MX2015002407A

MX2015002407A - Metodo para produccion y seleccion de moleculas que comprenden al menos dos entidades diferentes y usos del mismo.

Info

Publication number: MX2015002407A
Application number: MX2015002407A
Authority: MX
Inventors: Georg Tiefenthaler; Mariel Beck
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2012-09-14
Filing date: 2013-09-12
Publication date: 2015-06-22
Also published as: EP2895496B1; BR112015003938A8; BR112015003938A2; HK1210189A1; CN104619715B; US9862779B2; JP6405311B2; KR20150052085A; JP2016500511A; SG11201500881XA; US20150291704A1; WO2014041072A1; CA2879499A1; RU2646159C2; EP2895496A1; RU2015111708A; CN104619715A

Abstract

Se reporta en la presente un método para producir un polipéptido que comprende al menos dos dominios de polipéptido, que comprende la etapa de cultivar una célula que comprende (a) un ácido nucleico que codifica para una sortasa A de S. aureus soluble con una señal de retención en retículo endoplásmico C-terminal, (b) un ácido nucleico que codifica para un primer dominio de polipéptido que comprende en su extremo C-terminal un motivo de sortasa seguido por una señal de retención en retículo endoplásmico, y (c) un ácido nucleico que codifica para un segundo dominio de polipéptido que comprende en su extremo N-terminal al menos una diglicina, con lo cual la célula secreta el conjugado de sortasa A del primer dominio de polipéptido y el segundo dominio de polipéptido, produciendo así un polipéptido que comprende al menos dos dominios del polipéptido.

Description

MÉTODO PARA PRODUCCIÓN Y SELECCIÓN DE MOLÉCULAS QUE COMPRENDEN AL MENOS DOS ENTIDADES DIFERENTES Y USOS DEL MISMO CAMPO DE LA INVENCIÓN En la presente se describe un metodo para producir y seleccionar moléculas formadas por la combinación de dos entidades diferentes, tales como entidades de unión, entidades efectoras o cargas útiles, al usar una transpeptidasa, tal como sortasa A, en donde las por lo menos dos entidades diferentes son unidas in vivo. Esto se ha logrado al añadir una señal de retención en retículo endoplásmico a la sortasa y a una de las entidades.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Durante los años pasados, una amplia variedad de proteínas terapéuticas específicas, incluyendo anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y ligandos para receptores de superficie celular han sido desarrollados y clínicamente probados. Ejemplos de proteínas son anticuerpos, conjugados de región Fe o vehículos de suministro dirigidos. Algunas de estas proteínas terapéuticas han sido conjugadas a varias clases de toxinas terapéuticas tales como fármacos de molécula pequeña, enzimas, radioisótopos, toxinas proteicas y otras toxinas para suministro específico a pacientes.

El suministro específico al sitio de enfermedad es un prerrequisito para alta eficacia y baja toxicidad de Ref.253726 cualquier molécula terapéutica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden participar en este contexto. Si el anticuerpo no es el principio terapéutico en sí, la conjugación de una molécula efectora a un anticuerpo hace posible lograr una ubicación precisa del fármaco en el sitio deseado dentro del cuerpo humano. Esto incrementa la concentración efectiva de fármaco dentro de esta área objetivo, optimizando de esta manera la eficacia terapéutica del agente. Además, con el suministro dirigido, el médico puede ser capaz de reducir la dosis total del agente terapéutico y, de esta manera, minimizar la exposición sistémica - algo que es particularmente relevante si la carga útil de fármaco tiene toxicidades asociadas o si éste va a ser usado en el tratamiento de condiciones crónicas (véase, por ejemplo, McCarron, P.A., et al., Mol. Interventions 5 (2005) 368-380).

En WO 2010087994 se reportan métodos para ligación y usos de los mismos. Enfoques recombinantes a anticuerpos biespecíficos tipo IgG son reportados por Marvin J.S., et al. (Acta Pharmacol. Sínica 26 (2005) 649-658). Levary, D.A., et al. (PLoS one, 6 (2011) el8342.l-el8342.6) reportan la fusión de proteína-proteína catalizada por sortasa A. En WO 2013/003555 se reporta el uso de sortasas para instalar asas de química clic para ligación de proteínas.

Strijbis, K. et al (Traffic 13 (2012) 780-789) reportan la ligación de proteínas en células vivas usando sortasa. Se ha declarado por ellos que la sortasa A de S. aureus dependiente de Ca2+ no es funcional intracelularmente, pero que la sortasa A de S. pyogenes indepndiente de Ca2+ es funcional en el sitosol y retículo endoplásmico (ER) del lumen de células tanto de Saccharomyces cerevisiae como HEK293T de mamífero.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En la presente se reporta un método para producir in vivo intracelularmente un conjugado catalizado por enzima (es decir, enzimático) de un primer dominio de polipéptido con un segundo dominio de polipéptido usando la enzima sortasa A dependiente de Ca2+ de Staphylococcus aureus ( S. aureus) , con lo cual uno de los dominios de polipéptidos y la enzima sortasa A soluble contienen una secuencia de señal de retención en retículo endoplásmico.

Esta teenología es especialmente adecuada para la generación rápida, por ejemplo, de una biblioteca de combinaciones de un primer grupo de dominios de polipéptido (por ejemplo, un primer grupo de dominios de unión tales como pares cognados de dominios variables de anticuerpo) y un segundo grupo de dominios de polipéptido (por ejemplo, un segundo grupo de dominios de unión tales como pares cognados de dominios variables de anticuerpo pero dirigido contra otros epítopos/antígenos que aquellos del primer grupo, o un grupo de moléculas de carga útil). Esta biblioteca puede ser fácilmente generada, ppoorr eejjeemmpplloo,, por transfección transitoria en células HEK y las combinaciones resultantes pueden ser tamizadas posteriormente, por ejemplo, para el efecto biológico deseado o propiedades deseadas.

Un aspecto como el reportado en la presente es un método para producir un polipéptido que comprende al menos dos dominios de polipéptido que comprenden la etapa de: - cultivar una célula que comprende a) un ácido nucleico que codifica para una sortasa A soluble con una señal de retención en retículo endoplásmico del extremo C-terminal, b) un ácido nucleico que codifica para un primer dominio de polipéptido que comprende en su extremo C-terminal o en su región C-terminal un motivo de sortasa seguido por una señal de retención en retículo endoplásmico, y c) un ácido nucleico que codifica para un segundo dominio de polipéptido que comprende en su extremo N-terminal un motivo de oligoglicina de al menos dos residuos de glicina, con lo cual la célula secreta el conjugado (mediado/catalizado) de sortasa A del primer dominio de polipéptido y el segundo dominio de polipéptido, produciendo de esta manera un polipéptido que comprende al menos dos dominios de polipéptido.

Un aspecto como el reportado aquí es un método para producir un aglutinante multiespecífico, que comprende al menos dos entidades de unión que comprende la etapa de - cultivar una célula que comprende a) un ácido nucleico que codifica para una sortasa A soluble con una señal de retención en retículo endoplásmico del extremo C-terminal, b) un ácido nucleico que codifica para una entidad de unión que comprende en su extremo C-terminal o en su región C-terminal un motivo de sortasa seguida por una señal de retención en retículo endoplásmico, y c) un ácido nucleico que codifica para una segunda entidad de unión que comprende en su extremo N-terminal al menos una diglicina, con lo cual la célula secreta el conjugado (mediado/catalizado) por sortasa A de la primera entidad de unión y la segunda entidad de unión, con lo cual la primera entidad de unión se une específicamente a un primer antígeno u objetivo y la segunda entidad de unión se une específicamente a un segundo antígeno u objetivo, produciendo así un aglutinante multiespecífico que comprende por lo menos dos entidades de unión.

En una modalidad de todos los aspectos está la sortasa A la sortasa A de Staphylococcus aureus ( S . aureus) .

En una modalidad el ácido nucleico que codifica para una sortasa A (soluble) con una señal de retención en retículo endoplásmico C-terminal codifica para una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 52.

En la presente se reporta un método para proporcionar moléculas terapéuticas altamente específicas y hechas a la medida para el tratamiento de una enfermedad, tal como cáncer o una infección viral, en un paciente que requiera de un tratamiento, con lo cual la molécula terapéutica está adaptada a las características de la enfermedad del paciente y/o al genotipo/fenotipo del paciente.

Esta adaptación se logra al hacer una molécula hecha a la medida tomando en cuenta el genotipo/fenotipo de las células afectadas/portadoras de enfermedad del paciente.

En una primera etapa el genotipo/fenotipo de las células (por ejemplo, la presencia y número/cantidad de moléculas de superficie celular específicas de enfermedad) que se desean dirigir con la molécula terapéutica es determinado. Esto se puede lograr, por ejemplo, por téenicas de proyección de imágenes de células tales como tinción inmunohistoquímica (IHC, inmunohistoquímica) de células de paciente derivadas por ejemplo de sangre y/o material de biopsia usando anticuerpos monoespecíficos (terapéuticos o de diagnóstico) marcados fluorescentemente. Como alternativa, el genotipo/fenotipo de las células puede analizarse después de tinción con anticuerpos terapéuticos o de diagnóstico marcados usando métodos a base de FACS. Las téenicas de proyección de imágenes in vivo incluyendo proyección de imágenes óptica, proyección de imagen molecular, proyección de imágenes por fluorescencia, proyección de imágenes de bioluminiscencia, MRI, PET, SPECT, CT y microscopía intravital pueden usarse también para la determinación del genotipo/fenotipo de células relacionadas con la enfermedad de un paciente. Dependiendo del genotipo/fenotipo determinado de las células relacionadas con la enfermedad de un paciente una combinación hecha a la medida de entidades de dirección/unión se puede seleccionar y se combina en una molécula terapéutica. Esta molécula terapéutica puede ser por ejemplo un anticuerpo biespecífico.

Tales moléculas terapéuticas hechas a la medida i) serán altamente específicas, ii) tendrán una buena eficacia terapéutica, y iii) inducirán menos efectos secundarios y/o efectos secundarios menos severos, en comparación con los terapéuticos seleccionados convencionalmente. Esto se puede lograr al equipar a la molécula terapéutica con propiedades de dirección mejoradas y/o suministro hechas a la medida, por ejemplo, para el suministro de una carga útil terapéutica a su sitio de acción deseado.

El suministro mejorado de la molécula terapéutica a su sitio de acción, tal como por ejemplo una célula cancerosa, se puede lograr por una selectividad y/o especificidad más alta/incrementada para la molécula terapéutica seleccionada en comparación con las moléculas terapéuticas seleccionadas convencionalmente. La molécula terapéutica comprende al menos dos entidades que se unen específicamente a o pueden ser unidas por diferentes proteínas (por ejemplo, dos marcadores de superficie celular diferentes).

La selectividad y/o especificidad incrementada de la molécula terapéutica hecha a la medida pueden lograrse por la unión simultánea de ambas entidades de dirección a sus respectivos objetivos/epítopos o por la unión simultánea de ambos dominios de polipéptido por su socio de interacción, o por mezclas de los mismos.

Especialmente adecuada es la combinación de dos entidades de unión que tienen una afinidad baja a media por sus respectivos objetivos/epítopos. Además, la unión fuera de objetivo se reduce ampliamente o puede ser incluso eliminada totalmente.

Se ha encontrado que con el método reportado en la presente es posible hacer a la medida, por ejemplo, aglutinantes biespecífíeos tales como anticuerpos biespecíficos dirigidos específicamente a dos marcadores de superficie encontrados sobre la superficie de una célula, tal como una cancerosa. Ya que las especificidades de unión se proporcionan individualmente por los componentes de partida, es posible hacer a la medida una molécula de dirección y unión multiespecífica simplemente al determinar los marcadores en superficie presentes en una célula, por ejemplo, en una célula cancerosa, y conjugando los respectivos fragmentos de anticuerpo que se unan específicamente a estos marcadores de superficie o a sus ligandos respectivos por un procedimiento enzimático. Ya que la conjugación enzimática se lleva a cabo por la enzima sortasa A, en una modalidad por la sortasa A de S. aureus, el aglutinante biespecífico (anticuerpo biespecífico) resultante se caracteriza por la presencia de la secuencia de aminoácidos LPXTG (SEQ ID NO: 01, en donde X puede ser cualquier residuo de aminoácido).

Un aspecto como el reportado en la presente es un método para seleccionar un aglutinante multiespecífico que se une específicamente a dos epítopos o antígenos diferentes, que comprende la etapa de seleccionar de una multitud de aglutinantes multiespecíficos que comprenden diferentes combinaciones de una primera entidad de unión y una segunda entidad de unión un aglutinante multiespecífico que se una específicamente a dos epítopos o antígenos diferentes.

Un aspecto como el reportado aquí es un método para seleccionar un anticuerpo biespecífico, que comprende las siguientes etapas: (i) determinar los marcadores de superficie celular presentes en una célula que contenga muestra y seleccionar los mismos al menos en un primer marcador de superficie y un segundo marcador de superficie, (ii) transfectar una célula con (a) un ácido nucleico que codifique para un anticuerpo Fab, o fragmento scFab, o un anticuerpo scFv que comprenda dentro de los 20 residuos de aminoácidos C-terminales la secuencia de aminoácidos LPXTG (SEQ ID NO: 01, en donde X puede ser cualquier residuo de aminoácidos) seguido por una señal de retención en retículo endoplásmico KDEL (SEQ ID NO: 02), con lo cual el fragmento Fab o scFab, o anticuerpo scFv se une específicamente al primer marcador de superficie o su ligando, (b) un ácido nucleico que codifica para un fragmento de anticuerpo de un brazo que comprende una cadena pesada de anticuerpo de longitud completa, una cadena ligera de anticuerpo de longitud completa y un polipéptido de la región Fe de la cadena pesada de anticuerpo, en donde la cadena pesada de anticuerpo de longitud completa y la cadena ligera de anticuerpo de longitud completa son cadenas de anticuerpo cognadas complementarias entre sí y el par de dominios variables (VH y VL) de las mismas forma un sitio de unión a antígeno que se une específicamente al segundo marcador superficial o su ligando, con lo cual la cadena pesada de anticuerpo de longitud completa y el polipéptido de región Fe de la cadena pesada de anticuerpo se enlazan covalentemente entre sí por medio de uno o más enlaces de disulfuro formando una región de bisagra de anticuerpo, y con lo cual el polipéptido de la región Fe de la cadena pesada de anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos de oligoglicina Gra (m = 2, o 3, o 4, o 5) en su extremo N-terminal, y (c) un ácido nucleico que codifica para una sortasa A soluble con una señal de retención en retículo endoplásmico C-terminal, y produciendo de esta manera el anticuerpo biespecífico.

Un aspecto como el reportado en la presente es un método para determinar una combinación de sitios de unión a antígeno que comprenden las siguientes etapas: (i) determinar la especificidad y/o selectividad y/o afinidad de unión y/o función efectora y/o vida media in vivo de una multitud de anticuerpos biespecíficos preparados al combinar (a) cada miembro de una primera multitud de anticuerpo Fab, o fragmentos scFab, o fragmentos de anticuerpo scFv con lo cual cada miembro comprende dentro de los 20 residuos de aminoácido C-terminales la secuencia de aminoácidos LPXTG (SEQ ID NO: 01, en donde X puede ser cualquier residuo de aminoácido) seguida por una señal de retención en retículo endoplásmico KDEL (SEQ ID NO: 02), con lo cual el Fab, o el fragmento scFab o anticuerpo scFv se une específicamente a un primer epítopo o antígeno, con (b) cada miembro de una multitud de fragmento de anticuerpo de un brazo que comprende una cadena pesada de anticuerpo de longitud completa, una cadena ligera de anticuerpo de longitud completa y un polipéptido de región Fe de la cadena pesada de anticuerpo, con lo cual la cadena pesada de anticuerpo de longitud completa y la cadena ligera de anticuerpo de longitud completa son cadenas de anticuerpo cognadas complementarias entre sí y el par de dominios variables (VH y VL) de las mismas forma un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un segundo epítopo o antígeno, con lo cual la cadena pesada de anticuerpo de longitud completa y el polipéptido de región Fe de cadena pesada de anticuerpo se enlaza covalentemente entre sí por medio de uno o más enlaces de disulfuro formando una región de bisagra de anticuerpo, y con lo cual el polipéptido de la región Fe de la cadena pesada de anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos de oligoglicina Gm (m = 2, o 3, o 4, o 5) en su extremo N-terminal, covalentemente por una reacción enzimática catalizada por sortasa A, y (ii) seleccionar el anticuerpo biespecífico con especificidad y/o selectividad y/o afinidad de unión y/o función efectora y/o vida media in vivo adecuada y determinar de esta manera una combinación de sitios de unión a antígeno.

En una modalidad de todos los aspectos está la sortasa A la sortasa A de Staphylococcus aureus { S. aureus) . En una modalidad el ácido nucleico que codifica para una sortasa A (soluble) con una señal de retención en retículo endoplásmico C-terminal codifica para una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 52.

Un aspecto como el reportado aquí es un anticuerpo biespecífico obtenido por un método como el reportado en la presente.

Un aspecto como el reportado en la presente es un anticuerpo biespecífico que comprende la secuencia de aminoácidos LPXTG (SEQ ID NO: 01, en donde X puede ser cualquier residuo de aminoácido) en una de sus cadenas pesadas.

En las siguientes modalidades de todos los aspectos según se reporta en la presente son dadas.

En una modalidad los miembros de la multitud de aglutinantes multiespecíficos se obtienen cada uno por un método como el reportado en la presente.

En una modalidad un aglutinante multiespecífico se selecciona con base en su especificidad y/o selectividad y/o afinidad de unión y/o función efectora y/o vida media in vivo.

En una modalidad la entidad de unión es un cognado de un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo.

En una modalidad el aglutinante multiespecífico es un anticuerpo biespecífico que comprende dos o cuatro entidades de unión.

En una modalidad el primer dominio de polipéptido y el segundo dominio de polipéptido se seleccionan independientemente unos de otros a partir de anticuerpo de longitud completa, scFv, scFab, cadena pesada de anticuerpo, cadena ligera de anticuerpo, fragmento de región Fe de cadena pesada de anticuerpo, par de dominio variable de cadena ligera de anticuerpo y dominio variable de cadena pesada de anticuerpo, fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno, VH, VL, CH1, CH2, CH3, CH4, CL, región de bisagra de anticuerpo, citosina, receptor, ligando receptor, marcador detectable, etiqueta y socio de un par de unión.

En una modalidad la señal de retención en retículo endoplásmico se selecciona de SEQ ID NO: 02 (KDEL), SEQ ID NO: 03 (HDEL), O SEQ ID NO: 04 (SFIXXXXMP).

En una modalidad el motivo de sortasa es LPXTG (SEQ ID NO: 01, en donde X puede ser cualquier residuo de aminoácido).

En una modalidad el primer dominio de unión o la primera entidad de unión está dentro de los 20 residuos de aminoácido C-terminales de la secuencia de aminoácidos LPXTG (SEQ ID NO: 01, en donde X puede ser cualquier residuo de aminoácido).

En una modalidad la célula es una célula de mamífero o una célula de levadura. En una modalidad la célula de mamífero se selecciona de una célula HEK, una célula CHO o una célula BHK.

En una modalidad la región Fe comprende una mutación del residuo de aminoácido de origen natural en la posición 329 y al menos de una mutación adicional de al menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende residuos de aminoácido en la posición 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322 y 331 a un residuo diferente, en donde los residuos en la región Fe son numerados de acuerdo con el índice EU de Kabat. El cambio de estos residuos de aminoácido específicos se traduce en una alteración de la función efectora de la región Fe en comparación con la región Fe no modificada (tipo salvaje).

En una modalidad la entidad de unión se selecciona de (o la primera entidad de unión y la segunda entidad de unión se seleccionan independientemente entre sí) del grupo de una entidad de unión a base de dominio DARPin, una entidad de unión a base de dominio de anticalina, entidad de unión a base de dominio scTCR tipo fragmento de receptor de células T, una entidad de unión a base de dominio VH de camello, una entidad de unión a base de dominio del décimo dominio de fibronectina 3, una entidad de unión a base de un dominio de tenascina, una entidad de unión a base de dominio de caderina, una entidad de unión a base de dominio ICAM, una entidad de unión a base de dominio titin, una entidad de unión a base de dominio GCSF-R, una entidad de unión a base de dominio receptor de citosina, una entidad de unión a base de dominio inhibidor de glicosidasa, una entidad de unión a base de dominio de superóxido dismutasa o fragmentos de anticuerpo tales como fragmento Fab, o scFab o scFv.

En una modalidad el primer dominio de polipéptido comprende i) la secuencia de aminoácidos LPXTG (SEQ ID NO: 01, en donde X puede ser cualquier residuo de aminoácido) en su región de la secuencia de aminoácidos C-terminal (es decir, dentro de los veinte residuos de aminoácido C-terminales) y ii) la señal de retención en retículo endoplásmico KDEL (SEQ ID NO: 02) en su extremo C-terminal, y el segundo dominio de polipéptido comprende una oligoglicina Gm (m = 2, o 3, o 4, o 5) en su extremo N-terminal.

En una modalidad el segundo dominio de polipéptido o la segunda entidad de unión comprende una secuencia de aminoácidos de oligoglicina Gm (m = 2, o 3, o 4, o 5) en su extremo N-terminal.

Un aspecto como el reportado en la presente es una formulación farmacéutica que comprende un aglutinante multiespecífico como el reportado en la presente.

Un aspecto como el reportado en la presente es el uso de un aglutinante multiespecífico como el reportado aquí en la fabricación de un medicamento.

En una modalidad el medicamento es para el tratamiento de cáncer.

Un aspecto como el reportado en la presente es un método para tratar a un individuo que tenga cáncer, que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un aglutinante multiespecífico como el reportado en la presente.

Un aspecto como el reportado en la presente es un método para destruir células cancerosas en un individuo', que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un aglutinante multiespecífico como el reportado aquí.

Un aspecto como el reportado en la presente es una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico como el reportado aquí.

Un aspecto como el reportado en la presente es el uso de un anticuerpo biespecífico como el reportado en la presente en la fabricación de un medicamento.

En una modalidad el medicamento es para el tratamiento de cáncer.

Un aspecto como el reportado en la presente es un método para tratar a un individuo que tenga cáncer, que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un anticuerpo biespecífico como el reportado aquí.

Un aspecto como el reportado en la presente es un método para destruir células cancerosas en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un anticuerpo biespecífico como el reportado en la presente. En una modalidad de todos los aspectos como los reportados aquí la región Fe es una región Fe humana o una variante de la misma.

En una modalidad la región Fe de anticuerpo humano es de la subclase IgGl humana, o de la subclase IgG2 humana, o de la subclase IgG3 humana o de la subclase IgG4 humana.

En una modalidad la región Fe de anticuerpo es una región Fe de anticuerpo humano de la subclase IgGl humana o de la subclase IgG4 humana.

En una modalidad la región Fe de anticuerpo humano comprende úna mutación del residuo de aminoácido de origen natural al menos en una de las siguientes posiciones de aminoácido 228, 233, 234, 235-, 236, 237, 297, 318, 320, 322, 329 y/o 331 a un residuo diferente, en donde los residuos en la región Fe de anticuerpo son numerados de acuerdo con el índice EU de Kabat.

En una modalidad la región Fe de anticuerpo humano comprende una mutación del residuo de aminoácido de origen natural en la posición 329 y al menos una mutación adicional de al menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende en residuos de aminoácido en la posición 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322 y 331 a un residuo diferente, en donde los residuos en la región Fe son numerados de acuerdo con el índice EU de Kaba . El cambio de . estos residuos de aminoácido específicos se traduce en una alteración de la función efectora de la región Fe en comparación con la región Fe no modificada (tipo salvaje).

En una modalidad la región Fe de anticuerpo humano tiene una afinidad reducida a la FcYRIIIA humana, y/o FcyRIIA, y/o FcyRI en comparación con un conjugado que comprende la región Fe de IgG tipo salvaje correspondiente.

En una modalidad el residuo de aminoácido en la posición 329 en la región Fe de anticuerpo humano es sustituido con glicina, o arginina, o un residuo de aminoácido lo suficientemente grande como para destruir el emparedado de prolina dentro de la región Fe.

En una modalidad la mutación en la región Fe de anticuerpo humano del residuo de aminoácido de origen natural es al menos una de S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, P329G y/o P331S.

En una modalidad la mutación es L234A y L235A si la región Fe de anticuerpo es de la subclase IgGl humana, o S228P y L235E si la región Fe de anticuerpo es de la subclase IgG4 humana.

En una modalidad la región Fe de anticuerpo comprende la mutación P329G.

En una modalidad la región Fe de anticuerpo comprende la mutación T366W en el primer polipéptido de la región Fe de la cadena pesada y las mutaciones T366S, L368A y Y407V en el segundo polipéptido de la región Fe de la cadena pesada, en donde la numeración es de acuerdo con el Indice EU de Kabat.

En una modalidad la región Fe de anticuerpo comprende la mutación S354C en el primer polipéptido de la región Fe de la cadena pesada y la mutación Y349C en el segundo polipéptido de la región Fe de la cadena pesada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 Mapa plasmídico del plásmido de expresión para una sortasa soluble que comprende una señal de retención endoplásmica en su extremo C-terminal.

Figura 2 Gel SDS teñido con Coomassie, condiciones reductoras; sobrenadantes de cultivo de células HEK293 transfectadas con scFab-GS-His6-GS-LPETGGS-KDEL (carril 1), scFab-GS-His6-GAPPPS-LPETGGS-KDEL (carril 2), (GGGGS)2 scFab (carril 3), sortasa soluble A-KDEL (carril 4), combinación 1+3+4 (relaciones de plásmido 2.5:5:1) (carril 5), combinación 2+3+4 (relación de plásmidos 2:8:1) (carril 6); scFab-GS-His6-GS-LPETGGS-KDEL y scFab-GS-His6 -GAPPPS-LPETGGS-KDEL se conservan casi intracelularmente, (GGGGS)2-scFab es expresado y secretado en el medio (aproximadamente 50 kDa), para la combinación una banda a aproximadamente 100 kDa del conjugado enzimático puede ser vista.

Figura 3 Gel SDS teñido con Coomassie, condiciones reductoras; lisados celulares (izquierda) de células HEK293 transfectadas con scFab-GS-His6-GS-LPETGGS-KDEL (carril 1), scFab-GS-His6-GAPPPS-LPETGGS-KDEL (carril 2), (GGGGS)2 scFab (carril 3), sortasa soluble A-KDEL (carril 4), combinación 1+3+4 (relación de plásmido 2.5:5:1) (carril 5), combinación 2+3+4 (relación de plásmido 2:8:1) (carril 6); scFab-GS-His6-GS-LPETGGS-KDEL y scFab-GS-His6-GAPPPS-LPETGGS-KDEL se retienen principalmente de manera intracelular.

Figura 4 Análisis Western blot de un gel SDS usando las muestras idénticas y llevado a cabo bajo condiciones idénticas a los genes de las figuras 2 y 3; las moléculas scFab-LPXTG y el producto de conjugación se detectan con un anticuerpo anti-His marcador (PentaHis-AK (Qiagen)); para la combinación se puede ver una banda en aproximadamente 100 kDa del conjugado enzimático.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I. Definiciones En la presente descripción y reivindicaciones la numeración de los residuos en una región Fe de la cadena pesada de inmunoglobulina es aquella del índice EU de kabat (Kabat E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), N1H Publication 91-3242, incorporado expresamente en la presente por referencia.

El término "alteración" indica la mutación, adición o supresión de uno o más residuos de aminoácido en una secuencia de aminoácidos progenitora.

El término "marcador" indica una secuencia de residuos de aminoácido conectadas entre sí por medio de enlaces péptidos que tiene propiedades de unión específicas. En una modalidad el marcador es un marcador de afinidad o purificación. En una modalidad el marcador se selecciona de marcador Arg, marcador His, marcador Flag, marcador 3xFlag, marcador Strep, marcador Nano, marcador SBP, marcador c-myc, marcador S, péptidos de unión a calmodulina, dominio de unión a celulosa, dominio de unión a quitina, marcador GST o marcador MPB. En una modalidad el marcador se selecciona de SEQ ID NO: 05 (RRRRR), o SEQ ID NO: 06 (RRRRRR), o SEQ ID NO: 07 (HHHHHHH), o SEQ ID NO: 08 (KDHL1HNVHKEFHAHAHNK), O SEQ ID NO: 09 (DYKDDDDK), o SEQ ID NO: 10 (DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK), o SEQ ID NO: 11 (AWRHPQFGG), o SEQ ID NO: 12 (WSHPQFEK), o SEQ ID NO: 13 (MDVEAWLGAR), o SEQ ID NO: 14 (MDVEAWLGARVPLVET), o SEQ ID NO: 15 (MDEKTTGWRGGHW EGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP), o SEQ ID NO: 16 (EQKLISEEDL), o SEQ ID NO: 17 (KETAAAKFERQHMDS), o SEQ ID NO: 18 (KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL), o SEQ ID NO: 19 (dominio de unión a celulosa o SEQ ID NO: 20 (dominio de unión a celulosa) o SEQ ID NO: 21 (TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQ), o SEQ ID NO: 22 (marcador GST) o SEQ ID NO: 23 (marcador MBP).

El término "fragmento de anticuerpo de unión a antígeno" indica una molécula que no es un anticuerpo de longitud completa que comprende una porción de un anticuerpo de longitud completa que se une al antígeno al cual se une el anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no están limitados a Fv, scFv, Fab, scFab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena individual (por ejemplo, scFv) y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no están limitados a, fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv y scFv, y otros fragmentos descritos abajo. Para una revisión de ciertos fragmentos de anticuerpo, véase Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134. Para una revisión de fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Plueckthun, A., In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, volumen 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, Nueva York (1994), páginas 269-315; véase, por ejemplo, WO 93/16185; US 5,571,894 y US 5,587,458. Para la discusión de fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos de epítopo de unión al receptor salvaje y que tienen vida media ín vivo incrementada, véase US 5,869,046.

Los fragmentos de anticuerpo pueden hacerse por varias téenicas, incluyendo pero no limitadas a digestión o corte proteolítico de un anticuerpo intacto así como la producción por células hospederas recombinantes (por ejemplo, células de E. coli o de fago o eucarióticas), como se describe en la presente.

El término "anticuerpo biespecífico" significa una molécula de unión a antígeno que puede unirse específicamente a un primer antígeno o epítopo y a un segundo antígeno o epitopo con lo cual el primer antígeno o epítopo es diferente del segundo antígeno o epítopo.

Los formatos de anticuerpo biespecíf icos se describen, por ejemplo, en WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 y WO 2010/145793.

El término "clase" de un anticuerpo indica el tipo de dominio constante o región constante poseído por su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos en humanos: IgA, IgD, igE, IgG, E IgM, y varias de éstas pueden dividirse más en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Los segmentos clínicos que codifican para los dominios constantes de la cadena que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas son llamados a, d, e, g y m, respectivamente. Además, existen dos clases de cadenas ligeras presentes en anticuerpos de origen humano kappa y lambda las cuales forman anticuerpos intactos en combinación con sus socios de cadena pesada cognados. Los genes que codifican para las cadenas ligeras kappa o lambda son llamados K y l, respectivamente.

El término "función efectora" significa aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe de un anticuerpo, las cuales varían con la clase y/o subclase de anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a Clq y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC),- unión al receptor Fe; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP); regulación descendente de receptores en superficie celular (por ejemplo, receptor de células B); y activación de células B. Esta función puede ser afectada, por ejemplo, la unión de una región Fe a un receptor Fe en una célula inmune con actividad fagocítica o lítica, o por la unión de una región Fe a componentes del sistema de complemento.

Una "cantidad efectiva" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

El término "región Fe" significa la región C- terminal de una inmunoglobulina. La región Fe es una molécula dimérica que comprende dos fragmentos de la cadena pesada de anticuerpo enlazados por disulfuro (cadenas de polipéptidos de la región Fe de la cadena pesada). Una región Fe puede ser generada por digestión con papaína, o digestión con IdeS, o digestión con tripsina de un anticuerpo intacto (longitud completa) o se puede producir de manera recombinante.

La región Fe que puede obtenerse de un anticuerpo de longitud completa o inmunoglobulina comprende al menos los residuos 226 (Cys) hacia el extremo C-terminal de la cadena pesada de longitud completa y, de esta manera, comprende una parte de la región de bisagra y dos o tres dominios de la región constante, es decir, un dominio CH2, un dominio CH3 y un dominio CH4 adicional/extra en el caso de los anticuerpos de clase IgE e IgM. Se conoce de US 5,648,260 y US 5,624,821 que la modificación de residuos de aminoácido definidos en la región Fe resulta en efectos fenotípicos.

La formación de la región Fe dimérica que comprende dos fragmentos de cadena pesada de anticuerpo idénticos o no idénticos es mediada por la dimerización no covalente de los dominios CH3 comprendidos (para los residuos de aminoácido implicados véase, por ejemplo, Dall'Acqua, Biochem, 37 (1998) 9266-9273). La región Fe es estabilizada covalentemente por la formación de enlaces de disulfuro en la región de bisagra (véase, por ejemplo, Huber, et al . , Nature 264 (1976) 415-420; Thies, et al . , J. Mol. Biol.293 (1999) 67-79). La introducción de cambios en residuos de aminoácido dentro del dominio CH3 para poder interrumpir la dimerización de las interacciones con el dominio CH3-CH3 no afectan adversamente la unión al receptor Fe neonato (FcRn) gracias a la ubicación de los residuos implicados en la dimerización del dominio CH3-CH3 los cuales se ubican en la interfaz interior de los dominios CH3, mientras que los residuos implicados en la interacción región Fc-FcRn se ubican fuera de los dominios CH2-CH3.

Los residuos asociados con funciones efectoras de una región Fe se ubican en la región de bisagra, los dominios CH2 y/o CH3 según se determina para una molécula de anticuerpo de longitud completa. Las funciones asociadas/mediadas por región Fe son: (i) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), (ii) unión a complemento (Clq), activación y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), (iii) fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP) (iv) fagocitosis/depuración de complejos antígeno anticuerpo (complejos inmunes), (v) liberación de citosina en algunos casos, y (vi) vida media/velocidad de depuración de anticuerpo y complejos antígeno-anticuerpo.

Las funciones efectoras asociadas a región Fe son desencadenadas/iniciadas por la interacción de la región Fe con moléculas o receptores específicos de función efectora. Predominantemente los anticuerpos de la subclase IgGl pueden efectuar la activación de receptor, mientras que los anticuerpos de las subclases IgG2 e IgG4 no tienen función efectora o tienen función efectora limitada.

Los receptores que provocan función efectora son los tipos de receptor Fe (y sub-tipos) FC7RI, Fc7R.II y FC7RIII. Las funciones efectoras asociadas con una subclase de IgGl pueden reducirse al introducir cambios de aminoácido específicos en la región de bisagra inferior, tales como L234A y/o L235A, los cuales están implicados en FcTR y la unión a Clq. Asimismo, ciertos residuos de aminoácido, especialmente ubicados en los dominios CH2 y/o CH3, están asociados con el control de la vida media en circulación de una molécula de anticuerpo o un polipéptido de fusión a la región Fe en el torrente sanguíneo. La vida media en circulación es determinada por la unión de la región Fe al receptor Fe neonato (FcRn).

El término "región Fe humana" significa la región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina de origen humano que contiene al menos una parte de la región de bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3. En una modalidad, una región Fe de la cadena pesada de anticuerpo IgG humano se extiende desde aproximadamente Glu216, o alrededor de Cys226, o de aproximadamente Pro230, hasta el extremo carboxilo-terminal de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C-terminal (Lys447) de la región Fe de anticuerpo puede o no estar presente.

Una cadena de polipéptido de una región Fe humana tipo salvaje de la subclase IgGl tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKS RWQQGNVFS C S VMHE ALHNH YTQKS L S L S PGK (SEQ ID NO : 24 ) .

Una cadena de polipéptidos de una región Fe humana tipo salvaje de la subclase IgG4 tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: CPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSQEDPEVQFN YVDGVEVHN AKTKPREEQFNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 25).

El término "anticuerpo de longitud completa" significa un anticuerpo que tiene una estructura y secuencia de aminoácidos sustancialmente idénticas a las de una estructura de anticuerpo nativa así como a polipéptidos que comprenden la región Fe como la reportada en la presente.

El término "cadena pesada de anticuerpo de longitud completa" significa un polipéptido que comprende en dirección N- a C-terminal un dominio variable de anticuerpo, un primer dominio constante, una región de bisagra de la cadena pesada de anticuerpo, un segundo dominio constante y un tercer dominio constante, y en algunos casos un cuarto dominio constante.

El término "región Fe de la cadena pesada de anticuerpo" significa un polipéptido que comprende una región de bisagra de la cadena pesada de anticuerpo, un primer dominio constante (normalmente el dominio CH2) y un segundo dominio constante (normalmente un dominio CH3).

El término "dominio CH2" significa la parte de un polipéptido de cadena pesada de anticuerpo que se extiende aproximadamente desde la posición EU 231 hasta la posición EU 340 (sistema de numeración EU de acuerdo con Kabat). En una modalidad un dominio CH2 tiene la secuencia de aminoácidos de: SEQ ID NO: 26 (APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQESTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK). El dominio CH2 es único toda vez que no está estrechamente aparejado con otro dominio. Más bien, dos cadenas de carbohidratos ramificadas N-enlazadas son interpuestas entre los dos dominios CH2 de una región Fe nativa intacta. Se ha especulado que el carbohidrato puede proporcionar un sustituto para el apareo dominio-dominio y ayudar a estabilizar el dominio CH2. Burton, Mol. Immunol.22 (1985) 161-206.

El término "dominio CH3" significa la parte de un polipéptido de cadena pesada de anticuerpo que se extiende aproximadamente desde la posición EU 341 hasta la posición EU 446. En una modalidad, el dominio CH3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 (GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVESCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG).

El término "cadena ligera de anticuerpo de longitud completa" significa un polipéptido que comprende en dirección N- a C-terminal un dominio variable de anticuerpo y un dominio constante.

El término "región de bisagra" significa la parte de un polipéptido de cadena pesada de anticuerpo que une en una cadena pesada de anticuerpo tipo salvaje el dominio CH1 y los dominios CH2, por ejemplo, aproximadamente de la posición 216 hasta alrededor de la posición 230 de acuerdo con el sistema de números EU de Kabat, o de aproximadamente la posición 226 a aproximadamente la posición 230 de acuerdo con el sistema de números de EU de Kabat. Las regiones de bisagra de otras subclases de IgG pueden ser determinadas al alinearse con los residuos de cisterna de la región de bisagra de la secuencia de la subclase de IgGl.

La región de bisagra es normalmente un dímero que consiste en dos polipéptidos con secuencia de aminoácidos idéntica. La región de bisagra comprende generalmente alrededor de 25 residuos de aminoácido y es flexible permitiendo que las regiones de unión a antígeno se muevan independientemente entre sí. La región de bisagra puede ser subdividida en tres subdominios: la región de bisagra superior, media e inferior (véase, por ejemplo, Roux, et al., J. Immunol.161 (1998) 4083).

El término "región de bisagra inferior" de una región Fe significa el tramo de residuos de aminoácido inmediatamente C-terminal a la región de bisagra media (central), es decir, residuos 233 a 239 de la región Fe de acuerdo con la numeración EU de Kabat.

El término "región Fe tipo salvaje" significa una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fe encontrada en la naturaleza. Las regiones Fe humanas tipo salvaje incluyen una región Fe de IgG humana nativa (alotipos A y no A), región Fe de IgG2 humana nativa, región Fe de IgG3 humana nativa y región Fe de IgG4 humana nativa así como las variantes de origen natural de las mismas.

El término "individuo" o "sujeto" significa un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no están limitados a, animales domesticados (por ejemplo, vacas, borregos, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, humanos y primates no humanos tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones, ratas, y hámsteres) . En ciertas modalidades, el individuo o sujeto es un humano.

La "identidad de secuencia de aminoácidos porcentual (%)" con respecto a una secuencia de polipéptidos de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido en la secuencia de polipéptidos de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr la identidad de secuencia porcentual máxima, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación de secuencia para efectos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse de varias maneras que están dentro de la capacidad en la téenica, por ejemplo, usando software de computadora disponible comercialmente tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros adecuados para alinear secuencias, incluyendo cualesquiera algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se estén comparando. Para los presentes efectos, sin embargo, los valores de identidad d secuencia de aminoácidos porcentual se generan usando el programa de computadora·de comparación de secuencia ALIGN-2. El programa de computadora para comparación de secuencias ALIGN-2 fue creado por Genentech, Inc., y el código de origen ha sido presentado con documentación de usuario en la oficina de derechos de autor de Estados Unidos, Washington D.C., 20559, en donde se registró con el registro de derechos de autor de E.U.A. No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código de origen. El programa ALIGN-2 debe ser compilado para usarse en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX digital V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencia son establecidos por el programa ALIGN-2 y no varían .

En situaciones en las que se emplea ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A a, con, o contra una secuencia de aminoácidos dada B (que como alternativa se puede llamar una secuencia de -aminoácidos dada A que tenga o comprenda cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos con, para o contra una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos de aminoácido calificados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación de ese programa de A y B, y en donde Y es el número total de residuos de aminoácido en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A. A menos que se indique específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en la presente se obtienen como se describió en el párrafo inmediatamente anterior usando el programa de computadora ALIGN-2.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permita que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea efectiva, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al cual se le administre la formulación.

Un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, que no es un ingrediente activo, el cual no es tóxico para un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, pero no está limitado a, un amortiguador, excipiente, estabilizador o conservador.

El término "fenotipo de un paciente" significa la composición de moléculas/receptores de superficie celular en un tipo de células de un paciente. La composición puede ser una composición cualitativa así como una cuantitativa. Las células para las cuales se determine/de el genotipo pueden ser una sola célula o una muestra que comprenda células.

El término "posición" significa la ubicación de un residuo de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Las posiciones pueden ser numeradas secuencialmente, o de acuerdo con un formato establecido, por ejemplo el índice EU de Kabat para numeración de anticuerpos.

El término "receptor" significa un polipéptido capaz de unirse a por lo menos un ligando. En una modalidad el receptor es un receptor de superficie celular que tiene un dominio de unión aligando extracelular y, opcionalmente, otros dominios (por ejemplo, dominio de transmembrana, dominio intracelular y/o ancla de membrana). El receptor a ser evaluado en el ensayo descrito en la presente puede ser un receptor intacto o un fragmento o derivado del mismo (por ejemplo, una proteína de fusión que comprende el dominio de unión del receptor fusionado a uno o más polipéptido heterólogos). Además, el receptor que será evaluado para sus propiedades de unión puede estar presente en una célula o aislado y opcionalmente recubierto en una placa de ensayo o alguna otra fase sólida.

Según se usa aquí, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo tales como "tratar" o "tratando") se refiere a la intervención clínica en un intento por alterar el curso natural del individuo que esté siendo tratado, y puede llevarse a cabo ya sea para profilaxis o durante el curso de patología clínica. Los efectos deseables de un tratamiento incluyen, pero no están limitados a, evitar la ocurrencia o recurrencia de enfermedad, alivio de síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, reducción de la velocidad de progresión de la enfermedad, disminución o paliación del estado de enfermedad, y remisión o pronóstico mejorado. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

II. Moléculas hechas a la medida que comprenden un primero y un segundo dominio de polipéptido Se ha encontrado que al usar un enfoque modular como el reportado aquí se pueden proporcionar polipéptidos terapéuticos diseñados a la medida. Estos polipéptidos son hechos a la medida con respecto a los dominios de polipéptido de los cuales se forman.

Con esta generación hecha a la medida de terapéuticos al combinar dos dominios de polipéptido, pueden combinarse diferentes modos de acción, tales como dirección doble (combinación de dos entidades de unión, aglutinante biespecífico o multiespecífico), dirección y suministro de carga útil (combinación de entidad de unión (dirección) y entidad efectora (carga útil), tales como conjugados de anticuerpo), o inhibición de receptor combinada (combinación de dos receptores y/o ligandos). Los terapéuticos resultantes son moléculas terapéuticas individuales que llevan a cabo simultáneamente los modos de acción de los dominios de polipéptido individuales. Con los mismos, por ejemplo, el efecto aditivo/sinérgico se espera en comparación con moléculas terapéuticas de un solo dominio.

Al usar entidades terapéuticas ya disponibles, tales como aquellas derivadas por ejemplo de anticuerpos terapéuticos, se puede lograr una producción rápida y fácil de una molécula terapéutica de varios dominios.

Por ejemplo, las moléculas/anticuerpos de unión manipuladas por avidez pueden unirse a dos o más marcadores de superficie celular presentes en una sola célula. Esta unión sólo es ávida si todas/ambas entidades de unión se unen simultáneamente a la célula. Para este fin anticuerpos de baja a media, baja a lata o media a alta afinidad son especialmente adecuados. Esto permite también por otro lado excluir combinaciones menos específicas de especificidades de unión durante un proceso de tamizado.

Con tal enfoque es posible la generación de moléculas terapéuticas hechas a la medida y de esta manera altamente eficaces. Estas moléculas tendrán menos o reducidos efectos secundarios severos/reducidos debido a sus propiedades mejoradas, tales como suministro dirigido (por ejemplo, carga útil para células tumorales) y dirección mejorada a células objetivo con base en selectividad y especificidad más altas del componente de dirección (que comprende al menos dos moléculas de unión).

Entre más alta sea la selectividad y especificidad de un aglutinante multiespecífico llevada a cabo por la unión simultánea (avidez) de la combinación de dos aglutinantes de "baja afinidad", se reducirá o prevendrá completamente una potencial unión "fuera de objetivo".

Métodos como los reportados aquí Un aspecto como el reportado en la presente es un método para producir un polipéptido que comprende al menos dos dominios de polipéptido que comprende las etapas de - cultivar una célula que comprende a) un ácido nucleico que codifica para una sortasa A soluble con una señal de retención en retículo endoplásmico del extremo C-terminal, b) un ácido nucleico que codifica para un primer dominio de polipéptido que comprende en su extremo C-terminal o en su región C-terminal un motivo de sortasa seguido por una señal de retención en retículo endoplásmico, y c) un ácido nucleico que codifica para un segundo dominio de polipéptido que comprende en su extremo N-terminal un motivo de oligoglicina de al menos dos residuos de glicina, con lo cual la célula secreta el conjugado (ligado) de sortasa A del primer dominio de polipéptido y el segundo dominio de polipéptido, produciendo de esta manera un polipéptido que comprende al menos dos dominios de polipéptido.

Un aspecto como el reportado aquí es un método para producir un aglutinante multiespecífico, que comprende al menos dos entidades de unión que comprende la etapa de - cultivar una célula que comprende a) un ácido nucleico que codifica para una sortasa A soluble con una señal de retención en retículo endoplásmico del extremo C-terminal, b) un ácido nucleico que codifica para una entidad de unión que comprende en su extremo C-terminal o en su región C-terminal un motivo de sortasa seguida por una señal de retención en retículo endoplásmico, y c) un ácido nucleico que codifica para una segunda entidad de unión que comprende en su extremo N-terminal al menos una diglicina, con lo cual la célula secreta el conjugado (ligado) de sortasa A de la primera entidad de unión y la segunda entidad de unión, con lo cual la primera entidad de unión se une específicamente a un primer antígeno u objetivo y la segunda entidad de unión se une específicamente a un segundo antígeno u objetivo, produciendo así un aglutinante multiespecífico que comprende por lo menos dos entidades de unión.

Un aspecto como el reportado aquí es un método para seleccionar un anticuerpo biespecífico, que comprende las siguientes etapas: (i) determinar los marcadores de superficie celular presentes en una célula que contenga muestra y seleccionar los mismos al menos en un primer marcador de superficie y un segundo marcador de superficie, (ii) transfectar una célula con (a) un ácido nucleico que codifique para un anticuerpo Fab, o fragmento scFab, o un anticuerpo scFv que comprenda dentro de los 20 residuos de aminoácidos C-terminales la secuencia de aminoácidos LPXTG (SEQ ID NO: 01, en donde X puede ser cualquier residuo de aminoácidos) seguido por una señal de retención en retículo endoplásmico KDEL (SEQ ID NO: 02), con lo cual el fragmento Fab o scFab, o anticuerpo scFv se une específicamente al primer marcador de superficie o su ligando, (b) un ácido nucleico que codifica para un fragmento de anticuerpo de un brazo que comprende una cadena pesada de anticuerpo de longitud completa, una cadena ligera de anticuerpo de longitud completa y un polipéptido de la región Fe de la cadena pesada de anticuerpo, en donde la cadena pesada de anticuerpo de longitud completa y la cadena ligera de anticuerpo de longitud completa son cadenas de anticuerpo cognadas complementarias entre sí y el par de dominios variables (VH y VL) de las mismas forma un sitio de unión a antígeno que se une específicamente al segundo marcador superficial o su ligando, con lo cual la cadena pesada de anticuerpo de longitud completa y el polipéptido de región Fe de la cadena pesada de anticuerpo se enlazan covalentemente entre sí por medio de uno o más enlaces de disulfuro formando una región de bisagra de anticuerpo, y con lo cual el polipéptido de la región Fe de la cadena pesada de anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos de oligoglicina Gm (m = 2, o 3, o 4, o 5) en su extremo N-terminal, y (c) un ácido nucleico que codifica para una sortasa A soluble con una señal de retención en retículo endoplásmico C-terminal, y produciendo de esta manera el anticuerpo biespecífico.

En las siguientes modalidades de todos los métodos como los reportados aquí son dados.

En una modalidad de todos los aspectos está la sortasa A la sortasa A de Staphylococcus aureus (S. aureus) . En una modalidad el ácido nucleico que codifica para una sortasa a (soluble) con una señal de retención en retículo endoplásmico C-terminal codifica para una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 52.

En una modalidad los miembros de la multitud de aglutinantes multiespecíficos se obtienen cada uno por un método como el reportado aquí.

En una modalidad la entidad de unión es un par cognado de un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo.

En una modalidad la entidad de unión se selecciona de (o la primera entidad de unión y la segunda entidad de unión se seleccionan independientemente entre sí) del grupo de una entidad de unión a base de dominio de dardo, un dominio de anticalina y una entidad de unión a base de dominio de anticalina, entidad de unión a base de dominio scTCR tipo fragmento de receptor de células T, una entidad de unión a base de dominio VH de camello, una entidad de unión a base de dominio del décimo dominio de fibronectina 3, una entidad de unión a base de un dominio de tenascina, una entidad de unión a base de dominio de caderina, una entidad de unión a base de dominio ICAM, una entidad de unión a base de dominio titin, una entidad de unión a base de dominio GCSF-R, una entidad de unión a base de dominio receptor de citosina, una entidad de unión a base de dominio inhibidor de glicosidasa, una entidad de unión a base de dominio de superóxido dismutasa o fragmentos de anticuerpo tales como fragmento Fab, o scFab o scFv.

En una modalidad el primer dominio de polipéptido comprende i) la secuencia de aminoácidos LPXTG (SEQ ID NO: 01, en donde X puede ser cualquier residuo de aminoácido) en su región de la secuencia de aminoácidos C-terminal (es decir, dentro de los veinte residuos de aminoácido C- terminales) y ii) la señal de retención en retículo endoplásmico KDEL (SEQ ID NO: 02) en su extremo C-terminal, y el segundo dominio de polipéptido comprende una oligoglicina Gm (m = 2, o 3, o 4, o 5) en su extremo N-terminal.

En una modalidad el segundo dominio de polipéptido o la segunda entidad de unión comprende una oligoglicina Gm (m = 2, o 3, o 4, o 5) y secuencia de aminoácidos en su extremo N-terminal.

En una modalidad la región Fe de anticuerpo humano comprende una mutación del residuo de aminoácido de origen natural al menos en una de las siguientes posiciones de aminoácido 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322, 329 y/o 331 a un residuo diferente, en donde los residuos en la región Fe de anticuerpo son numerados de acuerdo con el índice EU de Kabat.

En una modalidad la región Fe de anticuerpo humano comprende una mutación del residuo de aminoácido de origen natural en la posición 329 y al menos una mutación adicional de al menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende en residuos de aminoácido en la posición 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322 y 331 a un residuo diferente, en donde los residuos en la región Fe son numerados de acuerdo con el índice EU de Kabat. El cambio de estos residuos de aminoácido específicos se traduce en una alteración de la función efectora de la región Fe en comparación con la región Fe no modificada (tipo salvaje).

En una modalidad la región Fe de anticuerpo humano tiene una afinidad reducida a la FcyRIIIA humana, y/o FCRIIA, y/o FcyRI en comparación con un conjugado que comprende la región Fe de IgG tipo salvaje correspondiente.

En una modalidad la región Fe de anticuerpo comprende la mutación P329G.

En una modalidad la región Fe de anticuerpo comprende la mutación T366W en el polipéptido de la región Fe de la cadena pesada y las mutaciones T366S, L368A y Y407V en el segundo polipéptido de la región Fe de la cadena pesada, en donde la numeración es de acuerdo con el índice EU de Kabat.

En una modalidad la región Fe de anticuerpo comprende aparte de una mutación del residuo de aminoácido de prolina en la posición 329 al menos una adición, mutación o supresión adicional de un residuo de aminoácido en la región Fe que está correlacionada con la estabilidad incrementada del conjugado de la región de Fe de anticuerpo.

En una modalidad, la adición, mutación o supresión adicional de un residuo de aminoácido en región Fe es en la posición 228 y/o 235 de la región Fe si la región Fe es de la subclase IgG4. En una modalidad el residuo de aminoácido serina en la posición 228 y/o el residuo de aminoácido leucina en la posición 235 es/son sustituidos por otro aminoácido. En una modalidad, el conjugado de la región Fe de anticuerpo comprende un residuo de prolina en la posición 228 (mutación del residuo de serina a un residuo de prolina). En una modalidad el conjugado de la región Fe de anticuerpo comprende un residuo de ácido glutámico en la posición 235 (mutación del residuo de leucina a un residuo de ácido glutámico).

En una modalidad la región Fe comprende tres mutaciones de aminoácido. En una modalidad las tres mutaciones de aminoácido son la mutación P329G, S228P y L23E (P329G SPLE).

En una modalidad la adición, mutación o supresión adicional de un residuo de aminoácido en la región Fe es en la posición 234 y/o 235 de la región Fe si la región Fe es de la subclase IgGl. En una modalidad el residuo de aminoácido leucina en la posición 234 y/o el residuo de aminoácido leucina en la posición 235 es/son. mutados por otro aminoácido.

En una modalidad la región Fe comprende una mutación de aminoácido en la posición 234, en donde el residuo de aminoácido leucina es mutado a un residuo de aminoácido alanina.

En una modalidad la región Fe comprende una mutación de aminoácido en la posición 235, en donde el residuo de aminoácido leucina es mutado a un residuo de aminoácido alanina.

En una modalidad la región Fe comprende una mutación de aminoácido en la posición 329, en donde el residuo de aminoácido prolina es mutado a un residuo de aminoácido glicina, una mutación de aminoácido en la posición 234, en donde el residuo de aminoácido leucina es mutado a un residuo de aminoácido alanina, y una mutación de aminoácido en la posición 235, en donde el residuo de aminoácido leucina es mutado a un residuo de aminoácido alanina.

Las variantes de la región Fe con afinidad incrementada para FcRn tienen vidas medias enfermas largas, y tales moléculas tendrán aplicaciones útiles en métodos para tratar mamíferos en donde una vida media sistémica larga del anticuerpo o conjugado de región Fe administrado se desee, por ejemplo, para tratar una enfermedad o trastorno crónico.

Los conjugados de la región Fe de anticuerpo con afinidad de unión a FcRn reducida tienen vidas medias en suero más cortas, y estas moléculas tendrán aplicaciones útiles en métodos para tratar mamíferos en los que una vida media sistémica más corta del conjugado de la región Fe de anticuerpo administrado se desee, por ejemplo, para evitar efectos secundarios tóxicos o para aplicaciones de proyección de imágenes de diagnóstico in vivo. Los polipéptidos de fusión a la región Fe o conjugados con afinidad de unión FcRn reducida son menos probables al cruzar la placenta, y de esta manera se pueden usar en el tratamiento de enfermedades o trastornos en mujeres embarazadas.

Una región Fe con afinidad de unión alterada para FcRn es en una modalidad una región Fe con una alteración de aminoácido en una o más de las posiciones de aminoácido 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 y/o 447.

La región Fe es en una modalidad una región Fe con una o más alteraciones de aminoácido en las posiciones de aminoácido 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 y/o 447.

Una región Fe que presenta unión incrementada a FcRn comprende en una modalidad una o más alteraciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácido 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 y/o 434.

En una modalidad, la región Fe es una región Fe de la subclase IgGl y comprende las mutaciones de aminoácido P329G y/o L234A y L235A.

En una modalidad la región Fe es una región Fe de la subclase IgG4 y comprende las mutaciones de aminoácido P329G y/o S228P y L235E.

En una modalidad, la región Fe de anticuerpo comprende la mutación T366W en el primer polipéptido de la región Fe de la cadena pesada y las mutaciones T366S, L368A y Y407V en el segundo polipéptido de la región Fe de la cadena pesada, en donde la numeración es de acuerdo con el índice EU de Kabat.

Conjugación enzimática usando sortasa A Un polipéptido de varios dominios puede obtenerse in vivo usando la enzima sortasa A.

Muchas bacterias gram-positivas usan sortasa para anclar de manera covalente una variedad de proteínas de superficie incluyendo factores de virulencia a su pared celular (peptidoglucano). Las sortasas son enzimas asociadas a membrana. La sortasa A de Staphylococcus aureus tipo salvaje (SrtA) es un polipéptido de 206 aminoácidos con una región que abarca la membrana N-terminal. En una primera etapa, sortasa A reconoce proteínas de substrato que contienen un motivo de secuencia de aminoácidos LPXTG (SEQ ID NO: 01) y corta el enlace de amida entre el Thr y Gly por medio de un sitio activo Cys. Esta reacción de corte de. péptido se traduce en un intermediario de tioéster de substrato de sortasa A. En una segunda etapa el intermediario de enzima tioéster acilo es resuelto por ataque nucleofílico de un grupo amino de una oligoglicina que contiene un segundo polipéptido de substrato (que corresponde a la unidad pentaglicina del péptidoglucano en S. aureus) llevando a una proteína de pared celular enlazada covalentemente y a la regeneración de sortasa A. En ausencia de nucleófilos de oligoglicina, el intermediario de enzima de acilo puede ser hidrolizado por una molécula de agua.

La ligación/conjugación mediada por sortasa ha empezado a ser aplicada para una variedad de propósitos de manipulación y bioconjugación de proteínas. Esta nueva téenica hace posible la introducción de funcionalidades naturales y sintéticas en polipéptidos marcados con LPXTG recombinantes o sintetizados químicamente. Ejemplos incluyen la fijación covalente de polímeros derivados de oligoglicina (por ejemplo, PEG), fluoróforos, vitaminas (por ejemplo, biotina y folato), lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, péptidos y proteínas sintéticos (por ejemplo, GFP) (Tsukiji, S. y Nagamune, T., ChemBioChem 10 (2009) 787-798; Popp, M.W.-L, y Ploegh, H.L., angew. Chem. Int. Ed. 50 (2011) 5024-5032).

Se ha demostrado que un motivo de glicina e incluso uno de diglicina del componente amino es suficiente para la etapa de ligación mediada por SrtA (Clancy, K.W., et al., Peptide Science 94 (2010) 385-396).

Para la conjugación enzimática una sortasa A truncada soluble que carece de la región que abarca membrana (SrtA; residuos de aminoácido 60-206 de SrtA de Staphylococcus aureus) puede ser usada (Ton-That, H., et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 96 (1999) 12424-12429; Ilangovan, H., et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 98 (2001) 6056-6061).

Cualquier dominio de polipéptido que comprenda un motivo de oligoglicina en al menos uno de sus extremos N-terminales (Gm, m = 2 ó 3, o 4, o 5) puede ser expresado y purificado a partir del sobrenadante de células eucariotas (por ejemplo, células HEK293, células CHO).

Una entidad de unión (por ejemplo, un polipéptido de unión a antígeno de cadena individual tal como un scFv, un scFab o un DARPin o un polipéptido de unión a antígeno de varias cadenas tal como un dsFv o un Fab) que comprende el motivo de reconocimiento de SrtA en el extremo C-terminal de una cadena de polipéptidos puede ser expresado y purificado a partir del sobrenadante de células eucarióticas (por ejemplo, células HEK293, células CHO).

El enfoque "Combimatrix" Es deseable combinar una primera entidad de unión, tal como un fragmento Fab de anticuerpo, con otra entidad de unión específica, tal como un segundo fragmento Fab de anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de un brazo que comprenda una cadena pesada de longitud completa y su cadena ligera de longitud completa cognada y un polipéptido de región Fe de cadena pesada enlazado por disulfuro. Además es posible tamizar, ya sea si una primera entidad de unión muestra mejores propiedades cuando se le enlaza a un número de otras entidades de unión diferentes. Usando un llamado enfoque Combimatrix, una multitud de combinaciones de entidades de unión pueden ser resueltas de una forma fácil. Se debe señalar que las segundas entidades de unión pueden ya sea unirse a diferentes objetivos/epítopos/antígenos, o se pueden unir al mismo antígeno pero a diferentes epítopos, o pueden unirse al mismo epítopo pero ser variantes diferentes de una sola entidad de unión (por ejemplo, candidatos de humanización).

En este escenario, se puede llevar a cabo un proceso de plataforma automática. Cualquier plataforma que use, por ejemplo, placas de 96 pocilios u otros formatos de alta emisión es adecuada, tal como un robot de pipeteo Eppendorf epMotion 5075vac.

Primero, se lleva a cabo la clonación de las construcciones que codifican para entidades de unión. Los plásmidos con los ácidos nucleicos de codificación de entidad de unión se obtienen normalmente por síntesis génica o amplificación de PCR, con lo cual la región C-terminal de una entidad de unión codificada contiene un motivo de sortasa, y una señal de retención en retículo endoplásmico, y la región N-terminal de la otra entidad de unión respectiva comprende un motivo de oligoglicina N-terminal que comprende al menos dos residuos de glicina consecutivos (diglicina). Los plásmidos se transfieren individualmente a un pocilio separado de una placa de varios pocilios (se puede cargar una placa completa). Posteriormente, los plásmidos son digeridos con una mezcla de enzimas de restricción que corta la región de codificación de entidad de unión. Es deseable diseñar todas las síntesis génicas y/o cebadores de PCR de tal manera que sólo una mezcla de enzimas de restricción se requiera para todos los plásmidos. Posteriormente, una etapa de limpieza opcional produce fragmentos de ADN purificados. Estos fragmentos son ligados en un esqueleto de plásmido que ha sido cortado fuera de un vector receptor con la misma mezcla de restricción que la mencionada arriba. Como alternativa, el procedimiento de clonación puede llevarse a cabo por una etapa de clonación mediada por SLIC. Después de la ligación, las plataformas automáticas transfieren todas las mezclas de ligación a una placa de varios pocilios adicional con células de E. coli competentes (por ejemplo, ToplO Multi Shot, Invitrogen), y se lleva a cabo una reacción de transformación. Las células son cultivadas hasta la densidad deseada. A partir de una alícuota de la mezcla de cultivo grupos de glicerol pueden ser obtenidos. A partir del plásmido de cultivo se aísla (por ejemplo, usando un minikit de aislamiento de plásmidos (por ejemplo, NucleoSpin 96 Plasmid, Machercy& Nagel)). La identidad del plásmido se verifica al digerir una alícuota con una mezcla de restricción adecuada y electroforesis con SDS-gel (por ejemplo, E-Gel 48, Invitrogen). Posteriormente una nueva placa puede ser cargada con una alícuota del plásmido para llevar a cabo una reacción de secuenciación de control.

En la siguiente etapa se expresan las entidades de unión. Para este fin, células HEK son sembradas en una placa de varios pocilios (por ejemplo, una placa de 48 pocilios) y se transfectan con las combinaciones de plásmidos aisladas respectivas (que contienen las regiones de codificación de identidad de unión en vectores de esqueleto adecuados) junto con un plásmido que codifica para sortasa soluble que porta una señal de retención endoplásmica C-terminal. De esta manera, células HEK son co-transfectadas con tres plásmidos de expresión: i) un plásmido que codifica para una entidad de unión que tiene un marcador His C-terminal, motivo de sortasa y señal de retención endoplásmica (en dirección N-terminal a C-terminal), ii) un plásmido que codifica para una entidad de unión que tiene un motivo de oligoglicina N-terminal de al menos dos residuos de glicina y iii) un plásmido que codifica para sortasa soluble que tiene una señal de retención endoplásmica C-terminal. Células HEK transíectadas son cultivadas durante varios días y posteriormente se cosechan los sobrenadantes de cultivo (por ejemplo, al filtrar a través de una placa de filtración de 1.2 mm y 0.22 mm usando una estación de vacío). Los títulos pueden ser monitoreados al llevar a cabo por ejemplo un ELISA.

Las entidades de unión son enlazadas entre sí usando una reacción de transpeptidación mediada por sortasa durante la expresión in vivo. Esto se logra ya que el dominio de unión que comprende el motivo de reconocimiento de sortasa C-terminal comprende una señal de retención en retículo endoplásmico. La sortasa soluble empleada comprende la misma señal de retención en retículo endoplásmico en su extremo C-terminal. Así, ambas moléculas son casi completamente retenidas en el retículo endoplásmico. Después de la entrada del segundo dominio de polipéptido en el retículo endoplásmico, la reacción de conjugación enzimática tiene lugar y el conjugado enzimático, el cual está libre de la señal de retención en retículo endoplásmico, que se retira durante la reacción de transpeptidación enzimática, es secretado en el medio de cultivo. Los conjugados pueden ser cosechados del medio de cultivo usando un procedimiento de selección con marcadores His (el sobrenadante de cultivo se aplica sobre por ejemplo placas His MultiTrap HP (GE Healthcare) y se filtra, con lo cual todas las moléculas que comprenden un marcador His se unen a la matriz (es decir, los conjugados) y pueden ser eluidas después de lavar con un amortiguador de elución adecuado, mientras que todas las demás moléculas no se unirán al material de cromatografía.

Las moléculas de unión multiespecíficas pueden hacerse usando el enfoque Combimatrix, véase la siguiente tabla abajo).

Los pocilios de la primera columna de una placa de varios pocilios indican diferentes plásmidos que codifican para primeras entidades de unión que comprenden un motivo de sortasa C-terminal (designado en números arábicos, por ejemplo, 1 a 11 para una placa de 96 pocilios). Los pocilios de la primera hilera de la misma placa indican diferentes plásmidos que codifican para segundas entidades de unión que comprenden una oligoglicina en el extremo N-terminal/en la región N-terminal (excluyendo la primera hilera, designada en letras, por ejemplo, A a G). Posteriormente todos los plásmidos que codifican para una primera entidad de unión de la primera hilera se combinan con todos los plásmidos que codifican para una segunda entidad de unión de la primera columna (por ejemplo, dando como resultado en 77 combinaciones en una placa de 96 pocilios), designada por una combinación de número y letra (por ejemplo, 1A a 11G). Además, plásmido que codifica para sortasa se añade a todos los pocilios. Todas las combinaciones son co-transfectadas en células HEK y de esta manera expresadas y conjugadas in vivo por la sortasa A que comprende una señal de retención en retículo endoplásmico. Una vez que se ha llevado a cabo la conjugación enzimática in vivo, se puede llevar a cabo una etapa de purificación opcional. Las moléculas de unión multiespecíficas están entonces listas para evaluación en ensayos bioquímicos o a base de células.

III. Métodos recombinantes Las células hospederas adecuadas para clonación y/o expresión/secreción de vectores que codifican para polipéptidos incluyen células procarióticas y eucarióticas descritas en la presente. Por ejemplo, polipéptidos pueden ser producidos en bacterias, en particular cuando no se requieran glucosilación y función efectora Fe (véanse, por ejemplo, US 5,648,237, US 5,789,199 y US 5,840,523, Charlton, Methods in Molecular biology 248 (2003) 245-254 (B.K.C. Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ), que describen la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli) . Después de la expresión, el polipéptido puede ser aislado de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble o se puede aislar a partir de la fracción insoluble, los llamados cuerpos de inclusión que pueden ser solubilizados y el polipéptido puede ser redoblado a formas bioactivas. Posteriormente, el polipéptido puede ser purificado más.

Además de procariontes, los microbrios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levaduras son anfitriones de clonación o expresión adecuados para vectores de codificación de polipéptidos, incluyendo cepas de hongos y levaduras cuyas vías de glicosilación han sido "humanizadas", dando como resultado la producción de un polipéptido con un patrón de glicosilación parcialmente o completamente humano (véase, por ejemplo, Gerngross, Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414, and Li, et al., Nat. Biotech.24 (2006) 210-215).

Las células hospederas adecuadas para la expresión de polipéptidos glicosilados también son derivadas de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insectos. Numerosas cepas vaculovirales han sido identificadas que pueden ser usadas en conjunto con células de insecto, particularmente para transfección de células de Spodoptera frugiperda .

Los cultivos de células vegetales también pueden utilizarse como anfitriones (véase, por ejemplo, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 y US 6,417,429 (que describe teenología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas)).

Las células de vertebrados también pueden ser usadas como anfitriones. Por ejemplo, las líneas de células de mamífero que están adaptadas para crecer en cultivo de suspensión pueden ser útiles. Otro ejemplo de líneas de células hospederas de mamífero útiles son la línea de células COS-7 (célula CV1 de riñón de mono transformada por SV40; la línea de células HEK293 (riñón embrionario humano), línea de células BHK (riñón de hámster bebé); línea de células de sertoli de ratón TM4 (células TM4 como las descritas, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod. 23 (1980) 243-251); la línea de células CV1 (células de riñón de mono); la línea de células VERO-76 (Células de riñón de mono verde africano); la línea de células HELA (células de carcinoma cervical humano); la línea de células MDCK (células de riñón canino); la línea de células BRL-3A (células de hígado de rata búfalo); la línea de células W138 (células de pulmón humano); la línea de células HepG2 (células de hígado humano),- la línea de células MMT 060562 (células de tumor mamario de ratón); la línea de células TRI, como la descrita, por ejemplo, en Mather, et al., Annals N.Y. Acd. Sci. 383 (1982) 44-68; la línea de células MRC5 y la línea de células FS4. Otras líneas de células hospederas de mamífero útiles incluyen la línea de células CHO (células de ovario de hámster chino, incluyendo líneas de células CHO DHFR negativas (urlaub, efc al . , Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A.77 (1980) 4216), y líneas de células de mieloma tales como línea de células YO, NSO y Sp2/0. Para una revisión de ciertas líneas de células hospederas de mamífero adecuadas para la producción de polipéptidos, véase, por ejemplo, Yazaki, and Wu, Methods in Molecular Biology, Antibody Engineering 248 (2004) 255-268 (B.K.C. Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ).

IV. Métodos y composiciones para diagnóstico y detección En ciertas modalidades, cualquiera de los anticuerpos biespecífíeos proporcionados en la presente es útil para detectar la presencia de uno o ambos antígenos en una muestra biológica. El término "detectar" según se usa en la presente abarca la detección cuantitativa o cualitativa. En ciertas modalidades, una muestra biológica comprende una célula o tejido, tal como biopsias de células cancerosas.

En una modalidad, un anticuerpo biespecífico para usarse en un método de diagnóstico o detección es proporcionado. En un aspecto más, se proporciona un método para detectar la presencia de células cancerosas en una muestra biológica. En ciertas modalidades, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo biespecífico como el descrito en la presente bajo condiciones que conduzcan a la unión del anticuerpo biespecífico a su antígeno o antígenos, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo biespecífico y su antígeno o antígenos. Este método puede ser un método in vi tro o in vivo.

Ejemplos de trastornos que pueden ser diagnosticados usando un anticuerpo de la invención incluyen cáncer.

En ciertas modalidades, se proporcionan anticuerpos biespecíficos marcados. Los marcadores incluyen, pero no están limitados a, marcadores o porciones que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromofóricos, densos en electrones, quimioluminiscentes y radioactivos, así como porciones, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Ejemplos de marcadores incluyen, pero no están limitados a, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o floresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (US 4,737,456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, peroxidasa de rábano (HRP), fosfatasa alcalina, b-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas sacáridas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosas-6- fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor colorante tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de spin, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables y similares.

V. Formulaciones farmaceuticas Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo biespecífico como el descrito en la presente se preparan al mezclar el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. (ed.), (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores farmacéuticamente aceptables generalmente no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen, pero no están limitados a: amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecil dimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de benzetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como poli (vinilpirrolidona); aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, mañosa, trehalosa o sorbitol; contra-iones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilen glicol (PEG). Ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables de la presente incluyen además agentes de dispersión de fármaco intersticiales tales como glicoproteínas de hialuronidasa neutras-activas y solubles (sHASEGP), por ejemplo, glicoproteínas de hialuronidasa PH-20 soluble humana, tal como rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Ciertos ejemplos de sHASEGPs y métodos de uso, incluyendo rhuPH20, se describen en US 2005/0260186 y US 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glicosaminoglicanasas adicionales tales como condroitinasas.

Ejemplos de formulaciones de anticuerpos liofilizadas se describen en US 6,267,958. Formulaciones de anticuerpo acuosas incluyen aquellas descritas en US 6,171,586 y WO 2006/044908, éstas últimas formulaciones incluyendo un amortiguador de histidina-acetato.

La presente formulación también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que esté siendo tratada, de preferencia aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Estos ingredientes activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito deseado.

Los ingredientes activos pueden ser atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por téenicas de coacervado o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de metacrilato de polimetilo, respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Estas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. (ed.) (1980).

Se pueden preparar preparaciones de liberación prolongada. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación prolongada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de artículos configurados, por ejemplo, películas o microcápsulas.

Las formulaciones que se usarán para administración in vivo generalmente son estériles. La esterilidad puede lograrse fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

VI. Métodos terapéuticos y composiciones Cualquiera de los anticuerpos biespecíficos provistos en la presente se puede usar en métodos terapéuticos.

En un aspecto, un anticuerpo biespecífico para usarse como un medicamento es proporcionado. En aspectos adicionales, se proporciona un anticuerpo biespecífico para usarse en el tratamiento de cáncer. En ciertas modalidades, se proporciona un anticuerpo biespecífico para usarse en un método de tratamiento. En ciertas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico para usarse en un método de tratamiento de un individuo que tenga cáncer, que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del anticuerpo biespecífico. En una modalidad de este tipo, el método comprende además administrar al individuo una cantidad efectiva de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como el descrito abajo. En modalidades adicionales, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico para usarse en eliminar/matar/lisar células cancerosas. En ciertas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico para usarse en un método para eliminar/matar/lisar células cancerosas en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del anticuerpo biespecífico para eliminar/matar/lisar células cancerosas. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores puede ser un humano.

En un aspecto más, la invención proporciona el uso de un anticuerpo biespecífico en la elaboración o preparación de un medicamento. En una modalidad, el medicamento es para el tratamiento de cáncer. En una modalidad más, el medicamento es para usarse en un método para tratar cáncer que comprende administrar a un individuo que tenga cáncer una cantidad efectiva del medicamento. En una modalidad de ese tipo, el método comprende además administrar al individuo una cantidad efectiva de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como el descrito abajo. En una modalidad más, el medicamento es para eliminar/matar/lisar células cancerosas. En una modalidad más, el medicamento es para usarse en un método para matar/eliminar/lisar células cancerosas en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del medicamento para eliminar/matar/lisar células cancerosas. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores puede ser un humano.

En un aspecto más, la invención proporciona un método para tratar cáncer. En una modalidad, el método comprende administrar a un individuo que tenga cáncer una cantidad efectiva de un anticuerpo biespecífico. En una modalidad tal, el método comprende además administrar al individuo una cantidad efectiva de al menos un agente terapéutico adicional, como el descrito abajo. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores puede ser un humano.

En un aspecto más, la invención proporciona un método para eliminar/matar/lisar células cancerosas en un individuo. En una modalidad, el método comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del anticuerpo biespecífico para eliminar/matar/lisar células cancerosas. En una modalidad, un "individuo" es un humano.

En un aspecto más, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos biespecíficos provistos en la presente, por ejemplo, para usarse en cualquiera de los métodos terapéuticos anteriores. En una modalidad, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos biespecíficos provistos en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos biespecíficos provistos en la presente y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe abajo.

Los anticuerpos de la invención pueden usarse ya sea solos o en combinación con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede ser co administrado con al menos un agente terapéutico adicional. En ciertas modalidades, un agente terapéutico adicional es un agente citotóxico o un agente quimioterapéutico.

Tales terapias de combinación indicadas arriba abarcan la administración combinada (cuando dos o más agentes terapéuticos se incluyen en la misma o separadas formulaciones), y administración separada, en cuyo caso, la administración del anticuerpo de la invención se puede presentar antes de, simultáneamente con y/o después de la administración del agente terapéutico y/o adyuvante adicional. Los anticuerpos de la invención también se pueden usar en combinación con terapia de radiación.

Un anticuerpo de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) puede ser administrado por cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, intrapulmonar e intranasal, y, si se desea para tratamiento local, administración intralesional. Infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea. La dosificación puede ser por medio de cualquier ruta adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Varios programas de dosificación incluyendo pero no limitados a administraciones individuales o múltiples durante varios puntos de tiempo, administración de bolo e infusión por pulsos se contemplan en la presente.

Los anticuerpos de la invención serían formulados, dosificados y administrados en una forma consistente con la buena práctica médica. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que esté siendo tratado, el mamífero particular que esté siendo tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio del suministro del agente, el método de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los practicantes médicos. El anticuerpo no tiene que ser, pero es opcionalmente, formulado con uno o más agentes usados actualmente para evitar o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad efectiva de estos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores descritos arriba. Estos se usan generalmente en las mismas dosis y con las mismas rutas de administración que las descritas aquí, o alrededor de 1 a 99% de las dosis descritas en la presente, o en cualquier dosis y por cualquier ruta que sea determinada en forma empírica o clínica como adecuada.

Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosis adecuada de un anticuerpo de la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que será tratada, el tipo de anticuerpo, la severidad y curso de la enfermedad, de si el anticuerpo se administra para efectos preventivos o terapéuticos, terapia previa, el historial clínico del paciente y respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico que tienda. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente en un momento o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 mg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0.5 mg/kg - 10 mg/kg) de anticuerpo puede ser una dosis candidata inicial para administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosis diaria típica puede variar de aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados arriba. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento generalmente sería prolongado hasta que se presente una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Un ejemplo de dosis del anticuerpo estaría en el intervalo de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Así, una o más dosis de aproximadamente 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) pueden ser administradas al paciente. Estas dosis pueden ser administradas de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de tal forma que el paciente reciba alrededor de dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Una dosis de carga superior inicial, seguida por una o más dosis más bajas puede ser administrada. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosis. El progreso de esta terapia se monitorea fácilmente por téenicas y ensayos convencionales.

Se entiende que cualquiera de las formulaciones o métodos terapéuticos anteriores puede llevarse a cabo usando un inmunoconjugado de la invención en lugar de o además de un anticuerpo biespecífico.

VII. Artículos de manufactura En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos arriba. El artículo de manufactura comprende un recipiente y una etiqueta o inserto de envase en, o asociado con, el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, bolsas para solución intravenosa, etc. Los recipientes pueden formarse a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es por sí misma o está combinada con otra composición efectiva para tratar, prevenir y/o diagnosticar la condición y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón que pueda ser perforado por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La etiqueta o inserto de envase indica que la composición se usa para tratar la condición de elección. Además, el artículo de manufactura puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un agente citotóxico adicional o de otra manera terapéutico. El artículo de manufactura en esta modalidad de la invención puede comprender además un inserto de envase que indique que las composiciones pueden usarse para tratar una condición particular. Como alternativa o además, el artículo de manufactura puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprenda un amortiguador farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI, por sus siglas en inglés), solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

Se entiende que cualquiera de los artículos de manufactura anteriores puede incluir un inmunoconjugado de la invención en lugar de o además de un anticuerpo biespecífico.

Ejemplos Los siguientes ejemplos son ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Se entiende que varias otras modalidades pueden ser practicadas, dada la descripción general proporcionada arriba.

Aunque la anterior descripción ha sido descrita en cierto detalle a manera de ilustración y ejemplo para efectos de claridad de entendimiento, las descripciones y ejemplos no deben considerarse como limitativas del alcance de la invención.

Materiales y métodos Téenicas de ADN recombinante Se usaron métodos estándares para manipular ADN como se describe en Sambrook, J. et al. Molecular cloning: A laboratory manual; Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, Nueva York, 1989. Los reactivos biológicos moleculares se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Síntesis de genes y oligonucleótidos Segmentos génicos deseados fueron preparados por síntesis química en Geneart GmbH (Regensburg, Alemania). Los fragmentos génicos sintetizados fueron clonados en un plásmido de E. coli para propagación/amplificación. Las secuencias de ADN de fragmentos génicos subclonados fueron verificadas por secuenciación de ADN. Como alternativa, fragmentos de ADN sintéticos cortos fueron ensamblados al fijar oligonucleótidos químicamente sintetizados o por medio de PCR. Los oligonucleótidos respectivos fueron preparados por GmbH (Planegg-Martinsried, Alemania).

Determinación de proteínas La concentración de proteínas de polipéptidos purificados se determinó al determinar la densidad óptica (OD) a 280 ntn, usando el coeficiente de extinción molar calculado sobre la base de la secuencia de aminoácidos del polipéptido.

Ejemplo 1 Generación de plásmidos de expresión para anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que incluyen fragmentos de anticuerpo Fab de cadena individual Las proteínas deseadas fueron expresadas por transfección transitoria de células de riñón embrionario humano (HEK 293). Para la expresión de un gen/proteína deseado (por ejemplo, cadena pesada de anticuerpo de longitud completa, cadena ligera de anticuerpo de longitud completa, fragmentos scFab o una cadena Fe que contiene una oligoglicina en su extremo N-terminal) se usó una unidad de transcripción que comprende los siguientes elementos funcionales: - el potenciador y promotor temprano inmediato del citomegalovirus humanos (P-CMV) incluyendo el intrón A, una región no traducida 5' (5'UTR) de inmunoglobulina de la cadena pesada humana, - una secuencia de señal (SS) de la cadena pesada de inmunoglobulina de murino, - un gen/proteína a ser expresado, y la secuencia de poliadenilación de hormona de crecimiento bobino (BGH pA).

Además de la unidad de expresión/casete que incluye el gen deseado a ser expresado, el plásmido de expresión de mamífero básico/estándar contiene - un origen de replicación del vector pUC18 que permite replicación de este plásmido en E. coli, y - un gen de beta-lactamasa que confiere resistencia a ampicilina en E. coli . a) Generación de un plásmido de expresión para un fragmento Fab de cadena individual (scFab) con marcador His C-terminal, motivo de sortasa y señal de retención ER El gen de fusión que codifica para scFab que comprende un marcador His C-terminal, seguido por un motivo de reconocimiento de sortasa y una señal de retención endoplásmica (ER) fue ensamblado al fusionar un fragmento de ADN que codificaba para los elementos de secuencia respectivos (marcador His6) (HHHHHH, SEQ ID NO: 07), motivo de sortasa (LPETGGS, SEQ ID NO: 28) y señal de retención en ER (KDEL, SEQ ID NO: 02), separados cada uno por un elemento de secuencia GS corto (GSHHHHHHGSLPETGGSKDEL (SEQ ID NO: 29) a una molécula Fab de cadena individual quimérica de rata-humano (Vkappa-huCkappa-enlazador-Vheavy-huCHl).

El plásmido de expresión para la expresión transitoria de un fragmento scFab con un marcador His C-terminal, motivo de sortasa y proteína de fusión en señal de retención Er en células HEK293 comprendía aparte del fragmento scFab con marcador His C-terminal, motivo de sortasa y casete de expresión de señal de retención ER, un origen de replicación del vector pUC18, el cual permite la replicación de este plásmido en E. coli, y un gen de beta-lactamasa que confiere resistencia a ampicilina en E. coli . La unidad de transcripción del fragmento scFab con marcador His C-terminal, motivo de sortasa y gen de fusión a señal de retención ER comprende los siguientes elementos funcionales: - el potenciador y promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (P-CMV) incluyendo intrón A, - región no traducida 5' (5'UTR) de inmunoglobulina de la cadena pesada humana, - una secuencia de señal de la cadena pesada de inmunoglobulina de murino, un ácido nucleico que codifica para scFab (Vkappa-huCkappa-enlazador-Vpesado-huCHl), - un ácido nucleico que codifica para marcador His, - un ácido nucleico que codifica para motivo de reconocimiento de sortasa, - un ácido nucleico que codifica para señal de retención ER, y la secuencia de poliadenilación de hormona de crecimiento bovino (BGH pA).

La secuencia de aminoácidos del fragmento scFab maduro del anticuerpo receptor anti-transferrina 3D8 con marcador His C-terminal, motivo de sortasa y proteína de fusión a señal de retención ER es DIQMTQSPASLSASLEEIVTITCQASQDIGNWLAWYQQKPGKSPQLLIYGATSLADGVPSR FSGSRSGTQFSLKISRVQVEDIGIYYCLQAYNTPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASW CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GGEVQLVESGGGLVQPGNSLTLSCVASGFTFSNYGMHWIRQAPKKGLEWIAMIYYDSSKMN YADTVKGRFTISRDNSKNTLYLEMNSLRSEDTAMYYCAVPTSHYW DVWGQGVSVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSW TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGSHHHHHHGSLPETGGSKDEL (SEQ ID NO: 30). b) Generación del plásmido de expresión para un fragmento Fab de cadena individual (scFab) con motivo de glicina-serina N-terminal El gen de fusión scFab que comprende un motivo de glicina-serina N-tertninal se ensambló al fusionar un fragmento de ADN que codifica para el elemento de secuencia respectivo ((G4S)2, SEQ ID NO: 31) a una molécula Fab de cadena individual quimérica de rata-humano (Vkappa-huCkappa-enlazador-Vheavy-huCHl).

El plásmido de expresión para la expresión transitoria de un fragmento scFab con un motivo de glicina-serina N-terminal en células HEK293 comprendía aparte del fragmento scFab con un casete de expresión de motivo de glicina-serina N-terminal, un origen de replicación del vector pUC18, lo cual permite la replicación de este plásmido en E. coli, y un gen de beta-lactamasa que confiere resistencia a ampicilina en E . coli . La unidad de transcripción del fragmento scFab con un gen de fusión a motivo de glicina-serina N-terminal comprende los siguientes elementos funcionales: - el potenciador y promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (P-CMV) incluyendo el intrón A, una región no traducida 5' (5'UTR) de inmunoglobulina de la cadena pesada humana, - una secuencia de señal de la cadena pesada de inmunoglobulina de murino, - un ácido nucleico que codifica para el motivo <G4S)2, un ácido nucleico que codifica para scFab, (Vkappa-huCkappa-linker-Vheavy-huCHl), y - la secuencia de poliadenilación de hormona de crecimiento bovino (BGH pA).

La secuencia de aminoácidos del fragmento scFab maduro del anticuerpo del receptor anti-transferrina 3D8 con motivo de glicina-serina N-terminal es GGGGSGGGGSDIQMTQSPASLSASLEEIVTITCQASQDIGNWLAWYQQKPGKSPQLLIYGA TSLADGVPSRFSGSRSGTQFSLKISRVQVEDIGIYYCLQAYNTPWTFGGGTKVEIKRTVAA PSVFIFPPSDEQLKSGTASW CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGEVQLVESGGGLVQPGNSLTLSCVASGFTFSNYGMHWIRQAPKKGLEWIA MIYYDSSKMNYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLEMNSLRSEDTAMYYCAVPTSHYW DVWGQ GVSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSW TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKVEPKSC (SEQ ID NO: 32). c) Generación del plásmido de expresión para un fragmento de región Fe de anticuerpo (FC) con motivo de glicina triple N-terminal El gen de fusión FC que comprende un motivo de glicina triple N-terminal fue ensamblado al fusionar un fragmento de ADN que codifica para el elemento de secuencia respectivo (GGG, SEQ ID NO: 33) a una molécula de la región Fe de la cadena pesada de anticuerpo humano.

El plásmido de expresión para la expresión transitoria de un fragmento de región Fe de anticuerpo con motivo de glicina triple N-terminal en células HEK293 comprende aparte de la región Fe de la cadena pesada de anticuerpo con casete de expresión de motivo de glicina triple N-terminal un origen de replicación del vector pUC18, el cual permite la replicación de ese plásmido en E. coli , y un gen de beta-lactamasa que confiere resistencia a ampicilina en E. coli . La unidad de transcripción del fragmento de la región Fe de anticuerpo (FC) con gen de fusión a motivo de glicina triple N-terminal comprende los siguientes elementos funcionales: - el potenciador y promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (P-CMV) que incluye intrón A, una región no traducida 5' (5'UTR) de inmunoglobulina de la cadena pesada humana, una secuencia de señal de la cadena pesada de inmunoglobulina de murino, - un ácido nucleico que codifica para GGG, - un ácido nucleico que codifica para una región Fe, y la secuencia de poliadenilación de hormona de crecimiento bovino (BGH pA).

La secuencia de aminoácidos del fragmento de la región Fe e anticuerpo maduro con motivo de glicina triple N-terminal es GGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 34). d) Plásmido de expresión para cadenas pesada y ligera de anticuerpo Plásmidos de expresión que codifican para los siguientes polipéptidos/proteínas fueron construidos de acuerdo con los métodos detallados arriba: dominio variable de la cadena pesada de pertuzumab combinado con una región constante de la cadena pesada humana de la subclase IgGl que contiene una mutación T366W: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYN QPvFKGPvFTLSVDRSKTLYLQMNSLPvAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKQV SLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CS VMHE ALHNH YTQKS LS LS PGK (SEQ ID NO : 35 ) . dominio variable de la cadena ligera de pertuzumab combinado con una región constante de la cadena ligera kappa humana: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ( SEQ ID NO : 36) . dominio variable de la cadena pesada de trastuzumab combinado con una región constante de la cadena pesada humana de la subclase IgGl que contiene una mutación T366S, L368A y Y407V: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTY1HWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYA DSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSW TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCW VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVS LSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 37). dominio variable de la cadena ligera de trastuzumab combinado con una región constante de la cadena ligera kappa humana: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSR FSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASW CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 38). - fragmento VH-CH1 de anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada de pertuzumab y una región constante 1 (CH1) de la cadena pesada humana de la subclase IgGl que contiene una secuencia de aminoácidos GGGSHHHHHHGSLPETGGSKDEL C-terminal: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYN QRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSW TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK VEPKSCGGGSHHHHHHGSLPETGGSKDEL (SEQ ID NO: 39). - fragmento VH-CH1 de anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada de pertuzumab y una región constante 1 (CH1) de la cadena pesada humana de la subclase IgGl que contiene una secuencia GSHHHHHHGSLPETGGSKDEL C-terminal: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYN QRFKGRFTLS VDRS KNTL YLQMNS LRAEDTAVYYCARNLGPS F YFD YWGQGTLVT V S SAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKVEPKSCGSHHHHHHGSLPETGGSKDEL (SEQ ID NO : 40 ) . - fragmento VH-CH1 de anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada de pertuzumab y una región constante 1 (CH1) de la cadena pesada humana de la subclase IgGl que contiene una secuencia HHHHHHGSLPETGGSKDEL C-terminal: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYN QRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSW TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCHHHHHHGSLPETGGSKDEL (SEQ ID NO: 41). - fragmento VH-CH1 de anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada de trastuzumab y una región constante 1 (CH1) de la cadena pesada humana de la subclase IgGl que contiene una secuencia GGGSHHHHHHGSLPETGGSGSKDEL C-terminal: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTY1HWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYA DSVKGRFTISADTSKTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSW TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKVEPKSCGGGSHHHHHHGSLPETGGSGSKD EL (SEQ ID NO: 42). - fragmento VH-CH1 de anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada de trastuzumab y una región constante 1 (CH1) de la cadena pesada humana de la subclase IgGl que contiene una secuencia GSHHHHHHGSLPETGGSGSKDEL C-terminal: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTY1HWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYA DSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSW TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKVEPKSCGSHHHHHHGSLPETGGSGSKDE L (SEQ ID NO: 43). - fragmento VH-CH1 de anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada de trastuzumab y una región constante 1 (CH1) de la cadena pesada humana de la subclase IgGl que contiene una secuencia HHHHHHGSLPETGGSGSKDEL C-terminal: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTY1HWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYA DS VKGRFT I SADTS KNTAYLQMNS LRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMD YWGQGTLVTVS S AS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKVEPKSCHHHHHHGSLPETGGSGSKDEL (SEQ ID NO : 44 ) . - polipéptido de región Fe de la cadena pesada (IgGl(CH2-CH3 humano)) con mutación T366S, L368A y Y407V que contiene una secuencia GGGDKTHTCPPC N-terminal: GGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVCTLPPSRDELTKQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 45). - polipéptido de región Fe de la cadena pesada (IgGl(CH2-CH3 humano) con mutación T366S, L368A y Y407V que contiene una secuencia GGHTCPPC N-terminal: GGHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 46). - polipéptido de región Fe de la cadena pesada (IgGl(CH2-CH3 humano) con mutación T366S, L368A y Y407V que contiene una secuencia GGCPPC N-terminal: GGCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL VSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 47). polipéptido de la región Fe de cadena pesada (IgGl(CH2-CH3 humano)) con mutación T366W que contiene una secuencia GGGDKTHTCPPC N-terminal: GGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 48). polipéptido de región Fe de la cadena pesada (IgGl(CH2-CH3 humano)) con mutaciones T366W que contiene una secuencia GGHTCPPC N-terminal: GGHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 49). polipéptido de región Fe de la cadena pesada (IgGl(CH2-CH3 humano)) con mutación T366W que contiene una secuencia GGCPPC N-terminal: GGCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 50).

Ejemplo 2 Generación de un plásmido de expresión para sortasa A de S. aureus soluble con señal de retención ER C-terminal El gen de fusión a sortasa que comprende una señal de retención ER C-terminal se ensambló al fusionar un fragmento de ADN que codificaba para una señal de retención ER (KDEL) a una molécula de sortasa A (60-206) de Staphylococcus aureus truncada N-terminalmente (SrtA-KDEL) .

El plásmido de expresión para la expresión transitoria de sortasa soluble con señal de retención ER en células HEK293 comprendía aparte de la sortasa soluble con casete de expresión de señal de retención ER un origen de replicación del vector pUC18, que permite la replicación de ese plásmido en E. coli , y un gen de beta-lactamasa que confiere resistencia a ampicilina en E. coli . La unidad de transcripción de la sortasa soluble con señal de retención ER comprende los siguientes elementos funcionales: el potenciador y promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (P-CMV) incluyendo intrón A, una región no traducida 5' (5'UTR) de inmunoglobulina de la cadena pesada humana, - una secuencia de señal de la cadena pesada de inmunoglobulina de murino, - un ácido nucleico que codifica para sortasa A de S . aureus truncada N-terminalmente, - un ácido nucleico que codifica para señal de retención ER, y - la secuencia de poliadenilación de hormona de crecimiento bovino (BGH pA).

Ya que el residuo de aminoácido C-terminal de la sortasa de S . aureus truncada N-terminalmente ya es una lisina (K), sólo la secuencia de aminoácidos DEL tuvo que ser fusionada en el extremo C-terminal de la enzima para poder establecer una señal de retención ER funcional ( (KDEL).

La secuencia de aminoácidos de la sortasa soluble madura con señal de retención ER (KDEL) es QAKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEENESLDDQNISIAGH TFIDRPNYQFTNLKAAKKGSMVYFKVGNETRKYKMTSIRDVKPTDVGVLDEQKGKDKQLTL ITCDDYNEKTGVWEKRKIFVATEVKDEL (SEQ ID NO: 51).

La secuencia de aminoácidos de la sortasa soluble madura con señal de retención en retículo endoplásmico GSKDEL es QAKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEENESLDDQNISIAGH TFIDRPNYQFTNLKAAKKGSMVYFKVGNETRKYKMTSIRDVKPTDVGVLDEQKGKDKQLTL ITCDDYNEKTGVWEKRKIFVATEVKGSKDEL (SEQ ID NO: 52).

Ejemplo 3 Expresión transitoria, purificación y caracterización analítica de los conjugados generados in vivo por transpeptidación mediada por sortasa Los conjugados fueron generados in vivo en células HEK293 transfectadas transitoriamente (derivadas de la línea de células de riñón embrionario humano 293) cultivadas en medio F17 (Invitrogen Corp.). Para la transfección, se usó el Reactivo de Transfección "293-Free" (Novagen). Las moléculas scFab extendidas N- y C-terminalmente como las descritas arriba así como la sortasa soluble fueron cada una expresadas a partir de plásmidos de expresión individuales. Las transfecciones se llevaron a cabo como se especifica en las instrucciones del fabricante. Sobrenadantes de cultivos de células que contenían proteínas de fusión fueron cosechados tres a siete (3-7) días después de la transfección. Los sobrenadantes fueron almacenados a temperatura reducida (por ejemplo, -80°C) hasta purificación.

Información general con respecto a la expresión recombinante de inmunoglobulinas humanas en, por ejemplo, células HEK293 se da en: Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203.

Los sobrenadantes de cultivo fueron filtrados y posteriormente purificados por cromatografía de afinidad a iones de Ni2+. Las proteínas secretadas que comprendían marcador His fueron capturadas por cromatografía de afinidad usando Ni Sepharose™ high performance His-Trap HP (GE Helathcare). Las proteínas no unidas fueron retiradas por lavado con amortiguador Tris 10 mM pH 7.5 que contenía 500 mM de NaCl y 30 mM de imidazol. Las proteínas que contenían marcador His unido fueron eluidas con 10 M de amortiguador Tris pH 7.5 que contenía 500 mM de NaCl y 500 mM de imidazol. La cromatografía de exclusión de tamaño en Superdex 200™ (GE Healthcare) se usó como segunda etapa de purificación. La cromatografía de exclusión de tamaño se llevó a cabo en 20 mM de amortiguador de histidina, NaCl 0.14 M, pH 6.0. Las proteínas recuperadas fueron dializadas en 10 mM de amortiguador de histidina, pH 6.0 que contenía 140 mM de NaCl, y se almacenaron a -80°C.

La concentración de proteínas de las proteínas se determinó al medir la densidad óptica (OD) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado sobre la base de la secuencia de aminoácidos. La pureza se analizó por SDS-PAGE en presencia y ausencia de un agente reductor (5 mM de 1,4-ditiotreitol) y tiñendo con azul brillante de Coomassie. El contenido agregado de las preparaciones de proteína de fusión Fe se determinó por SEC de alto rendimiento usando una columna de exclusión de tamaño analítica SK3000SWxl (Tosohaas, Stuttgart, Alemania). La integridad del esqueleto de aminoácidos de las proteínas de fusión Fe reducidas se verificó por espectrometría de masas Nano Electrospray QTOF después de la remoción de N-glucanos por tratamiento enzimático con péptido -N-glucosidasa F (Roche Applied Science).

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para producir un polipéptido que comprende al menos dos dominios de polipéptido, caracterizado porque comprende la etapa de - cultivar una célula que comprende a) un ácido nucleico que codifica para una sortasa de S. aureus soluble con una señal de retención en retícula endoplásmico C-terminal, b) un ácido nucleico que codifica para un primer dominio de polipéptido que comprende en su extremo C-terminal un motivo de sortasa seguido por una señal de retención en retículo endoplásmico, y c) un ácido nucleico que codifica para un segundo dominio de polipéptido que comprende en su extremo N-terminal al menos una diglicina, con lo cual la célula secreta el conjugado de sortasa A del primer dominio de polipéptido y el segundo dominio de polipéptido, produciendo de esta manera un polipéptido que comprende al menos dos dominios de polipéptido.

2. Un método para producir un aglutinante multiespecífico que comprende al menos dos entidades de unión, caracterizado porque comprende la etapa de - cultivar una célula que comprende a) un ácido nucleico que codifica para una sortasa A de S. aureus soluble con una señal de retención en retículo endoplásmico C-terminal, b) un ácido nucleico que codifica para una primera entidad de unión que comprende en su extremo C-terminal un motivo de sortasa seguido por una señal de retención en retículo endoplásmico, y c) un ácido nucleico que codifica para una segunda entidad de unión que comprende en su extremo N-terminal al menos una diglicina, con lo cual la célula secreta el conjugado de sortasa A de la primera entidad de unión y la segunda entidad de unión, con lo cual la primera entidad de unión se une específicamente a un primer antígeno objetivo y la segunda entidad de unión se une específicamente a un segundo antígeno objetivo, produciendo así un aglutinante multiespecífico que comprende al menos dos entidades de unión.

3. Un método para seleccionar un aglutinante multiespecífico que se une específicamente a dos epítopos o antígenos diferentes, caracterizado porque comprende la etapa de seleccionar a partir de una multitud de aglutinantes multiespecíficos que comprenden diferentes combinaciones de una primera entidad de unión y una segunda entidad de unión un aglutinante multiespecífico que se une específicamente a dos epítopos o antígenos diferentes, en donde los miembros de la multitud de aglutinantes multiespecíficos se obtienen cada uno por el método de conformidad con la reivindicación 2.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque un aglutinante multiespecífico se selecciona con base en su especificidad y/o selectividad y/o afinidad de unión y/o función efectora y/o vida media in vivo.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque la entidad de unión es un par cognado de un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque el aglutinante multiespecífico es un anticuerpo biespecífico que comprende dos o cuatro entidades de unión.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer dominio de polipéptido y el segundo dominio de polipéptido se seleccionan independientemente entre sí a partir de anticuerpo de longitud completa, scFv, scFab, cadena pesada de anticuerpo, cadena ligera de anticuerpo, fragmento de región Fe de cadena pesada de anticuerpo, par de dominio variable de cadena ligera de anticuerpo y dominio variable de cadena pesada de anticuerpo, VH, VL, CH1, CH2, CH3, CH4, CL, región de bisagra de anticuerpo, citocina, receptor, ligando receptor, marcador detectable, etiqueta y socio de un par de unión.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la señal de retención en retículo endoplásmico se selecciona de SEQ ID NO: 02 (KDEL), SEQ ID NO: 03 (HDEL) O SEQ ID NO: 04 (SFIXXXXMP).

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el motivo de sortasa es LPXTG (SEQ ID NO: 01, en donde X puede ser cualquier residuo de aminoácido).

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el primer dominio de unión o la primera entidad de unión está dentro de los 20 residuos de aminoácido C-terminales de la secuencia de aminoácidos LPXTG (SEQ ID NO: 01, en donde X puede ser cualquier residuo de aminoácido).

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la célula es una célula de mamífero o una célula de levadura.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la célula de mamífero se selecciona de una célula HEK, una célula CHO o una célula BHK.

13. Un método para seleccionar un anticuerpo biespecífico, caracterizado porque comprende las siguientes etapas (i) determinar los marcadores de superficie celular presentes en una célula que contenga muestra y seleccionar los mismos al menos en un primer marcador de superficie y un segundo marcador de superficie, (ii) transfectar una célula con (a) un ácido nucleico que codifique para un anticuerpo Fab, o fragmento scFab, o un anticuerpo scFv que comprenda dentro de los 20 residuos de aminoácidos C-terminales la secuencia de aminoácidos LPXTG (SEQ ID NO: 01, en donde X puede ser cualquier residuo de aminoácidos) seguido por una señal de retención en retículo endoplásmico KDEL (SEQ ID NO: 02), con lo cual el fragmento Fab o scFab, o anticuerpo scFv se une específicamente al primer marcador de superficie o su ligando, (b) un ácido nucleico que codifica para un fragmento de anticuerpo de un brazo que comprende una cadena pesada de anticuerpo de longitud completa, una cadena ligera de anticuerpo de longitud completa y un polipéptido de la región Fe de la cadena pesada de anticuerpo, en donde la cadena pesada de anticuerpo de longitud completa y la cadena ligera de anticuerpo de longitud completa son cadenas de anticuerpo cognadas complementarias entre sí y el par de dominios variables (VH y VL) de las mismas forma un sitio de unión a antígeno que se une específicamente al segundo marcador superficial o su ligando, con lo cual la cadena pesada de anticuerpo de longitud completa y el polipéptido de región Fe de la cadena pesada de anticuerpo se enlazan covalentemente entre sí por medio de uno o más enlaces de disulfuro formando una región de bisagra de anticuerpo, y con lo cual el polipéptido de la región Fe de la cadena pesada de anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos de oligoglicina Gm (m = 2, o 3, o 4, o 5) en su extremo N-terminal, y (c) un ácido nucleico que codifica para una sortasa A soluble con una señal de retención en retículo endoplásmico C-terminal, y produciendo de esta manera el anticuerpo biespecífico.

14. Un método para determinar una combinación de sitios de unión a antígeno, caracterizado porque comprende las siguientes etapas (i) determinar la especificidad y/o selectividad y/o afinidad de unión y/o función efectora y/o vida media in vivo de una multitud de anticuerpos biespecíficos preparados al combinar (a) cada miembro de una primera multitud de anticuerpo Fab, o fragmentos scFab, o fragmentos de anticuerpo scFv con lo cual cada miembro comprende dentro de los 20 residuos de aminoácido C-terminales la secuencia de aminoácidos LPXTG (SEQ ID NO: 01, en donde X puede ser cualquier residuo de aminoácido) seguida por una señal de retención en retículo endoplásmico KDEL (SEQ ID NO: 02), con lo cual el Fab, o el fragmento scFab o anticuerpo scFv se une específicamente a un primer epítopo o antígeno, con (b) cada miembro de una multitud de fragmento de anticuerpo de un v brazo que comprende una cadena pesada de anticuerpo de longitud completa, una cadena ligera de anticuerpo de longitud completa y un polipéptido de región Fe de la cadena pesada de anticuerpo, con lo cual la cadena pesada de anticuerpo de longitud completa y la cadena ligera de anticuerpo de longitud completa son cadenas de anticuerpo cognadas complementarias entre sí y el par de dominios variables (VH y VL) de las mismas forma un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un segundo epítopo o antígeno, con lo cual la cadena pesada de anticuerpo de longitud completa y el polipéptido de región Fe de cadena pesada de anticuerpo se enlaza covalentemente entre sí por medio de uno o más enlaces de disulfuro formando una región de gozne de anticuerpo, y con lo cual el polipéptido de la región Fe de la cadena pesada de anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos de oligoglicina Gm (m = 2, o 3, o 4, o 5) en su extremo N-terminal, por medio de una reacción de acoplamiento enzimático intracelular mediada por sortasa A de S. aureus, y (ii) seleccionar el anticuerpo biespecífico con especificidad y/o selectividad y/o afinidad de unión y/o función efectora y/o vida media in vivo adecuada y determinar de esta manera una combinación de sitios de unión a antígeno.

15. Un anticuerpo biespecífico caracterizado porque se obtiene por el método de conformidad con cualquiera de la reivindicación 6 a 13.

16. Un anticuerpo biespecífico caracterizado porque I comprende la secuencia de aminoácidos LPXTG (SEQ ID NO: 01, en donde X puede ser cualquier residuo de aminoácido) en una de sus cadenas pesadas.

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13 o el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16, caracterizado porque la región Fe comprende una mutación del residuo de aminoácido de origen natural en la posición 329 y al menos una mutación adicional de al menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende residuos de aminoácido en la posición 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322 y 331 a un residuo diferente, en donde los residuos en la región Fe son numerados de acuerdo con el índice EU de Kabat.

18. Una formulación farmacéutica caracterizada porque comprende el anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 15 o 16 ó 17.

19. Uso del anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 15 o 16 o 17, en la manufactura de un medicamento.