EA031928B1 - Композиция для лечения диабета или диажирения, содержащая конъюгат аналога оксинтомодулина - Google Patents

Композиция для лечения диабета или диажирения, содержащая конъюгат аналога оксинтомодулина Download PDF

Info

Publication number
EA031928B1
EA031928B1 EA201590759A EA201590759A EA031928B1 EA 031928 B1 EA031928 B1 EA 031928B1 EA 201590759 A EA201590759 A EA 201590759A EA 201590759 A EA201590759 A EA 201590759A EA 031928 B1 EA031928 B1 EA 031928B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
oxyntomodulin
diabetes
seq
xaa xaa
analogue
Prior art date
Application number
EA201590759A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201590759A1 (ru
Inventor
Чин Сун Ким
Дэ Джин Ким
Сан Хюн Ли
Сун Юб Чун
Се Чан Квон
Original Assignee
Ханми Фарм. Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ханми Фарм. Ко., Лтд. filed Critical Ханми Фарм. Ко., Лтд.
Publication of EA201590759A1 publication Critical patent/EA201590759A1/ru
Publication of EA031928B1 publication Critical patent/EA031928B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6435—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a connective tissue peptide, e.g. collagen, fibronectin or gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретение относится к композиции для предупреждения или лечения диабета, диажирения или осложнений диабета, содержащей конъюгат аналога оксинтомодулина в качестве активного ингредиента. Изобретение также относится к способу лечения диабета, диажирения или осложнений диабета, включающему введение субъекту фармацевтически эффективного количества конъюгата аналога оксинтомодулина. Аналог оксинтомодулина обладает высокой способностью к активации рецептора GLP-1 (глюкагоноподобного пептида-1) и рецептора глюкагона по сравнению с нативным оксинтомодулином. Аналог оксинтомодулина индуцирует развитие бета-клеток и повышает секрецию инсулина, снижая в результате этого уровни глюкозы в крови, которые были повышены вследствие высококалорийного рациона с высоким содержанием жира. Аналог оксинтомодулина индуцирует снижение массы тела и уменьшение приема пищи с повышением чувствительности к инсулину и дает возможность поддержания уровней глюкозы в крови, которые не контролируются вследствие инсулинорезистентности, на нормальных уровнях. Следовательно, аналог оксинтомодулина можно эффективно применять для предупреждения или лечения диабета и родственных заболеваний.

Description

Изобретение относится к композиции для предупреждения или лечения диабета, диажирения или осложнений диабета, содержащей конъюгат аналога оксинтомодулина в качестве активного ингредиента.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу предупреждения или лечения диабета, диажирения или осложнений диабета, включающему введение субъекту фармацевтически эффективного количества конъюгата аналога оксинтомодулина.
Предшествующий уровень техники
В последние годы в Корее поступление жиров из пищевых продуктов возросло вследствие экономического роста и вестернизации привычек питания и возросло количество метаболических заболеваний, вызванных недостатком физической активности, таких как гиперлипидемия, ожирение, диабет, гипертензия, артериосклероз и жировая болезнь печени.
Диабет представляет собой вид метаболического заболевания, при котором секреция инсулина недостаточна или нормальные функции не выполняются (DeFronzo, 1988). Диабет характеризуется повышенными уровнями глюкозы в крови, вызывающими различные состояния и синдромы. В случае диабета глюкоза выводится с мочой. В последние годы вследствие возрастания ожирения, в частности абдоминального ожирения, заболеваемость диабетом резко возросла.
По оценкам число пациентов с диабетом во всем мире в 2000 г. составляло 170 млн и ожидают, что к 2030 г. оно достигнет 370 млн. Тем не менее, недавний отчет показал, что число заболеваний диабетом во всем мире к 2008 г. уже достигло приблизительно 350 млн (Danaei et al., 2011) и, следовательно, это число значительно больше, чем ожидалось. Сообщали, что приблизительно 80% или более пациентов с диабетом типа 2 страдали ожирением, тогда как лишь менее 10% пациентов с ожирением страдали диабетом (Harris et al,. 1987). Данное соотношение между диабетом и ожирением связано с тем, что жирные кислоты накапливаются в бета-клетках или в чувствительных к инсулину тканях, таких как почки, печень или сердце, за счет нерегулярной секреции адипокинов и свободных жирных кислот, что приводит к липотоксичности.
Если хроническое гипергликемическое состояние не лечить надлежащим образом, оно приводит к различным патологическим состояниям в организме. В характерном случае оно повышает риск ретинопатии, дисфункции почек, нейропатии, удара, вызванного сосудистым расстройством, заболеваний почек или сердца, язвы, связанной с синдромом диабетической стопы, и сердечнососудистого заболевания. Такие осложнения снижают качество жизни и, в конечном счете, сокращают среднюю продолжительность жизни пациентов с диабетом. Следовательно, для предупреждения осложнений диабета необходим эффективный контроль уровней глюкозы в крови.
Современные способы, применяемые для контроля уровней глюкозы в крови, включают модификацию образа жизни (диетотерапию или лечебную физкультуру) и фармакотерапию. Тем не менее, диетотерапию или лечебную физкультуру трудно контролировать и строго выполнять, и их терапевтический эффект также недостаточен. Следовательно, большинство пациентов с диабетом полагаются на модификацию образа жизни вместе с контролем уровней глюкозы в крови за счет лекарственных средств, таких как инсулин, стимуляторы секреции инсулина, усилители чувствительности к инсулину и агенты, снижающие уровень глюкозы в крови.
Инсулин, который получают рекомбинантными методами, является необходимым лекарственным средством для пациентов с диабетом типа 1 и пациентов с диабетом типа 2, у которых уровни глюкозы в крови не контролируются, и обладает преимуществом для контроля уровня глюкозы в крови. Тем не менее, он имеет недостатки, включающие чувство страха перед подкожными иглами, трудности при введении, риск гипогликемии и увеличение массы тела.
Меглитиниды, являющиеся стимуляторами секреции инсулина, представляют собой лекарственные средства, обладающие очень быстрым действием, их принимают перед едой, и они включают НовоНорм (репаглинид), Fastic (натеглинид), Glufast (митиглинид) и т.д. Усилители чувствительности к инсулину характеризуются тем, что они не вызывают гипогликемии или вызывают лишь небольшую гипогликемию, когда их принимают отдельно, и их примеры включают метформин, представляющий собой бигуанидное лекарственное средство, тиазолидиндионовые лекарственные средства, такие как Авандия (розиглитазон), Актос (пиоглитазон) и т.д.
Лекарственные средства, которые были разработаны недавно, включают агонисты GLP-1, разработанные на основе действия глюкагоноподобного пептида-1, представляющего собой гормон, который стимулирует секрецию инсулина, и примеры агонистов GLP-1 включают эксенатид и лираглутид. Кроме того, ингибиторы DPP-4 (дипептидилпептидаза-4) также представляют собой недавно разработанные новые лекарственные средства, которые ингибируют активность DPP-4, представляющей собой фермент, быстро инактивирующий GLP-1, и их характерные примеры включают Янувию (ситаглиптин).
Тем не менее, сообщают, что указанные лекарственные средства обладают побочными эффектами, включающими гепатотоксичность, желудочно-кишечное расстройство, сердечнососудистое заболевание и канцерогенез, и стоимость лечения диабета в год также высока, и, следовательно, существует препятствие при лечении диабета. Действительно, затраты, связанные с преддиабетом и диабетом, достигли около 200 триллионов вон в США в 2007 г. (Dall et al., 2010), и затраты, связанные с ожирением, также достигли 150 триллионов вон в США в 2008 г. (Finkelstein et al., 2009).
- 1 031928
Таким образом, существует неотложная необходимость в разработке лекарственных средств, которые можно применять для лечения как диабета, так и диажирения, посредством снижения массы тела и эффективного снижения уровней глюкозы в крови, и которые, в то же время, имеют меньшие побочные эффекты.
В качестве кандидата на такие лекарственные средства недавно привлек внимание оксинтомодулин. Оксинтомодулин продуцируется из предшественника пре-глюкагона, и представляет собой пептид, который может связываться как с глюкагоноподобным пептидом-1 (GLP-1), так и с рецептором глюкагона, выполняя двойную функцию. В связи с такими характеристиками оксинтомодулин был исследован с различными целями, включающими лечение ожирения, диабета, гиперлипидемии и жировой болезни печени.
Тем не менее, оксинтомодулин имеет проблему, состоящую в том, что его следует вводить в высокой дозе, поскольку он обладает коротким периодом полувыведения in vivo, и его активность недостаточна для применения при лечении ожирения, диабета, гиперлипидемии и жировой болезни печени.
Описание изобретения Техническая задача
Авторы настоящего изобретения разработали конъюгат аналога оксинтомодулина, обладающий повышенной активностью по сравнению с нативным оксинтомодулином, и обнаружили, что указанный конъюгат аналога оксинтомодулина снижает уровни глюкозы в крови, повышает толерантность к глюкозе и повышает долю гликозилированного гемоглобина (HbAlc) в модели мышей с ожирением, индуцированным рационом с высоким содержанием жира (HF DIO) и в модели мышей с диабетом (db/db), вызванным мутацией в рецепторе лептина, что указывает на то, что конъюгат аналога оксинтомодулина можно эффективно применять для лечения диабета, диажирения и осложнений диабета, и, таким образом, было выполнено настоящее изобретение.
Техническое решение
Согласно изобретению предложена композиция для предупреждения или лечения диабета, диажирения или осложнений диабета, содержащая конъюгат аналога оксинтомодулина в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель, где конъюгат аналога оксинтомодулина содержит:
аналог оксинтомодулина, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, 25 или 26;
участок Fc иммуноглобулина и непептидильный полимер, представляющий собой биосовместимый полимер, обладающий устойчивостью к протеиназе in vivo и имеющий молекулярную массу в диапазоне от 1 до 20 кДа, где непептидильный полимер ковалентно связывает аналог оксинтомодулина и участок Fc иммуноглобулина.
Один аспект изобретения составляет композиция, где аналог оксинтомодулина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.
Еще один аспект изобретения составляет композиция, где аминокислоты в положениях 12 и 16 или 16 и 20 аналога оксинтомодулина образуют кольцо, предпочтительно, где аналог оксинтомодулина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 26.
Предпочтительно в композиции по изобретению, как она определена выше, непептидильный полимер представляет собой полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль или сополимер этиленгликоля/пропиленгликоля или поливиниловый спирт, наиболее предпочтительно полиэтиленгликоль.
Предпочтительно в композиции по изобретению, как она определена выше, один конец непептидильного полимера связан с участком Fc иммуноглобулина, а другой конец непептидильного полимера связан с аминной группой или тиольной группой аналога оксинтомодулина.
Согласно еще одному аспекту композиция по изобретению, как она определена выше, дополнительно содержащит фармацевтический агент, проявляющий превентивные или терапевтические эффекты против диабета, диажирения или осложнений диабета, в частности, где диабет представляет собой инсулинозависимый диабет типа 1 или инсулиннезависимый диабет типа 2, а диажирение является результатом ожирения.
Согласно изобретению также предложен способ лечения диабета, диажирения или осложнений диабета, включающий введение субъекту фармацевтически эффективного количества конъюгата аналога оксинтомодулина, где конъюгат аналога оксинтомодулина содержит:
аналог оксинтомодулина, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, 25 или 26;
участок Fc иммуноглобулина и непептидильный полимер, представляющий собой биосовместимый полимер, обладающий устойчивостью к протеиназе in vivo и имеющий молекулярную массу в диапазоне от 1 до 20 кДа, где непептидильный полимер ковалентно связывает аналог оксинтомодулина и участок Fc иммуноглобулина.
Согласно одному аспекту способа по изобретению аналог оксинтомодулина содержит аминокис- 2 031928 лотную последовательность SEQ ID NO: 24.
Согласно еще одному аспекту способа, аминокислоты в положениях 12 и 16 или 16 и 20 аналога оксинтомодулина образуют кольцо, предпочтительно аналог оксинтомодулина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO:26.
Предпочтительно непептидильный полимер представляет собой полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль или сополимер этиленгликоля/пропиленгликоля или поливиниловый спирт, наиболее предпочтительно полиэтиленгликоль.
Предпочтительно один конец непептидильного полимера связан с участком Fc иммуноглобулина, а другой конец непептидильного полимера связан с аминной группой или тиольной группой аналога оксинтомодулина.
Согласно еще одному аспекту способ дополнительно включает введение фармацевтического агента, проявляющего превентивные или терапевтические эффекты против диабета, диажирения или осложнений диабета, в частности, где диабет представляет собой инсулинозависимый диабет типа 1 или инсулиннезависимый диабет типа 2, а диажирение является результатом ожирения.
Полезные эффекты изобретения
Конъюгат аналога оксинтомодулина по настоящему изобретению обладает более высокой активностью активации рецептора GLP-1 и рецептора глюкагона по сравнению с нативным оксинтомодулином. Кроме того, конъюгат аналога оксинтомодулина по настоящему изобретению индуцирует развитие бетаклеток и повышает секрецию инсулина, снижая в результате этого уровни глюкозы в крови, которые были повышены вследствие высококалорийного рациона с высоким содержанием жира. Кроме того, конъюгат аналога оксинтомодулина индуцирует снижение массы тела и уменьшение потребления пищи с повышением чувствительности к инсулину и дает возможность поддержания уровней глюкозы в крови, которые не контролируются вследствие инсулинорезистентности, на нормальных уровнях. Таким образом, конъюгат аналога оксинтомодулина можно эффективно применять для предупреждения или лечения диабета и родственных заболеваний.
Описание графических материалов
Фиг. 1 представляет собой графическую диаграмму, показывающую изменение массы тела, вызванное введением конъюгата аналога оксинтомодулина длительного действия мышам с ожирением, индуцированным рационом с высоким содержанием жира в течение длительного периода времени (26 недель). Изменение массы тела выражено в виде процента относительно массы тела, измеренной в сутки 0.
Фиг. 2 представляет собой графическую диаграмму, показывающую AUC (площадь под кривой) изменения уровня глюкозы в крови, вызванного введением конъюгата аналога оксинтомодулина длительного действия у мышей с ожирением, индуцированным рационом с высоким содержанием жира, в течение длительного периода времени (26 недель).
Фиг. 3 представляет собой графическую диаграмму, показывающую 4-недельное изменение массы тела, вызванное 4-недельным введением конъюгата аналога оксинтомодулина длительного действия в модели мышей с диабетом, индуцированным мутацией в рецепторе лептина.
Фиг. 4 представляет собой графическую диаграмму, показывающую AUC (площадь под кривой) изменения уровня глюкозы в крови, вызванного 4-недельным введением конъюгата аналога оксинтомодулина длительного действия в модели мышей с диабетом, индуцированным мутацией в рецепторе лептина.
Наилучшее техническое выполнение изобретения
В одном аспекте в настоящем изобретении предложена композиция для предупреждения или лечения диабета, диажирения и осложнений диабета, содержащая конъюгат аналога оксинтомодулина в качестве активного ингредиента.
При использовании здесь термин оксинтомодулин относится к пептиду, продуцируемому из преглюкагона, являющегося предшественником глюкагона. В настоящем изобретении подразумевают, что оксинтомодулин включает нативный оксинтомодулин и его предшественник, аналог, фрагменты и варианты. Предпочтительно оксинтомодулин имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA).
При использовании здесь термин вариант оксинтомодулина представляет собой пептид, имеющий один или более аминокислотных остатков, отличающихся от остатков аминокислотной последовательности нативного оксинтомодулина, и обладает функцией активации GLP-1 и рецепторов глюкагона. Вариант оксинтомодулина может быть получен любым путем из замены некоторых аминокислот нативного оксинтомодулина, их добавления, делеции, модификации или комбинации перечисленного.
При использовании здесь термин аналог оксинтомодулина относится к пептиду, производному пептида или пептидомиметику, который получен путем добавления, делеции или замены некоторых аминокислот нативного оксинтомодулина, и может в более высокой степени активировать и рецептор GLP-1, и рецептор глюкагона по сравнению с нативным оксинтомодулином.
При использовании здесь термин фрагмент оксинтомодулина относится к фрагменту, имеющему добавление или делецию одной или более аминокислот на амино-или карбокси-конце нативного оксинтомодулина, в котором добавленные аминокислоты могут также представлять собой неприродные ами- 3 031928 нокислоты (например, аминокислоту D-типа). Эти фрагменты оксинтомодулина обладают функцией регулирования уровней глюкозы в крови in vivo.
Способы получения варианта, аналога и фрагмента оксинтомодулина можно применять по отдельности или в комбинации. Например, настоящее изобретение включает пептид, имеющий одну или более чем одну аминокислоту, отличающуюся от аминокислот нативного пептида, имеющий дезаминированные аминокислотные остатки на N-конце, и обладающий функцией активации как рецептора GLP-1, так и рецептора глюкагона.
Аминокислоты, упоминаемые в данном описании, сокращают согласно правилам номенклатуры IUPAC-IUB, как описано ниже:
Алании А; Аргинин R;
Аспарагин N; Аспарагиновая кислота D;
Цистеин С; Глутаминовая кислота Е;
Глутамин Q; Глицин G;
Гистидин Н; Изолейцин I;
Лейцин L; Лизин K;
Метионин М; Фенилаланин F
Пролин Р; Серин S;
Треонин Т; Триптофан W;
Тирозин Y; Валин V.
Как он раскрыт в данном описании, аналог оксинтомодулина включает любой пептид, который получен путем замены, добавления, делеции или посттрансляционной модификации (например, метилирования, ацилирования, убиквитинирования или внутримолекулярного ковалентного связывания) аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и может активировать как рецептор глюкагона, так и рецептор GLP-1. При замене или добавлении аминокислот можно использовать не только 20 аминокислот, обычно присутствующих в белках человека, но также атипичные или неприродные аминокислоты. Коммерческие источники атипичных аминокислот включают фирмы Sigma-Aldrich, ChemPep Inc. и Genzyme Pharmaceuticals. Пептиды, включающие эти аминокислоты, и атипичные пептидные последовательности могут быть синтезированы и приобретены у коммерческих поставщиков, например American Peptide Company или Bachem (USA) или Anygen (Korea).
Как он раскрыт в данном описании, аналог оксинтомодулина представляет собой новый пептид, включающий аминокислотную последовательность следующей формулы 1:
R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20X21-X22-X23-X24-R2 (SEQ ID NO:54) (Формула 1), где R1 представляет собой гистидин, дезамино-гистидил, диметил-гистидил (N-диметил-гистидил), бета-гидроксиимидазопропионил, 4-имидазоацетил, бета-карбоксиимидазопропионил или тирозин;
XI представляет собой Aib (аминоизомасляную кислоту), d-аланин, глицин, Sar (N-метилглицин), серии или d-серин;
Х2 представляет собой глутаминовую кислоту или глутамин;
Х3 представляет собой лейцин или тирозин;
Х4 представляет собой серии или аланин;
Х5 представляет собой лизин или аргинин;
Х6 представляет собой глутамин или тирозин;
Х7 представляет собой лейцин или метионин;
Х8 представляет собой аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту;
Х9 представляет собой глутаминовую кислоту, серии или альфа-метил-глутаминовую кислоту или делетирован;
X10 представляет собой глутамин, глутаминовую кислоту, лизин, аргинин или серии или делетирован;
XII представляет собой аланин, аргинин или валин или делетирован;
X12 представляет собой аланин, аргинин, серии или валин или делетирован;
X13 представляет собой лизин, глутамин, аргинин или альфа-метил-глутаминовую кислоту или делетирован;
X14 представляет собой аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту или лейцин или делетирован;
X15 представляет собой фенилаланин или делетирован;
X16 представляет собой изолейцин или валин или делетирован;
X17 представляет собой аланин, цистеин, глутаминовую кислоту, лизин, глутамин или альфаметил-глутаминовую кислоту или делетирован;
X18 представляет собой триптофан или делетирован;
XI9 представляет собой аланин, изолейцин, лейцин, серии или валин или делетирован;
Х20 представляет собой аланин, лизин, метионин, глутамин или аргинин или делетирован;
Х21 представляет собой аспарагин или делетирован;
- 4 031928
Х22 представляет собой аланин, глицин или треонин или делегирован;
Х23 представляет собой цистеин или лизин или делегирован;
Х24 представляет собой пептид, имеющий от 2 до 10 аминокислот состоящий из комбинации аланина, глицина и серина, или делетирован; и
R2 представляет собой KRNRNNIA (SEQ ID NO: 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 36), GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 37), HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO: 38), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO: 39), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO:40) или делетирован (за исключением случая, где аминокислотная последовательность формулы 1 идентична SEQ ID NO: 1).
Для повышения активности оксинтомодулина дикого типа по отношению к рецептору глюкагона и к рецептору GLP-1 аналог оксинтомодулина по настоящему изобретению может быть замещен 4имидазоацетилом, полученным путем делеции альфа-углерода гистидина в положении 1 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, дезамино-гистидилом, полученным путем делеции N-концевой аминогруппы, диметил-гистидилом (N-диметил-гистидилом), полученным путем модификации Nконцевой аминогруппы двумя метальными группами, бета-гидроксиимидазопропионилом, полученным путем замещения N-концевой аминогруппы гидроксильной группой, или бета-карбоксиимидазопропионилом, полученным путем замещения N-концевой аминогруппы карбоксильной группой. Кроме того, рецептор-связывающий участок GLP-1 может быть замещен аминокислотами, усиливающими гидрофобные и ионные связи, или их комбинацией. Кроме того, часть последовательности оксинтомодулина может быть замещена аминокислотной последовательностью GLP-1 или эксендина-4, чтобы повысить активность рецептора GLP-1.
Кроме того, часть последовательности оксинтомодулина может быть замещена последовательностью, усиливающей альфа-спираль. Предпочтительно аминокислоты в положениях 10, 14, 16, 20, 24 и 28 аминокислотной последовательности формулы 1 могут быть замещены аминокислотами или производными аминокислот, состоящими из следующих: Tyr(4-Me), Phe, Phe(4-Me), Phe(4-Cl), Phe(4-CN), Phe(4NO2), Phe(4-NH2), Phg, Pal, Nal, Ala(2-тиенил) и Ala(бензотиенил), о которых известно, что они стабилизируют альфа-спираль, и тип и число встраиваемых аминокислот или производных аминокислот, стабилизирующих альфа-спираль, не ограничено. Предпочтительно аминокислоты в положениях 10 и 14, 12 и 16, 16 и 20, 20 и 24, и 24 и 28 аминокислотной последовательности могут быть также замещены глутаминовой кислотой или лизином, чтобы образовать кольца, и число встраиваемых колец не ограничено. Наиболее предпочтительно аналог оксинтомодулина может иметь аминокислотную последовательность, выбранную из формул 2-6.
Как он раскрыт в данном описании, аналог оксинтомодулина по настоящему изобретению представляет собой новый пептид, включающий аминокислотную последовательность приведенной ниже формулы 2, полученной путем замещения аминокислотной последовательности оксинтомодулина последовательностью эксендина или GLP-1:
R1-A-R3 (SEQ ID NO: 55) (Формула 2)
Как он раскрыт в данном описании, аналог оксинтомодулина представляет собой новый пептид, включающий аминокислотную последовательность приведенной ниже формулы 3, полученную путем связывания части аминокислотной последовательности оксинтомодулина и части аминокислотной последовательности эксендина или GLP-1 посредством соответствующего аминокислотного линкера:
R1-B-C-R4 (SEQ ID NO: 56) (Формула 3).
Как он раскрыт в данном описании, аналог оксинтомодулина представляет собой новый пептид, включающий аминокислотную последовательность приведенной ниже формулы 4, где часть аминокислотной последовательности оксинтомодулина замещена аминокислотой, усиливающей гидрофобное связывание с рецептором GLP-1. Например, он представляет собой пептид, где Leu в положении 26 замещен аминокислотой I1e или Val, усиливающей гидрофобность.
R1-SQGTFTSDYSKYLD-D1-D2-D3-D4-D5-LFVQW-D6-D7-N-D8-R3 (SEQ ID NO: 57) (Формула 4).
Как он раскрыт в данном описании, аналог оксинтомодулина представляет собой новый пептид, включающий аминокислотную последовательность приведенной ниже формулы 5, где часть аминокислотной последовательности нативного оксинтомодулина делетирована, добавлена или замещена другими аминокислотами для повышения способностей нативного оксинтомодулина к активации рецептора GLP1 и рецептора глюкагона:
R1-E1-QGTFTSDYSKYLD-E2-E3-RA-E4-E5-FV-E6-WLMNT-E7-R5 (SEQ ID NO: 58) (Формула 5).
В формулах 2-5 R1 является таким, как описано в формуле 1;
А выбран из группы, состоящей из
SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT (SEQ ID NO: 41),
SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT (SEQ ID NO: 42), SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT (SEQ ID NO: 43), GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 44), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 45), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA (SEQ ID NO:46) и SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG (SEQ ID NO: 47);
- 5 031928
В выбран из группы, состоящей из
SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT (SEQ ID NO: 41),
SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT (SEQ ID NO: 42),
SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT (SEQ ID NO: 43), GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 44), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 45), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA (SEQ ID NO: 46), SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG (SEQ ID NO: 47), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEW (SEQ ID NO: 48) и SQGTFTSDYSRYLD (SEQ ID NO: 49);
С представляет собой пептид, имеющий от 2 до 10 аминокислот, состоящий из комбинации аланина, глицина и серина;
D1 представляет собой серии, глутаминовую кислоту или аргинин;
D2 представляет собой аргинин, глутаминовую кислоту или серии;
D3 представляет собой аргинин, аланин или валин;
D4 представляет собой аргинин, валин или серии;
D5 представляет собой глутамин, аргинин или лизин;
D6 представляет собой изолейцин, валин или серии;
D7 представляет собой метионин, аргинин или глутамин;
D8 представляет собой треонин, глицин или аланин;
Е1 представляет собой серии, Aib, Sar, d-аланин или d-серин;
Е2 представляет собой серии или глутаминовую кислоту;
ЕЗ представляет собой аргинин или лизин;
Е4 представляет собой глутамин или лизин;
Е5 представляет собой аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту;
Е6 представляет собой глутамин, цистеин или лизин;
Е7 представляет собой цистеин или лизин или делетирован;
R3 представляет собой KRNRNNIA (SEQ ID NO: 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 36) или GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 37);
R4 представляет собой HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO: 38), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO: 39) или HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO: 40); и
R5 представляет собой KRNRNNIA (SEQ ID NO: 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 36) или GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 37) или делетирован (за исключением случая, где аминокислотные последовательности формул 2-5 идентичны SEQ ID NO: 1).
Предпочтительно аналог оксинтомодулина, как он раскрыт в данном описании, может представлять собой новый пептид приведенной ниже формулы 6:
R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20X21-X22-X23-X24-R2 (SEQ ID NO: 59) (Формула 6) где R1 представляет собой гистидин, дезаминогистидил, 4-имидазоацетил или тирозин;
XI представляет собой Aib (аминоизомасляную кислоту), глицин, серии или d-серин;
Х2 представляет собой глутаминовую кислоту или глутамин;
Х3 представляет собой лейцин или тирозин;
Х4 представляет собой серии или аланин;
Х5 представляет собой лизин или аргинин;
Х6 представляет собой глутамин или тирозин;
Х7 представляет собой лейцин или метионин;
Х8 представляет собой аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту;
Х9 представляет собой глутаминовую кислоту или альфа-метил-глутаминовую кислоту или делетирован;
X10 представляет собой глутамин, глутаминовую кислоту, лизин или аргинин или делетирован;
XII представляет собой аланин или аргинин или делетирован;
X12 представляет собой аланин или валин или делетирован;
X13 представляет собой лизин, глутамин, аргинин или альфа-метил-глутаминовую кислоту или делетирован;
X14 представляет собой аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту или лейцин или делетирован;
X15 представляет собой фенилаланин или делетирован;
X16 представляет собой изолейцин или валин или делетирован;
X17 представляет собой аланин, цистеин, глутаминовую кислоту, глутамин или альфа-метилглутаминовую кислоту или делетирован;
X18 представляет собой триптофан или делетирован;
X19 представляет собой аланин, изолейцин, лейцин или валин или делетирован;
- 6 031928
Х20 представляет собой аланин, лизин, метионин или аргинин или делегирован;
Х21 представляет собой аспарагин или делегирован;
Х22 представляет собой треонин или делетирован;
Х23 представляет собой цистеин, лизин или делетирован;
Х24 представляет собой пептид, имеющий от 2 до 10 аминокислот, состоящий из глицина, или делетирован; и
R2 представляет собой KRNRNNIA (SEQ ID NO: 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 36), GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 37), HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO: 38), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO: 39) or HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO: 40) или делетирован (за исключением случая, где аминокислотная последовательность формулы 6 идентична последовательности SEQ ID NO: 1).
Более предпочтительно аналог оксинтомодулина, как он раскрыт в данном описании, может быть выбран из группы, состоящей из пептидов SEQ ID NO: 2-34. Еще более предпочтительно аналог оксинтомодулина, как он раскрыт в данном описании, может представлять собой аналог оксинтомодулина, описанный в табл. 1 примера 2-1.
В примере настоящего изобретения были получены аналоги оксинтомодулина, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2-34, соответственно, и было обнаружено, что аналоги оксинтомодулина проявляли превосходную способность активировать рецептор GLP-1 и рецептор глюкагона по сравнению с нативным оксинтомодулином (пример 2). Иными словами, из указанных выше результатов видно, что аналог оксинтомодулина, как он раскрыт в данном описании, проявляет превосходные эффекты при предупреждении или лечении диабета, диажирения и/или осложнений диабета по сравнению с традиционным оксинтомодулином посредством активации рецептора GLP-1 и рецептора глюкагона.
Аналоги оксинтомодулина по настоящему изобретению находятся в форме конъюгатов, включающих различные полимеры для повышения терапевтического эффекта и периода полувыведения аналогов in vivo.
Конъюгаты, как они раскрыты в данном описании, обладают более длительными действиями, чем нативный оксинтомодулин, и конъюгаты длительного действия включают оксинтомодулин, полученный путем модификации, замены, добавления или делеции аминокислот нативного оксинтомодулина, оксинтомодулин, конъюгированный с биоразлагаемым полимером, таким как полиэтиленгликоль (ПЭГ), оксинтомодулин, конъюгированный с альбумином, антителом, эластином, фибронектином или полисахаридом, таким как хитин, или с белком длительного действия, таким как фрагмент иммуноглобулина, оксинтомодулин, конъюгированный с жирной кислотой, обладающей способностью к связыванию с альбумином in vivo, или оксинтомодулин, инкапсулированный в биоразлагаемых наночастицах, и тип конъюгата длительного действия, применяемого в настоящем изобретении, не ограничен.
Конъюгат может представлять собой конъюгат, где аналог оксинтомодулина, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-34, связан с участком Fc иммуноглобулина посредством непептидильного полимера.
Участок Fc иммуноглобулина представляет собой биоразлагаемый полипептид, метаболизируемый in vivo, и, следовательно, безопасен для применения в качестве носителя для лекарственного средства. Участок Fc иммуноглобулина имеет низкую молекулярную массу по сравнению с полноразмерной молекулой иммуноглобулина, и, следовательно, обладает преимуществом в отношении получения, очистки и выхода конъюгатов. Кроме того, поскольку аминокислотная последовательность различается между антителами, участок Fab, проявляющий высокую негомогенность, удаляют, и, следовательно, гомогенность вещества может быть значительно увеличена, и возможность индуцирования антигенности в крови может быть также уменьшена.
При использовании здесь термин участок Fc иммуноглобулина относится к белку, содержащему константную область 2 тяжелой цепи (CH2) и константную область 3 тяжелой цепи (CH3) иммуноглобулина, исключая вариабельные участки тяжелой цепи и легкой цепи, константную область 1 тяжелой цепи (CH1) и константную область 1 легкой цепи (CL1) иммуноглобулина. Он может дополнительно включать шарнирную область при константной области тяжелой цепи. Участок Fc иммуноглобулина по настоящему изобретению может также представлять собой расширенный участок Fc, частично или полностью включающий константную область 1 тяжелой цепи (CH1) и/или константную область 1 легкой цепи (CL1), исключая вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, если он обладает эффектом, по существу равным или лучшим по сравнению с нативным белком. Кроме того, участок Fc иммуноглобулина может представлять собой участок, имеющий делецию части относительно длинной аминокислотной последовательности, соответствующей CH2 и/или CH3. В частности, участок Fc иммуноглобулина по настоящему изобретению может включать следующие участки: 1) домен CH1, домен CH2, домен CH3 и домен CH4, 2) домен CH1 и домен CH2, 3) домен CH1 и домен CH3, 4) домен CH2 и домен CH3, 5) комбинацию одного или более доменов и шарнирную область иммуноглобулина (или часть шарнирной области), либо 6) димер каждого домена константной области тяжелой цепи и константной области легкой цепи.
Участок Fc иммуноглобулина по настоящему изобретению включает нативную аминокислотную последовательность и ее производное (мутант). При использовании здесь термин производное амино
- 7 031928 кислотной последовательности относится к последовательности, отличающейся от нативной аминокислотной последовательности вследствие делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации одного или более аминокислотных остатков нативной аминокислотной последовательности. Например, в случае IgG Fc аминокислотные остатки в положениях 214-238, 297-299, 318-322 или 327-331, известные как важные для связывания, можно использовать в качестве подходящих сайтов для модификации.
Кроме того, возможны другие различные производные, включая производное, имеющее делецию участка, способного к образованию дисульфидной связи, либо делецию некоторых аминокислотных остатков на N-конце нативного Fc, либо добавление остатка метионина на N-конце нативного Fc. Кроме того, чтобы удалить эффекторные функции, делеция может происходить в сайте связывания комплемента, таком как Clq-связывающий сайт, и в сайте ADCC (антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность). Способы получения таких производных последовательности участка Fc иммуноглобулина раскрыты в Международных заявках на патенты WO 97/34631, WO 96/32478 и т.д.
Аминокислотные замены в белках и пептидах, в целом не изменяющие активность белков или пептидов, известны в данной области техники (Н. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Наиболее часто встречающимися заменами являются следующие: Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly, в обоих направлениях. Кроме того, участок Fc может быть при необходимости модифицирован посредством фосфорилирования, сульфатирования, акрилирования, гликозилирования, метилирования, фарнезилирования, ацетилирования, амидирования и тому подобного.
Описанные выше производные Fc проявляют биологическую активность, идентичную активности участка Fc по настоящему изобретению, или обладают повышенной структурной стабильностью по отношению к нагреванию, pH или тому подобному.
Кроме того, указанный участок Fc может быть получен из нативных форм, выделенных от человека и других животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок, либо может представлять собой их рекомбинанты или производные, полученные из трансформированных клеток животных или микроорганизмов. В данном изобретении участок Fc может быть получен из нативного иммуноглобулина путем выделения полноразмерного иммуноглобулина из живого организма человека или животного и обработки выделенного иммуноглобулина протеиназой. При обработке полноразмерного иммуноглобулина папаином он расщепляется на участки Fab и Fc, а при обработке полноразмерного иммуноглобулина пепсином он расщепляется на фрагменты pF'c и F(ab)2. Участок Fc или pF'c можно выделить, используя эксклюзионную хроматографию или тому подобное. Предпочтительно участок Fc человеческого происхождения представляет собой рекомбинантный участок Fc иммуноглобулина, полученный из микроорганизма.
Кроме того, участок Fc иммуноглобулина может находиться в форме, имеющей нативные сахарные цепи, либо увеличенные или уменьшенные сахарные цепи по сравнению с нативной формой, либо может находиться в дегликозилированной форме. Увеличение, уменьшение или удаление сахарных цепей участка Fc иммуноглобулина может быть достигнуто общепринятыми способами, такими как химический способ, ферментативный способ и генно-инженерный способ с использованием микроорганизма. Участок Fc, полученный путем удаления сахарных цепей из Fc, проявляет значительное снижение аффинности связывания с участком Clq и к снижению или утрате антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности или комплементзависимой цитотоксичности, и, следовательно, не индуцирует нежелательные иммунные ответы in vivo. В этом отношении участок Fc иммуноглобулина в дегликозилированной или агликозилированной форме может быть более подходящим для задач настоящего изобретения в качестве носителя лекарственного средства.
При использовании здесь термин дегликозилирование относится к ферментативному удалению сахарных группировок из участка Fc, и термин агликозилирование относится к негликозилированному участку Fc, продуцируемому в прокариоте, предпочтительно в Е. coli.
В то же время, участок Fc иммуноглобулина может быть выделен от человека или других животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок. Предпочтительно он выделен от человека.
Кроме того, участок Fc иммуноглобулина может быть выделен из IgG, IgA, IgD, IgE, IgM или их комбинации или гибрида. Предпочтительно он выделен из IgG или IgM, являющихся самыми обильными белками в крови человека, и наиболее предпочтительно из IgG, о котором известно, что он увеличивает периоды полувыведения лиганд-связывающих белков.
При использовании здесь термин комбинация означает, что полипептиды, кодирующие одноцепочечные участки Fc иммуноглобулинов одинакового происхождения, связаны с одноцепочечным полипептидом другого происхождения с образованием димера или мультимера. В частности, димер или мультимер может быть образован из двух или более фрагментов, выбранных из группы, состоящей из фрагментов IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc и IgE Fc.
При использовании здесь термин гибрид означает, что в одноцепочечном участке Fc иммуноглобулина присутствуют последовательности, соответствующие двум или более фрагментам Fc иммуногло- 8 031928 булина различного происхождения. В настоящем изобретении возможны различные формы гибрида.
Иными словами, возможен гибрид, состоящий из доменов в количестве от 1 до 4, выбранных из группы, состоящей из CH1, CH2, CH3 и CH4 IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc и IgD Fc, и он может включать шарнирную область.
В то же время, IgG может быть также разделен на подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и в настоящем изобретении также возможна комбинация или гибрид этих подклассов. Предпочтительно IgG относится к подклассам IgG2 и IgG4, и наиболее предпочтительно он представляет собой участок Fc IgG4, в котором по существу отсутствуют эффекторные функции, такие как комплементзависимая цитотоксичность (CDC).
Иными словами, наиболее предпочтительным участком Fc иммуноглобулина, используемым в качестве носителя лекарственного средства в настоящем изобретении, является участок Fc, выделенный из IgG4 человека. Участок Fc человеческого происхождения более предпочтителен, чем участок Fc происхождения, отличающегося от человеческого, который может действовать в качестве антигена в организме человека и вызывать нежелательные иммунные ответы, такие как продуцирование нового антитела против антигена.
При использовании здесь термин непептидильный полимер относится к биосовместимому полимеру, включающему два или более повторяющихся звеньев, связанных друг с другом любой ковалентной связью вместо пептидной связи. В настоящем изобретении непептидильный полимер можно использовать взаимозаменяемо с непептидильным линкером.
Непептидильный полимер, который можно использовать в настоящем изобретении, может быть выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля/пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемых полимеров, таких как PLA (полимолочная кислота) и PLGA (сополимер молочной и гликолевой кислот), липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинаций. Предпочтительно непептидильный полимер представляет собой полиэтиленгликоль. Кроме того, его производные, известные в данной области техники, и производные, которые могут быть легко получены способом, известным в данной области техники, также находятся в пределах объема настоящего изобретения.
Пептидный линкер, используемый в слитом белке, полученном традиционным способом слияния в рамке считывания, имеет недостатки, состоящие в том, что он легко расщепляется протеиназой in vivo, и, следовательно, достаточный эффект увеличения периода полувыведения активного лекарственного средства в сыворотке за счет носителя не может быть получен, как ожидалось. Тем не менее, в настоящем изобретении можно использовать полимер, обладающий устойчивостью к протеиназе, для поддержания периода полувыведения пептида в сыворотке, аналогично носителю. Таким образом, в настоящем изобретении можно использовать любой непептидильный полимер без ограничения, если он представляет собой полимер, обладающий упомянутой выше функцией, то есть полимер, обладающий устойчивостью к протеиназе in vivo. Непептидильный полимер имеет молекулярную массу в диапазоне от 1 до 100 кДа, и предпочтительно от 1 до 20 кДа. Непептидильный полимер по настоящему изобретению, связанный с участком Fc иммуноглобулина, может представлять собой один вид полимера или комбинацию различных полимеров.
Непептидильный полимер, используемый в настоящем изобретении, может иметь активную группу, способную к связыванию с участком Fc иммуноглобулина и белковым лекарственным средством. Активная группа на обоих концах непептидильного полимера предпочтительно выбрана из группы, состоящей из активной альдегидной группы, пропиональдегидной группы, бутиральдегидной группы, малеимидной группы и производного сукцинимида.
Производное сукцинимида может представлять собой сукцинимидилпропионат, гидроксисукцинимидил, сукцинимидилкарбоксиметил или сукцинимидилкарбонат. В частности, когда непептидильный полимер имеет активную альдегидную группу на его обоих концах, неспецифические взаимодействия можно свести к минимуму, и физиологически активный полипептид и иммуноглобулин могут быть эффективно связаны с обоими концами непептидильного полимера, соответственно. Конечный продукт, образованный путем восстановительного алкилирования альдегидной связью, значительно более стабилен, чем связанный амидной связью. Альдегидная активная группа селективно связывается с N-концом при низком pH и может образовывать ковалентную связь с остатком лизина при высоком pH, таком как pH 9,0.
Активные группы на обоих концах линкера, то есть непептидильного полимера, могут быть одинаковыми или разными. Например, непептидильный полимер может содержать на одном конце малеимидную группу, а на другом конце альдегидную группу, пропиональдегидную группу или бутиральдегидную группу. Для получения конъюгата длительного действия по настоящему изобретению при использовании в качестве непептидильного полимера полиэтиленгликоля, содержащего активную гидроксигруппу на его обоих концах, эта гидроксигруппа может быть активирована с образованием различных активных групп с помощью известных химических реакций, либо можно использовать полиэтиленгликоль, содержащий имеющуюся в продаже модифицированную активную группу.
- 9 031928
Конъюгат по настоящему изобретению может представлять собой конъюгат, в котором каждый конец непептидильного полимера связан с участком Fc иммуноглобулина и с аминной или тиольной группой аналога оксинтомодулина, соответственно.
Кроме того, в настоящем изобретении оба конца непептидильного полимера включают активные группы, с которыми может связываться участок Fc иммуноглобулина и белковое лекарственное средство. Примеры активных групп включают, без ограничения, альдегидную группу, пропиональдегидную группу или бутиральдегидную группу, малеимидную группу, производное сукцинимида (сукцинимидилпропионат, гидроксисукцинимидил, сукцинимидилпропионаткарбоксиметил или сукцинимидилкарбонат) и тому подобное.
Активные группы на обоих концах линкера, то есть непептидильного полимера, могут быть одинаковыми или разными. Например, непептидильный полимер может иметь на одном конце малеимидную группу, а на другом конце альдегидную группу, пропиональдегидную группу или бутиральдегидную группу. Например, когда непептидильный полимер имеет активную альдегидную группу на одном конце и активную малеимидную группу на другом конце, неспецифические взаимодействия можно свести к минимуму, и физиологически активный полипептид и иммуноглобулин могут быть эффективно связаны с обоими концами непептидильного полимера. В примере настоящего изобретения конъюгат синтезировали путем связывания оксинтомодулина или его аналога с участком Fc иммуноглобулина посредством ковалентной связи, используя непептидильный полимер ПЭГ, включающий одну пропиональдегидную группу или как малеимидную группу, так и альдегидную группу.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно применять для предупреждения или лечения диабета, диажирения и/или осложнений диабета.
При использовании здесь термин предупреждение относится ко всем действиям, ингибирующими или замедляющим развитие заболевания-мишени. В частности, термин предупреждение означает введение аналога оксинтомодулина по настоящему изобретению для контроля уровней глюкозы в крови до нормальных уровней, в результате чего ингибируют или замедляют развитие диабета, диажирения или осложнений диабета.
При использовании здесь термин лечение относится ко всем действиям, облегчающим, улучшающим или ослабляющим симптомы развившегося заболевания. В частности, термин лечение означает введение аналога оксинтомодулина по настоящему изобретению для поддержания уровней глюкозы в крови на нормальных уровнях, в результате чего облегчают, улучшают или ослабляют состояния диабета, диажирения или осложнений диабета.
При использовании здесь термин диабет представляет собой вид метаболического заболевания, при котором секреция инсулина недостаточна или нормальные функции не выполняются. Диабет характеризуется повышенными уровнями глюкозы в крови, вызывающими различные состояния и синдромы. В случае диабета глюкоза выводится с мочой.
При использовании здесь термин диажирение относится к диабету, которому сопутствуют состояния ожирения, в частности к диабету типа 2, или к состояниям ожирения, которые, как правило, встречаются у пациентов с диабетом типа 2. Приблизительно 80-90% пациентов с диабетом типа 2 страдают состояниями ожирения, и для них характерна инсулинорезистентность. Надлежащая лечебная физкультура, диетотерапия и фармакотерапия могут предотвратить диажирение и облегчить состояния диажирения. В настоящем изобретении диажирение может означать диажирение в результате ожирения.
При использовании здесь термин осложнения диабета относится к различным патологическим состояниям, встречающимся в организме вследствие гипергликемических состояний, сохраняющихся в течение длительного периода времени. Примеры осложнений диабета включают, без ограничения, ретинопатию, дисфункцию почек, нейропатию, удар, вызванный сосудистым расстройством, заболевания почек или сердца, язву, связанную с синдромом диабетической стопы, и сердечнососудистое заболевание. Если гипергликемическое состояние сохраняется в течение длительного периода времени, оно приводит к различным патологическим состояниям в организме. Как правило, оно повышает риск ретинопатии, дисфункции почек, нейропатии, удара, вызванного сосудистым расстройством, заболеваний почек или сердца, язвы, связанной с синдромом диабетической стопы, и сердечнососудистого заболевания. Таким образом, для предупреждения осложнений диабета необходим эффективный контроль уровней глюкозы в крови.
Соответственно, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно применять для предупреждения или лечения диабета, диажирения или осложнений диабета.
В примере настоящего изобретения конъюгат аналога оксинтомодулина длительного действия по настоящему изобретению был получен путем ковалентного связывания аналога оксинтомодулина по настоящему изобретению с участком Fc иммуноглобулина посредством полиэтиленгликоля, и полученный конъюгат вводили в модели мышей с ожирением, индуцированным рационом с высоким содержанием жира, и в модели мышей с диабетом, индуцированным мутацией в рецепторе лептина. В результате было показано, что масса тела и прием пищи группы, которой вводили конъюгат аналога оксинтомодулина длительного действия по настоящему изобретению, были значимо снижены по сравнению с уровнями модели животных с индуцированным ожирением (фиг. 1), и что уровень глюкозы в крови значимо сни- 10 031928 жался (фиг. 2). Кроме того, конъюгат аналога оксинтомодулина длительного действия по настоящему изобретению проявлял эффект снижения глюкозы в крови, равный или более высокий, чем имеющийся в продаже аналог GLP-1 длительного действия Виктоза® (фиг. 2).
В примере настоящего изобретения конъюгат аналога оксинтомодулина длительного действия был получен путем ковалентного связывания аналога оксинтомодулина по настоящему изобретению с участком Fc иммуноглобулина, и полученный конъюгат вводили в модели мышей с диабетом, индуцированным мутацией в рецепторе лептина. В результате было показано, что в группе, которой вводили конъюгат аналога оксинтомодулина длительного действия, увеличение массы тела было значимо ингибировано по сравнению с контрольной группой (фиг. 3), и уровень глюкозы в крови значимо снижался (фиг. 4), и данный конъюгат также показал лучший эффект снижения глюкозы в крови по сравнению с имеющимся в продаже аналогом GLP-1 длительного действия Виктоза® (фиг. 4).
Иными словами, аналог оксинтомодулина согласно настоящему изобретению выполняет функцию индуцирования развития бета-клеток in vivo с повышением секреции инсулина, улучшая посредством этого способность к контролю уровня глюкозы в крови.
Кроме того, аналог оксинтомодулина согласно настоящему изобретению индуцирует снижение массы тела с улучшением чувствительности к инсулину и предотвращает развитие сердечнососудистых заболеваний, включая атеросклероз, гиперлипидемию и гипертензию, которые могут развиваться вследствие инсулинорезистентности. Соответственно, аналог оксинтомодулина по настоящему изобретению можно эффективно применять в качестве агента для лечения диабета, диажирения и осложнений диабета. Кроме того, конъюгат по настоящему изобретению обладает высокой способностью к активации рецептора GLP-1 и рецептора глюкагона по сравнению с нативным оксинтомодулином и проявляет увеличенный период полувыведения в крови in vivo за счет связанного с ним участка Fc, и, следовательно, его активность может поддерживаться in vivo в течение увеличенного периода времени.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать фармацевтический агент, проявляющий превентивное или терапевтическое действие против диабета, диажирения или осложнений диабета. Для введения аналога оксинтомодулина по настоящему изобретению в комбинации с фармацевтическим агентом, известным в качестве терапевтического агента против диабета, диажирения или осложнений диабета, композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать этот известный фармацевтический агент.
Таким образом, композицию по настоящему изобретению можно применять отдельно или вводить в комбинации с другими лекарственными средствами для предупреждения или лечения диабета, диажирения или осложнений диабета.
При использовании здесь термин введение означает введение данного вещества пациенту любым подходящим способом. Конъюгат по настоящему изобретению можно вводить любым обычным путем, если он может достичь ткани-мишени. В частности, конъюгат аналога по настоящему изобретению можно вводить интраперитонеально, внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрикожно, перорально, локально, интраназально, внутрилегочным путем или интраректально, но путь введения не ограничен ими. Тем не менее, поскольку пептид расщепляется при пероральном введении, пероральную композицию предпочтительно готовят таким образом, чтобы активный ингредиент был покрыт или защищен от разложения в желудке. Предпочтительно композицию по настоящему изобретению можно вводить в инъекционной форме. Кроме того, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить, используя любую систему, способную к доставке активного ингредиента в клетки-мишени.
Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат аналога оксинтомодулина по настоящему изобретению, может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Для перорального введения фармацевтически приемлемые носители включают связующее вещество, смазывающее вещество, разрыхлитель, эксципиент, солюбилизатор, диспергирующий агент, стабилизатор, суспендирующий агент, краситель и корригент. Для инъекционных препаратов фармацевтически приемлемые носители включают буфер, консервант, анальгетик, солюбилизатор, изотонический агент и стабилизатор. Для местного введения фармацевтически приемлемые носители включают основу, эксципиент, смазывающее вещество и консервант. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно готовить в различных дозируемых формах, используя упомянутые выше фармацевтически приемлемые носители. Например, для перорального введения фармацевтическую композицию можно готовить в форме таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток или тому подобного. Для инъекционных препаратов фармацевтическая композиция может быть представлена в виде ампулы, содержащей стандартную дозу, или контейнера, содержащего множественные дозы. Кроме того, фармацевтическую композицию можно также включать в растворы, суспензии, таблетки, пилюли, капсулы и препараты пролонгированного высвобождения.
Кроме того, примеры носителя, эксципиента и разбавителя, подходящего для приготовления, включают лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, аравийскую камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат,
- 11 031928 тальк, стеарат магния и минеральные масла. Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать наполнители, антикоагулянты, смазывающие вещества, увлажняющие агенты, корригенты, консервант и тому подобное.
Дозу фармацевтической композиции по настоящему изобретению определяют в соответствии с видом активного ингредиента вместе с различными факторами, такими как заболевание, подлежащее лечению, путь введения, возраст пациента, пол и масса тела, а также тяжесть заболевания. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению имеет длительный период полувыведения in vivo и превосходную биодоступность, и, следовательно, число и частоту введения фармацевтической композиции можно значительно уменьшить.
В другом аспекте в настоящем изобретении предложен способ предупреждения или лечения диабета, диажирения или осложнений диабета, включающий введение субъекту фармацевтически эффективного количества конъюгата аналога оксинтомодулина.
Аналог оксинтомодулина, диабет, диажирение и осложнения диабета являются здесь такими, как определено выше.
При использовании здесь термин субъект относится к субъекту с подозрением на диабет, диажирение или осложнения диабета. В частности, этот термин означает млекопитающих, включая людей, крыс и домашних животных, страдающих описанным выше заболеванием или имеющих риск развития описанного выше заболевания. Кроме того, субъект может представлять собой любого субъекта, которого можно лечить аналогом оксинтомодулина по настоящему изобретению.
Терапевтический способ по настоящему изобретению может включать введение фармацевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей конъюгат. Суммарная суточная доза композиции может быть определена на основании надлежащего медицинского заключения врача, и композицию можно вводить один раз или несколько раз. Тем не менее, в свете задачи настоящего изобретения конкретная терапевтически эффективная доза композиции для какого-либо конкретного пациента может варьировать в зависимости от различных факторов, хорошо известных в области медицины, включающих вид и степень ответа, который должен быть достигнут, конкретные композиции в том отношении, применяют ли совместно другие агенты, возраст пациента, массу тела, состояние здоровья, пол и режим питания, время и путь введения, скорость секреции композиции, продолжительность лечения, другие лекарственные средства, применяемые в комбинации или совместно с композицией по настоящему изобретению, а также другие факторы, известные в области медицины.
Также в настоящем изобретении раскрыто применение конъюгата аналога оксинтомодулина по настоящему изобретению при получении лекарственного средства для предупреждения или лечения диабета, диажирения или осложнений диабета.
Также в настоящем изобретении раскрыт способ получения конъюгата аналога оксинтомодулина.
Способ получения по настоящему изобретению может включать следующие стадии: (1) ковалентное связывание непептидильного полимера, содержащего активную альдегидную, малеимидную или сукцинимидную группу на обоих концах, с аминной или тиольной группой пептида-аналога оксинтомодулина; (2) выделение конъюгата, включающего пептид-аналог оксинтомодулина, содержащего непептидильный полимер, ковалентно связанный с этим аналогом в положениях, отличающихся от аминоконцевого положения, из реакционной смеси стадии (1); и (3) ковалентное связывание участка Fc иммуноглобулина с другим концом связанного непептидильного полимера выделенного конъюгата, в результате чего получают пептидный конъюгат, включающий участок Fc иммуноглобулина и пептид-аналог оксинтомодулина, связанные с обоими концами непептидильного полимера, соответственно.
Более конкретно способ получения может включать следующие стадии: (1) ковалентное связывание непептидильного полимера, содержащего активную альдегидную группу и активную малеимидную группу на каждом его конце, с остатком цистеина аналога оксинтомодулина; (2) выделение конъюгата, включающего аналог оксинтомодулина, содержащего непептидильный полимер, ковалентно связанный с остатком цистеина, из реакционной смеси стадии (1); и (3) ковалентное связывание участка Fc иммуноглобулина с другим концом связанного непептидильного полимера выделенного конъюгата, в результате чего получают пептидный конъюгат, включающий участок Fc иммуноглобулина и аналог оксинтомодулина, связанные с обоими концами непептидильного полимера, соответственно.
Техническое выполнение изобретения
Далее настоящее изобретение раскрыто более подробно со ссылкой на примеры. Тем не менее, понятно, что эти примеры предназначены только для иллюстративных целей и не подразумевают ограничения объема настоящего изобретения.
Пример 1. Получение линии клеток для активации in vitro.
Пример 1-1. Получение линии клеток, демонстрирующей сАМР(циклический аденозинмонофосфат)-ответ на GLP-1.
Используя участок, соответствующий ORF (открытая рамка считывания), кДНК (комплементарная ДНК) (OriGene Technologies, Inc. USA) гена рецептора GLP-1 человека в качестве матрицы, проводили PCR (полимеразная цепная реакция), используя прямые и обратные праймеры, включающие сайт рестрикции HindIII и сайт рестрикции EcoRI, соответственно, с получением в результате продукта PCR.
- 12 031928
Прямой праймер: 5'-CCCGGCCCCCGCGGCCGCTATTCGAAATAC-3' (SEQ ID NO: 50).
Обратный праймер: 5'-GAACGGTCCGGAGGACGTCGACTCTTAAGATAG-3' (SEQ ID NO: 51).
Продукт PCR клонировали в известный экспрессионный вектор животных клеток x0GC/dhfr, в результате чего сконструировали рекомбинантный вектор x0GC/GLP-1R.
Рекомбинантный вектор x0GC/GLP-1R вводили в линию клеток CHO DG44, культивировали в среде DMEM/F12 (10% фетальная бычья сыворотка (FBS)), используя липофектамин (Invitrogene, USA), с получением трансформанта. Трансформант инкубировали в селективной среде, содержащей 1 мг/мл G418 и 10 нМ метотрексат, и от него отбирали моноклональные линии клеток. Затем, наконец, из моноклональных линий клеток отбирали линию клеток, демонстрирующую надлежащий зависимый от концентрации сАМР-ответ на GLP-1.
Пример 1-2. Получение линии клеток, демонстрирующей сАМР-ответ на глюкагон.
Используя участок, соответствующий ORF (открытая рамка считывания), кДНК (OriGene Technologies, Inc. USA) гена рецептора глюкагона человека в качестве матрицы, проводили PCR, используя прямые и обратные праймеры, включающие сайт рестрикции EcoRI и сайт рестрикции XhoI, соответственно, с получением в результате продукта PCR.
Прямой праймер: 5'-CAGCGACACCGACCGTCCCCCCGTACTTAAGGCC-3' (SEQ ID NO: 52).
Обратный праймер: 5'-CTAACCGACTCTCGGGGAAGACTGAGCTCGCC-3' (SEQ ID NO: 53).
Продукт PCR клонировали в известный экспрессионный вектор животных клеток x0GC/dhfr, в результате чего сконструировали рекомбинантный вектор x0GC/GCGR.
Рекомбинантный вектор x0GC/GCGR вводили в линию клеток CHO DG44, культивировали в среде DMEM/F12 (10% фетальная бычья сыворотка (FBS)), используя липофектамин (Invitrogene, USA), с получением трансформанта. Трансформант инкубировали в селективной среде, содержащей 1 мг/мл G418 и 10 нМ метотрексат, и от него отбирали моноклональные линии клеток. Затем, наконец, из моноклональных линий клеток отбирали линию клеток, демонстрирующую надлежащий зависимый от концентрации сАМР-ответ на глюкагон.
Пример 2. Активность аналогов оксинтомодулина in vitro.
Пример 2-1. Синтез аналогов оксинтомодулина.
Для измерения активностей аналогов оксинтомодулина in vitro синтезировали аналоги оксинтомодулина, имеющие аминокислотные последовательности, представленные в табл. 1 ниже.
Таблица 1. Оксинтомодулин и аналоги оксинтомодулина
SEQ Ш NO Последовательность
SEQ Ш NO: 1 HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA
SEQ Ш NO: 2 CA-SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNTKRNRNNIA
SEQ Ш NO: 3 CA-SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNTGPSSGAPPPS
SEQ Ш NO: 4 CA-GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS
SEQ Ш NO: 5 CA-GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS
SEQ Ш NO: 6 CA-GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAAHSQGTFTSDYSKYLD
SEQ Ш NO: 7 CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIEWLMNTK
SEQ Ш NO: 8 CA-SQGTFTSDLSRQLEEEAVRLFIEWLMNK
SEQ Ш NO: 9 CA-GQGTFTSDYSRYLDEEAVXLFIEWLMNTKRNRNNIA
SEQ ID NO: 10 CA-SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNGGPSSGAPPPSK
SEQ ID NO: 11 CA-GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAAHSQGTFTSDYSRYLDK
SEQ ID NO: 12 CA-SQGTFTSDYSRYLDGGGHGEGTFTSDLSKQMEEEAVK
SEQ ID NO: 13 CA-SQGTFTSDYSRYLDXEAVXLFIEWLMNTK
SEQ ID NO: 14 CA-GQGTFTSDYSRYLDEEAVXLFIXWLMNTKRNRNNIA
SEQ ID NO: 15 CA-GQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIXWLMNTKRNRNNIA
SEQ ID NO: 16 CA-SQGTFTSDLSRQLEGGGHSQGTFTSDLSRQLEK
SEQ ID NO: 17 CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIEWIRNTKRNRNNIA
SEQ ID NO: 18 CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIEWIRNGGPSSGAPPPSK
SEQ ID NO: 19 CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVKLFIEWIRNTKRNRNNIA
SEQ ID NO: 20 CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVKLFIEWIRNGGPSSGAPPPSK
SEQ ID NO: 21 CA-SQGTFTSDYSRQLEEEAVRLFIEWVRNTKRNRNNIA
SEQ ID NO: 22 DA-SQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTK
SEQ ID NO: 23 HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVCWLMNT
- 13 031928
SEQ ГО NO: 24 HAibQGTFTSDY SKYLDEKRAK EFVQWLMNTC
SEQ ID NO: 25 HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC
SEQ ГО NO: 26 HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC
SEQ ГО NO: 27 HAibQGTFTSDYSKYLDEQAAKEFICWLMNT
SEQ ID NO: 28 HAibQGTFTSDY SKYLDEKRAK EFVQWLMNT
SEQ ID NO: 29 H(d)SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA
SEQ ID NO: 30 CA-SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA
SEQ ID NO: 31 CA-(d)SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA
SEQ ID NO: 32 CA-AibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC
SEQ ID NO: 33 HAibQGTFTSDYAKYLDEKRAKEFVQWLMNTC
SEQ ID NO: 34 YAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC
В табл. 1 выше аминокислоты, указанные жирным шрифтом, означают образование кольца, и аминокислоты, обозначенные как X, означают альфа-метил-глутаминовые кислоты, представляющие собой не нативные аминокислоты. Кроме того, СА представляет собой 4-имидазоацетил, DA представляет собой дезамино-гистидил, и (d)S представляет собой d-серин.
Пример 2-2. Измерение активностей аналогов оксинтомодулина in vitro.
Для измерения эффектов пептидов, полученных в примере 2-1 выше, измеряли активности пептидов в клетках in vitro, используя трансформанты, полученные в примерах 1-1 и 1-2.
Каждый из трансформантов трансформировали таким образом, чтобы они экспрессировали каждый из генов: рецептора GLP-1 человека и рецептора глюкагона человека - в клетках яичника китайского хомячка (CHO) и подходили для измерения активностей GLP-1 и глюкагона. Таким образом, активность каждого из аналогов оксинтомодулина измеряли, используя каждый из трансформантов.
В частности, каждый из трансформантов субкультивировали два или три раза в неделю, и клетки распределяли в каждую лунку 96-луночного планшета при плотности 1x105 клеток/лунка и культивировали в течение 24 ч.
Культивированные клетки промывали буфером KRB, суспендировали в 40 мл буфера KRB, содержащего 1 мМ изобутилметилксантин (IBMX), а затем давали стоять при комнатной температуре в течение 5 мин. Каждый из оксинтомодулина (SEQ ID NO:
1) и аналогов оксинтомодулина (SEQ ID NO: 2-6, 8, 10-13, 17, 18, 23-25, 27, 28 и 32-34) серийно разводили в пять раз от 1000 нМ до 0,02 нМ, и 40 мл каждого из разведений добавляли к клеткам, после чего эти клетки инкубировали в CO2 инкубаторе при 37°С в течение 1 ч. Затем добавляли 20 мл буфера для лизиса клеток, чтобы лизировать клетки, и концентрацию цАМФ в каждом из клеточных лизатов измеряли, используя набор для анализа cAMP (Molecular Device, USA). На основании результатов измерения вычисляли значения EC50 и сравнивали друг с другом (табл. 2).
Таблица 2. Сравнение активностей аналогов оксинтомодулина в отношении рецептора GLP-1 и рецепторе глюкагона in vitro
SEQ ID NO EC50 (hM)
CHO/GLP-1R CHO/GCGR
SEQ ID NO: 1 50-210 10-43
SEQ ID NO: 2 51,8 12,8
SEQ ID NO: 3 >1000 637,7
SEQ ID NO: 4 5,5 >1000
SEQ ID NO: 5 5,9 >1000
SEQ ID NO: 6 500,1 >1000
SEQ ID NO: 8 419,6 >1000
SEQ ID NO: 10 >1000 >1000
SEQ ID NO: 11 >1000 >1000
SEQ ID NO: 12 >1000 >1000
SEQ ID NO: 13 >1000 >1000
SEQ ID NO: 17 97,9 >1000
SEQ ID NO: 18 96,3 >1000
SEQ ID NO: 23 2,46 5,8
SEQ ID NO: 24 1,43 6,95
SEQ ID NO: 25 1,9 1,3
SEQ ID NO: 27 2,8-5,5 3,1-5,6
SEQ ID NO: 28 3,1 0,3
SEQ ID NO: 32 41,3 17,7
SEQ ID NO: 33 2,2 80,2
SEQ ID NO: 34 12,5 1,04
- 14 031928
Как видно в табл. 2 выше, аналоги оксинтомодулина показали превосходные активности in vitro в отношении рецептора GLP-1 и глюкагона по сравнению с оксинтомодулином SEQ ID NO: 1.
Известно, что оксинтомодулин обладает эффектом лечения ожирения, гиперлипидемии, жировой болезни печени или атеросклероза посредством активации рецептора GLP-1 и рецептора глюкагона. Аналоги оксинтомодулина согласно настоящему изобретению обладают высокой способностью к активации рецептора GLP-1 и рецептора глюкагона in vitro по сравнению с нативным оксинтомодулином, что позволяет предположить, что эти аналоги оксинтомодулина в высокой степени эффективны при лечении диабета, диажирения или осложнений диабета по сравнению с нативным оксинтомодулином.
Пример 3. Получение конъюгата, включающего аналог оксинтомодулина (SEQ ID NO: 23) и иммуноглобулин Fc (иммуноглобулин Fc-конъюгированного аналога оксинтомодулина 23).
Для ПЭГилирования MAL-10K-ALD ПЭГ (NOF., Japan) при остатке цистеина в положении 24 аминокислотной последовательности аналога оксинтомодулина (SEQ ID NO: 23) этому аналогу оксинтомодулина (SEQ ID NO: 23) и MAL-10K-ALD ПЭГ давали возможность взаимодействовать друг с другом при молярном отношении 1:3 при концентрации белка 3 мг/мл при комнатной температуре в течение 3 ч. Эту реакцию проводили в 50 мМ Трис буфере (pH 8,0), содержащем 1 М гуанидин. После завершения взаимодействия реакционный раствор наносили на SOURCE S в описанных ниже условиях, в результате чего очищали аналог оксинтомодулина, моно-ПЭГилированный при остатке цистеина. Колонка: SOURCE S, скорость тока: 2,0 мл/мин, градиент: А 0 ->100% 50 мин В (А: 20 мМ Na цитрат (pH 3,0) + 45% этанол, В: А + 1 М KCl).
Затем очищенному моно-ПЭГилированному аналогу оксинтомодулина (SEQ ID NO: 23) и иммуноглобулину Fc давали возможность взаимодействовать друг с другом при молярном отношении 1:5, при концентрации белка 20 мг/мл при 4°С в течение 16 ч. Реакцию проводили в 100 мМ калий-фосфатном буфере (pH 6,0), содержащем 20 мМ SCB (цианоборгидрид натрия) в качестве восстанавливающего агента. После завершения взаимодействия реакционный раствор наносили на колонку для очистки SOURCE (колонка: SOURCE 15Q, скорость тока: 2,0 мл/мин, градиент: А 0 -> 4% 1 мин, В -> 20% 80 мин В (А: 20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, В: А + 1 М NaCl)) и колонку Source ISO (колонка: SOURCE ISO, скорость тока: 2,0 мл/мин, градиент: В 0 -> 100% 100 мин А, (А: 20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, В: А + 1,1 М сульфат аммония (СА)), в результате чего очищали конъюгат, содержащий аналог оксинтомодулина (SEQ ID NO: 23) и иммуноглобулин Fc.
Пример 4. Получение конъюгата, содержащего аналог оксинтомодулина (SEQ ID NO: 25) и иммуноглобулин Fc (иммуноглобулин Fc-конъюгированный аналог оксинтомодулина 25).
Для ПЭГилирования MAL-10K-ALD ПЭГ при остатке цистеина в положении 30 аминокислотной последовательности аналога оксинтомодулина (SEQ ID NO: 25) аналогу оксинтомодулина (SEQ ID NO: 25) и MAL-10K-ALD ПЭГ давали возможность взаимодействовать друг с другом при молярном отношении 1:3, при концентрации белка 3 мг/мл при комнатной температуре в течение 3 ч. Реакцию проводили в 50 мМ Трис-буфере (pH 8,0), содержащем 1 М гуанидин. После завершения взаимодействия реакционный раствор наносили на SOURCE S в описанных ниже условиях, в результате чего очищали аналог оксинтомодулина, моно-ПЭГилированный при остатке цистеина: колонка: SOURCE S, скорость тока: 2,0 мл/мин, градиент: А 0 -> 100% 50 мин В (А: 20 мМ Na-цитрат (pH 3,0) + 45% этанол, В: А + 1 М KCl).
Затем очищенному моно-ПЭГилированному аналогу оксинтомодулина (SEQ ID NO: 25) и иммуноглобулину Fc давали возможность взаимодействовать друг с другом при молярном отношении 1:5, при концентрации белка 20 мг/мл, при 4°С в течение 16 ч. Реакцию проводили в 100 мМ калий-фосфатном буфере (pH 6,0), содержащем 20 мМ SCB в качестве восстанавливающего агента. После завершения взаимодействия реакционный раствор наносили на колонку SOURCE 15Q (колонка: SOURCE 15Q, скорость тока: 2,0 мл/мин, градиент: А 0 -> 4% 1 мин В -> 20% 80 мин В (А: 20 мМ Трис-HCl (pH 7,5), В: А + 1 М NaCl)) и колонку Source ISO (колонка: SOURCE ISO, скорость тока: 2,0 мл/мин, скорость тока: В 0 -> 100% 100 мин А (А: 20 мМ Трис-HCl (pH 7,5), В: А + 1,1 М СА)), в результате чего очищали конъюгат, содержащий аналог оксинтомодулина (SEQ ID NO: 25) и иммуноглобулин Fc.
Пример 5. Получение конъюгата, содержащего аналог оксинтомодулина (SEQ ID NO: 27) и иммуноглобулин Fc (иммуноглобулин Fc-конъюгированный аналог оксинтомодулина 27).
Для ПЭГилирования MAL-10K-ALD ПЭГ при остатке цистеина в положении 30 аминокислотной последовательности аналога оксинтомодулина (SEQ ID NO: 27) аналогу оксинтомодулина (SEQ ID NO: 27) и MAL-10K-ALD ПЭГ давали возможность взаимодействовать друг с другом при молярном отношении 1:3, при концентрации белка 3 мг/мл при комнатной температуре в течение 3 ч. Реакцию проводили в 50 мМ Трис-буфере (pH 8,0), содержащем 1 М гуанидин. После завершения взаимодействия реакционный раствор наносили на SOURCE S в описанных ниже условиях, в результате чего получили аналог оксинтомодулина, моно-ПЭГилированный при остатке цистеина: колонка: SOURCE S, скорость тока: 2,0 мл/мин, градиент: А 0 -> 100% 50 мин В (А: 20 мМ Na-цитрат (pH 3,0) + 45% этанол, В: А + 1 М KCl).
Затем очищенному моно-ПЭГилированному аналогу оксинтомодулина (SEQ ID NO: 27) и иммуноглобулину Fc давали возможность взаимодействовать друг с другом при молярном отношении 1:5, при концентрации белка 20 мг/мл при 4°С в течение 16 ч. Реакцию проводили в 100 мМ калий-фосфатном буфере (pH 6,0), содержащем 20 мМ SCB в качестве восстанавливающего агента. После завершения вза- 15 031928 имодействия реакционный раствор наносили на колонку SOURCE 15Q (колонка: SOURCE 15Q, скорость тока: 2,0 мл/мин, градиент: А 0 -> 4% 1 мин В -> 20% 80 мин В (А: 20 мМ Трис-HCl (pH 7,5), В: А + 1М
NaCl)) и колонку Source ISO (колонка: SOURCE ISO, скорость тока: 2,0 мл/мин, градиент: В 0 -> 100%
100 мин А (А: 20 мМ Трис-HCl (pH 7,5), В: А + 1,1 М СА)), в результате чего очищали конъюгат, содержащий аналог оксинтомодулина (SEQ ID NO: 27) и иммуноглобулин Fc.
Пример 6. Эффекты конъюгата аналога оксинтомодулина длительного действия на снижение массы тела и уровня глюкозы в крови мышей с ожирением, индуцированным рационом с высоким содержанием жира (HF DIO).
Пример 6-1. Экспериментальный метод.
6-недельных мышей (C57BL/6, 120-130 г) приобретали у фирмы OrientBIO (Korea). Приобретенные мыши C57BL/6 являются животными, часто используемыми при исследованиях по ожирению и диабету, поскольку ожирение у них можно относительно легко индуцировать посредством рациона с высоким содержанием жира. Мыши HF DIO являются грызунами, часто используемыми в исследованиях диабета, и у них естественным путем проявляется ожирение и диабетические состояния, подобные таким состояниям у людей, в результате внесения в организм корма с высоким содержанием жира без генетических манипуляций, в отличие от мышей db/db с диабетом, индуцированным мутацией в рецепторе лептина. По этой причине в настоящем изобретении данных животных использовали для изучения эффектов композиции по настоящему изобретению на снижение массы тела и уровней глюкозы в крови при диажирении.
Животным давали свободный доступ к корму с высоким содержанием жира (60% ккал за счет жира, D12492; Research Diets Inc.), стерилизованному облучением УФ светом. Животным также давали свободный доступ к фильтрованной и стерилизованной УФ облучением водопроводной воде, используя поилки с водой. Животных держали в виварии, удовлетворяющем стандартам GLP (надлежащая лабораторная практика), при цикле 12 ч свет/12 ч темнота (освещение: с 6.00 до 18.00), и все экспериментальные методы выполняли в соответствии со стандартным руководством по экспериментам на животных. Введение лекарственного средства начинали после 26 недель индуцирования ожирения, и животных делили на пять групп (n равно 6), как показано в табл. 3 ниже.
Таблица 3
Группы Вводимые лекарственные средства Способы введения
HFD10- индуцирован- ная группа Носитель (PBS) S.C. (подкож- но) Один раз в неделю
HFD10индуцированные группы с введением лекарственного средства Виктоза® 100 нмоль/кг S.C. Один раз в сутки
SEQ ГО NO: 25-Fc конъюгат 1 нмоль/кг S.C. Один раз в неделю
SEQ ГО NO: 25-Fc конъюгат 3 нмоль/кг
SEQ ГО NO: 25-Fc конъюгат 5 нмоль/кг
В частности, группу 1 (HF DIO-индуцированная группа, контрольная группа) кормили кормом с высоким содержанием жира, и вводили подкожно 5 мл/кг (объем инъекции) забуференного фосфатом физиологического раствора, модифицированного по Дульбекко (DPBS, Sigma) один или более чем один раз в неделю. Для теста на толерантность к глюкозе в крови группе 1 вводили подкожно забуференный фосфатом физиологический раствор, модифицированный по Дульбекко (DPBS, Sigma) за 24 ч до теста и подвергали ее голоданию в течение 16 ч. Кровь собирали из хвостовой части, чтобы измерить уровень глюкозы натощак, и измеряли уровни глюкозы через 15, 30, 60, 90 и 120 мин после внутрибрюшинного введения 1 г/кг глюкозы.
Группу 2 (HF DIO-индуцированная группа с введением 100 нмоль/кг Виктозы®) кормили рационом с высоким содержанием жира для индуцирования ожирения и гипергликемии, а затем вводили один раз в сутки подкожно 5 мл/кг (объем инъекции) имеющегося в продаже препарата Виктоза® (GSK). Для теста на толерантность к глюкозе в крови группу 2 подвергали голоданию в течение 16 ч перед тестом и вводили подкожно 100 нмоль/кг Виктоза® за 4 ч до теста. Кровь собирали из хвостовой части, чтобы измерить уровень глюкозы натощак, и измеряли уровни глюкозы в крови через 15, 30, 60, 90 и 120 мин после внутрибрюшинного введения 1 г/кг глюкозы.
Группу 3 (HF DIO-индуцированная группа с введением 1 нмоль/кг конъюгата SEQ ID NO: 25-Fc) кормили рационом с высоким содержанием жира для индуцирования ожирения и гипергликемии, а затем вводили подкожно один раз в неделю 1 нмоль/кг (объем инъекции 5 мл/кг) конъюгата SEQ ID NO: 25-Fc,
- 16 031928 полученного в примере 4. Для теста на толерантность к глюкозе в крови группу 3 подвергали голоданию в течение 24 ч перед тестом и вводили подкожно 1 нмоль/кг конъюгата SEQ ID NO: 25-Fc за 24 ч до теста и подвергали голоданию в течение 16 часов. Кровь собирали из хвостовой части, чтобы измерить уровень глюкозы натощак, и измеряли уровни глюкозы в крови через 15, 30, 60, 90 и 120 мин после внутрибрюшинного введения 1 г/кг глюкозы.
Группу 4 (HF DЮ-индуцированная группа с введением 3 нмоль/кг конъюгата SEQ ID NO: 25-Fc) кормили рационом с высоким содержанием жира для индуцирования ожирения и гипергликемии, а затем вводили подкожно один раз в неделю 3 нмоль/кг (объем инъекции 5 мл/кг) конъюгата SEQ ID NO: 25-Fc, полученного в примере 4. Для теста на толерантность к глюкозе в крови группу 3 подвергали голоданию в течение 24 ч перед тестом и вводили подкожно 3 нмоль/кг конъюгата SEQ ID NO: 25-Fc за 24 ч до теста и подвергали голоданию в течение 16 ч. Кровь собирали из хвостовой части, чтобы измерить уровень глюкозы натощак, и измеряли уровни глюкозы в крови через 15, 30, 60, 90 и 120 мин после внутрибрюшинного введения 1 г/кг глюкозы.
Группу 5 (HF DЮ-индуцированная группа с введением 5 нмоль/кг конъюгата SEQ ID NO: 25-Fc) кормили рационом с высоким содержанием жира для индуцирования ожирения и гипергликемии, а затем вводили подкожно один раз в неделю 5 нмоль/кг (объем инъекции 5 мл/кг) конъюгата SEQ ID NO: 25-Fc, полученного в примере 4. Для теста на толерантность к глюкозе в крови группу 5 подвергали голоданию в течение 24 ч перед тестом и вводили подкожно 5 нмоль/кг конъюгата SEQ ID NO: 25-Fc за 24 ч до теста и подвергали голоданию в течение 16 ч. Кровь собирали из хвостовой части, чтобы измерить уровень глюкозы натощак, и измеряли уровни глюкозы в крови через 15, 30, 60, 90 и 120 мин после внутрибрюшинного введения 1 г/кг глюкозы.
Для всех групп (n равно 6) физиологический раствор или каждое лекарственное средство вводили в течение 2 недель, а затем анализировали его эффекты на снижение массы тела и уровня глюкозы в крови.
Пример 6-2. Эффекты конъюгата аналога оксинтомодулина длительного действия на снижение массы тела и уровня глюкозы в крови мышей с ожирением, индуцированным рационом с высоким содержанием жира (HF DIO), которые являются стабильными моделями ожирения.
Для исследования эффекта конъюгата аналога оксинтомодулина длительного действия по настоящему изобретению на снижение уровня глюкозы в крови мышей с ожирением, индуцированным рационом с высоким содержанием жира (в течение 26 недель) (HF DIO), которые являются стабильными моделями ожирения, мышам DIO, классифицированным в Примере 6-1, вводили подкожно конъюгат аналога оксинтомодулина длительного действия один раз в неделю в течение 2 недель. Массу тела и потребление пищи измеряли ежедневно, и кровь собирали из хвостовой части мышей DIO в сутки 0, 3, 7, 10 и 14, и изменение уровней глюкозы в крови анализировали, используя HITACHI 7020. Изменения массы тела и уровня глюкозы в крови показаны на фиг. 1 и 2.
На фиг. 1 показано изменение массы тела, а на фиг. 2 показана AUC (площадь под кривой) глюкозы в крови. Полученные результаты статистически обрабатывали и вычисляли средние значения и стандартные отклонения средних значений.
При проверке достоверности между группами (n равно 6) данные статистически обрабатывали, используя критерий Даннета однофакторного дисперсионного анализа ANOVA, и значение p менее 0,05 считали статистически значимым.
В частности, результаты измерения изменения массы тела показали, что масса тела мышей с ожирением, индуцированным рационом с высоким содержанием жира в течение 26 недель, не снижалась, тогда как при введении мышам с ожирением конъюгата аналога оксинтомодулина длительного действия (конъюгата SEQ ID NO: 25-Fc) их масса тела снижалась дозозависимо (фиг. 1).
Результаты измерения уровня глюкозы в крови показали, что уровень глюкозы в крови мышей с ожирением дозозависимо снижался при введении этим мышам конъюгата аналога оксинтомодулина длительного действия (конъюгата SEQ ID NO: 25-Fc). В частности, при введении мышам с ожирением 5 нмоль/кг конъюгата аналога оксинтомодулина длительного действия (конъюгата SEQ ID NO: 25-Fc) их уровень глюкозы в крови значимо снижался по сравнению с уровнем мышей DIO с ожирением, индуцированным рационом с высоким содержанием, и эффект снижения уровня глюкозы в крови под действием 5 нмоль/кг аналога оксинтомодулина длительного действия (конъюгат SEQ ID NO: 25-Fc) был равным или лучшим по сравнению с имеющимся в продаже лекарственным средством Виктоза® для лечения диабета (фиг. 2).
На основании результатов примера 6-2 было обнаружено, что конъюгат аналога оксинтомодулина длительного действия по настоящему изобретению, содержащий аналог оксинтомодулина, ковалентно связанный с участком Fc иммуноглобулина посредством ПЭГ, снижал массу тела и уровень глюкозы в крови мышей с ожирением, индуцированным рационом с высоким содержанием жира (HF DIO), что позволяет предположить возможность его эффективного применения для лечения диабета, диажирения или родственных заболеваний.
Пример 7. Эффекты конъюгата аналога оксинтомодулина длительного действия на снижение массы тела и уровня глюкозы в крови мышей db/db с диабетом, индуцированным мутацией в рецепторе лептина.
- 17 031928
Пример 7-1. Экспериментальный метод.
7-недельных самцов мышей BKS.Cg -+ Leprdb/+Leprdb/OlaHsd (25 плюс/минус 3 г, Harlan U.S.A) приобретали у фирмы Doo Yeol Biotech (Korea). Мышей BKS.Cg -+Leprdb/+Leprdb/OlaHsd (далее обозначенных как мыши db/db) являются грызунами, чаще всего используемыми в исследованиях диабета вместе с мышами ob/ob, и у них естественным путем проявляется ожирение и диабетические состояния, подобные таким состояниям у людей посредством мутации в рецепторе лептина. По этой причине в настоящем изобретении этих животных использовали для изучения эффекта, снижающего уровень глюкозы в крови, агента по настоящему изобретению при разработке агента для лечения диабета.
Приобретенных животных акклиматизировали и адаптировали к условиям эксперимента в течение 1 недели, а затем случайно группировали в соответствии с их уровнями глюкозы.
Животным давали свободный доступ к твердому корму (Picolab Rodent diet 5053), стерилизованному облучением УФ светом. Животным также давали свободный доступ к фильтрованной и стерилизованной УФ облучением водопроводной воде, используя поилки с водой. Животных держали в виварии, удовлетворяющем стандартам GLP, при цикле 12 ч свет/12 ч темнота (освещение: с 6.00 до 18.00), и все экспериментальные методы выполняли в соответствии со стандартным руководством по экспериментам на животных. Животных делили на четыре группы (n равно 7) и вводили лекарственные средства, как показано в табл. 4 ниже.
Таблица 4
Группы Вводимые лекарственные средства Способы введения
Контрольная группа Носитель (PBS) S.C. Один раз в неделю х 4
Группы с введением лекарственных средств Виктоза® 60 нмоль/кг S.C. Один раз в сутки х 28
Виктоза® 100 нмоль/кг
Конъюгат SEQ Ш NO: 23-Fc 15 нмоль/кг S.C. Один раз в неделю х 4
Конъюгат SEQ Ш NO: 25-Fc 6 нмоль/кг
В частности, группе 1 (носитель), представляющей собой контрольную группу, вводили подкожно 5 мл/кг забуференного фосфатом физиологического раствора, модифицированного по Дульбекко (DPBS, Sigma) один раз в неделю.
Группе 2 (группе с введением лекарственного средства 60 нмоль/кг Виктоза®) вводили подкожно один раз в сутки 60 нмоль/кг (доза для диабета; объем инъекции 5 мл/кг) имеющегося в продаже Виктоза® (GSK).
Группе 3 (группе с введением лекарственного средства 100 нмоль/кг Виктоза®) вводили подкожно один раз в сутки 100 нмоль/кг (доза для ожирения; объем инъекции 5 мл/кг) имеющегося в продаже Виктоза® (GSK).
Группе 4 (15 нмоль/кг конъюгата SEQ ID NO: 23-Fc), представляющей собой группу с введением лекарственного средства, вводили подкожно один раз в неделю 15 нмоль/кг (объем инъекции 5 мл/кг) конъюгата SEQ ID NO: 23-Fc, полученного в примере 4.
Группе 5 (6 нмоль/кг конъюгата SEQ ID NO: 25-Fc), представляющей собой группу с введением лекарственного средства, вводили подкожно один раз в неделю 6 нмоль/кг (объем инъекции 5 мл/кг) конъюгата SEQ ID NO: 25-Fc, полученного в примере 4.
Для всех групп (n равно 7) физиологический раствор или каждое лекарственное средство вводили в течение 4 недель, а затем анализировали его эффекты на снижение массы тела и уровня глюкозы в крови.
Пример 7-2. Анализ действий конъюгата аналога оксинтомодулина длительного действия на снижение массы тела и уровня глюкозы в крови мышей db/db с диабетом, индуцированным мутацией в рецепторе лептина.
Для изучения эффекта конъюгата аналога оксинтомодулина длительного действия по настоящему изобретению на снижение уровня глюкозы в крови мышей db/db с диабетом, индуцированным мутацией в рецепторе лептина, мышам db/db, классифицированным в примере 7-1, вводили подкожно конъюгат аналога оксинтомодулина длительного действия один раз в неделю в течение 4 недель. Изменение массы тела мышей измеряли два раза в неделю, и кровь собирали из хвостовой части мышей db/db (каждые сутки в недели 1 и 4, и два раза в неделю в недели 2 и 3), и изменение уровня глюкозы в крови анализировали, используя набор HITACHI 7020.
На фиг. 3 показано изменение массы тела, и на фиг. 4 показана AUC (площадь под кривой) глюкозы в крови. Полученные результаты статистически обрабатывали и вычисляли средние значения и стандартные отклонения средних значений. При проверке достоверности между группами (n равно 6) данные статистически обрабатывали, используя критерий Даннета однофакторного дисперсионного анализа
- 18 031928
ANOVA, и значение p менее 0,05 считали статистически достоверным.
В частности, результаты измерения изменений массы тела продемонстрировали, что масса тела мышей db/db контрольной группы непрерывно возрастала со дня начала введения, тогда как приведении мышам конъюгата аналога оксинтомодулина длительного действия (конъюгата SEQ ID NO: 23-Fc или конъюгата SEQ ID NO: 25-Fc) масса тела по существу не изменялась по сравнению с массой тела, измеренной в сутки начала эксперимента, что позволяет предположить, что конъюгат проявляет значимый эффект ингибирования возрастания массы тела (фиг. 3).
Результаты измерений уровня глюкозы в крови показали, что при введении мышам конъюгата аналога оксинтомодулина длительного действия (конъюгата SEQ ID NO: 23-Fc или конъюгата SEQ ID NO: 25-Fc) уровень глюкозы в крови значимо снижался по сравнению с контрольной группой. В частности, введение 6 нмоль/кг конъюгата аналога оксинтомодулина длительного действия (конъюгата SEQ ID NO: 25-Fc) показало эффект снижения глюкозы в крови по сравнению с имеющимся в продаже лекарственным средством Виктоза® для лечения диабета (фиг. 4).
На основании результатов примера 7 было обнаружено, что конъюгат аналога оксинтомодулина длительного действия по настоящему изобретению, содержащий аналог оксинтомодулина, ковалентно связанный с участком Fc иммуноглобулина посредством ПЭГ, достоверно снижал уровень глюкозы в крови (индекс диабета) у мышей db/db с диабетом, индуцированным мутацией в рецепторе лептина, по сравнению с носителем и с Виктоза®, применяемым в качестве лекарственного средства для лечения диабета, что позволяет предположить, что конъюгат аналога оксинтомодулина длительного действия по настоящему изобретению можно с высокой эффективностью применять для лечения диабета. Кроме того, конъюгат аналога оксинтомодулина длительного действия по настоящему изобретению продемонстрировал значимый эффект ингибирования увеличения массы тела, что позволяет предположить, что он может уменьшить сердечнососудистые осложнения диабета.
На основании результатов примеров 6 и 7 видно, что конъюгат аналога оксинтомодулина длительного действия по настоящему изобретению продемонстрировал превосходный эффект снижения глюкозы в крови, равный или лучший по сравнению с Виктоза®, обладающим, как известно, эффектом снижения глюкозы, а также превосходным эффектом снижения массы тела, что позволяет предположить, что конъюгат аналога оксинтомодулина длительного действия по настоящему изобретению можно эффективно применять в качестве агента для лечения диабета, диажирения и осложнений диабета благодаря его эффекту снижения уровня глюкозы в крови.
Обычному специалисту в данной области техники понятно, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без отклонения от его сущности или существенных характеристик. Описанные воплощения следует рассматривать во всех отношениях только как иллюстративные и неограничивающие. Объем настоящего изобретения, таким образом, показан прилагаемой формулой изобретения, а не приведенным выше описанием. Все изменения, произведенные в пределах значения и серии эквивалентов формулы изобретения, следует включать в объем настоящего изобретения.
СКОРРЕКТИРОВАННЫЙ ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> ХАНМИ ФАРМ. КО., ЛТД.
<120> КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДИАБЕТА ИЛИ ДИАЖИРЕНИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ
АНАЛОГ ОКСИНТОМОДУЛИНА <130> 106132.000115 <140> 201590759 <141> 2013-11-06 <150> PCT/KR2013/009990 <151> 2013-11-06 <150> KR 10-2012-0124724 <151> 2012-11-06 <160> 59 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 37
- 19 031928 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(37) <223> Оксинтомодулин <400> 1
His Ser Gln Gly
Thr Phe Thr Ser
Asp Tyr Ser Lys
Tyr Leu Asp Ser
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn
25 30
Arg Asn Asn Ile Ala <210> 2 <211> 37 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 4-Имидазоацетил <400> 2
His Ser Gln Gly
Thr Phe Thr Ser
Asp Tyr Ser Lys
Tyr Leu Asp Glu
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn
25 30
Arg Asn Asn Ile Ala <210> 3 <211> 39 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES
- 20 031928
Tyr Leu Asp Glu <223> 4-Имидазоацетил <400> 3
His Ser Gln Gly
Thr Phe Thr Ser
Asp Tyr Ser Lys
Arg Arg Ala Gln Asp
Phe Val Ala Trp Leu Lys Asn Thr Gly Pro Ser
30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser <210> 4 <211> 39 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 4-Имидазоацетил <400> 4
His Gly Gln Gly
Thr Phe Thr Ser
Asp Tyr Ser Arg
Tyr Leu Glu Glu
Glu Ala Val Arg Leu Phe
Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser <210> 5 <211> 39 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 4-Имидазоацетил <400> 5
His Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Gln Met Glu Glu 1 5 10 15
- 21 031928
Glu Ala Val
Arg Leu
Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser <210> 6 <211> 42 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 4-Имидазоацетил <400> 6
His Gly Glu Gly
Thr Phe Thr Ser
Asp Leu Ser Arg
Gln Met Glu Glu
Glu
Ala
Val
Arg
Leu
Phe
Ile
Glu
Trp
Ala Ala His Ser Gln
Gly Thr
Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys
Tyr Leu Asp <210> 7 <211> 30 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 4-Имидазоацетил <400> 7
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu
5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys
25 30
- 22 031928 <210> 8 <211> 29 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 4-Имидазоацетил <400> 8
His Ser Gln Gly
Thr Phe Thr Ser
Asp Leu Ser Arg
Gln Leu Glu Glu
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Lys
25 <210> 9 <211> 37 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 4-имидазоацетил <220>
<221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Альфа-метил-глутаминовая кислота <400> 9
His Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp
5
Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu
15
Glu Ala Val Glu Leu Phe Ile Glu Trp
Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn 30
Arg Asn Asn Ile Ala <210> 10 <211> 40 <212> ПРТ
- 23 031928 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 4-Имидазоацетил <400> 10
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Gln Met Glu Glu
5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe
Ile Glu Trp Leu Met Asn Gly Gly Pro Ser
30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys <210> 11 <211> 43 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 4-имидазоацетил <400>
Gly
His
Glu
Gly
Thr
Phe
Thr
Ser
Asp
Leu
Ser Arg
Gln Met
Glu Glu
Glu
Ala
Val
Arg
Leu
Phe
Ile
Glu
Trp
Ala
Ala His
Ser Gln
Gly Thr
Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Lys
40 <210> 12 <211> 38 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
- 24 031928 полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 4-Имидазоацетил <400> 12
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Gly
5 10 15
Gly Gly His
Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met
25 30
Glu Glu Glu Ala Val Lys <210> 13 <211> 30 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 4-имидазоацетил <220>
<221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Альфа-метил-глутаминовая кислота <220>
<221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Альфа-метил-глутаминовая кислота <400> 13
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu
5 10 15
Glu Ala Val Glu Leu Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys
25 30 <210> 14 <211> 37 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
- 25 031928 <223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 4-Имидазоацетил <220>
<221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Альфа-метил-глутаминовая кислота <220>
<221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Альфа-метил-глутаминовая кислота <400> 14
His Gly Gln Gly
Thr Phe Thr Ser
Asp Tyr Ser Arg
Tyr Leu Asp Glu
Glu Ala Val Glu Leu Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn
25 30
Arg Asn Asn Ile Ala <210> 15 <211> 37 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 4-имидазоацетил <220>
<221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Альфа-метил-глутаминовая кислота <400> 15
His Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp
5
Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu
15
Glu
Ala
Val
Arg
Leu Phe Ile Glu Trp
Leu Met Asn Thr Lys
Arg Asn
Arg Asn Asn Ile Ala
- 26 031928 <210> 16 <211> 34 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 4-имидазоацетил <400> 16
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Leu Glu Gly
5 10 15
Gly Gly His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Leu
25 30
Glu Lys <210> 17 <211> 37 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 4-имидазоацетил <400> 17
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp
5
Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu
15
Glu
Ala
Val
Arg
Leu Phe Ile Glu Trp
Ile Arg Asn Thr Lys
Arg Asn
Arg Asn Asn Ile Ala <210> 18 <211> 40 <212> ПРТ
- 27 031928 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 4-имидазоацетил <400> 18
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu
5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe
Ile Glu Trp Ile Arg Asn Gly Gly Pro Ser
30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys <210> 19 <211> 37 <212> ПРТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 4-имидазоацетил <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> Образование кольца между остатками
<400> 19
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Ile Arg Asn Thr Lys Arg Asn
25 30
Arg Asn Asn Ile Ala <210> 20 <211> 40 <212> ПРТ <213> искусственная последовательность
- 28 031928 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 4-имидазоацетил <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> Образование кольца между остатками
<400> 20
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe
Ile Glu Trp Ile Arg Asn Gly Gly Pro Ser
30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys <210> 21 <211> 37 <212> ПРТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 4-имидазоацетил <400> 21
His Ser Gln Gly
Thr Phe Thr Ser
Asp Tyr Ser Arg
Gln Leu Glu Glu
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Val Arg Asn Thr Lys Arg Asn
25 30
Arg Asn Asn Ile Ala <210> 22 <211> 30 <212> ПРТ <213> искусственная последовательность <220>
- 29 031928 <223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Дезамино-гистидил <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> Образование кольца между остатками <400> 22
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys
25 30 <210> 23 <211> 29 <212> ПРТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 23
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Cys Trp Leu Met Asn Thr
25 <210> 24 <211> 30 <212> ПРТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 24
- 30 031928
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys
25 30 <210> 25 <211> 30 <212> ПРТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> Образование кольца между остатками <400> 25
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys
25 30 <210> 26 <211> 30 <212> ПРТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <220>
<221> MOD_RES <222> (12)..(16) <223> Образование кольца между остатками <400> 26
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys
- 31 031928 <210> 27 <211> 29 <212> ПРТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> Образование кольца между остатками <400> 27
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Met Asn Thr
25 <210> 28 <211> 29 <212> ПРТ <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 28
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
25 <210> 29 <211> 37 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
- 32 031928 полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> D-Ser <400> 29
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn
25 30
Arg Asn Asn Ile Ala <210> 30 <211> 37 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 4-Имидазоацетил <400> 30
His Ser Gln Gly
Thr Phe Thr Ser
Asp Tyr Ser Lys
Tyr Leu Asp Ser
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn
25 30
Arg Asn Asn Ile Ala <210> 31 <211> 37 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 4-Имидазоацетил
- 33 031928 <220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> D-Ser <400> 31
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn
25 30
Arg Asn Asn Ile Ala <210> 32 <211> 30 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 4-Имидазоацетил <220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> Образование кольца между остатками <400> 32
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys
25 30 <210> 33 <211> 30 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина
- 34 031928 <220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> Образование кольца между остатками <400> 33
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Glu
5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys
25 30 <210> 34 <211> 30 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт производного оксинтомодулина <220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> Образование кольца между остатками <400> 34
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
5 10 15
Lys Arg Ala Lys
Glu
Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys
30 <210> 35 <211> 8 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт группы R2 <400> 35
Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala
5 <210> 36
- 35 031928 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт группы R2 <400> 36
Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
5 10 <210> 37 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт группы R2 <400> 37
Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys
5 10 <210> 38 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт группы R2 <400> 38
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp
5 10 15 <210> 39 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт группы R2 <400> 39
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Lys
5 10 15 <210> 40 <211> 20 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт группы R2
- 36 031928 <400> 40
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys
5 10
Glu Ala Val Lys <210> 41 <211> 28 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности полипептидный конструкт группы A или B
Gln Met Glu Glu синтетический <400> 41
Ser Gln Gly Thr
Phe Thr Ser Asp
Tyr Ser Lys Tyr
Leu Asp Ser Arg
Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
25 <210> 42 <211> 28 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности полипептидный конструкт группы A или B синтетический <400>
Ser Gln Gly
Thr
Phe
Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr 10
Leu Asp Glu Glu
Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr
25 <210> 43 <211> 28 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности полипептидный конструкт группы A или B синтетический <400>
Ser Gln Gly
Thr
Phe
Thr Ser Asp Tyr
Ser Lys Tyr
Leu Asp Glu Arg
Arg Ala Gln
Asp
Phe
Val Ala Trp Leu
Lys Asn Thr
- 37 031928 <210> 44 <211> 28 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт группы A или B <400>
Gly Gln Gly
Thr
Phe
Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Glu Glu Glu 10 15
Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly
25 <210> 45 <211> 28 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт группы A или B <400> 45
Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Gln Met Glu Glu Glu
5 10 15
Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly
25 <210> 46 <211> 26 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт группы A или B <400> 46
Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Met Glu Glu Glu
5 10 15
Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Ala Ala
25 <210> 47 <211> 28 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт группы A или B
- 38 031928 <400> 47
Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Gln Met Glu Glu Glu
5 10 15
Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Gly
25 <210> 48 <211> 24 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт группы B <400>
Gly Glu Gly
Thr
Phe
Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Met Glu Glu Glu 10 15
Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp <210> 49 <211> 14 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептидный конструкт группы B <400> 49
Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp
5 10 <210> 50 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 50 cccggccccc gcggccgcta ttcgaaatac 30 <210> 51 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер
- 39 031928 <400> 51 gaacggtccg gaggacgtcg actcttaaga tag <210> 52 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 52 cagcgacacc gaccgtcccc ccgtacttaa ggcc 34 <210> 53 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 53 ctaaccgact ctcggggaag actgagctcg cc 32 <210> 54 <211> 60 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Гистидин, дезамино-гистидил, диметил-гистидил (N-диметилгистидил), бета-гидроксиимидазопропионил, 4-имимдазоацетил, бета-карбоксиимидазопропионил или тирозин <220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib (аминоизомасляная кислота), d-аланин, глицин,
Sar (N-метилглицин), серин или d-серин <220>
<221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Глутаминовая кислота или глутамин <220>
<221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Лейцин или тирозин
- 40 031928 <220>
<221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Серин или аланин <220>
<221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Лизин или аргинин <220>
<221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Глутамин или тирозин <220>
<221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Лейцин или метионин <220>
<221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота <220>
<221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Глутаминовая кислота, серин, альфа-метил-глутаминовая кислота или не присутствует <220>
<221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Глутамин, глутаминовая кислота, лизин, аргинин, серин или не присутствует
<220> <221> <222> <223> MOD_RES (18)..(18) Аланин, аргинин, валин или не присутствует
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> Аланин, аргинин, серин, валин или не присутствует
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
Лизин, глутамин, аргинин, альфа-метил-глутаминовая кислота или не присутствует <220>
<221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, лейцин или не присутствует <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Может присутствовать или не присутствовать
- 41 031928 <220>
<221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Изолейцин, валин или не присутствует <220>
<221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Аланин, цистеин, глутаминовая кислота, лизин, глутамин, альфа-метил-глутаминовая кислота или не присутствует <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Может присутствовать или не присутствовать <220>
<221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Аланин, изолейцин, лейцин, серин, валин или не присутствует <220>
<221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Аланин, лизин, метионин, глутамин, аргинин или не присутствует <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Может присутствовать или не присутствовать <220>
<221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Аланин, глицин, треонин или не присутствует <220>
<221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Цистеин, лизин или не присутствует <220>
<221> MOD_RES <222> (31)..(40) <223> Аланин, глицин, серин или не присутствует <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (31)..(40) <223> Эта область может охватывать от 2 до 10 аминокислот, где некоторые положения могут отсутствовать <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (41)..(60) <223> Эта область может охватывать от 8 до 20 аминокислот, включая KRNRNNIA, или GPSSGAPPPS, или GPSSGAPPPSK, или
HSQGTFTSDYSKYLD, или HSQGTFTSDYSRYLDK, или HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK, где некоторые или все положения могут отсутствовать
- 42 031928 <220>
<223> См. описание, как оно подано, в отношении подробного раскрытия замен и предпочтительных воплощений <400> 54
Xaa 1 Xaa Xaa Gly Thr 5 Phe Thr Ser Asp Xaa 10 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 Xaa
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
<210> 55 <211> 40 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Гистидин, дезамино-гистидил, диметил-гистидил (N-диметилгистидил), бета-гидроксиимидазопропионил, 4-имидазоацетил, бета-карбокси-имидазопропионил или тирозин <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (2)..(29) <223> Эта область может охватывать от 26 до 28 аминокислот, включая SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT, или SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT, или SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT, или
GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG, или GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG, <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (2)..(29) <223> Продолжение вышеприведенного,· или GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA, или SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG, где некоторые положения могут отсутствовать <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (30)..(40) <223> Эта область может охватывать от 8 до 11 аминокислот, включая KRNRNNIA, или GPSSGAPPPS, или GPSSGAPPPSK, где некоторые положения могут отсутствовать <220>
<223> См. описание, как оно подано, в отношении подробного раскрытия
- 43 031928 замен и предпочтительных воплощений <400> 55
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
Xaa Xaa
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa <210> 56 <211> 59 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Дезамино-гистидил, диметил-гистидил (N-диметилгистидил), бета-гидроксиимидазопропионил, 4-имимдазоацетил, бета-карбоксиимидазопропионил или тирозин <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (2)..(29) <223> Эта область может охватывать от 14 до 28 аминокислот, включая SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT, или SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT, или SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT, или
GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG, или GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG, <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (2)..(29) <223> Продолжение вышеприведенного,· или GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA, или SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG, или GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEW, или SQGTFTSDYSRYLD, где некоторые положения могут отсутствовать <220>
<221> MOD_RES <222> (30)..(39) <223> Аланин, глицин, серин или не присутствует <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (30)..(39) <223> Эта область может охватывать от 2 до 10 аминокилот, где некоторые положения могут отсутствовать <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (40)..(59) <223> Эта область может охватывать от 15 до 20 аминокислот, включая
HSQGTFTSDYSKYLD, или HSQGTFTSDYSRYLDK, или
- 44 031928
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK, где некоторые положения могут отсутствовать <220>
<223> См. описание, как оно подано, в отношении подробного раскрытия замен и предпочтительных воплощений <400> 56
Xaa 1 Xaa Xaa Xaa Xaa 5 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 10 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 Xaa
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55
<210> 57 <211> 40 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Гистидин, дезамино-гистидил, диметил-гистидил (N-диметилгистидил), бета-гидроксиимидазопропионил, 4-имимдазоацетил, бета-карбоксиимидазопропионил или тирозин <220>
<221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Серин, глутаминовая кислота или аргинин <220>
<221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Аргинин, глутаминовая кислота или серин <220>
<221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Аргинин, аланин или валин <220>
<221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Аргинин, валин или серин <220>
<221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Глутамин, аргинин или лизин
- 45 031928 <220>
<221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Изолейцин, валин or серин <220>
<221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Метионин, аргинин или глутамин <220>
<221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Треонин, глицин или аланин <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (30)..(40) <223> Эта область может охватывать от 8 до 11 аминокислот, включая KRNRNNIA, или GPSSGAPPPS, или GPSSGAPPPSK, где некоторые положения могту отсутствовать <220>
<223> См. описание, как оно подано, в отношении подробного раскрытия замен и предпочтительных воплощений <400> 57
Xaa 1 Ser Gln Gly Thr 5 Phe Thr Ser Asp Tyr 10 Ser Lys Tyr Leu Asp 15 Xaa
Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Phe Val Gln Trp Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa <210> 58 <211> 41 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Гистидин, дезамино-гистидил, диметил-гистидил (N-диметилгистидил), бета-гидроксиимидазопропионил, 4-имимдазоацетил, бета-карбоксиимидазопропионил или тирозин <220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Серин, Aib, саркозин, d-аланин или d-серин <220>
- 46 031928 <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Серин или глутаминовая кислота <220>
<221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Аргинин или лизин <220>
<221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Глутамин или лизин <220>
<221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота <220>
<221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Глутамин, цистеин или лизин <220>
<221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Цистеин, лизин или не присутствует <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (31)..(41) <223> Эта область может охватывать от 8 до 11 аминокислот, включая KRNRNNIA, или GPSSGAPPPS, или GPSSGAPPPSK, где некоторые или все положения могту отсутствовать <220>
<223> См. описание, как оно подано, в отношении подробного раскрытия замен и предпочтительных воплощений <400> 58
Xaa 1 Xaa Gln Gly Thr 5 Phe Thr Ser Asp Tyr 10 Ser Lys Tyr Leu Asp 15 Xaa
Xaa Arg Ala Xaa Xaa Phe Val Xaa Trp Leu Met Asn Thr Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
Xaa Xaa <210> 59 <211> 60 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
- 47 031928 <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Гистидин, дезамино-гистидил, 4-имидазоацетил или тирозин <220>
<221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib (аминоизомасляная кислота), глицин или серин <220>
<221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Глутаминовая кислота или глутамин <220>
<221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Лейцин или тирозин <220>
<221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> серин или аланин <220>
<221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Лизин или аргинин <220>
<221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Глутамин или тирозин <220>
<221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Лейцин или метионин <220>
<221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота <220>
<221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Глутаминовая кислота, альфа-метил-глутаминовая кислота или не присутствует <220>
<221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Глутамин, глутаминовая кислота, лизин, аргинин или не присутствует <220>
<221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Аланин, аргинин или не присутствует <220>
<221> MOD_RES
- 48 031928 <222> (19)..(19) <223> Аланин, валин или не присутствует <220>
<221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Лизин, глутамин, аргинин, альфа-метил-глутаминовая кислота или не присутствует <220>
<221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, лейцин или не присутствует <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Может присутствовать или не присутствовать <220>
<221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Изолейцин, валин или не присутствует <220>
<221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Аланин, цистеин, глутаминовая кислота, глутамин, альфа-метил-глутаминовая кислота или не присутствует <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Может присутствовать или не присутствовать <220>
<221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Аланин, изолейцин, лейцин, валин или не присутствует <220>
<221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Аланин, лизин, метионин, аргинин или не присутствует <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (28)..(29) <223> Может присутствовать или не присутствовать <220>
<221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Цистеин, лизин или не присутствует <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (31)..(40) <223> Эта область может охватывать от 2 до 10 остатков, где некоторые положения могут не присутствовать <220>
- 49 031928 <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(60) <223> Эта область может охватывать от 8 до 20 аминокислот, включая KRNRNNIA, или GPSSGAPPPS, или GPSSGAPPPSK, или
HSQGTFTSDYSKYLD, или HSQGTFTSDYSRYLDK, или HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK, где некоторые или все положения могут отсутствовать <220>
<223> См. описание, как оно подано, в отношении подробного раскрытия замен и предпочтительных воплощений <400> 59
Xaa 1 Xaa Xaa Gly Thr 5 Phe Thr Ser Asp Xaa 10 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 Xaa
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Asn Thr Xaa Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (22)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Композиция для предупреждения или лечения диабета, диажирения или осложнений диабета, содержащая конъюгат аналога оксинтомодулина в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель, где конъюгат аналога оксинтомодулина содержит аналог оксинтомодулина, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, 25 или 26;
    участок Fc иммуноглобулина и непептидильный полимер, представляющий собой биосовместимый полимер, обладающий устойчивостью к протеиназе in vivo и имеющий молекулярную массу в диапазоне от 1 до 20 кДа, где непептидильный полимер ковалентно связывает аналог оксинтомодулина и участок Fc иммуноглобулина.
  2. 2. Композиция по п.1, где аналог оксинтомодулина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.
  3. 3. Композиция по п.1, где аминокислоты в положениях 12 и 16 или 16 и 20 аналога оксинтомодулина образуют кольцо.
  4. 4. Композиция по п.3, где аналог оксинтомодулина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25.
  5. 5. Композиция по п.3, где аналог оксинтомодулина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
  6. 6. Композиция по любому из пп.1-5, где непептидильный полимер представляет собой полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль или сополимер этиленгликоля/пропиленгликоля или поливиниловый спирт.
  7. 7. Композиция по п.6, где непептидильный полимер представляет собой полиэтиленгликоль.
  8. 8. Композиция по любому из пп.1-7, где один конец непептидильного полимера связан с участком Fc иммуноглобулина, а другой конец непептидильного полимера связан с аминной группой или тиольной группой аналога оксинтомодулина.
  9. 9. Композиция по любому из пп.1-8, дополнительно содержащая фармацевтический агент, проявляющий превентивные или терапевтические эффекты против диабета, диажирения или осложнений диабета.
  10. 10. Композиция по любому из пп.1-9, где диабет представляет собой инсулинозависимый диабет типа 1 или инсулиннезависимый диабет типа 2.
    - 50 031928
  11. 11. Композиция по п.10, где диажирение является результатом ожирения.
  12. 12. Способ лечения диабета, диажирения или осложнений диабета, включающий введение субъекту фармацевтически эффективного количества конъюгата аналога оксинтомодулина, где конъюгат аналога оксинтомодулина содержит аналог оксинтомодулина, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, 25 или 26;
    участок Fc иммуноглобулина и непептидильный полимер, представляющий собой биосовместимый полимер, обладающий устойчивостью к протеиназе in vivo и имеющий молекулярную массу в диапазоне от 1 до 20 кДа, где непептидильный полимер ковалентно связывает аналог оксинтомодулина и участок Fc иммуноглобулина.
  13. 13. Способ по п.12, где аналог оксинтомодулина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.
  14. 14. Способ по п.12, где аминокислоты в положениях 12 и 16 или 16 и 20 аналога оксинтомодулина образуют кольцо.
  15. 15. Способ по п.14, где аналог оксинтомодулина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25.
  16. 16. Способ по п.14, где аналог оксинтомодулина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
  17. 17. Способ по любому из пп.12-16, где непептидильный полимер представляет собой полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль или сополимер этиленгликоля/пропиленгликоля или поливиниловый спирт.
  18. 18. Способ по п.17, где непептидильный полимер представляет собой полиэтиленгликоль.
  19. 19. Способ по любому из пп.12-18, где один конец непептидильного полимера связан с участком Fc иммуноглобулина, а другой конец непептидильного полимера связан с аминной группой или тиольной группой аналога оксинтомодулина.
  20. 20. Способ по любому из пп.12-19, дополнительно включающий введение фармацевтического агента, проявляющего превентивные или терапевтические эффекты против диабета, диажирения или осложнений диабета.
  21. 21. Способ по любому из пп.12-20, где диабет представляет собой инсулинозависимый диабет типа 1 или инсулиннезависимый диабет типа 2.
  22. 22. Способ по п.21, где диажирение является результатом ожирения.
EA201590759A 2012-11-06 2013-11-06 Композиция для лечения диабета или диажирения, содержащая конъюгат аналога оксинтомодулина EA031928B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120124724A KR101993393B1 (ko) 2012-11-06 2012-11-06 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 당뇨병 또는 비만성 당뇨병 치료용 조성물
PCT/KR2013/009990 WO2014073845A1 (en) 2012-11-06 2013-11-06 A composition for treating diabetes or diabesity comprising oxyntomodulin analog

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201590759A1 EA201590759A1 (ru) 2015-12-30
EA031928B1 true EA031928B1 (ru) 2019-03-29

Family

ID=50684885

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201892383A EA037956B1 (ru) 2012-11-06 2013-11-06 Композиция для лечения диабета или диажирения, содержащая конъюгат аналога оксинтомодулина
EA201590759A EA031928B1 (ru) 2012-11-06 2013-11-06 Композиция для лечения диабета или диажирения, содержащая конъюгат аналога оксинтомодулина

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201892383A EA037956B1 (ru) 2012-11-06 2013-11-06 Композиция для лечения диабета или диажирения, содержащая конъюгат аналога оксинтомодулина

Country Status (30)

Country Link
US (2) US20150299282A1 (ru)
EP (2) EP2916860B1 (ru)
JP (4) JP6363613B2 (ru)
KR (1) KR101993393B1 (ru)
CN (1) CN104918632B (ru)
AR (2) AR093386A1 (ru)
AU (3) AU2013342324B2 (ru)
BR (3) BR122021003984B1 (ru)
CA (1) CA2890329C (ru)
CL (1) CL2015001207A1 (ru)
DK (1) DK2916860T3 (ru)
EA (2) EA037956B1 (ru)
ES (1) ES2802099T3 (ru)
HK (1) HK1211856A1 (ru)
HR (1) HRP20200925T1 (ru)
HU (1) HUE049240T2 (ru)
IL (2) IL238631B (ru)
LT (1) LT2916860T (ru)
MX (1) MX360335B (ru)
MY (1) MY173828A (ru)
NZ (2) NZ708105A (ru)
PE (1) PE20151420A1 (ru)
PH (2) PH12018501424A1 (ru)
PL (1) PL2916860T3 (ru)
PT (1) PT2916860T (ru)
SG (3) SG10202110636WA (ru)
TW (4) TWI755341B (ru)
UA (1) UA117570C2 (ru)
WO (1) WO2014073845A1 (ru)
ZA (1) ZA201503999B (ru)

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3434687B1 (en) 2011-06-10 2021-03-10 Hanmi Science Co., Ltd. Novel oxyntomodulin derivatives and pharmaceutical composition for treating obesity comprising the same
CN109306015B (zh) 2011-06-17 2022-04-26 韩美科学株式会社 包括泌酸调节肽和免疫球蛋白片段的结合物以及其应用
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
KR101968344B1 (ko) 2012-07-25 2019-04-12 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 고지혈증 치료용 조성물
UA116217C2 (uk) 2012-10-09 2018-02-26 Санофі Пептидна сполука як подвійний агоніст рецепторів glp1-1 та глюкагону
KR101993393B1 (ko) 2012-11-06 2019-10-01 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 당뇨병 또는 비만성 당뇨병 치료용 조성물
CA2890324C (en) 2012-11-06 2021-02-23 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Liquid formulation of protein conjugate comprising the oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment
HUE035803T2 (en) 2012-12-21 2018-05-28 Sanofi Sa Dual GLP1 / GIP or trigonal GLP1 / GIP / glucagon agonists
EP3080149A1 (en) 2013-12-13 2016-10-19 Sanofi Dual glp-1/glucagon receptor agonists
WO2015086730A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Sanofi Non-acylated exendin-4 peptide analogues
TW201609795A (zh) 2013-12-13 2016-03-16 賽諾菲公司 作為雙重ｇｌｐ－１／ｇｉｐ受體促效劑的艾塞那肽－４（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）胜肽類似物
TW201609799A (zh) 2013-12-13 2016-03-16 賽諾菲公司 雙重ｇｌｐ－１／ｇｉｐ受體促效劑
ES2897935T3 (es) * 2014-03-31 2022-03-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Método para mejorar la solubilidad de proteína y péptido mediante el uso del enlace a un fragmento Fc de inmunoglobulina
TW201625668A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 作為胜肽性雙重ｇｌｐ－１／昇糖素受體激動劑之艾塞那肽－４衍生物
TW201625670A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自ｅｘｅｎｄｉｎ－４之雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑
TW201625669A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自艾塞那肽－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）之肽類雙重ＧＬＰ－１／升糖素受體促效劑
AR100695A1 (es) * 2014-05-30 2016-10-26 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Composición para el tratamiento de diabetes mellitus que comprende insulina y un agonista dual glp-1 / glucagón
US9932381B2 (en) 2014-06-18 2018-04-03 Sanofi Exendin-4 derivatives as selective glucagon receptor agonists
TWI772252B (zh) 2014-09-16 2022-08-01 南韓商韓美藥品股份有限公司 長效glp-1/高血糖素受體雙促效劑治療非酒精性脂肝疾病之用途
US11135271B2 (en) * 2014-12-30 2021-10-05 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Glucagon derivatives with improved stability
KR102418477B1 (ko) 2014-12-30 2022-07-08 한미약품 주식회사 글루카곤 유도체
AR105319A1 (es) 2015-06-05 2017-09-27 Sanofi Sa Profármacos que comprenden un conjugado agonista dual de glp-1 / glucagón conector ácido hialurónico
EP3322437B1 (en) 2015-06-30 2024-01-17 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Glucagon derivative and a composition comprising a long acting conjugate of the same
TW201706291A (zh) 2015-07-10 2017-02-16 賽諾菲公司 作為選擇性肽雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑之新毒蜥外泌肽（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）衍生物
US10800826B2 (en) 2015-10-05 2020-10-13 Merck Sharp & Dohme Corp. Antibody peptide conjugates that have agonist activity at both the glucagon and glucagon-like peptide 1 receptors
US11510993B2 (en) 2015-10-06 2022-11-29 Merck Sharp & Dohme Llc Antibody drug conjugate for anti-inflammatory applications
BR112018013525A2 (pt) 2015-12-31 2018-12-04 Hanmi Pharm. Co., Ltd. conjugado de longa atuação de agonista de receptor de glucagon/glp-1/gip triplo e composição farmacêutica
EP3407916B1 (en) 2016-01-29 2023-12-20 Merck Sharp & Dohme LLC Phosphonate linkers and their use to facilitate cellular retention of compounds
KR101887576B1 (ko) * 2016-04-15 2018-08-13 (주)케어젠 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 펩타이드 및 이의 용도
SG11201811697SA (en) * 2016-06-29 2019-01-30 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Glucagon derivative, conjugate thereof, composition comprising same and therapeutic use thereof
BR112019005637A2 (pt) 2016-09-23 2019-07-30 Hanmi Pharm Ind Co Ltd análogos da insulina com afinidade reduzida para o receptor de insulina e seu uso
CN108299554B (zh) * 2017-01-13 2021-05-25 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 胃泌酸调节素类似物
CA3054899A1 (en) 2017-03-23 2018-09-27 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analog complex with reduced affinity for insulin receptor and use thereof
CN106986924A (zh) * 2017-03-23 2017-07-28 中国药科大学 胃泌酸调节素（oxm）类似物及其应用
KR20190038456A (ko) * 2017-09-29 2019-04-08 한미약품 주식회사 효력이 향상된 지속성 단백질 결합체
WO2019171352A2 (en) * 2018-03-08 2019-09-12 Janssen Pharmaceutica Nv Methods of treating severe non-diabetic obesity
WO2020017916A1 (en) * 2018-07-19 2020-01-23 D&D Pharmatech Inc. Pharmaceutical composition comprising polypeptide
WO2020017919A1 (ko) * 2018-07-19 2020-01-23 한미정밀화학주식회사 생리활성 폴리펩타이드에 사용되는 신규한 중간체 및 이의 제조방법
KR20200135618A (ko) * 2019-05-23 2020-12-03 ㈜ 디앤디파마텍 폴리펩티드를 포함하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
US11929171B2 (en) 2018-10-18 2024-03-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for evaluation and treatment of glycemic dysregulation and atherosclerotic cardiovascular disease and applications thereof
US20200262887A1 (en) 2018-11-30 2020-08-20 Opko Ireland Global Holdings, Ltd. Oxyntomodulin peptide analog formulations
WO2020128967A2 (en) * 2018-12-19 2020-06-25 Janssen Pharmaceutica Nv Methods of treating severe non-diabetic obesity
KR20210118857A (ko) * 2019-02-15 2021-10-01 한미정밀화학주식회사 생리활성 폴리펩타이드에 사용되는 신규한 중간체 및 이의 제조방법
KR102094103B1 (ko) * 2019-05-08 2020-03-27 ㈜ 디앤디파마텍 폴리펩티드를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2022104394A1 (en) * 2020-11-16 2022-05-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Systems and methods for diagnostic assessment and treatment of insulin resistance and hyperglycemia

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010096052A1 (en) * 2009-02-19 2010-08-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Oxyntomodulin analogs
US20100330108A1 (en) * 2003-11-13 2010-12-30 Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. Pharmaceutical composition for treating obesity-related disease comprising insulinotropic peptide conjugate
US20120003712A1 (en) * 2009-03-20 2012-01-05 Hanmi Holdings Co., Ltd. Method for preparing a site-specific physiologically active polypeptide conjugate

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
EP0904107B1 (en) 1996-03-18 2004-10-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
AU749815B2 (en) 1998-03-06 2002-07-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Protein-free preparations
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6677136B2 (en) 2000-05-03 2004-01-13 Amgen Inc. Glucagon antagonists
GB0121709D0 (en) 2001-09-07 2001-10-31 Imp College Innovations Ltd Food inhibition agent
US7217845B2 (en) 2002-11-25 2007-05-15 Sun Bio, Inc. Bifunctional polyethylene glycol derivatives
GB0300571D0 (en) * 2003-01-10 2003-02-12 Imp College Innovations Ltd Modification of feeding behaviour
CA2513213C (en) 2003-01-22 2013-07-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US7772188B2 (en) 2003-01-28 2010-08-10 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
WO2005035761A1 (en) 2003-10-16 2005-04-21 Compugen Ltd. Splice variants of preproglucagon, glucagon-like peptide-1 and oxyntomodulin
KR101135244B1 (ko) 2007-11-29 2012-04-24 한미사이언스 주식회사 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 비만 관련질환 치료용 조성물
WO2005047334A1 (en) * 2003-11-13 2005-05-26 Hanmi Pharmaceutical. Co., Ltd. Igg fc fragment for a drug carrier and method for the preparation thereof
US20090238838A1 (en) 2003-11-13 2009-09-24 Hanmi Pharm. Ind. Co. Ltd. Insulinotropic peptide conjugate using an immunoglobulin fc
BRPI0518761A2 (pt) 2004-12-02 2008-12-09 Domantis Ltd fusço de droga, conjugado de droga, Ácido nucleico recombinante, construÇço de Ácido nucleico, cÉlula hospedeira, mÉtodo para produzir uma fusço de droga, composiÇço farmacÊutica, droga, mÉtodo de tratamento e/ou prevenÇço de uma condiÇço em um paciente, mÉtodo de retardo ou prevenÇço de progressço de doenÇa, e, mÉtodo para diminuir a absorÇço de alimentos por um paciente
BRPI0606992A2 (pt) 2005-02-11 2009-07-28 Amylin Pharmaceuticals Inc análogo e polipeptìdeos hìbridos de gip com propriedades selecionáveis
KR100754667B1 (ko) 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
GB0511986D0 (en) 2005-06-13 2005-07-20 Imp College Innovations Ltd Novel compounds and their effects on feeding behaviour
PT1891105E (pt) 2005-06-13 2012-06-27 Imp Innovations Ltd Análogos de oxintomodulina e seus efeitos sobre o comportamento da alimentação
EP2330124B1 (en) 2005-08-11 2015-02-25 Amylin Pharmaceuticals, LLC Hybrid polypeptides with selectable properties
JP5297817B2 (ja) 2006-02-22 2013-09-25 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション オキシントモジュリン誘導体
EP2474318A1 (en) 2006-06-07 2012-07-11 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
TWI428346B (zh) 2006-12-13 2014-03-01 Imp Innovations Ltd 新穎化合物及其等對進食行為影響
GB0624868D0 (en) 2006-12-13 2007-01-24 Imp Innovations Ltd Novel compounds and their effects on feeding behaviour
US20090098130A1 (en) 2007-01-05 2009-04-16 Bradshaw Curt W Glucagon-like protein-1 receptor (glp-1r) agonist compounds
JP2008169195A (ja) 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
CA2677932A1 (en) 2007-02-15 2008-08-21 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/glp-1 receptor co-agonists
US20100196405A1 (en) 2007-07-10 2010-08-05 Kingman Ng GLP-1 Fc FUSION PROTEIN FORMULATION
WO2009033739A2 (en) 2007-09-11 2009-03-19 Mondobiotech Laboratories Ag Use of a peptide as a therapeutic agent
EP2214691B1 (en) 2007-10-30 2015-09-30 Indiana University Research and Technology Corporation Compounds exhibiting glucagon antagonist and glp-1 agonist activity
WO2009099763A1 (en) 2008-01-30 2009-08-13 Indiana University Research And Technology Corporation Ester-based peptide prodrugs
JP5753779B2 (ja) 2008-06-17 2015-07-22 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 生理学的ｐＨの緩衝液中で向上した溶解性及び安定性を示すグルカゴン類縁体
CL2009001424A1 (es) 2008-06-17 2010-04-30 Univ Indiana Res & Tech Corp Peptido tipo glucagon; dimero que comprende dos de dichos peptidos; composicion farmaceutica que lo comprende; y su uso para tratar diabetes o inducir perdida de peso.
WO2010013012A2 (en) 2008-08-01 2010-02-04 Lund University Bioscience Ab Novel polypeptides and uses thereof
WO2010033240A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Nektar Therapeutics Carbohydrate-based drug delivery polymers and conjugates thereof
WO2010033220A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Nektar Therapeutics Modified therapeutics peptides, methods of their preparation and use
KR20110126591A (ko) 2008-12-15 2011-11-23 질랜드 파마 에이/에스 글루카곤 유사체
WO2010071807A1 (en) 2008-12-19 2010-06-24 Indiana University Research And Technology Corporation Amide based glucagon superfamily peptide prodrugs
MX2011009798A (es) 2009-03-20 2011-12-08 Amgen Inc Inmunoglobulinas portadoras y usos de las mismas.
SG176858A1 (en) 2009-06-16 2012-02-28 Univ Indiana Res & Tech Corp Gip receptor-active glucagon compounds
ES2537287T3 (es) 2009-07-13 2015-06-05 Zealand Pharma A/S Análogos de glucagón acilados
US20120294855A1 (en) 2009-11-03 2012-11-22 Eli Lilly & Company Glp-1 receptor agonist compounds for obstructive sleep apnea
US20120269830A1 (en) 2009-12-07 2012-10-25 Lawrence Horowitz Conjugates with improved pharmacokinetic properties
US8703701B2 (en) * 2009-12-18 2014-04-22 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists
AR079344A1 (es) 2009-12-22 2012-01-18 Lilly Co Eli Analogo peptidico de oxintomodulina, composicion farmaceutica que lo comprende y uso para preparar un medicamento util para tratar diabetes no insulinodependiente y/u obesidad
AR079345A1 (es) * 2009-12-22 2012-01-18 Lilly Co Eli Analogo peptidico de oxintomodulina
JP6054861B2 (ja) 2010-03-26 2016-12-27 ノヴォ ノルディスク アー／エス 新規のグルカゴン類似体
JP6050746B2 (ja) 2010-05-13 2016-12-21 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションIndiana University Research And Technology Corporation Ｇタンパク質共役受容体活性を示すグルカゴンスーパーファミリーのペプチド
KR20130102470A (ko) 2010-06-24 2013-09-17 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 아미드계 글루카곤 슈퍼패밀리 펩티드 프로드러그
KR101382593B1 (ko) 2010-07-21 2014-04-10 한미사이언스 주식회사 신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물
CN101974077A (zh) 2010-09-15 2011-02-16 南京瑞年天平医药科技有限公司 一种新颖的多肽化合物
KR101767570B1 (ko) * 2010-10-26 2017-08-14 한미사이언스 주식회사 항 비만 펩타이드의 지속형 결합체
KR101303388B1 (ko) 2010-10-26 2013-09-03 한미사이언스 주식회사 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제
CN102010473A (zh) 2010-11-10 2011-04-13 曹鹏 重组胃泌酸调节素融合蛋白及其制备和应用
EP2654774A4 (en) 2010-12-22 2015-07-01 Marcadia Biotech Inc METHOD FOR THE TREATMENT OF METABOLISM DISEASES AND ADIPOSITAS WITH GIP AND GLP-1 RECEPTOR ACTIVE PUCIDIDES ON GLUCAGON BASIS
EP2492749A1 (en) 2011-02-28 2012-08-29 Rohm and Haas Electronic Materials LLC Photoresist compositions and methods of forming photolithographic patterns
KR101161526B1 (ko) 2011-05-16 2012-07-02 숭실대학교산학협력단 연료전지용 촉매전극을 위한 코어/쉘 구조의 나노 지지체 및 그 제조방법
EP3434687B1 (en) 2011-06-10 2021-03-10 Hanmi Science Co., Ltd. Novel oxyntomodulin derivatives and pharmaceutical composition for treating obesity comprising the same
CN109306015B (zh) * 2011-06-17 2022-04-26 韩美科学株式会社 包括泌酸调节肽和免疫球蛋白片段的结合物以及其应用
RU2014101697A (ru) 2011-06-22 2015-07-27 Индиана Юниверсити Рисерч Энд Текнолоджи Корпорейшн Коагонисты рецепторов глюкагона/glp-1
BR112014025951A2 (pt) 2012-04-19 2017-07-11 Opko Biologics Ltd variantes de oxintomodulina de longa ação e métodos de produção do mesmo
RU2015101697A (ru) 2012-06-21 2016-08-10 Индиана Юниверсити Рисерч Энд Текнолоджи Корпорейшн Аналоги глюкагона, обладающие активностью рецептора gip
KR101968344B1 (ko) 2012-07-25 2019-04-12 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 고지혈증 치료용 조성물
AR092873A1 (es) 2012-09-26 2015-05-06 Cadila Healthcare Ltd Peptidos como agonistas triples de los receptores de gip, glp-1 y glugagon
KR101993393B1 (ko) * 2012-11-06 2019-10-01 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 당뇨병 또는 비만성 당뇨병 치료용 조성물
CA2890324C (en) 2012-11-06 2021-02-23 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Liquid formulation of protein conjugate comprising the oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment
JP6137046B2 (ja) 2014-05-09 2017-05-31 信越化学工業株式会社 単量体、高分子化合物、レジスト材料及びパターン形成方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100330108A1 (en) * 2003-11-13 2010-12-30 Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. Pharmaceutical composition for treating obesity-related disease comprising insulinotropic peptide conjugate
WO2010096052A1 (en) * 2009-02-19 2010-08-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Oxyntomodulin analogs
US20120003712A1 (en) * 2009-03-20 2012-01-05 Hanmi Holdings Co., Ltd. Method for preparing a site-specific physiologically active polypeptide conjugate

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SANTOPRETE et al., "DPP-IVresistant, long-acting oxyntomodulin derivatives" Journal of Peptide Science, Vol.17, No.4, pp.270-280 (2011) See the whole document, especially Figure 1 and Table 2 *
VOROBIEV et al., "Chemical polysialylation: design of conjugated human oxyntomodulin with a prolonged anorexic effect in vivo" Biochimie, Vol.95, pp. 264-270 (Epub 27 September 2012) See the whole document. *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014073845A1 (en) 2014-05-15
ZA201503999B (en) 2016-07-27
CN104918632A (zh) 2015-09-16
BR112015010203A8 (pt) 2019-11-26
BR112015010203B1 (pt) 2021-05-18
DK2916860T3 (da) 2020-06-15
EA201590759A1 (ru) 2015-12-30
JP2020079301A (ja) 2020-05-28
IL238631B (en) 2020-04-30
PH12015501009B1 (en) 2015-07-27
JP2018162298A (ja) 2018-10-18
NZ748034A (en) 2020-10-30
EP2916860A4 (en) 2016-06-22
IL273305A (en) 2020-04-30
SG10202110636WA (en) 2021-11-29
LT2916860T (lt) 2020-07-10
IL273305B (en) 2021-10-31
PE20151420A1 (es) 2015-09-24
PL2916860T3 (pl) 2020-11-02
NZ738835A (en) 2020-03-27
AU2019275590B2 (en) 2022-01-20
TW202144394A (zh) 2021-12-01
BR112015010203A2 (pt) 2017-08-22
AR126851A2 (es) 2023-11-22
KR20140058104A (ko) 2014-05-14
TWI755341B (zh) 2022-02-11
CA2890329A1 (en) 2014-05-15
TWI645856B (zh) 2019-01-01
BR122021003984B1 (pt) 2022-07-12
CA2890329C (en) 2024-01-23
CN104918632B (zh) 2017-10-31
IL238631A0 (en) 2015-06-30
JP6363613B2 (ja) 2018-07-25
AU2018200138B2 (en) 2019-09-12
SG10201703732VA (en) 2017-06-29
EP3679944B1 (en) 2022-03-30
AR093386A1 (es) 2015-06-03
JP2015536943A (ja) 2015-12-24
AU2018200138A1 (en) 2018-02-01
TW202041528A (zh) 2020-11-16
AU2019275590A1 (en) 2020-01-02
ES2802099T3 (es) 2021-01-15
HRP20200925T1 (hr) 2020-09-18
AU2013342324A1 (en) 2015-05-28
TWI741218B (zh) 2021-10-01
TW201900206A (zh) 2019-01-01
SG11201503420QA (en) 2015-05-28
JP7050834B2 (ja) 2022-04-08
JP7341263B2 (ja) 2023-09-08
AU2013342324B2 (en) 2018-02-22
NZ708105A (en) 2018-06-29
EP3679944A1 (en) 2020-07-15
EP2916860B1 (en) 2020-03-11
HUE049240T2 (hu) 2020-09-28
PH12018501424B1 (en) 2019-04-01
UA117570C2 (uk) 2018-08-27
TW201422232A (zh) 2014-06-16
US20180237490A1 (en) 2018-08-23
KR101993393B1 (ko) 2019-10-01
CL2015001207A1 (es) 2015-07-03
JP6666959B2 (ja) 2020-03-18
PT2916860T (pt) 2020-07-02
MY173828A (en) 2020-02-24
PH12015501009A1 (en) 2015-07-27
PH12018501424A1 (en) 2019-04-01
MX2015005699A (es) 2016-02-05
EA037956B1 (ru) 2021-06-15
HK1211856A1 (en) 2016-06-03
US20150299282A1 (en) 2015-10-22
JP2022048398A (ja) 2022-03-25
BR122019024272B1 (pt) 2021-05-18
EA201892383A1 (ru) 2019-03-29
US10550168B2 (en) 2020-02-04
MX360335B (es) 2018-10-29
TWI754980B (zh) 2022-02-11
EP2916860A1 (en) 2015-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019275590B2 (en) A Composition For Treating Diabetes Or Diabesity Comprising Oxyntomudulin Analog
JP6903086B2 (ja) オキシントモジュリン誘導体を含む高脂血症の治療のための組成物
JP6345216B2 (ja) オキシントモジュリンと免疫グロブリン断片とを含む結合体及びその用途
NZ748034B2 (en) A Composition For Treating Diabetes Or Diabesity Comprising Oxyntomodulin Analog

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM