JP3538611B2 - 高親和性ｉｐ３結合ポリペプチド - Google Patents
高親和性ｉｐ３結合ポリペプチドInfo
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、イノシトール1,4,
5-三リン酸に対し高親和性結合活性を有するポリペプチ
ド、該ポリペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子を含
有する組換えベクター、該ベクターを含む形質転換体及
びイノシトール1,4,5-三リン酸に対する高親和性結合ポ
リペプチドの製造方法に関する。
5-三リン酸に対し高親和性結合活性を有するポリペプチ
ド、該ポリペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子を含
有する組換えベクター、該ベクターを含む形質転換体及
びイノシトール1,4,5-三リン酸に対する高親和性結合ポ
リペプチドの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】イノシトール1,4,5−三リン酸（以下、I
P3ともいう）は、ホルモン、成長因子、神経伝達物質な
どの細胞外刺激を受けてイノシトールリン脂質代謝が活
性化されることにより産生されるセカンドメッセンジャ
ーの一つである。IP3は、細胞内カルシウム濃度の増加
を誘導する物質であり、このIP3誘導カルシウム上昇
は、幅広い動物種における様々な細胞機能を制御する普
遍性の高い重要なシグナル伝達機構である。例えば、IP
3は、線虫[線形動物]、ショウジョウバエ[節足動物]、
イカ[軟体動物]などの無脊椎動物からマウスやヒトなど
の脊椎動物に至るまで、広範囲にわたり受精と胚発生、
発生分化、細胞増殖、分泌、免疫、筋収縮、脳神経（味
覚、視覚、記憶、学習等）などの多くの生理機能を制御
している。
P3ともいう）は、ホルモン、成長因子、神経伝達物質な
どの細胞外刺激を受けてイノシトールリン脂質代謝が活
性化されることにより産生されるセカンドメッセンジャ
ーの一つである。IP3は、細胞内カルシウム濃度の増加
を誘導する物質であり、このIP3誘導カルシウム上昇
は、幅広い動物種における様々な細胞機能を制御する普
遍性の高い重要なシグナル伝達機構である。例えば、IP
3は、線虫[線形動物]、ショウジョウバエ[節足動物]、
イカ[軟体動物]などの無脊椎動物からマウスやヒトなど
の脊椎動物に至るまで、広範囲にわたり受精と胚発生、
発生分化、細胞増殖、分泌、免疫、筋収縮、脳神経（味
覚、視覚、記憶、学習等）などの多くの生理機能を制御
している。
【０００３】その分子メカニズムは、IP3がその標的で
あるIP3受容体に結合することから始まる。すなわち、I
P3が細胞内カルシウム貯蔵部位（小胞体など）に存在す
るIP3受容体（IP3感受性カルシウムチャネル）に結合す
ると、チャネルが開口してカルシウム貯蔵部位からカル
シウムが細胞質に放出され、多くのカルシウム依存性の
タンパク質や酵素の活性をコントロールするというもの
である。
あるIP3受容体に結合することから始まる。すなわち、I
P3が細胞内カルシウム貯蔵部位（小胞体など）に存在す
るIP3受容体（IP3感受性カルシウムチャネル）に結合す
ると、チャネルが開口してカルシウム貯蔵部位からカル
シウムが細胞質に放出され、多くのカルシウム依存性の
タンパク質や酵素の活性をコントロールするというもの
である。
【０００４】IP3で誘導されたカルシウムのシグナル伝
達に関与する化合物としてヘパリン、アデノホスチン
（カビの代謝化合物の一種）及びゼストスポンジン（海
綿の代謝化合物の一種）が挙げられる。しかし、ヘパリ
ンはIP3結合を阻害するが、細胞内での標的が多く特異
性が低い。また、アデノホスチンはIP3結合の拮抗的ア
ゴニストでIP3受容体チャネルの強力な活性剤である
が、カビからの収量が低く膜透過性もないため使用に限
界がある。そして、ゼストスポンジンはIP3の結合には
影響しないIP3受容体チャネルの阻害剤であると最近報
告されたが、収量が低く特異性についても不明な点が多
い。従って、現在では、IP3誘導カルシウムシグナル伝
達に作用する有用な化合物はほとんど存在しない。特
に、細胞レベルで増加したIP3を特異的にトラップする
ことで、IP3誘導カルシウムシグナル伝達を阻害する物
質やシステムはこれまでに存在しない。
達に関与する化合物としてヘパリン、アデノホスチン
（カビの代謝化合物の一種）及びゼストスポンジン（海
綿の代謝化合物の一種）が挙げられる。しかし、ヘパリ
ンはIP3結合を阻害するが、細胞内での標的が多く特異
性が低い。また、アデノホスチンはIP3結合の拮抗的ア
ゴニストでIP3受容体チャネルの強力な活性剤である
が、カビからの収量が低く膜透過性もないため使用に限
界がある。そして、ゼストスポンジンはIP3の結合には
影響しないIP3受容体チャネルの阻害剤であると最近報
告されたが、収量が低く特異性についても不明な点が多
い。従って、現在では、IP3誘導カルシウムシグナル伝
達に作用する有用な化合物はほとんど存在しない。特
に、細胞レベルで増加したIP3を特異的にトラップする
ことで、IP3誘導カルシウムシグナル伝達を阻害する物
質やシステムはこれまでに存在しない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、イノシトー
ル1,4,5-三リン酸に対する高親和性結合ポリペプチド、
該ポリペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子を含有す
る組換えベクター、該ベクターを含む形質転換体及びイ
ノシトール1,4,5-三リン酸に対する高親和性結合ポリペ
プチドの製造方法を提供することを目的とする。
ル1,4,5-三リン酸に対する高親和性結合ポリペプチド、
該ポリペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子を含有す
る組換えベクター、該ベクターを含む形質転換体及びイ
ノシトール1,4,5-三リン酸に対する高親和性結合ポリペ
プチドの製造方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意研究を行った結果、IP3受容体のN末端
側の一部のアミノ酸配列を有するタンパク質からIP3に
対し極めて高い親和性の結合活性を有するポリペプチド
を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
解決するため鋭意研究を行った結果、IP3受容体のN末端
側の一部のアミノ酸配列を有するタンパク質からIP3に
対し極めて高い親和性の結合活性を有するポリペプチド
を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明は、以下の(a)、(b)又は
(c)の組換えポリペプチドである。 (a) 配列番号14で表わされるアミノ酸配列を含むポリペ
プチド (b) 配列番号14で表わされるアミノ酸配列において１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列を含み、かつイノシトール1,4,5-三リン酸
との高親和性結合活性を有するポリペプチド (c) 配列番号14で表わされるアミノ酸配列と相同性が70
％以上のアミノ酸配列からなり、かつイノシトール1,4,
5-三リン酸との高親和性結合活性を有するポリペプチド
(c)の組換えポリペプチドである。 (a) 配列番号14で表わされるアミノ酸配列を含むポリペ
プチド (b) 配列番号14で表わされるアミノ酸配列において１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列を含み、かつイノシトール1,4,5-三リン酸
との高親和性結合活性を有するポリペプチド (c) 配列番号14で表わされるアミノ酸配列と相同性が70
％以上のアミノ酸配列からなり、かつイノシトール1,4,
5-三リン酸との高親和性結合活性を有するポリペプチド
【０００８】さらに、本発明は、前記(a) 、(b)若しく
は(c)のポリペプチドをコードする遺伝子、又は該遺伝
子と相同性が70％以上の塩基配列からなり、かつイノシ
トール1,4,5-三リン酸との高親和性結合活性を有するポ
リペプチドをコードする遺伝子である。
は(c)のポリペプチドをコードする遺伝子、又は該遺伝
子と相同性が70％以上の塩基配列からなり、かつイノシ
トール1,4,5-三リン酸との高親和性結合活性を有するポ
リペプチドをコードする遺伝子である。
【０００９】さらに、本発明は、以下の(d)又は(e)のDN
Aを含む遺伝子である。 (d) 配列番号13で表わされる塩基配列からなるDNA (e) 配列番号13で表わされる塩基配列からなるDNAと相
同性が70％以上の塩基配列からなり、かつイノシトール
1,4,5-三リン酸との高親和性結合活性を有するポリペプ
チドをコードするDNA
Aを含む遺伝子である。 (d) 配列番号13で表わされる塩基配列からなるDNA (e) 配列番号13で表わされる塩基配列からなるDNAと相
同性が70％以上の塩基配列からなり、かつイノシトール
1,4,5-三リン酸との高親和性結合活性を有するポリペプ
チドをコードするDNA
【００１０】さらに、本発明は、前記遺伝子を含有する
組換えベクターである。さらに、本発明は、前記組換え
ベクターを含む形質転換体である。さらに、本発明は、
前記形質転換体を培養し、得られる培養物からイノシト
ール1,4,5-三リン酸に対し高親和性結合活性を有するポ
リペプチドを採取することを特徴とする前記ポリペプチ
ドの製造方法である。
組換えベクターである。さらに、本発明は、前記組換え
ベクターを含む形質転換体である。さらに、本発明は、
前記形質転換体を培養し、得られる培養物からイノシト
ール1,4,5-三リン酸に対し高親和性結合活性を有するポ
リペプチドを採取することを特徴とする前記ポリペプチ
ドの製造方法である。
【００１１】さらに、本発明は、前記タンパク質を含
む、IP3誘導性カルシウム拮抗剤若しくはカルシウム産
生に伴う疾患の治療剤、又は前記遺伝子を含む、カルシ
ウム産生に伴う疾患の遺伝子治療剤である。疾患として
は、神経系、血管系、呼吸器系、消化器系、リンパ系、
泌尿器系及び生殖系の組織に生じるものからなる群から
選ばれる少なくとも一つが挙げられる。以下、本発明を
詳細に説明する。
む、IP3誘導性カルシウム拮抗剤若しくはカルシウム産
生に伴う疾患の治療剤、又は前記遺伝子を含む、カルシ
ウム産生に伴う疾患の遺伝子治療剤である。疾患として
は、神経系、血管系、呼吸器系、消化器系、リンパ系、
泌尿器系及び生殖系の組織に生じるものからなる群から
選ばれる少なくとも一つが挙げられる。以下、本発明を
詳細に説明する。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明のポリペプチドは、IP3と
極めて親和性が高く、IP3に対して特異的に結合するタ
ンパク質であり、天然型IP3受容体のN末端側の一部のア
ミノ酸配列を含むもの（切断型ともいう）である。本発
明のポリペプチドを高親和性IP3結合ポリペプチドとも
いう。
極めて親和性が高く、IP3に対して特異的に結合するタ
ンパク質であり、天然型IP3受容体のN末端側の一部のア
ミノ酸配列を含むもの（切断型ともいう）である。本発
明のポリペプチドを高親和性IP3結合ポリペプチドとも
いう。
【００１３】１．IP3受容体をコードする遺伝子のクロ
ーニング 本発明の高親和性IP3結合ポリペプチドを得るため、ま
ず、天然型IP3受容体タンパク質をコードする遺伝子を
クローニングする。IP3受容体遺伝子の塩基配列は既に
公知であるが（Nucleic Acid Res. 17: 5385-5386, 198
9; Nature 342: 32-38, 1989）、以下の通り遺伝子工学
的手法により調製することもできる。
ーニング 本発明の高親和性IP3結合ポリペプチドを得るため、ま
ず、天然型IP3受容体タンパク質をコードする遺伝子を
クローニングする。IP3受容体遺伝子の塩基配列は既に
公知であるが（Nucleic Acid Res. 17: 5385-5386, 198
9; Nature 342: 32-38, 1989）、以下の通り遺伝子工学
的手法により調製することもできる。
【００１４】(1) IP3受容体をコードするcDNAライブラ
リーの作製及びスクリーニング IP3受容体のmRNAの調製は、通常行われる手法により行
うことができる。例えば、マウス小脳などの組織又は細
胞を、グアニジン試薬、フェノール試薬等で処理して全
RNAを得た後、オリゴdT-セルロースやセファロース2Bを
担体とするポリU-セファロース等を用いたアフィニティ
ーカラム法、あるいはバッチ法によりポリ(A+)RNA(mRN
A)を得る。得られたmRNAを鋳型として、オリゴdTプライ
マー及び逆転写酵素を用いて一本鎖cDNAを合成した後、
該一本鎖cDNAから二本鎖cDNAを合成する。このようにし
て得られた二本鎖cDNAを適当なクローニングベクターに
組み込んで組換えベクターを作製する。得られる組換え
ベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、テトラサイク
リン耐性、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を
選択することにより、cDNAのライブラリーを得ることが
できる。
リーの作製及びスクリーニング IP3受容体のmRNAの調製は、通常行われる手法により行
うことができる。例えば、マウス小脳などの組織又は細
胞を、グアニジン試薬、フェノール試薬等で処理して全
RNAを得た後、オリゴdT-セルロースやセファロース2Bを
担体とするポリU-セファロース等を用いたアフィニティ
ーカラム法、あるいはバッチ法によりポリ(A+)RNA(mRN
A)を得る。得られたmRNAを鋳型として、オリゴdTプライ
マー及び逆転写酵素を用いて一本鎖cDNAを合成した後、
該一本鎖cDNAから二本鎖cDNAを合成する。このようにし
て得られた二本鎖cDNAを適当なクローニングベクターに
組み込んで組換えベクターを作製する。得られる組換え
ベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、テトラサイク
リン耐性、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を
選択することにより、cDNAのライブラリーを得ることが
できる。
【００１５】ここで、大腸菌の形質転換は、Hanahanの
方法[Hanahan,D.： J. Mol. Biol. 166：557-580(198
3)]、すなわち塩化カルシウム、塩化マグネシウム又は
塩化ルビジウムを共存させて調製したコンピテント細胞
に、組換えベクターを加える方法等により行うことがで
きる。なお、ベクターとしてプラスミドを用いる場合
は、テトラサイクリン、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝
子を含有することが必要である。また、プラスミド以外
のクローニングベクター、例えばλファージ等を用いる
こともできる。
方法[Hanahan,D.： J. Mol. Biol. 166：557-580(198
3)]、すなわち塩化カルシウム、塩化マグネシウム又は
塩化ルビジウムを共存させて調製したコンピテント細胞
に、組換えベクターを加える方法等により行うことがで
きる。なお、ベクターとしてプラスミドを用いる場合
は、テトラサイクリン、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝
子を含有することが必要である。また、プラスミド以外
のクローニングベクター、例えばλファージ等を用いる
こともできる。
【００１６】上記のようにして得られる形質転換体から
目的のDNAを有する株を選択するスクリーニング方法と
しては、例えば、抗体を用いたイムノスクリーニングに
よる「expression cloning」、あるいは既知の配列から
プライマーを合成し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反
応(PCR)を行う方法が挙げられる。
目的のDNAを有する株を選択するスクリーニング方法と
しては、例えば、抗体を用いたイムノスクリーニングに
よる「expression cloning」、あるいは既知の配列から
プライマーを合成し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反
応(PCR)を行う方法が挙げられる。
【００１７】このようにして得られた、抗体エピトープ
をコードするDNA断片又はDNA増幅断片を、32P、35S又は
ビオチン等で標識してプローブとし、これを形質転換体
のDNAを変性固定したニトロセルロースフィルターとハ
イブリダイズさせ、得られたポジティブ株を検索するこ
とによりさらに他のDNA断片をスクリーニングすること
ができる。
をコードするDNA断片又はDNA増幅断片を、32P、35S又は
ビオチン等で標識してプローブとし、これを形質転換体
のDNAを変性固定したニトロセルロースフィルターとハ
イブリダイズさせ、得られたポジティブ株を検索するこ
とによりさらに他のDNA断片をスクリーニングすること
ができる。
【００１８】(2) 塩基配列の決定
得られたクローンについて塩基配列の決定を行う。塩基
配列の決定はマキサム-ギルバートの化学修飾法、又はM
13ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等
の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基
配列決定装置（例えばPERKIN-ELMER社製373A DNAシーク
エンサー等）を用いて配列決定が行われる。配列番号３
にIP3受容体をコードする天然型（完全長）の遺伝子の
塩基配列を、配列番号４にIP3受容体の完全長のアミノ
酸配列を示す。
配列の決定はマキサム-ギルバートの化学修飾法、又はM
13ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等
の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基
配列決定装置（例えばPERKIN-ELMER社製373A DNAシーク
エンサー等）を用いて配列決定が行われる。配列番号３
にIP3受容体をコードする天然型（完全長）の遺伝子の
塩基配列を、配列番号４にIP3受容体の完全長のアミノ
酸配列を示す。
【００１９】２．本発明の高親和性IP3結合ポリペプチ
ドをコードする遺伝子の設計及び合成 (1) 高親和性IP3結合ポリペプチドをコードする遺伝子
の設計及び合成 本発明の高親和性IP3結合ポリペプチドは、天然型IP3受
容体タンパク質のN末端側の一部の領域の配列を含むも
のであり、完全長のIP3受容体タンパク質のアミノ酸配
列（配列番号４）のうち第579〜800番目以降、好ましく
は579〜734番目以降のアミノ酸が切断されたものであ
る。本発明においては、この切断型ポリペプチドをIP3
スポンジという（図１）。本発明のポリペプチドは、こ
のように切断型とすることにより、IP3に対して親和性
が極めて高くなり、特異的にIP3と結合することができ
る（高親和性IP3結合活性）。
ドをコードする遺伝子の設計及び合成 (1) 高親和性IP3結合ポリペプチドをコードする遺伝子
の設計及び合成 本発明の高親和性IP3結合ポリペプチドは、天然型IP3受
容体タンパク質のN末端側の一部の領域の配列を含むも
のであり、完全長のIP3受容体タンパク質のアミノ酸配
列（配列番号４）のうち第579〜800番目以降、好ましく
は579〜734番目以降のアミノ酸が切断されたものであ
る。本発明においては、この切断型ポリペプチドをIP3
スポンジという（図１）。本発明のポリペプチドは、こ
のように切断型とすることにより、IP3に対して親和性
が極めて高くなり、特異的にIP3と結合することができ
る（高親和性IP3結合活性）。
【００２０】ここで、「高親和性」とは、本発明のIP3
スポンジのIP3に対する親和性が、T734型IP3受容体のIP
3に対する親和性と比較して100〜1000倍（好ましくは50
0〜1000倍）近く高いことを意味する。
スポンジのIP3に対する親和性が、T734型IP3受容体のIP
3に対する親和性と比較して100〜1000倍（好ましくは50
0〜1000倍）近く高いことを意味する。
【００２１】本発明において、IP3スポンジは、配列番
号14で表されるアミノ酸配列を少なくとも含むものであ
る。該アミノ酸配列は、配列番号４で表されるアミノ酸
配列の第226番目から第578番目のアミノ酸に対応する。
本発明では、この範囲のアミノ酸領域をコア領域とす
る。そして、IP3との高親和性結合活性を保持しなが
ら、断片の長さ及び該断片をコードするDNAの長さを任
意に設定することができる。例えば、配列番号４で表さ
れるアミノ酸配列のうち第224番目〜604番目(配列番号
３で表される塩基配列の第998番目〜2140番目の配列に
よりコードされる)のアミノ酸を含むものでもよく、第1
番目〜604番目（配列番号３で表される塩基配列の第329
番目〜2140番目の配列によりコードされる) のアミノ酸
を含むものでもよく、第1番目〜734番目（配列番号３で
表される塩基配列の第329番目〜2540番目の配列により
コードされる) のアミノ酸を含むものでもよい。
号14で表されるアミノ酸配列を少なくとも含むものであ
る。該アミノ酸配列は、配列番号４で表されるアミノ酸
配列の第226番目から第578番目のアミノ酸に対応する。
本発明では、この範囲のアミノ酸領域をコア領域とす
る。そして、IP3との高親和性結合活性を保持しなが
ら、断片の長さ及び該断片をコードするDNAの長さを任
意に設定することができる。例えば、配列番号４で表さ
れるアミノ酸配列のうち第224番目〜604番目(配列番号
３で表される塩基配列の第998番目〜2140番目の配列に
よりコードされる)のアミノ酸を含むものでもよく、第1
番目〜604番目（配列番号３で表される塩基配列の第329
番目〜2140番目の配列によりコードされる) のアミノ酸
を含むものでもよく、第1番目〜734番目（配列番号３で
表される塩基配列の第329番目〜2540番目の配列により
コードされる) のアミノ酸を含むものでもよい。
【００２２】これらの断片は、該断片の外側の領域であ
って配列番号３で表される塩基配列の任意の領域の配列
に基づいてプライマーを設計し、天然型のIP3受容体を
コードするDNA（配列番号３；Nucleic Acid Res. 17: 5
385-5386, 1989; Nature 342: 32-38, 1989）を鋳型と
してPCRを行うことにより得ることができる。
って配列番号３で表される塩基配列の任意の領域の配列
に基づいてプライマーを設計し、天然型のIP3受容体を
コードするDNA（配列番号３；Nucleic Acid Res. 17: 5
385-5386, 1989; Nature 342: 32-38, 1989）を鋳型と
してPCRを行うことにより得ることができる。
【００２３】(2) 本発明のIP3スポンジの変異型をコー
ドする遺伝子（変異型IP3遺伝子）の作製 本発明においては、IP3スポンジのアミノ酸配列の少な
くとも一部に変異を導入することもできる。従って、該
変異型も本発明のIP3スポンジに含まれる。アミノ酸に
変異を導入するには、該アミノ酸をコードする遺伝子の
塩基配列に変異を導入する手法が採用される。
ドする遺伝子（変異型IP3遺伝子）の作製 本発明においては、IP3スポンジのアミノ酸配列の少な
くとも一部に変異を導入することもできる。従って、該
変異型も本発明のIP3スポンジに含まれる。アミノ酸に
変異を導入するには、該アミノ酸をコードする遺伝子の
塩基配列に変異を導入する手法が採用される。
【００２４】遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法若
しくはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる
方法により行うことができる。例えば、変異オリゴヌク
レオチドをプライマーとして用いた部位特異的突然変異
誘発法(Yoshikawa, F. et al., J. Biol. Chem. 271: 1
8277-18284, 1996)に基づいて変異を導入するが、変異
導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）、Mutant-
G(TAKARA社製）、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagene
sis シリーズキットなど）を用いて変異を導入すること
もできる。
しくはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる
方法により行うことができる。例えば、変異オリゴヌク
レオチドをプライマーとして用いた部位特異的突然変異
誘発法(Yoshikawa, F. et al., J. Biol. Chem. 271: 1
8277-18284, 1996)に基づいて変異を導入するが、変異
導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）、Mutant-
G(TAKARA社製）、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagene
sis シリーズキットなど）を用いて変異を導入すること
もできる。
【００２５】まず、本発明のIP3スポンジをコードする
遺伝子（IP3スポンジ遺伝子ともいう）のうち、変異さ
せた塩基及びその変異部位の前後10塩基程度の領域を含
むプライマーを合成する。そして、IP3スポンジ遺伝子
を鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR反応を行う。
この産物を精製後、適当な制限酵素で処理することによ
り、目的の変異型IP3スポンジ遺伝子を得ることができ
る。
遺伝子（IP3スポンジ遺伝子ともいう）のうち、変異さ
せた塩基及びその変異部位の前後10塩基程度の領域を含
むプライマーを合成する。そして、IP3スポンジ遺伝子
を鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR反応を行う。
この産物を精製後、適当な制限酵素で処理することによ
り、目的の変異型IP3スポンジ遺伝子を得ることができ
る。
【００２６】(3) 塩基配列の決定
上記(1)又は(2)の通り得られた遺伝子について塩基配列
の決定を行う。塩基配列の決定はマキサム-ギルバート
の化学修飾法、又はM13ファージを用いるジデオキシヌ
クレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができ
るが、通常は自動塩基配列決定機（例えばPERKIN-ELMER
社製373A DNAシークエンサー等）を用いて配列決定が行
われる。
の決定を行う。塩基配列の決定はマキサム-ギルバート
の化学修飾法、又はM13ファージを用いるジデオキシヌ
クレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができ
るが、通常は自動塩基配列決定機（例えばPERKIN-ELMER
社製373A DNAシークエンサー等）を用いて配列決定が行
われる。
【００２７】配列番号１に本発明のIP3スポンジ遺伝子
の塩基配列を、配列番号2に本発明のIP3スポンジのアミ
ノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列からなるポリ
ペプチドがIP3に対し高親和性であり、IP3と特異的に結
合する活性（高親和性IP3結合活性）を有する限り、当
該アミノ酸配列において少なくとも１個、例えば１若し
くは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じ
てもよい。
の塩基配列を、配列番号2に本発明のIP3スポンジのアミ
ノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列からなるポリ
ペプチドがIP3に対し高親和性であり、IP3と特異的に結
合する活性（高親和性IP3結合活性）を有する限り、当
該アミノ酸配列において少なくとも１個、例えば１若し
くは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じ
てもよい。
【００２８】また、コア領域（配列番号14で表わされる
アミノ酸配列）の少なくとも１個、好ましくは１〜10個
程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失して
もよく、配列番号14で表わされるアミノ酸配列に少なく
とも１個、好ましくは１〜10個程度、さらに好ましくは
１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列
番号14で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好
ましくは１〜10個程度、さらに好ましくは１〜５個のア
ミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
アミノ酸配列）の少なくとも１個、好ましくは１〜10個
程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失して
もよく、配列番号14で表わされるアミノ酸配列に少なく
とも１個、好ましくは１〜10個程度、さらに好ましくは
１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列
番号14で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好
ましくは１〜10個程度、さらに好ましくは１〜５個のア
ミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
【００２９】また、コア領域のアミノ酸配列を含むもの
であって、天然型IP3受容体のアミノ酸配列（配列番号
４）のうちN末端側の第579〜800番目以降、好ましくは5
79〜734番目以降のアミノ酸が切断されているものであ
れば、アミノ酸の長さに限定されるものではない。例え
ば、配列番号４で表されるアミノ酸配列の第224〜604番
目のアミノ酸（G224という）及び該アミノ酸をコードす
る遺伝子も本発明のIP3スポンジ及びIP3スポンジ遺伝子
に含まれる。
であって、天然型IP3受容体のアミノ酸配列（配列番号
４）のうちN末端側の第579〜800番目以降、好ましくは5
79〜734番目以降のアミノ酸が切断されているものであ
れば、アミノ酸の長さに限定されるものではない。例え
ば、配列番号４で表されるアミノ酸配列の第224〜604番
目のアミノ酸（G224という）及び該アミノ酸をコードす
る遺伝子も本発明のIP3スポンジ及びIP3スポンジ遺伝子
に含まれる。
【００３０】さらに、G224のアミノ酸配列のほか、該ア
ミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜10個程
度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸において前記
変異が生じてもよい。従って、G224のアミノ酸配列にお
いて、第441番目のアルギニンがグルタミンに置換した
もの（m49という）なども本発明のIP3スポンジに含まれ
る(図1参照）。なお、アミノ酸の位置の番号は、配列番
号４で表されるアミノ酸配列の1番目の位置を基準とし
て（第１番目）指定したものである。
ミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜10個程
度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸において前記
変異が生じてもよい。従って、G224のアミノ酸配列にお
いて、第441番目のアルギニンがグルタミンに置換した
もの（m49という）なども本発明のIP3スポンジに含まれ
る(図1参照）。なお、アミノ酸の位置の番号は、配列番
号４で表されるアミノ酸配列の1番目の位置を基準とし
て（第１番目）指定したものである。
【００３１】さらに、コア領域（配列番号14で表わされ
るアミノ酸配列）と相同性が70％以上のアミノ酸配列か
らなり、かつイノシトール1,4,5-三リン酸との高親和性
結合活性を有するポリペプチドも、本発明のポリペプチ
ドに含まれる。
るアミノ酸配列）と相同性が70％以上のアミノ酸配列か
らなり、かつイノシトール1,4,5-三リン酸との高親和性
結合活性を有するポリペプチドも、本発明のポリペプチ
ドに含まれる。
【００３２】従って、上記変異が導入されたアミノ酸配
列を有し、かつIP3との高親和性結合活性を有するポリ
ペプチドをコードする遺伝子も、本発明の遺伝子に含ま
れる。また、本発明のIP3スポンジに含まれるアミノ酸
をコードする塩基配列のほか、縮重コドンにおいてのみ
異なる同一のポリペプチドをコードする縮重異性体も本
発明の遺伝子に含まれる。さらに、上記遺伝子の塩基配
列と70％以上の相同性を有するDNA、例えばIP3受容体遺
伝子ファミリーに属する他のタイプDNAであって本発明
のポリペプチドの対応する領域をコードするDNAも本発
明の遺伝子に含まれる。
列を有し、かつIP3との高親和性結合活性を有するポリ
ペプチドをコードする遺伝子も、本発明の遺伝子に含ま
れる。また、本発明のIP3スポンジに含まれるアミノ酸
をコードする塩基配列のほか、縮重コドンにおいてのみ
異なる同一のポリペプチドをコードする縮重異性体も本
発明の遺伝子に含まれる。さらに、上記遺伝子の塩基配
列と70％以上の相同性を有するDNA、例えばIP3受容体遺
伝子ファミリーに属する他のタイプDNAであって本発明
のポリペプチドの対応する領域をコードするDNAも本発
明の遺伝子に含まれる。
【００３３】一旦本発明の遺伝子の塩基配列が決定され
ると、その後は、化学合成によって、又は決定された当
該塩基配列から合成したプライマーを用いたPCRによっ
て、本発明の遺伝子を得ることができる。
ると、その後は、化学合成によって、又は決定された当
該塩基配列から合成したプライマーを用いたPCRによっ
て、本発明の遺伝子を得ることができる。
【００３４】３．本発明のIP3スポンジ遺伝子を含む組
換えベクター及び形質転換体の作製 (1) 組換えベクターの作製 本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の
IP3スポンジ遺伝子を連結(挿入)することにより得るこ
とができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクター
は、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、
例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられ
る。
換えベクター及び形質転換体の作製 (1) 組換えベクターの作製 本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の
IP3スポンジ遺伝子を連結(挿入)することにより得るこ
とができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクター
は、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、
例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられ
る。
【００３５】プラスミド DNAとしては、大腸菌由来のプ
ラスミド（例えばpET-3a, pBR322,pBR325, pUC118, pUC
119等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110, pTP
5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13, YEp24, YC
p50等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファー
ジ等が挙げられる。また、レトロウイルス、アデノウイ
ルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、ある
いはバキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用
いることもできる。さらに、GST、GFP、His-tag、Myc-t
agなどが連結された融合プラスミド（例えばpGEX-2T,pE
GFP-N3など）を用いることもできる。
ラスミド（例えばpET-3a, pBR322,pBR325, pUC118, pUC
119等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110, pTP
5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13, YEp24, YC
p50等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファー
ジ等が挙げられる。また、レトロウイルス、アデノウイ
ルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、ある
いはバキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用
いることもできる。さらに、GST、GFP、His-tag、Myc-t
agなどが連結された融合プラスミド（例えばpGEX-2T,pE
GFP-N3など）を用いることもできる。
【００３６】ベクターに本発明の遺伝子を挿入するに
は、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、
適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニ
ングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採
用される。
は、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、
適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニ
ングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採
用される。
【００３７】本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発
揮されるようにベクターに組み込まれることが必要であ
る。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本
発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシ
スエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シ
グナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）
などを含有するものを連結することができる。なお、選
択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝
子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子
等が挙げられる。
揮されるようにベクターに組み込まれることが必要であ
る。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本
発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシ
スエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シ
グナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）
などを含有するものを連結することができる。なお、選
択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝
子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子
等が挙げられる。
【００３８】(2) 形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目
的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによ
り得ることができる。ここで、宿主としては、本発明の
遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるもので
はない。例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia c
oli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Ba
cillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プ
チダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属に属す
る細菌が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ(Sacch
aromyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(S
chizosaccharomyces pombe)等の酵母が挙げられ、COS細
胞、CHO細胞、HEK293細胞、PC12細胞等の動物細胞が挙
げられ、あるいはSf9、Sf21等の昆虫細胞が挙げられ
る。
的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによ
り得ることができる。ここで、宿主としては、本発明の
遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるもので
はない。例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia c
oli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Ba
cillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プ
チダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属に属す
る細菌が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ(Sacch
aromyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(S
chizosaccharomyces pombe)等の酵母が挙げられ、COS細
胞、CHO細胞、HEK293細胞、PC12細胞等の動物細胞が挙
げられ、あるいはSf9、Sf21等の昆虫細胞が挙げられ
る。
【００３９】大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発
明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると
同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の
遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ま
しい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれて
いてもよい。
明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると
同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の
遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ま
しい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれて
いてもよい。
【００４０】大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・
コリ(Escherichia coli)BL21、JM109、HB101などが挙げ
られ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(B
acillus subtilis)MI 114、207-21などが挙げられる。
コリ(Escherichia coli)BL21、JM109、HB101などが挙げ
られ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(B
acillus subtilis)MI 114、207-21などが挙げられる。
【００４１】プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現
できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrp
プロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PR
プロモーターなどの、大腸菌ファージに由来するT7プロ
モーターなどが用いられる。tacプロモーターなどのよ
うに、人為的に設計改変されたプロモーターを用いても
よい。
できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrp
プロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PR
プロモーターなどの、大腸菌ファージに由来するT7プロ
モーターなどが用いられる。tacプロモーターなどのよ
うに、人為的に設計改変されたプロモーターを用いても
よい。
【００４２】細菌への組換えベクターの導入方法は、細
菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるもので
はない。例えばカルシウムイオンを用いる方法[Cohen,
S.N.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110-
2114 (1972)]、エレクトロポレーション法等が挙げられ
る。
菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるもので
はない。例えばカルシウムイオンを用いる方法[Cohen,
S.N.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110-
2114 (1972)]、エレクトロポレーション法等が挙げられ
る。
【００４３】酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロ
ミセス・セレビシエ(Saccharomycescerevisiae)、シゾ
サッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pomb
e)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)などが用い
られる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現
できるものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモ
ーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク
質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモータ
ー、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモー
ター、AOX1プロモーター等が挙げられる。
ミセス・セレビシエ(Saccharomycescerevisiae)、シゾ
サッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pomb
e)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)などが用い
られる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現
できるものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモ
ーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク
質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモータ
ー、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモー
ター、AOX1プロモーター等が挙げられる。
【００４４】酵母への組換えベクターの導入方法として
は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定され
ず、例えばエレクトロポレーション法[Becker, D.M. et
al.：Methods. Enzymol., 194： 182-187 (1990)]、ス
フェロプラスト法[Hinnen, A.et al.：Proc. Natl. Aca
d. Sci., USA, 75： 1929-1933 (1978)]、酢酸リチウム
法[Itoh, H.：J. Bacteriol., 153：163-168 (1983)]等
が挙げられる。
は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定され
ず、例えばエレクトロポレーション法[Becker, D.M. et
al.：Methods. Enzymol., 194： 182-187 (1990)]、ス
フェロプラスト法[Hinnen, A.et al.：Proc. Natl. Aca
d. Sci., USA, 75： 1929-1933 (1978)]、酢酸リチウム
法[Itoh, H.：J. Bacteriol., 153：163-168 (1983)]等
が挙げられる。
【００４５】動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞CO
S-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細
胞）、マウスL細胞、ラットGH3、PC12若しくはNG108-15
細胞、又はヒトFL、HEK293、HeLa若しくはJurkat細胞な
どが用いられる。プロモーターとしてSRαプロモータ
ー、SV40プロモーター、LTRプロモーター、β-アクチン
プロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウ
イルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。
S-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細
胞）、マウスL細胞、ラットGH3、PC12若しくはNG108-15
細胞、又はヒトFL、HEK293、HeLa若しくはJurkat細胞な
どが用いられる。プロモーターとしてSRαプロモータ
ー、SV40プロモーター、LTRプロモーター、β-アクチン
プロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウ
イルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。
【００４６】動物細胞への組換えベクターの導入方法と
しては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カル
シウム法、リポフェクション法等が挙げられる。昆虫細
胞を宿主とする場合は、Sf9細胞、Sf21細胞などが用い
られる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法として
は、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、
エレクトロポレーション法などが用いられる。
しては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カル
シウム法、リポフェクション法等が挙げられる。昆虫細
胞を宿主とする場合は、Sf9細胞、Sf21細胞などが用い
られる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法として
は、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、
エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００４７】４．IP3スポンジの生産
本発明のIP3スポンジは、前記形質転換体を培養し、そ
の培養物から採取することにより得ることができる。
「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは
培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意
味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法
は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われ
る。
の培養物から採取することにより得ることができる。
「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは
培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意
味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法
は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われ
る。
【００４８】大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得
られた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得
る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の
培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培
地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源として
は、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン
等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノ
ール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。
られた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得
る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の
培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培
地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源として
は、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン
等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノ
ール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。
【００４９】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム
塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキ
ス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物と
しては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リ
ン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウ
ム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウ
ム等が挙げられる。
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム
塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキ
ス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物と
しては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リ
ン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウ
ム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウ
ム等が挙げられる。
【００５０】培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養
などの好気的条件下、37℃で６〜24時間行う。培養期間
中、pHは7.0〜7.5に保持する。pHの調整は、無機又は有
機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応
じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培
地に添加してもよい。
などの好気的条件下、37℃で６〜24時間行う。培養期間
中、pHは7.0〜7.5に保持する。pHの調整は、無機又は有
機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応
じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培
地に添加してもよい。
【００５１】プロモーターとして誘導性のプロモーター
を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する
場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加して
もよい。例えば、発現ベクターpET-3aはイソプロピル-
β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導可能なT7プ
ロモーターを有するため、該発現ベクターで形質転換し
た微生物を培養するときには IPTG等を培地に添加する
ことができる。また、インドールアクリル酸(IAA)で誘
導可能なtrpプロモーターを用いた発現ベクターで形質
転換した微生物を培養するときにはIAA等を培地に添加
することができる。
を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する
場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加して
もよい。例えば、発現ベクターpET-3aはイソプロピル-
β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導可能なT7プ
ロモーターを有するため、該発現ベクターで形質転換し
た微生物を培養するときには IPTG等を培地に添加する
ことができる。また、インドールアクリル酸(IAA)で誘
導可能なtrpプロモーターを用いた発現ベクターで形質
転換した微生物を培養するときにはIAA等を培地に添加
することができる。
【００５２】動物細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI16
40培地、DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添
加した培地等が挙げられる。培養は、通常、５％CO2存
在下、37℃で１〜30日行う。培養中は必要に応じてカナ
マイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加しても
よい。
を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI16
40培地、DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添
加した培地等が挙げられる。培養は、通常、５％CO2存
在下、37℃で１〜30日行う。培養中は必要に応じてカナ
マイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加しても
よい。
【００５３】培養後、本発明のIP3スポンジが菌体内又
は細胞内に生産される場合には、超音波処理、凍結融解
の繰り返し、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は
細胞を破砕することによりIP3スポンジを採取する。ま
た、本発明のIP3スポンジが菌体外又は細胞外に生産さ
れる場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離
等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質
の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば
硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることに
より、前記培養物中から本発明のIP3スポンジを単離精
製することができる。
は細胞内に生産される場合には、超音波処理、凍結融解
の繰り返し、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は
細胞を破砕することによりIP3スポンジを採取する。ま
た、本発明のIP3スポンジが菌体外又は細胞外に生産さ
れる場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離
等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質
の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば
硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることに
より、前記培養物中から本発明のIP3スポンジを単離精
製することができる。
【００５４】５．カルシウム拮抗剤等
本発明のタンパク質及び遺伝子はIP3誘導カルシウム放
出を阻害する機能を有するため、カルシウム拮抗剤、カ
ルシウム産生に伴う疾患の治療剤、カルシウム産生に伴
う疾患の遺伝子治療剤として有用である。従って、本発
明の治療剤又は遺伝子治療剤を、経口又は非経口的に全
身又は局所投与することができる。
出を阻害する機能を有するため、カルシウム拮抗剤、カ
ルシウム産生に伴う疾患の治療剤、カルシウム産生に伴
う疾患の遺伝子治療剤として有用である。従って、本発
明の治療剤又は遺伝子治療剤を、経口又は非経口的に全
身又は局所投与することができる。
【００５５】本発明のタンパク質又は遺伝子をカルシウ
ム産生に伴う疾患の治療剤又は遺伝子治療剤として使用
する場合は、使用する対象を特に限定するものではな
い。例えば、神経系（脳、脊髄等）、血管系（動脈、静
脈、心臓等）、呼吸器系（気管、肺等）、消化器系（唾
液腺、胃、腸、肝臓、膵臓等）、リンパ系（リンパ節、
脾臓、胸腺等）、泌尿器系（腎臓等）、生殖系（精巣、
卵巣、子宮等）などの組織に生じる疾患について治療又
は予防を特異目的として用いることができる。これらの
疾患は、単独であっても、併発したものであっても、上
記以外の他の疾病を併発したものであってもよく、いず
れも本発明のタンパク質又は遺伝子の使用の対象とする
ことができる。
ム産生に伴う疾患の治療剤又は遺伝子治療剤として使用
する場合は、使用する対象を特に限定するものではな
い。例えば、神経系（脳、脊髄等）、血管系（動脈、静
脈、心臓等）、呼吸器系（気管、肺等）、消化器系（唾
液腺、胃、腸、肝臓、膵臓等）、リンパ系（リンパ節、
脾臓、胸腺等）、泌尿器系（腎臓等）、生殖系（精巣、
卵巣、子宮等）などの組織に生じる疾患について治療又
は予防を特異目的として用いることができる。これらの
疾患は、単独であっても、併発したものであっても、上
記以外の他の疾病を併発したものであってもよく、いず
れも本発明のタンパク質又は遺伝子の使用の対象とする
ことができる。
【００５６】本発明の治療剤を経口投与する場合は、錠
剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内
用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれのもので
あってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥生成物に
してもよい。また、本発明の治療剤を非経口投与する場
合は、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内
注射、皮下注射、坐剤などの製剤形態を選択することが
でき、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投
与量容器の状態で提供される。
剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内
用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれのもので
あってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥生成物に
してもよい。また、本発明の治療剤を非経口投与する場
合は、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内
注射、皮下注射、坐剤などの製剤形態を選択することが
でき、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投
与量容器の状態で提供される。
【００５７】これらの各種製剤は、製剤上通常用いられ
る賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、
界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防
腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等な
どを適宜選択し、常法により製造することができる。
る賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、
界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防
腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等な
どを適宜選択し、常法により製造することができる。
【００５８】上記各種製剤は、医薬的に許容される担体
又は添加物を共に含むものであってもよい。このような
担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有
機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニ
ルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸
ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルス
ターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビ
アゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロ
ピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリ
ン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン
酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトー
ル、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物
は、本発明の剤型に応じて上記の中から適宜又は組み合
わせて選択される。
又は添加物を共に含むものであってもよい。このような
担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有
機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニ
ルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸
ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルス
ターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビ
アゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロ
ピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリ
ン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン
酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトー
ル、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物
は、本発明の剤型に応じて上記の中から適宜又は組み合
わせて選択される。
【００５９】本発明の治療剤の投与量は、投与対象の年
齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変える
ことができる。この場合、本発明のタンパク質の有効量
と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合
せとして投与される有効量は、一回につき体重1kgあた
り0.0001〜1000mg/bodyの範囲の投与量を選ぶことがで
き、１日１回から数回に分けて１日以上投与される。
齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変える
ことができる。この場合、本発明のタンパク質の有効量
と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合
せとして投与される有効量は、一回につき体重1kgあた
り0.0001〜1000mg/bodyの範囲の投与量を選ぶことがで
き、１日１回から数回に分けて１日以上投与される。
【００６０】本発明の遺伝子を遺伝子治療剤として使用
する場合は、本発明の遺伝子を注射により直接投与する
方法のほか、該遺伝子が組込まれたベクターを投与する
方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイ
ルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペス
ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レト
ロウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベ
クターを用いることにより効率よく投与することができ
る。また、本発明の遺伝子をリポソームなどのリン脂質
小胞に導入し、そのリポソームを投与する方法を採用し
てもよい。すなわち、リポソームは、生物的に分解可能
な素材を含む閉鎖小胞であるため、リポソームと本発明
の遺伝子とを混合することにより、リポソーム内部の水
層や脂質二分子層に本発明の遺伝子を保持させる（リポ
ソーム-遺伝子複合体）。次に、該複合体を細胞ととも
に培養すると複合体中の遺伝子が細胞内に取り込まれる
（リポフェクション法）。そして、得られる細胞を以下
の投与方法で投与すればよい。
する場合は、本発明の遺伝子を注射により直接投与する
方法のほか、該遺伝子が組込まれたベクターを投与する
方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイ
ルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペス
ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レト
ロウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベ
クターを用いることにより効率よく投与することができ
る。また、本発明の遺伝子をリポソームなどのリン脂質
小胞に導入し、そのリポソームを投与する方法を採用し
てもよい。すなわち、リポソームは、生物的に分解可能
な素材を含む閉鎖小胞であるため、リポソームと本発明
の遺伝子とを混合することにより、リポソーム内部の水
層や脂質二分子層に本発明の遺伝子を保持させる（リポ
ソーム-遺伝子複合体）。次に、該複合体を細胞ととも
に培養すると複合体中の遺伝子が細胞内に取り込まれる
（リポフェクション法）。そして、得られる細胞を以下
の投与方法で投与すればよい。
【００６１】本発明の遺伝子治療剤の投与形態として
は、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、中枢神
経系組織（脳、脊髄等）、血管系（動脈、静脈、心臓
等）、呼吸器系（気管、肺等）、消化器系（唾液腺、
胃、腸、肝臓、膵臓等）、リンパ系（リンパ節、脾臓、
胸腺等）、泌尿器系（腎臓等）、生殖系（精巣、卵巣、
子宮等）などに局所投与を行うことができる。さらに、
カテーテル技術、外科的手術等と組み合わせた投与形態
をを採用することもできる。
は、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、中枢神
経系組織（脳、脊髄等）、血管系（動脈、静脈、心臓
等）、呼吸器系（気管、肺等）、消化器系（唾液腺、
胃、腸、肝臓、膵臓等）、リンパ系（リンパ節、脾臓、
胸腺等）、泌尿器系（腎臓等）、生殖系（精巣、卵巣、
子宮等）などに局所投与を行うことができる。さらに、
カテーテル技術、外科的手術等と組み合わせた投与形態
をを採用することもできる。
【００６２】本発明の遺伝子治療剤の投与量は、年齢、
性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なる
が、通常は、本発明の遺伝子の重量にすると成人1日あ
たり0.01〜100mg/bodyの範囲が適当である。
性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なる
が、通常は、本発明の遺伝子の重量にすると成人1日あ
たり0.01〜100mg/bodyの範囲が適当である。
【００６３】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲が限定されるものではない。 〔実施例1〕 高親和性IP3結合ポリペプチド(IP3スポン
ジ)の発現プラスミドの構築 マウスタイプ1 IP3受容体（mIP3R1）のアミノ末端側の7
34個のアミノ酸（T734）は特異的なIP3結合活性を有す
る。T734をコードするcDNA部分をE. coli形質発現ベク
ターpET-3a(IPTG添加で誘導可能なT7プロモーターによ
り発現制御がなされる）にクローン化したプラスミド p
ET−T734（Yoshikawa F, et al., J. BiolChem.271:182
77-18284, 1996.)を親プラスミドとして、以下のIP3結
合ポリペプチド(以下、高親和性のものはIP3 スポンジ
ともいう)の発現プラスミドを構築した。
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲が限定されるものではない。 〔実施例1〕 高親和性IP3結合ポリペプチド(IP3スポン
ジ)の発現プラスミドの構築 マウスタイプ1 IP3受容体（mIP3R1）のアミノ末端側の7
34個のアミノ酸（T734）は特異的なIP3結合活性を有す
る。T734をコードするcDNA部分をE. coli形質発現ベク
ターpET-3a(IPTG添加で誘導可能なT7プロモーターによ
り発現制御がなされる）にクローン化したプラスミド p
ET−T734（Yoshikawa F, et al., J. BiolChem.271:182
77-18284, 1996.)を親プラスミドとして、以下のIP3結
合ポリペプチド(以下、高親和性のものはIP3 スポンジ
ともいう)の発現プラスミドを構築した。
【００６４】1-1．高親和性IP3スポンジ T604 の発現プ
ラスミド T734の最初のメチオニン（M-1）から604番目のリジン
（K-604）までのポリペプチド（T604）をコードするよ
うに、相補鎖のオリゴヌクレオチドをプライマーとして
用いたPCRによる部位特異的突然変異誘発（Yoshikawa
F, et al., J. Biol Chem.271:18277-18284, 1996.)を
行い、T734の605番目に終止コドン(TAA)とそれに続くBa
mHI認識部位(GGATCC)を導入した。
ラスミド T734の最初のメチオニン（M-1）から604番目のリジン
（K-604）までのポリペプチド（T604）をコードするよ
うに、相補鎖のオリゴヌクレオチドをプライマーとして
用いたPCRによる部位特異的突然変異誘発（Yoshikawa
F, et al., J. Biol Chem.271:18277-18284, 1996.)を
行い、T734の605番目に終止コドン(TAA)とそれに続くBa
mHI認識部位(GGATCC)を導入した。
【００６５】
なお、センスプライマーには、最初のメチオニンコドン
(ATG)を含む直前の配列（下線部位）にNdeIの切断認識
配列(CATATG）を導入した。
(ATG)を含む直前の配列（下線部位）にNdeIの切断認識
配列(CATATG）を導入した。
【００６６】PCR反応液は、鋳型DNA 100ng、10mM KCl、
6mM (NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH8.2)、2mM MgCl2、0.
1% TritonX-100、10μg/ml BSA、200μM dNTPs、1μM
センスプライマー、1μM アンチセンスプライマー、Pfu
DNAポリメラーゼ 2.5ユニットを全量で100μlとして用
いた。PCRは、95℃で1分反応させた後、95℃で1分、57
℃で3分及び72℃で3分の反応を1サイクルとしてこれを3
0サイクル行った。
6mM (NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH8.2)、2mM MgCl2、0.
1% TritonX-100、10μg/ml BSA、200μM dNTPs、1μM
センスプライマー、1μM アンチセンスプライマー、Pfu
DNAポリメラーゼ 2.5ユニットを全量で100μlとして用
いた。PCRは、95℃で1分反応させた後、95℃で1分、57
℃で3分及び72℃で3分の反応を1サイクルとしてこれを3
0サイクル行った。
【００６７】得られた増幅断片を、5'末端側については
NdeIで、3'末端側についてはBamHIで処理し、T734の第6
05番目以降（カルボキシル末端側）のアミノ酸配列を無
くしたアミノ酸配列をコードするDNAを含有する欠失変
異体pET-T604を作製した。
NdeIで、3'末端側についてはBamHIで処理し、T734の第6
05番目以降（カルボキシル末端側）のアミノ酸配列を無
くしたアミノ酸配列をコードするDNAを含有する欠失変
異体pET-T604を作製した。
【００６８】１-2.高親和性IP3スポンジ G224 の発現プ
ラスミド T734の最初のメチオニン(M-1)から 604番目のリジン(K-
604)までのポリペプチド(T604)をコードするように、相
補鎖のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPC
Rによる部位特異的突然変異誘発（Yoshikawa F, et a
l., J. Biol Chem.271:18277-18284, 1996.)を行い、T7
34の605番目に終止コドン(TAA)とそれに続くEcoRI認識
部位(GAATCC)を導入した。。
ラスミド T734の最初のメチオニン(M-1)から 604番目のリジン(K-
604)までのポリペプチド(T604)をコードするように、相
補鎖のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPC
Rによる部位特異的突然変異誘発（Yoshikawa F, et a
l., J. Biol Chem.271:18277-18284, 1996.)を行い、T7
34の605番目に終止コドン(TAA)とそれに続くEcoRI認識
部位(GAATCC)を導入した。。
【００６９】
PCRは1-1に記載の条件と同様の条件で行った。
【００７０】得られた増幅断片を、5'末端側については
NdeIで、3'末端側についてはEcoRIで処理し、T734の第6
05番目以降（カルボキシル末端側）のアミノ酸配列を無
くしたアミノ酸配列をコードするDNAを含有する欠失変
異体pET-T604eを作製した。
NdeIで、3'末端側についてはEcoRIで処理し、T734の第6
05番目以降（カルボキシル末端側）のアミノ酸配列を無
くしたアミノ酸配列をコードするDNAを含有する欠失変
異体pET-T604eを作製した。
【００７１】次に、pET-T604eを鋳型として用いて、PCR
による部位特異的突然変異誘発を行い、T604の224番目
のメチオン(M-224)の直前にBamHI 認識部位（GGATCC)
を導入した。 PCRは1-1に記載の条件と同様の条件で行った。
による部位特異的突然変異誘発を行い、T604の224番目
のメチオン(M-224)の直前にBamHI 認識部位（GGATCC)
を導入した。 PCRは1-1に記載の条件と同様の条件で行った。
【００７２】得られた増幅断片（変異導入プラスミド）
をBamHI及びEcoRIで切断し、第224〜第604番目のアミノ
酸配列をコードするcDNA断片を得た。このcDNA断片をGS
T融合プラスミド pGEX-2TのBamHI-EcoRI部位にインフレ
ームで連結し、pGEX-G224を得た。プラスミド pGEX-G22
4は、GSTに続いてM-224からK-604までのポリペプチドが
ひと続きになった融合ポリペプチドG224(図1)を発現す
るものである。
をBamHI及びEcoRIで切断し、第224〜第604番目のアミノ
酸配列をコードするcDNA断片を得た。このcDNA断片をGS
T融合プラスミド pGEX-2TのBamHI-EcoRI部位にインフレ
ームで連結し、pGEX-G224を得た。プラスミド pGEX-G22
4は、GSTに続いてM-224からK-604までのポリペプチドが
ひと続きになった融合ポリペプチドG224(図1)を発現す
るものである。
【００７３】１-3. 低親和性IP3結合ポリペプチドG224-
m30の発現プラスミド pGEX-G224を鋳型として用いて、連続的PCRによる部位特
異的突然変異誘発を行った。T604の第508番目のリジン
（K-508）をアラニンにする置換変異（K508A）を導入す
るため、以下の2種類のミスマッチオリゴヌクレオチド
を合成した。
m30の発現プラスミド pGEX-G224を鋳型として用いて、連続的PCRによる部位特
異的突然変異誘発を行った。T604の第508番目のリジン
（K-508）をアラニンにする置換変異（K508A）を導入す
るため、以下の2種類のミスマッチオリゴヌクレオチド
を合成した。
【００７４】
5'-GAGAGCGGCAGGCACTGATGAGGG-3'(配列番号９)
5'-CCCTCATCAGTGCCTGCCGCTCTC-3'(配列番号10)
上記プライマーを用いて連続的PCRによる部位特異的突
然変異誘発を行った。PCRの条件及び反応液組成は以下
の通りである。
然変異誘発を行った。PCRの条件及び反応液組成は以下
の通りである。
【００７５】第一反応1
PCRは1-1項に記載の条件と同様の条件で行った。
【００７６】第一反応2
PCRの条件は1-1項に記載のものと同様である。
【００７７】第二反応
第一反応1及び2のPCR反応産物をそれぞれ10μl、プライ
マー（配列番号7及び8)を各1μMとし、第一反応と同様
の条件でPCRを行った。得られた増幅断片をBamHI及びEc
oRIで切断し、この断片をGST融合プラスミドpGEX-2TのB
amHI-EcoRI部位にインフレームで連結し、プラスミド p
GEX-G224-m30を得た。この変異プラスミドは、G224に点
変異K508Aをもつポリペプチド G224-m30を発現するもの
である（図１、m30）。
マー（配列番号7及び8)を各1μMとし、第一反応と同様
の条件でPCRを行った。得られた増幅断片をBamHI及びEc
oRIで切断し、この断片をGST融合プラスミドpGEX-2TのB
amHI-EcoRI部位にインフレームで連結し、プラスミド p
GEX-G224-m30を得た。この変異プラスミドは、G224に点
変異K508Aをもつポリペプチド G224-m30を発現するもの
である（図１、m30）。
【００７８】１-4. 高親和性IP3スポンジ G224-m49 の
発現プラスミド pGEX-G224 を鋳型として用いて、連続的PCRによる部位
特異的突然変異誘発を行った。T604の第441番目のアル
ギニン(R-441)をグルタミンにする置換変異(R441Q)を導
入するため、以下の2種類のミスマッチオリゴヌクレオ
チドを合成した。 5'-GCTGAGGTTCAAGACCTGGACTTTG-3'（配列番号11） 5'-AAAGTCCAGGTCTTGAACCTCAGC-3'（配列番号12）
発現プラスミド pGEX-G224 を鋳型として用いて、連続的PCRによる部位
特異的突然変異誘発を行った。T604の第441番目のアル
ギニン(R-441)をグルタミンにする置換変異(R441Q)を導
入するため、以下の2種類のミスマッチオリゴヌクレオ
チドを合成した。 5'-GCTGAGGTTCAAGACCTGGACTTTG-3'（配列番号11） 5'-AAAGTCCAGGTCTTGAACCTCAGC-3'（配列番号12）
【００７９】第一反応1
PCRの条件は1-3項に記載のものと同様である。
【００８０】第一反応2
PCRの条件は1-3項に記載のものと同様である。
【００８１】第二反応
第一反応1及び2のPCR反応産物をそれぞれ10μl、プライ
マー（配列番号６及び８)を各1μMとし、第一反応と同
様の条件でPCRを行った。得られた増幅断片をBamHI-Eco
RIで切断し、その断片をpGEX-2TのBamHI-EcoRI部位にイ
ンフレームで連結した。得られたプラスミド pGEX-G224
-m49は、G224に点変異R441Qをもつポリペプチド G234-m
49を発現するものである（図１、m49）。
マー（配列番号６及び８)を各1μMとし、第一反応と同
様の条件でPCRを行った。得られた増幅断片をBamHI-Eco
RIで切断し、その断片をpGEX-2TのBamHI-EcoRI部位にイ
ンフレームで連結した。得られたプラスミド pGEX-G224
-m49は、G224に点変異R441Qをもつポリペプチド G234-m
49を発現するものである（図１、m49）。
【００８２】〔実施例2〕高親和性IP3結合ポリペプチド
の大腸菌での発現と調製 IP3結合コアは、大半が不溶性の封入体（inclusion bod
y) となるため発現量が少ない。本発明者は、IP3結合領
域を遺伝子工学的に改変することで、より低分子である
こと、より安定に大量発現できること、可溶性タンパク
質として回収できること、より高い親和性をもつこと、
そして特異性は従来のIP3受容体とほぼ同じであること
を特徴とする高親和性のIP3ポリペプチドの作製を試み
た。
の大腸菌での発現と調製 IP3結合コアは、大半が不溶性の封入体（inclusion bod
y) となるため発現量が少ない。本発明者は、IP3結合領
域を遺伝子工学的に改変することで、より低分子である
こと、より安定に大量発現できること、可溶性タンパク
質として回収できること、より高い親和性をもつこと、
そして特異性は従来のIP3受容体とほぼ同じであること
を特徴とする高親和性のIP3ポリペプチドの作製を試み
た。
【００８３】T734は、低温培養法（16〜22℃) を採用す
ることにより、安定に大量発現ができて可溶性画分への
回収率も比較的良いが（Kd＝50±2.４nM、Bmax＝46pmpl
/mgタンパク質、大腸菌(E.coli)培養の1リットルあたり
1.85mg (E.coli湿重量約0.5ｇが相当）)、この数十倍が
封入体となる（Yoshikawa F, et al., J. Biol Chem.27
1:18277-18284, 1996)。まず、これらの特性を保持した
できるだけ小さいポリペプチドの作製を試みた。
ることにより、安定に大量発現ができて可溶性画分への
回収率も比較的良いが（Kd＝50±2.４nM、Bmax＝46pmpl
/mgタンパク質、大腸菌(E.coli)培養の1リットルあたり
1.85mg (E.coli湿重量約0.5ｇが相当）)、この数十倍が
封入体となる（Yoshikawa F, et al., J. Biol Chem.27
1:18277-18284, 1996)。まず、これらの特性を保持した
できるだけ小さいポリペプチドの作製を試みた。
【００８４】実施例１で得られた発現プラスミドのう
ち、pET 系はE.coli BL21(DE3)に、pGEX系はJM109 に、
それぞれトランスフォーメーション法で導入した。IPTG
による発現誘導、及びE.coliからの発現タンパク質の調
製は、主にYoshikawa らの方法（Yoshikawa F, et al.,
J. Biol Chem.271:18277-18284, 1996)を改良して行っ
た。
ち、pET 系はE.coli BL21(DE3)に、pGEX系はJM109 に、
それぞれトランスフォーメーション法で導入した。IPTG
による発現誘導、及びE.coliからの発現タンパク質の調
製は、主にYoshikawa らの方法（Yoshikawa F, et al.,
J. Biol Chem.271:18277-18284, 1996)を改良して行っ
た。
【００８５】すなわち、各プラスミドが導入されたE.co
liをLブロス(100μg/mlアンピシリン含有）中で22℃で
振とう培養して、吸光度OD600が約1.5になったときにIP
TGを0.5mMになるように添加した。さらに16℃で数時間
振とう培養した後、E.coliを遠沈で回収して、プロテア
ーゼ阻害剤(1mM PMSF, 10μMロイペプチン, 1μMペプス
タチンA, 2μg/mlアプロチニン)を含むPBSに懸濁した。
超音波処理によりE.coliを破砕した後、超遠心分離（Be
ckman Ti35ローター、25,000rpm、1時間、４℃）により
発現ポリペプチドが含まれる上清（可溶性画分）を回収
した。
liをLブロス(100μg/mlアンピシリン含有）中で22℃で
振とう培養して、吸光度OD600が約1.5になったときにIP
TGを0.5mMになるように添加した。さらに16℃で数時間
振とう培養した後、E.coliを遠沈で回収して、プロテア
ーゼ阻害剤(1mM PMSF, 10μMロイペプチン, 1μMペプス
タチンA, 2μg/mlアプロチニン)を含むPBSに懸濁した。
超音波処理によりE.coliを破砕した後、超遠心分離（Be
ckman Ti35ローター、25,000rpm、1時間、４℃）により
発現ポリペプチドが含まれる上清（可溶性画分）を回収
した。
【００８６】可溶性画分からGST融合ポリペプチドを精
製するには、グルタチオン-Sepharoseカラム（Pharmaci
a LKB)を用いたアフィニティー精製法に従って行った。
すなわち、主に製造会社から提供されたマニュアルに従
い、10mM グルタチオン/50mMTris-HCl(pH 8.0)でGST融
合ポリペプチドをカラムから溶出した。そして、PD10脱
塩カラム（Pharmacia LKB) を用いてポリペプチド溶液
を10mM HEPES-KOH(pH7.2), 88mM NaCl, 1mM KCl に平衡
化し、分注して各IP3スポンジを得た(図1；G224,m30,m4
9,GST)。IP3スポンジは、使用するまで-80℃で保存し
た。
製するには、グルタチオン-Sepharoseカラム（Pharmaci
a LKB)を用いたアフィニティー精製法に従って行った。
すなわち、主に製造会社から提供されたマニュアルに従
い、10mM グルタチオン/50mMTris-HCl(pH 8.0)でGST融
合ポリペプチドをカラムから溶出した。そして、PD10脱
塩カラム（Pharmacia LKB) を用いてポリペプチド溶液
を10mM HEPES-KOH(pH7.2), 88mM NaCl, 1mM KCl に平衡
化し、分注して各IP3スポンジを得た(図1；G224,m30,m4
9,GST)。IP3スポンジは、使用するまで-80℃で保存し
た。
【００８７】結果を以下に示す。T734をカルボキシル末
端から少しずつ短くする一連の欠失変異体を作製して解
析した結果、T705及びT699はT734の特性とあまり違いは
なかった。T569、T572、T576では可溶性タンパク質とし
ての発現量が低下した。結果的に、カルボキシル末端を
604番目のリジン（K-604)まで欠失させたT604を作製開
発することで、安定に可溶性タンパク質として大量発現
することに成功した（図１）。
端から少しずつ短くする一連の欠失変異体を作製して解
析した結果、T705及びT699はT734の特性とあまり違いは
なかった。T569、T572、T576では可溶性タンパク質とし
ての発現量が低下した。結果的に、カルボキシル末端を
604番目のリジン（K-604)まで欠失させたT604を作製開
発することで、安定に可溶性タンパク質として大量発現
することに成功した（図１）。
【００８８】図１において、一番上(IP3R1)はIP3受容体
のIP3結合コア領域（core; 226-578アミノ酸) を含むア
ミノ末端側を示す。その下は、順にT604（１〜604 アミ
ノ酸）、G224 (GST ＋224 〜604 アミノ酸）、G224m30
(G224 にK508A 変異）、G224m49 (G224 にR441Q 変異)
、GST (pGEX-2T由来) を示す。
のIP3結合コア領域（core; 226-578アミノ酸) を含むア
ミノ末端側を示す。その下は、順にT604（１〜604 アミ
ノ酸）、G224 (GST ＋224 〜604 アミノ酸）、G224m30
(G224 にK508A 変異）、G224m49 (G224 にR441Q 変異)
、GST (pGEX-2T由来) を示す。
【００８９】T604の[3H]IP3結合活性は、T734と比較す
るとほぼ同じであるが（Kd＝45nM)、可溶性タンパク質
としては高収率(Bmax＝690pmol/mgタンパク質)であっ
た。すなわち、E.coli培養の1リットルあたり19mgの高
収量であった(図２、表１)。
るとほぼ同じであるが（Kd＝45nM)、可溶性タンパク質
としては高収率(Bmax＝690pmol/mgタンパク質)であっ
た。すなわち、E.coli培養の1リットルあたり19mgの高
収量であった(図２、表１)。
【００９０】
【表１】
【００９１】T604は全体の発現量ではT734とほぼ同じで
あるが、可溶性タンパク質としての収率が格段と向上す
る。また、T604は30℃や37℃での培養でもほぼ同等に可
溶性タンパク質としての収率が高く、発現誘導開始後わ
ずか２時間以内でピークに達した。
あるが、可溶性タンパク質としての収率が格段と向上す
る。また、T604は30℃や37℃での培養でもほぼ同等に可
溶性タンパク質としての収率が高く、発現誘導開始後わ
ずか２時間以内でピークに達した。
【００９２】図２において、ａはT604(66kDa)を発現す
る大腸菌抽出液(可溶性画分)の0.1μgのタンパク質をウ
エスタンブロット解析したものである。対照として、T6
04を含まないベクター(pET-3a)のみを形質転換した細胞
抽出液を用いた。ｂは、可溶性画分0.7μl中に含まれる
特異的なIP3結合の総量をT734、T604及びベクターで比
較したものである。ｃは、３μgのT604可溶性画分と9.6
nMの [3H]IP3との結合を各濃度の非標識IP3（cold IP3
ともいう）で競合阻害することで、Schatchardプロット
解析をしたものである。その結果は、Kd＝45±7.6、Bma
x＝690±64pmol/mgタンパク質であった。
る大腸菌抽出液(可溶性画分)の0.1μgのタンパク質をウ
エスタンブロット解析したものである。対照として、T6
04を含まないベクター(pET-3a)のみを形質転換した細胞
抽出液を用いた。ｂは、可溶性画分0.7μl中に含まれる
特異的なIP3結合の総量をT734、T604及びベクターで比
較したものである。ｃは、３μgのT604可溶性画分と9.6
nMの [3H]IP3との結合を各濃度の非標識IP3（cold IP3
ともいう）で競合阻害することで、Schatchardプロット
解析をしたものである。その結果は、Kd＝45±7.6、Bma
x＝690±64pmol/mgタンパク質であった。
【００９３】次に、アミノ末端側を短くする試みを行っ
た。T734のアミノ末端側は、コア領域の外側であって
も、少しでも欠失すると（例えばわずか31アミノ酸が欠
失しても）IP3結合活性を失うが、コア領域のアミノ末
端に近い 220〜225 アミノ酸残基まで短くすると活性が
戻る（Yoshikawaら、1996) 。この原因は不明である
が、おそらくコア領域が活性な立体構造を形成する際に
欠失の程度が立体障害として影響するためと思われる。
アミノ末端を200〜225アミノ酸まで短くした活性型は概
して高親和性であるが、いずれも可溶性タンパク質とし
ての発現量は低減する。
た。T734のアミノ末端側は、コア領域の外側であって
も、少しでも欠失すると（例えばわずか31アミノ酸が欠
失しても）IP3結合活性を失うが、コア領域のアミノ末
端に近い 220〜225 アミノ酸残基まで短くすると活性が
戻る（Yoshikawaら、1996) 。この原因は不明である
が、おそらくコア領域が活性な立体構造を形成する際に
欠失の程度が立体障害として影響するためと思われる。
アミノ末端を200〜225アミノ酸まで短くした活性型は概
して高親和性であるが、いずれも可溶性タンパク質とし
ての発現量は低減する。
【００９４】前記と同様に、T604を元にして223番まで
欠失したタンパク質（N4-T604; アミノ酸残基224番目〜
604番目まで)は、元のT604よりも高活性（約３倍）とな
るが、可溶性タンパク質は大量に得られなかった。従っ
て、結合親和性をもったIP3結合領域のタンパク質のみ
を、安定かつ可溶性タンパク質として大量発現させるに
は、T604が最も適していることがわかった。
欠失したタンパク質（N4-T604; アミノ酸残基224番目〜
604番目まで)は、元のT604よりも高活性（約３倍）とな
るが、可溶性タンパク質は大量に得られなかった。従っ
て、結合親和性をもったIP3結合領域のタンパク質のみ
を、安定かつ可溶性タンパク質として大量発現させるに
は、T604が最も適していることがわかった。
【００９５】〔実施例3〕IP3スポンジの発現
(1) [3H]-IP3結合 (IP3 binding)阻害実験
実施例２により得られた結果に基づき、より高親和性の
IP3結合ポリペプチドの作製を試みた。上述のように、T
604やT734のアミノ末端側を223番目まで欠失すると高い
[3H]IP3結合活性を示す。コアに最も近い224〜579アミ
ノ酸領域の356アミノ酸残基だけでも、Kd＝2.3nMの高親
和性を示す（Yoshikawa ら、1996(前出）) 。しかし、
これらはいずれも可溶性タンパク質としての発現レベル
が低下する。すなわち、アミノ末端を大きく欠失させる
ことが高親和性につながるが、可溶性を有するタンパク
質を安定に大量発現させることはできなくなり、大半が
不溶性の封入体となる。
IP3結合ポリペプチドの作製を試みた。上述のように、T
604やT734のアミノ末端側を223番目まで欠失すると高い
[3H]IP3結合活性を示す。コアに最も近い224〜579アミ
ノ酸領域の356アミノ酸残基だけでも、Kd＝2.3nMの高親
和性を示す（Yoshikawa ら、1996(前出）) 。しかし、
これらはいずれも可溶性タンパク質としての発現レベル
が低下する。すなわち、アミノ末端を大きく欠失させる
ことが高親和性につながるが、可溶性を有するタンパク
質を安定に大量発現させることはできなくなり、大半が
不溶性の封入体となる。
【００９６】一般的に、外来ポリペプチドは GST融合体
にすると安定性・可溶性・発現レベルなどが概して向上
することが知られている。そこで、本実施例では、IP3
受容体のアミノ末端側領域(1〜223番目）の代わりに GS
Tを連結し、GST とIP3結合部位（224〜604アミノ酸領
域）との融合タンパク質G224を作製した（図１）。これ
らの融合タンパク質のIP3結合活性の測定は、主にYoshi
kawa ら(1996)の方法に従った。
にすると安定性・可溶性・発現レベルなどが概して向上
することが知られている。そこで、本実施例では、IP3
受容体のアミノ末端側領域(1〜223番目）の代わりに GS
Tを連結し、GST とIP3結合部位（224〜604アミノ酸領
域）との融合タンパク質G224を作製した（図１）。これ
らの融合タンパク質のIP3結合活性の測定は、主にYoshi
kawa ら(1996)の方法に従った。
【００９７】0.2μgの融合タンパク質（IP3スポンジ）
を、9.6nMのD-myo-[3H](1,4,5)IP3(777 GBq/mmol; DuPo
nt NEN)（以下「[3H]IP3」と略記）及び各濃度の非標識
D-myo-(1,4,5)IP3(Dojindo)(以下「cold IP3」と略記）
を含む100μlの結合バッファーα(50mM Tris-HCl（4℃
でpH8.0），1mM EDTA, 1mM β-メルカプトエタノール)
に混合して、氷上で10分静置した。4μlの50mg/ml γ-
グロブリン(Sigma)(終濃度：1mg/ml)と100μlの30％PEG
6000(Sigma)/結合バッファーα溶液（終濃度：15％）
とを混合した。これをさらに氷上で5分静置後、10,000
×ｇ、２℃で５分間遠心して、ポリペプチド/PEG複合体
を回収した。PEG沈殿させた[3H]IP3結合ポリペプチド
は、180μlの可溶化剤Solvable (DuPont NEN) を加えて
良く可溶化した。18μlの氷酢酸で中和したのちに、５m
lの液体シンチレーションカウンター（Atomlight［DuPo
nt NEN］)に添加して放射活性を測定した。非特異的結
合は、２μMまたは10μM cold IP3存在下での放射活性
を測定することにより決定し、特異的結合は各測定値か
ら非特異的結合値を差し引くことで算出した。
を、9.6nMのD-myo-[3H](1,4,5)IP3(777 GBq/mmol; DuPo
nt NEN)（以下「[3H]IP3」と略記）及び各濃度の非標識
D-myo-(1,4,5)IP3(Dojindo)(以下「cold IP3」と略記）
を含む100μlの結合バッファーα(50mM Tris-HCl（4℃
でpH8.0），1mM EDTA, 1mM β-メルカプトエタノール)
に混合して、氷上で10分静置した。4μlの50mg/ml γ-
グロブリン(Sigma)(終濃度：1mg/ml)と100μlの30％PEG
6000(Sigma)/結合バッファーα溶液（終濃度：15％）
とを混合した。これをさらに氷上で5分静置後、10,000
×ｇ、２℃で５分間遠心して、ポリペプチド/PEG複合体
を回収した。PEG沈殿させた[3H]IP3結合ポリペプチド
は、180μlの可溶化剤Solvable (DuPont NEN) を加えて
良く可溶化した。18μlの氷酢酸で中和したのちに、５m
lの液体シンチレーションカウンター（Atomlight［DuPo
nt NEN］)に添加して放射活性を測定した。非特異的結
合は、２μMまたは10μM cold IP3存在下での放射活性
を測定することにより決定し、特異的結合は各測定値か
ら非特異的結合値を差し引くことで算出した。
【００９８】一方、Scatchardプロット解析は次の条件
で行った。低親和性の場合（G224-m30及び対照のGST)
は、100μlの結合バッファーα中で、２μgのIP3結合ポ
リペプチドに対して9.6nM の[3H]IP3(DuPont NEN)及び1
0-20nMの cold IP3を加えた条件、並びに0.01μgのIP3
結合ポリペプチドに対して9.6nM の[3H]IP3(DuPont NE
N)及び50nM-2μM の cold IP3を加えた条件で結合実験
を行った。高親和性IP3スポンジの場合（G224及びG224-
m49)は、0.02μｇのIP3スポンジに対してcold IP3を加
えず、 [3H]-IP3濃度を0.15, 0.3, 0.6, 1.2, 2.4, 4.
8, 9.6nMに振り分けたサンプルについて結合実験を行っ
た。
で行った。低親和性の場合（G224-m30及び対照のGST)
は、100μlの結合バッファーα中で、２μgのIP3結合ポ
リペプチドに対して9.6nM の[3H]IP3(DuPont NEN)及び1
0-20nMの cold IP3を加えた条件、並びに0.01μgのIP3
結合ポリペプチドに対して9.6nM の[3H]IP3(DuPont NE
N)及び50nM-2μM の cold IP3を加えた条件で結合実験
を行った。高親和性IP3スポンジの場合（G224及びG224-
m49)は、0.02μｇのIP3スポンジに対してcold IP3を加
えず、 [3H]-IP3濃度を0.15, 0.3, 0.6, 1.2, 2.4, 4.
8, 9.6nMに振り分けたサンプルについて結合実験を行っ
た。
【００９９】また、小脳ミクロソームの[3H]IP3結合活
性におけるIP3結合ポリペプチド(IP3スポンジ)の阻害効
果は以下のように解析した。マウスddY(Nippon SLC)小
脳からのミクロソーム画分の調製は、主にNakadaらの方
法(Nakada S. et al., Biochem. J. 277:125-131,1991)
に従った。100μlの結合バッファーα中で、各濃度のIP
3スポンジの添加による、40μgの小脳ミクロソームと9.
6nMの[3H]-IP3との結合の変化を上記の方法（Scatchard
プロット解析を参照）で測定した。
性におけるIP3結合ポリペプチド(IP3スポンジ)の阻害効
果は以下のように解析した。マウスddY(Nippon SLC)小
脳からのミクロソーム画分の調製は、主にNakadaらの方
法(Nakada S. et al., Biochem. J. 277:125-131,1991)
に従った。100μlの結合バッファーα中で、各濃度のIP
3スポンジの添加による、40μgの小脳ミクロソームと9.
6nMの[3H]-IP3との結合の変化を上記の方法（Scatchard
プロット解析を参照）で測定した。
【０１００】その結果、G224はT734の500倍以上も高親
和性であった（Kd＝83pM、Bmax＝1.6pmol/μｇタンパク
質)（図3a）。そして、G224は(1,4,5)IP3及び(2,4,5)IP
3をよく結合し、収量は大腸菌培養1リットルあたり約30
mg IP3結合活性タンパク質であった。また、グルタチオ
ンカラム及びそれに続くPD10カラムによる精製後は、約
24mg/lで回収することができた（表１）。T734にR441Q
変異を導入すると結合活性が上昇するが（Yoshikawa
ら、1996(前出)) 、G224にR441Q 変異を導入したG224-m
49では、親和性がさらに２倍上昇し、T734の約 1,000倍
となった（Kd＝約43pM、Bmax＝1.7pmol/μgタンパク質)
（図３、表１）。一方、T734にK508A 変異を導入すると
結合活性が著減するが（Yoshikawa ら、1996(前出))、G
224にK508A変異を導入したG224-m30においても結合活性
が著減し（Kd＝約330nM 、Bmax ＝3.0pmol/μg タンパ
ク質)、G224の約4,000分の１、G224-m49の約7,700分の
１になった（図３、表１）。
和性であった（Kd＝83pM、Bmax＝1.6pmol/μｇタンパク
質)（図3a）。そして、G224は(1,4,5)IP3及び(2,4,5)IP
3をよく結合し、収量は大腸菌培養1リットルあたり約30
mg IP3結合活性タンパク質であった。また、グルタチオ
ンカラム及びそれに続くPD10カラムによる精製後は、約
24mg/lで回収することができた（表１）。T734にR441Q
変異を導入すると結合活性が上昇するが（Yoshikawa
ら、1996(前出)) 、G224にR441Q 変異を導入したG224-m
49では、親和性がさらに２倍上昇し、T734の約 1,000倍
となった（Kd＝約43pM、Bmax＝1.7pmol/μgタンパク質)
（図３、表１）。一方、T734にK508A 変異を導入すると
結合活性が著減するが（Yoshikawa ら、1996(前出))、G
224にK508A変異を導入したG224-m30においても結合活性
が著減し（Kd＝約330nM 、Bmax ＝3.0pmol/μg タンパ
ク質)、G224の約4,000分の１、G224-m49の約7,700分の
１になった（図３、表１）。
【０１０１】(2) 新規IP3スポンジによるIP3結合の吸収
阻害 IP3結合ポリペプチドG224及びG224-m49は、本来のIP3受
容体に比較して500〜1,000倍以上高い親和性を示す強力
なIP3結合活性をもつ。そこで、G224とG224-m49を特異
的なIP3吸収体（スポンジ）(IP3スポンジ)として適用で
きるか、すなわち溶液中のIP3を特異的に結合吸収する
ことでIP3受容体への結合分を競合的に低減させること
ができるかを検証した（図４）。
阻害 IP3結合ポリペプチドG224及びG224-m49は、本来のIP3受
容体に比較して500〜1,000倍以上高い親和性を示す強力
なIP3結合活性をもつ。そこで、G224とG224-m49を特異
的なIP3吸収体（スポンジ）(IP3スポンジ)として適用で
きるか、すなわち溶液中のIP3を特異的に結合吸収する
ことでIP3受容体への結合分を競合的に低減させること
ができるかを検証した（図４）。
【０１０２】マウス小脳は、そのミクロソーム画分に他
の組織に比して少なくとも50倍以上の高い[3H]IP3結合
活性が存在する組織であって、IP3受容体が最も豊富な
組織である（Maedaら、1990(前出))。100μl溶液中にお
ける40μgの小脳ミクロゾーム（Kd＝21nM、Bmax＝23pmo
l/mgタンパク質)と9.6nM の[3H]IP3との結合を、各濃度
のIP3スポンジが競合的に阻害する割合（％）、すなわ
ちIP3スポンジ非存在下での活性を100％としたときの阻
害の割合を解析した。この100μl溶液中には約0.92pmol
の小脳IP3受容体のIP3結合部位と、0.96pmolの[3H]IP3
が存在する計算になる。
の組織に比して少なくとも50倍以上の高い[3H]IP3結合
活性が存在する組織であって、IP3受容体が最も豊富な
組織である（Maedaら、1990(前出))。100μl溶液中にお
ける40μgの小脳ミクロゾーム（Kd＝21nM、Bmax＝23pmo
l/mgタンパク質)と9.6nM の[3H]IP3との結合を、各濃度
のIP3スポンジが競合的に阻害する割合（％）、すなわ
ちIP3スポンジ非存在下での活性を100％としたときの阻
害の割合を解析した。この100μl溶液中には約0.92pmol
の小脳IP3受容体のIP3結合部位と、0.96pmolの[3H]IP3
が存在する計算になる。
【０１０３】その結果、対照のGSTのみでは、100μg/ml
でも阻害効果は見られなかった（図４）。これに対し
て、高親和性のG224及びG224-m49では、強いIP3結合阻
害活性が見られ、IC50は約10μg/mlであった（図４）。
一方、低親和性のG224-m30では阻害活性が低く、IC50が
100μg/mlであった。このin vitroの実験系では、IP3
スポンジ濃度が約25μg/ml以上になるとミクロゾーム膜
とともに遠沈しやすくなるため、濃度依存性カーブが乱
れる傾向がある（図４）。25μg/ml以上の濃度から観察
されるG224-m30での見掛け上の阻害も、主な成分はこの
高濃度下での遠沈による影響かもしれない。
でも阻害効果は見られなかった（図４）。これに対し
て、高親和性のG224及びG224-m49では、強いIP3結合阻
害活性が見られ、IC50は約10μg/mlであった（図４）。
一方、低親和性のG224-m30では阻害活性が低く、IC50が
100μg/mlであった。このin vitroの実験系では、IP3
スポンジ濃度が約25μg/ml以上になるとミクロゾーム膜
とともに遠沈しやすくなるため、濃度依存性カーブが乱
れる傾向がある（図４）。25μg/ml以上の濃度から観察
されるG224-m30での見掛け上の阻害も、主な成分はこの
高濃度下での遠沈による影響かもしれない。
【０１０４】これらの結果は、結合親和性に応じてより
効率よくIP3受容体の[3H]IP3結合を濃度依存的に阻害す
ることを示している。従って、本発明の高親和性IP3結
合ポリペプチドは新規のIP3スポンジとしてIP3中和剤、
IP3誘導性カルシウムの拮抗薬などに応用することがで
きる。
効率よくIP3受容体の[3H]IP3結合を濃度依存的に阻害す
ることを示している。従って、本発明の高親和性IP3結
合ポリペプチドは新規のIP3スポンジとしてIP3中和剤、
IP3誘導性カルシウムの拮抗薬などに応用することがで
きる。
【０１０５】〔実施例4〕IP3誘導Ca2+放出（IP3-induce
d Ca2+release;IICR）阻害実験 IP3誘導Ca2+放出に使用するマウス小脳のミクロソーム
画分は実施例３のように調製して、最終的にはバッファ
ーBで懸濁した後、分注して使用するまで−80℃で保存
した。 バッファーBの組成：110mM KCl, 10mM NaCl, 5mM KH2PO
4，1mM DTT, 50mM HEPES-KOH, pH7.2 (プロテアーゼ阻
害剤 カクテル［0.1mM PMSF, 10μM ロイペプチン, 10
μMペプスタチンA, 10μM E-64］と２mM MgCl2を含む）
d Ca2+release;IICR）阻害実験 IP3誘導Ca2+放出に使用するマウス小脳のミクロソーム
画分は実施例３のように調製して、最終的にはバッファ
ーBで懸濁した後、分注して使用するまで−80℃で保存
した。 バッファーBの組成：110mM KCl, 10mM NaCl, 5mM KH2PO
4，1mM DTT, 50mM HEPES-KOH, pH7.2 (プロテアーゼ阻
害剤 カクテル［0.1mM PMSF, 10μM ロイペプチン, 10
μMペプスタチンA, 10μM E-64］と２mM MgCl2を含む）
【０１０６】小脳ミクロソームを用いたIP3誘導Ca2+放
出活性については、fura-2 (Molecular Probe)をCa2+蛍
光指示薬として、IP3添加時の２波長励起（340nm と380
nm)による500nmの蛍光強度の比（F340/F380)の変化を蛍
光分光光度計CAF110(Nihon Bunko)で測定することによ
り行った。
出活性については、fura-2 (Molecular Probe)をCa2+蛍
光指示薬として、IP3添加時の２波長励起（340nm と380
nm)による500nmの蛍光強度の比（F340/F380)の変化を蛍
光分光光度計CAF110(Nihon Bunko)で測定することによ
り行った。
【０１０７】小脳ミクロゾームからのIP3誘導Ca2+放出
は、一般的にEC50＝100〜200nM IP3である。100μｇの
小脳ミクロソームを500μlの放出バッファー(バッファ
ーBに１mM MgCl2,２μM fura2,１mM DTT, 10mMクレアチ
ンリン酸, 40U/mlクレアチンキナーゼ,１μg/ml オリゴ
マイシン, プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有）と共に
測定用キュベットの中でスターラーバーで混合した。以
下の反応は30℃で常にスターラーバーで攪拌混合し続け
る条件下で行った。
は、一般的にEC50＝100〜200nM IP3である。100μｇの
小脳ミクロソームを500μlの放出バッファー(バッファ
ーBに１mM MgCl2,２μM fura2,１mM DTT, 10mMクレアチ
ンリン酸, 40U/mlクレアチンキナーゼ,１μg/ml オリゴ
マイシン, プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有）と共に
測定用キュベットの中でスターラーバーで混合した。以
下の反応は30℃で常にスターラーバーで攪拌混合し続け
る条件下で行った。
【０１０８】キュベット中の混合液に１mM ATPを添加し
てCa2+ポンプ（Ca2+-ATPase)を活性化することでミクロ
ソーム内腔へCa2+を取り込ませた（Ca2+ローディン
グ）。fura２蛍光レベルの減少が一定になるまでモニタ
ーし続けることでCa2+ローディングを確認した。そし
て、閾下レベル(subthreshold level)においてIP3を添
加したときのfura2 蛍光強度比（F340/F380)の変化を測
定した。
てCa2+ポンプ（Ca2+-ATPase)を活性化することでミクロ
ソーム内腔へCa2+を取り込ませた（Ca2+ローディン
グ）。fura２蛍光レベルの減少が一定になるまでモニタ
ーし続けることでCa2+ローディングを確認した。そし
て、閾下レベル(subthreshold level)においてIP3を添
加したときのfura2 蛍光強度比（F340/F380)の変化を測
定した。
【０１０９】一方、IP3スポンジによる小脳ミクロソー
ムのIP3誘導Ca2+放出活性の阻害効果の解析は、ATP添加
によるfura2 蛍光強度の減少（Ca2+のミクロソーム内へ
の取り込みによる）カーブがほぼ一定化してから、各濃
度のIP3スポンジを混合して、その約１分後に50nM〜１
μM IP3を反応混合液中に加えて誘導されるfura2 蛍光
強度の変化を測定することで行った。
ムのIP3誘導Ca2+放出活性の阻害効果の解析は、ATP添加
によるfura2 蛍光強度の減少（Ca2+のミクロソーム内へ
の取り込みによる）カーブがほぼ一定化してから、各濃
度のIP3スポンジを混合して、その約１分後に50nM〜１
μM IP3を反応混合液中に加えて誘導されるfura2 蛍光
強度の変化を測定することで行った。
【０１１０】高親和性のG224を用いたIP3スポンジの濃
度依存性は、3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200μg
/mlの各濃度で反応液に添加して、その約１分後に100nM
IP3を加えて誘導されるCa2+放出活性を測定することで
決定した。また、低親和性のG224-m30の濃度依存性は、
G224-m30を200, 400, 500μg/mlの濃度で添加して１分
後に100nM IP3を加えて誘導されるCa2+放出活性、及びG
224-m30を500μg/mlで添加して1分後に50nM IP3を加え
て誘導されるCa2+放出活性を測定して決定した。
度依存性は、3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200μg
/mlの各濃度で反応液に添加して、その約１分後に100nM
IP3を加えて誘導されるCa2+放出活性を測定することで
決定した。また、低親和性のG224-m30の濃度依存性は、
G224-m30を200, 400, 500μg/mlの濃度で添加して１分
後に100nM IP3を加えて誘導されるCa2+放出活性、及びG
224-m30を500μg/mlで添加して1分後に50nM IP3を加え
て誘導されるCa2+放出活性を測定して決定した。
【０１１１】その結果、IP3スポンジがIP3を吸収するこ
とによりマウス小脳ミクロゾームのIP3受容体へのIP3結
合を競合的に特異的に阻害することが示された（図５〜
７）。図5及び6において、縦軸はfura2 蛍光強度比（F3
40/F380)の変化(すなわちCa2 +量の変化）、横軸は時間
（秒）を表す。
とによりマウス小脳ミクロゾームのIP3受容体へのIP3結
合を競合的に特異的に阻害することが示された（図５〜
７）。図5及び6において、縦軸はfura2 蛍光強度比（F3
40/F380)の変化(すなわちCa2 +量の変化）、横軸は時間
（秒）を表す。
【０１１２】図5a,b,cに示すように、IP3スポンジ非存
在下(対照)では、IP3濃度依存的なIP3誘導Ca2+放出活性
が観察された。低親和性のG224-m30では、500μg/mlの
濃度でも100nM IP3によるCa2+放出には阻害効果はな
く、50nM IP3でも対照と比較して変化はほとんど見られ
なかった（図5d,e）。GST のみでは、632μg/mlの高濃
度でも50nM IP3誘導Ca2+放出活性に変化は見られなかっ
た（図5f）。従って、いずれの場合も、対照と比較して
顕著な変化は見られなかった。
在下(対照)では、IP3濃度依存的なIP3誘導Ca2+放出活性
が観察された。低親和性のG224-m30では、500μg/mlの
濃度でも100nM IP3によるCa2+放出には阻害効果はな
く、50nM IP3でも対照と比較して変化はほとんど見られ
なかった（図5d,e）。GST のみでは、632μg/mlの高濃
度でも50nM IP3誘導Ca2+放出活性に変化は見られなかっ
た（図5f）。従って、いずれの場合も、対照と比較して
顕著な変化は見られなかった。
【０１１３】これらの結果と対照的に、高親和性のG224
は、濃度依存的なIP3誘導Ca2+放出の顕著な阻害効果が
観察された（図６）。また、高親和性のG224は、100μg
/mlにおいて最大の阻害効果を得、IP3誘導Ca2+放出をほ
ぼ完全に阻害した（図6f）。
は、濃度依存的なIP3誘導Ca2+放出の顕著な阻害効果が
観察された（図６）。また、高親和性のG224は、100μg
/mlにおいて最大の阻害効果を得、IP3誘導Ca2+放出をほ
ぼ完全に阻害した（図6f）。
【０１１４】ここで、図６に示す各濃度のG224を添加し
た時のCa2+放出のピーク値を、G224非存在下を100％と
してプロットした（図７）。横軸は各濃度のG224を、縦
軸はCa2+放出のピーク値を示す。図７の結果から明らか
な通り、IP3誘導Ca2+放出の50％阻害に要するG224の濃
度は約20μg/mlとなる。
た時のCa2+放出のピーク値を、G224非存在下を100％と
してプロットした（図７）。横軸は各濃度のG224を、縦
軸はCa2+放出のピーク値を示す。図７の結果から明らか
な通り、IP3誘導Ca2+放出の50％阻害に要するG224の濃
度は約20μg/mlとなる。
【０１１５】以上のことから、高親和性のIP3結合ポリ
ペプチドはIP3スポンジとして、小脳ミクロゾームの上
のIP3受容体によるIP3誘導Ca2+放出を特異的に濃度依存
的に阻害することが明らかになった。
ペプチドはIP3スポンジとして、小脳ミクロゾームの上
のIP3受容体によるIP3誘導Ca2+放出を特異的に濃度依存
的に阻害することが明らかになった。
【０１１６】
【発明の効果】本発明により、イノシトール1,4,5-三リ
ン酸に対する高親和性結合ポリペプチド、該ポリペプチ
ドをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベク
ター、該ベクターを含む形質転換体及び該ポリペプチド
の製造方法が提供される。
ン酸に対する高親和性結合ポリペプチド、該ポリペプチ
ドをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベク
ター、該ベクターを含む形質転換体及び該ポリペプチド
の製造方法が提供される。
【０１１７】本発明のポリペプチドは、IP3誘導カルシ
ウムシグナル伝達依存性の特異的な細胞機能を阻害制御
するために用いることが可能である（IP3中和剤、IP3誘
導性カルシウム拮抗薬など）。また、本発明のポリペプ
チド及び遺伝子は、IP3誘導カルシウムシグナル伝達の
活性化を捉えることができるIP3シグナル検出薬として
有用である。さらに、本発明の遺伝子は、カルシウム産
生に伴う疾患の治療薬として有用である。
ウムシグナル伝達依存性の特異的な細胞機能を阻害制御
するために用いることが可能である（IP3中和剤、IP3誘
導性カルシウム拮抗薬など）。また、本発明のポリペプ
チド及び遺伝子は、IP3誘導カルシウムシグナル伝達の
活性化を捉えることができるIP3シグナル検出薬として
有用である。さらに、本発明の遺伝子は、カルシウム産
生に伴う疾患の治療薬として有用である。
【０１１８】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> The Institute of Physical and Chemical Research(RIKEN);
Katsuhiko Mikoshiba
<120> High affinity IP3 binding polypeptide
<130> RJH11-054N
<140>
<141>
<150> JP98/242207
<151> 1998-08-27
<160> 14
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 1812
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1812)
<400> 1
atg tct gac aaa atg tcg agt ttc cta cat att gga gac att tgt tct 48
Met Ser Asp Lys Met Ser Ser Phe Leu His Ile Gly Asp Ile Cys Ser
1 5 10 15
ctg tat gcg gag gga tct acg aat gga ttt atc agc acc tta ggc ttg 96
Leu Tyr Ala Glu Gly Ser Thr Asn Gly Phe Ile Ser Thr Leu Gly Leu
20 25 30
gtt gat gac cgt tgt gtt gta cag cca gaa gcc ggg gac ctt aac aat 144
Val Asp Asp Arg Cys Val Val Gln Pro Glu Ala Gly Asp Leu Asn Asn
35 40 45
cca ccc aag aaa ttc aga gac tgc ctc ttt aag cta tgt cct atg aat 192
Pro Pro Lys Lys Phe Arg Asp Cys Leu Phe Lys Leu Cys Pro Met Asn
50 55 60
cga tac tcc gca cag aaa cag ttc tgg aaa gct gct aag ccc ggg gcc 240
Arg Tyr Ser Ala Gln Lys Gln Phe Trp Lys Ala Ala Lys Pro Gly Ala
65 70 75 80
aac agc act aca gat gca gtg ctg ctc aac aaa ttg cat cat gct gca 288
Asn Ser Thr Thr Asp Ala Val Leu Leu Asn Lys Leu His His Ala Ala
85 90 95
gac ttg gaa aag aag cag aat gag aca gaa aac agg aaa ttg ttg ggg 336
Asp Leu Glu Lys Lys Gln Asn Glu Thr Glu Asn Arg Lys Leu Leu Gly
100 105 110
acc gtc atc caa tat ggc aac gtg atc cag ctc ctg cat ttg aaa agc 384
Thr Val Ile Gln Tyr Gly Asn Val Ile Gln Leu Leu His Leu Lys Ser
115 120 125
aat aaa tac ctg act gtg aat aag agg ctc cca gcc ttg cta gag aag 432
Asn Lys Tyr Leu Thr Val Asn Lys Arg Leu Pro Ala Leu Leu Glu Lys
130 135 140
aat gcc atg agg gtg acg ttg gac gag gct gga aat gaa ggg tcc tgg 480
Asn Ala Met Arg Val Thr Leu Asp Glu Ala Gly Asn Glu Gly Ser Trp
145 150 155 160
ttt tac att caa cca ttt tac aag ctt cgc tcc atc gga gac agt gtg 528
Phe Tyr Ile Gln Pro Phe Tyr Lys Leu Arg Ser Ile Gly Asp Ser Val
165 170 175
gtc ata ggc gac aag gta gtt ttg aat cct gtc aat gct ggc cag cct 576
Val Ile Gly Asp Lys Val Val Leu Asn Pro Val Asn Ala Gly Gln Pro
180 185 190
cta cat gcc agc agt cat cag ctg gtg gat aac cca ggc tgc aat gag 624
Leu His Ala Ser Ser His Gln Leu Val Asp Asn Pro Gly Cys Asn Glu
195 200 205
gtc aac tcc gtc aac tgt aat aca agc tgg aag ata gtg ctt ttc atg 672
Val Asn Ser Val Asn Cys Asn Thr Ser Trp Lys Ile Val Leu Phe Met
210 215 220
aaa tgg agt gat aac aaa gac gac att ctc aaa gga ggt gat gtg gtg 720
Lys Trp Ser Asp Asn Lys Asp Asp Ile Leu Lys Gly Gly Asp Val Val
225 230 235 240
agg ctc ttc cat gcc gag caa gag aag ttt ctc acc tgt gat gag cac 768
Arg Leu Phe His Ala Glu Gln Glu Lys Phe Leu Thr Cys Asp Glu His
245 250 255
cgg aag aag cag cat gtg ttc ctg agg acc acc ggc agg cag tca gcc 816
Arg Lys Lys Gln His Val Phe Leu Arg Thr Thr Gly Arg Gln Ser Ala
260 265 270
acg tcg gcc acc agt tct aaa gcc ctg tgg gaa gtg gag gta gtc cag 864
Thr Ser Ala Thr Ser Ser Lys Ala Leu Trp Glu Val Glu Val Val Gln
275 280 285
cac gac cca tgt cgg ggt gga gct ggg tac tgg aat agc ctc ttc cgg 912
His Asp Pro Cys Arg Gly Gly Ala Gly Tyr Trp Asn Ser Leu Phe Arg
290 295 300
ttc aag cac ctg gct aca ggg cat tac ttg gct gca gag gta gac cct 960
Phe Lys His Leu Ala Thr Gly His Tyr Leu Ala Ala Glu Val Asp Pro
305 310 315 320
gac ttt gag gaa gaa tgc ctg gag ttt cag ccc tca gtg gac cct gat 1008
Asp Phe Glu Glu Glu Cys Leu Glu Phe Gln Pro Ser Val Asp Pro Asp
325 330 335
cag gat gca tct cgg agt agg ttg aga aac gcg caa gaa aaa atg gta 1056
Gln Asp Ala Ser Arg Ser Arg Leu Arg Asn Ala Gln Glu Lys Met Val
340 345 350
tac tct ctg gtc tcc gtg cct gaa ggc aac gac atc tcc tcc atc ttt 1104
Tyr Ser Leu Val Ser Val Pro Glu Gly Asn Asp Ile Ser Ser Ile Phe
355 360 365
gag cta gac ccc acg act ctg cgt gga ggt gac agc ctt gtc cca agg 1152
Glu Leu Asp Pro Thr Thr Leu Arg Gly Gly Asp Ser Leu Val Pro Arg
370 375 380
aac tcc tat gtc cgt ctc aga cac ctg tgc acc aac acc tgg gta cac 1200
Asn Ser Tyr Val Arg Leu Arg His Leu Cys Thr Asn Thr Trp Val His
385 390 395 400
agc aca aac atc ccc atc gac aag gaa gag gag aag cct gtg atg ctg 1248
Ser Thr Asn Ile Pro Ile Asp Lys Glu Glu Glu Lys Pro Val Met Leu
405 410 415
aaa att ggt acc tct ccc ctg aag gag gac aag gaa gca ttt gcc ata 1296
Lys Ile Gly Thr Ser Pro Leu Lys Glu Asp Lys Glu Ala Phe Ala Ile
420 425 430
gtt cct gtt tcc cct gct gag gtt cgg gac ctg gac ttt gcc aat gat 1344
Val Pro Val Ser Pro Ala Glu Val Arg Asp Leu Asp Phe Ala Asn Asp
435 440 445
gcc agc aag gtg ctg ggc tcc atc gct ggg aag ttg gaa aag ggc acc 1392
Ala Ser Lys Val Leu Gly Ser Ile Ala Gly Lys Leu Glu Lys Gly Thr
450 455 460
atc acc cag aat gag aga agg tct gtc acg aag ctt ttg gaa gac ttg 1440
Ile Thr Gln Asn Glu Arg Arg Ser Val Thr Lys Leu Leu Glu Asp Leu
465 470 475 480
gtt tac ttt gtc acg ggt gga act aac tct ggc caa gac gtg ctt gaa 1488
Val Tyr Phe Val Thr Gly Gly Thr Asn Ser Gly Gln Asp Val Leu Glu
485 490 495
gtt gtc ttc tct aag ccc aat cga gag cgg cag aag ctg atg agg gaa 1536
Val Val Phe Ser Lys Pro Asn Arg Glu Arg Gln Lys Leu Met Arg Glu
500 505 510
cag aat att ctc aag cag atc ttc aag ctg ttg cag gcc ccc ttc acg 1584
Gln Asn Ile Leu Lys Gln Ile Phe Lys Leu Leu Gln Ala Pro Phe Thr
515 520 525
gac tgc ggg gat ggc ccg atg ctt cgg ctg gag gag ctg ggg gat cag 1632
Asp Cys Gly Asp Gly Pro Met Leu Arg Leu Glu Glu Leu Gly Asp Gln
530 535 540
cgc cat gct cct ttc aga cat att tgc cga ctc tgc tac agg gtc ctg 1680
Arg His Ala Pro Phe Arg His Ile Cys Arg Leu Cys Tyr Arg Val Leu
545 550 555 560
cga cac tca cag caa gac tac agg aag aac cag gag tac ata gcc aag 1728
Arg His Ser Gln Gln Asp Tyr Arg Lys Asn Gln Glu Tyr Ile Ala Lys
565 570 575
cag ttt ggc ttc atg cag aag cag att ggc tat gac gtg ctg gcc gaa 1776
Gln Phe Gly Phe Met Gln Lys Gln Ile Gly Tyr Asp Val Leu Ala Glu
580 585 590
gac acc atc act gcc ctg ctc cac aac aac cgg aaa 1812
Asp Thr Ile Thr Ala Leu Leu His Asn Asn Arg Lys
595 600
<210> 2
<211> 604
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Met Ser Asp Lys Met Ser Ser Phe Leu His Ile Gly Asp Ile Cys Ser
1 5 10 15
Leu Tyr Ala Glu Gly Ser Thr Asn Gly Phe Ile Ser Thr Leu Gly Leu
20 25 30
Val Asp Asp Arg Cys Val Val Gln Pro Glu Ala Gly Asp Leu Asn Asn
35 40 45
Pro Pro Lys Lys Phe Arg Asp Cys Leu Phe Lys Leu Cys Pro Met Asn
50 55 60
Arg Tyr Ser Ala Gln Lys Gln Phe Trp Lys Ala Ala Lys Pro Gly Ala
65 70 75 80
Asn Ser Thr Thr Asp Ala Val Leu Leu Asn Lys Leu His His Ala Ala
85 90 95
Asp Leu Glu Lys Lys Gln Asn Glu Thr Glu Asn Arg Lys Leu Leu Gly
100 105 110
Thr Val Ile Gln Tyr Gly Asn Val Ile Gln Leu Leu His Leu Lys Ser
115 120 125
Asn Lys Tyr Leu Thr Val Asn Lys Arg Leu Pro Ala Leu Leu Glu Lys
130 135 140
Asn Ala Met Arg Val Thr Leu Asp Glu Ala Gly Asn Glu Gly Ser Trp
145 150 155 160
Phe Tyr Ile Gln Pro Phe Tyr Lys Leu Arg Ser Ile Gly Asp Ser Val
165 170 175
Val Ile Gly Asp Lys Val Val Leu Asn Pro Val Asn Ala Gly Gln Pro
180 185 190
Leu His Ala Ser Ser His Gln Leu Val Asp Asn Pro Gly Cys Asn Glu
195 200 205
Val Asn Ser Val Asn Cys Asn Thr Ser Trp Lys Ile Val Leu Phe Met
210 215 220
Lys Trp Ser Asp Asn Lys Asp Asp Ile Leu Lys Gly Gly Asp Val Val
225 230 235 240
Arg Leu Phe His Ala Glu Gln Glu Lys Phe Leu Thr Cys Asp Glu His
245 250 255
Arg Lys Lys Gln His Val Phe Leu Arg Thr Thr Gly Arg Gln Ser Ala
260 265 270
Thr Ser Ala Thr Ser Ser Lys Ala Leu Trp Glu Val Glu Val Val Gln
275 280 285
His Asp Pro Cys Arg Gly Gly Ala Gly Tyr Trp Asn Ser Leu Phe Arg
290 295 300
Phe Lys His Leu Ala Thr Gly His Tyr Leu Ala Ala Glu Val Asp Pro
305 310 315 320
Asp Phe Glu Glu Glu Cys Leu Glu Phe Gln Pro Ser Val Asp Pro Asp
325 330 335
Gln Asp Ala Ser Arg Ser Arg Leu Arg Asn Ala Gln Glu Lys Met Val
340 345 350
Tyr Ser Leu Val Ser Val Pro Glu Gly Asn Asp Ile Ser Ser Ile Phe
355 360 365
Glu Leu Asp Pro Thr Thr Leu Arg Gly Gly Asp Ser Leu Val Pro Arg
370 375 380
Asn Ser Tyr Val Arg Leu Arg His Leu Cys Thr Asn Thr Trp Val His
385 390 395 400
Ser Thr Asn Ile Pro Ile Asp Lys Glu Glu Glu Lys Pro Val Met Leu
405 410 415
Lys Ile Gly Thr Ser Pro Leu Lys Glu Asp Lys Glu Ala Phe Ala Ile
420 425 430
Val Pro Val Ser Pro Ala Glu Val Arg Asp Leu Asp Phe Ala Asn Asp
435 440 445
Ala Ser Lys Val Leu Gly Ser Ile Ala Gly Lys Leu Glu Lys Gly Thr
450 455 460
Ile Thr Gln Asn Glu Arg Arg Ser Val Thr Lys Leu Leu Glu Asp Leu
465 470 475 480
Val Tyr Phe Val Thr Gly Gly Thr Asn Ser Gly Gln Asp Val Leu Glu
485 490 495
Val Val Phe Ser Lys Pro Asn Arg Glu Arg Gln Lys Leu Met Arg Glu
500 505 510
Gln Asn Ile Leu Lys Gln Ile Phe Lys Leu Leu Gln Ala Pro Phe Thr
515 520 525
Asp Cys Gly Asp Gly Pro Met Leu Arg Leu Glu Glu Leu Gly Asp Gln
530 535 540
Arg His Ala Pro Phe Arg His Ile Cys Arg Leu Cys Tyr Arg Val Leu
545 550 555 560
Arg His Ser Gln Gln Asp Tyr Arg Lys Asn Gln Glu Tyr Ile Ala Lys
565 570 575
Gln Phe Gly Phe Met Gln Lys Gln Ile Gly Tyr Asp Val Leu Ala Glu
580 585 590
Asp Thr Ile Thr Ala Leu Leu His Asn Asn Arg Lys
595 600
<210> 3
<211> 9848
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (329)..(8575)
<400> 3
gctgaagcgt ttcctcaagc ctgccggggt gggaggagag gaggaggtgg tggtggtgga 60
ggaggtggag gcagagggtg gagagagaga aagcgcacgc cgagaggagg tgtgggtgtt 120
ccgctcccat cctaacggaa cgagctccct cttcgcggac atgggattgc ccagcggctg 180
ctaacccctc tcctggtcct gatcccccaa accggcgtgg ctccccggtc accaaggagc 240
tgattacaag ggaccaggat ttgcatcctt ggctgggcgt ccattggcta cagagtgcct 300
gacctgggtc aggctttcca acacggac atg tct gac aaa atg tcg agt ttc 352
Met Ser Asp Lys Met Ser Ser Phe
1 5
cta cat att gga gac att tgt tct ctg tat gcg gag gga tct acg aat 400
Leu His Ile Gly Asp Ile Cys Ser Leu Tyr Ala Glu Gly Ser Thr Asn
10 15 20
gga ttt atc agc acc tta ggc ttg gtt gat gac cgt tgt gtt gta cag 448
Gly Phe Ile Ser Thr Leu Gly Leu Val Asp Asp Arg Cys Val Val Gln
25 30 35 40
cca gaa gcc ggg gac ctt aac aat cca ccc aag aaa ttc aga gac tgc 496
Pro Glu Ala Gly Asp Leu Asn Asn Pro Pro Lys Lys Phe Arg Asp Cys
45 50 55
ctc ttt aag cta tgt cct atg aat cga tac tcc gca cag aaa cag ttc 544
Leu Phe Lys Leu Cys Pro Met Asn Arg Tyr Ser Ala Gln Lys Gln Phe
60 65 70
tgg aaa gct gct aag ccc ggg gcc aac agc act aca gat gca gtg ctg 592
Trp Lys Ala Ala Lys Pro Gly Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Val Leu
75 80 85
ctc aac aaa ttg cat cat gct gca gac ttg gaa aag aag cag aat gag 640
Leu Asn Lys Leu His His Ala Ala Asp Leu Glu Lys Lys Gln Asn Glu
90 95 100
aca gaa aac agg aaa ttg ttg ggg acc gtc atc caa tat ggc aac gtg 688
Thr Glu Asn Arg Lys Leu Leu Gly Thr Val Ile Gln Tyr Gly Asn Val
105 110 115 120
atc cag ctc ctg cat ttg aaa agc aat aaa tac ctg act gtg aat aag 736
Ile Gln Leu Leu His Leu Lys Ser Asn Lys Tyr Leu Thr Val Asn Lys
125 130 135
agg ctc cca gcc ttg cta gag aag aat gcc atg agg gtg acg ttg gac 784
Arg Leu Pro Ala Leu Leu Glu Lys Asn Ala Met Arg Val Thr Leu Asp
140 145 150
gag gct gga aat gaa ggg tcc tgg ttt tac att caa cca ttt tac aag 832
Glu Ala Gly Asn Glu Gly Ser Trp Phe Tyr Ile Gln Pro Phe Tyr Lys
155 160 165
ctt cgc tcc atc gga gac agt gtg gtc ata ggc gac aag gta gtt ttg 880
Leu Arg Ser Ile Gly Asp Ser Val Val Ile Gly Asp Lys Val Val Leu
170 175 180
aat cct gtc aat gct ggc cag cct cta cat gcc agc agt cat cag ctg 928
Asn Pro Val Asn Ala Gly Gln Pro Leu His Ala Ser Ser His Gln Leu
185 190 195 200
gtg gat aac cca ggc tgc aat gag gtc aac tcc gtc aac tgt aat aca 976
Val Asp Asn Pro Gly Cys Asn Glu Val Asn Ser Val Asn Cys Asn Thr
205 210 215
agc tgg aag ata gtg ctt ttc atg aaa tgg agt gat aac aaa gac gac 1024
Ser Trp Lys Ile Val Leu Phe Met Lys Trp Ser Asp Asn Lys Asp Asp
220 225 230
att ctc aaa gga ggt gat gtg gtg agg ctc ttc cat gcc gag caa gag 1072
Ile Leu Lys Gly Gly Asp Val Val Arg Leu Phe His Ala Glu Gln Glu
235 240 245
aag ttt ctc acc tgt gat gag cac cgg aag aag cag cat gtg ttc ctg 1120
Lys Phe Leu Thr Cys Asp Glu His Arg Lys Lys Gln His Val Phe Leu
250 255 260
agg acc acc ggc agg cag tca gcc acg tcg gcc acc agt tct aaa gcc 1168
Arg Thr Thr Gly Arg Gln Ser Ala Thr Ser Ala Thr Ser Ser Lys Ala
265 270 275 280
ctg tgg gaa gtg gag gta gtc cag cac gac cca tgt cgg ggt gga gct 1216
Leu Trp Glu Val Glu Val Val Gln His Asp Pro Cys Arg Gly Gly Ala
285 290 295
ggg tac tgg aat agc ctc ttc cgg ttc aag cac ctg gct aca ggg cat 1264
Gly Tyr Trp Asn Ser Leu Phe Arg Phe Lys His Leu Ala Thr Gly His
300 305 310
tac ttg gct gca gag gta gac cct gac ttt gag gaa gaa tgc ctg gag 1312
Tyr Leu Ala Ala Glu Val Asp Pro Asp Phe Glu Glu Glu Cys Leu Glu
315 320 325
ttt cag ccc tca gtg gac cct gat cag gat gca tct cgg agt agg ttg 1360
Phe Gln Pro Ser Val Asp Pro Asp Gln Asp Ala Ser Arg Ser Arg Leu
330 335 340
aga aac gcg caa gaa aaa atg gta tac tct ctg gtc tcc gtg cct gaa 1408
Arg Asn Ala Gln Glu Lys Met Val Tyr Ser Leu Val Ser Val Pro Glu
345 350 355 360
ggc aac gac atc tcc tcc atc ttt gag cta gac ccc acg act ctg cgt 1456
Gly Asn Asp Ile Ser Ser Ile Phe Glu Leu Asp Pro Thr Thr Leu Arg
365 370 375
gga ggt gac agc ctt gtc cca agg aac tcc tat gtc cgt ctc aga cac 1504
Gly Gly Asp Ser Leu Val Pro Arg Asn Ser Tyr Val Arg Leu Arg His
380 385 390
ctg tgc acc aac acc tgg gta cac agc aca aac atc ccc atc gac aag 1552
Leu Cys Thr Asn Thr Trp Val His Ser Thr Asn Ile Pro Ile Asp Lys
395 400 405
gaa gag gag aag cct gtg atg ctg aaa att ggt acc tct ccc ctg aag 1600
Glu Glu Glu Lys Pro Val Met Leu Lys Ile Gly Thr Ser Pro Leu Lys
410 415 420
gag gac aag gaa gca ttt gcc ata gtt cct gtt tcc cct gct gag gtt 1648
Glu Asp Lys Glu Ala Phe Ala Ile Val Pro Val Ser Pro Ala Glu Val
425 430 435 440
cgg gac ctg gac ttt gcc aat gat gcc agc aag gtg ctg ggc tcc atc 1696
Arg Asp Leu Asp Phe Ala Asn Asp Ala Ser Lys Val Leu Gly Ser Ile
445 450 455
gct ggg aag ttg gaa aag ggc acc atc acc cag aat gag aga agg tct 1744
Ala Gly Lys Leu Glu Lys Gly Thr Ile Thr Gln Asn Glu Arg Arg Ser
460 465 470
gtc acg aag ctt ttg gaa gac ttg gtt tac ttt gtc acg ggt gga act 1792
Val Thr Lys Leu Leu Glu Asp Leu Val Tyr Phe Val Thr Gly Gly Thr
475 480 485
aac tct ggc caa gac gtg ctt gaa gtt gtc ttc tct aag ccc aat cga 1840
Asn Ser Gly Gln Asp Val Leu Glu Val Val Phe Ser Lys Pro Asn Arg
490 495 500
gag cgg cag aag ctg atg agg gaa cag aat att ctc aag cag atc ttc 1888
Glu Arg Gln Lys Leu Met Arg Glu Gln Asn Ile Leu Lys Gln Ile Phe
505 510 515 520
aag ctg ttg cag gcc ccc ttc acg gac tgc ggg gat ggc ccg atg ctt 1936
Lys Leu Leu Gln Ala Pro Phe Thr Asp Cys Gly Asp Gly Pro Met Leu
525 530 535
cgg ctg gag gag ctg ggg gat cag cgc cat gct cct ttc aga cat att 1984
Arg Leu Glu Glu Leu Gly Asp Gln Arg His Ala Pro Phe Arg His Ile
540 545 550
tgc cga ctc tgc tac agg gtc ctg cga cac tca cag caa gac tac agg 2032
Cys Arg Leu Cys Tyr Arg Val Leu Arg His Ser Gln Gln Asp Tyr Arg
555 560 565
aag aac cag gag tac ata gcc aag cag ttt ggc ttc atg cag aag cag 2080
Lys Asn Gln Glu Tyr Ile Ala Lys Gln Phe Gly Phe Met Gln Lys Gln
570 575 580
att ggc tat gac gtg ctg gcc gaa gac acc atc act gcc ctg ctc cac 2128
Ile Gly Tyr Asp Val Leu Ala Glu Asp Thr Ile Thr Ala Leu Leu His
585 590 595 600
aac aac cgg aaa ctc ctg gag aag cac atc acc gcg gca gag att gac 2176
Asn Asn Arg Lys Leu Leu Glu Lys His Ile Thr Ala Ala Glu Ile Asp
605 610 615
acg ttt gtc agc ctg gtg cga aag aac agg gag ccc agg ttc ttg gat 2224
Thr Phe Val Ser Leu Val Arg Lys Asn Arg Glu Pro Arg Phe Leu Asp
620 625 630
tac ctc tct gac ctc tgc gta tcc atg aac aag tca atc cct gtg aca 2272
Tyr Leu Ser Asp Leu Cys Val Ser Met Asn Lys Ser Ile Pro Val Thr
635 640 645
cag gag ctc atc tgt aaa gct gtg ctc aat ccc acc aat gct gac atc 2320
Gln Glu Leu Ile Cys Lys Ala Val Leu Asn Pro Thr Asn Ala Asp Ile
650 655 660
ctg att gag acc aag ctg gtt ctt tct cgt ttt gag ttt gaa ggc gtt 2368
Leu Ile Glu Thr Lys Leu Val Leu Ser Arg Phe Glu Phe Glu Gly Val
665 670 675 680
tcc act gga gag aat gct ctg gaa gcc ggg gag gat gag gaa gag gtg 2416
Ser Thr Gly Glu Asn Ala Leu Glu Ala Gly Glu Asp Glu Glu Glu Val
685 690 695
tgg ctg ttc tgg agg gac agc aac aaa gag atc cgt agt aag agt gtc 2464
Trp Leu Phe Trp Arg Asp Ser Asn Lys Glu Ile Arg Ser Lys Ser Val
700 705 710
cgg gaa ttg gcg caa gat gct aaa gag gga cag aag gaa gac agg gac 2512
Arg Glu Leu Ala Gln Asp Ala Lys Glu Gly Gln Lys Glu Asp Arg Asp
715 720 725
atc ctc agc tac tac aga tat cag ctg aac ctc ttt gca agg atg tgt 2560
Ile Leu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Gln Leu Asn Leu Phe Ala Arg Met Cys
730 735 740
ctg gac cgc cag tac ctg gcc atc aat gaa atc tcc ggg cag ctg gat 2608
Leu Asp Arg Gln Tyr Leu Ala Ile Asn Glu Ile Ser Gly Gln Leu Asp
745 750 755 760
gtt gat ctc att ctc cgc tgc atg tct gac gag aac ctc ccc tac gac 2656
Val Asp Leu Ile Leu Arg Cys Met Ser Asp Glu Asn Leu Pro Tyr Asp
765 770 775
ctc agg gca tcc ttt tgc cgc ctc atg ctt cac atg cat gtg gac cga 2704
Leu Arg Ala Ser Phe Cys Arg Leu Met Leu His Met His Val Asp Arg
780 785 790
gat ccc caa gag cag gtg aca cct gtg aaa tat gcc cga ctg tgg tca 2752
Asp Pro Gln Glu Gln Val Thr Pro Val Lys Tyr Ala Arg Leu Trp Ser
795 800 805
gaa att ccc tct gag atc gcc att gat gac tat gac agc agt gga aca 2800
Glu Ile Pro Ser Glu Ile Ala Ile Asp Asp Tyr Asp Ser Ser Gly Thr
810 815 820
tcc aaa gat gaa att aag gag agg ttt gca cag acg atg gag ttt gtg 2848
Ser Lys Asp Glu Ile Lys Glu Arg Phe Ala Gln Thr Met Glu Phe Val
825 830 835 840
gag gag tac cta aga gat gtg gtt tgt caa aga ttc ccc ttc tct gat 2896
Glu Glu Tyr Leu Arg Asp Val Val Cys Gln Arg Phe Pro Phe Ser Asp
845 850 855
aag gag aaa aat aag ctc acg ttt gag gtt gtg aac tta gcc agg aat 2944
Lys Glu Lys Asn Lys Leu Thr Phe Glu Val Val Asn Leu Ala Arg Asn
860 865 870
ctc ata tac ttt ggt ttc tac aac ttt tct gac ctt ctc cga tta acc 2992
Leu Ile Tyr Phe Gly Phe Tyr Asn Phe Ser Asp Leu Leu Arg Leu Thr
875 880 885
aag atc ctc ttg gca atc tta gac tgt gtc cat gtg acc act atc ttc 3040
Lys Ile Leu Leu Ala Ile Leu Asp Cys Val His Val Thr Thr Ile Phe
890 895 900
ccc att agc aag atg aca aaa gga gaa gag aat aaa ggc agt aac gtg 3088
Pro Ile Ser Lys Met Thr Lys Gly Glu Glu Asn Lys Gly Ser Asn Val
905 910 915 920
atg agg tct atc cat ggc gtt ggg gag ctg atg acc cag gtg gtg ctg 3136
Met Arg Ser Ile His Gly Val Gly Glu Leu Met Thr Gln Val Val Leu
925 930 935
cgg gga gga ggc ttc ttg ccc atg act ccc atg gct gcg gcc cct gaa 3184
Arg Gly Gly Gly Phe Leu Pro Met Thr Pro Met Ala Ala Ala Pro Glu
940 945 950
gga aat gtg aag cag gca gag cca gag aaa gag gac atc atg gtc atg 3232
Gly Asn Val Lys Gln Ala Glu Pro Glu Lys Glu Asp Ile Met Val Met
955 960 965
gac acc aag ttg aag atc att gaa ata ctc cag ttt att ttg aat gtg 3280
Asp Thr Lys Leu Lys Ile Ile Glu Ile Leu Gln Phe Ile Leu Asn Val
970 975 980
aga ttg gat tat agg atc tcc tgc ctc ctg tgt ata ttt aag cga gag 3328
Arg Leu Asp Tyr Arg Ile Ser Cys Leu Leu Cys Ile Phe Lys Arg Glu
985 990 995 1000
ttt gat gaa agc aat tcc cag tca tca gaa aca tcc tcc gga aac agc 3376
Phe Asp Glu Ser Asn Ser Gln Ser Ser Glu Thr Ser Ser Gly Asn Ser
1005 1010 1015
agc cag gaa ggg cca agt aat gtg cca ggt gct ctt gac ttt gaa cac 3424
Ser Gln Glu Gly Pro Ser Asn Val Pro Gly Ala Leu Asp Phe Glu His
1020 1025 1030
att gaa gaa caa gcg gaa ggc atc ttt gga gga agt gag gag aac aca 3472
Ile Glu Glu Gln Ala Glu Gly Ile Phe Gly Gly Ser Glu Glu Asn Thr
1035 1040 1045
cct ttg gac ctg gat gac cat ggt ggc aga acc ttc ctc agg gtc ctg 3520
Pro Leu Asp Leu Asp Asp His Gly Gly Arg Thr Phe Leu Arg Val Leu
1050 1055 1060
ctc cac ttg aca atg cat gac tac cca ccc ctg gtg tct ggg gcc ctg 3568
Leu His Leu Thr Met His Asp Tyr Pro Pro Leu Val Ser Gly Ala Leu
1065 1070 1075 1080
cag ctc ctc ttt cgg cac ttc agc cag agg cag gag gtc ctt cag gcc 3616
Gln Leu Leu Phe Arg His Phe Ser Gln Arg Gln Glu Val Leu Gln Ala
1085 1090 1095
ttc aaa cag gtt caa ctg ctg gtt act agc caa gat gtg gac aac tac 3664
Phe Lys Gln Val Gln Leu Leu Val Thr Ser Gln Asp Val Asp Asn Tyr
1100 1105 1110
aaa cag atc aag caa gac ttg gac caa cta agg tcc att gtg gag aag 3712
Lys Gln Ile Lys Gln Asp Leu Asp Gln Leu Arg Ser Ile Val Glu Lys
1115 1120 1125
tct gag ctc tgg gtg tac aaa ggc caa ggt ccc gat gag cct atg gac 3760
Ser Glu Leu Trp Val Tyr Lys Gly Gln Gly Pro Asp Glu Pro Met Asp
1130 1135 1140
gga gcc tcc ggt gaa aat gag cat aag aaa acc gag gag ggg acg agc 3808
Gly Ala Ser Gly Glu Asn Glu His Lys Lys Thr Glu Glu Gly Thr Ser
1145 1150 1155 1160
aag cca ctg aag cac gag agc acc agc agc tac aac tac cga gtg gtg 3856
Lys Pro Leu Lys His Glu Ser Thr Ser Ser Tyr Asn Tyr Arg Val Val
1165 1170 1175
aaa gag att ttg att cga ctt agc aag ctc tgc gtg cag gag agc gcg 3904
Lys Glu Ile Leu Ile Arg Leu Ser Lys Leu Cys Val Gln Glu Ser Ala
1180 1185 1190
tcg gtg agg aag agc cgg aag cag cag caa cga ctg ctg agg aac atg 3952
Ser Val Arg Lys Ser Arg Lys Gln Gln Gln Arg Leu Leu Arg Asn Met
1195 1200 1205
ggc gca cac gct gtg gtg ctg gag ctg ctg cag atc ccc tac gag aag 4000
Gly Ala His Ala Val Val Leu Glu Leu Leu Gln Ile Pro Tyr Glu Lys
1210 1215 1220
gcc gaa gac aca aag atg caa gag atc atg cgg ctg gct cat gaa ttt 4048
Ala Glu Asp Thr Lys Met Gln Glu Ile Met Arg Leu Ala His Glu Phe
1225 1230 1235 1240
ttg cag aat ttc tgt gca ggc aac cag cag aat caa gct ttg ctg cat 4096
Leu Gln Asn Phe Cys Ala Gly Asn Gln Gln Asn Gln Ala Leu Leu His
1245 1250 1255
aaa cac ata aac ctg ttt ctc aag cca ggg atc ctg gag gca gtg acg 4144
Lys His Ile Asn Leu Phe Leu Lys Pro Gly Ile Leu Glu Ala Val Thr
1260 1265 1270
atg cag cac atc ttc atg aac aac ttc cag ctg tgc agt gag atc aac 4192
Met Gln His Ile Phe Met Asn Asn Phe Gln Leu Cys Ser Glu Ile Asn
1275 1280 1285
gag aga gtg gtc cag cac ttt gtt cac tgc ata gag acc cac ggt cga 4240
Glu Arg Val Val Gln His Phe Val His Cys Ile Glu Thr His Gly Arg
1290 1295 1300
aac gtc cag tat atc aag ttt ctc cag acg att gtc aag gca gaa ggg 4288
Asn Val Gln Tyr Ile Lys Phe Leu Gln Thr Ile Val Lys Ala Glu Gly
1305 1310 1315 1320
aaa ttc att aaa aag tgc caa gac atg gtc atg gct gag ctt gtc aac 4336
Lys Phe Ile Lys Lys Cys Gln Asp Met Val Met Ala Glu Leu Val Asn
1325 1330 1335
tct gga gag gac gtc ctc gtg ttc tac aat gac aga gcc tct ttc cag 4384
Ser Gly Glu Asp Val Leu Val Phe Tyr Asn Asp Arg Ala Ser Phe Gln
1340 1345 1350
act ctg atc cag atg atg cgg tcc gag cgt gac cgg atg gat gag aac 4432
Thr Leu Ile Gln Met Met Arg Ser Glu Arg Asp Arg Met Asp Glu Asn
1355 1360 1365
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Ser Pro Leu Met Tyr His Ile His Leu Val Glu Leu Leu Ala Val Cys
1370 1375 1380
aca gag ggc aag aat gtg tac acg gag atc aag tgc aac tcc ttg ctc 4528
Thr Glu Gly Lys Asn Val Tyr Thr Glu Ile Lys Cys Asn Ser Leu Leu
1385 1390 1395 1400
ccg ctc gat gac atc gtt cgt gtg gtc act cat gaa gac tgc atc ccc 4576
Pro Leu Asp Asp Ile Val Arg Val Val Thr His Glu Asp Cys Ile Pro
1405 1410 1415
gag gtt aag atc gct tac att aac ttc ctg aat cac tgc tat gtg gat 4624
Glu Val Lys Ile Ala Tyr Ile Asn Phe Leu Asn His Cys Tyr Val Asp
1420 1425 1430
acg gag gtg gag atg aag gag att tac aca agc aac cac atg tgg aag 4672
Thr Glu Val Glu Met Lys Glu Ile Tyr Thr Ser Asn His Met Trp Lys
1435 1440 1445
ttg ttt gag aat ttc ctc gtg gac atc tgc agg gcc tgt aac aac aca 4720
Leu Phe Glu Asn Phe Leu Val Asp Ile Cys Arg Ala Cys Asn Asn Thr
1450 1455 1460
agc gac agg aag cac gca gac tcc att ctg gag aag tac gtc act gaa 4768
Ser Asp Arg Lys His Ala Asp Ser Ile Leu Glu Lys Tyr Val Thr Glu
1465 1470 1475 1480
atc gtg atg agc atc gtc acc acc ttc ttc agc tct ccc ttc tca gac 4816
Ile Val Met Ser Ile Val Thr Thr Phe Phe Ser Ser Pro Phe Ser Asp
1485 1490 1495
cag agc acc act ctg cag acc cgc cag cct gtc ttt gtg caa ctc ctg 4864
Gln Ser Thr Thr Leu Gln Thr Arg Gln Pro Val Phe Val Gln Leu Leu
1500 1505 1510
caa ggc gtg ttc cga gtt tac cac tgc aac tgg ctg atg ccg agc caa 4912
Gln Gly Val Phe Arg Val Tyr His Cys Asn Trp Leu Met Pro Ser Gln
1515 1520 1525
aaa gcc tcg gtg gag agc tgc atc cgg gtg ctc tct gac gta gcc aag 4960
Lys Ala Ser Val Glu Ser Cys Ile Arg Val Leu Ser Asp Val Ala Lys
1530 1535 1540
agc cgg gcc ata gcc att cct gtt gac ctg gac agc caa gtc aac aac 5008
Ser Arg Ala Ile Ala Ile Pro Val Asp Leu Asp Ser Gln Val Asn Asn
1545 1550 1555 1560
ctc ttc ctg aag tcc cac aac att gtg cag aaa aca gcc ctg aac tgg 5056
Leu Phe Leu Lys Ser His Asn Ile Val Gln Lys Thr Ala Leu Asn Trp
1565 1570 1575
cgg tta tca gcc cga aac gcc gct cgc aga gac tct gta ctg gca gca 5104
Arg Leu Ser Ala Arg Asn Ala Ala Arg Arg Asp Ser Val Leu Ala Ala
1580 1585 1590
tcc aga gac tac cga aat atc att gag agg tta cag gac atc gtg tct 5152
Ser Arg Asp Tyr Arg Asn Ile Ile Glu Arg Leu Gln Asp Ile Val Ser
1595 1600 1605
gcc cta gag gac cgg ctc agg ccc ctg gtg cag gct gag ctg tct gtg 5200
Ala Leu Glu Asp Arg Leu Arg Pro Leu Val Gln Ala Glu Leu Ser Val
1610 1615 1620
ctc gtg gat gtt cta cac aga cca gaa ctg ctc ttc ccc gag aac acg 5248
Leu Val Asp Val Leu His Arg Pro Glu Leu Leu Phe Pro Glu Asn Thr
1625 1630 1635 1640
gat gcc agg agg aaa tgt gag agt gga ggt ttc atc tgc aag cta ata 5296
Asp Ala Arg Arg Lys Cys Glu Ser Gly Gly Phe Ile Cys Lys Leu Ile
1645 1650 1655
aaa cat acc aag caa ctg ctg gag gag aat gaa gag aaa cta tgc att 5344
Lys His Thr Lys Gln Leu Leu Glu Glu Asn Glu Glu Lys Leu Cys Ile
1660 1665 1670
aaa gtc tta cag acc ctc agg gaa atg atg acc aaa gac aga ggc tat 5392
Lys Val Leu Gln Thr Leu Arg Glu Met Met Thr Lys Asp Arg Gly Tyr
1675 1680 1685
gga gag aag caa att tcc att gat gaa tcg gaa aat gcc gag ctg cca 5440
Gly Glu Lys Gln Ile Ser Ile Asp Glu Ser Glu Asn Ala Glu Leu Pro
1690 1695 1700
cag gca ccg gaa gct gag aac tcc aca gag cag gag ctt gaa cca agt 5488
Gln Ala Pro Glu Ala Glu Asn Ser Thr Glu Gln Glu Leu Glu Pro Ser
1705 1710 1715 1720
cca ccc ctg agg caa ctg gaa gac cat aaa agg ggt gag gca ctc cga 5536
Pro Pro Leu Arg Gln Leu Glu Asp His Lys Arg Gly Glu Ala Leu Arg
1725 1730 1735
caa att ttg gtc aac cgt tac tat gga aac atc aga cct tca gga aga 5584
Gln Ile Leu Val Asn Arg Tyr Tyr Gly Asn Ile Arg Pro Ser Gly Arg
1740 1745 1750
aga gag agc ctt acc agc ttt ggc aat ggc cca cta tca cca gga gga 5632
Arg Glu Ser Leu Thr Ser Phe Gly Asn Gly Pro Leu Ser Pro Gly Gly
1755 1760 1765
ccc agc aag cct ggt gga gga ggg gga ggt cct gga tct agt tcc aca 5680
Pro Ser Lys Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Gly Ser Ser Ser Thr
1770 1775 1780
agc agg ggt gag atg agc ctg gct gag gtt cag tgt cac ctc gac aag 5728
Ser Arg Gly Glu Met Ser Leu Ala Glu Val Gln Cys His Leu Asp Lys
1785 1790 1795 1800
gag ggg gcc tcc aac ctg gtc atc gat ctc ata atg aat gca tcc agt 5776
Glu Gly Ala Ser Asn Leu Val Ile Asp Leu Ile Met Asn Ala Ser Ser
1805 1810 1815
gac cga gta ttc cat gaa agc att ctg ctg gcc atc gca ctt ctg gaa 5824
Asp Arg Val Phe His Glu Ser Ile Leu Leu Ala Ile Ala Leu Leu Glu
1820 1825 1830
gga ggc aac acc acc atc cag cac tcg ttt ttc tgc cgg ctg aca gaa 5872
Gly Gly Asn Thr Thr Ile Gln His Ser Phe Phe Cys Arg Leu Thr Glu
1835 1840 1845
gat aag aaa tca gag aag ttc ttc aag gtt ttt tac gat cga atg aag 5920
Asp Lys Lys Ser Glu Lys Phe Phe Lys Val Phe Tyr Asp Arg Met Lys
1850 1855 1860
gtg gcc cag cag gaa atc aag gcg aca gtg aca gtg aac acc agc gac 5968
Val Ala Gln Gln Glu Ile Lys Ala Thr Val Thr Val Asn Thr Ser Asp
1865 1870 1875 1880
ttg gga aac aaa aag aaa gat gat gaa gtg gac agg gat gcc ccg tct 6016
Leu Gly Asn Lys Lys Lys Asp Asp Glu Val Asp Arg Asp Ala Pro Ser
1885 1890 1895
cgg aag aaa gcc aaa gag ccc aca aca cag ata aca gaa gag gtc cgg 6064
Arg Lys Lys Ala Lys Glu Pro Thr Thr Gln Ile Thr Glu Glu Val Arg
1900 1905 1910
gat cag ctc ctg gaa gca tct gct gcc acc agg aaa gcc ttt acc acc 6112
Asp Gln Leu Leu Glu Ala Ser Ala Ala Thr Arg Lys Ala Phe Thr Thr
1915 1920 1925
ttc cgg agg gag gcc gac cct gat gac cat tac cag tct ggg gag ggc 6160
Phe Arg Arg Glu Ala Asp Pro Asp Asp His Tyr Gln Ser Gly Glu Gly
1930 1935 1940
acc cag gct aca acc gac aaa gcc aag gat gac cta gag atg agc gct 6208
Thr Gln Ala Thr Thr Asp Lys Ala Lys Asp Asp Leu Glu Met Ser Ala
1945 1950 1955 1960
gtc atc acc atc atg cag cct atc ctg cgc ttc ctg cag ctg ctg tgt 6256
Val Ile Thr Ile Met Gln Pro Ile Leu Arg Phe Leu Gln Leu Leu Cys
1965 1970 1975
gaa aac cac aac cga gat ctg cag aat ttc ctt cgt tgc caa aat aat 6304
Glu Asn His Asn Arg Asp Leu Gln Asn Phe Leu Arg Cys Gln Asn Asn
1980 1985 1990
aag acc aac tac aat ttg gtg tgt gag aca ctg cag ttt ctg gac tgt 6352
Lys Thr Asn Tyr Asn Leu Val Cys Glu Thr Leu Gln Phe Leu Asp Cys
1995 2000 2005
att tgt ggg agc aca acc gga ggc ctt ggt ctt ctt gga ctg tac ata 6400
Ile Cys Gly Ser Thr Thr Gly Gly Leu Gly Leu Leu Gly Leu Tyr Ile
2010 2015 2020
aat gaa aag aat gta gca ctt atc aac caa acc ctg gag agt ctg acg 6448
Asn Glu Lys Asn Val Ala Leu Ile Asn Gln Thr Leu Glu Ser Leu Thr
2025 2030 2035 2040
gag tac tgt caa ggg cct tgc cat gag aac cag aac tgc atc gcc acc 6496
Glu Tyr Cys Gln Gly Pro Cys His Glu Asn Gln Asn Cys Ile Ala Thr
2045 2050 2055
cac gag tcc aat ggc atc gat atc atc aca gcc ctc atc ctc aat gat 6544
His Glu Ser Asn Gly Ile Asp Ile Ile Thr Ala Leu Ile Leu Asn Asp
2060 2065 2070
atc aac cct ctg gga aag aag cgg atg gac ctg gtg tta gaa ctg aag 6592
Ile Asn Pro Leu Gly Lys Lys Arg Met Asp Leu Val Leu Glu Leu Lys
2075 2080 2085
aac aat gct tcg aag ctg cta ctg gcc atc atg gaa agc aga cac gat 6640
Asn Asn Ala Ser Lys Leu Leu Leu Ala Ile Met Glu Ser Arg His Asp
2090 2095 2100
agt gaa aat gca gag agg atc ctg tac aac atg agg ccc aag gag ctg 6688
Ser Glu Asn Ala Glu Arg Ile Leu Tyr Asn Met Arg Pro Lys Glu Leu
2105 2110 2115 2120
gtg gaa gtg atc aag aag gcc tac atg caa ggt gaa gtg gaa ttt gag 6736
Val Glu Val Ile Lys Lys Ala Tyr Met Gln Gly Glu Val Glu Phe Glu
2125 2130 2135
gat ggg gag aac ggt gag gat gga gct gcc tca ccc agg aac gtg ggc 6784
Asp Gly Glu Asn Gly Glu Asp Gly Ala Ala Ser Pro Arg Asn Val Gly
2140 2145 2150
cac aac atc tac atc ctc gct cac cag ttg gct cgg cat aac aaa gaa 6832
His Asn Ile Tyr Ile Leu Ala His Gln Leu Ala Arg His Asn Lys Glu
2155 2160 2165
ctt caa acc atg ctg aaa cct gga ggc cag gtg gat ggg gat gaa gct 6880
Leu Gln Thr Met Leu Lys Pro Gly Gly Gln Val Asp Gly Asp Glu Ala
2170 2175 2180
ctg gag ttc tac gcg aag cac aca gca caa att gag att gtc aga ctg 6928
Leu Glu Phe Tyr Ala Lys His Thr Ala Gln Ile Glu Ile Val Arg Leu
2185 2190 2195 2200
gac cgg aca atg gaa cag atc gtc ttc cct gtg ccc agc atc tgt gaa 6976
Asp Arg Thr Met Glu Gln Ile Val Phe Pro Val Pro Ser Ile Cys Glu
2205 2210 2215
ttc ctg act aag gaa tcg aaa ctt cga ata tat tac acc aca gag cgg 7024
Phe Leu Thr Lys Glu Ser Lys Leu Arg Ile Tyr Tyr Thr Thr Glu Arg
2220 2225 2230
gat gag caa ggt agc aag atc aat gac ttc ttc ctg cgc tcc gag gac 7072
Asp Glu Gln Gly Ser Lys Ile Asn Asp Phe Phe Leu Arg Ser Glu Asp
2235 2240 2245
ctc ttt aac gag atg aac tgg cag aag aaa ctt cga gcc cag cct gtc 7120
Leu Phe Asn Glu Met Asn Trp Gln Lys Lys Leu Arg Ala Gln Pro Val
2250 2255 2260
ttg tac tgg tgt gcc cga aac atg tct ttc tgg agc agc atc tcc ttc 7168
Leu Tyr Trp Cys Ala Arg Asn Met Ser Phe Trp Ser Ser Ile Ser Phe
2265 2270 2275 2280
aac ctg gcc gtc ctg atg aac ctg ctg gtg gcg ttt ttc tat cca ttt 7216
Asn Leu Ala Val Leu Met Asn Leu Leu Val Ala Phe Phe Tyr Pro Phe
2285 2290 2295
aaa gga gtg agg gga gga aca cta gag cca cac tgg tca ggc ctc ctg 7264
Lys Gly Val Arg Gly Gly Thr Leu Glu Pro His Trp Ser Gly Leu Leu
2300 2305 2310
tgg aca gcc atg ctc atc tct ctg gcc att gtc att gct ctg ccc aag 7312
Trp Thr Ala Met Leu Ile Ser Leu Ala Ile Val Ile Ala Leu Pro Lys
2315 2320 2325
ccc cac ggc atc cgg gcc tta att gct tct aca atc cta cga ctg ata 7360
Pro His Gly Ile Arg Ala Leu Ile Ala Ser Thr Ile Leu Arg Leu Ile
2330 2335 2340
ttt tca gtt ggg ttg cag ccc aca ctg ttt ctg ctg gga gct ttc aat 7408
Phe Ser Val Gly Leu Gln Pro Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ala Phe Asn
2345 2350 2355 2360
gtc tgc aat aaa atc atc ttc ctg atg agc ttt gtg ggc aac tgt ggg 7456
Val Cys Asn Lys Ile Ile Phe Leu Met Ser Phe Val Gly Asn Cys Gly
2365 2370 2375
acc ttc acc aga ggc tac cgg gcc atg gtt ctg gat gtg gag ttc ctc 7504
Thr Phe Thr Arg Gly Tyr Arg Ala Met Val Leu Asp Val Glu Phe Leu
2380 2385 2390
tat cat ttg ctg tat cta ctc atc tgt gcc atg ggc ctc ttc gta cat 7552
Tyr His Leu Leu Tyr Leu Leu Ile Cys Ala Met Gly Leu Phe Val His
2395 2400 2405
gag ttc ttc tat agc ttg ctg ctt ttt gat tta gtg tac aga gag gag 7600
Glu Phe Phe Tyr Ser Leu Leu Leu Phe Asp Leu Val Tyr Arg Glu Glu
2410 2415 2420
act ttg ctt aat gtc att aaa agt gtc acc cgc aat gga cgg tcc atc 7648
Thr Leu Leu Asn Val Ile Lys Ser Val Thr Arg Asn Gly Arg Ser Ile
2425 2430 2435 2440
atc ttg aca gcg gtc ctg gct ctg atc ctg gtt tac ctg ttc tca att 7696
Ile Leu Thr Ala Val Leu Ala Leu Ile Leu Val Tyr Leu Phe Ser Ile
2445 2450 2455
gtg ggc tat ctg ttc ttc aag gat gac ttt atc ttg gaa gta gat agg 7744
Val Gly Tyr Leu Phe Phe Lys Asp Asp Phe Ile Leu Glu Val Asp Arg
2460 2465 2470
ttg ccc aat gaa aca gct gtt cca gaa act ggc gag agt ttg gcc aac 7792
Leu Pro Asn Glu Thr Ala Val Pro Glu Thr Gly Glu Ser Leu Ala Asn
2475 2480 2485
gat ttc ctg tac tct gat gtg tgc agg gta gag acg ggg gag aac tgc 7840
Asp Phe Leu Tyr Ser Asp Val Cys Arg Val Glu Thr Gly Glu Asn Cys
2490 2495 2500
acc tct cct gca ccc aaa gaa gag ctg ctc cct gcc gaa gaa acg gaa 7888
Thr Ser Pro Ala Pro Lys Glu Glu Leu Leu Pro Ala Glu Glu Thr Glu
2505 2510 2515 2520
cag gat aag gaa cac acg tgt gag acc ctg ctc atg tgc atc gtc act 7936
Gln Asp Lys Glu His Thr Cys Glu Thr Leu Leu Met Cys Ile Val Thr
2525 2530 2535
gtt ctg agt cac ggg ctg cgg agt ggg gga ggg gta gga gac gtg ctc 7984
Val Leu Ser His Gly Leu Arg Ser Gly Gly Gly Val Gly Asp Val Leu
2540 2545 2550
agg aag cca tcc aaa gag gag cct ctg ttt gct gca agg gtg atc tac 8032
Arg Lys Pro Ser Lys Glu Glu Pro Leu Phe Ala Ala Arg Val Ile Tyr
2555 2560 2565
gac ctc ctc ttc ttc ttc atg gtc atc atc atc gtc ctg aac ctg att 8080
Asp Leu Leu Phe Phe Phe Met Val Ile Ile Ile Val Leu Asn Leu Ile
2570 2575 2580
ttc ggg gtc atc atc gac acc ttt gct gac ctg agg agt gag aag caa 8128
Phe Gly Val Ile Ile Asp Thr Phe Ala Asp Leu Arg Ser Glu Lys Gln
2585 2590 2595 2600
aag aag gag gag atc tta aaa acc acg tgc ttc atc tgc ggc ttg gaa 8176
Lys Lys Glu Glu Ile Leu Lys Thr Thr Cys Phe Ile Cys Gly Leu Glu
2605 2610 2615
agg gac aag ttt gac aat aag act gtc acc ttt gaa gag cac atc aag 8224
Arg Asp Lys Phe Asp Asn Lys Thr Val Thr Phe Glu Glu His Ile Lys
2620 2625 2630
gaa gaa cac aac atg tgg cac tat ctg tgc ttc atc gtg ctg gtg aaa 8272
Glu Glu His Asn Met Trp His Tyr Leu Cys Phe Ile Val Leu Val Lys
2635 2640 2645
gtg aag gac tcc aca gag tac acc ggg cct gag agt tac gtg gca gag 8320
Val Lys Asp Ser Thr Glu Tyr Thr Gly Pro Glu Ser Tyr Val Ala Glu
2650 2655 2660
atg atc agg gaa aga aac ctt gat tgg ttc ctc aga atg aga gcc atg 8368
Met Ile Arg Glu Arg Asn Leu Asp Trp Phe Leu Arg Met Arg Ala Met
2665 2670 2675 2680
tcc ctg gtc agc agc gat tct gaa ggg gaa cag aac gag ctg agg aac 8416
Ser Leu Val Ser Ser Asp Ser Glu Gly Glu Gln Asn Glu Leu Arg Asn
2685 2690 2695
ctg cag gag aag ctg gag tct acc atg aag ctg gtc acc aat ctt tct 8464
Leu Gln Glu Lys Leu Glu Ser Thr Met Lys Leu Val Thr Asn Leu Ser
2700 2705 2710
ggc cag ctg tca gaa cta aag gac cag atg aca gaa cag agg aag cag 8512
Gly Gln Leu Ser Glu Leu Lys Asp Gln Met Thr Glu Gln Arg Lys Gln
2715 2720 2725
aaa caa aga atc ggc ctt cta gga cat cct cct cac atg aat gtc aac 8560
Lys Gln Arg Ile Gly Leu Leu Gly His Pro Pro His Met Asn Val Asn
2730 2735 2740
cca cag cag ccg gcc taggcaaatg aggcagaggg actctgctca gccctctgta 8615
Pro Gln Gln Pro Ala
2745
tatcactgtc agggtgggta cggctcattg gttctgattt gcccactaag ggtacatgtg 8675
cgcttagtac atttgtaaat actcagtttt gtattgtatg tatatgattg ctattctcag 8735
aggtttggac tttcgtattg taattagctc tgttggcatg gtgacttgtc actcctgcca 8795
aaaatattaa aaatgccttt tttggaagga ctacagaaag tacctgattt gcacttgaac 8855
cagattatag atttaaaagt atatgacatg tattttgtat ttaaaactag aatagccagt 8915
atttatgttt tttataaaac tgtgcaatac aaattatgca atcaccataa ctttgtaact 8975
cctgagtgtc ctaagggagt acacatcttt gaagctgatt tgttgatact cgtgtaataa 9035
atggttaaat atcaaatgct gctgctgctg ccaaaattat attaatagcg agtttctggc 9095
ccctgggcaa ttttgtacct tgtaattatc ctatggtgat gctgtttctc gttgctaatg 9155
gcattagtgc ccctgtatcc tagtgataac tccaggtctg tgaaccattc aaacagcatt 9215
cattttgaga aaagcaactt tagtttcaag gataatttta agcttcaaaa ttaatcattt 9275
aaagtgtttc tttaagagag ccatgttaga ggctcacact ttagcttgaa aggagttgat 9335
gaattaattt tttaaaggga actttttaca tgacgtttgg aataacagca tattgctgac 9395
cagtcagtgt catctcccgg gtgaattttg atgtcacgtt atagtcaaat gagttagctg 9455
atggtttcta gattttcttc ctctgaacca tgatgcagta ggtaagaagt tattatgcgt 9515
atatacatat atacattcat atacgacaaa gtaggagctg tccccttagg atgcatagct 9575
gcccctaggg tacgtagctg aacactgaca atggcgttct tctgaaagag ccacgtttgg 9635
gttttatttc tttgtcacat gatttctttt ctggatgggt gcaaagtatc acaggaagtg 9695
ttttctctct gtcgccttgt tttgtacctg ggtctcgctt tactagaccg tctctgcaca 9755
aaagtttaaa aactgaaccg tatgcagagt tccgaagcaa gtcaagtttg taaatgcata 9815
cctaaaaata tttaataaac gatgcagaat cct 9848
<210> 4
<211> 2749
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Met Ser Asp Lys Met Ser Ser Phe Leu His Ile Gly Asp Ile Cys Ser
1 5 10 15
Leu Tyr Ala Glu Gly Ser Thr Asn Gly Phe Ile Ser Thr Leu Gly Leu
20 25 30
Val Asp Asp Arg Cys Val Val Gln Pro Glu Ala Gly Asp Leu Asn Asn
35 40 45
Pro Pro Lys Lys Phe Arg Asp Cys Leu Phe Lys Leu Cys Pro Met Asn
50 55 60
Arg Tyr Ser Ala Gln Lys Gln Phe Trp Lys Ala Ala Lys Pro Gly Ala
65 70 75 80
Asn Ser Thr Thr Asp Ala Val Leu Leu Asn Lys Leu His His Ala Ala
85 90 95
Asp Leu Glu Lys Lys Gln Asn Glu Thr Glu Asn Arg Lys Leu Leu Gly
100 105 110
Thr Val Ile Gln Tyr Gly Asn Val Ile Gln Leu Leu His Leu Lys Ser
115 120 125
Asn Lys Tyr Leu Thr Val Asn Lys Arg Leu Pro Ala Leu Leu Glu Lys
130 135 140
Asn Ala Met Arg Val Thr Leu Asp Glu Ala Gly Asn Glu Gly Ser Trp
145 150 155 160
Phe Tyr Ile Gln Pro Phe Tyr Lys Leu Arg Ser Ile Gly Asp Ser Val
165 170 175
Val Ile Gly Asp Lys Val Val Leu Asn Pro Val Asn Ala Gly Gln Pro
180 185 190
Leu His Ala Ser Ser His Gln Leu Val Asp Asn Pro Gly Cys Asn Glu
195 200 205
Val Asn Ser Val Asn Cys Asn Thr Ser Trp Lys Ile Val Leu Phe Met
210 215 220
Lys Trp Ser Asp Asn Lys Asp Asp Ile Leu Lys Gly Gly Asp Val Val
225 230 235 240
Arg Leu Phe His Ala Glu Gln Glu Lys Phe Leu Thr Cys Asp Glu His
245 250 255
Arg Lys Lys Gln His Val Phe Leu Arg Thr Thr Gly Arg Gln Ser Ala
260 265 270
Thr Ser Ala Thr Ser Ser Lys Ala Leu Trp Glu Val Glu Val Val Gln
275 280 285
His Asp Pro Cys Arg Gly Gly Ala Gly Tyr Trp Asn Ser Leu Phe Arg
290 295 300
Phe Lys His Leu Ala Thr Gly His Tyr Leu Ala Ala Glu Val Asp Pro
305 310 315 320
Asp Phe Glu Glu Glu Cys Leu Glu Phe Gln Pro Ser Val Asp Pro Asp
325 330 335
Gln Asp Ala Ser Arg Ser Arg Leu Arg Asn Ala Gln Glu Lys Met Val
340 345 350
Tyr Ser Leu Val Ser Val Pro Glu Gly Asn Asp Ile Ser Ser Ile Phe
355 360 365
Glu Leu Asp Pro Thr Thr Leu Arg Gly Gly Asp Ser Leu Val Pro Arg
370 375 380
Asn Ser Tyr Val Arg Leu Arg His Leu Cys Thr Asn Thr Trp Val His
385 390 395 400
Ser Thr Asn Ile Pro Ile Asp Lys Glu Glu Glu Lys Pro Val Met Leu
405 410 415
Lys Ile Gly Thr Ser Pro Leu Lys Glu Asp Lys Glu Ala Phe Ala Ile
420 425 430
Val Pro Val Ser Pro Ala Glu Val Arg Asp Leu Asp Phe Ala Asn Asp
435 440 445
Ala Ser Lys Val Leu Gly Ser Ile Ala Gly Lys Leu Glu Lys Gly Thr
450 455 460
Ile Thr Gln Asn Glu Arg Arg Ser Val Thr Lys Leu Leu Glu Asp Leu
465 470 475 480
Val Tyr Phe Val Thr Gly Gly Thr Asn Ser Gly Gln Asp Val Leu Glu
485 490 495
Val Val Phe Ser Lys Pro Asn Arg Glu Arg Gln Lys Leu Met Arg Glu
500 505 510
Gln Asn Ile Leu Lys Gln Ile Phe Lys Leu Leu Gln Ala Pro Phe Thr
515 520 525
Asp Cys Gly Asp Gly Pro Met Leu Arg Leu Glu Glu Leu Gly Asp Gln
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Arg His Ala Pro Phe Arg His Ile Cys Arg Leu Cys Tyr Arg Val Leu
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Arg His Ser Gln Gln Asp Tyr Arg Lys Asn Gln Glu Tyr Ile Ala Lys
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Gln Phe Gly Phe Met Gln Lys Gln Ile Gly Tyr Asp Val Leu Ala Glu
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Val Lys Tyr Ala Arg Leu Trp Ser Glu Ile Pro Ser Glu Ile Ala Ile
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Asp Asp Tyr Asp Ser Ser Gly Thr Ser Lys Asp Glu Ile Lys Glu Arg
820 825 830
Phe Ala Gln Thr Met Glu Phe Val Glu Glu Tyr Leu Arg Asp Val Val
835 840 845
Cys Gln Arg Phe Pro Phe Ser Asp Lys Glu Lys Asn Lys Leu Thr Phe
850 855 860
Glu Val Val Asn Leu Ala Arg Asn Leu Ile Tyr Phe Gly Phe Tyr Asn
865 870 875 880
Phe Ser Asp Leu Leu Arg Leu Thr Lys Ile Leu Leu Ala Ile Leu Asp
885 890 895
Cys Val His Val Thr Thr Ile Phe Pro Ile Ser Lys Met Thr Lys Gly
900 905 910
Glu Glu Asn Lys Gly Ser Asn Val Met Arg Ser Ile His Gly Val Gly
915 920 925
Glu Leu Met Thr Gln Val Val Leu Arg Gly Gly Gly Phe Leu Pro Met
930 935 940
Thr Pro Met Ala Ala Ala Pro Glu Gly Asn Val Lys Gln Ala Glu Pro
945 950 955 960
Glu Lys Glu Asp Ile Met Val Met Asp Thr Lys Leu Lys Ile Ile Glu
965 970 975
Ile Leu Gln Phe Ile Leu Asn Val Arg Leu Asp Tyr Arg Ile Ser Cys
980 985 990
Leu Leu Cys Ile Phe Lys Arg Glu Phe Asp Glu Ser Asn Ser Gln Ser
995 1000 1005
Ser Glu Thr Ser Ser Gly Asn Ser Ser Gln Glu Gly Pro Ser Asn Val
1010 1015 1020
Pro Gly Ala Leu Asp Phe Glu His Ile Glu Glu Gln Ala Glu Gly Ile
025 1030 1035 1040
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1045 1050 1055
Gly Arg Thr Phe Leu Arg Val Leu Leu His Leu Thr Met His Asp Tyr
1060 1065 1070
Pro Pro Leu Val Ser Gly Ala Leu Gln Leu Leu Phe Arg His Phe Ser
1075 1080 1085
Gln Arg Gln Glu Val Leu Gln Ala Phe Lys Gln Val Gln Leu Leu Val
1090 1095 1100
Thr Ser Gln Asp Val Asp Asn Tyr Lys Gln Ile Lys Gln Asp Leu Asp
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Gln Leu Arg Ser Ile Val Glu Lys Ser Glu Leu Trp Val Tyr Lys Gly
1125 1130 1135
Gln Gly Pro Asp Glu Pro Met Asp Gly Ala Ser Gly Glu Asn Glu His
1140 1145 1150
Lys Lys Thr Glu Glu Gly Thr Ser Lys Pro Leu Lys His Glu Ser Thr
1155 1160 1165
Ser Ser Tyr Asn Tyr Arg Val Val Lys Glu Ile Leu Ile Arg Leu Ser
1170 1175 1180
Lys Leu Cys Val Gln Glu Ser Ala Ser Val Arg Lys Ser Arg Lys Gln
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Gln Gln Arg Leu Leu Arg Asn Met Gly Ala His Ala Val Val Leu Glu
1205 1210 1215
Leu Leu Gln Ile Pro Tyr Glu Lys Ala Glu Asp Thr Lys Met Gln Glu
1220 1225 1230
Ile Met Arg Leu Ala His Glu Phe Leu Gln Asn Phe Cys Ala Gly Asn
1235 1240 1245
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1250 1255 1260
Pro Gly Ile Leu Glu Ala Val Thr Met Gln His Ile Phe Met Asn Asn
265 1270 1275 1280
Phe Gln Leu Cys Ser Glu Ile Asn Glu Arg Val Val Gln His Phe Val
1285 1290 1295
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1300 1305 1310
Gln Thr Ile Val Lys Ala Glu Gly Lys Phe Ile Lys Lys Cys Gln Asp
1315 1320 1325
Met Val Met Ala Glu Leu Val Asn Ser Gly Glu Asp Val Leu Val Phe
1330 1335 1340
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Glu Arg Asp Arg Met Asp Glu Asn Ser Pro Leu Met Tyr His Ile His
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1445 1450 1455
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Lys Lys Leu Arg Ala Gln Pro Val Leu Tyr Trp Cys Ala Arg Asn Met
2260 2265 2270
Ser Phe Trp Ser Ser Ile Ser Phe Asn Leu Ala Val Leu Met Asn Leu
2275 2280 2285
Leu Val Ala Phe Phe Tyr Pro Phe Lys Gly Val Arg Gly Gly Thr Leu
2290 2295 2300
Glu Pro His Trp Ser Gly Leu Leu Trp Thr Ala Met Leu Ile Ser Leu
305 2310 2315 2320
Ala Ile Val Ile Ala Leu Pro Lys Pro His Gly Ile Arg Ala Leu Ile
2325 2330 2335
Ala Ser Thr Ile Leu Arg Leu Ile Phe Ser Val Gly Leu Gln Pro Thr
2340 2345 2350
Leu Phe Leu Leu Gly Ala Phe Asn Val Cys Asn Lys Ile Ile Phe Leu
2355 2360 2365
Met Ser Phe Val Gly Asn Cys Gly Thr Phe Thr Arg Gly Tyr Arg Ala
2370 2375 2380
Met Val Leu Asp Val Glu Phe Leu Tyr His Leu Leu Tyr Leu Leu Ile
385 2390 2395 2400
Cys Ala Met Gly Leu Phe Val His Glu Phe Phe Tyr Ser Leu Leu Leu
2405 2410 2415
Phe Asp Leu Val Tyr Arg Glu Glu Thr Leu Leu Asn Val Ile Lys Ser
2420 2425 2430
Val Thr Arg Asn Gly Arg Ser Ile Ile Leu Thr Ala Val Leu Ala Leu
2435 2440 2445
Ile Leu Val Tyr Leu Phe Ser Ile Val Gly Tyr Leu Phe Phe Lys Asp
2450 2455 2460
Asp Phe Ile Leu Glu Val Asp Arg Leu Pro Asn Glu Thr Ala Val Pro
465 2470 2475 2480
Glu Thr Gly Glu Ser Leu Ala Asn Asp Phe Leu Tyr Ser Asp Val Cys
2485 2490 2495
Arg Val Glu Thr Gly Glu Asn Cys Thr Ser Pro Ala Pro Lys Glu Glu
2500 2505 2510
Leu Leu Pro Ala Glu Glu Thr Glu Gln Asp Lys Glu His Thr Cys Glu
2515 2520 2525
Thr Leu Leu Met Cys Ile Val Thr Val Leu Ser His Gly Leu Arg Ser
2530 2535 2540
Gly Gly Gly Val Gly Asp Val Leu Arg Lys Pro Ser Lys Glu Glu Pro
545 2550 2555 2560
Leu Phe Ala Ala Arg Val Ile Tyr Asp Leu Leu Phe Phe Phe Met Val
2565 2570 2575
Ile Ile Ile Val Leu Asn Leu Ile Phe Gly Val Ile Ile Asp Thr Phe
2580 2585 2590
Ala Asp Leu Arg Ser Glu Lys Gln Lys Lys Glu Glu Ile Leu Lys Thr
2595 2600 2605
Thr Cys Phe Ile Cys Gly Leu Glu Arg Asp Lys Phe Asp Asn Lys Thr
2610 2615 2620
Val Thr Phe Glu Glu His Ile Lys Glu Glu His Asn Met Trp His Tyr
625 2630 2635 2640
Leu Cys Phe Ile Val Leu Val Lys Val Lys Asp Ser Thr Glu Tyr Thr
2645 2650 2655
Gly Pro Glu Ser Tyr Val Ala Glu Met Ile Arg Glu Arg Asn Leu Asp
2660 2665 2670
Trp Phe Leu Arg Met Arg Ala Met Ser Leu Val Ser Ser Asp Ser Glu
2675 2680 2685
Gly Glu Gln Asn Glu Leu Arg Asn Leu Gln Glu Lys Leu Glu Ser Thr
2690 2695 2700
Met Lys Leu Val Thr Asn Leu Ser Gly Gln Leu Ser Glu Leu Lys Asp
705 2710 2715 2720
Gln Met Thr Glu Gln Arg Lys Gln Lys Gln Arg Ile Gly Leu Leu Gly
2725 2730 2735
His Pro Pro His Met Asn Val Asn Pro Gln Gln Pro Ala
2740 2745
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 5
tgtcagacat atgcgtgttg gaa 23
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 6
cgcgggatcc ttatttccgg ttgttgtgga gcaggg 36
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 7
ccggaattct tatttccggt tgttgtggag caggg 35
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 8
cgcggatcca tgaaatggag tgataacaaa gacgaca 37
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 9
gagagcggca ggcactgatg aggg 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 10
ccctcatcag tgcctgccgc tctc 24
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 11
gctgaggttc aagacctgga ctttg 25
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA
<400> 12
aaagtccagg tcttgaacct cagc 24
<210> 13
<211> 1059
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1059)
<400> 13
tgg agt gat aac aaa gac gac att ctc aaa gga ggt gat gtg gtg agg 48
Trp Ser Asp Asn Lys Asp Asp Ile Leu Lys Gly Gly Asp Val Val Arg
1 5 10 15
ctc ttc cat gcc gag caa gag aag ttt ctc acc tgt gat gag cac cgg 96
Leu Phe His Ala Glu Gln Glu Lys Phe Leu Thr Cys Asp Glu His Arg
20 25 30
aag aag cag cat gtg ttc ctg agg acc acc ggc agg cag tca gcc acg 144
Lys Lys Gln His Val Phe Leu Arg Thr Thr Gly Arg Gln Ser Ala Thr
35 40 45
tcg gcc acc agt tct aaa gcc ctg tgg gaa gtg gag gta gtc cag cac 192
Ser Ala Thr Ser Ser Lys Ala Leu Trp Glu Val Glu Val Val Gln His
50 55 60
gac cca tgt cgg ggt gga gct ggg tac tgg aat agc ctc ttc cgg ttc 240
Asp Pro Cys Arg Gly Gly Ala Gly Tyr Trp Asn Ser Leu Phe Arg Phe
65 70 75 80
aag cac ctg gct aca ggg cat tac ttg gct gca gag gta gac cct gac 288
Lys His Leu Ala Thr Gly His Tyr Leu Ala Ala Glu Val Asp Pro Asp
85 90 95
ttt gag gaa gaa tgc ctg gag ttt cag ccc tca gtg gac cct gat cag 336
Phe Glu Glu Glu Cys Leu Glu Phe Gln Pro Ser Val Asp Pro Asp Gln
100 105 110
gat gca tct cgg agt agg ttg aga aac gcg caa gaa aaa atg gta tac 384
Asp Ala Ser Arg Ser Arg Leu Arg Asn Ala Gln Glu Lys Met Val Tyr
115 120 125
tct ctg gtc tcc gtg cct gaa ggc aac gac atc tcc tcc atc ttt gag 432
Ser Leu Val Ser Val Pro Glu Gly Asn Asp Ile Ser Ser Ile Phe Glu
130 135 140
cta gac ccc acg act ctg cgt gga ggt gac agc ctt gtc cca agg aac 480
Leu Asp Pro Thr Thr Leu Arg Gly Gly Asp Ser Leu Val Pro Arg Asn
145 150 155 160
tcc tat gtc cgt ctc aga cac ctg tgc acc aac acc tgg gta cac agc 528
Ser Tyr Val Arg Leu Arg His Leu Cys Thr Asn Thr Trp Val His Ser
165 170 175
aca aac atc ccc atc gac aag gaa gag gag aag cct gtg atg ctg aaa 576
Thr Asn Ile Pro Ile Asp Lys Glu Glu Glu Lys Pro Val Met Leu Lys
180 185 190
att ggt acc tct ccc ctg aag gag gac aag gaa gca ttt gcc ata gtt 624
Ile Gly Thr Ser Pro Leu Lys Glu Asp Lys Glu Ala Phe Ala Ile Val
195 200 205
cct gtt tcc cct gct gag gtt cgg gac ctg gac ttt gcc aat gat gcc 672
Pro Val Ser Pro Ala Glu Val Arg Asp Leu Asp Phe Ala Asn Asp Ala
210 215 220
agc aag gtg ctg ggc tcc atc gct ggg aag ttg gaa aag ggc acc atc 720
Ser Lys Val Leu Gly Ser Ile Ala Gly Lys Leu Glu Lys Gly Thr Ile
225 230 235 240
acc cag aat gag aga agg tct gtc acg aag ctt ttg gaa gac ttg gtt 768
Thr Gln Asn Glu Arg Arg Ser Val Thr Lys Leu Leu Glu Asp Leu Val
245 250 255
tac ttt gtc acg ggt gga act aac tct ggc caa gac gtg ctt gaa gtt 816
Tyr Phe Val Thr Gly Gly Thr Asn Ser Gly Gln Asp Val Leu Glu Val
260 265 270
gtc ttc tct aag ccc aat cga gag cgg cag aag ctg atg agg gaa cag 864
Val Phe Ser Lys Pro Asn Arg Glu Arg Gln Lys Leu Met Arg Glu Gln
275 280 285
aat att ctc aag cag atc ttc aag ctg ttg cag gcc ccc ttc acg gac 912
Asn Ile Leu Lys Gln Ile Phe Lys Leu Leu Gln Ala Pro Phe Thr Asp
290 295 300
tgc ggg gat ggc ccg atg ctt cgg ctg gag gag ctg ggg gat cag cgc 960
Cys Gly Asp Gly Pro Met Leu Arg Leu Glu Glu Leu Gly Asp Gln Arg
305 310 315 320
cat gct cct ttc aga cat att tgc cga ctc tgc tac agg gtc ctg cga 1008
His Ala Pro Phe Arg His Ile Cys Arg Leu Cys Tyr Arg Val Leu Arg
325 330 335
cac tca cag caa gac tac agg aag aac cag gag tac ata gcc aag cag 1056
His Ser Gln Gln Asp Tyr Arg Lys Asn Gln Glu Tyr Ile Ala Lys Gln
340 345 350
ttt 1059
Phe
<210> 14
<211> 353
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 14
Trp Ser Asp Asn Lys Asp Asp Ile Leu Lys Gly Gly Asp Val Val Arg
1 5 10 15
Leu Phe His Ala Glu Gln Glu Lys Phe Leu Thr Cys Asp Glu His Arg
20 25 30
Lys Lys Gln His Val Phe Leu Arg Thr Thr Gly Arg Gln Ser Ala Thr
35 40 45
Ser Ala Thr Ser Ser Lys Ala Leu Trp Glu Val Glu Val Val Gln His
50 55 60
Asp Pro Cys Arg Gly Gly Ala Gly Tyr Trp Asn Ser Leu Phe Arg Phe
65 70 75 80
Lys His Leu Ala Thr Gly His Tyr Leu Ala Ala Glu Val Asp Pro Asp
85 90 95
Phe Glu Glu Glu Cys Leu Glu Phe Gln Pro Ser Val Asp Pro Asp Gln
100 105 110
Asp Ala Ser Arg Ser Arg Leu Arg Asn Ala Gln Glu Lys Met Val Tyr
115 120 125
Ser Leu Val Ser Val Pro Glu Gly Asn Asp Ile Ser Ser Ile Phe Glu
130 135 140
Leu Asp Pro Thr Thr Leu Arg Gly Gly Asp Ser Leu Val Pro Arg Asn
145 150 155 160
Ser Tyr Val Arg Leu Arg His Leu Cys Thr Asn Thr Trp Val His Ser
165 170 175
Thr Asn Ile Pro Ile Asp Lys Glu Glu Glu Lys Pro Val Met Leu Lys
180 185 190
Ile Gly Thr Ser Pro Leu Lys Glu Asp Lys Glu Ala Phe Ala Ile Val
195 200 205
Pro Val Ser Pro Ala Glu Val Arg Asp Leu Asp Phe Ala Asn Asp Ala
210 215 220
Ser Lys Val Leu Gly Ser Ile Ala Gly Lys Leu Glu Lys Gly Thr Ile
225 230 235 240
Thr Gln Asn Glu Arg Arg Ser Val Thr Lys Leu Leu Glu Asp Leu Val
245 250 255
Tyr Phe Val Thr Gly Gly Thr Asn Ser Gly Gln Asp Val Leu Glu Val
260 265 270
Val Phe Ser Lys Pro Asn Arg Glu Arg Gln Lys Leu Met Arg Glu Gln
275 280 285
Asn Ile Leu Lys Gln Ile Phe Lys Leu Leu Gln Ala Pro Phe Thr Asp
290 295 300
Cys Gly Asp Gly Pro Met Leu Arg Leu Glu Glu Leu Gly Asp Gln Arg
305 310 315 320
His Ala Pro Phe Arg His Ile Cys Arg Leu Cys Tyr Arg Val Leu Arg
325 330 335
His Ser Gln Gln Asp Tyr Arg Lys Asn Gln Glu Tyr Ile Ala Lys Gln
340 345 350
Phe
【０１１９】
配列番号５：合成DNA
配列番号６：合成DNA
配列番号７：合成DNA
配列番号８：合成DNA
配列番号９：合成DNA
配列番号１０：合成DNA
配列番号１１：合成DNA
配列番号１２：合成DNA
【図面の簡単な説明】
【図１】IP3スポンジの構造を示す図である。
【図２】T604の高発現とIP3結合活性を示す図である。
【図３】IP3スポンジのIP3結合活性を示す図である。
【図４】IP3スポンジ濃度依存的なIP3結合阻害曲線を示
す図である。
す図である。
【図５】IP3誘導Ca2+放出における低親和性G224m30とGS
Tの効果を示す図である。
Tの効果を示す図である。
【図６】高親和性IP3スポンジG224によるIP3誘導Ca2+放
出の阻害効果を示す図である。
出の阻害効果を示す図である。
【図７】高親和性IP3スポンジ G224の濃度依存性のIP3
誘導Ca2+放出の阻害曲線を示す図である。
誘導Ca2+放出の阻害曲線を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
//(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 内山 剛
東京都品川区上大崎３−９−25−101
(56)参考文献 特許2778771（ＪＰ，Ｂ２)
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，1990年，Ｖｏｌ．265， Ｎｏ．21,
ｐ． 12679−12685
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
C07K 14/00 - 16/46
C12P 21/00 - 21/08
C12N 1/00 - 7/08
G01N 33/50 - 33/98
C12Q 1/00 - 1/70
A61K 31/00 - 48/00
A61P 1/00 - 43/00
ＰｕｂＭｅｄ、ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴ
Ｎ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
Claims (15)
- 【請求項１】 配列番号２で表わされるアミノ酸配列中
第２２４〜６０４番目のアミノ酸からなるポリペプチド
であって、かつイノシトール1,4,5-三リン酸との高親和
性結合活性を有するポリペプチド。 - 【請求項２】 配列番号２で表わされるアミノ酸配列中
第２２４〜６０４番目のアミノ酸からなるポリペプチド
において第４４１番目のアルギニンをグルタミンへ置換
する変異を有するポリペプチドであって、かつイノシト
ール1,4,5-三リン酸との高親和性結合活性を有するポリ
ペプチド。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載のイノシトール1,4,
5-三リン酸との高親和性結合活性を有するポリペプチド
がＧＳＴと融合したＧＳＴ融合ポリペプチド。 - 【請求項４】 以下のポリペプチドをコードする遺伝
子。配列番号２で表わされるアミノ酸配列中第２２４〜
６０４番目のアミノ酸からなるポリペプチドであって、
かつイノシトール1,4,5-三リン酸との高親和性結合活性
を有するポリペプチド。 - 【請求項５】 以下のポリぺプチドをコードする遺伝
子。配列番号２で表わされるアミノ酸配列中第２２４〜
６０４番目のアミノ酸からなるポリペプチドにおいて第
４４１番目のアルギニンをグルタミンへ置換する変異を
有するポリペプチドであって、かつイノシトール1,4,5-
三リン酸との高親和性結合活性を有するポリペプチド。 - 【請求項６】 請求項４又は５に記載の遺伝子をＧＳＴ
をコードする遺伝子と連結させたＧＳＴ融合ポリペプチ
ドをコードする遺伝子。 - 【請求項７】 配列番号１で表わされる塩基配列の第６
７０番目から第１８１２番目で終わる塩基配列からな
り、かつイノシトール1,4,5-三リン酸との高親和性結合
活性を有するポリペプチドをコードするDNA。 - 【請求項８】 以下の遺伝子。配列番号１で表わされる
塩基配列の第６７０番目から第１８１２番目の塩基配列
中１３２１−１３２２塩基がaaに置換されてなり、かつ
イノシトール1,4,5-三リン酸との高親和性結合活性を有
するポリペプチドをコードするDNA。 - 【請求項９】 請求項４〜８のいずれか１項に記載の遺
伝子を含有する組換えベクター。 - 【請求項１０】 請求項９記載の組換えベクターを含む
形質転換体。 - 【請求項１１】 請求項１０記載の形質転換体を培養
し、得られる培養物からイノシトール1,4,5-三リン酸に
対し高親和性結合活性を有するポリペプチドを採取する
ことを特徴とする前記ポリペプチドの製造方法。 - 【請求項１２】 請求項１、２又は３記載のタンパク質
を含む、IP3誘導性カルシウム拮抗剤。 - 【請求項１３】 請求項１、２又は３記載のタンパク質
を含む、カルシウム産生に伴う疾患の治療剤。 - 【請求項１４】 請求項４〜８いずれか１項記載の遺伝
子を含む、カルシウム産生に伴う疾患の遺伝子治療剤。 - 【請求項１５】 疾患が、神経系、血管系、呼吸器系、
消化器系、リンパ系、泌尿器系及び生殖系の組織に生じ
るものからなる群から選ばれる少なくとも一つである請
求項１３又は１４記載の治療剤。
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-
1999
- 1999-08-26 JP JP24032599A patent/JP3538611B2/ja not_active Expired - Fee Related
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