬酸鈉(pH 3.0)+45%乙醇，B：A+1M KCl)。
然後，由純化之單-PEG基化調酸素類似物(SEQ ID NO：27)與免疫球蛋白Fc彼此依1：5之莫耳比，在蛋白質濃度20mg/ml，於4℃反應16小時。該反應係在含20mM SCB作為還原劑之100mM磷酸鉀緩衝液(pH 6.0)中進行。反應完成後，施加反應溶液至下列條件之SOURCE 15Q管柱(管 柱：SOURCE 15Q，流速：2.0ml/min，梯度：A 0→4% 1min B→20% 80min B(A：20mM Tris-HCl(pH 7.5)，B：A+1M NaCl))及Source ISO管柱(管柱：SOURCE ISO，流速：2.0ml/min，流速：B 0→100% 100min A(A：20mM Tris-HCl(pH 7.5)，B：A+1.1M AS))，藉以純化包含調酸素類似物(SEQ ID NO：27)與免疫球蛋白Fc之結合物。
實例6：長效性調酸素類似物於高脂肪膳食誘發肥胖(HF DIO)小鼠中降低體重及血糖濃度之效果
實例6-1：實驗方法
6-週齡大小鼠(C57BL/6，120-130g)係購自OrientBIO(韓國)。所購得之C57BL/6小鼠為常用於肥胖及糖尿病之動物，因為此動物很容易利用高脂肪膳食誘發肥胖。HF DIO小鼠為常用於糖尿病研究之囓齒類，其不需要基因操作即可將高脂肪膳食轉移至器官中，並自然顯示類似人類之肥胖及糖尿病病症，此點不同於以瘦體素受體突變誘發糖尿病之db/db小鼠。因此，本發明中，此等動物可用於檢測本發明組成物於糖胖症中降低體重及血糖濃度之效果。
讓此等動物攝取經過UV照射殺菌之高脂肪膳食(60%Kcal來自脂肪膳食，D12492；Research Diets Inc.)。此外，此等動物亦利用水瓶攝取經過過濾及UV-殺菌之自來水。動物飼養在符合GLP標準之飼養籠中，在12-小時照光/12-小時黑暗之循環下(照光：早上6點至晚上6點)，所有實驗過程均依據動物實驗之標準規定進行。在誘發肥胖26週後開始投與藥物，並將動物分成5組(n=6)，如下表3 所示。
明確言之，第1組(HF DIO誘發組，對照組)接受高脂肪飼料及一週一次或更多次經皮下投與5ml/kg(注射體積)杜氏(Dulbecco’s)磷酸鹽緩衝生理食鹽水(DPBS，Sigma)。進行血糖耐受性試驗時，第1組在試驗前24小時接受皮下投與杜氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水(DPBS，Sigma)，並禁食16小時。從尾部收集血液，測定空腹葡萄糖濃度，並在腹部內投與1g/kg葡萄糖後15分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘與120分鐘時測定血糖濃度。
第2組(HF DIO-誘發組及100nmol/kg VICTOZA®-投藥組)接受高脂肪膳食餵食，以誘發肥胖及高血糖症，然後一天一次經皮下投與5ml/kg(注射體積)市售商品VICTOZA®(GSK)。進行血糖耐受性試驗時，第2組在試驗前禁食16小時後，再於試驗前4小時經皮下投與100nmol/kg VICTOZA®。從尾部收集血液，測定空腹葡萄糖濃度，然後在腹部內投與1g/kg之葡萄糖後15分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘及120分鐘時測定血糖濃度。
第3組(HF DIO-誘發組及1nmol/kg SEQ ID NO：25-Fc結合物-投藥組)接受高脂肪膳食餵食，以誘發肥胖及高血糖症，然後一週一次經皮下投與1nmol/kg(注射體積5ml/kg)實例4製備之SEQ ID NO：25-Fc結合物。進行血糖耐受性試驗時，第3組於試驗前24小時經皮下投與1nmol/kg SEQ ID NO：25-Fc結合物，並在試驗前禁食16小時。從尾部收集血液，測定空腹葡萄糖濃度，然後在腹部內投與1g/kg之葡萄糖後15分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘及120分鐘時，測定血糖濃度。
第4組(HF DIO-誘發組及3nmol/kg SEQ ID NO：25-Fc結合物-投藥組)接受高脂肪膳食餵食，以誘發肥胖及高血糖症，然後一週一次經皮下投與3nmol/kg(注射體積5ml/kg)實例4製備之SEQ ID NO：25-Fc結合物。進行血糖耐受性試驗時，第4組於試驗前24小時經皮下投與3nmol/kg SEQ ID NO：25-Fc結合物，並在試驗前禁食16小時。從尾部收集血液，測定空腹葡萄糖濃度，然後在腹部內投與1g/kg之葡萄糖後15分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘及120分鐘時，測定血糖濃度。
第5組(HF DIO-誘發組及5nmol/kg SEQ ID NO：25-Fc結合物-投藥組)接受高脂肪膳食餵食，以誘發肥胖及高血糖症，然後一週一次經皮下投與5nmol/kg(注射體積5ml/kg) 實例4製備之SEQ ID NO：25-Fc結合物。進行血糖耐受性試驗時，第5組於試驗前24小時經皮下投與5nmol/kg SEQ ID NO：25-Fc結合物，並在試驗前禁食16小時。從尾部收集血液，測定空腹葡萄糖濃度，然後在腹部內投與1g/kg之葡萄糖後15分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘及120分鐘時，測定血糖濃度。
所有組(n=6)中，均投與生理食鹽水或各藥物2週，然後分析其對降低體重及血糖濃度之效果。
實例6-2：長效性調酸素類似物於高脂肪膳食誘發肥胖(HF DIO)小鼠中降低體重及血糖濃度之效果
為了檢測本發明長效性調酸素類似物在高脂肪膳食誘發(26週)肥胖(HF DIO)小鼠(其係穩定肥胖模式)中降低血糖濃度之效果，對依據實例6-1分組之DIO小鼠經皮下投與長效性調酸素類似物，一週一次，共2週。每天測定體重及飼料攝取量，並於第0、3、7、10及14天自DIO小鼠尾部收集血液，採用HITACHI 7020分析血糖濃度變化。體重及血糖濃度之變化示於第1圖及第2圖中。
第1圖顯示體重之變化，及第2圖顯示血糖AUC(曲線下面積)。所得結果經過統計分析，計算平均值及平均值之標準偏差。
在證實各組(n=6)之間之顯著性時，數據係採用鄧肯氏單向ANOVA試驗(Dunnett's test of one-way ANOVA)進行統計分析，並以p<0.05之數值視為具有統計顯著性。
明確言之，體重變化之測定結果顯示，由高脂肪膳食 誘發肥胖(26週)之小鼠之體重並未下降，而接受投與長效性調酸素類似物(SEQ ID NO：25-Fc結合物)之肥胖小鼠之體重則隨劑量變化而下降(第1圖)。
測定血糖濃度之結果顯示，當肥胖小鼠接受投與長效性調酸素類似物(SEQ ID NO：25-Fc結合物)時，該小鼠之血糖濃度隨劑量變化而下降。特定言之，當肥胖小鼠接受投與5nmol/kg之長效性調酸素類似物(SEQ ID NO：25-Fc結合物)時，其血糖濃度比高脂肪膳食誘發之DIO小鼠顯著下降，且5nmol/kg之長效性調酸素類似物(SEQ ID NO：25-Fc結合物)之降血糖效果等於或優於VICTOZA®(其係一種供治療糖尿病之市售商品藥物)(第2圖)。
由實例6-2之結果發現，本發明長效性調酸素類似物結合物(其包含利用PEG共價連接免疫球蛋白Fc區之調酸素類似物)可降低高脂肪膳食誘發之肥胖(HF DIO)小鼠之體重及血糖濃度，此表示其可用於有效治療糖尿病、糖胖症或相關疾病。
實例7：長效性調酸素類似物於瘦體素受體突變所誘發糖尿病之db/db小鼠中降低體重及血糖濃度之效果
實例7-1：實驗方法
7-週齡雄性BKS.Cg -+ Leprdb/+Leprdb/OlaHsd小鼠(25±3g,Harlan U.S.A)係購自Doo Yeol Biotech(韓國)。BKS.Cg -+ Leprdb/+Leprdb/OlaHsd小鼠(下文稱為db/db小鼠)為最常與ob/ob小鼠一起用於糖尿病試驗之囓齒類，且此等小鼠透 過瘦體素受體突變而自然顯示類似人類之糖尿病症狀。因此本發明在發展治療糖尿病之藥劑中，使用此等動物來檢測本發明製劑之降血糖效果。
讓所購得之動物適應實驗環境一週後，依據其葡萄糖濃度隨機分組。
讓動物攝取經過UV殺菌之固體飼料(Picolab囓齒類飼料5053)。此外亦使用水瓶讓動物攝取經過過濾及UV殺菌之自來水。動物飼養在符合GLP標準之飼養籠中，在12-小時照光/12-小時黑暗之循環下(照光：早上6點至晚上6點)，所有實驗過程均依據動物實驗之標準規定進行。將動物分成4組(n=7)，及如下表4所示投與藥物。
明確言之，第1組(媒劑)對照組接受經皮下投與5ml/kg之杜氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水(DPBS,Sigma)，一週一次。
第2組(投與60nmol/kg之VICTOZA®)藥物處理組每天 一次經皮下投與60nmol/kg(針對糖尿病之劑量；注射體積5ml/kg)之市售商品Victoza®(GSK)。
第3組(投與100nmol/kg之VICTOZA®)藥物處理組每天一次經皮下投與100nmol/kg(針對肥胖之劑量；注射體積5ml/kg)之市售商品Victoza®(GSK)。
第4組(15nmol/kg之SEQ ID NO：23-Fc結合物)藥物處理組每週一次經皮下投與15nmol/kg(注射體積5ml/kg)之實例4製備之SEQ ID NO：23-Fc結合物。
第5組(6nmol/kg之SEQ ID NO：25-Fc結合物)藥物處理組每週一次經皮下投與6nmol/kg(注射體積5ml/kg)之實例4製備之SEQ ID NO：25-Fc結合物。
所有組(n=7)均接受投與生理食鹽水或各藥物4週，然後分析其對降低體重及血糖濃度之效果。
實例7-2：長效性調酸素類似物於瘦體素受體突變所誘發糖尿病之db/db小鼠中降低體重及血糖濃度之效果之分析法
為了檢測本發明長效性調酸素類似物於瘦體素受體突變所誘發糖尿病之db/db小鼠中降低血糖濃度之效果，對實例7-1中所分組之the db/db小鼠經皮下投與長效性調酸素類似物，一週一次，共4週。每週兩次測定小鼠之體重變化，並自db/db小鼠尾部抽血(於第1週與第4週係每天抽血，於第1週及第3週係每週2次)，並採用HITACHI 7020分析血糖濃度變化。
第3圖顯示體重變化，及第4圖顯示血糖AUC(曲線 下面積)。所得結果經過統計分析，計算平均值及平均值之標準偏差。在證實各組(n=6)之間之顯著性時，數據係採用鄧肯氏單向ANOVA試驗進行統計分析，並以p<0.05之數值視為具有統計顯著性。
明確言之，體重變化之測定結果顯示，db/db小鼠對照組之體重從投藥日開始即持續上升，而當小鼠接受投與長效性調酸素類似物(SEQ ID NO：23-Fc結合物或SEQ ID NO：25-Fc結合物)時，其體重與開始投藥日時所測定之體重沒有實質上變化，此表示結合物在抑制體重上升上顯示顯著之效果(第3圖)。
血糖濃度之測定結果顯示，當小鼠接受投與長效性調酸素類似物(SEQ ID NO：23-Fc結合物或SEQ ID NO：25-Fc結合物)時，血糖濃度比對照組顯著下降。特定言之，相較於VICTOZA®(其係供治療糖尿病之市售商品藥物)，投與6nmol/kg之長效性調酸素類似物(SEQ ID NO：25-Fc結合物)顯示降血糖效果(第4圖)。
由實例7之結果可見，相較於媒劑及常用於治療糖尿病藥物之VICTOZA®，本發明長效性調酸素類似物(其包含利用PEG共價連接免疫球蛋白Fc區之調酸素類似物)可在瘦體素受體突變誘發糖尿病之db/db小鼠中顯著降低血糖濃度(糖尿病之指標)，此表示本發明長效性調酸素類似物可極有效用於治療糖尿病。此外，本發明長效性調酸素類似物顯示抑制體重上升之顯著效果，此表示其可降低糖尿病心血管併發症。
由實例6與7之結果可見，本發明長效性調酸素類似物結合物顯示等於或優於已知具有降血糖效果之VICTOZA®之優異降血糖效果，及具有優異之減輕體重效應，此表示本發明長效性調酸素類似物結合物可藉由其降血糖效應，有效用為治療糖尿病、糖胖症及糖尿病性併發症之藥物。
熟悉此相關技術者咸了解，本發明可在不偏離其精神或基本特徵下，以其他特定形式進行具體實施例。所說明之具體實施例在所有態樣中均僅視為說明且無限制性。因此本發明之範圍係由附錄之申請專利範圍而非上述說明來指示。在與申請專利範圍等同之定義及範圍內之所有變化均視為屬於本發明之範圍。
<110> 韓美藥品股份有限公司
<120> 治療糖尿病或糖胖症之包括調酸素類似物之組成物
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<150> PCT/KR2013/009990
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<150> KR 10-2012-0124724
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<160> 59
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 37
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(37)
<223> 調酸素
<400> 1
<210> 2
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的 調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 4-咪唑乙醯基
<400> 2
<210> 3
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之敘述：合成的 調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 4-咪唑乙醯基
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<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之敘述：合成的 調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 4-咪唑乙醯基
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的 調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 4-咪唑乙醯基
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列之敘述：合成的 調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之敘述：合成的 調酸素衍生物之多肽結構
<220>
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<223> 人工序列之敘述：合成的調酸素衍生物之肽結構
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的 調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 4-咪唑乙醯基
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> α-甲基-麩胺酸
<400> 9
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<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 4-咪唑乙醯基
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的 調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 4-咪唑乙醯基
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 4-咪唑乙醯基
<400> 12
<210> 13
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的 調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 4-咪唑乙醯基
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> α-甲基-麩胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> α-甲基-麩胺酸
<400> 13
<210> 14
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的 調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 4-咪唑乙醯基
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> α-甲基-麩胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> α-甲基-麩胺酸
<400> 14
<210> 15
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的 調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 4-咪唑乙醯基
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> α-甲基-麩胺酸
<400> 15
<210> 16
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 4-咪唑乙醯基
<400> 16
<210> 17
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 4-咪唑乙醯基
<400> 17
<210> 18
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 4-咪唑乙醯基
<400> 18
<210> 19
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 4-咪唑乙醯基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基之間的環形成
<400> 19
<210> 20
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 4-咪唑乙醯基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基之間的環形成
<400> 20
<210> 21
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 4-咪唑乙醯基
<400> 21
<210> 22
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 脫胺基-組胺醯基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基之間的環形成
<400> 22
<210> 23
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的調酸素衍生物之肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib
<400> 23
<210> 24
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib
<400> 24
<210> 25
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基之間的環形成
<400> 25
<210> 26
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(16)
<223> 殘基之間的環形成
<400> 26
<210> 27
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的調酸素衍生物之肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基之間的環形成
<400> 27
<210> 28
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的調酸素衍生物之肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib
<400> 28
<210> 29
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> D-Ser
<400> 29
<210> 30
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 4-咪唑乙醯基
<400> 30
<210> 31
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的調酸素衍生物之多肽結構
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 4-咪唑乙醯基
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> D-Ser
<400> 31
<210> 32
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的多肽調酸素衍生物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 4-咪唑乙醯基
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib
<400> 32
<210> 33
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的多肽調酸素衍生物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib
<400> 33
<210> 34
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的多肽調酸素衍生物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib
<400> 34
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的基團R2之肽結構
<400> 35
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的基團R2之肽結構
<400> 36
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的基團R2之肽結構
<400> 37
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的基團R2之肽結構
<400> 38
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的基團R2之肽結構
<400> 39
<210> 40
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的基團R2之肽結構
<400> 40
<210> 41
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的基團A或B之肽結構
<400> 41
<210> 42
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的 基團A或B之肽結構
<400> 42
<210> 43
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的基團A或B之肽結構
<400> 43
<210> 44
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的基團A或B之肽結構
<400> 44
<210> 45
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的基圖A或B之肽結構
<400> 45
<210> 46
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的基團A或B之肽結構
<400> 46
<210> 47
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的基團A或B之肽結構
<400> 47
<210> 48
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的基團B之肽結構
<400> 48
<210> 49
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的基團B之肽結構
<400> 49
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的引子
<400> 50
<210> 51
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的引子
<400> 51
<210> 52
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的引子
<400> 52
<210> 53
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的引子
<400> 53
<210> 54
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 組胺酸、脫胺基-組胺醯基、二甲基-組胺醯基(N-二甲基-組胺醯基)、β-羥基咪唑丙醯基、4-咪唑乙醯基、β-羧基咪唑丙醯基或酪胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib(胺基異丁酸)、d-丙胺酸、甘胺酸、Sar(N-甲基甘胺酸)、絲胺酸或d-絲胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 麩胺酸或麩醯胺
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 白胺酸或酪胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 絲胺酸或丙胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 離胺酸或精胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 麩醯胺或酪胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 白胺酸或甲硫胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 天冬胺酸或麩胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 麩胺酸、絲胺酸、α-甲基-麩胺酸或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 為麩醯胺、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、絲胺酸或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> 丙胺酸、精胺酸、纈胺酸或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> 丙胺酸、精胺酸、絲胺酸、纈胺酸或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> 離胺酸、麩醯胺、精胺酸、α-甲基-麩胺酸或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> 天冬胺酸、麩胺酸、白胺酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> 可能存在或可能不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> 異白胺酸、纈胺酸或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> 丙胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、離胺酸、麩醯胺、α-甲基-麩胺酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> 可能存在或可能不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(26)
<223> 丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、絲胺酸、纈胺酸或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> 丙胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、麩醯胺、精胺酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> 可能存在或可能不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (29)..(29)
<223> 丙胺酸、甘胺酸、蘇胺酸或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (30)..(30)
<223> 半胱胺酸、離胺酸或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (31)..(40)
<223> 丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(40)
<223> 本區域可包括2至10個胺基酸，其中有些位置可能不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(60)
<223> 本區域可包括8至20個胺基酸，包括“KRNRNNIA”或“GPSSGAPPPS”或“GPSSGAPPPSK”或“HSQGTFTSDYSKYLD”或“HSQGTFTSDYSRYLDK”或“HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK”，其中有些或所有位置可能不存在
<220>
<223> 參見申請時說明書中對於取代基和較佳具體實施例的詳細說明
<400> 54
<210> 55
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 組胺酸、脫胺基-組胺醯基、二甲基-組胺醯基(N-二甲基-組胺醯基)、β-羥基咪唑丙醯基、4-咪唑乙醯基、β-羧基咪唑丙醯基或酪胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(29)
<223> 本區域可包括26至28個胺基酸，包括“SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT”或“SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT”或“SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT”或“GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG”或“GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG”
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(29)
<223> 承上：或“GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA”或“SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG”，其中有些位置可能不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(40)
<223> 本區域可包括8至11個胺基酸，包括“KRNRNNIA”或“GPSSGAPPPS”或“GPSSGAPPPSK”，其中有些位置可能不存在
<220>
<223> 參見申請時說明書中對於取代基和較佳具體實施例的詳細說明
<400> 55
<210> 56
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 組胺酸、脫胺基-組胺醯基、二甲基-組胺醯基(N-二甲基-組胺醯基)、β-羥基咪唑丙醯基、4-咪唑乙醯基、β-羧基咪唑丙醯基或酪胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(29)
<223> 本區域可包括14至28個胺基酸，包括“SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT”或“SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT”或“SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT”或“GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG”或“GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG”
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(29)
<223> 承上；或“GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA”或“SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG”或“GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEW”或“SQGTFTSDYSRYLD”，其中有些位置可能不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (30)..(39)
<223> 丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(39)
<223> 本區域可包括2至10個胺基酸，其中有些位置可能不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(59)
<223> 本區域可包括15至20個胺基酸，包括“HSQGTFTSDYSKYLD”或“HSQGTFTSDYSRYLDK”或“HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK〞，其中有些位置可能不存在
<220>
<223> 參見申請時說明書中對於取代基和較佳具體實施例的詳細說明
<400> 56
<210> 57
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 組胺酸、脫胺基-組胺醯基、二甲基-組胺醯基(N-二甲基-組胺醯基)、β-羥基咪唑丙醯基、4-咪唑乙醯基、β-羧基咪唑丙醯基或酪胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 絲胺酸、麩胺酸或精胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 精胺酸、麩胺酸或絲胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> 精胺酸、丙胺酸或纈胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> 精胺酸、纈胺酸或絲胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> 麩醯胺、精胺酸或離胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(26)
<223> 異白胺酸、纈胺酸或絲胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> 甲硫胺酸、精胺酸或麩醯胺
<220>
<221> MOD_RES
<222> (29)..(29)
<223> 蘇胺酸、甘胺酸或丙胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(40)
<223> 本區域可包括8至11個胺基酸，包括“KRNRNNIA”或“GPSSGAPPPS”或“GPSSGAPPPSK”，其中有些位置可能不存在
<220>
<223> 參見申請時說明書中對於取代基和較佳具體實施例的詳細說明
<400> 57
<210> 58
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 組胺酸、脫胺基-組胺醯基、二甲基-組胺醯基(N-二甲基-組胺醯基)、β-羥基咪唑丙醯基、4-咪唑乙醯基、β-羧基咪唑丙醯基或酪胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 絲胺酸、Aib、甲基甘胺酸、d-丙胺酸或d-絲胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 絲胺酸或麩胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 精胺酸或離胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> 麩醯胺或離胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> 天冬胺酸或麩胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> 麩醯胺、半胱胺酸或離胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (30)..(30)
<223> 半胱胺酸、離胺酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(41)
<223> 本區域可包括8至11個胺基酸，包括“KRNRNNIA”或“GPSSGAPPPS”或“GPSSGAPPPSK”，其中有些或所有位置可能不存在
<220>
<223> 參見申請時說明書中對於取代基和較佳具體實施例的詳細說明
<400> 58
<210> 59
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之敘述：合成的多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 組胺酸、脫胺基-組胺醯基、4-咪唑乙醯基或酪胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib(胺基異丁酸)、甘胺酸或絲胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 麩胺酸或麩醯胺
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 白胺酸或酪胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 絲胺酸或丙胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 離胺酸或精胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 麩醯胺或酪胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 白胺酸或甲硫胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 天冬胺酸或麩胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 麩胺酸、α-甲基-麩胺酸或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 麩醯胺、麩胺酸、離胺酸或精胺酸或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> 丙胺酸、精胺酸或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> 丙胺酸、纈胺酸或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> 離胺酸、麩醯胺、精胺酸或α-甲基-麩胺酸或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> 天冬胺酸、麩胺酸、白胺酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> 可能存在或可能不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> 異白胺酸、纈胺酸或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> 丙胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺、α-甲基-麩胺酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> 可能存在或可能不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(26)
<223> 丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、纈胺酸或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> 丙胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、精胺酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(29)
<223> 可能存在或可能不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (30)..(30)
<223> 半胱胺酸、離胺酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(40)
<223> 本區域可包括2至10個殘基，其中有些位置可能不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(60)
<223> 本區域可包括8至20個胺基酸，包括“KRNRNNIA”或“GPSSGAPPPS”或“GPSSGAPPPSK”或“HSQGTFTSDYSKYLD”或“HSQGTFTSDYSRYLDK”或“HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK”，其中有些或所有位置可能不存在
<220>
<223> 參見申請時說明書中對於取代基和較佳具體實施例的詳細說明
<400> 59

Claims (11)

  1. 一種醫藥有效量之調酸素類似物結合物之用途，係用於製備治療糖尿病、糖胖症或糖尿病性併發症之藥物，其中該調酸素類似物結合物包含調酸素類似物，係包含SEQ ID NO：24、25或26之胺基酸序列；免疫球蛋白Fc區；以及非肽基聚合物；其中該非肽基聚合物共價連接該調酸素類似物與該免疫球蛋白Fc區。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該調酸素類似物包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中在該調酸素類似物之位置12和16或16和20之胺基酸形成環。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該調酸素類似物包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列。
  5. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該調酸素類似物包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之用途，其中該非肽基聚合物包括聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯基醇、多醣、聚乙烯基乙基醚、PLA(聚乳酸)、PLGA(聚乳酸-乙醇酸)、脂質聚合物、玻尿酸、或其組合。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該非肽基聚合物係聚乙二醇。
  8. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該多醣係葡聚醣、幾丁質或其組合。
  9. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之用途，其中該非肽基聚合物之一末端連接至該免疫球蛋白Fc區之胺基或硫醇基，及該非肽基聚合物之另一末端連接至該調酸素類似物之胺基或硫醇基。
  10. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之用途，其進一步包含對糖尿病、糖胖症或糖尿病性併發症顯示預防或醫療效果之藥劑。
  11. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之用途，其中該糖尿病為依賴胰島素之第1型糖尿病或不依賴胰島素之第2型糖尿病。
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