ES2802099T3 - Una composición para el tratamiento de la diabetes que comprende un análogo de oxintomodulina - Google Patents

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Abstract

Una composición para su uso en la prevención o el tratamiento de la diabetes, la composición comprende un conjugado de análogo de oxintomodulina como un ingrediente activo en donde el conjugado de análogo de oxintomodulina comprende un análogo de oxintomodulina que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 24, 25 o 26; una región Fc de inmunoglobulina; y un polímero no peptidílico, en donde el polímero no peptidílico une el análogo de oxintomodulina a la región Fc de inmunoglobulina a través de un enlace covalente.

Description

DESCRIPCIÓN
Una composición para el tratamiento de la diabetes que comprende un análogo de oxintomodulina
Campo técnico
La presente invención se refiere a una composición para prevenir o tratar la diabetes, la composición que comprende un análogo de oxintomodulina como un ingrediente activo. Además, se describe en la presente descripción un método para prevenir o tratar la diabetes, diabesidad o complicaciones diabéticas, el método que comprende administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de un análogo de oxintomodulina a un sujeto.
Antecedentes de la técnica
En los últimos años, en Corea, la ingesta de grasas de los alimentos ha aumentado debido al crecimiento económico y la occidentalización de los hábitos alimenticios, y han aumentado enfermedades metabólicas tales como hiperlipidemia, obesidad, diabetes, hipertensión, arteriosclerosis y enfermedad del hígado graso, que son provocadas por falta de ejercicio.
La diabetes es un tipo de enfermedad metabólica en la cual la secreción de insulina es insuficiente o no se realizan las funciones normales (DeFronzo, 1988). La diabetes se caracteriza por el aumento de los niveles de glucosa en sangre que provocan diversas afecciones y síndromes. En el caso de la diabetes, la glucosa se excreta con la orina. En los últimos años, debido al aumento de la obesidad, particularmente la obesidad abdominal, la incidencia de diabetes ha aumentado de manera explosiva.
A nivel mundial, el número de pacientes diabéticos se estimó en 170 millones en el año 2000 y se esperaba que alcanzara los 370 millones en el año 2030. Sin embargo, un informe reciente mostró que el número de diabetes ya alcanzó alrededor de 350 millones en todo el mundo en el año 2008 (Danaei y otros, 2011), y por lo tanto es mucho mayor de lo esperado. Se informó que alrededor del 80 % o más de los pacientes con diabetes tipo 2 eran obesos, mientras que solo menos del 10 % de los pacientes obesos eran diabéticos (Harris y otros, 1987). Esta relación entre diabetes y obesidad se debe a que los ácidos grasos se acumulan en las células beta o en los tejidos sensibles a la insulina tales como los riñones, el hígado o el corazón debido a la secreción irregular de adipocinas y ácidos grasos libres, lo que resulta en lipotoxicidad.
Si una condición hiperglucémica crónica no se trata adecuadamente, conduce a varias condiciones patológicas en el cuerpo. Por lo general, aumenta el riesgo de retinopatía, disfunción renal, neuropatía, accidente cerebrovascular provocado por un trastorno vascular, enfermedades renales o cardíacas, úlcera del pie diabético y enfermedad cardiovascular. Tales complicaciones reducen la calidad de vida y eventualmente reducen la esperanza de vida de los pacientes diabéticos. Por lo tanto, para prevenir complicaciones diabéticas, el control eficaz de los niveles de glucosa en sangre es esencial.
Los métodos actuales que se usan para controlar los niveles de glucosa en sangre incluyen la modificación del estilo de vida (terapia de dieta o terapia de ejercicio) y la terapia con fármacos. Sin embargo, la terapia de dieta o la terapia de ejercicio es difícil de controlar e implementar estrictamente, y el efecto terapéutico de la misma también es insuficiente.
Por lo tanto, la mayoría de los pacientes diabéticos confían en la modificación del estilo de vida junto con el control de los niveles de glucosa en sangre mediante fármacos tales como insulina, estimuladores de la secreción de insulina, potenciadores de la sensibilidad a la insulina y agentes reductores del nivel de glucosa en sangre.
La insulina que se produce mediante métodos de recombinación es un fármaco esencial para pacientes diabéticos tipo 1 y pacientes diabéticos tipo 2 cuyos niveles de glucosa en sangre no están controlados, y es ventajoso para controlar los niveles de glucosa en sangre. Sin embargo, tiene deficiencias, que incluyen una sensación de miedo a las agujas hipodérmicas, dificultad en la administración, riesgo de hipoglucemia y un aumento de peso.
Las meglitinidas que son estimuladores de la secreción de insulina son fármacos que tienen un efecto muy rápido, se toman antes de las comidas e incluyen NovoNorm (repaglinida), Fastic (nateglinida), Glufast (mitiglinida), etc. Los potenciadores de la sensibilidad a la insulina se caracterizan porque provocan poca o ninguna hipoglucemia cuando se toman solos, y los ejemplos de los mismos incluyen metformina que es un fármaco de biguanida, fármacos de tiazolidinediona tales como Avandia (rosiglitazona), Actos (pioglitazona), etc.
Los fármacos que se desarrollaron recientemente incluyen agonistas de GLP-1 desarrollados en base a la acción del péptido similar al glucagón 1, una hormona que estimula la secreción de insulina, y los ejemplos de los agonistas de GLP-1 incluyen exenatida y liraglutida. Además, los inhibidores de DPP-4 también son nuevos fármacos desarrollados recientemente, que inhiben la actividad de DPP-4 (dipeptidil peptidasa-4), una enzima que inactiva rápidamente GLP-1, y ejemplos típicos de los mismos incluyen Januvia (sitagliptina).
Sin embargo, se informó que estos fármacos tienen efectos secundarios, que incluyen hepatotoxicidad, trastorno gastrointestinal, enfermedad cardiovascular y carcinogénesis, y el costo anual para el tratamiento de la diabetes también es alto, y por lo tanto es un obstáculo en el tratamiento de la diabetes. De hecho, el costo asociado con la prediabetes y la diabetes alcanzó alrededor de 200 trillones de Won en los Estados Unidos en el año 2007 (Dall y otros, 2010), y el costo asociado con la obesidad también alcanzó los 150 trillones de Won en los Estados Unidos en el año 2008 (Finkelstein y otros, 2009).
Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar fármacos, que puedan usarse para tratar tanto la diabetes como la diabesidad reduciendo el peso y reduciendo eficazmente los niveles de glucosa en sangre y, al mismo tiempo, tengan menos efectos secundarios.
Como un candidato para tales fármacos, la oxintomodulina ha recibido atención recientemente. La oxintomodulina se produce a partir del preglucagón, un precursor, y es un péptido que puede unirse tanto al péptido similar a glucagón-1 (GLP-1) como al receptor de glucagón para realizar una función doble. Debido a tales características, la oxintomodulina se ha estudiado para diversos fines, incluido el tratamiento de la obesidad, la diabetes, la hiperlipidemia y la enfermedad del hígado graso.
El documento CN102010473 A describe una oxintomodulina estable de acción prolongada que puede usarse para el tratamiento de la diabetes y la obesidad.
Sin embargo, la oxintomodulina tiene el problema de que debe administrarse a una dosis alta, ya que tiene una vida media corta in vivo y la actividad de la misma es insuficiente para el uso en el tratamiento de la obesidad, diabetes, hiperlipidemia y enfermedad del hígado graso.
Descripción
Problema técnico
Los presentes inventores han desarrollado un análogo de oxintomodulina que tiene una mayor actividad en comparación con la oxintomodulina nativa y han descubierto que el análogo de oxintomodulina reduce los niveles de glucosa en sangre, mejora la tolerancia a la glucosa y aumenta la relación de hemoglobina glucosilada (HbA1c) en un modelo de ratón inducido por una dieta con alto contenido de grasas (HF DIO) y un modelo de ratón diabético (db/db) inducido por una mutación en el receptor de leptina, lo que indica que el análogo de oxintomodulina puede usarse eficazmente para el tratamiento de la diabetes, completando de este modo la presente invención.
Solución técnica
Es un objetivo de la presente invención proporcionar una composición para prevenir o tratar la diabetes, que comprende
un análogo de oxintomodulina como un ingrediente activo en donde el conjugado de análogo de oxintomodulina comprende
un análogo de oxintomodulina que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 24, 25 o 26; una región Fc de inmunoglobulina; y un polímero no peptidílico, en donde el polímero no peptidílico une el análogo de oxintomodulina a la región Fc de inmunoglobulina a través de un enlace covalente.
Se describe además en la presente descripción un método para prevenir o tratar diabetes, diabesidad y complicaciones diabéticas, que comprende administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de un análogo de oxintomodulina a un sujeto.
Se describe adicionalmente en la presente descripción el uso del análogo de oxintomodulina de la presente invención en la preparación de un medicamento para prevenir o tratar la diabetes, la diabesidad y las complicaciones diabéticas.
Efectos ventajosos
El análogo de oxintomodulina de la presente invención tiene una alta actividad para activar el receptor de GLP-1 y el receptor de glucagón en comparación con la oxintomodulina nativa. Además, el análogo de oxintomodulina de la presente invención induce la expansión de las células beta y aumenta la secreción de insulina, reduciendo de este modo los niveles de glucosa en sangre que aumentaron con una dieta alta en calorías y grasas. Además, el análogo de oxintomodulina induce disminuciones en el peso corporal y la ingesta de dieta para mejorar la sensibilidad a la insulina y permitir que los niveles de glucosa en sangre, que no se controlan debido a la resistencia a la insulina, se mantengan a niveles normales. Por lo tanto, el análogo de oxintomodulina puede usarse eficazmente para la prevención o el tratamiento de la diabetes y enfermedades relacionadas.
Descripción de los dibujos
La Figura 1 es un diagrama gráfico que muestra el cambio en el peso corporal provocado por la administración de un análogo de oxintomodulina de acción prolongada en ratones con obesidad inducida por una dieta con alto contenido de grasas durante un largo período de tiempo (26 semanas). El cambio en el peso corporal se expresó como un porcentaje con relación al peso corporal medido el día 0.
La Figura 2 es un diagrama gráfico que muestra un AUC (área bajo la curva) para el cambio en el nivel de glucosa en sangre provocado por la administración de un análogo de oxintomodulina de acción prolongada en ratones con obesidad inducida por una dieta con alto contenido de grasas durante un largo período de tiempo (26 semanas). La Figura 3 es un diagrama gráfico que muestra el cambio de 4 semanas en el peso corporal provocado por la administración durante 4 semanas de un análogo de oxintomodulina de acción prolongada en un modelo de ratón con diabetes inducida por una mutación en el receptor de leptina.
La Figura 4 es un diagrama gráfico que muestra un AUC (área bajo la curva) para el cambio en el nivel de glucosa en sangre provocado por la administración durante 4 semanas de un análogo de oxintomodulina de acción prolongada en un modelo de ratón con diabetes inducida por una mutación en el receptor de leptina.
Mejor modo
Se describe en la presente descripción una composición para prevenir o tratar diabetes, diabesidad y complicaciones diabéticas, que comprende un análogo de oxintomodulina como ingrediente activo.
Como se usa en la presente descripción, el término "oxintomodulina" se refiere a un péptido producido a partir de preglucagón que es un precursor de glucagón. En la presente invención, la oxintomodulina está destinada a incluir oxintomodulina nativa y sus precursores, análogos, fragmentos y variantes. Preferentemente, la oxintomodulina tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 (HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA). Como se usa en la presente descripción, la expresión "variante de oxintomodulina" es un péptido que tiene uno o más residuos de aminoácidos diferentes de los de la secuencia de aminoácidos de oxintomodulina nativa y posee una función de activación de los receptores de GLP-1 y glucagón. La variante de oxintomodulina puede prepararse por cualquiera de sustitución, adición, deleción, modificación o una combinación de los mismos de algunos aminoácidos de oxintomodulina nativa.
Como se usa en la presente descripción, la expresión "análogo de oxintomodulina" se refiere a un péptido, derivado de péptido o imitador de péptido, que se prepara mediante la adición, deleción o sustitución de algunos aminoácidos de oxintomodulina nativa y puede activar altamente tanto el receptor de GLP-1 como el receptor de glucagón, en comparación con la oxintomodulina nativa.
Como se usa en la presente descripción, la expresión "fragmento de oxintomodulina" se refiere a un fragmento que tiene una adición o deleción de uno o más aminoácidos en el extremo amino o carboxilo terminal de la oxintomodulina nativa, en donde los aminoácidos añadidos también pueden ser aminoácidos que no son de origen natural (por ejemplo, aminoácido tipo D). Estos fragmentos de oxintomodulina tienen la función de regular los niveles de glucosa en sangre in vivo.
Los métodos para preparar la variante, análogo y fragmento de oxintomodulina pueden usarse solos o en combinación. Por ejemplo, la presente invención incluye un péptido, que tiene uno o más aminoácidos diferentes de los del péptido nativo, tiene restos de aminoácidos desaminados en el extremo N-terminal y tiene la función de activar tanto el receptor de GLP-1 como el receptor de glucagón.
Los aminoácidos mencionados en la presente descripción se abrevian de acuerdo con las reglas de nomenclatura de IUPAC-IUB de la siguiente manera:
Alanina A; Arginina R;
Asparagina N; Ácido aspártico D;
Cisteína C; Ácido glutámico E;
Glutamina Q; Glicina G;
Histidina H; Isoleucina I;
Leucina L; Lisina K;
Metionina M; Fenilalanina F
Prolina P; Serina S;
Treonina T; Triptófano W;
Tirosina Y; Valina V.
Se describe en la presente descripción un análogo de oxintomodulina que abarca cualquier péptido que se prepara mediante la sustitución, adición, deleción o modificación postraduccional (por ejemplo, metilación, acilación, ubiquitinación o unión covalente intramolecular) de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y puede activar los receptores de glucagón y GLP-1. Tras la sustitución o adición de aminoácidos, no solo pueden usarse los 20 aminoácidos que se encuentran comúnmente en las proteínas humanas, sino también los aminoácidos atípicos o no naturales. Las fuentes comerciales de aminoácidos atípicos incluyen Sigma-Aldrich, ChemPep Inc. y Genzyme Pharmaceuticals. Los péptidos que incluyen estos aminoácidos y las secuencias de péptidos atípicos pueden sintetizarse y comprarse a proveedores comerciales, por ejemplo, American Peptide Company o Bachem (Estados Unidos) O Anygen (Corea).
Se describe adicionalmente en la presente descripción un análogo de oxintomodulina que es un nuevo péptido que incluye la secuencia de aminoácidos de la siguiente fórmula 1:
Fórmula 1 R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X 19-X20-X21-X22-X23-X24-R2
en donde
R1 es histidina, desamino-histidilo, dimetil-histidilo (N-dimetil-histidilo), beta-hidroxiimidazopropionilo, 4-imidazoacetilo, beta-carboxiimidazopropionilo o tirosina;
XI es Aib (ácido aminosiobutírico), d-alanina, glicina, Sar (N-metilglicina), serina o d-serina;
X2 es ácido glutámico o glutamina;
X3 es leucina o tirosina;
X4 es serina o alanina;
X5 es lisina o arginina;
X6 es glutamina o tirosina;
X7 es leucina o metionina;
X8 es ácido aspártico o ácido glutámico;
X9 es ácido glutámico, serina o ácido alfa-metil-glutámico o se deleciona;
X10 es glutamina, ácido glutámico, lisina, arginina o serina o se deleciona;
X II es alanina, arginina o valina o se deleciona;
X12 es alanina, arginina, serina o valina o se deleciona;
X13 es lisina, glutamina, arginina o ácido alfa-metil-glutámico o se deleciona;
X14 es ácido aspártico, ácido glutámico o leucina o se deleciona;
X15 es fenilalanina o se deleciona;
X16 es isoleucina o valina o se deleciona;
X17 es alanina, cisteína, ácido glutámico, lisina, glutamina o ácido alfa-metil-glutámico o se deleciona;
X18 es triptófano o se deleciona;
X19 es alanina, isoleucina, leucina, serina o valina o se deleciona;
X20 es alanina, lisina, metionina, glutamina o arginina o se deleciona;
X21 es asparagina o se deleciona;
X22 es alanina, glicina o treonina o se deleciona;
X23 es cisteína o lisina o se deleciona;
X24 es un péptido que tiene de 2 a 10 aminoácidos que consiste en una combinación de alanina, glicina y serina o se deleciona; y
R2 es KRNRNNIA (SEQ ID NO: 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 36), GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 37), HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO: 38), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO: 39), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO: 40) o se deleciona (con la excepción del caso en el que la secuencia de aminoácidos de fórmula 1 es idéntica a la de la SEQ ID NO: 1).
Para aumentar la actividad de la oxintomodulina de tipo silvestre para el receptor de glucagón y el receptor de GLP-1, el análogo de oxintomodulina de la presente invención puede sustituirse con 4-imidazoacetilo obtenido por deleción del carbono alfa de la histidina en la posición 1 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, desaminohistidilo obtenido por deleción del grupo amino N-terminal, dimetil-histidilo (N-dimetil-histidilo) obtenido por modificación del grupo amino N-terminal con dos grupos metilo, beta-hidroxi imidazopropionilo obtenido por sustitución del grupo amino N-terminal con un grupo hidroxilo, o beta-carboxi imidazopropionilo obtenido por sustitución del grupo amino N-terminal con un grupo carboxilo. Además, la región de unión al receptor de GLP-1 puede estar sustituida con aminoácidos que mejoran los enlaces hidrófobos e iónicos o una combinación de los mismos. Además, una porción de la secuencia de oxintomodulina puede estar sustituida con la secuencia de aminoácidos de GLP-1 o Exendin-4 para aumentar la actividad del receptor de GLP-1.
Además, una porción de la secuencia de oxintomodulina puede estar sustituida con una secuencia que mejora la hélice alfa. Preferentemente, los aminoácidos en las posiciones 10, 14, 16, 20, 24 y 28 de la secuencia de aminoácidos de fórmula 1 pueden estar sustituida con aminoácidos o derivados de aminoácidos que consisten en Tyr(4-Me), Phe, Phe(4-Me), Phe(4-Cl), Phe(4-CN), Phe(4-NO2), Phe(4-NH2), Phg, Pal, Nal, Ala(2-tienilo) y Ala(benzotienilo) que se sabe que estabilizan la hélice alfa, y el tipo y el número de aminoácidos o derivados de aminoácidos estabilizadores de la hélice alfa que se insertarán no están limitados. Preferentemente, los aminoácidos en las posiciones 10 y 14, 12 y 16, 16 y 20, 20 y 24, y 24 y 28 de la secuencia de aminoácidos también pueden sustituirse con ácido glutámico o lisina para formar anillos, y el número de los anillos a insertar no están limitados.
Con la máxima preferencia, el análogo de oxintomodulina puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las siguientes fórmulas 2 a 6.
Se describe adicionalmente en la presente descripción, un análogo de oxintomodulina que es un péptido novedoso que incluye la secuencia de aminoácidos de la siguiente fórmula 2, obtenida por sustitución de la secuencia de aminoácidos de oxintomodulina con la de exendina o GLP-1:
Fórmula 2 R1-A-R3
Se describe adicionalmente en la presente descripción, un análogo de oxintomodulina que es un péptido novedoso que incluye la secuencia de aminoácidos de la siguiente fórmula 3, que se prepara uniendo una porción de la secuencia de aminoácidos de oxintomodulina y una porción de la secuencia de aminoácidos de exendina o GLP-1 a través de un enlazador de aminoácidos adecuado:
Fórmula 3 R1-BC-R4
Se describe adicionalmente en la presente descripción, un análogo de oxintomodulina que es un péptido novedoso que incluye la secuencia de aminoácidos de la siguiente fórmula 4, en donde una porción de la secuencia de aminoácidos de oxintomodulina se sustituye con un aminoácido que mejora la unión hidrófoba a receptor de GLP-1. Por ejemplo, es un péptido en donde la Leu en la posición 26 se sustituye con el aminoácido Ile o Val que aumenta la hidrofobicidad.
Fórmula 4 R1-SQGTFTSDYSKYLD-D1-D2-D3-D4-D5-LFVQW-D6-D7-N-D8-R3
Se describe adicionalmente en la presente descripción, un análogo de oxintomodulina que es un péptido novedoso que incluye la secuencia de aminoácidos de la siguiente fórmula 5, en donde una porción de la secuencia de aminoácidos de oxintomodulina nativa se deleciona, añade o sustituye con otros aminoácidos para aumentar las capacidades de la oxintomodulina nativa para activar el receptor de GLP-1 y el receptor de glucagón:
Fórmula 5 R1-E1-QGTFTSDYSKYLD-E2-E3-RA-E4-E5-FV-E6-WLMNT-E7-R5
En las fórmulas 2 a 5, R1 es como se describe en la fórmula 1;
A se selecciona del grupo que consiste en SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT (SEQ ID NO: 41), SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT (SEQ ID NO: 42), SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT (SEQ ID NO: 43), GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 44), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 45), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA (SEQ ID NO: 46), y SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG (SEQ ID NO: 47);
B se selecciona del grupo que consiste en SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT (SEQ ID NO: 41), SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT (SEQ ID NO: 42), SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT (SEQ ID NO: 43), GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 44), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 45), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA (SEQ ID NO: 46), SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG (SEQ ID NO: 47), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEW (SEQ ID NO: 48), y SQGTFTSDYSRYLD (SEQ ID NO: 49); C es un péptido que tiene de 2 a 10 aminoácidos que consiste en una combinación de alanina, glicina y serina; D1 es serina, ácido glutámico o arginina;
D2 es arginina, ácido glutámico o serina;
D3 es arginina, alanina o valina;
D4 es arginina, valina o serina;
D5 es glutamina, arginina o lisina;
D6 es isoleucina, valina o serina;
D7 es metionina, arginina o glutamina;
D8 es treonina, glicina o alanina;
E1 es serina, Aib, Sar, d-alanina o d-serina;
E2 es serina o ácido glutámico;
E3 es arginina o lisina;
E4 es glutamina o lisina;
E5 es ácido aspártico o ácido glutámico;
E6 es glutamina, cisteína o lisina;
E7 es cisteína o lisina o se deleciona;
R3 es KRNRNNIA (SEQ ID NO: 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 36) o GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 37);
R4 es HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO: 38), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO: 39) o HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO: 40); y
R5 es KRNRNNIA (SEQ ID NO: 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 36) o GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 37) o se deleciona (con la excepción del caso en el que las secuencias de aminoácidos de las fórmulas 2 a 5 son idénticas al de la SEQ ID NO: 1).
Además, se describe en la presente descripción un análogo de oxintomodulina que puede ser un péptido novedoso de la siguiente fórmula 6:
Fórmula 6 R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13 -X14-X15-X16-X17-X18-X 19-X20-X21-X22-X23-X24-R2
en donde R1 es histidina, desamino-histidilo, 4-imidazoacetilo o tirosina;
XI es Aib (ácido aminosiobutírico), glicina, serina o d-serina;
X2 es ácido glutámico o glutamina;
X3 es leucina o tirosina;
X4 es serina o alanina;
X5 es lisina o arginina;
X6 es glutamina o tirosina;
X7 es leucina o metionina;
X8 es ácido aspártico o ácido glutámico;
X9 es ácido glutámico o ácido alfa-metil-glutámico o se deleciona;
X10 es glutamina, ácido glutámico, lisina o arginina o se deleciona;
X II es alanina o arginina o se deleciona;
X12 es alanina o valina o se deleciona;
X13 es lisina, glutamina, arginina o ácido alfa-metil-glutámico o se deleciona;
X14 es ácido aspártico, ácido glutámico o leucina o se deleciona;
X15 es fenilalanina o se deleciona;
X16 es isoleucina o valina o se deleciona;
X17 es alanina, cisteína, ácido glutámico, glutamina o ácido alfa-metil-glutámico o se deleciona; X18 es triptófano o se deleciona;
X19 es alanina, isoleucina, leucina o valina o se deleciona;
X20 es alanina, lisina, metionina o arginina o se deleciona;
X21 es asparagina o se deleciona;
X22 es treonina o se deleciona;
X23 es cisteína, lisina o se deleciona;
X24 es un péptido que tiene de 2 a 10 aminoácidos que consiste en glicina o se deleciona; y
R2 es KRNRNNIA (SEQ ID NO: 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 36), GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 37), HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO: 38), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO: 39) o HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO: 40) o se deleciona (con la excepción del caso en el que la secuencia de aminoácidos de la fórmula 6 es idéntica a la de la SEQ ID NO: 1). Además, se describe en la presente descripción, un análogo de oxintomodulina que puede seleccionarse del grupo que consiste en los péptidos de las SEQ ID NO: 2 a 34. Incluso con mayor preferencia, el análogo de oxintomodulina de la presente descripción puede ser un análogo de oxintomodulina descrito en la Tabla 1 del Ejemplo 2-1.
Se describe además en la presente descripción que se prepararon análogos de oxintomodulina que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2 a 34, respectivamente, y se encontró que los análogos de oxintomodulina mostraron una excelente capacidad para activar el receptor de GLP-1 y el receptor de glucagón en comparación a oxintomodulina nativa (Ejemplo 2). En otras palabras, podría verse a partir de los resultados anteriores que el análogo de oxintomodulina, como se describe en la presente descripción, exhibió excelentes efectos sobre la prevención o el tratamiento de diabetes, diabesidad y/o complicaciones diabéticas en comparación con la oxintomodulina convencional activando el receptor de GLP-1 y el receptor de glucagón.
Los análogos de oxintomodulina de la presente invención están presentes en forma de conjugados que comprenden diversos polímeros para mejorar el efecto terapéutico y la vida media in vivo de los análogos.
Los conjugados de la presente invención tienen efectos de acción más prolongada que la oxintomodulina nativa, y los conjugados de acción prolongada incluyen una oxintomodulina preparada mediante la modificación, sustitución, adición o deleción de los aminoácidos de oxintomodulina nativa, una oxintomodulina conjugada con un polímero biodegradable tal como polietilenglicol (PEG), una oxintomodulina conjugada con una albúmina, anticuerpo, elastina, fibronectina o polisacárido tal como quitina o con una proteína de acción prolongada tal como un fragmento de inmunoglobulina, una oxintomodulina conjugada con un ácido graso que tiene la capacidad de unirse a la albúmina in vivo, o una oxintomodulina encapsulada en nanopartículas biodegradables, y el tipo de conjugado de acción prolongada que se usa en la presente invención no está limitado.
Preferentemente, el conjugado es un conjugado en donde un análogo de oxintomodulina que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2 a 34 está unido a una región Fc de inmunoglobulina a través de un polímero no peptidílico.
La región Fc de inmunoglobulina es un polipéptido biodegradable que se metaboliza in vivo y, por lo tanto, es seguro para su uso como portador de un fármaco. La región Fc de inmunoglobulina tiene un peso molecular bajo en comparación con la molécula de inmunoglobulina completa, y por lo tanto es ventajosa en términos de preparación, purificación y rendimiento de conjugados. Además, debido a que la secuencia de aminoácidos difiere entre los anticuerpos, se elimina una porción Fab que muestra una alta no homogeneidad y, por lo tanto, la homogeneidad del material puede aumentarse considerablemente y la posibilidad de inducir antigenicidad sanguínea también puede reducirse.
Como se usa en la presente descripción, el término "región Fc de inmunoglobulina" se refiere a una proteína que contiene la región constante de cadena pesada 2 (CH2) y la región constante de cadena pesada 3 (CH3) de una inmunoglobulina, excluyendo las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera, la región constante de cadena pesada 1 (CH1) y la región constante de cadena ligera 1 (CL1) de la inmunoglobulina.
Puede incluir además una región de bisagra en la región constante de cadena pesada. Además, la región Fc de inmunoglobulina de la presente invención puede ser una región Fc expandida que incluye parte o la totalidad de la región constante de cadena pesada 1 (CH1) y/o la región constante de cadena ligera 1 (CL1), excepto para las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera, siempre que tenga un efecto que sea sustancialmente igual o mejor que la proteína nativa. Además, la región Fc de inmunoglobulina puede ser una región que tiene una deleción de una porción de una secuencia de aminoácidos relativamente larga correspondiente a CH2 y/o CH3. Específicamente, la región Fc de inmunoglobulina de la presente invención puede comprender 1) un dominio CH1, un dominio CH2, un dominio CH3 y un dominio CH4, 2) un dominio CH1 y un dominio CH2, 3) un dominio CH1 y un dominio CH3, 4) un dominio CH2 y un dominio CH3, 5) una combinación de uno o más dominios y una región bisagra de inmunoglobulina (o una porción de la región bisagra), o 6) un dímero de cada dominio de las regiones constantes de cadena pesada y la región constante de cadena ligera.
La región Fc de inmunoglobulina de la presente invención incluye una secuencia de aminoácidos nativa y un derivado de secuencia (mutante) de la misma. Como se usa en la presente descripción, el término "derivado de secuencia de aminoácidos" se refiere a una secuencia que es diferente de la secuencia de aminoácidos nativa debido a la deleción, inserción, sustitución no conservadora o conservadora o una combinación de las mismas de uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos nativa. Por ejemplo, en el caso de una Fc de IgG, los residuos de aminoácidos en las posiciones 214 a 238, 297 a 299, 318 a 322 o 327 a 331, que se sabe que son importantes en la unión, pueden usarse como sitios adecuados para la modificación.
Además, son posibles otros diversos derivados, incluido uno que tiene una deleción de una región capaz de formar un enlace disulfuro, o una deleción de algunos residuos de aminoácidos en el extremo N-terminal del Fc nativo o una adición de un residuo de metionina en el extremo N-terminal de Fc nativo. Además, para eliminar las funciones efectoras, puede ocurrir una deleción en un sitio de unión al complemento, tal como un sitio de unión a C1q y un sitio ADCC (citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos). Las técnicas para preparar tales derivados de secuencia de la región Fc de inmunoglobulina se describen en las publicaciones de patentes internacionales núms. WO 97/34631, WO 96/32478, etc.
Los intercambios de aminoácidos en proteínas y péptidos, que generalmente no alteran la actividad de las proteínas o péptidos, son conocidos en la técnica (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, Nueva York, 1979). Los intercambios más comunes son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly, en ambas direcciones. Además, la región Fc, si es necesario, puede modificarse mediante fosforilación, sulfatación, acrilación, glucosilación, metilación, farnesilación, acetilación, amidación y similares.
Los derivados de Fc descritos anteriormente muestran una actividad biológica idéntica a la de la región Fc de la presente invención o tienen una estabilidad estructural aumentada contra el calor, el pH o similares.
Además, esta región Fc puede obtenerse de formas nativas aisladas de seres humanos y otros animales incluidas vacas, cabras, cerdos, ratones, conejos, hámsteres, ratas y cobayas, o pueden ser recombinantes o derivados de las mismas, obtenidos de células animales o microorganismos transformados.
En la presente descripción, la región Fc puede obtenerse de una inmunoglobulina nativa aislando una inmunoglobulina completa de un cuerpo humano o animal vivo y tratando la inmunoglobulina aislada con proteinasa. Cuando la inmunoglobulina completa se trata con papaína, se escinde en regiones Fab y Fc, y cuando la inmunoglobulina completa se trata con pepsina, se divide en fragmentos pF'c y F (ab)2. Fc o pF'c pueden aislarse mediante el uso de cromatografía de exclusión por tamaño o similar. Preferentemente, una región Fc derivada de humano es una región Fc de inmunoglobulina recombinante obtenida de un microorganismo.
Además, la región Fc de inmunoglobulina puede estar en forma de cadenas de azúcar nativas o cadenas de azúcar aumentadas o disminuidas en comparación con una forma nativa, o puede estar en una forma desglicosilada. El aumento, disminución o eliminación de las cadenas de azúcar Fc de inmunoglobulina puede lograrse mediante métodos convencionales tales como un método químico, un método enzimático y un método de ingeniería genética mediante el uso de un microorganismo. La región Fc obtenida mediante la eliminación de las cadenas de azúcar de Fc muestra una disminución significativa en la afinidad de unión a la parte C1q y una disminución o pérdida en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos o la citotoxicidad dependiente del complemento, y por lo tanto no induce respuestas inmunitarias innecesarias in vivo. A este respecto, una región Fc de inmunoglobulina en una forma desglicosilada o aglicosilada puede ser más adecuada para el objetivo de la presente invención como un portador farmacológico.
Como se usa en la presente descripción, el término "desglicosilación" se refiere a la eliminación enzimática de restos de azúcar de una región Fc, y el término "aglicosilación" se refiere a una región Fc no glicosilada producida en un procariota, preferentemente E. coli.
Mientras tanto, la región Fc de inmunoglobulina puede derivarse de seres humanos u otros animales incluidos vacas, cabras, cerdos, ratones, conejos, hámsteres, ratas y cobayas. Preferentemente, se deriva de seres humanos.
Además, la región Fc de inmunoglobulina puede derivarse de IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, o una combinación o híbrido de los mismos. Preferentemente, se deriva de IgG o IgM, que se encuentran entre las proteínas más abundantes en la sangre humana, y con la máxima preferencia de IgG que se sabe que mejora la vida media de las proteínas de unión a ligando.
Como se usa en la presente descripción, el término "combinación" significa que los polipéptidos que codifican regiones Fc de inmunoglobulina de cadena sencilla del mismo origen están unidos a un polipéptido de cadena única de un origen diferente para formar un dímero o multímero. Específicamente, puede formarse un dímero o multímero a partir de dos o más fragmentos seleccionados del grupo que consiste en fragmentos Fc de IgG, Fc de IgA, Fc de IgM, Fc de IgD y Fc de IgE.
Como se usa en la presente descripción, el término "híbrido" significa que las secuencias correspondientes a dos o más fragmentos Fc de inmunoglobulina de diferentes orígenes están presentes en una región Fc de inmunoglobulina de cadena única. En la presente invención, son posibles diversas formas de híbrido. En otras palabras, es posible un híbrido compuesto de 1 a 4 dominios seleccionados del grupo que consiste en CH1, CH2, CH3 y CH4 de Fc de IgG, Fc de IgM, Fc de IgA, Fc de IgE y Fc de IgD, y puede incluir una bisagra.
Mientras tanto, la IgG también puede subclasificarse en IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, y en la presente invención, también es posible una combinación o híbrido de estas subclases. Preferentemente, IgG es la subclase IgG2 e IgG4, y con la máxima preferencia, es la región Fc de IgG4 que carece sustancialmente de funciones efectoras tal como la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
En otras palabras, la región Fc de inmunoglobulina más preferida que se usa como portador farmacológico en la presente invención es una región Fc derivada de IgG4 humana. Una región Fc derivada de seres humanos es más preferible que una región Fc no derivada de seres humanos, que puede actuar como un antígeno en el cuerpo humano y provocar respuestas inmunitarias indeseables, tal como la producción de un nuevo anticuerpo contra el antígeno.
Como se usa en la presente descripción, la expresión polímero no peptidílico se refiere a un polímero biocompatible que incluye dos o más unidades repetitivas unidas entre sí por cualquier enlace covalente en lugar de un enlace peptídico. En la presente invención, el polímero no peptidílico puede usarse indistintamente con el enlazador no peptidílico.
El polímero no peptidílico que puede usarse en la presente invención puede seleccionarse del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, un copolímero de etilenglicol/propilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol polivinílico, polisacáridos, dextrano, éter poliviniletílico, polímeros biodegradables tales como PLA (poli(ácido láctico)) y PLGA (ácido poliláctico-glicólico), polímeros lipídicos, quitinas, ácido hialurónico y combinaciones de los mismos. Preferentemente, el polímero no peptidílico es polietilenglicol. Además, los derivados de los mismos conocidos en la técnica y los derivados que pueden prepararse fácilmente mediante un método conocido en la técnica también están dentro del alcance de la presente invención.
El enlazador peptídico que se usa en una proteína de fusión obtenida mediante un método convencional de fusión en marco tiene inconvenientes en el sentido de que es fácilmente escindido por la proteinasa in vivo y, por lo tanto, no puede obtenerse un efecto suficiente de aumentar la vida media en suero del fármaco activo por un portador como se esperaba. Sin embargo, en la presente invención, el polímero que tiene resistencia a la proteinasa puede usarse para mantener la vida media en suero del péptido, similar al portador. Por lo tanto, cualquier polímero no peptidílico puede usarse sin limitación en la presente invención, siempre que sea un polímero que tenga la función mencionada anteriormente, es decir, un polímero que tenga resistencia a la proteinasa in vivo. El polímero no peptidílico tiene un peso molecular en el intervalo de 1 a 100 kDa, y preferentemente de 1 a 20 kDa. El polímero no peptidílico de la presente invención, que está unido a la región Fc de inmunoglobulina, puede ser un tipo de polímero o una combinación de diferentes polímeros.
El polímero no peptidílico que se usa en la presente invención puede tener un grupo reactivo capaz de unirse a la región Fc de inmunoglobulina y al fármaco proteico. El grupo reactivo en ambos extremos del polímero no peptidílico se selecciona preferentemente del grupo que consiste en un grupo aldehido reactivo, un grupo propionaldehído, un grupo butiraldehído, un grupo maleimida y un derivado de succinimida.
El derivado de succinimida puede ser propionato de succinimidilo, hidroxi succinimidilo, succinimidil carboximetilo o carbonato de succinimidilo. En particular, cuando el polímero no peptidílico tiene un grupo aldehído reactivo en ambos extremos del mismo, pueden minimizarse las reacciones no específicas, y un polipéptido fisiológicamente activo y una inmunoglobulina pueden unirse eficazmente a ambos extremos del polímero no peptidílico, respectivamente. Un producto final generado por alquilación reductora con un enlace aldehído es mucho más estable que el unido por un enlace amida. El grupo reactivo aldehído se une selectivamente a un extremo N-terminal a un pH bajo y puede formar un enlace covalente con un residuo de lisina a un pH alto tal como pH 9,0.
Los grupos reactivos en ambos extremos del enlazador que es el polímero no peptidílico pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, el polímero no peptidílico puede poseer un grupo maleimida en un extremo y un grupo aldehído, un grupo propionaldehído o un grupo butiraldehído en el otro extremo.
Cuando se usa un polietilenglicol que tiene un grupo hidroxilo reactivo en ambos extremos del mismo como el polímero no peptidílico, el grupo hidroxilo puede activarse a varios grupos reactivos mediante reacciones químicas conocidas, o un polietilenglicol que tiene un grupo reactivo modificado disponible comercialmente puede usarse para preparar el conjugado de acción prolongada de la presente invención.
El conjugado de la presente invención puede ser uno en el que cada extremo del polímero no peptidílico está unido a la región Fc de inmunoglobulina y al grupo amino o tiol del análogo de oxintomodulina, respectivamente.
Mientras tanto, en la presente invención, ambos extremos del polímero no peptidílico incluyen grupos reactivos a los que puede unirse una región Fc de inmunoglobulina y un fármaco proteico. Los ejemplos de los grupos reactivos incluyen, pero no se limitan a, un grupo aldehído, un grupo propionaldehído o un grupo butiraldehído, un grupo maleimida, un derivado de succinimida (propionato de succinimidilo, hidroxilsuccinimidilo, propionato de succinimidilo, carbonato e carboximetilo o de succinimidilo) y similares.
Los grupos reactivos en ambos extremos del enlazador que es el polímero no peptidílico pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, el polímero no peptidílico puede tener un grupo maleimida en un extremo y un grupo aldehído, un grupo propionaldehído o un grupo butiraldehído en el otro extremo. Por ejemplo, cuando el polímero no peptidílico tiene un grupo aldehído reactivo en un extremo y un grupo maleimida reactivo en el otro extremo, pueden minimizarse las reacciones no específicas, y un polipéptido fisiológicamente activo y una inmunoglobulina pueden unirse eficazmente a ambos extremos del polímero no peptidílico. En un ejemplo de la presente invención, se sintetizó un conjugado uniendo oxintomodulina o su análogo a la región Fc de inmunoglobulina a través de un enlace covalente usando el PEG de polímero no peptidílico que incluye un grupo propionaldehído solo o un grupo maleimida y un grupo aldehído.
La composición farmacéutica de la presente invención puede usarse para la prevención o el tratamiento de la diabetes.
Como se usa en la presente descripción, el término "prevención" se refiere a todas las acciones que inhiben o retrasan el desarrollo de una enfermedad diana. Específicamente, el término "prevención" significa administrar el análogo de oxintomodulina de la presente invención para controlar los niveles de glucosa en sangre a niveles normales para inhibir o retrasar así el desarrollo de diabetes.
Como se usa en la presente descripción, el término "tratamiento" se refiere a todas las acciones que alivian, mejoran o mitigan los síntomas de la enfermedad desarrollada. Específicamente, el término "tratamiento" significa administrar el análogo de oxintomodulina de la presente invención para mantener los niveles de glucosa en sangre de manera estable a niveles normales para aliviar, mejorar o mitigar las condiciones de diabetes.
Como se usa en la presente descripción, el término "diabetes" es un tipo de enfermedad metabólica en la que la secreción de insulina es insuficiente o no se realizan funciones normales. La diabetes se caracteriza por el aumento de los niveles de glucosa en sangre que provocan diversas afecciones y síndromes. En el caso de la diabetes, la glucosa se excreta con la orina.
Como se usa en la presente descripción, el término "diabesidad" se refiere a diabetes acompañada de afecciones de obesidad, particularmente diabetes tipo 2, o afecciones de obesidad que generalmente aparecen en pacientes con diabetes tipo 2.
Aproximadamente el 80-90 % de los pacientes con diabetes tipo 2 tienen condiciones de obesidad y se caracterizan por resistencias a la insulina. El ejercicio adecuado, la terapia dietética y la terapia farmacológica pueden prevenir la diabesidad y aliviar las afecciones de la diabesidad. En la presente invención, la diabetes puede significar uno resultante de la obesidad.
Como se usa en la presente descripción, el término "complicaciones diabéticas" se refiere a diversas afecciones patológicas que se producen en el cuerpo debido a afecciones hiperglucémicas mantenidas durante un largo período de tiempo.
Los ejemplos de complicaciones diabéticas incluyen, entre otros, retinopatía, disfunción renal, neuropatía, accidente cerebrovascular provocado por un trastorno vascular, enfermedades renales o cardíacas, úlcera del pie diabético y enfermedad cardiovascular. Si una afección hiperglucémica se mantiene durante un largo período de tiempo, conduce a varias afecciones patológicas en el cuerpo. Por lo general, aumenta el riesgo de retinopatía, disfunción renal, neuropatía, accidente cerebrovascular provocado por un trastorno vascular, enfermedades renales o cardíacas, úlcera del pie diabético y enfermedad cardiovascular. Por lo tanto, para prevenir complicaciones diabéticas, el control eficaz de los niveles de glucosa en sangre es esencial.
Por consiguiente, la composición farmacéutica de la presente invención puede usarse para la prevención o el tratamiento de la diabetes.
En un ejemplo de la presente invención, se preparó un conjugado de análogo de oxintomodulina de acción prolongada de la presente invención uniendo covalentemente el análogo de oxintomodulina de la presente invención a una región Fc de inmunoglobulina con polietilenglicol, y el conjugado preparado se administró a un modelo de ratón con obesidad inducida por una dieta con alto contenido de grasas y un modelo de ratón con diabetes inducida por una mutación en el receptor de leptina. Como resultado, se demostró que el peso corporal y la ingesta de alimento del grupo con administración del conjugado de análogo de oxintomodulina de acción prolongada de la presente invención disminuyeron significativamente en el modelo animal inducido por la obesidad (Figura 1) y que el nivel de glucosa en sangre disminuyó significativamente (Figura 2). Además, el conjugado de análogo de oxintomodulina de acción prolongada de la presente invención mostró un efecto reductor de la glucosa en sangre igual o mayor que VICTOZA®, un análogo de GLP-1 de acción prolongada disponible comercialmente (Figura 2). En un ejemplo de la presente invención, se preparó un conjugado de análogo de oxintomodulina de acción prolongada uniendo covalentemente el análogo de oxintomodulina de la presente invención a una región Fc de inmunoglobulina, y el conjugado preparado se administró a un modelo de ratón con diabetes inducida por una mutación en el receptor de leptina. Como resultado, se demostró que, en el grupo con administración del conjugado de análogo de oxintomodulina de acción prolongada, un aumento en el peso corporal se inhibió significativamente en comparación con el del grupo de control (Figura 3), y el nivel de glucosa en sangre significativamente disminuyó (Figura 4), y también el conjugado mostró un efecto superior de disminución de la glucosa en sangre en comparación con VICTOZA®, un análogo de GLP-1 de acción prolongada disponible comercialmente (Figura 4). En otras palabras, el análogo de oxintomodulina de acuerdo con la presente invención funciona para inducir la expansión de células beta in vivo para aumentar la secreción de insulina, mejorando así la capacidad de controlar los niveles de glucosa en sangre. Además, el análogo de oxintomodulina de acuerdo con la presente invención induce una disminución en el peso corporal para mejorar la sensibilidad a la insulina y prevenir el desarrollo de enfermedades cardiovasculares, que incluyen arteriosclerosis, hiperlipidemia e hipertensión, que pueden desarrollarse por resistencia a la insulina. Por consiguiente, el análogo de oxintomodulina de la presente invención puede usarse eficazmente como un agente para tratar la diabetes. Además, el conjugado de la presente invención tiene una alta capacidad para activar el receptor de GLP-1 y el receptor de glucagón, en comparación con la oxintomodulina nativa, y muestra una vida media en sangre aumentada in vivo debido a la región Fc unida al mismo, y por lo tanto la actividad de los mismos puede mantenerse in vivo durante un período prolongado de tiempo.
La composición de la presente invención puede ser una composición farmacéutica.
La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender además un agente farmacéutico que muestra un efecto preventivo o terapéutico contra la diabetes. Para administrar el análogo de oxintomodulina de la presente invención en combinación con un agente farmacéutico conocido como un agente terapéutico contra la diabetes, la composición de la presente invención puede comprender además este agente farmacéutico conocido. Por lo tanto, la composición de la presente invención puede usarse sola o administrarse en combinación con otros fármacos para prevenir o tratar la diabetes.
Como se usa en la presente descripción, el término "administración" significa introducir un material dado en un paciente mediante cualquier método apropiado. El análogo de la presente invención puede administrarse por cualquier ruta general, siempre que pueda alcanzar un tejido diana. Específicamente, el análogo de la presente invención puede administrarse por vía intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, oral, local, intranasal, intrapulmonar o intrarrectal, pero no está limitado a los mismos. Sin embargo, debido a que el péptido se digiere cuando se administra por vía oral, la composición oral se formula preferentemente de modo que el ingrediente activo esté recubierto o protegido de la degradación en el estómago. Preferentemente, la composición de la presente invención puede administrarse en forma inyectable. Además, la composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse mediante el uso de cualquier sistema capaz de suministrar el ingrediente activo a las células diana.
La composición farmacéutica que comprende el análogo de oxintomodulina de la presente invención puede comprender además un portador farmacéuticamente aceptable. Para la administración oral, los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen un aglutinante, un lubricante, un desintegrante, un excipiente, un solubilizante, un agente dispersante, un estabilizante, un agente de suspensión, un colorante y un agente saborizante.
Para las preparaciones inyectables, los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen un tampón, un conservante, un analgésico, un solubilizante, un agente isotónico y un estabilizante. Para la administración tópica, los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen una base, un excipiente, un lubricante y un conservante. La composición farmacéutica de la presente invención puede formularse en diversas formas de dosificación mediante el uso de los portadores farmacéuticamente aceptables mencionados anteriormente. Por ejemplo, para la administración oral, la composición farmacéutica puede formularse en tabletas, grageas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas o similares. Para preparaciones inyectables, la composición farmacéutica puede proporcionarse en forma de una ampolla de dosificación unitaria o un recipiente de dosificación múltiple. Además, la composición farmacéutica también puede formularse en soluciones, suspensiones, tabletas, píldoras, cápsulas y preparaciones de liberación sostenida.
Mientras tanto, los ejemplos del portador, excipiente y diluyente adecuado para la formulación incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, almidón, goma de acacia, alginato, gelatina, fosfato de calcio, silicato de calcio, celulosa, metilcelulosa, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, agua, metilhidroxibenzoato, propilhidroxibenzoato, talco, estearato de magnesio y aceites minerales. Además, la composición farmacéutica de la presente invención puede incluir además cargas, agentes anticoagulantes, lubricantes, agentes humectantes, sabores, conservantes y similares.
La dosis de la composición farmacéutica de la presente invención se determina de acuerdo con el tipo de ingrediente activo junto con diversos factores tales como la enfermedad a tratar, la vía de administración, la edad, el sexo y el peso del paciente, y la gravedad de la enfermedad. La composición farmacéutica de la presente invención tiene una vida media larga in vivo y una excelente biodisponibilidad, y por lo tanto el número y la frecuencia de administración de la composición farmacéutica pueden reducirse significativamente.
Se describe además en la presente descripción un método para prevenir o tratar diabetes, diabesidad o complicaciones diabéticas, el método que comprende administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz del análogo de oxintomodulina a un sujeto.
En la presente descripción, el análogo de oxintomodulina, la diabetes, la diabesidad y las complicaciones diabéticas son como se definieron anteriormente.
Como se usa en la presente descripción, el término "sujeto" se refiere a un sujeto con sospecha de tener diabetes, diabesidad o complicaciones diabéticas. Específicamente, el término significa mamíferos, incluidos seres humanos, ratas y animales domésticos, que tienen o corren el riesgo de desarrollar la enfermedad anterior. Además, el sujeto puede ser cualquier sujeto que pueda ser tratado por el análogo de oxintomodulina de la presente invención.
El método terapéutico, como se describe en la presente descripción, puede comprender administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de la composición farmacéutica que comprende el conjugado. La dosis diaria total de la composición puede determinarse mediante un juicio médico apropiado por parte de un médico, y la composición puede administrarse una o varias veces. Sin embargo, en vista del propósito, la dosis terapéuticamente eficaz específica de la composición para cualquier paciente en particular puede variar dependiendo de varios factores bien conocidos en el campo médico, incluido el tipo y el grado de respuesta a alcanzar, composiciones concretas de acuerdo si los agentes se usan con ellos o no, la edad del paciente, el peso corporal, el estado de salud, el sexo y la dieta, el tiempo y la vía de administración, la tasa de secreción de la composición, la duración del tratamiento, otros fármacos usados en combinación o coincidentes con la composición de la presente invención, y otros factores conocidos en el campo médico.
Se describe adicionalmente en la presente descripción el uso del análogo de oxintomodulina de la presente invención en la preparación de un medicamento para prevenir o tratar la diabetes, la diabesidad o las complicaciones diabéticas.
Se describe adicionalmente en la presente descripción un método para preparar el conjugado de análogo de oxintomodulina.
El método de preparación puede comprender las etapas de: (1) unir covalentemente un polímero no peptidílico que tiene un grupo aldehído, maleimida o succinimida reactivo en ambos extremos al grupo amino o tiol de un péptido análogo de oxintomodulina; (2) separar un conjugado que comprende el péptido análogo de oxintomodulina, que tiene el polímero no peptidílico unido covalentemente al mismo en posiciones distintas del extremo amino terminal, de la mezcla de reacción de la etapa (1); y (3) unir covalentemente una región Fc de inmunoglobulina al otro extremo del polímero no peptidílico unido del conjugado separado, produciendo así un conjugado peptídico que comprende la región Fc de inmunoglobulina y el péptido análogo de oxintomodulina, unido a ambos extremos del polímero no peptidílico, respectivamente.
Más específicamente, el método de preparación puede comprender las etapas de: (1) unir covalentemente un polímero no peptidílico, que tiene un grupo aldehído reactivo y un grupo maleimida reactivo en cada extremo del mismo, al residuo de cisteína de un análogo de oxintomodulina; (2) separar un conjugado que comprende el análogo de oxintomodulina, que tiene el polímero no peptidílico unido covalentemente al residuo de cisteína, de la mezcla de reacción de la etapa (1); y (3) unir covalentemente una región Fc de inmunoglobulina al otro extremo del polímero no peptidílico unido del conjugado separado, produciendo así un conjugado peptídico que comprende la región Fc de inmunoglobulina y el análogo de oxintomodulina, unido a ambos extremos del polímero no peptidílico, respectivamente.
Modo para la invención
En lo sucesivo, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los ejemplos. Sin embargo, debe entenderse que estos ejemplos son solo para fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención.
Ejemplo 1: Producción de la línea celular para activación in vitro
Ejemplo 1-1: Producción de la línea celular que muestra la respuesta de AMPc a GLP-1
Mediante el uso de una porción correspondiente al ORF (marco de lectura abierto) del ADNc (OriGene Technologies, Inc. Estados Unidos) del gen del receptor de GLP-1 humano como plantilla, la PCR se realizó mediante el uso de cebadores inversos y directos que incluyen un sitio de escisión HindIII y un sitio de escisión EcoRI, respectivamente, obteniendo de este modo un producto de PCR.
Cebador directo: 5'-CCCGGCCCCCGCGGCCGCTATTCGAAATAC-3' (SEQ ID NO: 50)
Cebador inverso: 5'-GAACGGTCCGGAGGACGTCGACTCTTAAGATAG-3' (SEQ ID NO: 51)
El producto de PCR se clonó en el vector de expresión en células animales conocido x0GC/dhfr, construyendo de este modo el vector recombinante x0GC/GLP-1R.
El vector recombinante x0GC/GLP-1R se introdujo en una línea celular CHO DG44, cultivada en medio DMEM/F12 (FBS al 10 %), mediante el uso de lipofectamina (Invitrogene, Estados Unidos), para obtener un transformante. El transformante se incubó en un medio selectivo que contenía 1 mg/ml de G418 y metotraxato 10 nM, y se seleccionaron las líneas celulares monoclonales a partir del mismo. A continuación, una línea celular que muestra una buena respuesta de AMPc dependiente de la concentración a GLP-1 finalmente se seleccionó de las líneas celulares monoclonales.
Ejemplo 1-2: Producción de la línea celular que muestra la respuesta de AMPc a glucagón
Mediante el uso de una porción correspondiente al ORF (marco de lectura abierto) del ADNc (OriGene Technologies, Inc. Estados Unidos) del gen del receptor de glucagón humano como plantilla, la PCR se realizó mediante el uso e cebadores inversos y directos que incluyen un sitio de escisión EcoRI y un sitio de escisión XhoI, respectivamente, obteniendo de este modo un producto de PCR.
Cebador directo: 5'-CAGCGACACCGACCGTCCCCCCGTACTTAAGGCC-3' (SEQ ID NO: 52)
Cebador inverso: 5'-CTAACCGACTCTCGGGGAAGACTGAGCTCGCC-3' (SEQ ID NO: 53)
El producto de PCR se clonó en el vector de expresión en células animales conocido x0GC/dhfr, construyendo de este modo el vector recombinante x0GC/GCGR.
El vector recombinante x0GC/GCGR se introdujo en una línea celular CHO DG44, cultivada en medio DMEM/F12 (FBS al 10 %), mediante el uso de lipofectamina (Invitrogene, Estados Unidos), para obtener un transformante. El transformante se incubó en un medio selectivo que contenía 1 mg/ml de G418 y metotraxato 10 nM, y se seleccionaron las líneas celulares monoclonales a partir del mismo. A continuación, una línea celular que muestra una buena respuesta de AMPc dependiente de la concentración a glucagón finalmente se seleccionó de las líneas celulares monoclonales.
Ejemplo 2: actividad in vitro de los análogos de oxintomodulina
Ejemplo 2-1: síntesis de análogos de oxintomodulina
Para medir las actividades in vitro de los análogos de oxintomodulina, se sintetizaron análogos de oxintomodulina que tienen las secuencias de aminoácidos que se muestran en la Tabla 1 a continuación.
Tabla 1
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En la Tabla 1 anterior, los aminoácidos indicados por las letras en negrita en cada una de las SEQ ID NO: 19, 20, 22, 25, 26, 27, 32, 33 y 34, tomados juntos, forman un anillo, y los aminoácidos indicados por X significan ácidos alfametil-glutámicos que son aminoácidos no nativos. Además, CA indica 4-imidazoacetilo, DA indica desamino-histidilo y (d)S indica d-serina.
Ejemplo 2-2: Medición de actividades in vitro de los análogos de oxintomodulina
Para medir los efectos de los péptidos preparados en el Ejemplo 2-1 anterior, se midieron las actividades in vitro de los péptidos en las células mediante el uso de los transformantes preparados en los Ejemplos 1-1 y 1-2.
Cada uno de los transformantes se transformó para expresar cada uno de los genes del receptor de GLP-1 humano y del receptor de glucagón en CHO (ovario de hámster chino) y fue adecuado para medir las actividades de GLP-1 y glucagón. Por lo tanto, la actividad de cada uno de los análogos de oxintomodulina se midió mediante el uso de cada uno de los transformantes.
Específicamente, cada uno de los transformantes se subcultivó dos o tres veces por semana, y las células se dispensaron en cada pocillo de una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 x 105 células/pocillo y se cultivaron durante 24 horas.
Las células cultivadas se lavaron con tampón KRB, se suspendieron en 40 ml de tampón KRB que contenía IBMX 1 mM y después se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
Cada uno de oxintomodulina (SEQ ID NO: 1) y los análogos de oxintomodulina (SEQ ID NO: 2-6, 8, 10-13, 17, 18, 23-25, 27, 28 y 32-34) se diluyeron en serie por cinco veces desde 1000 nM a 0,02 nM, y se añadieron 40 ml de cada una de las diluciones a las células, que se incubaron a continuación en una incubadora de CO2 a 37 °C durante 1 hora. A continuación, se añadieron 20 ml de tampón de lisis celular para lisar las células, y se midió la concentración de AMPc en cada uno de los lisados celulares mediante el uso de un kit de ensayo de AMPc (Molecular Device, Estados Unidos). A partir de los resultados de la medición, se calcularon los valores de CE50 y se compararon entre sí (Tabla 2).
Tabla 2
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Como puede verse en la Tabla 2 anterior, los análogos de oxintomodulina mostraron excelentes actividades del receptor de GLP-1 y glucagón in vitro en comparación con la oxintomodulina de la SEQ ID NO: 1.
Se conoce que la oxintomodulina tiene el efecto de tratar la obesidad, la hiperlipidemia, la enfermedad del hígado graso o la arteriosclerosis al activar el receptor de GLP-1 y el receptor de glucagón. Los análogos de oxintomodulina de acuerdo con la presente invención tienen una alta capacidad para activar el receptor de GLP-1 y el receptor de glucagón in vitro, en comparación con la oxintomodulina nativa, lo que sugiere que estos análogos de oxintomodulina son altamente eficaces en el tratamiento de la diabetes, diabesidad o complicaciones diabéticas, en comparación con la oxintomodulina nativa.
Ejemplo 3: Preparación de un conjugado que comprende análogo de oxintomodulina (SEQ ID NO: 23) y Fc de inmunoglobulina (análogo de oxintomodulina conjugado con Fc de inmunoglobulina 23)
Para PEGilar MAL-10K-ALD PEG (NOF., Japón) en un residuo de cisteína en la posición 24 de la secuencia de aminoácidos del análogo de oxintomodulina (SEQ ID NO: 23), se dejaron reaccionar entre sí el análogo de oxintomodulina (SEQ ID NO: 23) y MAL-10K-ALD PEG en una relación molar de 1:3 a una concentración de proteína de 3 mg/ml a temperatura ambiente durante 3 horas. La reacción se realizó en tampón Tris 50 mM (pH 8,0) que contenía guanidina 1 M. Una vez completada la reacción, la solución de reacción se aplicó a SOURCe S en las siguientes condiciones, purificando de este modo un análogo de oxintomodulina mono-PEGilado en la cisteína: columna: SOURCE S, tasa de flujo: 2,0 ml/min, gradiente: A 0 -> 100 % 50 min B (A: citrato de sodio 20 mM (pH 3,0) etanol al 45 %, B: A KCl 1 M).
A continuación, se dejaron reaccionar entre sí el análogo de oxintomodulina monopegilado purificado (SEQ ID NO: 23) y una Fc de inmunoglobulina en una relación molar de 1:5 a una concentración de proteína de 20 mg/ml a 4 °C durante 16 horas. La reacción se realizó en tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 6,0) que contenía SCB 20 mM como un agente reductor. Una vez completada la reacción, la solución de reacción se aplicó a una columna de purificación SOURCE (columna: SOURCE 15Q, tasa de flujo: 2,0 ml/min, gradiente: A 0 -> 4 % 1 min, B -> 20 % 80 min B (A: Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, B: A NaCl 1 M)) y una columna Source ISO (columna: Source ISO, tasa de flujo: 2,0 ml/min, gradiente: B 0 -> 100 % 100 min A, (A: Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, B: A AS 1,1 M)), purificando de este modo un conjugado que comprende el análogo de oxintomodulina (SEQ ID NO: 23) y la Fc de inmunoglobulina. Ejemplo 4: Preparación de un conjugado que comprende análogo de oxintomodulina (SEQ ID NO: 25) y Fc de inmunoglobulina (análogo de oxintomodulina conjugado con Fc de inmunoglobulina 25)
Para PEGilar MAL-10K-ALD PEG en un residuo de cisteína en la posición 30 de la secuencia de aminoácidos de un análogo de oxintomodulina (SEQ ID NO: 25), se dejaron reaccionar entre sí el análogo de oxintomodulina (SEQ ID NO: 25) y MAL-10K-ALD PEG en una relación molar de 1:3 a una concentración de proteína de 3 mg/ml a temperatura ambiente durante 3 horas. La reacción se realizó en tampón Tris 50 mM (pH 8,0) que contenía guanidina 1 M. Una vez completada la reacción, la solución de reacción se aplicó a SOURCE S en las siguientes condiciones, purificando de este modo un análogo de oxintomodulina mono-PEGilado en la cisteína: columna: SOURCE S, tasa de flujo: 2,0 ml/min, gradiente: A 0 -> 100 % 50 min B (A: Na-citrato 20 mM (pH 3,0) etanol al 45 %, B: A KCl 1 M).
A continuación, se dejaron reaccionar entre sí el análogo de oxintomodulina mono-PEGilado purificado (SEQ ID NO: 25) y una Fc de inmunoglobulina en una relación molar de 1:5 a una concentración de proteína de 20 mg/ml a 4 °C durante 16 horas. La reacción se realizó en tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 6,0) que contenía SCB 20 mM como un agente reductor. Una vez completada la reacción, la solución de reacción se aplicó a una columna SOURCE 15Q (columna: SOURCE 15Q, tasa de flujo: 2,0 ml/min, gradiente: A 0 -> 4 % 1 min B -> 20 % 80 min B (A: Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), B: A NaCl 1 M)) y una columna SOURCE ISO (columna: SOURCE ISO, tasa de flujo: 2,0 ml/min, tasa de flujo: B 0 -> 100 % 100 min A (A: Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), B: A AS 1,1 M)), purificando de este modo un conjugado que comprende el análogo de oxintomodulina (SEQ ID NO: 25) y la Fc de inmunoglobulina. Ejemplo 5: Preparación de un conjugado que comprende análogo de oxintomodulina (SEQ ID NO: 27) y Fc de inmunoglobulina (análogo de oxintomodulina conjugado con Fc de inmunoglobulina 27)
Para PEGilar MAL-10K-ALD PEG en un residuo de cisteína en la posición 30 de la secuencia de aminoácidos de un análogo de oxintomodulina (SEQ ID NO: 27), se dejaron reaccionar entre sí el análogo de oxintomodulina (SEQ ID NO: 27) y MAL-10K-ALD PEG en una relación molar de 1:3 a una concentración de proteína de 3 mg/ml a temperatura ambiente durante 3 horas. La reacción se realizó en tampón Tris 50 mM (pH 8,0) que contenía guanidina 1 M. Una vez completada la reacción, la solución de reacción se aplicó a SOURCE S en las siguientes condiciones, obteniendo de este modo un análogo de oxintomodulina mono-PEGilado en la cisteína: columna: SOURCE S, tasa de flujo: 2,0 ml/min, gradiente: A 0 -> 100 % 50 min B (A: Na-citrato 20 mM (pH 3,0) etanol al 45 %, B: A KCl 1 M).
A continuación, se dejaron reaccionar entre sí el análogo de oxintomodulina mono-PEGilado purificado (SEQ ID NO: 27) y una Fc de inmunoglobulina en una relación molar de 1:5 a una concentración de proteína de 20 mg/ml a 4 °C durante 16 horas. La reacción se realizó en tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 6,0) que contenía SCB 20 mM como un agente reductor. Una vez completada la reacción, la solución de reacción se aplicó a una columna SOURCE 15Q (columna: SOURCE 15Q, tasa de flujo: 2,0 ml/min, gradiente: A 0 -> 4 % 1 min B -> 20 % 80 min B (A: Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), B: A NaCl 1 M)) y una columna SOURCE ISO (columna: SOURCE ISO, tasa de flujo: 2,0 ml/min, gradiente: B 0 -> 100 % 100 min A (A: Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), B: A AS 1,1 M)), purificando de este modo un conjugado que comprende el análogo de oxintomodulina (SEQ ID NO: 27) y la Fc de inmunoglobulina.
Ejemplo 6: Efectos del análogo de oxintomodulina de acción prolongada en la reducción del peso corporal y el nivel de glucosa en sangre de ratones con obesidad inducida por una dieta con alto contenido de grasas (HF DIO) Ejemplo 6-1: Método experimental
Se compraron ratones de 6 semanas de edad (C57BL/6, 120-130 g) de OrientBIO (Corea). Los ratones C57BL/6 comprados son animales que se usan ampliamente en estudios sobre obesidad y diabetes, porque la obesidad en ellos puede inducirse relativamente fácilmente con una dieta con alto contenido de grasas. Los ratones HF DIO son roedores que se usan con frecuencia en estudios de diabetes y, naturalmente, muestran obesidad y condiciones diabéticas similares a las de los humanos como resultado del trasplante de una dieta con alto contenido de grasas en el órgano sin manipulación genética, a diferencia de los ratones db/db con diabetes inducida por una mutación en el receptor de leptina. Por esta razón, en la presente invención, estos animales se usaron para examinar los efectos de la composición de la presente invención sobre las reducciones en el peso corporal y los niveles de glucosa en sangre en la diabesidad.
A los animales se les permitió acceder a una dieta con alto contenido de grasas (60 % Kcal de una dieta rica en grasas, D12492; Research Diets Inc.) esterilizada por irradiación UV. Además, a los animales se les permitió acceder a agua del grifo filtrada y esterilizada con UV mediante el uso de botellas de agua. Los animales se mantuvieron en una cámara de cría que satisfacía los estándares de GLP bajo un ciclo de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad (iluminación: 6 am a 6 pm), y todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con la guía estándar para experimentos con animales. La administración del fármaco se inició después de 26 semanas de inducción de obesidad, y los animales se dividieron en cinco grupos (n=6) como se muestra en la Tabla 3 a continuación.
Tabla 3
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Específicamente, el grupo 1 (grupo inducido por HF DIO, grupo de control) se alimentó con alimentación con alto contenido de grasas y se le administró por vía subcutánea 5 ml/kg (volumen de inyección) de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS, Sigma) una vez o más a la semana. Para una prueba de tolerancia a la glucosa en sangre, al grupo 1 se le administró por vía subcutánea solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS, Sigma) a las 24 horas antes de la prueba y en ayunas durante 16 horas. Se recogió la sangre de la porción de la cola para medir el nivel de glucosa en ayunas, y se midieron los niveles de glucosa en sangre a los 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos y 120 minutos después de la administración intraabdominal de 1 g/kg de glucosa.
El grupo 2 (grupo inducido por HIO DIO y con administración de 100 nmol/kg de VICTOZA®) se alimentó con una dieta con alto contenido de grasas para inducir obesidad e hiperglucemia, y después se le administró una vez al día por vía subcutánea 5 ml/kg (volumen de inyección) de VICTOZA®(GSK) disponible comercialmente.
Para una prueba de tolerancia a la glucosa en sangre, el grupo 2 se sometió a ayunas durante 16 horas antes de la prueba y se le administró por vía subcutánea 100 nmol/kg de VICTOZA® a las 4 horas antes de la prueba. Se recogió la sangre de la porción de la cola para medir el nivel de glucosa en ayunas, y se midieron los niveles de glucosa en sangre a los 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos y 120 minutos después de la administración intraabdominal de 1 g/kg de glucosa.
El grupo 3 (grupo inducido por HF DIO y con administración de 1 nmol/kg de conjugado de SEQ ID NO:25-Fc) se alimentó con alimentación de alto contenido de grasas para inducir obesidad e hiperglucemia, y después se le administró por vía subcutánea una vez a la semana 1 nmol/kg (volumen de inyección de 5 ml/kg) del conjugado de SEQ ID NO:25-Fc preparado en el Ejemplo 4. Para una prueba de tolerancia a la glucosa en sangre, el grupo 3 se sometió a ayunas durante 24 horas antes de la prueba y se le administró por vía subcutánea 1 nmol/kg del conjugado de SEQ ID NO: 25-Fc a las 24 horas antes de la prueba y en ayunas durante 16 horas. Se recogió la sangre de la porción de la cola para medir el nivel de glucosa en ayunas, y se midieron los niveles de glucosa en sangre a los 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos y 120 minutos después de la administración intraabdominal de 1 g/kg de glucosa.
El grupo 4 (grupo inducido por HF DIO y 3 nmol/kg de conjugado de SEQ ID NO: 25-Fc) se alimentó con alimento de alto contenido de grasa para inducir obesidad e hiperglucemia, y después se administró por vía subcutánea una vez a la semana con 3 nmol/kg (volumen de inyección de 5 ml/kg) del conjugado de SEQ ID NO: 25-Fc preparado en el Ejemplo 4. Para una prueba de tolerancia a la glucosa en sangre, el grupo 3 sometió a ayunas durante 24 horas antes de la prueba y se le administró por vía subcutánea 3 nmol/kg del conjugado de SEQ ID NO: 25-Fc a las 24 horas antes de la prueba y en ayunas durante 16 horas. Se recogió la sangre de la porción de la cola para medir el nivel de glucosa en ayunas, y se midieron los niveles de glucosa en sangre a los 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos y 120 minutos después de la administración intraabdominal de 1 g/kg de glucosa.
El grupo 5 (grupo inducido por HF DIO y con administración de 5 nmol/kg de SEQ ID NO: 25-Fc) se alimentó con alimento rico en grasas para inducir obesidad e hiperglucemia, y después se le administró por vía subcutánea una vez a la semana 5 nmol/kg (volumen de inyección de 5 ml kg) del conjugado de SEQ ID NO: 25-Fc preparado en el Ejemplo 4. Para una prueba de tolerancia a la glucosa en sangre, el grupo 3 se sometió a ayunas durante 24 horas antes de la prueba y se le administró por vía subcutánea 5 nmol/kg del conjugado de SEQ ID NO: 25-Fc a las 24 horas antes de la prueba y en ayunas durante 16 horas. Se recogió la sangre de la porción de la cola para medir el nivel de glucosa en ayunas, y se midieron los niveles de glucosa en sangre a los 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos y 120 minutos después de la administración intraabdominal de 1 g/kg de glucosa.
A todos los grupos (n=6), se le administró solución salina o cada fármaco durante 2 semanas, y después se analizaron sus efectos sobre las reducciones en el peso corporal y el nivel de glucosa en sangre.
Ejemplo 6-2: Efectos del análogo de oxintomodulina de acción prolongada sobre las reducciones en el peso corporal y el nivel de glucosa en sangre de ratones con obesidad inducida por una dieta con alto contenido de grasas (HF DIO) que son modelos estables de obesidad
P examinar el efecto del análogo de oxintomodulina de larga duración de la presente invención en una reducción en el nivel de glucosa en sangre de ratones obesos (HF DIO) inducidos por una dieta con alto contenido de grasas (durante 26 semanas) que son modelos estables de obesidad, a los ratones DIO clasificados en el Ejemplo 6-1 se les administró por vía subcutánea el análogo de oxintomodulina de acción prolongada una vez por semana durante 2 semanas. El peso corporal y la ingesta de alimento se midieron todos los días, y la sangre se recogió de la porción de la cola de los ratones DIO en los días 0, 3, 7, 10 y 14, y el cambio en los niveles de glucosa en sangre se analizó mediante el uso de HITACHI 7020. Los cambios en el peso corporal y el nivel de glucosa en sangre se muestran en las Figuras 1 y 2.
La Figura 1 muestra el cambio en el peso corporal, y la Figura 2 muestra el AUC (área bajo curva) de glucosa en sangre. Los resultados obtenidos se procesaron estadísticamente y se calcularon los valores medios y las desviaciones estándar de los valores medios.
En la verificación de la significancia entre los grupos (n=6), los datos se procesaron estadísticamente mediante el uso de la prueba de Dunnett de ANOVA unidireccional, y un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
Específicamente, los resultados de la medición del cambio en el peso corporal indicaron que el peso corporal de los ratones con obesidad inducida por una dieta con alto contenido de grasas durante 26 semanas no disminuyó, mientras que, cuando a los ratones con obesidad se les administró análogo de oxintomodulina de acción prolongada (conjugado de SEQ ID NO: 25-Fc), el peso corporal de los mismos disminuyó de una manera dependiente de la dosis (Figura 1).
Los resultados de la medición del nivel de glucosa en sangre indicaron que el nivel de glucosa en sangre de los ratones con obesidad disminuyó de una manera dependiente de la dosis, cuando a los ratones se les administró el análogo de oxintomodulina de acción prolongada (conjugado de SEQ ID NO: 25-Fc). En particular, cuando a los ratones con obesidad se les administró 5 nmol/kg del análogo de oxintomodulina de acción prolongada (conjugado de SEQ ID NO: 25-Fc), el nivel de glucosa en sangre de los mismos disminuyó significativamente en comparación con el de ratones DIO inducidos por dieta con alto contenido de grasas, y el efecto reductor de la glucosa en sangre de 5 nmol/kg del análogo de oxintomodulina de acción prolongada (conjugado de SEQ ID NO: 25-Fc) fue igual o mejor que el de VICTOZA®, que es un fármaco comercialmente disponible para tratar la diabetes (Figura 2).
A partir de los resultados del Ejemplo 6-2, se encontró que el conjugado de análogo de oxintomodulina de acción prolongada de la presente invención, que comprende el análogo de oxintomodulina unido covalentemente a la región Fc de inmunoglobulina por PEG, redujo el peso corporal y el nivel de glucosa en sangre del ratones con obesidad inducida por una dieta con alto contenido de grasas (HF DIO), lo que sugiere que puede usarse eficazmente para el tratamiento de la diabetes, la diabesidad o enfermedades relacionadas.
Ejemplo 7: Efectos del análogo de oxintomodulina de acción prolongada sobre las reducciones en el peso corporal y el nivel de glucosa en sangre de ratones db/db con diabetes inducida por mutación en el receptor de leptina Ejemplo 7-1: Método experimental
Se compraron ratones BKS.Cg -+ Leprdb/+Leprdb/OlaHsd machos de 7 semanas de edad (25 ± 3 g, Harlan U.S.A) de Doo Yeol Biotech (Corea). Los ratones BKS.Cg -+ Leprdb/+Leprdb/OlaHsd (en lo sucesivo denominados ratones db/db) son roedores que se usan con mayor frecuencia en estudios de diabetes junto con ratones ob/ob, y estos ratones muestran naturalmente afecciones diabéticas similares a los de los seres humanos a través de una mutación en el receptor de leptina. Por esta razón, en la presente invención, estos animales se usaron para examinar el efecto reductor de la glucosa en sangre del agente de la presente invención en el desarrollo de un agente para tratar la diabetes.
Los animales comprados se aclimataron y adaptaron al entorno experimental durante 1 semana, y después se agruparon al azar de acuerdo con sus niveles de glucosa.
Se permitió a los animales el acceso a alimento sólido (dieta Picolab Rodent 5053) esterilizado por irradiación UV. Además, a los animales se les permitió acceder a agua del grifo filtrada y esterilizada con UV mediante el uso de botellas de agua. Los animales se mantuvieron en una cámara de cría que satisfacía con los estándares de GLP en un ciclo de luz de 12 horas/oscuridad de 12 horas (iluminación: 6 am a 6 pm), y todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con la guía estándar para experimentos con animales. Los animales se dividieron en cuatro grupos (n = 7) y se les administró fármacos como se muestra en la Tabla 4 a continuación.
Tabla 4
Figure imgf000021_0001
Específicamente, al grupo 1 (vehículo), un grupo de control, se le administró por vía subcutánea 5 ml/kg de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS, Sigma) una vez por semana.
Al grupo 2 (un grupo con administración de 60 nmol/kg de VICTOZA®, con administración de fármacos), se le administró por vía subcutánea una vez al día 60 nmol/kg (dosis para diabetes; volumen de inyección de 5 ml/kg) de VICTOZA®(GSK) disponible en el mercado.
Al grupo (grupos con administración de 100 nmol/kg de VICTOZA®, con administración de fármacos), se le administró por vía subcutánea una vez al día 100 nmol/kg (dosis para la obesidad; volumen de inyección de 5 ml/kg) de Victoza®(GSK) disponible comercialmente.
Al grupo 4 (15 nmol/kg de conjugado de SEQ ID NO: 23-Fc), un grupo con administración de fármacos, se le administró por vía subcutánea una vez a la semana 15 nmol/kg (volumen de inyección de 5 ml/kg) del conjugado de SEQ ID NO: 23-Fc preparado en el Ejemplo 4.
Al grupo 5 (6 nmol/kg de conjugado de SEQ ID NO: 25-Fc), un grupo con administración de fármacos, se le administró por vía subcutánea una vez a la semana 6 nmol/kg (volumen de inyección de 5 ml/kg) del conjugado de SEQ ID NO: 25-Fc preparado en el Ejemplo 4.
A todos los grupos (n=7), se les administró solución salina o cada fármaco durante 4 semanas, y después se analizaron sus efectos sobre las reducciones en el peso corporal y el nivel de glucosa en sangre.
Ejemplo 7-2: Análisis de los efectos del análogo de oxintomodulina de acción prolongada sobre las reducciones en el peso corporal y el nivel de glucosa en sangre de ratones db/db con diabetes por mutación en el receptor de leptina Para examinar el efecto del análogo de oxintomodulina de acción prolongada de la presente invención en una reducción en el nivel de glucosa en sangre de ratones db/db con diabetes inducida por una mutación en el receptor de leptina, a los ratones db/db clasificados en el Ejemplo 7-1 se les administró por vía subcutánea el análogo de oxintomodulina de acción prolongada una vez por semana durante 4 semanas. El cambio en el peso corporal de los ratones se midió dos veces por semana, y la sangre se recogió de la porción de la cola de los ratones db/db (todos los días en las semanas 1 y 4, y dos veces por semana en las semanas 2 y 3), y el cambio en el nivel de glucosa en sangre se analizó mediante el uso de HITACHI 7020.
La Figura 3 muestra el cambio en el peso corporal, y la Figura 4 muestra el AUC (área bajo curva) de la glucosa en sangre. Los resultados obtenidos se procesaron estadísticamente y se calcularon los valores medios y las desviaciones estándar de los valores medios. En la verificación de la significancia entre los grupos (n=6), los datos se procesaron estadísticamente mediante el uso de la prueba de Dunnett de ANOVA unidireccional, y un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
Específicamente, los resultados de la medición del cambio en el peso corporal indicaron que el peso corporal del grupo de control de ratones db/db aumentó continuamente desde el día del inicio de la administración, mientras que, cuando a los ratones se les administró el análogo de oxintomodulina de acción prolongada (el conjugado de SEQ ID NO: 23-Fc o el conjugado de SEQ ID NO: 25-Fc), el peso corporal no cambió sustancialmente del peso corporal medido el día del estado de administración, lo que sugiere que el conjugado mostró un efecto significativo de inhibición del aumento del peso corporal (Figura 3).
Los resultados de la medición del nivel de glucosa en sangre indicaron que, cuando a los ratones se les administró el análogo de oxintomodulina de acción prolongada (el conjugado de SEQ ID NO: 23-Fc o el conjugado de SEQ ID NO: 25-Fc), el nivel de glucosa en sangre disminuyó significativamente en comparación con la del grupo de control. En particular, la administración de 6 nmol/kg del análogo de oxintomodulina de acción prolongada (conjugado de SEQ ID NO: 25-Fc) mostró un efecto reductor de la glucosa en sangre en comparación con el de VICTOZA® que es un fármaco comercialmente disponible para el tratamiento de la diabetes (Figura 4).
A partir de los resultados del Ejemplo 7, se encontró que el análogo de oxintomodulina de acción prolongada de la presente invención, que comprende el análogo de oxintomodulina unido covalentemente a la región Fc de inmunoglobulina por PEG, redujo significativamente el nivel de glucosa en sangre (índice de diabetes) en el ratones db/db con diabetes inducida por la mutación en el receptor de leptina, en comparación con el vehículo y VICTOZA® que se usa como un fárma
prolongada de la presente invención puede usarse de manera muy eficaz para el tratamiento de la diabetes. Además, el análogo de oxintomodulina de acción prolongada de la presente invención mostró un efecto significativo de inhibición del aumento del peso corporal, lo que sugiere que puede reducir las complicaciones cardiovasculares diabéticas.
A partir de los resultados de los Ejemplos 6 y 7, se observó que el conjugado de análogo de oxintomodulina de larga duración de la presente invención mostró un excelente efecto reductor de la glucosa en sangre igual o mejor que VICTOZA® que se sabe que también tiene un efecto reductor de la glucosa en sangre, así como también un excelente efecto reductor de peso corporal, lo que sugiere que el conjugado de análogo de oxintomodulina de larga duración de la presente invención puede usarse eficazmente como un agente para tratar diabetes, diabesidad y complicaciones diabéticas, en virtud de su efecto reductor del nivel sanguíneo.
<110> HANMI SCIENCE CO., LTD.
<120> Una composición para el tratamiento de la diabetes o la diabesidad que comprende un análogo de oxintomodulina
<130> OPA13135PCT
<150> KR10-2012-0124724
<151> 2012-11-06
<160> 53
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 37
<212> PRT
<213> oxintomodulina
<400> 1
His Ser Gln Gly Thr Phe ThrSer Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp PheVal Gln Trp LeuMet Asn ThrLys Arg Asn
20 25 30
Arg AsnAsn lie Ala
35
<210> 2
<211> 37
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta "H" se refiere a un derivado de histidina, 4-imidazoacetilo.
<400> 2
His Ser Gln Gly Thr Phe ThrSer Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp LeuMet Asn ThrLys Arg Asn
20 25 30
Arg AsnAsn lie Ala
35
<210>3
<211> 39
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta “H” se refiere a un derivado de histidina, 4-imidazoacetilo.
<400> 3
His Ser Gln Gly Thr Phe ThrSer Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp PheVal Ala Trp Leu Lys Asn ThrGly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 4
<211> 39
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta “H” se refiere a un derivado de histidina, 4-imidazoacetilo.
<400> 4
His Gly Gln Gly Thr Phe Thr SerAsp Tyr SerArg Tyr LeuGlu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp LeuLys AsnGly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210>5
<211> 39
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta “H” se refiere a un derivado de histidina, 4-imidazoacetilo.
<400> 5
His Gly Gln Gly Thr Phe Thr SerAsp Tyr SerArg Gln Met GluGlu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp LeuLys AsnGly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
< 210 > 6
<211> 42
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta “H” se refiere a un derivado de histidina, 4-imidazoacetilo.
<400> 6
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr SerAsp Leu SerArg Gln Met GluGlu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu TrpAla Ala His Ser Gln Gly Thr
20 25 30
Phe ThrSer Asp Tyr SerLys Tyr Leu Asp
35 40
<210>7
<211> 30
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta “H” se refiere a un derivado de histidina, 4-imidazoacetilo.
<400>7
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr SerAsp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp LeuMet Asn Thr Lys
20 25 30
<210>8
<211> 29
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta “H” se refiere a un derivado de histidina, 4-imidazoacetilo.
<400> 8
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr SerAsp Leu Ser Arg Gln Leu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp LeuMet Asn Lys
20 25
<210>9
<211> 37
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta “H” se refiere a un derivado de histidina, 4-imidazoacetilo.
<220>
<221> VARIANTE
<222> (20)
<223> Xaa = ácido alfa-metil-glutámico
<400> 9
His Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr LeuAsp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Xaa LeuPhe lie Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn
20 25 30
Arg AsnAsn lie Ala
35
<210> 10
<211> 40
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta “H” se refiere a un derivado de histidina, 4-imidazoacetilo.
<400> 10
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr SerAsp Tyr SerArg Gln Met GluGlu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp LeuMet Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys
<210> 11
<211> 43
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta “H” se refiere a un derivado de histidina, 4-imidazoacetilo.
<400> 11
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000026_0002
<210 12
<211> 38
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta “H” se refiere a un derivado de histidina, 4-imidazoacetilo.
<400> 12
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr SerAsp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Gly
1 5 10 15
Gly Gly His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser AspLeu Ser Lys Gln Met
20 25 30
Glu Glu Glu Ala Val Lys
35
<210> 13
<211> 30
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta “H” se refiere a un derivado de histidina, 4-imidazoacetilo.
<220>
<221> VARIANTE
<222> (16)
<223> Xaa = ácido alfa-metil-glutámico
<220>
<221> VARIANTE
<222> (20)
<223> Xaa = ácido alfa-metil-glutámico
<400> 13
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr SerAsp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Xaa
1 5 10 15
Glu Ala Val Xaa LeuPhe lie Glu Trp Leu MetAsn Thr Lys <210> 14
<211> 37
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta “H” se refiere a un derivado de histidina, 4-imidazoacetilo.
<220>
<221> VARIANTE
<222> (20)
<223> Xaa = ácido alfa-metil-glutámico
<220>
<221> VARIANTE
<222> (24)
<223> Xaa = ácido alfa-metil-glutámico
<400> 14
His Gly Gln Gly Thr PheThr Ser Asp Tyr SerArg Tyr LeuAsp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Xaa Leu Phe lie Xaa TrpLeu Met Asn ThrLys Arg Asn
20 25 30
Arg AsnAsn lie Ala
35
<210> 15
<211> 37
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta “H” se refiere a un derivado de histidina, 4-imidazoacetilo.
<220>
<221> VARIANTE
<222> (24)
<223> Xaa = ácido alfa-metil-glutámico
<400> 15
His Gly Gln Gly Thr PheThr Ser Asp Tyr SerArg Tyr LeuAsp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Xaa TrpLeu Met Asn Thr Lys Arg Asn
20 25 30
Arg AsnAsn lie Ala
35
<210> 16
<211> 34
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta “H” se refiere a un derivado de histidina, 4-imidazoacetilo.
<400> 16
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Leu Glu Gly
Figure imgf000028_0001
Gly Gly His Ser Gln Gly Thr Phe Thr SerAsp Leu SerArg Gln Leu
20 25 30
Glu Lys
<210> 17
<211> 37
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta “H” se refiere a un derivado de histidina, 4-imidazoacetilo.
<400> 17
His Ser Gln Gly Thr Phe ThrSer Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp lie Arg Asn ThrLys Arg Asn
20 25 30
Arg AsnAsn lie Ala
35
<210> 18
<211> 40
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta “H” se refiere a un derivado de histidina, 4-imidazoacetilo.
<400> 18
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp lie Arg Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys
35 40
<210> 19
<211> 37
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta “H” se refiere a un derivado de histidina, 4-imidazoacetilo.
<400> 19
His Ser Gln Gly Thr Phe ThrSer Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe lie Glu Trp lie Arg Asn ThrLys Arg Asn
20 25 30
Arg AsnAsn lie Ala
35
<210> 20
<211> 40
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta “H” se refiere a un derivado de histidina, 4-imidazoacetilo.
<400> 20
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe lie Glu Trp lie Arg Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys
35 40
<210> 21
<211> 37
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta “H” se refiere a un derivado de histidina, 4-imidazoacetilo.
<400> 21
His Ser Gln Gly Thr Phe ThrSer Asp Tyr Ser Arg Gln Leu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Val Arg Asn Thr Lys Arg Asn
20 25 30
Arg AsnAsn lie Ala
35
<210> 22
<211> 30
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta “H” se refiere a un derivado de histidina, desamino-histidilo.
<400> 22
Figure imgf000030_0001
<210> 23
<211> 29
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)
<223> Xaa = ácido aminoisobutírico
<400> 23
Figure imgf000030_0002
<210> 24
<211> 30
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)
<223> Xaa = ácido aminoisobutírico
<400> 24
Figure imgf000030_0003
<210> 25
<211> 30
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)
<223> Xaa = ácido aminoisobutírico
<400> 25
His Xaa Gln Gly Thr PheThr Ser Asp TyrSer Lys Tyr LeuAsp Glu
Figure imgf000030_0004
<210> 26
<211> 30
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)
<223> Xaa = ácido aminoisobutírico
<400> 26
His XaaGln Gly Thr Phe Thr Ser Asp TyrSer Lys Tyr LeuAsp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met AsnThr Cys
20 25 30
<210> 27
<211> 29
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)
<223> Xaa = ácido aminoisobutírico
<400> 27
His XaaGln Gly Thr Phe Thr Ser Asp TyrSer Lys Tyr LeuAsp Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Cys Trp LeuMet Asn Thr
20 25
<210> 28
<211> 29
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)
<223> Xaa = ácido aminoisobutírico
<400> 28
His XaaGln Gly Thr Phe Thr Ser Asp TyrSer Lys Tyr LeuAsp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 29
<211> 37
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)
<223> Esta “S” se refiere a una variante de serina, d-serina.
<400> 29
His Ser Gln Gly Thr Phe ThrSer Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp PheVal Gln Trp LeuMet Asn ThrLys Arg Asn
20 25 30
Arg AsnAsn lie Ala
35
<210> 30
<211> 37
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta “H” se refiere a un derivado de histidina, 4-imidazoacetilo
<400> 30
His Ser Gln Gly Thr Phe ThrSer Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp PheVal Gln Trp LeuMet Asn ThrLys Arg Asn
20 25 30
Arg AsnAsn lie Ala
35
<210> 31
<211> 37
<212> PRT
<213> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta “H” se refiere a un derivado de histidina, 4-imidazoacetilo
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)
<223> Esta “S” se refiere a una variante de serina, d-serina.
<400> 31
His Ser Gln Gly Thr Phe ThrSer Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp PheVal Gln Trp LeuMet Asn ThrLys Arg Asn
20 25 30
Arg AsnAsn lie Ala
35
<210> 32
<211> 30
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Esta “H” se refiere a un derivado de histidina, 4-imidazoacetilo.
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)
<223> Xaa = ácido aminoisobutírico
<400> 32
His XaaGln Gly Thr Phe Thr Ser Asp TyrSer Lys Tyr LeuAsp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met AsnThr Cys
20 25 30
<210> 33
<211> 30
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)
<223> Xaa = ácido aminoisobutírico
<400> 33
His XaaGln Gly Thr Phe Thr Ser Asp TyrAla Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met AsnThr Cys
20 25 30
<210> 34
<211> 30
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)
<223> Xaa = ácido aminoisobutírico
<400> 34
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr SerAsp Tyr Ser Lys Tyr Leu AspGlu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met AsnThr Cys
20 25 30
<210> 35
<211>8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo R2
<400> 35
Lys Arg AsnArg AsnAsn lie Ala
1 5
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo R2
<400> 36
Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
1 5 10
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo R2
<400> 37
Gly Pro SerSer Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys
1 5 10
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo R2
<400> 38
His Ser Gln Gly Thr PheThr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo R2
<400> 39
Figure imgf000034_0001
<210> 40
<211> 20
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo R2
<400> 40
His Gly Glu Gly Thr PheThr Ser Asp LeuSer Lys Gln Met GluGlu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys
20
<210> 41
<211> 28
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo A o B
<400> 41
Ser Gln Gly Thr PheThr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp SerArg
1 5 10 15
Arg Ala Gln Asp PheVal Gln Trp LeuMet Asn Thr
20 25
<210> 42
<211> 28
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo A o B
<400> 42
Figure imgf000035_0001
<210> 43
<211> 28
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo A o B
<400> 43
Figure imgf000035_0002
<210> 44
<211> 28
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo A o B
<400> 44
Figure imgf000035_0003
<210> 45
<211> 28
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo A o B
<400> 45
Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Gln Met Glu Glu Glu
1 5 10 15
Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Lys Asn Gly
20 25
<210> 46
<211> 26
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo A o B
<400> 46
Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Met Glu Glu Glu
1 5 10 15
Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Ala Ala
20 25
<210> 47
<211> 28
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo A o B
<400> 47
Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Gln Met Glu Glu Glu
1 5 10 15
Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Met Asn Gly
20 25
<210> 48
<211> 24
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo B
<400> 48
Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Met Glu Glu Glu
1 5 10 15
Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp
20
< 210 > 49
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo B
<400> 49
Ser Gln Gly Thr PheThr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp
1 5 10
<210> 50
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 50
cccggccccc gcggccgcta ttcgaaatac 30
<210> 51
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 51
gaacggtccg gaggacgtcg actcttaaga tag 33
<210> 52
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 52
cagcgacacc gaccgtcccc ccgtacttaa ggcc 34
<210> 53
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 53
ctaaccgact ctcggggaag actgagctcg cc 32

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una composición para su uso en la prevención o el tratamiento de la diabetes, la composición comprende un conjugado de análogo de oxintomodulina como un ingrediente activo en donde el conjugado de análogo de oxintomodulina comprende
un análogo de oxintomodulina que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 24, 25 o 26; una región Fc de inmunoglobulina; y
un polímero no peptidílico, en donde el polímero no peptidílico une el análogo de oxintomodulina a la región Fc de inmunoglobulina a través de un enlace covalente.
2. La composición para su uso en la prevención o el tratamiento de la diabetes de la reivindicación 1, en donde el análogo de oxintomodulina comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24.
3. La composición para su uso de la reivindicación 1, en donde los aminoácidos en las posiciones 12 y 16 o 16 y 20 del análogo de oxintomodulina forman un anillo, en donde el análogo de oxintomodulina de acuerdo con la SEQ ID NO: 26 tiene un anillo que comprende una lisina en la posición aminoacídica 12 y un ácido glutámico en la posición aminoacídica 16 y en donde el análogo de acuerdo con la SEQ ID NO: 25 tiene un anillo que comprende un ácido glutámico en la posición aminoacídica 16 y una lisina en la posición aminoacídica 20.
4. La composición para su uso en la prevención o el tratamiento de la diabetes de la reivindicación 3, en donde el análogo de oxintomodulina comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25
5. La composición para su uso en la prevención o el tratamiento de la diabetes de la reivindicación 3, en donde el análogo de oxintomodulina comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26.
6. La composición para su uso en la prevención o el tratamiento de la diabetes de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polímero no peptidílico es polietilenglicol, polipropilenglicol, un copolímero de etilenglicol/propilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol polivinílico, un polisacárido, éter poliviniletílico, PLA (ácido poliláctico), PLGA (ácido poliláctico-glicólico), un polímero lipídico, ácido hialurónico o una combinación de los mismos.
7. La composición para su uso en la prevención o el tratamiento de la diabetes de la reivindicación 6, en donde el polímero no peptidílico es polietilenglicol.
8. La composición para su uso en la prevención o el tratamiento de la diabetes de la reivindicación 6, en donde el polisacárido es dextrano, una quitina o una combinación de los mismos.
9. La composición para su uso en la prevención o el tratamiento de la diabetes de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde un extremo del polímero no peptidílico está unido a la región Fc de inmunoglobulina y el otro extremo del polímero no peptidílico está unido a un grupo amino o a un grupo tiol del análogo de oxintomodulina.
10. La composición para su uso en la prevención o el tratamiento de la diabetes de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un agente farmacéutico que muestra efectos preventivos o terapéuticos contra la diabetes.
11. La composición para su uso en la prevención o el tratamiento de la diabetes de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la diabetes es diabetes tipo 1 dependiente de insulina o diabetes tipo 2 independiente de insulina.
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