JP6405311B2 - 少なくとも2つの異なる実体を含む分子を作製および選択するための方法ならびにその使用 - Google Patents
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Description
ここ数年の間に、抗体、抗体断片、および細胞表面受容体に対するリガンドを含む多種多様な特異的治療的タンパク質が開発され、臨床的に試験されている。例示的なタンパク質は、抗体、Fc領域結合体、または標的化送達ビヒクルである。これらの治療的タンパク質には、患者への特異的送達のために、低分子薬物、酵素、放射性同位体、タンパク毒素、および他の毒素などいくつかのクラスの治療的毒素に結合されているものもある。
-(a)C末端の小胞体保留シグナルを有する可溶性ソルターゼAをコードする核酸、
(b)ソルターゼモチーフとそれに続く小胞体保留シグナルをそのC末端にまたはそのC末端領域中に含む第1のポリペプチドドメインをコードする核酸、および
(c)少なくとも2つのグリシン残基のオリゴグリシンモチーフをそのN末端に含む第2のポリペプチドドメインをコードする核酸
を含む細胞を培養する段階
を含み、
その細胞が、第1のポリペプチドドメインおよび第2のポリペプチドドメインのソルターゼA(の媒介による/によって触媒された)結合体を分泌し、
それによって、少なくとも2つのポリペプチドドメインを含むポリペプチドを作製する、方法である。
-(a)C末端の小胞体保留シグナルを有する可溶性ソルターゼAをコードする核酸、
(b)ソルターゼモチーフとそれに続く小胞体保留シグナルをそのC末端にまたはそのC末端領域中に含む第1の結合実体をコードする核酸、および
(c)少なくともジグリシンをそのN末端に含む第2の結合実体をコードする核酸
を含む細胞を培養する段階
を含み、
その細胞が、第1の結合実体および第2の結合実体のソルターゼA(の媒介による/によって触媒された)結合体を分泌し、
第1の結合実体が、第1の抗原または第1の標的に特異的に結合し、かつ第2の結合実体が、第2の抗原または第2の標的に特異的に結合し、
それによって、少なくとも2つの結合実体を含む多重特異性結合物質を作製する、方法である。
-第1の結合実体および第2の結合実体の様々な組合せを含む多重特異性結合物質の多数群より、2つの異なるエピトープまたは抗原に特異的に結合する多重特異性結合物質を選択する段階
を含む、方法である。
(i)細胞を含む試料中に存在する細胞表面マーカーを決定し、かつそれらから少なくとも第1の表面マーカーおよび第2の表面マーカーを選択する段階、
(ii)(a)20(二十)個のC末端アミノ酸残基内にアミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO: 01、Xは任意のアミノ酸残基であってよい)とそれに続く小胞体保留シグナルKDEL(SEQ ID NO: 02)を含む抗体FabまたはscFab断片またはscFv抗体をコードする核酸であって、FabまたはscFab断片またはscFv抗体が第1の表面マーカーまたはそのリガンドに特異的に結合する、核酸、(b)完全長抗体重鎖、完全長抗体軽鎖、および抗体重鎖Fc領域ポリペプチドを含む一アーム抗体断片をコードする核酸であって、完全長抗体重鎖および完全長抗体軽鎖が互いに相補的な同種の抗体鎖であり、かつそれらの可変ドメイン(VHおよびVL)の対が、第2の表面マーカーまたはそのリガンドに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、完全長抗体重鎖および抗体重鎖Fc領域ポリペプチドが、抗体ヒンジ領域を形成している1つまたは複数のジスルフィド結合によって互いに共有結合的に連結されており、かつ抗体重鎖Fc領域ポリペプチドがそのN末端にオリゴグリシンGm(m=2または3または4または5)アミノ酸配列を有している、核酸、ならびに、(c)C末端の小胞体保留シグナルを有する可溶性ソルターゼAをコードする核酸を、細胞にトランスフェクトする段階
を含み、
かつそれによって、二重特異性抗体を作製する、方法である。
(i)(a)20個のC末端アミノ酸残基内にアミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO: 01、Xは任意のアミノ酸残基であってよい)とそれに続く小胞体保留シグナルKDEL(SEQ ID NO: 02)を含み、FabまたはscFab断片またはscFv抗体断片が、第1のエピトープまたは第1の抗原に特異的に結合する、抗体FabまたはscFab断片またはscFv抗体断片の第1の多数群の各メンバーを、(b)一アーム抗体断片が完全長抗体重鎖、完全長抗体軽鎖、および抗体重鎖Fc領域ポリペプチドを含み、完全長抗体重鎖および完全長抗体軽鎖が互いに相補的な同種の抗体鎖であり、かつそれらの可変ドメイン(VHおよびVL)の対が、第2のエピトープまたは第2の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、完全長抗体重鎖および抗体重鎖Fc領域ポリペプチドが、抗体ヒンジ領域を形成している1つまたは複数のジスルフィド結合によって互いに共有結合的に連結されており、かつ抗体重鎖Fc領域ポリペプチドがそのN末端にオリゴグリシンGm(m=2または3または4または5)アミノ酸配列を有している、一アーム抗体断片の多数群の各メンバーと、ソルターゼAによって触媒される酵素反応によって共有結合的に結合させることによって調製された多数の二重特異性抗体の結合特異性および/または選択性および/または親和性および/またはエフェクター機能および/またはインビボ半減期を明らかにする段階、ならびに
(ii)適切な結合特異性および/または選択性および/または親和性および/またはエフェクター機能および/またはインビボ半減期を有する二重特異性抗体を選択し、かつそれによって、抗原結合部位の組合せを決定する段階
を含む、方法である。
[本発明1001]
少なくとも2つのポリペプチドドメインを含むポリペプチドを作製するための方法であって、
-(a)C末端の小胞体保留シグナルを有する黄色ブドウ球菌(S. aureus)可溶性ソルターゼAをコードする核酸、
(b)ソルターゼモチーフとそれに続く小胞体保留シグナルをそのC末端に含む第1のポリペプチドドメインをコードする核酸、および
(c)少なくともジグリシンをそのN末端に含む第2のポリペプチドドメインをコードする核酸
を含む細胞を培養する段階
を含み、
該細胞が、該第1のポリペプチドドメインおよび該第2のポリペプチドドメインのソルターゼA結合体を分泌し、
それによって、少なくとも2つのポリペプチドドメインを含むポリペプチドを作製する、方法。
[本発明1002]
少なくとも2つの結合実体を含む多重特異性結合物質(multispecific binder)を作製するための方法であって、
-(a)C末端の小胞体保留シグナルを有する黄色ブドウ球菌可溶性ソルターゼAをコードする核酸、
(b)ソルターゼモチーフとそれに続く小胞体保留シグナルをそのC末端に含む第1の結合実体をコードする核酸、および
(c)少なくともジグリシンをそのN末端に含む第2の結合実体をコードする核酸
を含む細胞を培養する段階
を含み、
該細胞が、該第1の結合実体および該第2の結合実体のソルターゼA結合体を分泌し、
該第1の結合実体が、第1の抗原または第1の標的に特異的に結合し、かつ該第2の結合実体が、第2の抗原または第2の標的に特異的に結合し、
それによって、少なくとも2つの結合実体を含む多重特異性結合物質を作製する、方法。
[本発明1003]
2つの異なるエピトープまたは抗原に特異的に結合する多重特異性結合物質を選択するための方法であって、
-第1の結合実体および第2の結合実体の様々な組合せを含む多重特異性結合物質の多数群より、2つの異なるエピトープまたは抗原に特異的に結合する多重特異性結合物質を選択する段階
を含み、
該多重特異性結合物質の多数群のメンバーがそれぞれ、本発明1002の方法によって得られる、方法。
[本発明1004]
多重特異性結合物質が、その結合特異性および/または選択性および/または親和性および/またはエフェクター機能および/またはインビボ半減期に基づいて選択されることを特徴とする、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記結合実体が、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメインの同種の対であることを特徴とする、本発明1002〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記多重特異性結合物質が、2つまたは4つの結合実体を含む二重特異性抗体であることを特徴とする、本発明1002〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記第1のポリペプチドドメインおよび前記第2のポリペプチドドメインが、互いに独立して完全長抗体、scFv、scFab、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖Fc領域断片、抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対、VH、VL、CH1、CH2、CH3、CH4、CL、抗体ヒンジ領域、サイトカイン、受容体、受容体リガンド、検出可能な標識、タグ、ならびに、結合対のパートナーより選択されることを特徴とする、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記小胞体保留シグナルがSEQ ID NO: 02(KDEL)、SEQ ID NO: 03(HDEL)、またはSEQ ID NO: 04(SFIXXXXMP)より選択されることを特徴とする、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記ソルターゼモチーフがLPXTG(SEQ ID NO: 01、Xは任意のアミノ酸残基であってよい)であることを特徴とする、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
結合している前記第1のドメイン、または前記第1の結合実体が、20個のC末端アミノ酸残基内にアミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO: 01、Xは任意のアミノ酸残基であってよい)を有することを特徴とする、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記細胞が哺乳動物細胞または酵母細胞であることを特徴とする、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記哺乳動物細胞がHEK細胞、CHO細胞、またはBHK細胞より選択されることを特徴とする、本発明1011の方法。
[本発明1013]
二重特異性抗体を選択するための方法であって、
(i)細胞を含む試料中に存在する細胞表面マーカーを決定し、かつそれらから少なくとも第1の細胞表面マーカーおよび第2の細胞表面マーカーを選択する段階、
(ii)(a)20個のC末端アミノ酸残基内にアミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO: 01、Xは任意のアミノ酸残基であってよい)とそれに続く小胞体保留シグナルKDEL(SEQ ID NO: 02)を含む抗体Fab断片または抗体scFabまたはscFv抗体をコードする核酸であって、該Fab断片または該scFv抗体が該第1の表面マーカーまたはそのリガンドに特異的に結合する、核酸、(b)完全長抗体重鎖、完全長抗体軽鎖、および抗体重鎖Fc領域ポリペプチドを含む一アーム抗体断片をコードする核酸であって、該完全長抗体重鎖および該完全長抗体軽鎖が互いに相補的な同種の抗体鎖であり、かつそれらの可変ドメイン(VHおよびVL)の対が、該第2の表面マーカーまたはそのリガンドに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、該完全長抗体重鎖および該抗体重鎖Fc領域ポリペプチドが、抗体ヒンジ領域を形成している1つまたは複数のジスルフィド結合によって互いに共有結合的に連結されており、かつ該抗体重鎖Fc領域ポリペプチドがそのN末端にオリゴグリシンG m (m=2または3または4または5)アミノ酸配列を有している、核酸、ならびに(c)C末端の小胞体保留シグナルを有する黄色ブドウ球菌可溶性ソルターゼAをコードする核酸を、細胞にトランスフェクトする段階
を含み、
かつそれによって、該二重特異性抗体を作製する、方法。
[本発明1014]
抗原結合部位の組合せを決定するための方法であって、
(i)(a)20個のC末端アミノ酸残基内にアミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO: 01、Xは任意のアミノ酸残基であってよい)とそれに続く小胞体保留シグナルKDEL(SEQ ID NO: 02)を含み、抗体Fab断片またはscFv抗体が第1のエピトープまたは第1の抗原に特異的に結合する、該Fab断片またはscFv抗体断片の第1の多数群の各メンバーを、(b)一アーム抗体断片が完全長抗体重鎖、完全長抗体軽鎖、および抗体重鎖Fc領域ポリペプチドを含み、該完全長抗体重鎖および該完全長抗体軽鎖が互いに相補的な同種の抗体鎖であり、かつそれらの可変ドメイン(VHおよびVL)の対が、第2のエピトープまたは第2の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、該完全長抗体重鎖および該抗体重鎖Fc領域ポリペプチドが、抗体ヒンジ領域を形成している1つまたは複数のジスルフィド結合によって互いに共有結合的に連結されており、かつ抗体重鎖Fc領域ポリペプチドがそのN末端にオリゴグリシンG m (m=2または3または4または5)アミノ酸配列を有している、該一アーム抗体断片の多数群の各メンバーと、黄色ブドウ球菌ソルターゼAの媒介による細胞内酵素結合反応によって結合させることによって調製された多数の二重特異性抗体の結合特異性および/または選択性および/または親和性および/またはエフェクター機能および/またはインビボ半減期を明らかにする段階、ならびに
(ii)適切な結合特異性および/または選択性および/または親和性および/またはエフェクター機能および/またはインビボ半減期を有する二重特異性抗体を選択し、かつそれによって、抗原結合部位の組合せを決定する段階
を含む、方法。
[本発明1015]
本発明1006〜本発明1013のいずれかの方法によって得られる、二重特異性抗体。
[本発明1016]
二重特異性抗体の重鎖のうちの1つにおいてアミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO: 01、Xは任意のアミノ酸残基であってよい)を含む、該二重特異性抗体。
[本発明1017]
Fc領域が、異なる残基への、天然に存在する329位のアミノ酸残基の変異と、228、233、234、235、236、237、297、318、320、322、および331位のアミノ酸残基を含む群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基の少なくとも1つのさらなる変異とを含むことを特徴とし、該Fc領域中の残基が、KabatのEUインデックスに従って番号をつけられている、本発明1006〜1013のいずれかの方法または本発明1015もしくは1016の抗体。
[本発明1018]
本発明1015または本発明1016または本発明1017の二重特異性抗体を含む、薬学的製剤。
[本発明1019]
医薬の製造における、本発明1015または本発明1016または本発明1017の二重特異性抗体の使用。
I. 定義
本明細書および特許請求の範囲において、免疫グロブリン重鎖Fc領域中の残基の番号付与は、KabatのEUインデックスのものである(参照により本明細書に明確に組み入れられるKabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242)。
より選択される。
(i)抗体依存性細胞障害(ADCC)、
(ii)補体(C1q)の結合、活性化、および補体依存性細胞障害(CDC)、
(iii)抗体依存性細胞性食作用(ADCP)、
(iv)抗原-抗体複合体(免疫複合体)の貪食/クリアランス、
(v)場合によりサイトカイン放出、ならびに
(vi)抗体および抗原-抗体複合体の半減期/クリアランス速度
である。
を有する。CH2ドメインは、別のドメインと接近して対になっていないという点で、独特である。もっと正確に言えば、N結合型分枝状炭水化物鎖2つが、インタクトな天然Fc領域の2つのCH2ドメインの間に介在している。炭水化物が、ドメイン間の対形成のための代用品となり、CH2ドメインを安定化するのに寄与し得ると推測されている。Burton, Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206。
を有する。
100×比X/Y
式中、Xは、配列アライメントプログラムALIGN-2によって、そのプログラムによるAおよびBのアライメントにおいて同一のマッチとして採点されたアミノ酸残基の数であり、Yは、B中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さに等しくない場合、Bに対するAのアミノ酸配列同一性%は、Aに対するBのアミノ酸配列同一性%と等しくならないことが認識されるであろう。別段の記載が特に無い限り、本明細書において使用されるアミノ酸配列同一性%の値はすべて、すぐ前の節で説明したように、ALIGN-2コンピュータープログラムを用いて得られる。
本明細書において報告されるモジュール式アプローチを用いることによってテーラーメイドの治療的ポリペプチドを提供できることが判明している。これらのポリペプチドは、それらが形成される元となるポリペプチドドメインに関してテーラーメイドである。
本明細書において報告される1つの局面は、少なくとも2つのポリペプチドドメインを含むポリペプチドを作製するための方法であって、
-(a)C末端の小胞体保留シグナルを有する可溶性ソルターゼAをコードする核酸、
(b)ソルターゼモチーフとそれに続く小胞体保留シグナルをそのC末端にまたはそのC末端領域中に含む第1のポリペプチドドメインをコードする核酸、および
(c)少なくともジグリシンモチーフをそのN末端に含む第2のポリペプチドドメインをコードする核酸
を含む細胞を培養する段階
を含み、
その細胞が、第1のポリペプチドドメインおよび第2のポリペプチドドメインのソルターゼA(によって連結された)結合体を分泌し、
それによって、少なくとも2つのポリペプチドドメインを含むポリペプチドを作製する、方法である。
-(a)C末端の小胞体保留シグナルを有する可溶性ソルターゼAをコードする核酸、
(b)ソルターゼモチーフとそれに続く小胞体保留シグナルをそのC末端にまたはそのC末端領域中に含む第1の結合実体をコードする核酸、および
(c)少なくともジグリシンモチーフをそのN末端に含む第2の結合実体をコードする核酸
を含む細胞を培養する段階
を含み、
その細胞が、第1の結合実体および第2の結合実体のソルターゼA(によって連結された)結合体を分泌し、
第1の結合実体が、第1の抗原または第1の標的に特異的に結合し、かつ第2の結合実体が、第2の抗原または第2の標的に特異的に結合し、
それによって、少なくとも2つの結合実体を含む多重特異性結合物質を作製する、方法である。
-第1の結合実体および第2の結合実体の様々な組合せを含む多重特異性結合物質の多数群より、2つの異なるエピトープまたは抗原に特異的に結合する多重特異性結合物質を選択する段階
を含み、方法である。
(i)細胞を含む試料中に存在する細胞表面マーカーを決定し、かつそれらから少なくとも第1の表面マーカーおよび第2の表面マーカーを選択する段階、
(ii)(a)20個のC末端アミノ酸残基内にアミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO: 01、Xは任意のアミノ酸残基であってよい)とそれに続く小胞体保留シグナルKDEL(SEQ ID NO: 02)を含む抗体Fab断片または抗体scFabまたはscFv抗体をコードする核酸であって、Fab断片またはscFab断片またはscFv抗体が第1の表面マーカーまたはそのリガンドに特異的に結合する、核酸、(b)完全長抗体重鎖、完全長抗体軽鎖、および抗体重鎖Fc領域ポリペプチドを含む一アーム抗体断片をコードする核酸であって、完全長抗体重鎖および完全長抗体軽鎖が互いに相補的な同種の抗体鎖であり、かつそれらの可変ドメイン(VHおよびVL)の対が、第2の表面マーカーまたはそのリガンドに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、完全長抗体重鎖および抗体重鎖Fc領域ポリペプチドが、抗体ヒンジ領域を形成している1つまたは複数のジスルフィド結合によって互いに共有結合的に連結されており、かつ抗体重鎖Fc領域ポリペプチドがそのN末端にオリゴグリシンGm(m=2または3または4または5)アミノ酸配列を有している、核酸、ならびに、(c)C末端の小胞体保留シグナルを有する可溶性ソルターゼAをコードする核酸を、細胞にトランスフェクトする段階
を含み、
かつそれによって、二重特異性抗体を作製する、方法である。
(i)(a)20個のC末端アミノ酸残基内にアミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO: 01、Xは任意のアミノ酸残基であってよい)とそれに続く小胞体保留シグナルKDEL(SEQ ID NO: 02)を含み、抗体Fab断片または抗体scFab断片またはscFv抗体が第1のエピトープまたは第1の抗原に特異的に結合する、抗体Fab断片または抗体scFab断片またはscFv抗体断片の第1の多数群の各メンバーを、(b)一アーム抗体断片が完全長抗体重鎖、完全長抗体軽鎖、および抗体重鎖Fc領域ポリペプチドを含み、完全長抗体重鎖および完全長抗体軽鎖が互いに相補的な同種の抗体鎖であり、かつそれらの可変ドメイン(VHおよびVL)の対が、第2のエピトープまたは第2の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、完全長抗体重鎖および抗体重鎖Fc領域ポリペプチドが、抗体ヒンジ領域を形成している1つまたは複数のジスルフィド結合によって互いに共有結合的に連結されており、かつ抗体重鎖Fc領域ポリペプチドがそのN末端にオリゴグリシンGm(m=2または3または4または5)アミノ酸配列を有している、一アーム抗体断片の多数群の各メンバーと、ソルターゼAの媒介による酵素結合反応を用いて結合させることによって調製された多数の二重特異性抗体の結合特異性および/または選択性および/または親和性および/またはエフェクター機能および/またはインビボ半減期を明らかにする段階、ならびに
(ii)適切な結合特異性および/または選択性および/または親和性および/またはエフェクター機能および/またはインビボ半減期を有する二重特異性抗体を選択し、かつそれによって、抗原結合部位の組合せを決定する段階
を含む、方法である。
複数ドメインポリペプチドは、例えば、酵素ソルターゼAを用いることによってインビボで得ることができる。
抗体Fab断片のような第1の結合実体を別の特異的結合実体、例えば、第2の抗体Fab断片または完全長重鎖およびその同種の完全長軽鎖およびジスルフィド結合された重鎖Fc領域ポリペプチドを含む一アーム抗体断片と組み合わせることが望ましい。さらに、第1の結合実体をいくつかの異なる他の結合実体に連結した場合に、第1の結合実体がより優れた特性を示すかどうかスクリーニングすることも可能である。いわゆるコンビマトリックスアプローチを用いて、結合実体の多数の組合せを簡単な方法で扱うことができる。第2の結合実体が、異なる標的/エピトープ/抗原に結合できるのか、または同じ抗原に結合するが異なるエピトープに結合できるのか、または同じエピトープに結合するが、単一の結合実体の異なる変種(例えば、ヒト化候補物)であり得るのかを指摘しなければならない。
ポリペプチドをコードするベクターのクローニングおよび/または発現/分泌に適した宿主細胞には、本明細書において説明する原核細胞および真核細胞が含まれる。例えば、特に、グリコシル化およびFcエフェクター機能が必要とされない場合、ポリペプチドは細菌において作製され得る(例えば、大腸菌における抗体断片の発現を説明しているUS 5,648,237、US 5,789,199、およびUS 5,840,523、Charlton, Methods in Molecular Biology 248 (2003) 245-254 (B.K.C. Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ)を参照されたい)。発現後、ポリペプチドは、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離され得、または不溶性画分から、いわゆる、可溶化できる封入体から単離され得、かつ、ポリペプチドは、生物活性型にリフォールディングされ得る。その後、ポリペプチドはさらに精製され得る。
ある特定の態様において、本明細書において提供される二重特異性抗体のいずれかは、生物試料において一方または両方の抗原の存在を検出するのに有用である。本明細書において使用される「検出する」という用語は、定量的検出または定性的検出を包含する。ある特定の態様において、生物試料は、細胞または組織、例えば癌細胞の生検材料を含む。
本明細書において説明する二重特異性抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するそのような抗体を1種または複数種の任意の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.), (1980))と混合することによって、凍結乾燥製剤または水性液剤の形態で調製される。通常、薬学的に許容される担体は、使用される投与量および濃度において受容者に非毒性であり、限定されるわけではないが、次のものが含まれる:リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤;保存剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール;メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レソルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾールなど);低分子量(約10残基未満の)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリ(ビニルピロリドン)のような親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸; グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物;EDTAのようなキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖;ナトリウムのような、塩を形成する対イオン;金属複合体(例えばZn-タンパク質複合体);ならびに/またはポリエチレングリコール(PEG)のような非イオン系界面活性剤。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体には、さらに、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)のような間質(interstitial)薬物分散剤、例えば、rhuPH20(HYLENEX(登録商標), Baxter International, Inc.)のようなヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質が含まれる。rhuPH20を含む、いくつかの例示的なsHASEGPおよび使用方法は、US 2005/0260186およびUS 2006/0104968において説明されている。1つの局面において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼのような1種または複数種の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
本明細書において提供される二重特異性抗体のいずれかを治療方法で使用することができる。
本発明の別の局面において、前述の障害の治療、予防、および/または診断に有用な材料を含む製造物が提供される。製造物は、容器、および容器の上または容器に伴うラベルまたは添付文書を含む。適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど様々な材料から形成されてよい。容器は、単独であるか、または病態を治療、予防、および/もしくは診断するのに有効な別の組成物と組み合わせられた組成物を含み、無菌取出口を有してよい(例えば、容器は、皮下注射針によって突き刺すことができる栓を有する静注液バッグまたはバイアルでよい)。組成物中の少なくとも1種の活性物質は、本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、その組成物が、選ばれた病態を治療するのに使用されることを示す。さらに、製造物は、(a)本発明の抗体を含む組成物がその中に含まれる第1の容器;および(b)別の細胞障害性物質またはそうでなければ治療物質を含む組成物がその中に含まれる第2の容器を含んでよい。本発明のこの態様の製造物は、それらの組成物を用いて特定の病態を治療できることを示す添付文書をさらに含んでよい。あるいはまたはさらに、製造物は、注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝化生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第2の(または第3の)容器をさらに含んでよい。これは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料もさらに含んでよい。
組換えDNA技術
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989において説明されているように、標準的方法を用いてDNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の取扱い説明書に従って使用した。
所望の遺伝子セグメントは、Geneart GmbH(Regensburg, Germany)において化学合成によって調製された。合成された遺伝子断片を、増殖/増幅のために大腸菌プラスミド中にクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列は、DNA配列決定によって確認した。あるいは、合成オリゴヌクレオチドを化学的にアニーリングすることによって、またはPCRによって、短い合成DNA断片を構築した。それぞれのオリゴヌクレオチドをmetabion GmbH(Planegg-Martinsried, Germany)によって調製した。
280nmにおける光学濃度(OD)を測定し、ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を用いることによって、精製したポリペプチドのタンパク質濃度を測定した。
単鎖Fab抗体断片を含む抗体および抗体断片のための発現プラスミドの作製
ヒト胎児由来腎臓細胞(HEK293)の一過性トランスフェクションによって、所望のタンパク質を発現させた。所望の遺伝子/タンパク質(例えば、完全長抗体重鎖、完全長抗体軽鎖、scFab断片、またはN末端にオリゴグリシンを含むFc鎖)を発現させるために、以下の機能的エレメントを含む転写ユニットを使用した:
-イントロンAを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター(P-CMV)、
-ヒト重鎖免疫グロブリン5'非翻訳領域(5'UTR)、
-マウス免疫グロブリンの重鎖シグナル配列(SS)、
-発現させる遺伝子/タンパク質、ならびに
-ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
-大腸菌においてこのプラスミドが複製するのを可能にするベクターpUC18由来の複製起点、および
-大腸菌にアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子
を含む。
C末端Hisタグ、続いてソルターゼ認識モチーフ、および内質保留(ER)シグナルを含むscFabコード融合遺伝子を、各配列エレメント(短いGS配列エレメントによってそれぞれ隔てられたHis6タグ(HHHHHH、SEQ ID NO: 07)、ソルターゼモチーフ(LPETGGS、SEQ ID NO: 28)、およびER保留シグナル(KDEL、SEQ ID NO: 02)をコードするDNA断片
をラット-ヒトキメラ単鎖Fab分子(Vκ-huCκ-リンカー-V重鎖-huCH1)に融合することによって、組み立てた。
-イントロンAを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター(P-CMV)、
-ヒト重鎖免疫グロブリン5'非翻訳領域(5'UTR)、
-マウス免疫グロブリンの重鎖シグナル配列、
-scFab(Vκ-huCκ-リンカー-V重鎖-huCH1)をコードする核酸、
-Hisタグをコードする核酸、
-ソルターゼ認識モチーフをコードする核酸、
-ER保留シグナルをコードする核酸、ならびに
-ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGHpA)。
N末端グリシン-セリンモチーフを含むscFab融合遺伝子を、各配列エレメント((G4S)2、SEQ ID NO: 31)をコードするDNA断片をラット-ヒトキメラ単鎖Fab分子(Vκ-huCκ-リンカー-V重鎖-huCH1)に融合することによって、組み立てた。
-イントロンAを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター(P-CMV)、
-ヒト重鎖免疫グロブリン5'非翻訳領域(5'UTR)、
-マウス免疫グロブリンの重鎖シグナル配列、
-(G4S)2モチーフをコードする核酸、
-scFab(Vκ-huCκ-リンカー-V重鎖-huCH1)をコードする核酸、ならびに
-ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
N末端トリプルグリシンモチーフを含むFC融合遺伝子を、各配列エレメント(GGG、SEQ ID NO: 33)をコードするDNA断片をヒト抗体重鎖Fc領域分子に融合することによって、組み立てた。
-イントロンAを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター(P-CMV)、
-ヒト重鎖免疫グロブリン5'非翻訳領域(5'UTR)、
-マウス免疫グロブリンの重鎖シグナル配列、
-GGGをコードする核酸、
-Fc領域をコードする核酸、ならびに
-ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
先に概説した方法に従って、以下のポリペプチド/タンパク質をコードする発現プラスミドを構築した。
-T366W変異を含むサブクラスIgG1のヒト重鎖定常領域と組み合わせられたペルツズマブ重鎖可変ドメイン:
。
-ヒトκ軽鎖定常領域と組み合わせられたペルツズマブ軽鎖可変ドメイン:
。
-T366S、L368A、およびY407V変異を含むサブクラスIgG1のヒト重鎖定常領域と組み合わせられたトラスツズマブ重鎖可変ドメイン:
。
-ヒトκ軽鎖定常領域と組み合わせられたトラスツズマブ軽鎖可変ドメイン:
。
-ペルツズマブ重鎖可変ドメインおよびC末端
アミノ酸配列を含むサブクラスIgG1のヒト重鎖定常領域1(CH1)を含む、抗体VH-CH1断片:
。
-ペルツズマブ重鎖可変ドメインおよびC末端
配列を含むサブクラスIgG1のヒト重鎖定常領域1(CH1)を含む、抗体VH-CH1断片:
。
-ペルツズマブ重鎖可変ドメインおよびC末端
配列を含むサブクラスIgG1のヒト重鎖定常領域1(CH1)を含む、抗体VH-CH1断片:
。
-トラスツズマブ重鎖可変ドメインおよびC末端
配列を含むサブクラスIgG1のヒト重鎖定常領域1(CH1)を含む、抗体VH-CH1断片:
。
-トラスツズマブ重鎖可変ドメインおよびC末端
配列を含むサブクラスIgG1のヒト重鎖定常領域1(CH1)を含む、抗体VH-CH1断片:
。
-トラスツズマブ重鎖可変ドメインおよびC末端
配列を含むサブクラスIgG1のヒト重鎖定常領域1(CH1)を含む、抗体VH-CH1断片:
。
-N末端
配列を含む、T366S、L368A、およびY407V変異を有する重鎖Fc領域ポリペプチド(ヒトIgG1(CH2-CH3)):
。
-N末端GGHTCPPC配列を含む、T366S、L368A、およびY407V変異を有する重鎖Fc領域ポリペプチド(ヒトIgG1(CH2-CH3)):
。
-N末端GGCPPC配列を含む、T366S、L368A、およびY407V変異を有する重鎖Fc領域ポリペプチド(ヒトIgG1(CH2-CH3)):
。
-N末端
配列を含む、T366W変異を有する重鎖Fc領域ポリペプチド(ヒトIgG1(CH2-CH3)):
。
-N末端GGHTCPPC配列を含む、T366W変異を有する重鎖Fc領域ポリペプチド(ヒトIgG1(CH2-CH3)):
。
-N末端GGCPPC配列を含む、T366W変異を有する重鎖Fc領域ポリペプチド(ヒトIgG1(CH2-CH3)):
。
C末端ER保留シグナルを有する黄色ブドウ球菌可溶性ソルターゼAの発現プラスミドの作製
ER保留シグナル(KDEL)をコードするDNA断片を、N末端が短縮された黄色ブドウ球菌ソルターゼA(60〜206)分子に融合することによって、C末端ER保留シグナルを含むソルターゼ融合遺伝子を組立てた(SrtA-KDEL)。
-イントロンAを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター(P-CMV)、
-ヒト重鎖免疫グロブリン5'非翻訳領域(5'UTR)、
-マウス免疫グロブリンの重鎖シグナル配列、
-N末端が短縮された黄色ブドウ球菌ソルターゼAをコードする核酸、
-ER保留シグナルをコードする核酸、ならびに
-ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGHpA)。
ソルターゼの媒介によるペプチド転移によってインビボで作製された結合体の一過性発現、精製、および分析的特徴決定
F17培地(Invitrogen Corp.)中で培養し、一過性にトランスフェクトしたHEK293細胞(ヒト胎児由来腎臓細胞株293に由来)において、インビボで結合体を生じさせた。トランスフェクションには、「293-Free」トランスフェクション試薬(Novagen)を使用した。前述のN末端およびC末端を伸長させたscFab分子ならびに可溶性ソルターゼをそれぞれ、個々の発現プラスミドから発現させた。トランスフェクションは、製造業者の取扱い説明書で指定されたようにして実施した。トランスフェクション後三〜七(3〜7)日目に、融合タンパク質を含む細胞培養上清を回収した。精製するまで、上清を低温(例えば-80℃)で保存した。
Claims (13)
- 少なくとも2つのポリペプチドドメインを含むポリペプチドを作製するための方法であって、
-(a)C末端の小胞体保留シグナルを有する黄色ブドウ球菌(S. aureus)可溶性ソルターゼAをコードする核酸、
(b)ソルターゼモチーフとそれに続く小胞体保留シグナルをそのC末端に含む第1のポリペプチドドメインをコードする核酸、および
(c)少なくともジグリシンをそのN末端に含む第2のポリペプチドドメインをコードする核酸
を含む細胞を培養する段階
を含み、
該細胞が、該第1のポリペプチドドメインおよび該第2のポリペプチドドメインのソルターゼA結合体を分泌し、
それによって、少なくとも2つのポリペプチドドメインを含むポリペプチドを作製する、方法。 - 少なくとも2つの結合実体を含む多重特異性結合物質(multispecific binder)を作製するための方法であって、
-(a)C末端の小胞体保留シグナルを有する黄色ブドウ球菌可溶性ソルターゼAをコードする核酸、
(b)ソルターゼモチーフとそれに続く小胞体保留シグナルをそのC末端に含む第1の結合実体をコードする核酸、および
(c)少なくともジグリシンをそのN末端に含む第2の結合実体をコードする核酸
を含む細胞を培養する段階
を含み、
該細胞が、該第1の結合実体および該第2の結合実体のソルターゼA結合体を分泌し、
該第1の結合実体が、第1の抗原または第1の標的に特異的に結合し、かつ該第2の結合実体が、第2の抗原または第2の標的に特異的に結合し、
それによって、少なくとも2つの結合実体を含む多重特異性結合物質を作製する、方法。 - 2つの異なるエピトープまたは抗原に特異的に結合する多重特異性結合物質を選択するための方法であって、
-第1の結合実体および第2の結合実体の様々な組合せを含む多重特異性結合物質の多数群より、2つの異なるエピトープまたは抗原に特異的に結合する多重特異性結合物質を選択する段階
を含み、
該多重特異性結合物質の多数群のメンバーがそれぞれ、請求項2記載の方法によって得られる、方法。 - 多重特異性結合物質が、その結合特異性および/または選択性および/または親和性および/またはエフェクター機能および/またはインビボ半減期に基づいて選択されることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- 前記結合実体が、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメインの同種の対であることを特徴とする、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性結合物質が、2つまたは4つの結合実体を含む二重特異性抗体であることを特徴とする、請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のポリペプチドドメインおよび前記第2のポリペプチドドメインが、互いに独立して完全長抗体、scFv、scFab、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖Fc領域断片、抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの対、VH、VL、CH1、CH2、CH3、CH4、CL、抗体ヒンジ領域、サイトカイン、受容体、受容体リガンド、検出可能な標識、タグ、ならびに、結合対のパートナーより選択されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記小胞体保留シグナルがSEQ ID NO: 02(KDEL)、SEQ ID NO: 03(HDEL)、またはSEQ ID NO: 04(SFIXXXXMP)より選択されることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ソルターゼモチーフがLPXTG(SEQ ID NO: 01、Xは任意のアミノ酸残基であってよい)であることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 結合している前記第1のドメイン、または前記第1の結合実体が、20個のC末端アミノ酸残基内にアミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO: 01、Xは任意のアミノ酸残基であってよい)を有することを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が哺乳動物細胞または酵母細胞であることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞がHEK細胞、CHO細胞、またはBHK細胞より選択されることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 二重特異性抗体を選択するための方法であって、
(i)細胞を含む試料中に存在する細胞表面マーカーを決定し、かつそれらから少なくとも第1の表面マーカーおよび第2の表面マーカーを選択する段階、
(ii)(a)20個のC末端アミノ酸残基内にアミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO: 01、Xは任意のアミノ酸残基であってよい)とそれに続く小胞体保留シグナルKDEL(SEQ ID NO: 02)を含む抗体Fab断片または抗体scFabまたはscFv抗体をコードする核酸であって、該Fab断片または該scFv抗体が該第1の表面マーカーまたはそのリガンドに特異的に結合する、核酸、(b)完全長抗体重鎖、完全長抗体軽鎖、および抗体重鎖Fc領域ポリペプチドを含む一アーム抗体断片をコードする核酸であって、該完全長抗体重鎖および該完全長抗体軽鎖が互いに相補的な同種の抗体鎖であり、かつそれらの可変ドメイン(VHおよびVL)の対が、該第2の表面マーカーまたはそのリガンドに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、該完全長抗体重鎖および該抗体重鎖Fc領域ポリペプチドが、抗体ヒンジ領域を形成している1つまたは複数のジスルフィド結合によって互いに共有結合的に連結されており、かつ該抗体重鎖Fc領域ポリペプチドがそのN末端にオリゴグリシンGm(m=2または3または4または5)アミノ酸配列を有している、核酸、ならびに(c)C末端の小胞体保留シグナルを有する黄色ブドウ球菌可溶性ソルターゼAをコードする核酸を、細胞にトランスフェクトする段階
を含み、
かつそれによって、該二重特異性抗体を作製する、方法。
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