JP2002508930A - 脳又は心臓の環状ヌクレオチドによってゲーティングされるイオンチャンネル化合物及びその使用 - Google Patents

脳又は心臓の環状ヌクレオチドによってゲーティングされるイオンチャンネル化合物及びその使用

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JP2002508930A
JP2002508930A JP2000525534A JP2000525534A JP2002508930A JP 2002508930 A JP2002508930 A JP 2002508930A JP 2000525534 A JP2000525534 A JP 2000525534A JP 2000525534 A JP2000525534 A JP 2000525534A JP 2002508930 A JP2002508930 A JP 2002508930A
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 本発明は、ＢＣＮＧタンパク質若しくはその一部又はＢＣＮＧ関連タンパク質若しくはその一部をコードする単離された核酸を提供する本発明は、さらに、ある化合物が、ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質の発現に影響を与えるかどうかをテストする方法も提供する。加えて、本発明は、さらに、ある化合物が、ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質と相互作用できる化合物を同定する方法を提供する。また、本発明はＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質の活性を調節できる化合物を同定する方法も提供する。さらに、本発明は、患者の症状を治療する方法であって、前記症状を治療するのに有効な一定量の前記提供された化合物を前記患者に投与することを備えた方法も提供する。最後に、本発明は、前記提供された化合物と薬学的許容される担体を備えた薬学的組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【従来の技術】
イオンチャンネルは、細胞膜を横切るイオンの流れを調節する多様なタンパク
質群である。神経系では、イオンチャンネル活性は、細胞間のコミュニケーショ
ンのための迅速且つ正確なシステムに進化してきた。各ニューロンの電気的な興
奮特性は、部分的には、ニューロンが発現しているチャンネルのセットによって
決定される。しかしながら、細胞は、生理的な事象又は成長における事象に応じ
て、個別のチャンネルの活性も調節することができ、イオンチャンネルが、多様
な電気的及び生化学的経路を統合する部位であり得るという証拠が増大している
。
【０００２】 インビボでは、イオンチャンネルは、異なる構造及び機能特性を持ったチャン
ネルをコードする幾つかの異なる遺伝子ファミリーから構成される多量体タンパ
ク質であると思われる。一つの遺伝子ファミリーの中では、様々なポア形成サブ
ユニットと補助サブユニットの組み合わせが集合することによって不均一性（ｈ
ｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）が生じる可能性がある（Ｇｒｅｅｎｅ、ｅｔ ａｌ
．，１９９５）。チャンネル特性は、セカンドメッセンジャーのカスケードによ
って調節され得、キナーゼのような細胞内タンパク質を直接結合することができ
るが、これは、シグナルカスケードをそのエフェクター分子に効率的にターゲッ
ティングするのに重要な方法であり得ることを示唆している。各ニューロンの電
気的特性は、部分的には、それが発現しているイオンチャンネルのセットによっ
て決定される。しかしながら、細胞は、生理的事象又は成長における事象に応じ
て、個別のチャンネルの活性を調節することもできる；ポア形成（α）サブユニ
ットは、補助（β）サブユニット、細胞骨格随伴タンパク質、及びタンパク質キ
ナーゼを含む様々な細胞内タンパク質と相互作用することができる（Ｇｒｅｅｎ
ｅ、ｅｔａｌ．， １９９５）。補助（β）サブユニットの他に、ポア形成サブ
ユニットは、Ｇタンパク質、細胞骨格随伴タンパク質及びタンパク質キナーゼを
含む様々な細胞内タンパク質及びセカンドメッセンジャー分子自体と相互作用す
ることができる（Ａｄｅｌｍａｎ，ｅｔ ａｌ．， １９９５）。
【０００３】 幾つかのクラスのイオンチャンネルは、環状ヌクレオチド（Ｚａｇｏｔｔａ，
ｅｔ ａｌ．， １９９６；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３
，及びＨｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、又はＣａ２＋（Ａｄｅｌｍａｎ
，ｅｔ ａｌ．， １９９２；Ｋｏｈｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９６）のよう
なセカンドメッセンジャー分子を直接結合でき、これらによって調節される。こ
の特性を有するチャンネルは、生化学的カスケードと電気的な活性を直接連関さ
せるので、神経のシグナリングを調節する上での中心的な要素であり得る。環状
ヌクレオチドによってゲーティングされるチャンネル（ＣＮＧ；ｃｙｃｌｉｃ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ ｃｈａｎｎｅｌ）は、視覚と嗅覚のシグナ
ル伝達の両者において異なる役割を果たしている；近年、ｃＡＭＰとｃＧＭＰが
様々な形態のシナプスの可塑性を媒介することが知られている海馬及び脳の他の
領域中にＣＮＧチャンネルが同定されたことは（Ｋｒａｐｉｖｉｎｉｓｋｙ，ｅ
ｔ ａｌ．，１９９５；Ｆｒｅｙ， ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｂｌｏｓｈａｋ
ｏｖ， ｅｔ ａｌ．， １９９７； ａｎｄ Ａｒａｎｃｉｏ， ｅｔ ａｌ
．， １９９５）、それが、中枢神経内の興奮性の調節にも寄与し得ることを示
唆している（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ， ｅｔ ａｌ．，１９９６及びＢｒａｄｌｅｙ
，ｅｔ ａｌ．， １９９７）。
【０００４】 最初に単離されたＫ＋チャンネルの構造遺伝子は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏ
ｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）中のシェーカー（Ｓｈ）座によっ
てコードされる遺伝子であった（Ｓｔｒｏｎｇ， ｅｔ ａｌ．， １９９３；
Ｐａｐａｚｉａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７）。その配列は、巨大で、いまだ増
えつづけている関連遺伝子のファミリーの原型である（Ｋａｍｂ，ｅｔ ａｌ．
，１９８７；Ｗａｒｍｋｅ，ｅｔ ａｌ．， １９９４）。まだ分子的な定義を
待たねばならないが、多くの十分に特性決定されたＫ＋電流の特性は、このファ
ミリーの他のメンバーが、まだ同定されるであろうことを予測せしめる（Ａｔｋ
ｉｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９１）。
【０００５】 初期のＫ＋チャンネルスーパーファミリーのメンバーは、機能的な欠損に必要
とされる対立遺伝子の染色体上の位置を決定することによって（ショウジョウバ
エのＳｈ、ｅａｇ、及びｓｌｏ；（Ｐａｐａｚｉａｎ， ｅｔ ａｌ．，１９８
７；Ｋａｍｂ，ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｗａｒｍｋｅ， ｅｔ ａｌ．，１９
９１；Ａｔｋｉｎｓｏｎ， ｅｔ １９９１））、又はウシの網膜のｃＧＭＰチ
ャンネルような相対的に豊富なタンパク質を精製した後にクローニングされたが
、Ｋ＋チャンネルスーパーファミリーの新規メンバーをクローニングするために
最も広く使用された戦略は、これらの配列との相同性によるものである。残念な
ことに、このアプローチは、Ｋ＋チャンネルスーパーファミリーの系統樹中に存
在するより多様な配列、及び存在の可能性がある新規な枝を同定するのには、あ
まり適していない。アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞中での発現
クローニングによれば、この問題を回避することができる；これは、チャンネル
の既存の、又は容易に検出できる生理的特性を示唆する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本願は、１９９７年１２月２３日に出願された米国出願０８／９９７，６８５
号の一部継続出願である１９９８年５月２８日に出願された米国出願０９／０８
６，４３６号の優先権を主張するものであり、その内容は、参照文献として本願
に組み込まれる。
【０００７】 本願を通じて、様々な文献が、著者と日付によって引用される。これらの文献
の完全な引用が、配列表と請求の範囲の直前にある明細書の末尾に、アルファベ
ット順で列記されているであろう。これらの文献の開示は、技術水準をより完全
に記載するために、その全体が本願の中に参照文献として組み込まれる。発明の概要 本発明は、ＢＣＮＧタンパク質又はその一部をコードする単離された核酸を提
供する。本発明は、さらに、ＢＣＮＧ関連タンパク質又はその一部をコードする
単離された核酸を提供する。さらに、本発明は、ｍＢＣＮＧ−１（ＡＴＣＣ受付
番号２０９７８１）をコードするｃＤＮＡを含むベクターを提供する。加えて、
本発明は、さらに、ｈＢＣＮＧ−１（ＡＴＣＣ受付番号２０９８２７）をコード
するｃＤＮＡを含むベクターを提供する。本発明は、単離されたＢＣＮＧタンパ
ク質も提供する。さらに、本発明は、単離されたＢＣＮＧ関連タンパク質も提供
する。
【０００８】 本発明は、さらに、ＢＣＮＧタンパク質若しくはその一部をコードする核酸、
又はＢＣＮＧ関連タンパク質若しくはその一部、及び担体を含む組成物を提供す
る。加えて、本発明は、さらに、ＢＣＮＧタンパク質若しくはその一部を含む組
成物、又はＢＣＮＧ関連タンパク質若しくはその一部、及び担体を含む組成物を
提供する。
【０００９】 加えて、本発明は、ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質をコード
する核酸と特異的にハイブリダイズできる核酸プローブを提供する。
【００１０】 本発明は、ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質をコードする試料
中の核酸を同定するための方法であって、 （ａ）試料中で核酸プローブとＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク
質をコードする核酸との間で複合体を形成させることが可能な条件下で、ＢＣＮ
Ｇタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリ
ダイズできる核酸プローブと前記試料を接触させる工程と； （ｂ）工程（ａ）で形成された複合体の量を決定する工程と； （ｃ）任意の配列を用いて形成された複合体の量と工程（ｂ）で決定された複
合体の量を比較する工程と を備え、ＢＣＮＧ特異的なプローブによって形成された複合体の量のほうが多い
ことが、前記試料中にＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質をコード
する核酸が存在することの指標となる方法を提供する。
【００１１】 さらに、本発明は、ある化合物が、ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タン
パク質の発現に影響を与えるかどうかをテストする方法であって、 （ａ）ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質を発現する試料を化合
物と接触させる工程と； （ｂ）前記試料中のＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質の発現量
を決定する工程と； （ｃ）工程（ｂ）で決定されたＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク
質の発現量を前記化合物の非存在下で決定された量と比較する工程と を備えた方法を提供する。
【００１２】 加えて、本発明は、さらに、ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質
と相互作用できる化合物を同定する方法であって、 （ａ）前記化合物とＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質をコード
する核酸との複合体を形成させることが可能な条件下で、ＢＣＮＧタンパク質又
はＢＣＮＧ関連タンパク質を発現している試料を化合物と接触させる工程と； （ｂ）前記化合物と前記ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質との
間で形成された複合体の量を決定する工程と； （ｃ）工程（ｂ）で形成された複合体の量を前記化合物の非存在下で形成され
た量と比較する工程と を備え、前記化合物の存在下で形成された複合体の量のほうが多いことが、ＢＣ
ＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質と相互作用できる化合物の存在の指
標となる方法を提供する。
【００１３】 本発明は、ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質活性を調節できる
化合物を同定する方法であって、 （ａ）ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質を発現している試料を
化合物と接触させる工程と； （ｂ）前記試料中のＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質の活性量
を決定する工程と； （ｃ）工程（ｂ）で決定されたＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク
質の活性量を前記化合物の非存在下で決定された量と比較する工程と を備え、活性の増加又は減少が、ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク
質の活性を調節できる化合物の存在の指標となる方法も提供する。
【００１４】 さらに、本発明は、患者の症状を治療する方法であって、前記症状を治療する
のに有効な量の提供された化合物を前記患者に投与することを含む方法も提供す
る。
【００１５】 最後に、本発明は、提供された化合物と薬学的に許容される担体とを含む薬学
的組成物を提供する。発明の詳細な記載 本発明は、ＢＣＮＧタンパク質又はその一部をコードする単離された核酸を提
供する。本発明は、さらに、ＢＣＮＧ関連タンパク質又はその一部をコードする
単離された核酸を提供する。
【００１６】 本発明の態様では、ＢＣＮＧタンパク質は、ｍＢＣＮＧ−１（ＡＴＣＣ受付番
号２０９７８１）（配列番号１）、ｍＢＣＮＧ−２（配列番号５）、ｍＢＣＮＧ
−３（配列番号９）、ｍＢＣＮＧ−４（配列番号１１）、ｈＢＣＮＧ−１（ＡＴ
ＣＣ受付番号２０９８２７）（配列番号３）、又はｈＢＣＮＧ−２（配列番号７
）に示された配列によってコードされる。本発明の一態様によれば、前記核酸は
、ＤＮＡ又はＲＮＡである。本発明の一態様では、前記核酸は、ｃＤＮＡである
。本発明の一態様によれば、ｃＤＮＡは、ｍＢＣＮＧ−１（ＡＴＣＣ受付番号２
０９７８１号）に対する配列番号１、ｈＢＣＮＧ−１に対する配列番号３、ｍＢ
ＣＮＧ−２に対する配列番号５、ｈＢＣＮＧ−２に対する配列番号７、ｍＢＣＮ
Ｇ−３に対する配列番号９、又はｍＢＣＮＧ−４に対する配列番号１１に示され
たヌクレオチド配列を有する。本発明のある態様は、前記核酸を含むベクターで
ある。本発明のある態様によれば、該ベクターは、ウイルス又はプラスミドＤＮ
Ａを含む。本発明の一態様は、前記核酸と調節要素を含む。本発明の一態様は、
適切な宿主中に提供された発現ベクターを含んでなる宿主ベクター系である。
【００１７】 さらに、本発明は、ｍＢＣＮＧ−１をコードするｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ受付番号
２０９７８１）を含むベクターを提供する。加えて、本発明は、さらに、ｈＢＣ
ＮＧ−１をコードするｃＤＮＡを含むベクターを提供する（ＡＴＣＣ受付番号２
０９８２７）。
【００１８】 本発明のある態様では、前記適切な宿主は、細菌細胞、真核細胞、哺乳類細胞
、又は昆虫細胞である。
【００１９】 本発明は、単離されたＢＣＮＧタンパク質も提供する。さらに、本発明は、単
離されたＢＣＮＧ関連タンパク質も提供する。
【００２０】 本発明の一態様では、ＢＣＮＧタンパク質は、ｍＢＣＮＧ−１に対する配列番
号２（図８Ａ−８Ｂ）、ｍＢＣＮＧ−２に対する配列番号６（図８Ａ−８Ｂ）、
ｍＢＣＮＧ−３に対する配列番号１０（図８Ａ−８Ｂ）、ｍＢＣＮＧ−４に対す
る配列番号１２（図８Ａ−８Ｂ）、ｈＢＣＮＧ−１に対する配列番号４（図８Ａ
−８Ｂ）、又はｈＢＣＮＧ−２に対する配列番号８（図８Ａ−８Ｂ）に示された
アミノ酸配列を有する。本発明の別の態様によれば、ＢＣＮＧ関連タンパク質は
、配列番号２：ｍＢＣＮＧ−１（図８Ａ−８Ｂ）：ｍＢＣＮＧ−２に対する配列
番号６（図８Ａ−８Ｂ）、ｍＢＣＮＧ−３に対する配列番号１０（図８Ａ−８Ｂ
）、ｍＢＣＮＧ−４に対する配列番号１２（図８Ａ−８Ｂ）、ｈＢＣＮＧ−１に
対する配列番号４（図８Ａ−８Ｂ）、又はｈＢＣＮＧ−２に対する配列番号８（
図８Ａ−８Ｂ）に示されたアミノ酸配列と実質的に相同なアミノ酸配列を有する
。
【００２１】 本発明は、さらに、ＢＣＮＧタンパク質若しくはその一部をコードする核酸、
又はＢＣＮＧ関連タンパク質若しくはその一部をコードする核酸と担体とを含む
組成物を提供する。本発明のある態様では、核酸は、実質的に、ｍＢＣＮＧ−１
に対する配列番号１、ｈＢＣＮＧ−１に対する配列番号３、ｍＢＣＮＧ−２に対
する配列番号５、ｈＢＣＮＧ−２に対する配列番号７、ｍＢＣＮＧ−３に対する
配列番号９、ｍＢＣＮＧ−４に対する配列番号１１に示されたコード配列、又は
このようなコード配列の一部と実質的に同一のコード配列を含む。
【００２２】 加えて、本発明は、さらに、ＢＣＮＧタンパク質若しくはその一部、又はＢＣ
ＮＧ関連タンパク質若しくはその一部と担体とを含む組成物を提供する。
【００２３】 本発明のある態様では、ＢＣＮＧタンパク質は、配列番号２：ｍＢＣＮＧ−１
（図８Ａ−８Ｂ）：ｍＢＣＮＧ−２に対する配列番号６（図８Ａ−８Ｂ）、ｍＢ
ＣＮＧ−３に対する配列番号１０（図８Ａ−８Ｂ）、ｍＢＣＮＧ−４に対する配
列番号１２（図８Ａ−８Ｂ）、ｈＢＣＮＧ−１に対する配列番号４（図８Ａ−８
Ｂ）、ｈＢＣＮＧ−２に対する配列番号８（図８Ａ−８Ｂ）に示されたアミノ酸
配列を含む。
【００２４】 さらに、本発明は、ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質をコード
する核酸と特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブを提供する。本発明の一
態様は、提供された核酸と特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブである。
本発明の一態様によれば、前記プローブは、配列番号１３、配列番号１４、配列
番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番
号２０、配列番号２１、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号
２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２
９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４
に示された核酸配列と特異的にハイブリダイズし得る。
【００２５】 本発明は、ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質をコードする試料
中の核酸を同定するための方法であって、 （ａ）試料中で核酸プローブとＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク
質をコードする核酸との間で複合体を形成させることが可能な条件下で、ＢＣＮ
Ｇタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリ
ダイズできる核酸プローブと前記試料を接触させる工程と； （ｂ）工程（ａ）で形成された複合体の量を決定する工程と； （ｃ）任意の配列を用いて形成された複合体の量と工程（ｂ）で決定された複
合体の量を比較する工程と を備え、ＢＣＮＧ特異的なプローブによって形成された複合体の量のほうが多い
ことが、前記試料中にＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質をコード
する核酸が存在することの指標となる方法を提供する。
【００２６】 本発明の一態様では、工程（ａ）は、さらに、ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮ
Ｇ関連タンパク質をコードする核酸分子を増幅することを含む。本発明の一態様
によれば、該増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応に適した条件下で、前記試料からの
前記核酸分子を、ｍＢＣＮＧ−１（配列番号１）、ｍＢＣＮＧ−２（配列番号５
）、ｍＢＣＮＧ−３（配列番号９）、ｍＢＣＮＧ−４（配列番号１１）、ｈＢＣ
ＮＧ−１（配列番号３）、又はｈＢＣＮＧ−２（配列番号７）と特異的にハイブ
リダイズできる少なくとも１つの増幅プライマーに接触させることを含む。本発
明の一態様では、ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質をコードする
前記増幅された核酸分子は、サイズ分画によって検出される。本発明の一態様は
、さらに、サイズ分画によって複合体を単離することを含む。本発明のある態様
によれば、核酸プローブは、検出可能なマーカーでラベルされる。本発明の一態
様では、検出可能なマーカーは、放射能ラベルされた分子、蛍光分子、酵素、リ
ガンド、磁気ビーズである。本発明の一態様によれば、前記プローブは、配列番
号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号
１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２１、配列番号２
２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７
、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、
配列番号３３、又は配列番号３４に示されたヌクレオチド配列を含む。本発明の
一態様では、核酸プローブは、ｍＢＣＮＧ−１（配列番号１）、ｍＢＣＮＧ−２
（配列番号５）、ｍＢＣＮＧ−３（配列番号９）、ｍＢＣＮＧ−４（配列番号１
１）、ｈＢＣＮＧ−１（配列番号３）、又はｈＢＣＮＧ−２（配列番号７）をコ
ードする核酸に特異的にハイブリダイズできる。本発明は、提供された増幅法に
よって同定された、以前には未知であった単離された核酸も提供する。ある態様
では、前記試料は、細胞、又は細胞抽出物、又は細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅ）、
又は組織試料、又は生物学的液体試料を含む。
【００２７】 さらに、本発明は、ある化合物が、ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タン
パク質の発現を調節するかどうかをテストする方法であって、 （ａ）ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質を発現する試料を化合
物と接触させる工程と； （ｂ）前記試料中のＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質の発現量
を決定する工程と； （ｃ）工程（ｂ）で決定されたＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク
質の発現量を前記化合物の非存在下で決定された量と比較することによって、前
記化合物が、ＢＣＮＧタンパク質の発現又はＢＣＮＧ関連タンパク質の発現を調
節するかどうかを決定する工程と を備えた方法を提供する。本発明は、一以上の化合物が、ＢＣＮＧタンパク質若
しくはＢＣＮＧ関連タンパク質の活性を調節するかどうか、又はＢＣＮＧタンパ
ク質若しくはＢＣＮＧ関連タンパク質の何れかをコードする核酸の発現を調節か
どうかを決定するために、極めて多くの化合物をスクリーニングするためのこの
ような方法を提供する。
【００２８】 加えて、本発明は、さらに、ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質
と相互作用できる化合物を同定する方法であって、 （ａ）前記化合物と前記ＢＣＮＧタンパク質又は前記ＢＣＮＧ関連タンパク質
をコードする核酸との複合体を形成させることが可能な条件下で、ＢＣＮＧタン
パク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質を発現している試料を化合物と接触させる工
程と； （ｂ）前記化合物と前記ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質との
間で形成された複合体の量を決定する工程と； （ｃ）工程（ｂ）で形成された複合体の量を前記化合物の非存在下で形成され
た量と比較する工程と を備え、前記化合物の存在下で形成された複合体の量のほうが多いことが、ＢＣ
ＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質と相互作用できる化合物の存在の指
標となる方法を提供する。
【００２９】 本発明は、ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質活性を調節できる
化合物を同定する方法であって、 （ａ）ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質を発現している試料を
化合物と接触させる工程と； （ｂ）前記試料中のＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質の活性量
を決定する工程と； （ｃ）工程（ｂ）で決定されたＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク
質の活性量を前記化合物の非存在下で決定された量と比較する工程と を備え、活性の増加又は減少が、ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク
質の活性を調節できる化合物の存在の指標となる方法も提供する。
【００３０】 本発明は、ここに記載されている化合物スクリーニング法によって、ＢＣＮＧ
タンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質の活性又は発現を調節できるものとして
同定される化合物又は組成物も提供する。
【００３１】 本発明の一態様は、まず、ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質が
産生される条件下で、発現系の中にＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパ
ク質をコードする核酸を導入し、前記発現系に前記核酸を発現させることを含む
工程（ａ）である。本発明の別の態様は、工程（ｂ）が、化合物の存在下でチャ
ンネル電流又は細胞内カルシウムレベルを測定することを含む。本発明の別の態
様では、前記発現系は、培養された宿主細胞を含む。
【００３２】 本発明の一態様では、ＢＣＮＧタンパク質は、ｍＢＣＮＧ−１（配列番号２）
、ｍＢＣＮＧ−２（配列番号６）、ｍＢＣＮＧ−３（配列番号１０）、ｍＢＣＮ
Ｇ−４（配列番号１２）、ｈＢＣＮＧ−１（配列番号４）、又はｈＢＣＮＧ−２
（配列番号８）のアミノ酸配列又はその一部を含む。本発明の一態様では、前記
試料は、細胞、細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅ）、又は無細胞翻訳（ｃｅｌｌ−ｆｒ
ｅｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）を含む。別の態様では、前記細胞は、心臓細胞
、腎臓細胞、肝細胞、気道上皮細胞、筋肉細胞、神経細胞、グリア細胞、ミクロ
グリア細胞、上皮細胞、単核細胞、腫瘍細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、又はアフ
リカツメガエルの卵母細胞を含む。
【００３３】 本発明は、さらに、本明細書のスクリーニング方法によって同定された以前に
は未知であった化合物を提供する。ある態様によれば、前記化合物は、ペプチド
、ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃ）、核酸、ポリマー、又は
小分子である。該小分子は、有機分子又は無機分子であり得る。前記小分子は、
ＢＣＮＧタンパク質の分子量よりも小さい分子量を有し得る。本発明の一態様に
よれば、前記化合物は、固相支持体に結合される。本発明の一態様では、前記Ｂ
ＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質は、イオンチャンネルタンパク質
又はイオンチャンネルサブユニットタンパク質のサブユニットである。ある態様
では、ＢＣＮＧ関連タンパク質は、細胞中及び細胞間にペースメーカー電流を作
り出すのに必要とされる成分である。本発明のある態様では、前記化合物は、イ
オンチャンネル活性のアゴニスト又はアンタゴニストである。
【００３４】 本発明のある態様によれば、前記修飾は、増加したイオン流速又は減少したイ
オン流速である。別の態様によれば、前記修飾は、増加したイオン許容性（ｐｅ
ｒｍｉｓｓｉｖｉｔｙ）又は減少したイオン許容性である。
【００３５】 本発明は、さらに、試料中のＢＣＮＧタンパク質活性又はＢＣＮＧ関連タンパ
ク質活性を調節する方法であって、前記試料を提供された化合物と接触させるこ
とを備えた方法も提供する。
【００３６】 さらに、本発明は、患者の症状を治療する方法であって、前記症状を治療する
のに有効な量の提供された化合物を患者に投与することを備えた方法も提供する
。前記症状は、異常な症状を含む。前記異常な症状は、記憶の喪失、心臓症状、
肝臓症状、細胞分泌を有する問題、膵臓症状、、脳のペースメーカー症状、又は
非神経細胞中のペースメーカー症状であり得る。
【００３７】 本発明は、さらに、提供された化合物と薬学的に許容される担体とを含む薬学
的組成物を提供する。本発明の一態様では、前記担体は、賦形剤、エアロゾル、
局所担体、水溶液、非水溶液、又は固相担体である。
【００３８】 本発明は、さらに、患者の症状を治療する方法であって、前記患者の前記症状
を治療するのに有効な量の提供された薬学的組成物を前記患者に投与することを
含む方法も提供する。
【００３９】 本発明のある態様では、前記症状は、神経、腎臓、肺、肝臓、又は心血管症状
である。本発明の一態様によれば、前記症状は、てんかん、アルツハイマー病、
パーキンソン病、長ＱＴ症候群（ｌｏｎｇ ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、洞不全
症候群、加齢に伴う記憶喪失、嚢胞性繊維症、突然死症候群、痛覚過敏、心室又
は心房の不整脈、家族性洞房結節病、又はペースメーカーリズム機能不全である
。本発明のさらなる態様では、前記患者は、ヒトである。患者の疾病を治療する
ためのある種のさらなる方法が、以下で論述されている。長ＱＴ病は、活動電位
が通常よりも長く持続する心臓の病気である。洞房結節病は、洞房結節が正常に
機能しない（例えば、心房細動後）後天的な病気である。
【００４０】 本発明は、さらに、ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質に特異的
に結合する抗体も提供する。本発明は、さらに、前記抗体を産生し得る細胞を提
供する。本発明は、試料中のＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質を
同定する方法であって、ａ）前記抗体と前記タンパク質との複合体を形成するこ
とが可能な条件下で、前記試料を抗体と接触させる工程と；ｂ）形成された複合
体の前記量を決定する工程と；ｃ）工程（ｂ）で形成された複合体の量と前記抗
体の非存在下で形成された複合体の量を比較する工程とを備え、前記抗体の存在
下で形成された複合体の量が増加して存在することが、前記試料中に前記タンパ
ク質を同定したことの指標となる方法を提供する。
【００４１】 本明細書で用いる、「ＢＣＮＧタンパク質」という用語は、ｍＢＣＮＧ−１、
ｍＢＣＮＧ−２、ｍＢＣＮＧ−３、ｍＢＣＮＧ−４、ｈＢＣＮＧ−１又はｈＢＣ
ＮＧ−２と実質的に類似又は同一のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。Ｂ
ＣＮＧタンパク質の例は、ｍＢＣＮＧ−１、ｍＢＣＮＧ−２、ｍＢＣＮＧ−３、
ｍＢＣＮＧ−４、ｈＢＣＮＧ−１又はｈＢＣＮＧ−２である。ＢＣＮＧタンパク
質は、マウス又はヒト以外の種のｍＢＣＮＧ−１、ｍＢＣＮＧ−２、ｍＢＣＮＧ
−３、ｍＢＣＮＧ−４、ｈＢＣＮＧ−１又はｈＢＣＮＧ−２の相同体であり得る
。あるいは、ＢＣＮＧタンパク質は、マウス、ヒト、又は他の哺乳動物、または
非哺乳動物種のＢＣＮＧタンパク質のファミリーの他のメンバーであり得る。Ｂ
ＣＮＧタンパク質は、イオンチャンネルの内在性（ｉｎｔｅｇｒａｌ）成分又は
サブユニットとして機能し得る。ＢＣＮＧタンパク質は、イオンチャンネルに付
随する付属タンパク質（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）又は非機能的タ
ンパク質であり得る。
【００４２】 用語「ＢＣＮＧ関連タンパク質」は、本明細書に記載されているＢＣＮＧタン
パク質の機能的ドメインの少なくとも１つと実質的な相同性を有するタンパク質
を含む（例３、図１１及び図１３参照）。例えば、疎水性コアは、このようなド
メインの１つである（例３、「疎水性コア」のサブセクションを参照）。機能的
なドメインの別の例は、Ｓ４電圧感受性ドメインである（例３、サブセクション
「Ｓ４電圧感受性ドメイン」参照）。機能的なドメインのさらに別の例は、環状
ヌクレオチド結合部位である（例３、サブセクション「環状ヌクレオチド結合部
位」参照）。さらに別の例は、ポアドメインである（例３、サブセクション「ポ
ア」参照）。ＢＣＮＧ関連タンパク質は、このように、イオンチャンネルの内在
性成分又はサブユニットとして機能し得る。ＢＣＮＧ関連タンパク質は、イオン
チャンネルに付随する付属タンパク質又は非機能的タンパク質であり得る。ＢＣ
ＮＧ関連タンパク質は、ＢＣＮＧタンパク質又はその一部との配列又は構造的同
一性によって定義される。このため、ＢＣＮＧタンパク質は、ＢＣＮＧ関連タン
パク質であり、ＢＣＮＧ関連タンパク質は、ＢＣＮＧタンパク質に限定されない
。
【００４３】 ｍＢＣＮＧ−１のアミノ酸配列は、配列番号２として表されている。該配列は
、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託され、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＡＦ０２８
７３７を与えられた。
【００４４】 ＢＣＮＧタンパク質は、ｍＢＣＮＧ−１と実質的な配列の類似性を示す。ＢＣ
ＮＧ関連タンパク質は、ｍＢＣＮＧ−１の実質的な相同性又は機能的関連性を示
す。当業者であれば理解できるように、実質的な配列の相同性には、保存された
アミノ酸置換に対する考慮が含まれる。機能的関連性は、明確な相同性がない領
域によって隔てられた類似性を有する配列のドメイン又は領域から収集され得る
。
【００４５】 本発明は、ＢＣＮＧタンパク質又はその一部を含む組成物、ＢＣＮＧ関連タン
パク質又はその一部、ＢＣＮＧタンパク質又はその一部をコードする核酸、ＢＣ
ＮＧ関連タンパク質又はその一部をコードする核酸、ＢＣＮＧタンパク質又はそ
の一部に対する抗体、ＢＣＮＧ関連タンパク質又はその一部に対する抗体、ＢＣ
ＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質又は他の任意の記載された本発明の
化合物の何れかの一部に対してアンチセンスである配列を有する核酸を提供する
。該組成物は、さらに、担体を含んでもよい。該担体は、薬学的に許容される担
体であり得る。
【００４６】 本明細書で使用する「その一部」とは、全配列未満を含む配列（例えば、アミ
ノ酸配列又はヌクレオチド配列）である。例えば、配列番号２に関していえば、
アミノ酸３５〜４５がその部分を表している。
【００４７】 本明細書で使用する語「特異的にハイブリダイズする」とは、核酸プローブが
、プローブの配列と実質的な相同性を有する核酸配列にハイブリダイズことを意
味する。該配列は、同一又はユニークである必要はない。しかしながら、該配列
は、当業者に理解されるように、配列間で構造又は機能的な関係を示さなければ
ならない。
【００４８】 ハイブリダイゼーションは、遺伝子ファミリーの近縁メンバーと遠縁メンバー
とを区別することができる。反応条件は、一つの種のハイブリダイゼーションを
最適し、他の種のハイブリダイゼーションを最小化するように調整できる。
【００４９】 マッチングがよくないハイブリッドの場合、ハイブリダイゼーションは、より
低調で、ハイブリダイゼーションカーブは、より低い温度の方に移る。クロスハ
イブリダイゼーションとセルフハイブリダイゼーションの速度定数の比（識別比
）を反応温度に対してプロットすると、Ｓ字状曲線が得られる。低温では、その
比は高いが、より高い温度では（完全にマッチしたハイブリッドでは、Ｔｍ−２
０℃に近づくと）、その比は０に近づく。低い温度でインキュベートすることに
よって遠縁配列を区別するのがより容易なはずであり、一方、高い温度でハイブ
リダイズすることによって、近縁の配列を区別するのが容易なはずであるという
ことが予測される点で、この関係は有用である。
【００５０】 ファミリーを成す配列の遠縁のメンバーを区別するためには、ハイブリダイゼ
ーションは、より寛大な（緩やかな）基準で起こるべきである。近縁のメンバー
を検出するためには、ハイブリダイゼーションは、厳格な基準で起こるべきであ
る。ファミリーの異なるメンバーは、おそらく、異なる識別対温度曲線を有する
ので、単一の折衷的な基準は有効でないであろう。緩やかな基準でのハイブリダ
イゼーションの後に、段階的によりストリンジェントな条件下で洗浄することは
、あるファミリーの遠縁のメンバーを検出するのに有用であり得るが、近縁のメ
ンバーを同定するのには適していない。これは、おそらく、ハイブリダイゼーシ
ョンと洗浄が異なるパラメーターに依存しているからであろう。ハイブリダイゼ
ーションは、核形成の頻度に依存しているのに対して、洗浄はハイブリッドの熱
的安定性(ＴＭ)に依存する。このため、ストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョンとその後のストリンジェントな洗浄は、穏やかなハイブリダイゼーションと
ストリンジェントな洗浄より、あるファミリーの近縁のメンバーを検出するのに
優れている。
【００５１】 ハイブリダイゼーションの程度は、相補性の程度、ハイブリダイズされる核酸
分子の長さ、及び反応混合物中の条件のストリンジェンシーに依存する。ストリ
ンジェンシー条件は、温度、塩濃度、核酸の濃度、核酸の長さ、核酸の配列、お
よび反応混合物の粘度を含む様々な因子（これらに限定されない）によって影響
を受ける。よりストリンジェントな条件は、効率的なハイブリダイゼーションを
達成するために核酸間のより大きな相補性を要求する。
【００５２】 ハイブリダイゼーションの好ましい方法は、ブロットハイブリダイゼーション
である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ． ｆｏｒ ａｄｄ
ｉｔｉｏｎａｌ ｄｅｔａｉｌｓ ｒｅｇａｒｄｉｎｇ ｂｌｏｔ ｈｙｂｒｉ
ｄｉｚａｔｉｏｎを参照。
【００５３】 本明細書において使用する核酸プローブとは、ある特定の核酸配列に特異的に
ハイブリダイズする核酸である。該プローブは、固相マトリックスに非特異的に
結合してもよい。核酸プローブは、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得、検出可能なマー
カーでラベルすることができる。このようなラベル手法には、放射性標識、ジゴ
キシゲニン標識、及びビオチン標識が含まれるが、これらに限定されない。ＤＮ
Ａを標識する周知の方法は、ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ酵素、又はポリヌク
レオチドキナーゼを用いた３２Ｐである。さらに、化学的な部分（ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）をピリミジン及びプリン環に付着させる方法（Ｄａｌ
ｅ， Ｒ．Ｎ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．， １９７３ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７０：２２３８−４２）、化学発光によって検出
することができる方法（Ｂａｒｔｏｎ， Ｓ．Ｋ． ｅｔ ａｌ，１９９２ Ｊ
．Ａｍ．Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．１１４：８７３６−４０）、及びビオチン化され
た核酸プローブを利用する方法（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｔ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．，１
９８３ Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３３：１２５−１３１；Ｅｒｉｃｋ
ｓｏｎ、 Ｐ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， １９８２ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ５１：２４１−４９；Ｍａｔｔｈａｅｉ，Ｆ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．
， １９８６ Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １５７−１２３−２８）、及び
市販の産物を用いて蛍光によって検出することができる方法を含むシグナルを増
幅するための非放射性手法がある。非放射性標識キットも市販されている。
【００５４】 核酸増幅は、Ｍｕｌｌｉｓ,米国特許第４，６８３，２０２号に記載されてお り、参照文献として本明細書に組み込まれる。
【００５５】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）では、増幅反応は、サンプル中に含まれるテ
ンプレート核酸を使用し、一以上のプローブ（「プライマー」）配列と誘導物質
（ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）を使用することができる。
【００５６】 増幅、特に伸長を実施するための適切な酵素には、例えば、大腸菌のＤＮＡポ
リメラーゼＩ、熱安定性Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌のＤＮＡポリメラ
ーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、他の入手し得るＤＮＡポリメ
ラーゼ、逆転写酵素、及びヌクレオチドのポリヌクレオチド（型増幅産物である
）への共有結合を促進するであろう他の酵素が含まれる。オリゴヌクレオチドプ
ローブ（プライマー）は、様々な製造業者によって売られている自動化された装
置によって合成することができ、又は商業的に調製されたものであり得る。
【００５７】 固相マトリックスは、当業者が入手することができる。固相マトリックスには
、試験管、ビーズ、微粒子、計量棒、プレートなどの形態のポリスチレン、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、又は任意の固相プラスチック材
料が含まれ得る。さらに、マトリックスには、膜、９６穴ミクロタイタープレー
ト、試験管、及びエッペンドルフチューブが含まれるが、これらに限定されない
。固相は、ガラスビーズ、ガラスの試験管、及びガラス製の他の任意の適切な形
状も含む。表面が、カルボキシル、アミノ、ヒドラジド、またはアルデヒド基を
担持するように修飾されたプラスチック又はガラスのような機能化された固相も
使用できる。一般的に、このようなマトリックスは、リガンド結合物質が付着で
きる任意の表面を含み、又はそれ自体リガンド付着部位を与える表面を含む。
【００５８】 本明細書で、タンパク質の活性又はイオンチャンネル活性の調節に関して使用
される「調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」という語は、前記活性のアップレギュ
レーション又はダウンレギュレーションを指す。アップレギュレーションには、
イオンチャネルの場合、増加されたイオンのフローが含まれるが、これに限定さ
れない。ダウンレギュレーションには、イオンチャネルの場合、減少したイオン
のフローが含まれるが、これに限定されない。例えば、活性調節の一形態は、チ
ャネルを介したイオンのフローを阻害し、活性を減少させるチャンネルブロック
タンパク質又は化合物であろう。あるいは、別の調節形態は、チャネルを介した
フローを促進し、活性を増加させるチャネル開放タンパク質又は化合物である。
さらに、チャネルを介したイオンフローの性状は、調節され得る。例えば、タン
パク質又は化合物は、チャネルをカリウムのフローに対して不応になるように変
化させて、別のイオンとともに、又は別のイオンの代わりに、カリウムのフロー
に対して許容可能（ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ）にし得る。調節という語は、遺伝子
発現の増加又は減少を記載するためにも使用される。
【００５９】 本発明の方法の何れを実施し、又は本発明の薬学的組成物の何れを調製する場
合にも、「治療的に有効な量」とは、ＢＣＮＧ関連タンパク質の活性又は機能を
調節することができる量である。従って、有効量は、処置される患者、処置され
る条件とともに変化するであろう。投与法には、皮膚、皮下、静脈内、非経口、
経口、局所、又はエアロゾルが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００６０】 本明細書で使用される「適切な薬学的に許容される担体」という語には、リン
酸緩衝化生理食塩水溶液、水、油／水エマルジョン、又はトリグリセリドエマル
ジョンのようなエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、錠剤、被覆された錠剤、
及びカプセルのような任意の標準的な薬学的に許容される担体が包含される。化
合物の静脈内及び腹腔内の投与に有用な許容されるトリグリセリドエマルジョン
の例は、商業的にＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）として知られているトリグ
リセリドエマルジョンである。
【００６１】 典型的には、このような担体は、デンプン、ミルク、糖、ある種のクレー、ゼ
ラチン、ステアリン酸、タルク、植物脂肪、又はオイル、ゴム、グリコール、又
は他の公知の賦形剤のような賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）を含有する。このよ
うな担体は、芳香及び色素添加剤、又は他の成分を含んでもよい。
【００６２】 本発明は、適切な希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、ア
ジュバント、及び／又は担体とともに薬学的組成物も提供する。このような組成
物は、液体又は凍結乾燥若しくはその他の方法で乾燥された調合剤であり、様々
な緩衝液含有物の希釈剤（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、アセテート、ホスフェー
ト）、ｐＨ及びイオン強度、表面への吸収を阻害するためのアルブミン又はゼラ
チンのような添加物、界面活性剤（例えば、トゥイーン２０、トゥイーン８０、
プルロニックＦ６８、胆汁酸塩）、可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチ
レングリセロール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、ニ亜硫酸ナトリウム
）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、バルク
物質すなわち張度調整剤（例えば、ラクトース、マニトール）、ポリエチレング
リコールのようなポリマーの化合物への共有結合、金属イオンとの錯化、又はポ
リ乳酸、ポリグリコール酸、ハイドロゲルなど、又はリポソームのようなポリマ
ー性化合物の粒状調製物中又は上への化合物の取り込み、リポソーム、ミクロエ
マルジョン、ミセル、単層又は複層のベジクル、赤血球のゴースト、又はスフェ
ロプラスト上への化合物の取り込みを含む。このような組成物は、化合物又は組
成物の物理的状態、溶解性、安定性、インビボ放出速度、インビボクリアランス
の速度に影響を与えるだろう。
【００６３】 制御された又は持続した放出組成物には、脂溶性デポ剤中の調合剤（例えば、
脂肪酸、ワックス、オイル）を含む。本発明には、ポリマーに被覆された粒状組
成物（例えば、ポロキサマー又はポロキサミン）、及び組織特異的な受容体に対
して誘導された抗体、リガンド、若しくは抗原に結合された、又は組織特異的な
受容体のリガンドに結合された化合物も含まれる。本発明の組成物の他の態様は
、粒状形態保護コーティング、プロテアーゼ阻害剤、又は非経口、肺、鼻、及び
口を含む様々な投与経路に対する浸透増強剤を取り込む。
【００６４】 投与されると、化合物は、多くの場合、循環中から急速に除去され、それ故、
相対的に短い薬理学的活性を誘導し得る。従って、治療的な有効性を維持するた
めに相対的に大量の生物活性化合物をしばしば投与することが必要とされ得る。
ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコール
の共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコー
ル、ポリビニルピロリドン、又はポリプロリンのような水溶性ポリマーの共有結
合によって修飾された化合物は、対応する未修飾の化合物に比べて、静脈内投与
後に、血中で実質的により長い半減期を示すことが知られている（Ａｂｕｃｈｏ
ｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８１； Ｎｅｗｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．， １９
８２； ａｎｄ Ｋａｔｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９８７）。このような修飾は
、水溶液中での化合物の溶解度を増加させ、凝集をなくし、化合物の物理的及び
化学的安定性を増大させ、化合物の免疫原性及び反応性を大幅に減らし得る。そ
の結果、所望のインビボ生物活性は、未修飾化合物よりも少ない頻度で、又は少
ない用量で、このようなポリマー化合物の付加物（ａｄｄｕｃｔ）を投与するこ
とによって達成され得る。
【００６５】 ＰＥＧは、哺乳動物中で極めて低い毒性を有するので、ポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）の化合物への付着は特に有用である（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ
ａｌ．， １９７１）。例えば、アデノシンデアミナーゼのＰＥＧ付加物は、米
国で、重症複合免疫不全症候群を治療するためにヒトに使用することが承認され
ている。ＰＥＧの抱合によって得られる第二の利点は、異種化合物の免疫原性と
抗原性を効果的に減少させることである。例えば、ヒトタンパク質のＰＥＧ付加
物は、激しい免疫応答を引き起こすリスクなしに他の哺乳動物種の疾病を治療す
るのに使用できるであろう。
【００６６】 担体は、化合物に対する、又は該化合物を産生し得る細胞に対する宿主免疫応
答を減少又は防ぐために、ミクロカプセル化デバイスを含む。本発明の化合物は
、リポソームのような膜にミクロカプセル化して搬送してもよい。
【００６７】 ＰＥＧのようなポリマーは、アミノ末端のアミノ酸のαアミノ基、リシン側鎖
のεアミノ基、システイン側鎖のスルフヒドリル基、アスパラギン酸及びグルタ
ミン酸側鎖のカルボキシル基、カルボキシ末端のアミノ酸のαカルボキシル基、
チロシン側鎖のようなタンパク質中の一以上の反応性アミノ酸残基に、又はある
種のアスパラギン、セリン，又はトレオニン残基に付着した糖鎖の活性化された
誘導体に都合よく付着され得る。
【００６８】 タンパクとの直接的な反応に適した多数の活性化された形態のＰＥＧが記載さ
れてきた。タンパク質のアミノ基との反応のための有用なＰＥＧ試薬には、カル
ボン酸又はカルボネート誘導体の活性エステル、特に、脱離基が、Ｎ−ヒドロキ
シスイシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、イミダゾール、又は１−ヒドロキシ
ー２−ニトロベンゼン−４−スルホネートであるものが含まれる。マレイミド又
はハロアセチル基を含むＰＥＧ誘導体は、タンパク質の遊離スルフヒドリル基を
修飾するための有用な試薬である。同様に、アミノヒドラジン又はヒドラジド基
を含むＰＥＧ試薬は、タンパク質中の炭水化物基の過ヨウソ酸酸化によって生じ
たアルデヒドとの反応に有用である。
【００６９】 本発明は、以下に列記されたＢＣＮＧタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む
核酸を提供する。
【００７０】 プラスミド名 受付番号 寄託日 ｍＢＣＮＧ−１ ２０９７８１ １９９８年４月２１日 ｍＢＣＮＧ−２ａ ２０９８２５ １９９８年５月１日 ｍＢＣＮＧ−２ｂ ２０９８２６ １９９８年５月１日 ｍＢＣＮＧ−３ａ ２０９８２４ １９９８年５月１日 ｍＢＣＮＧ−３ｂ ２０９８２８ １９９８年５月１日 ｈＢＣＮＧ−１ ２０９８２７ １９９８年５月１日 ｈＢＣＮＧ−２ ２０９８２９ １９９８年５月１日 本発明によって提供される上記プラスミドは、特許手続上の微生物の寄託の国
際的承認に関するブダペスト条約の規定の下で、アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１ブルーバード大学、マナサス、ＶＡ
２０１０８−０９７１、アメリカに寄託された。患者の疾病又は症状の治療 本発明の化合物と組成物は、ペースメーカー機能に関連する疾病又は症状を治
療するために患者に投与し得る。該化合物と組成物は、ＢＣＮＧタンパク質又は
ＢＣＮＧ関連タンパク質、及びこれ又はその一部をコードする核酸のみならず、
本発明のスクリーニング法によって同定された化合物も含む。例えば、本発明で
有用な化合物は、ペプチド、小分子（有機又は無機）、ペプチド模倣物、又は上
述したその他の化合物であり得る。
【００７１】 例えば、本発明の化合物及び組成物は、記憶欠損又は疾患を治療するのに有用
であり得る。このような記憶疾患又は欠損は、脳及び中枢神経系の細胞の異常な
ペースメーキング機能を含み得る。記憶疾患又は欠損は、アルツハイマー病、パ
ーキンソン病、又は加齢に関連した記憶喪失によるものであり得る。
【００７２】 本発明は、患者の感覚疾患を治療するための方法であって、本発明の化合物又
は組成物を前記患者に投与することを備えた方法を提供する。このような感覚疾
患には、目（盲目、視力の喪失）、鼻（嗅覚の喪失）、触覚（無感覚）、及び味
覚（味覚能力の欠如）の感覚疾患が含まれる。
【００７３】 別の例では、本発明は、聴力疾患に罹患した患者を治療するための方法であっ
て、本発明の化合物又は組成物の量を投与することを含む方法を提供する。ＢＣ
ＮＧアイソフォームが、かなりの量で聴覚システムの組織中に発現されているこ
とが以下で示されている。これらの聴覚組織及び細胞中のＢＣＮＧ遺伝子の制御
によって、聴覚システムの細胞の応答特性を変化させることが可能であり得る。
このように、（例えば、局所化されたウイルスベクター、又はリポソーム担持タ
ンパク質を介して）核酸又はタンパク質を患者に投与すれば、このような聴覚疾
患が治療されるであろう。聴覚疾患は、聾唖、又は聴力の喪失であり得る。
【００７４】 別の態様では、本発明は、呼吸を制御するＣＮＳ（中枢神経系）領域の欠陥、
又は肺の欠陥の何れかによる呼吸疾患に罹患した患者を治療するための方法であ
って、ある量の本発明の化合物又は組成物を患者に投与することを備えた方法を
提供する。好ましくは、該化合物は、ＢＣＮＧアイソフォーム、ＢＣＮＧアイソ
フォームと相互作用する、肺組織及び／又は脳の核に通常発現されている呼吸制
御に重要な化合物（例えば、小分子）を含む。呼吸疾患は、乳児突然死症候群、
又は規則的な呼吸における任意の困難（例えば、息の短さ）であり得る。呼吸疾
患は、喘息であり得る。
【００７５】 本発明は、患者の失読症を治療するための方法であって、患者の失読症を治療
するのに有効な量の本発明の化合物又は組成物を患者に投与することを備えた方
法を提供する。本発明は、注意欠陥障害又は学習障害を治療するための方法も提
供する。学習に関連した障害は、視床に存在するイオンチャネルの異常な作用（
増加又は減少の何れか）から生じ得る。脳の該領域は、不眠、注意、及び覚醒に
関与すると考えられる。このような機能の異常な状態を含む疾患は、本発明の化
合物及び薬学的組成物を用いて治療し得る。本発明は、患者の薬物中毒の症状を
治療する方法であって、本発明の組成物を患者に投与することにより、患者のイ
オンチャネル機能を調節し、患者の薬物中毒の症状を治療することを備えた方法
を提供する。
【００７６】 本発明は、異常な分泌又は分泌の欠如に罹患した患者において、通常は分泌を
もたらす細胞の分泌を制御する方法であって、前記細胞の分泌を制御するために
治療的有効量の本発明の化合物又は組成物を患者に投与することを備えた方法を
提供する。前記化合物又は組成物は、細胞が分泌をもたらしたときに制御するた
めに、細胞の休止期又は分泌期に制御し得る。前記細胞は、膵臓細胞、肝細胞、
又は脾臓細胞であり得る。
【００７７】 本発明は、非ペースメーキング細胞でのリバウンド興奮（ｅｘｃｉｔａｔｉｏ
ｎ）を制御するための方法を提供する。
【００７８】 ＢＣＮＧタンパク質は、痛み及び痛覚過敏の調節に有効である薬物のスクリー
ニングの有用な標的である。発現されたＢＣＮＧ−１タンパク質の特性に類似し
た特性を有するペースメーカータイプチャネルは、一次求心性感覚ニューロン中
に同定されており、該チャネルは、プロスタグランジンＥ２、炎症中に放出され
る痛覚過敏誘導物質によって活性化される（Ｉｎｇｒａｍ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉ
ａｍｓ、１９９６）。該チャネルは、痛みの知覚と痛い刺激に対する過敏症にお
いて役割を果たすことが提案されてきた。本発明は、患者の痛みを治療する方法
であて、患者にある量の本発明の組成物を投与することを備えた方法を提供する
。
【００７９】 ＢＣＮＧ−２を含む心室筋に発現されたＢＣＮＧチャネルのアイソフォームは
、これらの中の異常なペースメーカーによる室及び／又は心房の不整脈を治療す
るのに有効である薬物のスクリーニングの有用な標的である。異常な活性化特性
を有するペースメーカーチャネルは、心不全時における、室を含む心臓の非ペー
スメーキング領域に検出される（Ｃｅｒｂａｉ ｅｔ ａｌ．、１９９４，１９ ９７）。
【００８０】 洞房結節中に発現されたＢＣＮＧ遺伝子のアイソフォームは、家族性洞房結節
病のような心臓ペースメーカー機能の遺伝病の有用な遺伝学的スクリーニングを
提供することができる。ある種の家族性、遺伝性心臓病には、洞房結節中のペー
スメーカーチャネル機能の欠陥が関与していると考えられている。
【００８１】 心臓に発現されたＢＣＮＧアイソフォームは、虚血のエピソードの間に、心筋
の損傷を制限することができる改良された薬物をスクリーニングするのに有用で
あろう。化合物ＺＤ７２８８によるペースメーカーチャネルのブロックは、心筋
の虚血中に梗塞のサイズを小さくすることが示されている（Ｓｃｈｌａｃｋ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９８）。
【００８２】 ＢＣＮＧ−１チャネルのアイソフォームは、インシュリンの放出を刺激し、又
は阻害する化合物を含む膵臓機能を変化させる薬物のスクリーニングとして有用
であろう。ヒトＢＣＮＧ−１タンパク質は、膵臓で発現されていることが実証さ
れた（Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
【００８３】 ＢＣＮＧチャネルのアイソフォームは、腎臓及び肝臓の機能を変化させる薬物
をスクリーニングするのに有用であろう。ＢＣＮＧアイソフォームは、それらが
、ホルモンの放出及びイオンの輸送機能に寄与し得るこれらの組織中で発現され
る。ペースメーカーチャネル伝導度と類似した、環状ヌクレオチド（ｃＧＭＰ）
によって刺激された１ｐＳのチャネルの活性は、腎臓の上皮細胞に報告された（
Ｍａｒｕｎａｄａ ｅｔ ａｌ．１９９１）。肝細胞は、細胞の代謝にカップル
された陽イオン透過性チャネルを発現することが示された（Ｌｉｄｏｓｋｙ ｅ
ｔ ａｌ．１９９７）。
【００８４】 本発明は、以下の実験の詳細の部で説明される。これらの部は、本発明の理解
を助けるために記されたものであり、その後の請求の範囲に記載された本発明を
如何なる意味においても限定するものではなく、またそのように解してはならな
い。 実験の詳細 例１：Ｎ−ｓｒｃのＳＨ３ドメインでの相互反応性クローニングは、環状ヌク
レオチドーゲーテッドチャンネルに対する相同性を持つ新しい脳−特異的イオン
チャンネル蛋白質を同定する。
【００８５】 Ｓｒｃチロシンキナーゼのニューロン形態と相互作用する分子につきスクリー
ニングすることによってイオンチャンネルの新しいクラスを表すように見える新
規なｃＤＮＡが単離された。コードされたポリペプチドｍＢＣＮＧ−１は、環状
ヌクレオチドーゲーテッドチャンネルおよび電圧−ゲーテッドチャンネル、Ｅａ
ｇおよびＨ−ｅｒｇのファミリーにおける蛋白質に遠く関連する。ｍＢＣＮＧ−
１はほぼ１３２ｋＤのグリコシル化蛋白質として専ら脳で発現される。免疫組織
化学分析は、ｍＢＣＮＧ−１が、特に錐体ニューロンかご細胞中にて、新皮質、
海馬および小脳におけるニューロンの特異的サブセットで優先的に発現される。
個々のニューロン内では、該ｍＢＣＮＧ−１蛋白質は、細胞型に応じて、樹状突
起または軸索末端いずれかに局在する。
【００８６】 サザーンブロット分析は、いくつかの他のＢＣＮＧ−関連配列がマウスゲノム
に存在することを示し、これはイオンチャンネルコーディング遺伝子の全く新し
いサブファミリーの出現を示す。これらの知見は、脳で膜興奮を潜在的に変調す
ることができ、環状ヌクレオチドによる調節に応答することができる、新規クラ
スのイオンチャンネルの存在を示唆する。
【００８７】 脳におけるシナプス強度の制御に寄与するシグナル変換経路を規定することは
、重要かつ長い間求められていた目標である。中枢神経系においてＳｒｃ−ファ
ミリーのチロシンキナーゼの生化学的標的を同定する努力において、酵母２−ハ
イブリッド系を用いて、Ｓｒｃキナーゼの神経特異的形態のＳＨ３ドメインと相
互作用できる蛋白質をクローンした（Ｂｒｕｇｇｅら、１９８５；Ｍａｒｔｉｎ
ｅｚら、１９８７）。新しい蛋白質のこのスクリーニングの結果、ｍＢＣＮＧ−
１（マウス脳環状ヌクレオチドーゲーテッド−１）が同定され、単離された。
【００８８】 ｍＢＣＮＧ−１はイオンチャンネル蛋白質として同定され、特徴付けられてお
り、電圧−ゲーテッドカリウムチャンネル、ＣＮＧチャンネルおよび植物の内に
向かう整流器に対する配列相同性を呈する。サザーンブロット分析は、これが蛋
白質の新しいファミリーの最初のメンバーであることを示唆する。ｍＢＣＮＧ−
１は専ら脳で発現され、新皮質、小脳皮質および海馬中のニューロンのサブセッ
トの突起に優先的に局在する。ｍＢＣＮＧ−１の特異的局所化パターンおよび環
状ヌクレオチドとの直接的相互作用の可能性は、それが、細胞間および細胞内シ
グナリングの発現において重要な成分である新しい脳−特異的イオンチャンネル
蛋白質を表し得ることを示唆する。
【００８９】 結果 ｍＢＣＮＧ−１の単離 ｍＢＣＮＧ−１、ＣＮＧ−関連およびＥａｇ−関連イオンチャンネルに対する
相同性を持つ新規ｃＤＮＡは、酵母２−ハイブリッドスクリーニングにおけるＮ
−ｓｒｃ ＳＨ３ドメインでの相互作用性クローニングによってまず単離され、
同定された。該ｓｒｃ遺伝子は交互にスプライスされた形態（Ｎ−ｓｒｃまたは
ｂｐ６０ｓｒｃ−ｃ（＋））を発現し、これはニューロン細胞に特異的であり、
増大したキナーゼ活性を有する（Ｂｒｕｇｇｅら、１９８５）。Ｎ−ｓｒｃ蛋白
質は当該蛋白質のＳｒｃ相同性３（ＳＨ３）ドメインに対応する領域への６個の
アミノ酸の挿入によって非ニューロン形態（Ｃ−ｓｒｃまたはｐｐ６０ｓｒｃ− ｃ とは異なる（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、１９８７）。ＳＨ３ドメインは蛋白質間相
互作用のためのモジュールと考えられる（Ｐａｗｓｏｎら、１９９５）。従って
、酵母２−ハイブリッドスクリーニング（Ｆｉｔｌｄｓら、１９８９；Ｚｅｒｖ
ｏｓら、１９９３）を用いて、Ｎ−ｓｒｃ ＳＨ３ドメインと選択的に相互作用
するであろう脳特異的蛋白質を同定した。
【００９０】 Ｎ−ｓｒｃ ＳＨ３餌（ｂａｉｔ）での５×１０５独立クローンのスクリーニ
ングの結果、融合生成物（ｐＪＧ−ｄ５）と陽性反応するシグナルが単離された
。このクローンはＮ−ｓｒｃ ＳＨ３ドメインとの強力な相互作用を示したが、
ｃ−ｓｒｃ，ｆｙｎまたはａｂｌ ＳＨ３ドメインとの有意な相互作用を示さな
い蛋白質をコードし、これは、酵母２−ハイブリッド系におけるＮ−ｓｒｃ Ｓ
Ｈ３ドメインの特異的認識を示す。ｐＪＧ−ｄ５の配列分析は、それがより大き
な蛋白質のＣ−末端部分をコードすることを示した。従って、重複するｃＤＮＡ
クローンをλｇｔ１０ライブラリーから単離し、オープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）が同定され、これは１０４ｋＤａの予測される分子量を持つ９１０個
のアミノ酸ポリペプチドをコードした（図１Ａ）。ｐＪＧ−ｄ５インサートはそ
のＣ−末端アミノ酸４０４−９１０に対応する。
【００９１】 予測された蛋白質のＮ−末端部分は、７つの疎水性ドメインを含む疎水性コア
を含有する（図１Ｂ）。これらのドメインは６つの膜貫通ドメイン（Ｓ１−Ｓ６
）および電圧活性化Ｋ＋チャンネルのポア領域（Ｐ）に対する有意な相同性を示
す（図１Ｃ）。疎水性コアに加えて、当該蛋白質のＣ−末端の半分には推定環状
ヌクレオチド結合部位（ＣＮＢ）がある（アミノ酸４７２−６０２、図１Ａおよ
び図１Ｄ）。この環状ヌクレオチ結合部位は、環状−ヌクレオチドーゲーテッド
チャンネル中の対応する領域に最も密接に関連する（３０％同様性）。細菌異化
産物遺伝子アクチベーター蛋白質（ＣＡＰ）における結合した環状ヌクレオチド
の近くに存在するアミノ酸はＮ−ｓｒｃ相互作用蛋白質で保存されており、これ
はＣＮＢが機能的であることを示唆する（Ｗｅｂｅｒら、１９８９）。これらの
特徴に基づいて、新しく同定された蛋白質はｍＢＣＮＧ−１（マウス脳環状ヌク
レオチドーゲーテッドー１）と命名された。
【００９２】 すべての周知のＫ＋チャンネルスーパーファミリー遺伝子の中で、ｍＢＣＮＧ
−１のコア領域はマウスＥａｇ蛋白質中の対応する領域に対して最高のアミノ酸
同様性を呈するが、環状ヌクレオチドーゲーテッドチャンネルに対する配列同様
性はこの領域では１７％に過ぎない（距離はＤＮＡＳＴＡＲのＭｅｇＡｌｉｇｎ
プログラムによって決定された）。ｍＢＣＮＧ−１のＳ４ドメインは合計して８
個の正に荷電した残基（セリンによって分離された、４つの２グループ）を有し
、これは、再度、環状ヌクレオチドーゲーテッドチャンネルに対するよりも電圧
活性化Ｋ＋チャンネルに似たものとする（Ｓｈおよびｅａｇファミリー）。
【００９３】 また、ｍＢＣＮＧ−１蛋白質の推定ポア形成領域（図１Ｃ）は、Ｓｈａｋｅｒ
およびＥａｇ−関連チャンネルにおける対応する領域に最も密接に関連する（い
ずれの場合においても３０％配列同様性）。しかしながら、それは、電圧活性化
Ｋ＋チャンネルで高度に保存された２つの位置において有意な置換を含有する：
ＧＹＧトリプレットに続くアスパルテート残基はアラニン（位置３５２）で置き
換えられ、その位置から−８におけるセリン／トレオニン残基はヒスチジン（位
置３４４）で置き換えられている。同様の置換が網膜ＣＮＧ−チャンネルのβー
サブユニットで見い出され、ここに、該アスパルテートに対応する位置はロイシ
ンによって占められ、リシンはその位置から−８において見い出される（Ｃｈｅ
ｎら、１９９３）。これは、該ｍＢＣＮＧ−１蛋白質がそれ自体で電流を通すこ
とができないが、第二の未だ同定されていないポリペプチドと組み合わされて作
用して、機能的ヘテロマルチマーイオンチャンネルを形成できることを示唆する
。
【００９４】 ｍＢＣＮＧ−１は１３２ｋＤａ糖蛋白質である。
【００９５】 ｍＢＣＮＧ−１ ｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ受託番号２０９７８１）（配列番号：１
）によってコードされた蛋白質を特徴付けるために、予測される細胞質テイル：
アミノ酸５９４−７２０（融合蛋白質ＧＳＴ−ｑ１；抗血清αｑ１）およびアミ
ノ酸７７７−９１０（融合蛋白質ＧＳＴ−ｑ２；抗血清αｑ２）における２つの
別々のドメインに対して抗体を生じさせた。両抗血清は、クローン化ｍＢＣＮＧ
−１配列のイン・ビトロ翻訳産物を特異的に免疫沈降させた。
【００９６】 マウス脳抽出物のウェスタンブロットにおいてαｑ１およびαｑ２抗血清は共
に１３２ｋＤａの見掛け分子量を持つ散漫なバンドを認識した（図２Ａ）。両抗
原性ドメインを一体化させたＧＳＴ−融合蛋白質（ＧＳＴ−ｄ５、アミノ酸４０
４−９１０）での抗血清の予備吸着による標識の完全な撤去は、それが天然ｍＢ
ＣＮＧ−１サブユニットを現すことを示す。ウェスタンブロッティングに先立っ
ての脳抽出物のＮ−グリコシダーゼＦでの処理の結果、今や、イン・ビトロ翻訳
されたＢＣＮＧ−１産物と共に移動する、観察されたバンドの分子量が実質的低
下した）（図２Ｂ）。
【００９７】 配列分析は、３つのＮ−グリコシル化コンセンサス部位がｍＢＣＮＧ−１蛋白
質に存在することを示す。これらのうち、Ａｓｎ３２７は原形質膜の細胞外部位
の膜貫通ドメインＳ５およびポア（Ｐ）の間に存在すると予測される（図１Ａお
よび図１Ｂ）。この部位は、ウシ桿状光受容体からのｃＧＭＰ−ゲーテッドチャ
ンネルのＡｓｎ３２７に対応し、ここにそれはグリコシル化の唯一の部位である
ことが示されている（Ｗｏｈｌｆａｒｔら、１９９２）。考え合わせると、これ
らのデータは、クローン化ｃＤＮＡ配列がｍＢＣＮＧ−１遺伝子の全長産物をコ
ードし、ｍＢＣＮＧ−１がＮ−結合糖蛋白質であることを示唆する。
【００９８】 ｍＢＣＮＧ−１はニューロンで発現される。
【００９９】 ノーザンブロット分析は脳からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡにおける複数ｍＢＣＮＧ
−１転写体の存在を明らかにし、最も豊富な種は３．４、４．４、５．８、およ
び８．２ｋｂ長である（図３）。該３．４ｋｂ転写体はサイズがクローン化ｃＤ
ＮＡに対応する。心臓、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓または精巣で発現は検出
されなかった。ｍＢＣＮＧ−１蛋白質の特異的発現はウェスタンブロット分析に
よって確認された。
【０１００】 脳内でのｍＢＣＮＧ−１の細胞局所化は、イン・サイチュハイブリダイゼーシ
ョン（図４）によって、および免疫組織化学染色（図５Ａ−５Ｆ）によって調べ
た。両方の場合において、最高レベルのｍＢＣＮＧ−１発現が脳皮質、海馬およ
び小脳で検出された。
【０１０１】 脳皮質において、イン・サイチュハイブリダイゼーションは、新皮質に沿った
連続的な線に分布したｍＢＣＮＧ−１ ｍＲＮＡ層Ｖ錐体ニューロン細胞体の強
力な発現を示す（図４）。免疫組織化学分析はこれらの細胞内のｍＢＣＮＧ−１
蛋白質の厳格な細胞下局所化を明らかにする。先端樹状突起の染色（図５Ａ）は
これらの繊維の末端分岐まで伸び、層Ｉで特に強く、これは錐体ニューロンの末
端樹状突起叢を含有する（図５Ｂ）。
【０１０２】 同様の発現パターンが海馬で認識できた。ここに、該イン・サイチュハイブリ
ダイゼーションは領域ＣＡ１およびＣＡ３の錐体細胞体層における強力なｍＢＣ
ＮＧ−１ ｍＲＮＡ発現を示す（図４）。領域ＣＡ３における標識は領域ＣＡ１
における標識よりもいくぶん顕著ではない。蛋白質レベルにおいて、最も強いｍ
ＲＮＡ免疫染色は、層ｌａｃｕｎｏｓｕｍ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅに対応する層
において海馬溝に沿って観察される（図５Ｃ）。この層は領域ＣＡ１における錐
体ニューロンの先端樹状突起の末端分岐を含有する（Ｒａｉｓｍａｎ、１９６５
）。さらに、領域ＣＡ１およびＣＡ３の層ｐｉｒａｍａｄａｌｅ内でｍＢＣＮＧ
−１免疫反応性が検出され：しかしながら、染色は錐体細胞体には存在せず、む
しろそれを囲む繊維に存在する（図５Ｄ）。これらの繊維は錐体ニューロンに会
合したかご細胞叢を現すようである。
【０１０３】 また、小脳における免疫染色はかご細胞発現に特徴的なパターンを示す。小脳
皮質において、かご細胞は終末分岐に活気を与え、「ｐｉｎｃｅａｕ」として知
られている区別される構造中のピルキニエ細胞軸索の初期セグメントに接触する
（Ｐａｌａｙら、１９７４）。図５Ｅおよび図５Ｆに示されるように、これらの
構造はαｑ１およびαｑ２抗血清によって強く標識され、他方、染色はプルキニ
エ細胞体を排除する。かくして、かご細胞においてｍＢＣＮＧ−１蛋白質は軸索
に選択的に局所化されるようであり、神経末端で特に豊富である。いくつかの脳
幹核の強い標識がイン・サイチュハイブリダイゼーションによって観察され（図
４）、免疫反応性の領域が嗅球を含めた他の脳領域で観察された。
【０１０４】 ｍＢＣＮＧ−１はＫ＋チャンネル遺伝子の新しいサブファミリーを規定する。
【０１０５】 これまでに特徴付けられているイオンチャンネル配列のほとんどは進化に関係
するマルチジーンファミリーのメンバーである。ｍＢＣＮＧ−１に関連するより
多くの配列が存在するか否かを調べるために、マウスゲノムＤＮＡサザーンブロ
ットを種々のストリンジェンシー条件下で分析した（図６）。
【０１０６】 プローブ（Ｂ１−Ｔ）は、膜貫通ドメインＳ５、ＰおよびＳ６を含めたｍＢＣ
ＮＧ−１の疎水性コア領域で設定され；当該蛋白質のＣ−末端部分における反復
領域を排除した。Ｂ１−Ｔプローブの融点した８℃（図６Ａ）融点から３３℃下
（図６Ｂ）のハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを低下させた結
果、ブロットの各レーンで多数の追加のハイブリダイゼーションシグナルが検出
された。Ｋ＋チャンネルスーパーファミリーにおける周知の配列はいずれもこれ
らの条件下でハイブリダイズするｍＢＣＮＧ−１に対する十分な相同性を有しな
い。これは、ｍＢＣＮＧ−１が非常に大きな群の関連遺伝子の最初の周知のメン
バーであることを示唆し、これは電圧−ゲーテッドＫ＋チャンネルスーパーファ
ミリーにおける新しい分岐を現す。
【０１０７】 考察 電圧−ゲーテッドカリウム（ＶＧＫ）チャンネルは関連遺伝子の大きくて依然
として拡大しつつあるスーパーファミリーを構成する（Ｓｔｒｏｎｇら、１９９
３：ＷａｒｍｅｋおよびＧｏｎｅｔｚｋｙ、１９９４）。ＶＧＫファミリーにお
ける新しい遺伝子をクローンニングするための最も広く使用された戦略は、少数
の最初のメンバー（ショウジョウバエからのＳｈ、ｅａｇおよびｓｌｏ）（Ｐａ
ｐａｚｉａｎら、１９８７；Ｋａｍｂら、１９８７；Ｗａｒｍｋｅら、１９９１
；Ａｔｋｉｎｓｏら、１９９１）、ウシ網膜からのｃＧＭＰ−チャンネル（Ｋａ
ｕｐｐら、１９８９））に対する相同性によってなされてきた。あいにくと、こ
のアプローチはより発散した配列を同定するのには十分に適していない。アフリ
カツメガエル卵母細胞における発現クローニングはこの問題を回避できるが、こ
れはチャンネルの予め存在するかまたは容易に検出できる生理学的特徴を意味す
る。
【０１０８】 標的蛋白質の構造または活性の先験的知識を要しない別のクローニング戦略は
蛋白質間相互作用によってＫ＋チャンネルにつきスクリーニングすることである
。Ｎ−ｓｒｃのＳＨ３ドメインを餌として用い、Ｋ＋チャンネルスーパーファミ
リーの新しい分岐を構成するように見える蛋白質ｍＢＣＮＧ−１を得た。ｍＢＣ
ＮＧ−１は、電圧−ゲーテッド＋チャンネルのモチーフを呈する（６つの膜貫通
スパンニングドメイン、高度に塩基性のＳ４およびＰ領域）（Ｓｔｒｏｎｇら、
１９９３、Ｗａｒｍｋｅら、１９９４および図１Ａ−１Ｄ）。６つの膜貫通ドメ
インおよびポアー様領域（Ｗａｒｍｋｅら、１９９４）の存在によって否定され
る、電圧活性化Ｋ＋チャンネルスーパーファミリーメンバーに対するその同様性
にかかわらず、ｍＢＣＮＧ−１は他の周知の配列のすべてからのかなりの発散を
示す。ｍＢＣＮＧ−１の環状ヌクレオチド結合部位はＣＮＧチャンネルに存在す
る部位と非常に似ているが（３０％）、Ｓ４および従前のものはＳｈａｋｅｒお
よびＥａｇにおける対応する領域に非常に密接に関連する。総じて、疎水性コア
領域における最高の同様性はマウスＥａｇ蛋白質に対するものである（２２％）
。かくして、ｍＢＣＮＧ−１はＫ＋チャンネルスーパーファミリーの新しい分岐
を構成するようである。
【０１０９】 Ｋ＋および先祖環状ヌクレオチド結合部位の間の融合は、植物および動物の間
の進化的分離に先だって起こったようである（Ｗａｒｍｋｅら、１９９４）。こ
の共通の先祖からの発散は、一方において、Ｅａｇ−関連チャンネルおよび植物
の内向き整流器（これは、元のＣＮＢ配列からの進行する片寄りを示しつつ、電
圧活性化Ｋ＋チャンネルの特徴のより多くを維持した）および、他方において、
ＣＮＧ−チャンネル（これは、環状ヌクレオチド結合部位に対してより進化した
拘束を示し、他方、それは電圧活性化およびＫ＋選択性を喪失した）に至ったで
あろう。ｍＢＣＮＧ−１の特徴は、それが、電圧−ゲーテッドＫ＋チャンネルお
よび環状ヌクレオチドーゲーテッドチャンネルの間の進化的リンクを現す先祖分
子に近いままであったであろう。
【０１１０】 嗅覚および網膜ＣＮＧ−チャンネルについての出現するパターンおよびｍＢＣ
ＮＧ−１の推定ポア形成領域の非コンセンサス配列は、アフリカツメガエル卵母
細胞でのｍＢＣＮＧ−１発現に続いての検出可能な電流の欠如がヘテロマルチマ
ーチャンネルのβサブユニットを表すｍＢＣＮＧ−１によるものであることを示
唆する（Ｃｈｅｎら、１９９３；Ｌｉｍａｎら、１９９４；Ｂｒａｄｌｅｙら、
１９９４）。事実、該データはマウスゲノムにおける多数のＢＣＮＧ−関連配列
の存在を示し、１以上のこれらの遺伝子が、活性チャンネルの形成に必要なさら
なるサブユニットをコードし得たことを示す。
【０１１１】 ｍＢＣＮＧ−１蛋白質は、脳のみで、特に大脳、海馬および小脳皮質内の主要
なクラスのニューロンのうちの２つ：錐体ニューロンおよびかご細胞で発現され
る。この分布は、大脳および海馬錐体ニューロンで発現される、Ｎ−ｓｒｃとの
ｍＢＣＮＧ−１のイン・ビボ相互作用に合致するであろう（Ｓｕｇｒｕｅら、１
９９０）。ｍＢＣＮＧ−１およびＮ−ｓｒｃ ＳＨ３ドメインの間の観察される
相互作用は、その生理学的重要性およびプロリンリッチの領域の役割がそうであ
るように興味がある。最近発見されたＷＷドメイン（Ｓｕｄｏｌら、１９９６；
Ｓｔａｕｂら、１９９６）を特に考慮すると、他の因子がｍＢＣＮＧ−１のプロ
リンリッチ領域を標的とすることができる可能性も考慮されるべきである。
【０１１２】 ｍＢＣＮＧ−１の変化した細胞下局所化（錐体細胞における樹状突起およびか
ご細胞における軸索）は、ｍＢＣＮＧ−１が、おそらくは、細胞型に応じてシナ
プス前またはシナプス後膜興奮性を調節することによってニューロンの異なる集
団で異なる役割を演じ得ることを示唆する。同様の分布がＫ＋チャンネルサブユ
ニットＫｖ１．２につき示されている（Ｓｈｅｎｇら、１９９４；Ｗａｎｇら、
１９９４）。Ｋｖ１．２は、重複するが異なる発現パターンを有するいくつかの
他のＳｈａｋｅｒ型サブユニットとでヘテロマルチマーＫ＋チャンネルを形成し
、発散した機能的特徴を持つある範囲のコンダクタンスを生起させる。
【０１１３】 海馬錐体細胞の樹状突起におけるｍＢＣＮＧ−１の存在は特に興味がある；ｃ
ＡＭＰはこれらの細胞における長期シナプス増強のいくつかの形態の確立に重要
であることが示されている（Ｆｒｅｙら、１９９３、Ｂｏｌｓｈａｋｏｖら，１
９９７；Ｔｈｏｍａｓら、１９９６）。ｍＢＣＮＧ−１の構造的な特徴は、環状
ヌクレオチド結合によって直接的に変調されるＫ＋導電性活性を予測させる。興
味あることに、同様の特徴を有する電流が領域ＣＡ１の海馬錐体ニューロンで規
制されており（Ｐｅｄａｒｚａｎｉら、１９９５）、そこではｍＢＣＮＧ−１が
高度に発現される。この電流（ＩＱ）は、ｃＡＭＰレベルに応答してニューロン
興奮性を調節することによって、海馬活性のノルアドレナリン変調に寄与すると
考えられる。ｍＢＣＮＧ−１はこのタイプの電流の原因であるチャンネルの形成
に参画し得た。
【０１１４】 実験手法 ｍＢＣＮＧ−１の酵母２ハイブリッド相互作用クローニング ２−ハイブリッドスクリーニングは公表された手法に従って行った（Ｚｅｒｖ
ｏｓら、１９９３）；使用した試薬はプラスミドｐＥＧ２０２，ｐＪＧ４−５，
ｐＪＫ１０３およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＥＧ
Ｙ４８を含んだ（ＭＡＴａ ｔｒｐ１ ｕｒａ３ ｈｉｓ３ ＬＥＵ２：：ｐＬ
ｅｘＡｏｐ６−ＬＥＵ２）。
【０１１５】 該餌はプラスミドｐＥＧ２０２中のＮ−ｓｒｃのＳＨ３ドメインをサブクロー
ニングすることによって創製され、マウスＮ−ｓｒｃ配列からのアミノ酸８３−
１４７を含有する（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、１９８７）。ｃＤＮＡ融合ライブラリ
ーは、成体Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスの全脳からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用い、プ
ラスミドｐＪＧ４−５にて構築し；該ｃＤＮＡは製造業者の指示に従って、ラン
ダムヘキサマーおよびＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ ＳＵＰＥＲＳｃｒｉｐｔ ＩＩ合成
キットを用いて合成した。＞１．５ｋｂの平均ｃＤＮＡサイズを持つ２つの画分
から構築されたライブラリーのみ（合計１×１０６独立クローン）を２ハイブリ
ッドスクリーニングで用いた。０．３％ＳｅａＰｒｅｐアガロース（ＦＭＣ）中
でライブラリー増幅を行って複雑性の変化を回避した。
【０１１６】 ライブラリーのスクリーニングでは、まず、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｄｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＥＧＹ４８を餌プラスミドｐＥＧ２０２−Ｎｓｒｃおよび
レポータープラスミドｐＪＫ１０３で共形質転換した。得られた株をＨＩＳ３お
よびＵＲＡ３マーカーでの選択下で維持し、引き続いて、プラスミドｐＪＧ４−
５中のマウス脳ｃＤＮＡライブラリー形質転換した。この記載はより正確である
が、置き換えられるべきである。というのは、形質転換ミックスは、０．３％Ｓ
ｅａＰｒｅｐアガロース（ＦＭＣ）を含有するＵｒａ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−ブルコ
ース培地中で２日間増殖させたからである；次いで、細胞を収穫し、Ｕｒａ−Ｈ
ｉｓ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−−ガラクトース上で平板培養した。フィルターリフトア
ッセイ（ＢｒｅｅｄｅおよびＮａｓｍｉｔｈ，１９８５）を用い、Ｌｅｕ＋コロ
ニーをβーガラクトシダーゼ活性につきスクリーニングした。陽性反応融合産物
を単離し、独立酵母株への再形質転換による特異性につきテストした。融合産物
ｐＪＧｄ５はｍＢＣＮＧ−１のＣ−末端部分に対応する（アミノ酸４０４−９１
０；図８参照）。
【０１１７】 ｍＢＣＮＧ−１の全長クローニング ｍＢＣＮＧ−１ ｃＤＮＡの５’末端領域の単離では、ｐＪＧ−ｄ５配列に由
来するネステッドオリゴヌクレオチドを用いてｐＪＧ４−５ライブラリに対して
２ラウンドのＰＣＲを行った。最初のラウンドにおける下流プライマーは：５’
−ＡＧＡＧＧＣＡＴＡＧＴＡＧＣＣＡＣＣＡＧＴＴＴＣＣ−３’（配列番号：１
３）（ｄ５．ＲＬ，ｍＢＣＮＧ−１配列のアミノ酸４５６−４６３に対応する；
図８参照）であった。第２ラウンドにおける下流プライマーは：５’−ＣＣＧＣ
ＴＣＧＡＧＧＣＣＴＴＧＧＴＡＴＣＧＧＴＧＣＴＣＡＴＡＧ−３’（配列番号：
１４）（ｄ５．Ｎ２、ｍＢＣＮＧ−１のアミノ酸４２４−４３０および付加され
たＸｈｏＩｖに対応）であった。上流プライマーはＢ４２酸性パッチ中のＥｃｏ
ＲＩ部位の５’側に位置する、ｐＪＧ４−５ベクター配列：５’−ＧＡＡＧＣＧ
ＧＡＴＧＴＴＡＡＣＧＡＴＡＣＣＡＧＣＣ−３’（配列番号：１５）（Ｂ４２）
またはＡＤＨターミネーター中のＥｃｏＲＩ部位の３’側に位置する、５’−Ｇ
ＡＣＡＡＧＣＣＧＡＣＡＡＣＣＴＴＧＡＴＴＧＧＡＧ−３’（配列番号：１６）
（ｔｅｒ）においてデザインされた２つのオリゴヌクレオチドのいずれかであっ
た。
【０１１８】 ＰＣＲサイクリングは以下のごとくに行った：１×（２分、９４℃）；２５×
（４５秒、９４℃：３０秒、５８℃；３分、７２℃）；１×（１０分、７２℃）
。
【０１１９】 反応のこのシリーズから得られた最長増幅産物は７００ｂｐ ＤＮＡ断片であ
り、これはｍＢＣＮＧ−１配列からのアミノ酸２０４−４３０を含有した（図８
参照）。この断片をサブクローンし、再度精製し、プローブとして用いて、高ス
トリンジェンシー条件（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１
５Ｍ塩化ナトリウム／０．０１５クエン酸ナトリウム、ｐＨ７）、５×デンハル
ト（１×デンハルト＝０．０２％フィコール／０．２％ポリビニルピロリドン／
０．０２％ウシ血清アルブミン）、０．５％ＳＤＳ、１００ｍｇ／ｍｌサケ精子
ＤＮＡ中で、６５℃における一晩のハイブリダイゼーション）にて、λｇｔ１０
中のマウス脳ｃＤＮＡライブラリ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ、カタログ番号ＭＬ３００
０ａ）をスクリーニングした。洗浄：１０分、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにて
室温、続いて、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにて６５℃で３０分を２回。
【０１２０】 陽性反応クローンは、さらに、下流プライマーとしてオリゴヌクレオチドｄ５
．ＲＬ（配列番号：１３）を用いるＰＣＲによってスクリーニングした。上流プ
ライマーは２つの以下のベクターオリゴヌクレオチド：λｇｔ１０配列中のＥｃ
ｏＲＩ部位の５’側に位置する、５’−ＧＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＧＴ
ＴＡＡＧＴＣＣ−３’（配列番号：１７）（１５’．Ｎ２）、または該ＥｃｏＲ
Ｉ部位の３’側に位置する、５’−ＧＴＧＧＣＴＴＡＴＧＡＧＴＡＴＴＴＣＴＴ
ＣＣＡＧＧＧ−３’（配列番号：１８）（１３’．Ｎ２）の内のいずれかであっ
た。ＰＣＲサイクリングは前記したごとくに行った。
【０１２１】 得られた産物をサブクローンし、配列決定した。最長伸長はｍＢＣＮＧ−１配
列のアミノ酸１−４６３を含有した（図８参照）；クローンｐＪＧ−ｄ５に含有
されるインサートを含むこのインサートの重複領域（アミノ酸４０５−４６３）
はＢｇｌ ＩＩ部位を含み、これを用いて、発現実験のためにプラスミドｐＳＤ
６４ＴＦ中のｍＢＣＮＧ−１ ｃＤＮＡの５’および３’断片を接合させた。
【０１２２】 インビトロ・転写（ＭＥＳＳＡＧＥ ＭＡＣＨＩＮＥ，Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓ
ｔｉｎ，ＴＸ）および翻訳イン・ビトロＥｘｐｒｅｓｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
。
【０１２３】 ノーザン／サザーンブロットハイブリダイゼーション 示されたアミノ酸６−１３１（λｇｔ１０−由来５’配列）および５９４−７
２０（ｐＪＧ−５由来３’配列）に対応するＰＣＲで生成したｃＤＮＡ断片を用
いて、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ（ＣＬＯ
ＮＴＥＣＨ，７７６２−１）をプローブした。
【０１２４】 サザーンブロットでは、記載されているごとく（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９
），ｍＢＣＮＧ−１配列のアミノ酸２７０−４６３に対応するＰＣＲで生成した
ｃＤＮＡ断片（Ｂ１−Ｔ）を用いてマウスＧｅｎｏ−Ｂｌｏｔ（ＣＬＯＮＴＥＣ
Ｈ、７６５０−１）をプローブした。ブロットを６５゜でハイブリダイズさせ（
５×標準セラインシトレート１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．０１
５Ｍクエン酸ナトリウム，水溶液中ｐＨ７緩衝液）、図面の脚注に記載したごと
くに洗浄した。洗浄条件は示した通りであった。式Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６
（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−（６７５／Ｌ）（Ｍ＝カチオン濃度であり
、Ｌは塩基対で現したプローブの長さである）に従って、Ｂ１−Ｔプローブにつ
いての融点（ＴＭ）を計算した。
【０１２５】 抗体の生産、抽出物および免疫化学およびイン・サイチュハイブリダイゼーシ
ョン グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−融合蛋白質は、プラスミド
ｐＧＥＸ−ｌｏｍｅｂｏｌｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中でｑ１（ｍＢＣＮＧ−１
蛋白質のアミノ酸５９４−７２０に対応）またはｑ２（ｍＢＣＮＧ−１蛋白質の
アミノ酸７７７−９１０に対応）（図１Ａ参照）をサブクローニングし、続いて
実質的には記載されているごとく（ＦｒａｎｇｉｏｎｉおよびＮｅｅｌ，１９９
３）誘導および精製することによって生成させた。融合蛋白質をリン酸緩衝化生
理食塩水（ＰＢＳ）で溶出させて、フロイントのアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ）
との１：１懸濁液としてウサギに注射した。抗血清を調製し、実質的には記載さ
れているごとくにテストした（Ｇｒａｎｔら、１９９５）。
【０１２６】 ウェスタンブロット分析では記載されているごとく（Ｇｒａｎｔ，１９９５）
、マウス脳抽出物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏ
ｂｉｌｏｎ−Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気ブロットした。ブロッキングおよ
び抗体インキュベーションはＴＢＳＴ（１０ｍＭトリスｐＨ７．５、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）＋２％ＢＳＡ中で行った。αｑ１およ
びαｑ２抗血清は１：１０００希釈で用いた。アルカリ性ホスフォターゼ（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ）にカップリングした２次抗−ウサギ抗体を１：５０００希釈で用い
、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中でのインキ
ュベーションによってバンドを可視化した。全脳抽出物は記載されているごとく
に調製した（Ｇｒａｎｔ，１９９５）。Ｎ−グリコシダーゼ処理では、２％ＳＤ
Ｓを抽出物に添加し、１０分間沸騰させることによって蛋白質を変性させた；反
応は５０ｍＭ ＮａＰ（ｐＨ７．２），２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％トリトン
−×１００、０．２％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌ蛋白質および２０Ｕ／ｍｌ Ｎ−グ
リコシダーゼＦ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）中、３７℃で１時間行った。
【０１２７】 免疫組織化学では、５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ／ＰＢＳ中でクエンチしたマウス脳
（４％パラフォルムアルデヒド／ＰＢＳ中で固定）の２０μｍ低温槽セクション
をブロックし（１０％ヤギ血清、０．１％ヤギ血清、ＰＢＳ中０．１％サポニン
）、次いで（ブロッキング溶液中に１：４００希釈した）αｑ１またはαｑ２抗
血清に暴露した。ＰＢＳプラス０．１％サポニン中で洗浄した後、ブロッキング
溶液中に１：２００希釈したＣｙ３−コンジュゲーテッドヤギ抗−ウサギＦ（ａ
ｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）と
共にセクションをインキュベートした。
【０１２８】 （３５Ｓ）チオ−ｓＡＴＰおよびターミナルトランスフェラーゼ（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて３１テイリングによって５×１０８ｃ
ｐｍ／μｇの特異的活性まで標識したオリゴヌクレオチドプローブを用い、実質
的に記載されているごとくに（Ｍａｙｆｏｒｄら，１９９５）イン・サイチュハ
イブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは３７℃で行った。ス
ライドを０．２×ＳＳＣ中にて６０℃で洗浄し、２週間フイルムに暴露した。
【０１２９】 例２：ＢＣＮＧ遺伝子ファミリー導入の同定 緒言 ＢＣＮＧファミリー（ｍＢＣＮＧ−１）における元の配列は、例１に記載され
た餌としてのｎ−Ｓｒｃトリプシンキナーゼと共に酵母２−ハイブリッド相互作
用クローニングを用いてマウス脳ｃＤＮＡライブラリーから単離した。この蛋白
質のＤＮＡおよびアミノ酸配列は、各々、配列番号：１および配列番号：２であ
る。 ｍＢＣＮＧ−１に相同な領域をコードする３つのさらなるマウスおよび２つの
ヒトｃＤＮＡクローン（受託番号２０９７８１）を単離した。全長ｍＢＣＮＧ−
１産物につきスクリーニングしつつ、マウス遺伝子（［ｍＢＣＮＧ−２［ＡＴＣ
Ｃ受託番号２０９８２５および２０９８２８］およびｍＢＣＮＧ−３［ＡＴＣＣ
受託番号２０９８２４および２０９８２８］）の２つを表す部分的ｃＤＮＡクロ
ーンを単離し、ならびに２つのヒト遺伝子（ｈＢＣＮＧ−１［ＡＴＣＣ受託番号
２０９８２７］およびｈＢＣＮＧ−２［ＡＴＣＣ受託番号２０９８２９］）はク
エリーとしてｍＢＣＮＧ−１の蛋白質配列（配列番号：２）を用い、ＥＳＴデー
タベース相同性サーチにより同定した。引き続いて、ライブラリースクリーニン
グまたはＲＴ−ＰＣＲスクリーニングによって、同定されたｃＤＮＡクローンの
さらなる伸長を得た。同定されたマウスおよびヒトＢＣＮＧ配列の模式図を図７
Ａ−７Ｂに表す。
【０１３０】 以下に記載する３つのさらなるマウス蛋白質は、８４−８８％の配列同様性を
有し、相互に密接に関連するが、Ｅａｇ−関連チャンネル（２２％同様性）およ
び環状フクレオチド−ゲーテッドチャンネル（１７％同様性）を含む、カリウム
チャンネルスーパーファミリーの全ての他の周知のメンバーと非常に遠い関連で
ある。
【０１３１】 ノーザンブロット分析は、これらのクローンの各々につき組織分布の個々のパ
ターンを示した（図９参照）。ｍＢＣＮＧ−１の発現は脳に制限されているよう
であるが（図９Ａ）、ｍＢＣＮＧ−２（図９Ｂ）およびｍＢＣＮＧ−３（図９Ｃ
）は脳ならびに心臓で発現される。ｍＢＣＮＧ−３についてのハイブリダイゼー
ションシグナルは骨格筋および肺からのポリＡ＋ＲＮＡでも検出される。
【０１３２】 これらのクローンの区別される配列および組織分布は、ＢＣＮＧクローンが、
心臓および脳に圧倒的に局所化する、特徴的な電圧感知よび環状ヌクレオチド結
合モチーフを持つ、イオンチャンネル蛋白質のファミリーを表すことを明らかと
する。
【０１３３】 結果 ｍＢＣＮＧ−２の最初の断片（ｍＢＣＮＧ２ａ［ＡＴＣＣ受託番号２０９８２
５］）は、ｍＢＣＮＧ−１の５’伸長を単離するために設計されたネステッドＰ
ＣＲ反応産物としてクローン化された（Ｓａｎｔｏｒｏら，１９９７）。この断
片は、２つのＰＣＲ産物の重複する領域における配列相違のためｍＢＣＮＧ−１
からの区別される遺伝子産物を表すようである。この相違はほとんど第３塩基コ
ドン置換であった。この断片を用いてマウス脳λｇｔ１０ライブラリーをスクリ
ーニングし；ｍＢＣＮＧ−１と同様であるがそれから区別される蛋白質のＮ−末
端部分を得た（クローン１１−λ１、ｍＢＣＮＧ−２ｂと命名［ＡＴＣＣ受託番
号２０９８２６］）。同一λｇｔ１０ライブラリースクリーニングから、弱く反
応するプラークも同定され、これは対応するインサート（クローン１５−７、ｍ
ＢＣＮＧ−３ａと命名［ＡＴＣＣ受託番号２０９８２４］）のサブクローニング
および配列決定に際して、ＢＣＮＧファミリーの第３の区別される遺伝子（ｍＢ
ＣＮＧ−３）を表すことが示された。配列番号：５はｍＢＣＮＧ−２ＤＮＡ配列
を表し、他方、配列番号：６はｍＢＣＮＧ−２アミノ酸配列を表す。配列番号：
９はｍＢＣＮＧ−３ＤＮＡ配列を表し、他方、配列番号：１０はｍＢＣＮＧ−３
アミノ酸配列を表す。
【０１３４】 マウスおよびヒトＥＳＴデータベースにおけるＢＬＡＳＴサーチは、２つのマ
ウスＢＣＮＧ遺伝子（Ｍ４１−ＥＳＴ、Ｍ２８−ＥＳＴ）および２つのヒトＢＣ
ＮＧ遺伝子（Ｈ５７−ＥＳＴ、Ｈ６１−ＥＡＴ）の断片であるように見える４つ
のＥＡＴクローンを明らかとした。
【０１３５】 Ｍ４１−ＥＳＴ配列は、環状ヌクレオチド結合部位を重複する、ＢＣＮＧ−様
遺伝子の３’断片を表すようであった。この配列におけるオリゴヌクレオチド（
オリゴ４１ＲＥＶ［配列番号：２４］）およびＢＣＮＧクローンの５’部分の保
存された領域におけるオリゴヌクレオチド（オリゴＢ１２３［配列番号：２３］
）を合成し、これを用いてマウスＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ産物を得た。Ｍ４１−
ＥＳＴクローンの５’末端およびｍＢＣＮＧ−２ｃＤＮＡ（クローン１１−λ１
、ｍＢＣＮＧ−２ｂと命名［ＡＴＣＣ受託番号２０９８２６］）の３’末端と重
複するＲＴ−ＰＣＲ産物セクションの配列決定は、Ｍ４１−ＥＳＴがｍＢＣＮＧ
−２の３’末端を表すことを確立した。
【０１３６】 また、Ｍ２８−ＥＳＴは、環状ヌクレオチド結合部位の３’末端領域を含めた
、ＢＣＮＧ−様遺伝子の断片を含有するようであった。Ｍ２８配列に基づく縮重
オリゴヌクレオチドはかく命名され（オリゴ２８ＲＥＶ［配列番号：２５］）、
マウスＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲ反応でＢ１２３オリゴヌクレオチド［配列番
号：２３］と一緒に使用された。得られた産物は、クローン１５−７の３’領域
との重複によって判断して、ｍＢＣＮＧ−３の延長を表すようであるが、配列決
定は、Ｍ２８−ＥＳＴクローンとの重複領域における差異を明らかとした。かく
して、Ｍ２８−ＥＳＴは、ｍＢＣＮＧ−４と命名されたさらにもう１つのＢＣＮ
Ｇ−様遺伝子を表す。配列番号：１１はｍＢＣＮＧ−４ＤＮＡ配列を表し、他方
、配列番号：１２はｍＢＣＮＧ−４アミノ酸配列を表す。Ｍ２８−ＥＳＴクロー
ンの完全な配列決定は、クローンの３’末端のみがＢＣＮＧ配列と整列すること
を明らかとし；６３２位の５’側の配列はイントロンを表すようであり、停止コ
ドンは８６９位に存在する（図１参照）。
【０１３７】 これらのＥＳＴおよびＢＣＮＧ遺伝子ファミリーの間の対応性を図７Ａ−７Ｂ
に模式的に示し、表Ｉに示す。クローンはＩＭＡＧＥコンソルティウムから得た
。クローンは以下のように使用した。
【表１】
【０１３８】 表Ｉは、（ここに命名された）普通名称、これらのＥＳＴおよびＢＣＮＧ遺伝
子間の可能な対応性、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号およびこれらのクローンにつき
Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．コンソルティウムおよびゲノムシステムによって使用され
るクローン識別番号をリストする。
【０１３９】 保存されたＢＣＮＧチャンネルファミリーの予測されるアミノ酸配列。
【０１４０】 ｍＢＣＮＧ−２（配列番号：６）、ｍＢＣＮＧ−３（配列番号：１０）および
ｍＢＣＮＧ−４（配列番号：１２）でコードされた蛋白質につき得られた推定さ
れた統合アミノ酸配列は図８Ａ−８Ｂに示され、これはｍＢＣＮＧ−１の全長配
列（配列番号：２）（Ｓａｎｔｏｒｏら，１９９７）（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番
号：ＡＦ２８７３７）に対して整列させた。同定された配列の全て（ｍＢＣＮＧ
−４を除く）は、電圧−ゲーテッドカリウムチャンネルのモチーフを含有する（
ＪａｎおよびＪａｎ，１９９７）。かくして、それらは、細胞内アミノ末端、６
つの推定膜貫通スパンニングドメイン（Ｓ１−Ｓ６）、および長細胞質カルボキ
シ末端を持つチャンネルサブユニットにつきコードするようである。他の電圧−
ゲーテッドチャンネルで電圧センサーとして働くようであるＳ４ドメインは、９
つの正に荷電した塩基性残基を含有し、いずれの他の電圧−ゲーテッドチャンネ
ルよりもそうである。加えて、３つのコドンは、Ｓ５およびＳ６膜貫通セグメン
トを連結させる高度に保存されたポア形成Ｐ領域を含有する。このＰループは電
圧−ゲーテッドＫチャンネルのＰ領域に相同であり、特に、Ｋチャンネル署名配
列トリプレットＧＹＧを含有し、これは、該クローンがＬ選択的イオンチャンネ
ルをコードするであろう（Ｈｅｇｉｎｂｏｔｈａｍら，１９９４）。
【０１４１】 ＢＣＮＧ蛋白質の長細胞質テイルは、ｃＡＭＰ−およびｃＧＭＰ−依存性蛋白
質キナーゼおよび異化産物活性化蛋白質、ＣＡＰ、細菌ｃＡＭＰ結合蛋白質（Ｓ
ｈａｂｂおよびＣｏｒｂｉｎ，１９９２）の環状ヌクレオチド（ＣＮＢ）に相同
である１２０アミノ酸のストレッチを含有する。ＢＣＮＧ環状ヌクレオチド−含
有ドメインは、視覚および嗅覚シグナル変換に関与する環状ヌクレオチド−ゲー
テッドチャンネルの結合ドメインと最も似ている（ＺａｇｏｔｔａおよびＳｉｅ
ｇｅｌｂａｍ，１９９６）。電圧−ゲーテッドチャンネルファミリーの他のメン
バーはＣＮＢ部位を含有すると報告されているが、これらの推定部位は、機能的
環状ヌクレオチド−結合蛋白質で見いだされた鍵となる保存された残基の多くを
欠く（Ｔｉｂｂｓら，１９９８）。驚くべきことに、これらの鍵となる残基はＢ
ＣＮＧチャンネルファミリーで保存され、これは、これらの結合部位が機能する
ようであることを示唆する。
【０１４２】 ある種のペースメーカーチャンネルは心臓プルキニエ繊維チャンネル（Ｃｈａ
ｎｇら，１９９１）のごときＰＫＡリン酸化によって調節することができるが、
他方、他のペースメーカーチャンネルは洞房節チャンネルのごときｃＡＭＰによ
って直接的に調節されるようである（ＤｉＦｒａｍｃｅｓｃｏおよびＴｏｒｔｏ
ｒａ，１９９１）。マウス（およびヒト）ＢＣＮＧ−１およびＢＣＮＧ−２は、
ＰＫＡリン酸のためのコンセンサス部位（図８Ｂ、矢印）内にあるその細胞質カ
ルボキシ末端においてセリン残基を含有するのは興味深い。ｍＢＣＮＧ−４はこ
の部位を含有せず、異なる組織におけるチャンネルの異なる変調特性についての
可能な説明を供する。可能なリン酸化部位についての特に驚くべきことは、それ
が、環状ヌクレオチド結合部位、リガンド結合ポケットの鍵となる部分を形成す
るＣ−ラセン内にあるということである（ＷｅｂｅｒおよびＳｔｅｉｚ，１９８
７）。杆体および嗅覚環状ヌクレオチド−ゲーテッドチャンネルについての研究
は、以前に、Ｃ−ラセンがリガンド−選択性およびリガンド−ゲーティングの効
率で重要な役割を演じることを示した（Ｇｏｕｌｄｉｎｇら，１９９４；Ｖａｒ
ｎｕｍら，１９９５）。かくして、このセリンのリン酸化は、環状ヌクレオチド
がある種のペースメーカーチャンネルのゲーティングをそれで変調する効率に影
響し得る。
【０１４３】 マウス蛋白質は相互に密接に関連し、８４−８６％の同様性を有する（図７Ｃ
）。顕著には、ｍＢＣＮＧ−２およびｍＢＣＮＧ−３は、いずれかがｍＢＣＮＧ
−１に対するよりも相互により密接に関連する（８９％同様）。限定された整列
が示し得る限り（図７の脚注参照）、ｍＢＣＮＧ−４は該群における最も遠く関
連する蛋白質であるように見える。
【０１４４】 ２つのヒトＢＣＮＧ遺伝子のクローニング Ｈ５７−ＥＳＴおよびｍＢＣＮＧ−１の間の高度な同様性は、このＥＳＴがｍ
ＢＣＮＧ−１のヒト同族体（ｈＢＣＮＧ−１と命名）の３’末端領域を表すよう
であることを示唆した。この推定に基づき、ｈＢＣＮＧ−１を増幅するためにＰ
ＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを合成した（図７参照）。１つのプライマー
はマウスＢＣＮＧクローンの５’末端における配列（オリゴＭＢ１−３［配列番
号：２６］）よりなるものであり、第２のプライマーはＨ５７−ＥＳＴにおける
配列（オリゴＨ５７．Ｃ［配列番号：２７］）に基づくものであった。（図７参
照）。ヒト脳ポリＡ＋ＲＮＡを用いて、予測された長さの単一の強力なＲＴ−Ｐ
ＣＲ産物を得た。ヒト心臓ポリＡ＋ＲＮＡからバンドは得られなかった。元のＥ
ＳＴクローンのおよびＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定の完了に際して、ｈＢＣＮＧ
−１配列の２２４７ｂｐが得られた（配列番号：３）（図７参照）。コードされ
たｈＢＣＮＧ蛋白質の予測されるアミノ酸配列（配列番号：４）を図８に示す。
顕著には、Ｓ６膜貫通セグメントを通ってＳ１から伸びる、ｈＢＣＮＧ−１蛋白
質の３０８アミノ酸長のコア領域はｍＢＣＮＧ−１に対して１００％同様である
。
【０１４５】 Ｈ６１−ＥＳＴ配列はｍＢＣＮＧ−２に対して顕著な配列同様性を示し、事実
、ｍＢＣＮＧ−２蛋白質のヒト同族体をコードし得た。従って、Ｈ６１−ＥＳＴ
クローン内の配列を用いて、ヒト脳λｇｔ１０ ｃＤＮＡライブラリーをプロー
ブした（図７参照）。Ｈ６１−ＥＳＴクローンの配列およびλｇｔ１０クローン
を組合せ、ｈｍＢＣＮＧ−２配列の１７９２ｂｐを得た（配列番号：７）（図７
参照）。コードされたｈＢＣＮＧ−２蛋白質の予測されるアミノ酸配列を配列番
号：８に示す（図８参照）。ｈＢＣＮＧ−２蛋白質の３０８アミノ酸長コア領域
はｍＢＣＮＧ−２に対して９８％同様である（図７Ｃ参照）。
【０１４６】 ＢＣＮＧ ｍＲＮＡ発現の組織分布 ノーザンブロット分析は、同定されたクローンの各々についての組織分布の個
々のパターンおよび転写体における高い対応性および相同なマウスおよびヒトク
ローンの間の局所化パターンを示す（図９および１０）。ｍＢＣＮＧ−１の発現
は脳に制限されているようであるが（図９、およびＳａｎｔｏｒｏら，１９９７
）、ｍＢＣＮＧ−２およびｍＢＣＮＧ−３は脳ならびに心臓で発現される（図９
）。ｍＢＣＮＧ−３についてのハイブリダイゼーションシグナルは、骨格筋およ
び肺からのポリＡ＋ＲＮＡでも検出される。組織分布の区別されるパターンがｍ
ＢＣＮＧ−４につき明らかにされ、これは、主として肝臓で発現されるようであ
るが、脳、肺および腎臓にも存在する（図９Ｄ）。
【０１４７】 相同なマウスおよびヒトＢＣＮＧ遺伝子は機能的に同様なようである。という
のは、それらは、ノーザンブロット分析によって明らかにされるように、非常に
同様の組織発現のパターンを呈するからである。図１０は、ｈＢＣＮＧ−１配列
内に設計されたプローブがヒト脳ポリＡ＋ＲＮＡにおいて４つの転写体を認識し
たことを示す。このパターンはｍＢＣＮＧ−１のノーザンブロットで観察された
ものと非常に似ている（図９およびＳａｎｔｏｒｏら，１９９７）。ヒト筋肉お
よび膵臓で弱いハイブリダイゼーションシグナルがｈＢＣＮＧ−１に検出される
。ｈＢＣＮＧ−２配列に基づいたプローブを用いるノーザンブロット分析は、ｍ
ＢＣＮＧ−２の発現パターンと高度に合致する発現パターンを示した（図１０；
図９と比較されたし）。豊富な３．４ｋｂ転写体が脳で検出され、同転写体は心
臓にも存在する。
【０１４８】 マウス脳内のｍＢＣＮＧ−１の分布の分析（Ｓａｎｔｏｒｏら，１９９７）は
、ｍＢＣＮＧ−１の最高の発現が皮質、海馬および小脳で起こることを明らかと
した。さらに、ｍＢＣＮＧ−１蛋白質は錐体ニューロンならびにこれらの領域内
のかご細胞の軸索末端に特異的に局所化する（例１参照）。また、異なる脳領域
内のｈＢＣＮＧ−１ ｍＲＮＡ分析のノーザンブロット分析は、遺伝子の分化的
発現を示し、最高レベルは皮質構造（海馬および扁桃；図１０）に存在する。ｈ
ＢＣＮＧ−２は全ての脳構造においてより均一レベルの高発現を示し、これは、
より普遍的な役割を示唆する。特に、脳梁−由来ＲＮＡにおける強力なハイブリ
ダイゼーションシグナルは膠細胞内でのｈＢＣＮＧ−２の発現を示し得る。
【０１４９】 実験手法 ライブラリースクリーニングおよびＲＴ−ＰＣＲクローニング 組換えＤＮＡ手法を含めたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ラムダファー
ジおよび核酸の標準的な操作は実質的に記載されているごとくに行った（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら，１９８９）。
【０１５０】 ｍＢＣＮＧ−２のクローニング ｐＪＧ４−５ライブラリーで行ったネステッドＰＣＲ反応（例１、ｍＢＣＮＧ
−１の全長クローニング参照）から、予測されるｍＢＣＮＧ−１配列と同様であ
るが同一ではない配列を有する増幅産物を単離した。かくして、それは、ｍＢＣ
ＮＧ−２と命名された、ｍＢＣＮＧ−１に密接に関連する異なる遺伝子を表すと
帰結された。同一された断片（「ｄＡ」）は、ｍＢＣＮＧ−２配列からのアミノ
酸２３４−４３０をコードした（ｍＢＣＮＧ−１によるナンバリング、図８参照
）。
【０１５１】 次に行ったのは、上流プライマーとしてのオリゴ：５’−ＴＧＧＧＡＡＧＡＧ
ＡＴＡＴＴＣＣＡＣＡＴＧＡＣＣ−３’（配列番号：１９）（７．ＳＥＱ１、ｍ
ＢＣＮＧ−１配列のアミノ酸２７０−２７７に対応；図８参照）、および下流プ
ライマーとしてのオリゴｄ５．ＲＬ（配列番号：１３）を用い、マウス脳および
心臓に由来するポリＡ＋ＲＮＡに対する一連のＲＴ−ＰＣＲ反応であった。心臓
ポリＡ＋ＲＮＡから６００ｂｐ産物が得られ、サブクローンし、配列決定し、ｍ
ＢＣＮＧ−２と同一であることが示された。ＰＣＲサイクリング：１×（２分、
９４℃）；２５×（５０秒、９４℃；４０秒、５２℃；１．５分、７２℃）；１
×（１０分、７２℃）。
【０１５２】 上流プライマーとしてのオリゴ：５’−ＴＡＣＧＡＣＣＴＧＧＣＡＡＧＴＧＣ
ＡＧＴＧＡＴＧＣＧＣ−３’（配列番号：２０）（ＡＳＥＱ２、ｍＢＣＮＧ−２
配列のアミノ酸２７８−２８６に対応、ｍＢＣＮＧ−１に従ったナンバリング；
図８参照）、および下流プライマーとしての５’−ＡＧＴＴＣＡＣＡＡＴＣＴＣ
ＣＴＣＡＣＧＣＡＧＴＧＧＣＣＣ−３’（配列番号：２１）（ＨＲＬ．２、ｍＢ
ＣＮＧ−２配列のアミノ酸４４４−４５２に対応、ｍＢＣＮＧ−１に従ったナン
バリング；図８参照）を用い、ｍＢＣＮＧ−２配列に由来するＰＣＲプローブ２
（プローブ「ｄＡ」）にて、高ストリンジェンシーにて（例１、ｍＢＣＮＧ−１
の全長クローニング参照）においてＣｌｏｎｔｅｃｈマウス脳λｇｔ１０ライブ
ラリーをスクリーニングした。
【０１５３】 下流プライマーとしてのオリゴヌクレオチド：５’−ＣＴＧＧＴＧＧＡＴＡＴ
ＡＴＣＧＧＡＴＧＡＧＣＣＧ−３’（配列番号：２２）（ＢＥ−ＡＳＥ、ｍＢＣ
ＮＧ−２配列のアミノ酸２６２−２６９に対応、ｍＢＣＮＧ−１に従ったナンバ
リング；図８参照）および上流プライマーとしての２つのラムダ由来オリゴヌク
レオチド（１５’．Ｎ２（配列番号：１７）または１３’．Ｎ２（配列番号：１
８））のいずれかを用い、陽性反応クローンをさらにＰＣＲによってスクリーニ
ングした（例、ｍＢＣＮＧ−１の全長スクリーニング参照）。より長い延長産物
を生じるクローンをサブクローンし、配列決定し、かくして、アミノ酸３０４ま
での（ｍＢＣＮＧ−１に従ったナンバリング；図８参照）ｍＢＣＮＧ−２配列の
Ｎ−末端部分が得られた。
【０１５４】 ＥＳＴ−Ｍ４１についての配列を得た後、上流プライマーとしてのオリゴヌク
レオチド：５’−ＣＡＧＴＧＧＧＡＡＧＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＣＡＴＧＡＣＣ−
３’（配列番号：２３）（Ｂ１２３、ＢＣＮＧ配列のアミノ酸２６９−２７７に
対応、ｍＢＣＮＧ−１に従ったナンバリング；図８参照）および下流プライマー
としての５’−ＧＡＴＣＡＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＴＧＴＧＣＡＧＣＡＡＧ−３’
（配列番号：２４）（４１ＲＥＶ、ｍＢＣＮＧ−２配列のアミノ酸５９０−５９
８に対応、ｍＢＣＮＧ−１に従ったナンバリング；図８参照）を用い、マウス脳
および心臓ポリＡ＋ＲＮＡ双方に対してさらなるラウンドのＲＴ−ＰＣＲを行っ
た。両ＲＮＡ調製物から予測された長さの延長産物が得られ、サブクローンし、
配列決定し、ｍＢＣＮＧ−２のλｇｔ１０由来５’断片およびＥＳＴ由来３’断
片を連結した。
【０１５５】 ＰＣＲサイクリングは以下の通りに行った：１×（２分、９４℃）；２５×（
４５秒、９４℃、３０秒、５５℃）；２×（１０分、７２℃）；１×（１０分、
７２℃）。
【０１５６】 ｍＢＣＮＧ−３のクローニング ｍＢＣＮＧ−２についてのλｇｔ１０ライブラリースクリーニング（前記参照
）から、一つの陽性反応クローンが得られ（＃１５）、これは終始弱いハイブリ
ダイゼーションシグナルを与えるように見えた。このインサートをオリゴヌクレ
オチド１５．Ｎ２（配列番号：１７）および１３．Ｎ２（配列番号：１８）で増
幅し、サブクローンし、配列決定し、ｍＢＣＮＧ−３と呼ばれる、ｍＢＣＮＧ−
１およびｍＢＣＮＧ−２双方から異なる、第３のＢＣＮＧ−関連配列を表すこと
が示された。同定された断片は、アミノ酸３１９までのｍＢＣＮＧ−３配列のＮ
−末端部分（ｍＢＣＮＧ−１に従うナンバリング；図８参照）をコードした。
【０１５７】 ＥＳＴ−Ｍ２８についても配列を得た後、上流プライマーとしてのオリゴヌク
レオチドＢ１２３、および下流プライマーとしての縮重オリゴヌクレオチド：５
’−ＣＡＣＣＫＣＲＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＡＣＧＣＴ−３’（配列：２５）
（２８ＲＥＶ、該ＢＣＮＧ配列のアミノ酸５５５４−５６１に対応、ｍＢＣＮＧ
−１に従うナンバリング；図８参照）を用い、マウス脳および心臓ポリＡ＋ＲＮ
Ａ双方に対してＲＴ−ＰＣＲを行った。予測された長さの延長産物が両ＲＮＡ調
製物から得られ、サブクローンし配列決定した。λｇｔ１０ ＃１５クローンの
既知の３’末端との重複によって判断して、両者はｍＢＣＮＧ−３の配列の延長
を表した。ＰＣＲサイクリングは：１×（２分、９４℃）；２５×（４５秒、９
４℃、３０秒、５５℃、２分、７２℃）；１×（１０分、７２℃）で行った。
【０１５８】 ｈＢＣＮＧ−１のクローニング ＥＳＴ−Ｈ５７についての配列が得られた後、上流プライマーとしてのオリゴ
ヌクレオチド：５’−ＡＴＧＴＴＣＧＧＳＡＧＣＣＡＧＡＡＧＧＣＧＧＴＧＧＡ
Ｇ−３’（配列：２６）（ＭＢ１−３，ＢＣＮＧ配列のアミノ酸１０２−１１０
に対応、ｍＢＣＮＧ−１に従うナンバリング；図８参照）、および下流プライマ
ーとしての５’−ＣＡＧＣＴＣＧＡＡＣＡＣＴＧＧＣＡＧＴＡＣＧＡＣ−３’（
配列番号：２７）（Ｈ５７．Ｃ，ｈＢＣＮＧ−１配列のアミノ酸５３７−５４４
に対応、ｍＢＣＮＧ−１に従うナンバリング；図８参照）を用い、ヒト脳ポリＡ ＋ ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。予測された長さの単一の延長産物
が得られ、サブクローンし、配列決定し、ｈＢＣＮＧ−１クローンの５’延長を
表すことが示された。
【０１５９】 ＰＣＲは以下のごとくに行った：１×（２分、９４℃）；２５×（４５秒、９
４℃、２０秒、５８℃、３分、７２℃）；１×（１０分、７２℃）。
【０１６０】 ｈＢＣＮＧ−２のクローニング ＥＳＴ−Ｈ６１についての配列が得られた後、上流プライマーとしてのオリゴ
ヌクレオチド：５’−ＡＡＣＴＴＣＡＡＣＴＧＣＣＧＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧ−３
’（配列番号：２）（Ｈ６１．Ａ，ｈＢＣＮＧ−２配列のアミノ酸４５２−４５
９に対応、ｍＢＣＮＧ−１に従うナンバリング；図８参照）、および該ＥＳＴ−
Ｈ６１ ＤＮＡについての下流プライマーとしての５’−ＧＡＡＡＡＡＧＣＣＣ
ＡＣＧＣＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧ−３’（配列番号：２９）（Ｈ６１．Ｆ，ｈＢＣ
ＮＧ−２配列のアミノ酸６２７−６３４に対応、ｍＢＣＮＧ−１に従うナンバリ
ング；図８参照）を用いてＰＣＲプローブを作成した。この断片を用いて高スト
リンジェンシー条件（前記参照）において、λｇｔ１０においてヒト脳海馬ｃＤ
ＮＡライブラリ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，カタログ番号ＨＬ３０２３ａ）をスクリー
ニングした。下流プライマーとしてのオリゴヌクレオチド；５’−ＣＡＣＣＡＧ
ＣＴＴＣＣＧＧＣＡＧＴＴＧＡＡＧＴＴＧ−３’（配列番号：３０）（Ｈ６１．
Ｃ，ｈＢＣＮＧ−２配列のアミノ酸４５２−４５９に対応、ｍＢＣＮＧ−１に従
うナンバリング；図８参照）および上流プライマーとしてのオリゴヌクレオチド
１５’．Ｎ２（配列番号：１７）または１３’．Ｎ２（配列番号：１８）のいず
れかを用い、陽性反応クローンをＰＣＲによってさらにスクリーニングした。最
長増幅産物を生じるクローンをサブクローンし、配列決定し、かくして、アミノ
酸５８７（ｍＢＣＮＧ−１に従うナンバリング；図８参照）までのｈＢＣＮＧ−
２配列のＮ−末端領域が得られた。
【０１６１】 ノーザンブロット マウス遺伝子発現実験では、Ｍｏｕｓｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ，カタログ番号７７６２−１
）を以下のＰＣＲ産物でプローブした：ｍＢＣＮＧ−１については、オリゴｑ０
．５’（５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＴＣＣＧＣＧＴＣＣＡＡ−
３’）（配列番号：３１）およびｑ０．３’（５’−ＣＣＴＧＡＡＴＴＣＡＣＴ
ＧＴＡＣＧＧＡＴＧＧＡＴ−３’）（配列番号：３２）を用いて得られたプロー
ブ「ｑ０」。ｍＢＣＮＧ−１配列のアミノ酸６−１３１に対応する増幅産物（図
７および図８参照）。ｍＢＣＮＧ−２については、オリゴＡＳＥＱ２／ＨＲＬ．
２（前記参照）を用いて得られたプローブ「ｄＡ」。ｍＢＣＮＧ−３については
、オリゴ１５．Ｎ２／１３．Ｎ２（前記参照）を用いて得られたプローブ「１５
−７」；ラムダファージＤＮＡ（クローン＃１５）に対して直接行った増幅。ｍ
ＢＣＮＧ−４については、ＥＳＴ−Ｍ２８ ＤＮＡからゲルー精製ＥｃｏＲＩ／
ＢｇｌＩＩ制限断片（４００ｂｐ）といてプローブ「Ｍ２８」が得られた。ｍＢ
ＣＮＧ−４配列のアミノ酸５２９−６０７に対応する断片（ｍＢＣＮＧ−１に従
うナンバリング；図８参照）、プラスｍＢＣＮＧ−４ ３’ＵＴＲの１８０ヌク
レオチド（非翻訳領域；配列番号：１１）。
【０１６２】 ヒト遺伝子発現実験では、Ｈｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎ
ｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ，カタログ番号７７６０−１）
またはＨｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌ
ｏｔ（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ，カタログ番号７７５０−１）を以下のＰＣＲ産物で
プローブした：ｈＢＣＮＧ−１については、オリゴＨ５７．Ａ（５’−ＧＴＣＧ
ＴＡＣＴＧＣＣＡＧＴＧＴＴＣＧＡＧＣＴＧ−３’）（配列番号：３３）および
Ｈ５７．Ｂ（５’−ＧＧＴＣＡＧＧＴＴＧＧＴＧＴＴＧＴＧＡＡＡＣＧＣＧ−３
’）（配列番号：３４）を用いて得られたプローブＨ５７。ｈＢＣＮＧ−１配列
のアミノ酸５３７−８００に対応する断片（ｍＢＣＮＧ−１に従うナンバリング
；図８参照）。ｈＢＣＮＧ−２については、オリゴＨ６１．Ａ（配列番号：２８
）およびＨ６１．Ｆ（配列番号：２９）（前記参照）を用いて得られたプローブ
「Ｈ６１」。
【０１６３】 ハイブリダイゼーションは、全て、製造業者のプロトコルハンドブックに示さ
れたごとく、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液中にて、６８℃で１時間行った。洗浄は
以下のごとくに行った：２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中にて室温で１０分間、続
いて０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中にて６５℃で３０分間を２回。０．５％
ＳＤＳ／Ｈ２Ｏ中にて５分間沸騰させることによってフィルターを引き続いての
ハイブリダイゼーションの間にストリップした。
【０１６４】 配列の整列およびＥＳＴデータベースサーチ 整列および距離の計算は、全て、示されたペプチド配列についてのＭｅｇＡｌ
ｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）で行った。
【０１６５】 ｍＢＣＮＧ−１ポリペプチド配列（当該蛋白質のＣ−末端領域に存在するグル
タミン反復を回避するためのアミノ酸１−７２０）およびＴＢＬＡＳＴＮプログ
ラムを用い、ＥＳＴデータベースサーチをＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）で行った。
【０１６６】 例３ マウスおよびヒトＢＣＮＧチャンネル遺伝子の生理学的および薬理学的
重要性 緒言 ＢＣＮＧ遺伝子ファミリーの予測される蛋白質のユニークな構造特徴および組
織分布は、それらが心臓および脳のペースメーカー電流（種々に呼ばれるＩｈ，
ＩｆまたはＩｑ）をコードすることを示唆した。あるいは、それは、心臓、腎臓
、肝臓および中枢神経系の機能で重要な他のーおそらくは同定されていないーイ
オン電流の成分であるらしいことが示唆された。予測されるＢＣＮＧ蛋白質のユ
ニークな構造特徴（通常のイオン伝導性ポア（Ｐ）ドメイン、高度に保存された
環状ヌクレオチド結合（ＣＮＢ）部位および高度に保存されかつ高度に荷電され
たＳ４電圧センサー）は、それらが、ポア、環状ヌクレオチド結合部位および電
圧−依存性ゲーティング装置を標的とする複数薬物介入を戦略に対して感受性で
有り得ることを示した。
【０１６７】 ＢＣＮＧ蛋白質の分析ならびに予測される構造および一般的特徴 ＢＣＮＧ遺伝子の予測されるアミノ酸配列は、それらが電圧−ゲーテッドイオ
ンチャンネルスーパーファミリーのメンバーであることを明らかとした。具体的
には、ＢＣＮＧ蛋白質は、電圧−ゲーテッドＫ＋チャンネル（Ｐｏｎｇｓら、１
９９５）および環状ヌクレオチドーゲーテッドチャンネル、Ｎａ，Ｋ＋およびＣ
ａに対して浸透性である非選択的カチオンチャンネル（ＺａｇｏｔｔａおよびＳ
ｉｂｇｅｌｂａｕｍ，１９９６）を含むチャンネルのスーパーファミリーに対す
る同様性を示す。図１１に模式的に示したように、ＢＣＮＧ蛋白質は、細胞質Ｎ
およびＣ末端を持つ６つの膜貫通スパンニングαーラセン、高度に塩基性の第４
の膜貫通ドメイン（Ｓ４）およびポア（ｐ）領域を有することが予測される。こ
れらのモチーフの各々は電圧−ゲーテッド＋ファミリーのメンバーで見いだされ
る。加えて、ＢＣＮＧ蛋白質は、Ｃ−末端によく保存された環状ヌクレオチド結
合部位を有する。相同モチーフは電圧−ゲーテッドＫ＋チャンネルのいくつかで
見いだされるが、それらのチャンネル中の環状ヌクレオチド結合部位はよく保存
されておらず、結合部位は機能するという証拠はほとんどない。事実、ＢＣＮＧ
チャンネルの環状ヌクレオチド結合部位は、それらの活性化を駆動するのに環状
ヌクレオチドの結合を使用する環状ヌクレオチドゲーテッドチャンネルで見いだ
された部位に最も相同である。さらに、ＢＣＮＧチャンネルのＰループは電圧活
性化Ｋ＋チャンネルおよび環状ヌクレオチドゲーテッドチャンネルで見いだされ
たものに相同であるが、ＢＣＮＧチャンネルに対してユニークであるイオン伝導
特性を生じるらしいアミノ酸配列のいくつかの非保存的変化がある。かくして、
ＢＣＮＧチャンネルは、それらが区別される生理学的および薬理学的特性を有す
ることを示唆する多数の点において、全ての従前に同定されているチャンネルか
ら区別されているように見える。電圧−ゲーテッドＫ＋チャンネル、環状オリゴ
ヌクレオチド−ゲーテッドチャンネルおよびＢＣＮＧチャンネルの配列における
これらの同様性および非同様性ならびにＢＣＮＧチャンネル機能特性についての
予測される結果を以下により詳しく議論する。
【０１６８】 結果 疎水性コア ＢＣＮＧチャンネルのコアは６つの膜貫通αーラセン配列（Ｓ１−Ｓ６）およ
びポア形成Ｐループを有すると予測される。この帰属はテトラマーＫ＋チャンネ
ル（およびテトラマー環状ヌクレオチドーゲーテッドチャンネル）の単一サブユ
ニットまたは偽テトラマーＮａおよびＣａチャンネルにおける単一反復に対して
相同である。この相同性は、ＢＣＮＧチャンネルが（電圧−非依存性であるが構
造的に類似の環状ヌクレオチドーゲーテッドチャンネルも含む）電圧−ゲーテッ
ドＫ＋チャンネルスーパーファミリーのメンバーであることを示唆する。電圧−
ゲーテッドＫ＋チャンネルおよび環状ヌクレオチドーゲーテッドチャンネルにつ
いて観察されるごとく（Ｃｈｅｎら、１９９３；Ｂｒａｄｌｅｙら、１９９４；
ＬｉｍａｎおよびＢａｃｋ，１９９４；Ｌｉｎら、１９９６）、ヘテロもしくは
ホモマルチマー構造において４つのかかるポリペプチドより構成されるようであ
る。しかしながら、ｍＢＣＮＧ−１は、全ての他の周知のＫ＋チャンネルおよび
環状ヌクレオチドーゲーテッドチャンネル配列からかなりの発散を示す。前記し
たごとく、疎水性コア領域における最高の相同性は、マウスＥａｇ（２２％アミ
ノ酸類似性）−縮重したおそらくは非機能的な環状ヌクレオチド結合部位Ｗａｒ
ｉｍｋｅおよびＧａｎｃｌｅｋｙを有する電圧−ゲーテッドＫ＋チャンネルに対
するものである。このコア領域にわたって、ｍＢＣＮＧ−１は、電圧非依存性環
状ヌクレオチドーゲーテッドチャンネルに対する１７％同一性を示す。
【０１６９】 対照的に、ＢＣＮＧ遺伝子によってコードされることが予測される蛋白質は相
互に対して高い相同性を示す（＞８０％，例１および２参照）。事実、マウスＢ
ＣＮＧ−１およびヒトＢＣＮＧ−１はコア領域にわたって同一である。同様に、
ｍＢＣＮＧ−２およびｈＢＣＮＧ−２はコア領域にわたって９８％同一である。
かくして遺伝子のＢＣＮＧファミリーは、環状ヌクレオチド結合によって調節し
得るＫ＋チャンネルスーパーファミリーの新しい分岐を構成するようである。か
かる配列保存を示すメンバーを持つ遺伝子ファミリーの存在は、重要な生物学的
機能を強く示唆する。
【０１７０】 Ｓ４電圧−感知ドメイン 第４膜貫通ラセン中の各第３位置における正に荷電したアルギニンおよびリシ
ン残基の存在は、電圧−依存性ゲーティングの署名配列である（Ｈｉｌｌｅ，１
９９２；Ｃａｔｔｅｒａｌｌ，１９９２、図１２参照）。電圧−非依存性環状ヌ
クレオチド−ゲーテッドチャンネルにおいて、Ｓ４は、負に荷電した酸性アミノ
酸によって置き換えられ、またはトリアド反復フレームの外にある負に荷電した
残基のいくつかで縮重している。これらの変化は、環状ヌクレオチドーゲーテッ
ドチャンネルのＳ４における正味の正の電荷の３−４まで減少させた。負に荷電
した残基のこの導入は、環状ヌクレオチドーゲーテッドチャンネルがもはや電圧
には応答しないという理由の基礎となるであろう。しかしながら、また、環状ヌ
クレオチドーゲーテッドチャンネルにおけるいくつかの他の構造的変化の結果と
して電圧−感受性が失われ、Ｓ４構造における発散は単に正の荷電を保持するた
めの進化的圧力の喪失の反映であり得る。
【０１７１】 ＢＣＮＧチャンネルのＳ４は、貧弱ではあるが、電圧−ゲーテッドＫ＋チャン
ネルＳｈａｋｅｒおよびｅａｇ中の対応する領域に最も密接に関連する（ｍＢＣ
ＮＧ−１はＳｈａｋｅｒおよびｅａｇのＳ４に対して３０％相同である）。ＢＣ
ＮＧチャンネルのＳ４中のアルギニンに代えてセリンを含ませることによる妨害
にもかかわらず、ＢＣＮＧ配列は、電圧−ゲーテッドＫ＋チャンネルスーパーフ
ァミリーのいずれの他のメンバーよりも正に荷電した残基を含有する（図１２参
照）。ＢＣＮＧ−１のＳ４ドメインは、９つまでの正に荷電した残基を有し（１
つの他のアルギニンの代わりにセリンによって分離された５つのうちの１つの群
および４つのうちの１つの群）、これは再度それを環状ヌクレオチドーゲーテッ
ドチャンネルに対するよりも電圧活性化Ｋ＋チャンネル（Ｓｈおよびｅａｇファ
ミリー）に対してより似たものとする。かかる高度に荷電されたＳ４の保持は、
これらのチャンネルのゲーティングが電圧感受性であることを強く示唆する。
【０１７２】 環状ヌクレオチド結合部位 環状ヌクレオチドは、細胞シグナリングに関与する蛋白質の多様なファミリー
の活性を調節する。これらは転写因子（細菌異化産物活性化蛋白質、ＣＡＰ）、
ｃＡＭＰ−およびｃＧＮＰ−依存性蛋白質キナーゼ（ＰＫＡおよびＰＫＧ）およ
び視覚および嗅覚シグナル変換に関与する環状ヌクレオチドーゲーテッド（ＣＮ
Ｇ）イオンチャンネルを含む（ＳｈａｐｂおよびＣｏｒｂｉｎ，１９９２；Ｚａ
ｇｏｔｔａおよびＳｉｅｇｅｌｂａｕｍ，１９９６）。これらの蛋白質のエフェ
クタードメイン内の明白な発散にもかかわらず、環状ヌクレオチド結合部位は共
通の構造体を保有するようである。ＣＡＰ（ＷｅｂｅｒおよびＳｔｅｉｔｚ、１
９８７）および組換えウシＰＫＡ Ｒ１αサブユニット（Ｓｕら、１９９５）の
結晶構造の溶液は、それらの環状ヌクレオチド結合部位が、αラセン（Ａラセン
）、８ストランドβーロール、およびさらに２つのαーラセン（ＢおよびＣ）か
ら形成され、Ｃ−ラセンは結合ポケットの裏面を形成することを示した。これら
の環状ヌクレオチド結合部位の内の１つを含むほぼ１２０個のアミノ酸のうち、
全てのＣＡＰ、ＰＫＡ、ＰＫＧおよび環状ヌクレオチドゲーテッドチャンネルに
おいて６つが不変である。かくして、不変残基は、これらの多様な蛋白質のＣＮ
Ｐ部位の折り畳みおよび／または機能において重要でーかつ保存されたー役割を
演じることが示唆される（ＳｈａｂｂおよびＣｏｒｂｉｎ，１９９２；Ｚａｇｏ
ｔｔａおよびＳｉｅｇｅｌｂａｕｍ，１９９６；ＷｅｂｅｒおよびＳｔｅｉｔｚ
，１９８７；Ｓｕら、１９９５；ＫｕｍａｒおよびＷｅｂｅｒ、１９９２；Ｓｃ
ｏｔｔら、１９９６）。事実、ＣＡＰ（ＷｅｂｅｒおよびＳｔｅｉｔｚ、１９８
７）および組換えウシＲ１α（Ｓｕら、１９９５）の結晶構造は、グリシンがβ
ーロール内のターンにあり、他方、グルタメートおよびアルギニンがヌクレオチ
ドのリボースーホスフェートとで結合を形成することを明らかにする。
【０１７３】 興味深いことにこれらの残基のうちの３つのみー２つのグリシンおよび該アル
ギニンーが、ＣＮＢ部位モチーフを担持するが、環状ヌクレオチド（ＫＡＴ１（
Ｈｏｓｈｉ，１９９５）およびショウジョウバエＥＧＧ（ｄＥＡＧ）（Ｂｒｕｇ
ｇｅｍａｎら、１９９３）の直接的結合によってそのゲーティングが有意には変
調できないより遠く関連する電圧−ゲーテッドチャンネルの内で保存されている
ようである（図１１参照） かくして、植物チャンネルＫＡＴ１において、最初のグリシンはアスパラギン
に突然変異されており、アラニンはトレオニンに変化されている。ｄＥＡＧにお
いて、グルタメートはアスパルテートに変化されている。さらに、βー７中の高
度に保存されたＲＸＡ配列に対するｄＥＡＧの整列は不確かである。しばしば、
ｄＥＡＧ βー７内のＳＡＡ配列は、ＲＸＡコンセンサス配列と整列し、これは
、アルギニンが失われセリンで置き換えられていることを示唆する。ＲＡＬはＲ
ＸＡコンセンサス配列と整列し、これは、アルギニンは保持されているが、アラ
ニンはロイシンで置き換えられていることを示すであろう。いずれの整列が考慮
されるかにかかわらず、ＫＡＴ１、ｄＥＡＧおよび関連チャンネルの結合部位配
列が、全て、機能的環状ヌクレオチド結合部位についてのコンセンサスモチーフ
からの偏りを示すことが明らかである。この構造的発散と歩調を合わせるにおい
ていずれかのクローン化ＥＡＧは直接的環状ヌクレオチド結合に対して感受性で
あるという唯１つの報告がある（Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、１９９３）。しか
しながら、この結果は確認されておらず今日では人工物であると考えられている
。植物チャンネルＫＡＴ１のゲーティングが環状ヌクレオチド変調に対して感受
性が弱いであろうといういくつかの証拠がある（Ｈｏｓｈｉ，１９９５）。
【０１７４】 図１３は、結合部位および環状ヌクレオチドの間の臨界的相互作用を示すｂＲ
ＥＴ１の環状ヌクレオチド結合部位の模式的表示を示す。
【０１７５】 第３（またはＣ）αーラセンがチャンネル活性化に際してアゴニストまで移動
し、プリン環とのさらなる好都合な接触を形成することを最近の証拠は示してい
る。事実、ｃＡＭＰに対するｃＧＭＰによるｂＲＥＴ１の選択的活性化は、Ｃ
α−ラセン、Ｄ６０４中の残基によってかなり決定される（Ｖａｒｎｕｎら、１
９９５）。この酸性残基は、環窒素上の水素およびｃＧＭＰプリン環のアミノ基
とで２つの水素結合を形成すると考えられる。ｃＧＭＰ選択的ｂＲＥＴ１チャン
ネルとは異なり、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰによって同等に良く活性化される（ｆ
ＯＬＦ１，Ｇｏｕｌｄｉｎｇら、１９９２；Ｇｏｕｌｄｉｎｇら、１９９４）ま
たはｃＡＭＰによる活性化に好影響する（ｒＯＬＦ１と共発現されるｒＯＬＦ２
、Ｌｉｍａｎ＆Ｂｕｃｋ，１９９４；Ｂｒａｄｌａｙら、１９９４）環状ヌクレ
オチドーゲーテッドチャンネルは、ここにおける酸性残基を有さず、むしろ、極
性または疎水性アミノ酸を有する（Ｖａｒｎｕｍら、１９９５）。Ｄ６０４の中
和の結果、ｃＧＭＰとの好都合な水素結合を形成する能力が失われｃＡＭＰのプ
リン環上の孤立電子対との不都合な相互作用が喪失し、かくして、ｃＡＭＰおよ
びｃＧＭＰの間で非選択的になり、またはｃＡＭＰにつき選択的とさえなるこの
位置に疎水性または極性残基を担持するチャンネルを説明する。
【０１７６】 ＢＣＮＧ蛋白質のＣ−末端において、これらの環状ヌクレオチド結合部位に相
同なほぼ１２０アミノ酸の配列がある。驚くべきことに、全ての機能的な環状ヌ
クレオチド結合部位で全く保存されていることが示されている６つの残基が同定
されたＢＣＮＧ蛋白質の全てで保存されている。ＢＣＮＧチャンネルの環状ヌク
レオチド結合部位は、電圧−非依存性で環状ヌクレオチドーゲーテッドチャンネ
ルに存在する機能的部位と非常に似ている（３０％）。チャンネル遺伝子で見い
だされる環状ヌクレオチド結合部位を蛋白質キナーゼにおけるそれと比較すると
、ＢＣＮＧチャンネル部位は、いずれかの他のイオンチャンネルのそれよりも同
様である（酵母ｃＡＭＰ−依存性蛋白質キナーゼに対して２５％同様性）。これ
らのデータは、ＢＣＮＧ遺伝子が、その活性が環状ヌクレオチドの直接的な結合
によって変調される蛋白質をコードすることを強く示唆する。さらに、ＢＣＮＧ
チャンネルは、全て、ｃＧＭＰ選択的ｂＲＥＴ１チャンネルでＤ６０４が見いだ
される位置においてイソロイシン残基を有する。かくして、ＢＣＮＧはｃＡＭＰ
選択的であることが示唆される。
【０１７７】 ポア Ｎａ，ＣａまたはＫ選択的ファミリーを、およびそのコンダクタンスが１−２
のオーダーの大きさだけ変化するこれらのファミリー内のチャンネルの存在を生
起させた機能的発散にもかかわらず、電圧−ゲーテッドスーパーファミリーの全
てのメンバーのポアは関連する（Ｉｔｉｌｌｉｃ １９９２；例えば、図１４参
照）。チャンネルのイオン透過特性に寄与する残基については多くが知られてお
り、これは、ＢＣＮＧ蛋白質の透過特性についての予測を可能とする（Ｍａｃｋ
ｉｎｎｏｎ，１９９１；Ｈｅｇｉｎｂｏｔｈｅｍら、１９９４）。
【０１７８】 総じて、ｍＢＣＮＧ−１のＰ領域は、貧弱ではあるが（３０％）、Ｋ選択的Ｓ
ｈａｋｅｒおよびｅａｇチャンネルにおける対応領域に非常に密接に関連する。
Ｐループ中のＧＹＧモチーフの存在に基づいて、ＢＣＮＧ蛋白質はＫ選択的であ
ると予測されるであろう。しかしながらＢＣＮＧ Ｐループは、他の電圧活性化
Ｋ＋チャンネルで高度に保存されているいくつかの位置で置換を含有する。これ
らの変化は図１４（これは、全ての他の主要なＫチャンネルファミリーからのチ
ャンネルに対するｍＢＣＮＧ−１の整列を示す）および図８（これは、すべての
現在クローン化されているＢＣＮＧ配列の整列を示す）で見ることができる。Ｇ
ＹＧトリプレットに続くアスパルテート残基は、マウスおよびヒトＢＣＮＧ−１
においてアラニン（３５２位）で、これまでに同定されている他のＢＣＮＧチャ
ンネルにおいてアルギニンによって置き換えられる。その位置（ｍＢＣＮＧ−１
中の残基３４４）からのセリン／トレオニン残基８残基Ｎ−末端は、ＢＣＮＧ配
列の全てにおいてヒスチジンで置き換えられる。アスパルテートから６残基Ｎ−
末端に、極性残基の代わりに疎水性ロイシン残基が導入される。加えて、アスパ
ルテートからマイナス１２の位置、図１４で整列させた他のチャンネルの全てに
おいて芳香族残基によって占められた部位において、リシン残基がＢＣＮＧ配列
の全てに導入される（図８および図１４）。
【０１７９】 ＢＣＮＧサブユニットのＰ領域で観察されるアミノ酸置換は、当該チャンネル
がそのＫ選択性を喪失したことを必ずしも示さない（例えば、リシンはＫ選択性
ＳｈａｗチャンネルのＰ領域に存在する、図１４参照）。Ｋチャンネルコンセン
サス配列からの実質的な偏りは、ＢＣＮＧ蛋白質が、ＮａおよびＫの間を十分に
選択しないチャンネルのファミリーを生じさせかねないことを示唆しーＢＣＮＧ
チャンネルが非選択的Ｉｈペースメーカー電流をコードするという仮説に合致す
る。
【０１８０】 考察 ＢＣＮＧ構造の重要性 植物および動物門双方で見いだされる多数のＫ＋チャンネル上の環状ヌクレオ
チド結合部位の存在は、先祖Ｋ＋チャンネルおよび先祖環状ヌクレオチド結合部
位の間の融合が植物および動物の進化的分離に先立って起こったようであること
を示唆する（ＷａｒａｋｅおよびＧａｎｅｔｚｋｙ，１９９４）。事実、これら
の部位の多くが縮重し、非機能的であるという知見はこの解釈を支持する。この
共通の先祖からの発散は、一方において、Ｅａｇ−関連チャンネル（ＥＡＧ、Ｅ
ＲＧ、ＥＬＫ）（ＷａｒｎｋｅおよびＧａｎｅｔｓｋｙ，１９９４）および植物
内向き整流器（ＡＫＴおよびＫＡＴ）に導き、（これは、元の環状ヌクレオチド
結合部位配列からの暫時の偏りを示しつつ、電圧活性化Ｋ＋チャンネルの特徴の
より多くを維持し）、他方において、ＣＮＧ−チャンネルに導き、（これは、そ
れらが電圧活性化およびＫ＋選択性喪失しつつ、環状ヌクレオチド結合部位に対
するより高い進化的拘束を示す）（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９２；Ｓｅｎｔｅ
ｎａｃら、１９９２）。ＢＣＮＧ−１の特徴は、それが電圧−ゲーテッドＫ＋チ
ャンネルおよび環状ヌクレオチドーゲーテッドチャンネルの間の進化的リンクを
表す先祖分子に近いままであったであろうことを示唆する。これは、ｍＢＣＮＧ
−１の環状ヌクレオチド結合部位が特に酵母ｃＡＭＰ−依存性蛋白質キナーゼに
おいて蛋白質キナーゼに存在する結合部位に対する最も近い相同性を示し（２５
％）、他方、チャンネルドメインが、環状ヌクレオチド結合部位を有さず、かく
して、おそらくは遺伝子融合事象の前に生起したＳｈａｋｅｒ遺伝子によってコ
ードされた電圧−依存性チャンネルに最も密接に関連するという観察によって支
持される。ｍＢＣＮＧ−１の環状ヌクレオチド結合部位は、環状ヌクレオチドー
ゲーテッドチャンネルに存在する部位に最も相同であり、これは、再度、これら
がおそらく共通の先祖から生起し、双方において、環状ヌクレオチド結合部位を
維持する圧力があったことを示す、なぜならば、それは蛋白質の機能に寄与した
からである。かくして、ＢＣＮＧ−１はＫ＋チャンネルスーパーファミリーの新
しい分岐に貢献するようである。
【０１８１】 生理学的重要性 イオンチャンネルは、全ての興奮性細胞の電気的活性の基礎となる中枢的成分
であり、イオン興奮性細胞で重要な輸送機能を果たす。イオンチャンネルの新規
なＤＣＮＧファミリーのメンバーは、脳および心筋ならびに骨格筋、肺、肝臓、
膵臓および腎臓双方において発現される。そのアミノ酸配列より、ＢＣＮＧチャ
ンネル遺伝子ファミリーのメンバーは、脳および心臓ならびに他の組織の電気生
理学的活性で重要な新規役割を有するようである。この見解は、まず、ＢＣＮＧ
チャンネル蛋白質につきコードするｍＲＮＡが心臓および脳双方で発現されると
いう発見に基づく。第２に、ＢＣＮＧチャンネルの推定一次アミノ酸配列が、そ
れらが電圧−ゲーテッドチャンネルファミリーのメンバーであるが、ほとんどの
電圧−ゲーテッドチャンネルとは異なり、ＢＣＮＧチャンネルがそのカルボキシ
末端において機能的環状ヌクレオチド結合ドメインであるように見えるものを含
むことを示す。
【０１８２】 ４つのマウスＢＣＮＧチャンネル遺伝子のノーザンブロットは、発現パターン
において興味深い差異を示す（図３、図９および図１０参照）。ｍＢＣＮＧ−１
は脳で選択的に発現される。ウェスタンブロットは、ｍＢＣＮＧ−１が蛋白質レ
ベルにてやはり高度に発現され、この発現がマウス脳を通じて広く分布すること
を確認する（図２参照）。ｍＢＣＮＧ−２は脳および心臓で発現される。ｍＢＣ
ＮＧ−３は脳、心臓、肺および骨格筋で発現される。ｍＢＣＮＧ−４は脳、肝臓
および腎臓で発現される。かくして、各遺伝子は、アミノ酸レベルではかなり同
様であるものの、区別される発現のパターンを示し、これは各々がユニークな生
理学的機能を有することを意味する。これは、ＢＣＮＧファミリーの２つのヒト
メンバー、ｈＢＣＮＧ−１およびｈＢＣＮＧ−２がマウス同族体と同様の発現パ
ターンを示すという発見によって生み出された。かくして、ｈＢＣＮＧ−１は脳
において選択的に発現され（膵臓においては弱いハイブリダイゼーション）、他
方、ｈＢＣＮＧ−２は脳および心臓で発現される。特定の器官系内においてさえ
、異なる遺伝子は異なる発現パターンを示す。かくして、脳ｈＢＣＮＧ−１は他
の脳領域におけるよりも海馬および脳梁でより高度に発現される。対照的に、ｈ
ＢＣＮＧ−２は全ての脳領域で高度に発現される。
【０１８３】 ＢＣＮＧアミノ酸配列および組織分布に基づいて、チャンネルが、膜脱分極に
よって活性化され、環状ヌクレオチドの直接的結合によって変調される電圧−ゲ
ーテッドカリウムチャンネル、または心臓（ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏおよびＴｏ
ｒｔａ，１９９１）および脳の種々の領域（Ｓｔｅｒｉｄｅら、１９９３）にお
いて自然発生電気活性の基礎となる過分極−活性化ペースメーカーチャンネルの
いずれかをコードすると仮定された。この後者の仮定は、ＢＣＮＧ遺伝子と同様
に、ペースメーカーが脳および心臓の双方で発現されるという発見に基づく。さ
らに、ペースメーカーチャンネルは、電圧および当該チャンネル上の細胞質部位
への環状ヌクレオチドの直接的結合によってゲートされる非選択的カチオンチャ
ンネルであることが知られている（ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏおよびＴｏｒｔａ，
１９９１；ＰｅｄａｒｚａｎｉおよびＳｔｏｒｍ，１９９５Ｌａｒｋｍａｎおよ
びＫｅｌｌｙ，１９９７，ＭｃＣｏｒｍｉｃｋおよびＰａｇｅ，１９９０）。今
日、ペースメーカーチャンネルの性質に関する生化学または分子生物学的情報は
ない。しかしながら、組織分布およびペースメーカーチャンネルとＢＣＮＧチャ
ンネルの間の提案されたゲーティングメカニズムにおける同様性は、ＢＣＮＧ遺
伝子が、ペースメーカーチャンネルを含む１以上のサブユニットをコードするこ
とを示唆した。
【０１８４】 ペースメーカーチャンネルは心臓組織および中枢ニューロン双方において電気
生理学的レベルで研究されてきた。両方の場合において、細胞膜電圧が−４０ｍ
Ｖよりも負にされるとチャンネルは活性化される。これらの非選択的チャンネル
はＮａおよびＫ＋イオン双方に対して透過性である。しかしながら、これらのチ
ャンネルが開く負の膜電位範囲において、その主な効果は正に荷電したナトリウ
ムを細胞外環境から細胞に侵入させ、細胞膜をより正になるようにすることであ
る。これは、結局は細胞膜電圧を閾値に到達せしめ、細胞は作動電圧をファイア
ーする（図１５参照）。環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）は膜電圧およびチャンネル活性
化の間の関係をシフトさせ、膜が脱分極するとより迅速にチャンネルにスイッチ
をいれることが知られている。これはペースメーカー脱分極の速度を増大させ、
自然発生活動電位ファイアリングの速度を増大させる。心臓がより速く拍動させ
るエピネフリン（アドレナリン）の能力に基礎を置くのはこの効果である。ペー
スメーカー電流に対するｃＡＭＰの効果は２つの別々の分子メカニズムを介して
起こるようである。まず、ｃＡＭＰは酵素、ｃＡＭＰ−依存性プロテインキナー
ゼ（ＰＫＡ）を活性化し、蛋白質リン酸化のレベルの増大に導く。第２に、ｃＡ
ＭＰはペースメーカーチャンネルの細胞質領域に直接的に結合し、蛋白質リン酸
化観察されるものと同様の効果を生じると考えられる。ｃＡＭＰのかかる直接的
作用は心臓および脳双方で報告されている（ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏおよびＴｏ
ｒｔａ，１９９１；ＰｅｄａｒｚａｎｉおよびＳｔｏｒｍ，１９９５）。
【０１８５】 それらが新規な電圧−ゲーテッドおよび環状ヌクレオチドーゲーテッドカリウ
ムチャンネルにつきコードするというＢＣＮＧチャンネルについての別の機能は
、イオンー導電性ポアを一列に並べ、よって、チャンネルのイオン選択性を決定
することが知られているアミノ酸領域によって示唆される。このＳ５−Ｓ６ルー
プは、ほとんどすべての電圧−ゲーテッドＫ＋チャンネルで保存されている３ア
ミノ酸モチーフＧＹＧを含有する（Ｈｅｇｉｎｂｏｔｈａｍら、１９９４）。Ｂ
ＣＮＧチャンネルＳ５−Ｓ６ループは、ＧＹＧモチーフを含めた他のカリウムチ
ャンネルのそれとのアミノ酸同様性を示す。これは、ＢＣＮＧチャンネルがＫ＋ 選択的であり得ることを示唆する。しかしながら、ＢＣＮＧチャンネルが他のＫ ＋ チャンネルと比較してＫ−選択性が低いことを示し得るＢＣＮＧおよび他のＫ ＋ チャンネルの間の配列に多数の驚くべき差異があり、これは、ＢＣＮＧチャン
ネルがＮａおよびＫ＋双方に対して透過性である非選択的カチオンペースメーカ
ーチャンネルにつきＢＣＮＧチャンネルがコードするという見解と合致する。
【０１８６】 海馬錐体細胞の樹状突起におけるｍＢＣＮＧ−１の存在は特に興味深い。とい
うのはｃＡＭＰは、これらの細胞における長期シナプス増強のいくつかの形態の
確立で重要であることが示されているからである（Ｆｒｅｙら、１９９３；Ｂｏ
ｓｈａｋｏｖら、１９９７；ＨｕａｎｇおよびＫａｎｄｅｌ，１９９４；Ｔｈｏ
ｍａｓら、１９９６）。ｍＢＣＮＧ−１の構造的特徴は、環状ヌクレオチド結合
によって直接的に変調されるＫ＋伝導活性を予測する。
【０１８７】 興味深いことには、ｍＢＣＮＧ−１が高度に発現される場合、同様の特徴を持
つ電流が領域ＣＡ１の海馬錐体ニューロンにおいて記載されてきた（Ｗａｒｍｋ
ｅら、１９９１）。この電流（ＩΩ）は、ｃＡＭＰレベルに応答してニューロン
興奮性を調節することによって海馬活性のノルアドレナリン作動性変調に寄与す
ると考えられる。ＢＣＮＧ−１はこのタイプの電流の原因であるチャンネルの形
成に参画することができる。
【０１８８】 電気シグナリングにおけるＢＣＮＧチャンネルの広い組織分布およびありそう
な重要な生理学的役割に基づくと、これらのチャンネルと相互作用する薬物は、
多数の神経学的病気、精神病および心臓病ならびに骨格筋、肝臓および腎臓のご
とき組織の全身病で潜在的に治療用途がある。
【０１８９】 神経学的病気： 海馬におけるこれらのチャンネルの高い発現および自然発生ペースメーカー発
生における潜在的役割に基づくと、それらは癲癇の治療用の有用で新規な標的な
り得る。例えば、これらのチャンネルをブロックすることによって、発作の重症
度を妨げまたは減少させることができる。老化関連記憶不足、発作−誘導記憶喪
失およびアルツハイマー病のごとき海馬ニューロン喪失に関連する病気において
、ペースメーカーチャンネル活性を増強した薬物は海馬においてニューロン活性
を増加させることによって治療で使用することができる。これらのチャンネルは
基礎神経節および線条においても発現されるので、それらはパーキンソン病およ
びハンチントン病において潜在的な標的となり得る。ＢＣＮＧチャンネルは視床
で高度に発現され、他方、ペースメーカーチャンネルは刺激で重要な自然発生活
動電位を生じるのに重要であることが示されてきた。かかるチャンネルの標的化
は注意不足障害を治療する助けとなり得る。
【０１９０】 精神病： 脳梁におけるｈＢＣＮＧ−１の高レベルの発現を仮定すれば、これらのチャン
ネルは、種々の情動障害および不安に関与する薬物用の標的となり得る。辺縁系
におけるそれらの高い発現は、それらが精神分裂症の治療で潜在的に有利で有
り得ることを示唆する。
【０１９１】 心臓病： 心臓におけるＢＣＮＧ−２チャンネルの発現は、それらがある種の心臓不整脈
の治療用の有用な標的となり得ることを示唆する。これらの遺伝子がペースメー
カーチャンネルをコードし得るという仮定に基づくと、ＢＣＮＧチャンネルはペ
ースメーカーチャンネル活性を増強する薬物を介して徐脈型不整脈および増強さ
れた自律性によるある種の頻拍性不整脈双方を治療するための潜在的な標的とな
るであろう。もしＢＣＮＧチャンネルがペースメーカーチャンネルでないとして
も、それらは心臓電気活性において重要な役割を演じるようであり、おそらくは
活動電位再分極に寄与し、かくして、依然として薬物開発のための魅力的な標的
であろう。
【０１９２】 多数の薬物、トキシンおよび内因性化合物は種々のタイプのイオンチャンネル
と相互作用することが示されている。これらの薬物は局所麻酔剤として、および
心臓不整脈、高血圧、癲癇および不安の治療において有用であることが判明した
。これらの薬物はポアブロッカー、アロステリックモジュレーターおよび競合的
アンタゴニストを含めたいくつかのクラスに分けられる（表ＩＩ参照）。ＢＣＮ
Ｇチャンネルはそれらを非常に魅力的な薬物とするいくつかのユニークな特徴を
表す。まず、脳特異的遺伝子（ＢＣＮＧ−１）および脳および心臓双方で発現さ
れる遺伝子（ＢＣＮＧ−２、３）がある。かくして、ＢＣＮＧは脳または心臓に
つき特異的な薬物を生じ得る。第２に、ＢＣＮＧチャンネルのポア領域は他の既
知のカリウムチャンネルのそれからのかなりの発散を示す。かくして、ＢＣＮＧ
チャンネルを選択的に変化させるが、他のタイプの電圧−ゲーテッドＫ＋チャン
ネル無しですませるポアーブロッキング薬物を生じる。第３に、環状ヌクレオチ
ドー結合部位は、ＢＣＮＧチャンネルのオープニングに関してもう１つの重要な
標的を解明する。特異的環状ヌクレオチドアナログをデザインすることによって
、チャンネルオープニングを増大させる合成アゴニスト、またはチャンネルオー
プニングを減少させるアンタゴニストいずれかをデザインすることが可能である
。イオンチャンネルについてのほとんどの入手可能な薬物はチャンネルオープニ
ングを減少させ、比較的少数のものがチャンネルオープニングを増加させる。Ｂ
ＣＮＧチャンネルのオープニングを増加または減少させる能力は、治療的に有効
な化合物に対してかなりの可能性を提供する。例えば、ウシ光受容体ＣＮＧチャ
ンネルにおいては、Ｒｐ−ｃＧＭＰＳはチャンネルオープニングのアンタゴニス
トであり、他方、Ｓｐ−ｃＧＭＰＳはアゴニストである（ＫｒａｎｅｒおよびＴ
ｉｂｂｓ、１９９６）。さらに、ＢＣＮＧチャンネルの環状ヌクレオチド結合部
位のアミノ酸配列は、プロテインキナーゼの環状ヌクレオチド結合部位および嗅
覚および光受容体ニューロンの環状ヌクレオチドーゲーテッドチャンネルに関し
てかなりの発散を示す。かくして、ＢＣＮＧチャンネルを特異的に標的とする環
状ヌクレオチドアナログをデザインすることができる。
【表２】
【０１９３】 それらのアミノ酸配列から、これらのチャンネルは、それらを薬物開発のため
の先験的に魅力的な標的とする３つの重要な生理学的特性を有するようである。
まず、それらのゲーティングは電圧−依存的であり、かくして、それは電圧−ゲ
ーティングメカニズムの変調に対して感受性であるべきである。第２に、それら
はそのＣ−末端に環状ヌクレオチド結合ドメインを保有し、おそらくは、そのゲ
ーティングは環状ヌクレオチドの直接的結合によって変調されるであろう。第３
に、ＢＣＮＧチャンネルのポア形成ドメインの異常な配列はチャンネルのイオン
伝導特性が選択的に標的とされるようにすべきである。
【０１９４】 もし、チャンネルのゲーティングが電圧−センサーマシーナリーおよび環状ヌ
クレオチド結合部位の双方に関与するならば、低い効率および低い選択性を持つ
２つの化合物を組み合わせてＢＣＮＧチャンネルを選択的に標的化することがで
きるような調和した薬物法となるであろう。かくして、種々の環状ヌクレオチド
結合ポケットに対して同様に弱い効果を有するものと組み合わせた多くの電圧−
活性化チャンネルに対して弱い薬理学的効果を単独で有するであろう１つの化合
物を一緒に適用することができる。ＢＣＮＧチャンネルを予測される例外として
、これらの構造要素の双方を機能的に組み合わせる分子のクラスは現在知られて
いないので、かかる方法はＢＣＮＧサブユニットを含有するチャンネルの高度に
効率的で選択的な標的化に導くようである。ＢＣＮＧサブタイプに対する選択的
介入も可能なはずである。
【０１９５】 薬物を介するこれらのチャンネルの調節は、癲癇および心臓不整脈と多様な病
気に関連する電気的活性を調節するためのユニークな機会を提供する。さらに、
これらのチャンネルの環状ヌクレオチド結合ドメインは、チャンネル機能を上昇
調節または下降調節するために新規で特異的な環状ヌクレオチドアゴニストまた
はアンタゴニストを開発するのに使用することができるユニークな薬理学的標的
を提供する。
【０１９６】 薬物は選択性を達成するためにＣＭＧとカップリングさせて、電圧−依存性ゲ
ーティングを変調することができる。
【０１９７】 ｍＢＣＮＧ−１、ｍＢＣＮＧ−２、ｍＢＣＮＧ−３、ｍＢＣＮＧ−４、ｈＢＣ
ＮＧ−１およびｈＢＣＮＧ−２を発現する細胞系は、チャンネルと相互作用する
化合物についての迅速なスクリーニングの期待を提供する。環状ヌクレオチド結
合ドメインと相互作用する薬物を同定するために、この領域を細菌において選択
的に発現させ、ついで精製させることができる。ついで、精製された蛋白質断片
を標準的なリガンド結合アッセイで用いて、高い親和性にて結合する環状ヌクレ
オチドアナログを検出することができる。
【０１９８】 種々のＢＣＮＧ遺伝子を発現する哺乳動物細胞系の全細胞パッチクランプを用
いて、チャンネルオープニングまたはポアを通じてのイオン浸透に対する薬物の
機能的効果をテストする。ＢＣＮＧチャンネルがＣＮＧチャンネルに似ている場
合、それらはカルシウムに対する有意な透過性を呈する。これは高スルプットス
クリーニングを可能とし、ここに、チャンネルの機能は細胞内カルシウム濃度を
イメージングすることによって評価される。チャンネルオープニングを増加させ
る薬物は内部カルシウムの増加させる。
【０１９９】 例４： アフリカツメガエル卵母細胞におけるｍＢＣＮＧ−１の機能的発現は天然ペー
スメーカー電流と同様の過分極−活性化カチオン電流を明らかにする。［脳の過
分極−活性化「ペースメーカー」チャンネルをコードする遺伝子の同定］ 緒言 心臓および脳におけるペースメーカー活性の精製は、環状ヌクレオチドによっ
て直接的に調節される過分極−活性化カチオンチャンネルによって媒介される。
我々は、従前に、カルボキシー末端環状ヌクレオチド結合ドメインを含有するマ
ウス脳（ｍＢＣＮＧ−１）からの電圧−ゲーテッドＫチャンネルファミリーの新
規メンバーをクローン化し、（Ｓａｎｔｏｒｏら、１９９７）、従って、それが
ペースメーカーチャンネル用の候補遺伝子であることを提案した。ｍＢＣＮＧ−
１の異種発現は、それが、脳においてペースメーカーチャンネルから区別され、
心臓におけるものと同様の特性を持つチャンネルにつき事実コードすることを示
す。ｍＢＣＮＧ−１に密接に関連した３つのさらなるマウス遺伝子および２つの
ヒト遺伝子は、脳および心臓を含めた異なる組織においてｍＲＮＡ発現のユニー
クなパターンを呈し、これらのチャンネルは広く発現された遺伝子ファミリーを
構成することを示す。
【０２００】 心臓および脳双方の電気活性はペースメーカーとして作用する特別化された細
胞に依存し筋肉活性、ある種の律動自立機能および特定の挙動状態を制御するこ
とができる活動電位の律動的自然発生ファイアリングを生じる。正常神経または
筋肉細胞において、ペースメーカー活性は細胞に固有であって、シナプス入力と
は独立した活動電位の自然発生ファイアリングによって特徴付けられる。ペース
メーカー活性の欠陥は遺伝した（Ｓｐｅｌｌｂｅｒｇ，１９７１）および獲得さ
れた（ＢｉｇｇｅｒおよびＲｅｉｆｆｅｌ，１９７９）心臓不整脈双方に至り、
また、種々の神経学的病気の基礎となり得る。
【０２０１】 これらの場合の多くにおいて、ペースメーカー活性は、ナトリウムおよびカリ
ウム双方に対して透過性であって、心臓（ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏ、１９９３）
および脳（Ｐａｐｅ，１９９６）双方に存在する過剰分局活性化チャンネルによ
って生じる。かかるカチオン透過性チャンネルは最初心臓洞房節細胞で記載され
（Ｂｒｏｗｎら、１９７９；ＹａｎａｇｉｈａｒａおよびＩｒｉｓａｗａ、１９
８０；ＢｒｏｗｎおよびＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏ、１９８０；ＤｉＦｒａｎｃｅ
ｓｃｏ、１９８６）、ここにそれらをＩｆまたはＩｈと呼ぶ。それらはそれ以来
心臓プルキニエ繊維（ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏ、１９８１）、心室筋肉（Ｙｕら
、１９９３）、および末梢（ＭａｙｒおよびＷｅｓｔｂｒｏｏｋ，１９８３）お
よび中枢神経（ＨａｌｌｉｗｅｌｌおよびＡｄａｍｓ，１９８２，レビューにつ
いてはＰａｐｐ，１９９６参照）において記載されており、ここにそれらをＩｈ またはＩｑと言う。心臓の洞房節細胞、最良の実験された例において、このペー
スメーカーチャンネルは心房および心室の律動的ファイアリングおよび鼓動を駆
動する（Ｂｒｏｗｎら、１９７９；ＹａｎａｇｉｈａｒａおよびＩｒｉｓａｗａ
、１９８０；ＢｒｏｗｎおよびＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏ、１９８０；しかし、Ｉ
ｒｉｓａｗａら、１９９３参照）。事実、アセチルコリンおよびノルエピネフリ
ンが心臓律動に対してその古典的な作用を発揮するのはこのペースメーカーチャ
ンネルの変調を介してである。
【０２０２】 脳においては、視床リレーニューロンにおけるペースメーカーチャンネル活性
の変調は睡眠−覚醒サイクルの間に刺激を調節するのに重要である（Ｐａｐｅお
よびＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，１９８９；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋおよびＢａｌ，１９９
７）脳幹核におけるペースメーカー活性は呼吸のリズムに寄与するようである（
ＪｏｈｏｎｓｏｎおよびＧｅｔｔｉｎｇ、１９９１；Ｄｅｋｉｎ，１９９３）。
最後に、高等皮質領域におけるペースメーカー活性は、ニューロン集団の活性を
同調させる（ＭａｃｃａｆｅｒｒｉおよびＭｃＢａｉｎ，１９９６，Ｓｔｒａｔ
ａら、１９９７）、知覚表示の別々の分析成分を一緒に結合させるために提案さ
れた同調（ＳｉｎｇｅｒおよびＧｒａｙ、１９９５）で重要で有り得る内因性発
振に寄与すると考えられる。ペースメーカー活性におけるこのチャンネルの役割
はその最良に特徴付けられた作用で有り得るが、それは非ペースメーキング細胞
における以下の過剰分局応答に続いて反動興奮に寄与し（Ｆａｉｎら、１９７８
；ＡｔｔｗｅｌｌおよびＷｉｌｓｏｎ，１９８０；ＷｏｌｌｍｕｔｈおよびＨｉ
ｌｌｅ、１９９２；ＨａｌｌｉｗｅｌｌおよびＡｄａｍｓ、１９８２；Ｍａｙｅ
ｒおよびＷｅｓｔｂｒｏｏｋ，１９８３）、さらなる機能的役割を有し得る。
【０２０３】 ペースメーカーチャンネルの１つの顕著な特徴は、その活性が第２メッセンジ
ャーｃＡＭＰを介して作用する神経伝達物質およびホルモンによって変調できる
ことである（Ｔｓｉｅｎ，１９７４；ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏおよびＴｏｒｔｏ
ｒｒａ，１９９１）。ｃＡＭＰレベルの上昇は、正の方向の２−１０ｍＶによる
ペースメーカーチャンネル活性化の電圧−依存性をシフトさせる。その結果、チ
ャンネルは、固定された負の電位への再分極化に際してより迅速かつより完全に
活性化する。事実、βアドレナリン作動性アゴニストに応答しての心拍の増加（
Ｂｒｏｗｎら、１９７９）および迷走神経刺激の間の心拍数の低下（ＤｉＦｒａ
ｎｃｅｓｃｏら、１９８９；Ｚａｚａら、１９９６）の原因であるペースメーカ
ー電流の活性化を変調させるのはｃＡＭＰの能力である。興味深いことには、ｃ
ＡＭＰの効果は洞房節細胞（ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏおよびＴｏｒｔｏｒｒａ，
１９９１）およびニューロン（ＰｅｂａｒｚａｍｉおよびＳｔｏｒｍ，１９９５
；ＩｎｇｒａｍおよびＷｉｌｌｉａｍｓ、１９９６）双方においてチャンネルへ
のその直接的結合を介して媒介されるようである。対照的に、Ｉｆは心臓プルキ
ニエ細胞においてＰＫＡ−依存性蛋白質リン酸化によって調節される（Ｃａｈｎ
ｇら、１９９１）。
【０２０４】 ペースメーカー活性は、細胞に固有であって、シナプス入力とは独立した神経
または筋肉細胞における活動電位の自然発生ファイアリングによって特徴付けら
れる。この自然発生ファイアリングは、過分極−活性化ペースメーカーチャンネ
ルのスイッチを入れることに関与すると考えられる遅いペースメーカー脱分極に
よって生じる（ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏ、１９９３）。かかるカチオンー透過性
チャンネルはまず心臓洞房節細胞で記載され（Ｂｒｏｗｎら、１９７９；Ｙａｎ
ａｇｉｈａｒａおよびＩｒｉｓａｗａ、１９８０；ＢｒｏｗｎおよびＤｉＦｒａ
ｎｃｅｓｃｏ、１９８０；ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏ、１９８６）、ここに、それ
らはＩｆまたはＩｈと呼ばれた。それらはそれ以来シナプスプルキニエ繊維（Ｄ
ｉＦｒａｎｃｅｓｃｏ、１９８１）、心室筋肉（Ｙｕら、１９９３）、および末
梢（ＭａｙｅｒおよびＷｅｓｔｂｒｏｏｋ，１９８３）および中枢ニューロン（
ＨａｌｌｉｗｅｌｌおよびＡｄａｍｓ、１９８２；レビューについてはＰａｐｅ
、１９９６参照）双方において記載されており、ここに、それらはＩｈまたはＩ ｑ と言う。
【０２０５】 ほとんどの電圧−ゲーテッドチャンネルとは異なり、ペースメーカーチャンネ
ルは、膜が活動電位の間に脱分極すれば閉じ、膜が負の電圧へと再分極する場合
にのみ開く。活動電位の再分極に際してのこれらのチャンネルのオープニングは
正に荷電したナトリウムイオンの流入を許し、自然発生ペースメーカー脱分極に
寄与する。もしこの脱分極が十分な振幅であれば、それは第２の活動電位をトリ
ガーすることができ、反復的、律動的な電気的活性に至るペースメーキングにお
けるこれらのチャンネルの役割を支持する多くの証拠があるが（ＤｉＦｒａｎｃ
ｅｓｃｏ、１９９３；１９９５；Ｐａｐｅ，１９９６）、それらの正確な定量的
寄与は依然として論争中である（Ｉｒｉｓａｗａら、１９９３；Ｖａｓｓａｌｌ
ｅ，１９９５）。
【０２０６】 ペースメーカーチャンネルの１つの顕著な特徴は、その活性が第２メッセンジ
ャーｃＡＭＰを介して作用する神経伝達物質およびホルモンによって変調できる
ことである（Ｔｓｉｅｎ、１９７４；ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏら、１９８６）。
ｃＡＭＰレベルの上昇は、正の方向の５−１０ｍＶによるペースメーカーチャン
ネル活性化の電圧−依存性をシフトさせる。その結果、固定された負の電位への
再分分極に際してチャンネルはより迅速かつより完全に活性化する。事実、βー
アドレナリン作動性アゴニストに応答しての心拍の増加（Ｂｒｏｗｎら、１９７
９）およびＡＣｈがムスカリン受容体刺激を通じて作用してｃＡＭＰレベルを減
少させる場合の迷走神経刺激の間の心拍の低下（ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏら、１
９８９；Ｚａｚａら、１９９６）の原因であるペースメーカー電流の活性化をス
ピードアップするのはｃＡＭＰの能力である。興味深いことには、ｃＡＭＰのこ
の効果は洞房節細胞（ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏおよびＴｏｒｔｏｒｒａ，１９９
１；ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏおよびＭａｎｇｏｉ，１９９４；Ｂｏｉｓら、１９
９７）およびニューロン（ＰｅｂａｒｚａｎｉおよびＳｔｏｒｍ，１９９５；Ｉ
ｎｇｒａｍおよびＷｉｌｌｉａｍｓ、１９９６）双方においてチャンネルへのそ
の直接的結合を通じて媒介されるように見える。対照的に、Ｉｆは心臓プルキニ
エ細胞におけるＰＫＡ−依存性蛋白質リン酸化によって調整される（Ｃｈａｎｇ
ら、１９９１）。
【０２０７】 ペースメーカー機能およびメカニズムの強い生理学的特徴付けにもかかわらず
、ペースメーカー脱分極を生じさせる原因である過分極、活性化カチオンチャン
ネルの分子性質は未だ同定されていない。いくつかの理由で、我々は、ペースメ
ーカーチャンネルに対する１つの候補遺伝子が、Ｓｒｃの神経特異的イソ形態の
ＳＨ３ドメインとのその相互作用に基づいてマウス脳ｃＤＮＡライブラリーから
元来はクローン化されたｍＢＣＮＧ−１であろうことを疑った（Ｓａｎｔｏｒｏ
ら、１９９７）。まず、ｍＢＣＮＧ−１（Ｓａｎｔｏｒｏらによって元々はＢＣ
ＮＧ−１と呼ばれた）の推定アミノ酸配列はそれが、異常ポアを持つ以外は、電
圧−ゲーテッドＫチャンネルのスーパーファミリーのメンバーであることを明ら
かにする（ＪａｎおよびＪａｎ、１９９７）。第２に、カルボキシ末端は、プロ
テインキナーゼのＣＮＢドメイン（ＳｈａｂｂおよびＣｏｒｂｉｍ、１９９２）
および環状ヌクレオチドーゲーテッドチャンネル（ＺａｇｏｔｔａおよびＳｉｅ
ｇｅｌｂｌｕｍ，１９９６）と相同である保存された環状ヌクレオチドー結合（
ＣＮＢ）ドメインを有する。これは、そのゲーティングが環状ヌクレオチドによ
って直接調節することができるのを示唆する。第３に、ｍＢＣＮＧ−１ ｍＲＮ
Ａおよび蛋白質は共に脳で広く発現される。
【０２０８】 ｍＢＣＮＧ−１は、電圧−ゲーテッドＫチャンネル（ＪａｎおよびＪａｎ、１
９９７）のスーパーファミリーのメンバーにつきコードする、ペースメーカーチ
ャンネルについての候補遺伝子であった（Ｓａｎｔｏｒｏら、１９９７）。この
チャンネルは、Ｓｒｃの神経特異的イソ形態（ｎ−Ｓｒｃ）のＳＨ３ドメインと
のその相互作用に基づいてマウス脳ｃＤＮＡライブラリから元来はクローン化さ
れた。チャンネル蛋白質およびｍＲＮＡは脳で広く発現される。ｍＢＣＮＧ−１
の推定アミノ酸配列（配列番号：２）（元来は、ＳａｎｔｏｒｏらによってＢＣ
ＮＧ−１と呼ばれた）は、カルボキシ末端、プロテインキナーゼのＣＮＢドメイ
ンに相同な環状ヌクレオチドー結合ドメイン（ＳｈａｂｂおよびＣｏｒｂｉｎ、
１９９２）および環状ヌクレオチドーゲーテッドチャンネル（Ｚａｇｏｔｔａお
よびＳｉｅｇｅｌｂａｕｍ，１９９６）を含有する。ｍＢＣＮＧ−１が、環状ヌ
クレオチドおよび脳におけるその広い分布によって直接的に調節することができ
る電圧−ゲーテッドチャンネルのサブユニットにつきコードするように見える事
実に基づき、ｍＢＣＮＧ−１は過剰−活性化カチオン電流のサブユニットにつき
コードすることが示唆された（Ｓａｎｔｏｒｏら、１９９７）。
【０２０９】 ここに、我々は、アフリカツメガエル卵母細胞におけるｍＢＣＮＧ−１の機能
的発現を報告する。パッチクランプレコーディングは、この遺伝子が、その４つ
の鍵となる特性において脳の内因性ペースメーカーチャンネルと同一であり、ま
た、心臓のそれに対してかなりの同様性を担持する過分極−活性化カチオンチャ
ンネルをコードすることを示す。さらに、我々は、マウス脳からのＢＣＮＧファ
ミリーの３つのさらなるメンバーを報告する（ｍＢＣＮＧ−２、３、４）。また
、これらの３つのさらなるクローンは心臓を含めた種々の組織で発現される。こ
の遺伝子の潜在的臨床的重要性のため、我々は、高度に保存され、ｍＢＣＮＧ−
１およびｍＢＣＮＧ−２に対して同様の発現パターンを示す２つのヒトクローン
を特徴付けた。かくして、ＢＣＮＧチャンネル遺伝子は脳のペースメーカーチャ
ンネルをコードするのみならず、それらは心臓を含めた種々の組織で広く発現さ
れるチャンネルのファミリーをコードし得る。
【０２１０】 結果 ｍＢＣＮＧ−１、電圧−ゲーテッドＫチャンネルのスーパーファミリーの新規
メンバーをコードする遺伝子の位置および推定アミノ酸配列は、脳に存在する過
分極−活性化ペースメーカータイプのチャンネルをコードするのではないかとい
うことを我々に示唆した。この考えを直接的にテストするために、我々は、アフ
リカツメガエル卵母細胞で発現されるｍＢＣＮＧ−１ ｃＤＮＡを合成し、無細
胞膜パッチで発現されたチャンネルの機能的特性を分析した。天然脳ペースメー
カーチャンネルは４つの区別される特性を有する：１）それは、過分極による遅
い反応速度で活性化され、２）それはＮａに対するＫにつき弱く選択するカチオ
ンチャンネルであり、３）それはＢａではなく外部Ｃｓによってブロックされ、
および４）それは細胞内ｃＡＭＰによって直接的に変調される。ｍＢＣＮＧ−１
の発現は、後記で示すごとく、これらの４つの特性の各々を持つチャンネルを生
じさせる。
【０２１１】 アフリカツメガエル卵母細胞におけるｍＢＣＮＧ−１の機能的発現は、天然ニ
ューロンペースメーカー電流と同様の過分極−活性化カチオン電流を明らかにす
る。
【０２１２】 ｍＢＣＮＧ−１ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞から得られたパッチは、天然ニ
ューロンペースメーカーで観察されたものに似た過分極−活性化電流を呈する。
膜が−４０ｍＶの保持電位から−８０ｍＶ未満のテスト電位に過分極されると、
これらの電流は活性化される（図１６Ａ、１６Ｂ）。低い負の電位での比較的遅
い時間経過にて内方電流にスイッチが入るが、その活性化速度は増大するレベル
の過分極でスピードアップする（図１６Ａ、１６Ｅ、１６Ｆ）。保持電位（−４
０ｍＶ）への復帰に際して、電流は比較的素早く脱活性化し、減衰する内方テイ
ル電流を生じる（図１６Ｃ）。
【０２１３】 −１３０ｍＶへの過分極過程は、典型的には、＞５０の異なるパッチの内で−
２０ｐＡないし−２００ｐＡの電流を活性化し、それより我々は記録した（５ｐ
Ａ未満の電流を持つパッチはしばしば観察されたが分析できなかった）。かかる
電流は未注入卵母細胞またはウシ杆体光受容体ＣＮＧチャンネル、ｃＧＭＰによ
って活性化される電圧−非依存性チャンネルをコードするｃＲＮＡを注入した卵
母細胞では観察されなかった。Ｉｆの単一チャンネルコンダクタンスは１ｐｓの
辺りであるので（ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏ，１９８６）、我々は、これらのパッ
チ（〜１−２μｍ２膜領域）が典型的には５０−１５００ｍＢＣＮＧ−１チャン
ネルを含有し、これはかなりのレベルの発現を示すと見積もった。低電流密度（
＜２ｐＡ）を呈する患者における識別される単一チャンネル電流の不存在は、天
然ペースメーカーチャンネルの小さな単一チャンネルコンダクタンスを呈するｍ
ＢＣＮＧ−１チャンネルと合致する。
【０２１４】 過分極に際しての活性化の経時および保持電位への復帰に際しての脱活性化の
経時は、共に、天然細胞におけるＩｆ電流で報告されているものと同様の特徴的
なシグモイド反応速度を示す（図１６Ｃ、１６Ｅ）（ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏ、
１９８４）。最初のラグに続き、活性化の経時は単一の指数関数によって近似さ
れ（図１６Ｅ）、その時定数は−１０５ｍＶにおける２９０±３７ｍｓ（平均値
±ｓ．ｅ．ｍ．，ｎ＝５）から−１３０ｍＶにおける９８±１４ｍｓ（ｎ＝５）
まで減少する（図１６Ｆ，表ＩＩＩ）。
【表３】
【０２１５】 表ＩＩＩ． ｍＢＣＮＧ−１の物理的特性の要約 対照。ボルツマン方程式からの定常状態活性化パラメーター：Ｖ１／２および
傾きについての平均値はテイル−電流活性化曲線に適合する；−１３０および−
１０５ｍＶへの過程についての活性化の時定数。ｃＡＭＰ。定常状態活性化曲線
のＶ１／２および傾きに対するｃＡＭＰの平均効果。ｃＡＭＰ前および洗浄後の
Ｖ１／２値を平均することによって測定したＶ１／２におけるシフト、次いで、
この平均値をｃＡＭＰの存在下（１、３０または３０００μＭ）におけるＶ１／ ２ 値から差し引く。傾きはｃＡＭＰの存在下での平均傾きを与える。２ｍＭ Ｃ
ｓ。ＣｓによるｍＢＣＮＧ−１電流の平均パーセントブロック。第２および第３
の線は各測定についての標準誤差および実験数を示す。
【０２１６】 活性化の定常状態電圧−依存性は、種々のテスト電圧に対する膜の過分極によ
って測定した（図１６Ｃ）。−４０ｍＶの保持電位への復帰に際しての減衰内方
テイル電流の相対的大きさは、先行する過分極の間の電流の分率活性化の尺度を
与える。ピークテイル電流振幅はテスト電圧についてのシグモイド依存性を示す
（図１６Ｄ）。それらは−８０ｍＶに対して負の電位で活性化し始め、−１１０
および−１２０ｍＶの間への過程で最大活性化に達する。ボルツマン方程式のこ
の関係への適合（実験手法参照）は、ｍＢＣＮＧ−１が半最大活性化される電圧
（Ｖ１／２＝−９９．９±０．８ｍＶ、ｎ＝５）ならびに電圧および活性化の間
の関係の傾き（−６．０±０．７ｍＶ、ｎ＝５についてのｅ−倍変化）の見積も
りを生じる。
【０２１７】 ｍＢＣＮＧ−１電流はＫおよびＮａによって運ばれる。
【０２１８】 天然ペースメーカーチャンネルはＮａよりもＫについて選択性が弱く、Ｎａお
よびＫの生理学的グラジエント下でほぼ−３０ｍＶの典型的な逆電位を呈する。
ｍＢＣＮＧ−１電流がカチオン導電性チャンネルによって事実媒介されることを
示すために、我々は、対称Ｃｌ濃度であるがその生理学的グラジエントを近似す
るＫおよびＮａの非対称の条件下でこれらの電流の逆電位を測定した（図１７Ａ
，１７Ｃ）。我々は、ｍＢＣＮＧ−１電流の逆電位は予測される値と非常に近い
−３１．８±１．６ｍＶ（ｎ＝４）で起こることを見いだした（図１７Ａ−Ｃ）
。添加したＣａの不存在下で前記測定が得られたので、我々は、次に、電圧−ゲ
ーテッドカルシウムチャンネルと同様に、外部Ｃａの存在下でこれらのチャンネ
ルがＣａ−選択的チャンネルに変換できる可能性を検討した（ＨｅｓｓおよびＴ
ｓｉｅｎ、１９８３）。しかしながら、我々は、１ｍＭ Ｃａの外部ＮａＣｌ溶
液への添加は、Ｃａ−選択的チャンネルで予測されるであろう、逆電位のいずれ
の正のシフトも引き起こさないことを見いだした（−３４．９±３ｍＶ、ｎ＝２
）。
【０２１９】 我々はｍＢＣＮＧ−１電流について測定した逆電位は、塩化物イオンによって
運ばれる電流について予測される０ｍＶの値から明らかに区別される。この点は
重要である。というのはアフリカツメガエル卵母細胞が、発現のそのレベルがｃ
ＲＮＡの発現に際して変化し得る内因性過分極−活性化Ｃｌチャンネルを含有す
るからである（Ｔｚｏｕｎｏｐｏｌｏｕｓら、１９９５）。ｍＢＣＮＧ−１チャ
ンネルを通じての電荷キャリアまたはｍＢＣＮＧ−１電流の我々の測定を汚染す
る電流いずれかとしてのＣｌの役割をさらに除外するために、我々はアスパルテ
ート、すなわちほとんどのＣｌチャンネルを透過しないアニオンによって内部Ｃ
ｌを置き換えた。これはＣｌ平衡電位を−７８ｍＶにシフトさせると予測される
。（天然Ｉｆチャンネルについて以前に報告されているもの（Ｆｒａｃｅら、１
９９２）と同様に）Ｃｌ置換はｍＢＣＮＧ−１電流の大きさを変化させたが、そ
れは逆電位において負のシフトを引き起こさなかった（図１７Ｂ，１７Ｃ；液体
接合電位またはＫイオン活性の変化によるであろう小さな正の電圧シフトが有る
得る）。かくして、ｍＢＣＮＧ−１は、事実、天然ＩｆおよびＩｈ電流と同様に
、ＫおよびＮａに対して透過性である過分極−活性化カチオンチャンネルをコー
ドすると結論された。測定された逆電位およびＧｏｌｄｍａｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ
−Ｋａｔｚ方程式に基づいて、該チャンネルは、天然ペースメーカーチャンネル
における比率と同様に、Ｎａに対するよりもＫに対して４倍透過性である。
【０２２０】 ｍＢＣＮＧ−１電流は外部Ｂａによってではなく外部Ｃｓによってブロックさ
れる。
【０２２１】 過分極−活性化チャンネルのいくつかの他のタイプからそれを区別するペース
メーカーチャンネルの特徴は、比較的低い濃度の細胞外Ｃｓによるブロックに対
するその感受性である（ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏ、１９８２；Ｎｏｍａら、１９
８３）。同時に、ペースメーカーチャンネルは外部Ｂａによるブロックに対して
比較的非感受性である（ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏ、１９８２）。我々は、ｍＢＣ
ＮＧ−１チャンネルが、外部カチオンに対するその感受性において天然ペースメ
ーカーチャンネルに類似していることを見いだした。かくして、ｍＢＣＮＧ−１
電流は、外部−外パッチの細胞外表面に適用された場合に２ｍＭ Ｃｓイオンに
よってほとんど完全にブロックされる（図１８Ａ−１８Ｂ；平均％阻害＝９２．
４±２．５，ｎ＝６）。この効果についての用量応答曲線は、ＩＣ５０が２００
μＭであり、ヒル係数が−１であることを示す（図１８Ｃ）。Ｃｓのブロッキン
グ作用とは対照的に、内向き整流器Ｋチャンネルおよび過分極活性化Ｃｌチャン
ネルをブロックする、外部溶液への１ｍＭ Ｂａの添加はほとんど効果がなかっ
た（図１８Ａ−Ｂ；平均パーセント阻害＝０±５％，ｎ＝３）。ｍＢＣＮＧ−１
チャンネルがＣｓによってかなりブロックされるという事実は、我々の電流測定
が外因性卵母細胞Ｃｌチャンネル（ＢａＲＩＳＨ，１９８３；Ｔｚｏｕｎｏｐｏ
ｌｏｕｓら、１９９５）またはストレッチー活性化カチオンチャンネル（Ｙａｎ
ｇおよびＳａｃｈｓ，１９９０）（そのいずれも外部Ｃｓによってブロックされ
ない）によっていずれかの有意な程度まで汚染されないことを示す。
【０２２２】 ｍＢＣＮＧ−１チャンネルはｃＡＭＰによって直接的に変調される。
【０２２３】 天然ペースメーカーチャンネルについての以前の研究は、無細胞内側−外パッ
チへのｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰの直接的適用が、活性化曲線のより正の
電位へのシフトのため、最大下過分極によって惹起されたＩｆ電流のサイズを増
加させることができることを示した（ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏおよびＴｏｒｔｏ
ｒａ、１９９１）。我々はｍＢＣＮＧ−１チャンネルでの定性的な同様の効果を
観察した（図１９Ａ−Ｃ）。かくして、内側−外パッチの内部表面へのｃＡＭＰ
の浴適用に応答して、１００ｍＶへの過程の間に内向き電流の大きさの可逆的な
増加がある。電流の該増加は１μＭ、３０μＭまたは３ｍＭ ｃＡＭＰに応答し
て観察される（図１９Ａ，図１９Ｂ）。
【０２２４】 ｃＡＭＰのこの効果は、２ｍＶだけのこれらのチャンネルの定常状態活性化曲
線の小さいが再現性のある正のシフトによる（図１９Ｃ；平均＝１．８±０．３
ｍＶ，ｎ＝５）。ｃＡＭＰのこの効果は小さいが、それは５パッチのうち５つで
終始観察され、統計学的に有意であることが判明した（Ｐ＜０．００１；対Ｔ−
検定）。さらに、ｃＡＭＰの洗浄後に我々が十分な活性化曲線を記録することが
できた４つのパッチにおいて、シフトは可逆的であることが示された。また、５
つの別々の実験からの個々の活性化曲線を平均して、ｃＡＭＰの存在または不存
在下いずれかで平均活性化曲線が得られる場合、電圧シフトが観察される（図１
９Ｃ）。平均手順は、異なるパッチ内での対照活性化曲線における小さな変動の
ためｃＡＭＰの効果を曖昧にする傾向があるが、曲線間の差異は依然として有意
である（Ｐ＜０．０５；一方を反復して測定する二方向ＡＮＯＶＡ、Ｆ（３，６
）＝１１．５６）。さらに、我々はここでｃＡＭＰで観察したシフトは、海馬（
ＰｅｄａｒｚａｎｉおよびＳｔｏｒｍ，１９９５）、すなわちｍＢＣＮＧ−１が
高度に発現される領域（Ｓａｎｔｏｒｏら、１９９７）におけるペースメーカー
チャンネルで観察されたシフトとほとんど同一である。内部溶液にはＡＴＰまた
はＧＴＰがなかったので、ｃＡＭＰは直接的にはチャンネルへの結合によって作
用するようである。
【０２２５】 前記観察に基づいて、我々は、ｍＢＣＮＧ−１発現に際して観察される過分極
−活性化電流が、天然脳ペースメーカーチャンネルと同様に、電圧−依存性、イ
オン選択性、イオンブロッキング特性および二次メッセンジャー変調にてのペー
スメーカーチャンネルの発現を表すと結論した。
【０２２６】 ＢＣＮＧ遺伝子のファミリーの同定 ｍＢＣＮＧ−１は脳でのみ発現されるので、我々は、他の関連遺伝子が心臓を
含めた異なる組織で発現し得るのではないかと考えた。我々は、ｍＢＣＮＧ−１
に相同な領域をコードする３つのさらなるマウスおよび２つのヒト遺伝子につき
部分的ｃＤＮＡクローンを単離した。２つのマウス遺伝子（ｍＢＣＮＧ−２およ
びｍＢＣＮＧ−３）を表す部分的ｃＤＮＡクローンは、全長ｍＢＣＮＧ−１産物
につきスクリーニングしつつ単離し、第４のマウス遺伝子（ｍＢＣＮＧ−４）な
らびに２つのヒト遺伝子（ｈＢＣＮＧ−１およびｈＢＣＮＧ−２）は、クエリー
としてのｍＢＣＮＧ−１の蛋白質配列を用い、ＥＳＴデータベース相同性サーチ
により同定した。同定されたｃＤＮＡクローンのさらなる延長は、引き続いて、
ライブラリスクリーニングまたはＲＴ−ＰＣＲクローニングによって得られた。
これまでに同定されたマウスおよびヒトＢＣＮＧ配列の模式図を図７Ａ−７Ｂに
掲げる。
【０２２７】 保存されたＢＣＮＧチャンネルファミリーの予測されるアミノ酸配列 ｍＢＣＮＧ−２、ｍＢＣＮＧ−３およびｍＢＣＮＧ−４がコードする蛋白質に
つきこれまで得られた、推定された、統合的部分配列を図８Ａ−８Ｂに示し、ｍ
ＢＣＮＧ−１の従前に報告されている全長配列に対して仮に整列させた（Ｓａｎ
ｔｏｒｏら、１９９７）。同定された配列の全て（ｍＢＣＮＧ−４を除く）は、
Ｓ１−Ｓ６膜貫通セグメント、荷電Ｓ４電圧−センサーおよびポアーライニング
Ｐループを含めた、電圧−ゲーテッドカリウムチャンネルの保存されたモチーフ
を含有する（ＪａｎおよびＪａｎ、１９９７）。加えて、全てのＢＣＮＧファミ
リーメンバーは、そのカルボキシ末端に保存された環状ヌクレオチド−結合ドメ
インを含有する。ｍＢＣＮＧ−１およびｍＢＣＮＧ−２が共にＰＫＡリン酸化に
対すコンセンサス部位内にあるその細胞質カルボキシ末端に存在するセリン残基
を含有し（図７Ａ−７Ｂ，矢印）、他方、ｍＢＣＮＧ−４はこの部位を含有しな
いのは興味深い。異なるチャンネル上のＰＫＡ部位の存在または不存在は、なぜ
に、心臓プルキニエ繊維チャンネルがＰＫＡリン酸化によって調節され（Ｃｈａ
ｎｇら、１９９１）、他方、洞房節チャンネルがｃＡＭＰによって直接調節され
る（ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏおよびＴｏｒｔｏｒａ、１９９１）かを説明するこ
とができる。
【０２２８】 ３つのマウス蛋白質は相互に密接に関連し、疎水性コア領域にわたって８４−
８６％の同様性を有する（アミノ酸１１１ないし４１９、ｍＢＣＮＧ−１に従っ
てナンバリング）。注目すべきは、ｍＢＣＮＧ−２およびｍＢＣＮＧ−３はいず
れかがｍＢＣＮＧ−１に対するよりも相互により密接に関連する（８９％同様）
。限定された整列が示すことができる限り、ｍＢＣＮＧ−４は群中で最も遠く関
連する蛋白質であるように見え（アミノ酸５２９ないし５９２）、ｍＢＣＮＧ−
１に対して７９％の同様性を有する。Ｓ１からＳ６膜貫通セグメンントを通って
延びる、ｈＢＣＮＧ−１蛋白質の３０８アミノ酸長コア領域はｍＢＣＮＧ−１に
対して１００％同一であり、他方、ｈＢＣＮＧ−２蛋白質のコア領域はｍＢＣＮ
Ｇ−２に対して９８％同様である。
【０２２９】 ＢＣＮＧ ｍＲＮＡ発現の組織分布 ノーザンブロット分析は、個々のクローンの各々についての組織分布の個々の
パターンおよび転写体における高い対応性および相同マウスとヒトクローンとの
間の局在を示した（図９Ａ、図９Ｂ、図１０Ａ−Ｄ）。区別されるアミノ末端プ
ローブ（プローブ「ｑ０」；Ｓａｎｔｏｒｏら、１９９７）を用いて以前に報告
されているごとく、ｍＢＣＮＧ−１の発現はかなり脳に限定されているようであ
る（図９Ａ−Ｄ；プローブ「ｑ１」，図７−Ｂ参照）。対照的に、ｍＢＣＮＧ−
２およびｍＢＣＮＧ−３は脳および心臓で発現される（図９Ａ−Ｄ）。また、ｍ
ＢＣＮＧ−３についてのハイブリダイゼーションシグナルは骨格筋および肺から
のポリＡ＋ＲＮＡで検出される。組織分布の区別されるパターンがｍＢＣＮＧ−
４で明らかにされ、これは肝臓で主として発現されるようであるが、脳、肺およ
び腎臓にも存在する（図９Ａ−Ｄ）。
【０２３０】 相同なマウスおよびヒトＢＣＮＧ遺伝子は機能的には類似するようである。と
いうのは、それらはノーザンンブロット分析によって明らかにされるごとく非常
に似た組織発現パターンを呈するからである。図１０Ａ−Ｄは、ｍＢＣＮＧ−１
ノーザンンブロットで観察されるものと同様に、ｈＢＣＮＧ−１配列内に設計さ
れたプローブがヒト脳ポリＡ＋ＲＮＡにおける４つの転写体を認識したことを示
す（図９Ａ−９ＤおよびＳａｎｔｏｒｏら、１９９７）。また、ヒト筋肉および
膵臓において弱いハイブリダイゼーションシグナルがｈＢＣＮＧ−１につき検出
される。ｈＢＣＮＧ−２配列に基づくプローブを用いるノーザンンブロット分析
は、ｍＢＣＮＧ−２の発現パターンとかなり合致する発現パターンを示した（図
１０Ａ−Ｄ；図９Ａ−９Ｄと比較されたし）。豊富な３．４ｋｄ転写体が脳で検
出され、同転写体は心臓にも存在する。
【０２３１】 マウス脳内でのｍＢＣＮＧ−１の分布の分析（Ｓａｎｔｏｒｏら、１９９７）
は、ｍＢＣＮＧ−１の最高発現が皮質、海馬および小脳で起こることを明らかに
した。また、異なる脳領域内のｈＢＣＮＧ−１ ｍＲＮＡのノーザンンブロット
分析は遺伝子の異なる発現を示し、最高レベルは皮質構造に存在する（海馬およ
び扁桃；図１０Ａ−Ｄ）。ｈＢＣＮＧ−２は全ての脳構造でより均一なレベルの
高い発現を示し、これはより不変的な役割を示す。特に、脳梁−由来のＲＮＡに
おける強力なハイブリダイゼーションシグナルは神経節細胞内でのｈＢＣＮＧ−
２の発現を示し得る。
【０２３２】 もし心臓で発現されたＢＣＮＧ−２およびＢＣＮＧ−３遺伝子が事実ペースメ
ーカーチャンネルをコードするならば我々は、それらが、ペースメーカーチャン
ネル活性が報告されている心臓組織で発現されることを予測するであろう。洞房
節は心臓の一義的なペースメーキング組織であるが、潜在的なペースメーカー活
性は心房（Ｔｈｕｒｉｎｇｅｒら、１９９２；Ｚｈｏｕら、１９９２）および心
室（Ｙｕら、１９９３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１９９７）筋肉双方で見いだされ
る。しかしながら、該節の外側の領域におけるチャンネルの活性化の電圧−依存
性は、通常は、非常に過分極した非生理学的電位までシフトする。心臓を通じて
のペースメーカーチャンネルの広く分布した出現のこの観察に従い、我々は、ｍ
ＢＣＮＧ−１ではなくｍＢＣＮＧ−２およびｍＢＣＮＧ−３を共に増幅するプラ
イマーが心室、心房および洞房節ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ産物を生じることを
見いだした（図２０Ａ）。心臓のこれらの領域の各々内におけるｍＢＣＮＧ−２
およびｍＢＣＮＧ−３の相対的発現を確立するために、我々はＲＴ−ＰＣＲ産物
に体してサザーンブロット分析を行った。ｍＢＣＮＧ−２またはｍＢＣＮＧ−３
を特異的に認識するプローブでのハイブリダイゼーションは、ＲＴ−ＰＣＲ産物
、従って分析された心臓領域内の支配的種はｍＢＣＮＧ−２であることを示す（
図２０Ｂ，Ｃ）。
【０２３３】 考察 脳についてのペースメーカーチャンネル遺伝子の同定 同定されたＢＣＮＧ遺伝子の区別される配列および分布は、ＢＣＮＧ産物が、
電圧−感知および環状ヌクレオチドー結合についての特徴的モチーフを持つ、イ
オンチャンネル蛋白質のファミリーを表すことを明らかにする。これらの遺伝子
は圧倒的に脳および心臓に位置する。アフリカツメガエル卵母細胞で発現させる
と、ｍＢＣＮＧ−１チャンネルは、その特性が心臓におけるペースメーカー電流
（Ｉｆ）のそれに密接に対応する過分極−活性化カチオンチャンネルを生起させ
る。我々は、心臓で発現されたＢＣＮＧチャンネルファミリーのメンバーが心臓
ペースメーカーチャンネルをコードするという直接的証拠を有しないが、組織分
布およびこれらの部分的ｃＤＮＡクローンと全長ｍＢＣＮＧ−１との配列同様性
は、それらが心臓チャンネルを十分にコードし得ることを示唆する。
【０２３４】 電圧−ゲーテッドＫチャンネルファミリーのメンバーは、一般に、４つのポア
ー形成サブユニットから構成されるテトラマーである（Ｍａｃｋｉｎｏｎ，１９
９１）。ｍＢＣＮＧ−１ ｃＲＮＡはそれ自身における機能的チャンネルの発現
に至るが、複数ＢＣＮＧ遺伝子の存在は、天然チャンネルがヘテロマルチマーで
あり得ることを示唆する。加えて、ＢＣＮＧチャンネルサブユニットは、該チャ
ンネルの機能を修飾する補助的非ポア形成βサブユニットと会合できる。ｍＢＣ
ＮＧ−１はそれがさらなるサブユニットと組み合わされた場合にｃＡＭＰによっ
てより潜在的に変調される可能性がある。あるいは、ｃＡＭＰが異なるＢＣＮＧ
ファミリーメンバーを変調する効率に固有の差異があり得る。この後者の可能性
を裏付けて、ＢＣＮＧ−１が圧倒的に発現される（図１０Ａ−Ｄ、Ｓａｎｔｏｒ
ｏら、１９９７）海馬ニューロンにおけるＩｈのｃＡＭＰ−依存性シフトは２−
３ｍＶにすぎず（ＰｅｄａｒｚａｎｉおよびＳｔｏｒｍ，１９９５）、ここに観
察された該シフトとほとんど同一である。これは、洞房節におけるＩｆについて
報告されている１０ｍＶシフト（ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏおよびＴｏｒｔｏｒａ
、１９９１）および知覚ニューロンにおけるＩｈの４−６ｍＶシフト（Ｉｎｇｒ
ａｍおよびＷｉｌｌｉａｍｓ、１９６６）とは対照的である。また、ｍＢＣＮＧ
−１の比較的迅速な活性化反応速度はそれを、より遅く活性化する心臓チャンネ
ルに対するよりも迅速に活性化された海馬チャンネル（Ｈａｌｌｗｅｌｌおよび
Ａｄａｍｓ，１９８２；Ｍａｃｃａｆｅｒｒｉら、１９９３；Ｐｅｄａｒｚａｎ
ｉおよびＳｔｏｒｍ，１９９５）に対してより同様とする。それは、ｃＡＭＰ効
率の差異が、ＢＣＮＧ−１およびＢＣＮＧ−２サブユニットの環状ヌクレオチド
結合ドメイン内のＰＫＡコンセンサス部位におけるセリン残基のリン酸化状態に
関連し得る興味深い可能性である。
【０２３５】 古典的電圧ゲーテッドチャンネルからの２つの重要な差異はｍＢＣＮＧ−１チ
ャンネルにその特徴的な特性を与える。
【０２３６】 ＢＣＮＧチャンネルおよび他の電圧−ゲーテッドＫチャンネル間の配列同様性
にもかかわらず、２つの重要な機能的差異がある。まず、ほとんどの電圧−ゲー
テッドＫチャンネルは通常は脱分極によって活性化される。ｍＢＣＮＧ−１の反
対の電圧−依存性極性が、かなり荷電した塩基性Ｓ４−電圧−感知ドメインの存
在にもかかわらず起こる。第２に、Ｋチャンネルファミリーのほとんどのメンバ
ーはＮａイオンよりもＫイオンについて少なくとも１００倍選択的であるが、天
然ペースメーカーチャンネルと同様に、ｍＢＣＮＧ−１チャンネルはカリウムー
対−ナトリウムにつき４倍選択的であるに過ぎない。しかしながら、ＢＣＮＧチ
ャンネルは他のＫ選択的チャンネルのＰ領域と同様であるＰ領域を含有する。我
々は、これらの差異の可能なメカニズムを以下に考察する。
【０２３７】 Ｓ４セグメントの存在にもかかわらず脱分極よりもむしろ膜過分極に際してど
のようにしてＢＣＮＧチャンネルが活性化できるのであろうか？電圧−依存性活
性化の同様の逆転極性が、植物のＳ４−含有ＫＡＴ１電圧−ゲーテッドカリウム
チャンネルで報告されている（Ｓｃｈａｃｈｔｍａｎら、１９９４）。ＫＡＴ１
およびｍＢＣＮＧ−１チャンネルの電圧−ゲーティング特性を説明することがで
きる１つの比較的簡単なメカニズムが、通常は迅速に活性化し、次いで脱分極に
際して迅速に不活化されるＳｈａｋｅｒ ＫチャンネルについてのＭｉｌｌａｒ
およびＡｌｄｒｉｃｈの研究（１９９６）によって提案されている。これらの著
者は、活性化ゲーティング反応を非常に負の電位（静止電位より十分未満）にシ
フトするＳ４点突然変異がＳｈａｋｅｒ Ｋチャンネルを過分極−活性化チャン
ネルに形質転換したことを示した。静止電位の近くの電圧では、突然変異体チャ
ンネルの活性化ゲートは開いた立体配置であっても、チャンネルは不活化反応に
より閉じている。活性化ゲートを閉じるのに十分には負でない中程度の過分極は
、不活化ゲートを開かせることによってチャンネルを開く。過分極に際してのＢ
ＣＮＧチャンネルの開口は不活化の同様の除去を反映し得た。
【０２３８】 ｍＢＣＮＧ−１チャンネルのより低いＫ選択性は、Ｐ領域における鍵となる位
置でのいくつかの非保存的変化を反映できた。かくして、該チャンネルはＫチャ
ンネル選択性配列の主要な一部を形成するＧＹＧモチーフを含有するものの、Ｇ
ＹＧトリプレットに対して２残基だけＮ末端側にある保存されたトレオニン残基
はＢＣＮＧチャンネルにおいてはシステインに変化している。この保存されたト
レオニンは、細菌ｋｃｓａチャンネルのＸ−線結晶構造におけるＫ選択性フィル
ターの一部を形成することが示されている（Ｄｏｙｌｅら、１９９８）。さらに
、（ＧＹＧトリプレットに対して直ぐ）Ｃ末端側の高度に保存されたアスパルテ
ートはＢＣＮＧクローンにおいてはアラニンまたはアルギニンである。
【０２３９】 ペースメーカー電流の病気における役割 翻訳後修飾によるＢＣＮＧチャンネル機能の変化、遺伝子発現の変化、または
遺伝的突然変異は、自動性の遺伝したまたは獲得した神経学的障害または病気の
基礎であり得るか？ＢＣＮＧ遺伝子がＣＮＳおよび、恐らくは、心臓ペースメー
カーチャンネルをコードするという我々の同定にて、今や、ある種のファミリー
洞律動病（Ｓｐｅｌｌｂｅｒｇ，１９７１）がペースメーカーチャンネルにおけ
る一次的欠陥によるものか否かを決定することができる。また、ペースメーカー
チャンネル機能における欠陥が、心房細動、洞頻脈および徐脈に関連する病的洞
症候群（ＢｉｇｇｅｒおよびＲｅｉｆｆｅｌ，１９７９）、および心不全に関連
する心室不整脈（Ｃｅｂａｌら，１９９４；１９９７）のごとき心臓の後天性病
気に貢献し得る。
【０２４０】 領域的特異的チャンネルをコードする多重遺伝子の存在は、例えば、脳ペース
メーカーチャンネルよりもむしろ心臓を特異的に標的化するであろう治療剤を開
発する興味深い可能性を提供する。その結果、刺激および恐らくは知覚意識につ
いての脳におけるペースメーカー活性の重要性はこれらの脳チャンネルを薬理学
的操作のための興味深い標的とするであろう。最後に、脳および心臓双方におけ
る電気的活性でのペースメーカーチャンネルの正確な役割に関する論争は、今や
、マウス遺伝学の強力なアプローチに適用すべきである。
【０２４１】 実験手法 ライブラリースクリーニングおよびＲＴ−ＰＣＲクローニング 組換えＤＮＡ手法を含めたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ラムダファー
ジおよび核酸の標準的操作は実質的に記載されているごとくに行った（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら、１９８９）。
【０２４２】 ｍＢＣＮＧ−２ ｃＤＮＡの最初の断片は、全長ｍＢＣＮＧ−１ ｃＤＮＡを
単離するために設計したＰＣＲ反応の産物としてクローン化した（Ｓａｎｔｏｒ
ｏら，１９９７）。この断片はｍＢＣＮＧ−２配列の２３４−４３０に対応し（
ここのおよび全体を通じてナンバリングはｍＢＣＮＧ−１に従う、図８Ａ−８Ｂ
参照）、これを用いて、高ストリンジェンシーにてマウス脳λｇｔ１０ライブラ
リー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ（登録商標） ＭＬ ３０００ａ）をスクリーニングし
、ｍＢＣＮＧ−２のＮ−末端一部を得た（クローン１１−λ１）。同一λｇｔ１
０ライブラリースクリーニングから、弱く反応するプラークも同定され（クロー
ン１５−７）、これは引き続いて第３の区別される遺伝子を表すことが示された
（ｍＢＣＮＧ−３）。
【０２４３】 マウスおよびヒトＥＳＴデータベースにおけるＢＬＡＳＴサーチは、２つのマ
ウスＢＣＮＧ遺伝子（Ｍ４１−ＥＳＴ，ｇｂ ＡＡ０２３３９３；Ｍ２８−ＥＳ
Ｔ，ｇｂ ＡＡ２３８７１２）および２つのヒトＢＣＮＧ遺伝子（Ｈ５７−ＥＳ
Ｔ，ｇｂ Ｈ４５５９１；Ｈ６１−ＥＳＴ，ｇｂ Ｎ７２７７０）の断片である
ように見える４つのＥＳＴクローンを明らかとした。これらの配列内にオリゴヌ
クレオチドを設計し、ＢＣＮＧクローンの保存された領域において設計されたオ
リゴヌクレオチドと一緒に使用してマウスまたはヒトポリＡ＋ＲＮＡからのＲＴ
−ＰＣＲ産物を得た（後記参照）。ＲＴ−ＰＣＲ産物を配列決定し、重複した領
域を比較して、ＥＳＴおよび周知のＢＣＮＧクローンの間の対応性を確立した（
図５参照）。Ｍ２８−ＥＳＴクローンは従前に同定されたＢＣＮＧ ｃＤＮＡか
らの第４の区別される遺伝子を表すようであった。Ｍ２８−ＥＳＴクローンの完
全な配列決定は、該クローンの３’末端のみがＢＣＮＧ配列と整列することを明
らかとした；６３２位の５’側の配列はイントロンを表すようであり、停止コド
ンは８６９位に存在する。
【０２４４】 ヒト脳λｇｔ１０ライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ（登録商標）、ＨＬ ３０
２２ａ）はＨ６１−ＥＳＴクローン（プローブ「Ｈ６１」；後記および図７Ａ−
Ｃ参照）に由来する断片でスクリーニングし、位置番号５８７におけるアミノ酸
までのｈＢＣＮＧ−２配列のＮ−末端領域を得た。
【０２４５】 以下のオリゴヌクレオチドにてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ（登録商標））を用い、マ
ウス脳およびマウス心臓（ＣＬＯＮＴＥＣＨ（登録商標）、６６１６−１および
６６１１−１）からのポリＡ＋ＲＮＡ調製物につきＲＴ−ＰＣＲ反応を行った（
９４℃での４５秒、５５℃での３０秒間および７２℃での２分間を２５回）。 Ｂ１２３ ５’ＣＡＧＴＧＧＧＡＡＧＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＣＡＴＧＡＣＣ３’
（配列番号２３）（アミノ酸２６９−２８８に対応）および４１ＲＥＶ５’ＧＡ
ＴＣＡＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＴＧＴＧＣＡＧＣＡＡＧ３’（配列番号２４）（ア
ミノ酸５９０−５９８に対応）または２８ＲＥＶ５’ＣＡＣＣＫＣＲＴＴＧＡＡ
ＧＴＧＧＴＣＣＡＣＧＣＴ３’（配列番号２５）（アミノ酸５５４−５６１に対
応） ヒト遺伝子については、以下のオリゴヌクレオチドを用い、ヒト脳およびヒト
心臓（ＣＬＯＮＴＥＣＨ（登録商標）、６５１６−１および６５３３−１）から
のポリＡ＋ＲＮＡにつき反応を行った（９４℃における４５秒、５８℃における
２０秒、および７２℃における７２分の２５回）。
【０２４６】 ＭＢ１−３ ５’ＡＴＧＴＴＣＧＧＳＡＧＣＣＡＧＡＡＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧ
３’（配列番号２６）（アミノ酸１０２−１１０に対応）およびＨ５７．Ｃ ５
’ＣＡＧＣＴＣＧＡＡＣＡＣＴＧＧＣＡＧＴＡＣＧＡ３’（配列番号２７）（ア
ミノ酸５３７−５４４に対応） ＢＣＮＧ−２／３転写体の心臓領域局所化については、オリゴヌクレオチドを
用い、ウサギ心臓の心室、心房または洞房節から単離されたポリＡ＋ＲＮＡで反
応を行った。
【０２４７】 ＢＣＮＧ−２／Ｆ２ ５’ＧＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＧＴＣＡＡＧＴＣＧＧＣ
Ｇ３’（配列番号３５）（アミノ酸１１２−１１９に対応）およびＢＣＮＧ−２
／Ｒ２ ５’ＧＡＡＧＡＴＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧＧＧＧＧＡＴＧＧＡ３’（配列
番号３６）（アミノ酸２１８−２２５に対応） 異なるファミリーメンバー内の認識の特異性を決定するために。同一オリゴヌ
クレオチドを、ｍＢＣＮＧ−１、２または３ｃＤＮＡをコードしたプラスミドＤ
ＮＡで用いた（図９Ａの脚注参照）。これらのプラスミドはランダムプライミン
グ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標））によって標識し、サザーンブロット分
析のためのプローブとして用いた。
【０２４８】 ノーザンブロット マウス遺伝子発現実験では、マウス多重組織ノーザンブロット（ＣＬＯＮＴＥ
ＣＨ（登録商標）、７７６２−１）を、ｍＢＣＮＧクローンの以下の領域を表す
ＰＣＲ産物でプローブした（図７Ａ−７Ｂにおける模式的表示および図８Ａ−８
Ｂにおけるアミノ酸ナンバリング参照）。 ｍＢＣＮＧ−１：プローブ「ｑ１」（アミノ酸５９４−７２０に対応；Ｓａｎｔ
ｏｒｏら，１９９７）； ｍＢＣＮＧ−２：プローブ「ｄＡ」（アミノ酸２３４−４３０に対応） ｍＢＣＮＧ−３：プローブ「１５−７」（スタートから３１９位までのｍＢＣＮ
Ｇ−３配列に対応） ｍＢＣＮＧ−４：プローブ「Ｍ２８」（ｍＢＣＮＧ−４配列のアミノ酸５２９−
６０７プラスｍＢＣＮＧ−４ ３’ＵＴＲの１８０ｎｔに対応；このプローブは
ＥＳＴ−Ｍ２８ ＤＮＡからのゲル精製ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ制限断片４００
ｂｐとして得られた。） ヒト遺伝子発現実験では、ヒト複数組織ノーザンブロット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ
（登録商標）、７７６０−１）またはヒト脳複数組織ノーザンブロット（ＣＬＯ
ＮＴＥＣＨ（登録商標）、７７５０−１）を以下のＰＣＲ産物でプローブした。 ｈＢＣＮＧ−１：プローブ「Ｈ５７」（５３７−８００に対応） ｈＢＣＮＧ−２：プローブ「Ｈ６１」（４５２−６３４に対応） ハイブリダイゼーションは製造業者のプロトコルハンドブックに示されたごと
く、全て、６８℃にて、１時間、ＥＸＰＲＥＳＳＨＹＢ（登録商標）溶液（ＣＬ
ＯＮＴＥＣＨ（登録商標））中で行った。ブロットを２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤ
Ｓ中、室温にて１０分間洗浄し、続いて０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６
５℃にて３０分間２回洗浄した。０．５％ＳＤＳ／Ｈ２Ｏ中で５分間沸騰するこ
とによって、フィルターを引き続いてのハイブリダイゼーションの間にストリッ
プした。
【０２４９】 電気生理学的記録 ｍＢＣＮＧ−１をｐＳＤ６４ＴＲ発現ベクターにサブクローンしした。ＳＰ６
ＲＮＡポリメラーゼ（Ｍｅｓｓａｇｅ Ｍａｃｈｉｎｅ（登録商標）、Ａｍｂ
ｉｏｎ（登録商標））を用いてＲＮＡをＢａｍＨＩ−線状化ＤＮＡから転写し、
従前に記載されているごろく（Ｇｏｕｌｄｉｎｇら、１９９２）調製したアフリ
カツメガエルの卵母細胞に注入した。
【０２５０】 パッチクランプ記録は、ｃＲＮＡ注入３−７日後に無細胞内側−外および外側
パッチから成した。データは、Ａｘｏｐａｔｃｈ２００Ａまたは２００Ｂ積分パ
ッチクランプ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（登録商標），ＵＳＡ
）を用いて獲得した。これらの実験の全てにおける保持電位は−４０ｍＶであっ
た。簡単のために、用いた溶液の略語記載のみを、テキストおよび図面の簡単な
記載で与え、十分な記載を以下に与える。
【０２５１】 ＫＣｌ−ＥＧＴＡ溶液は：１０７ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４，ＫＯＨ），１ｍＭＥＧＴＡを含有した。ＮａＣｌ
−ＥＧＴＡ溶液は１０７ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＨＥＰＳ
（ｐＨ７．４，ＭａＯＨ）、１ｍＭ ＥＧＴＡを含有した。ＫＣｌ／ＮａＣｌ−
ＥＧＴＡおよびＫＣｌ／ＮａＣｌ−ＣａＣｌ２溶液は：各々、１ｍＭ ＥＧＴＡ
または１ｍＭ ＣａＣｌ２いずれかと共に８２ｍＭ ＫＣｌ，３０ｍＭ ＮａＣ
ｌ，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４，ＫＯＨ）を含有した。いくつかの実験
において、我々は、Ｃｌを以下のＫＡｓｐａｒｔａｔｅ−ＥＧＴＡ溶液中のアス
パルテートで置き換えた：１０７ｍＭ Ｋ−Ａｓｐａｒｔａｔｅ、５ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４，ＫＯＨ），１ｍＭ ＥＧＴＡ。適当
な場合、ＮａＣｌのイソーオスモル置換によって細胞内溶液にＮａ−ｃＡＭＰを
含ませ、他方、各々、ＮａＣｌまたはＣａＣｌ２のイソ−浸透圧置換によって示
された細胞外溶液にＣｓＣｌおよびＢａＣｌ２を含ませた。３Ｍ ＫＣｌ寒天ブ
リッジ電極によって、Ａｇ−ＡｇＣｌ接地ワイアを浴溶液に結合した。最大の補
償接合電位は３．４ｍＶであると測定された。電圧はこの相殺を説明するように
修正されなかった。全ての記録は室温（２２−２４℃）で得た。
【０２５２】 ｐＣｌａｍｐ（登録商標）ソフトウェア（ｖ ６．０，ＡＸＯＮ ＩＮＳＴＲ
ＵＭＥＮＴＳ（登録商標），Ｎ＝８）およびＰｅｎｔｉｕｍ １００ ｍＨｚ
ＰＣコンピュターまたはＰｕｌｓｅソフトウェア（ｖ ８．１１，Ｈｅｋａ，Ｎ
＝１０）およびＭＡＣＩＮＴＩＯＳＨ ＣＥＮＴＲＩＳ ６５０コンピューター
を用い、Ｐ／Ｎプロトコルを使用して電圧クランププロトコルを適用して補償さ
れない直線リークおよびキャパシタンスを差し引いた。特に示さない限り、デー
タは１．２５ｋＨｚ（８極Ｂｅｓｓｅｌフィルター、Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｄｅ
ｖｉｃｅｓ９０２）においてローパス濾過し、ＴＬ−１ ＤＭＡインターフェイ
ス（ＡＸＯＮ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ（登録商標））またはＩＴＣ−１６イン
ターフェイス（ＩＮＳＴＲＵＴＥＣＨ ＣＯＲＰ．（登録商標））いずれかを用
い２．５ｋＨｚでデジタル化した。分析は、ｐＣｌａｍｐ（ｖ ６．０，ＡＸＯ
Ｎ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ（登録商標））、Ｐｕｌｓｅ（ｖ ８．１１，Ｈｅ
ｋａ）またはＳｉｇｍａｐｌｏｔ（ｖ ４．０ ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．）を用いて
行った。
【０２５３】 電流−電圧の関係は、３秒電圧段階において定常状態電流を測定することによ
って得た（電流は２．５秒ないし２．９５秒の間で平均した）。定常状態活性化
曲線は、−４０ｍＶへの引き続いての脱分極電圧段階に際して観察されたテイル
電流の振幅から決定した（電流は−４０ｍＶへの復帰に続く４−１０ミリ秒の間
を平均した）。電流値は過分極段階電圧に対してプロットし、ボルツマン方程式
： Ｉ（Ｖ）＝Ａ１＋Ａ２／｛１＋ｅｘｐ［−（Ｖ−Ｖ１／２）／傾き］」｝ ［式中、Ａ１はオフセットであり、Ａ２振幅であり、ＶはｍＶで表した電圧であ
り、Ｖ１／２は活性化中点電圧である］ に適合させた。データおよび適合させたボルツマン関数を、次いで、該適合の
最大振幅に正規化した。活性化時定数は、最初のラグ後に電流の上昇相に単一の
指数関数を適合させることによって決定した。
【０２５４】 異なるイオン条件下で逆電位を測定するために、−４０ｍＶに保持した内側−
外パッチを３００ミリ秒の間に−１３０ｍＶにステップさせ、次いで５ｍＶ増分
にて−６０ないし＋２０ｍＶの範囲の一連のテスト電位にステップバックさせた
。テイル電流のテイル振幅は、テスト電位への段階後、２および４ミリ秒の間の
データを平均することによって測定した。外部ＣｓおよびＤａに対するｍＢＣＮ
Ｇ−１電流の感度は、外側−外パッチクランプ立体配置を用い、−１３０ｍＶへ
の１秒ステップの終わりにおいて定常状態電流値を測定することによって決定し
た（電流は８００ミリ秒ないし９９０ミリ秒の間を平均した）。これらの一連の
実験の双方において、Ｓｙｌｇａｒｄで電極を被覆してピペットキャパシタンス
を最小化し、データは２．５ｋＨｚで濾過し、５ｋＨｚでサンプリングした。
【０２５５】 カルシウムを添加しないＥＧＴＡ（１ｍＭ）を内部溶液に含ませることによっ
て、卵母細胞膜（Ｂａｒｉｓｈ、１９８３）中の内因性Ｃａ−活性化Ｃｌチァン
ネルからの汚染を最小化した。また卵母細胞はその大きな単一チャンネルコンダ
クタンンス（６０ｐＳ）によって認識することができるストレッチー活性化カチ
オンチャンネルを含有する（ＹａｎｇおよびＳａｃｈｓ、１９９０）。かかるチ
ャンネル活性を含有するパッチは実験しなかった。
【０２５６】 例５：ＢＣＮＧチャンネルサブユニットおよび候補蛋白質の共発現 ＢＣＮＧ蛋白質またはＢＣＮＧ−関連蛋白質はヘテロマルチマー蛋白質を形成
することができる。新規なＢＣＮＧサブユニットの機能的役割を解明するために
、新規なＢＣＮＧサブユニットを重複する組織分布を有するＢＣＮＧサブユニッ
トと共発現させる。電圧−ゲーテットＫ＋チャンネルおよび環状ヌクレオチドー
ゲーテットチャンネルは共にヘテロマルチマーを形成する。ある場合には、サブ
ユニットは完全に区別される蛋白質とで複合体を形成することができる（例えば
、ＭｉｎｋとでＫｖＬＱＴ１−（Ｂａｒｈａｍｉｎら、１９９６）；Ｍｉｎｋと
でＨＥＲＧ（ＭｃＤｏｎａｌｄら、１９９７）；スルホニル尿素受容体とでＩｒ
Ｋ６．１およびＩｒＫ６．２（Ｉｓｏｍｏｔｏら、１９９６；Ｉｎａｇａｋｉら
、１９９６）。ＢＣＮＧ蛋白質はＭｉｎｋまたはＥＲＧ様サブユニットのごとき
サブユニットで組み立てることができる。候補蛋白質は、重複した組織分布およ
び既知の機能的特性に基づく見込みをベースとして選択される。例えば、Ｋｖ１
．２は細胞下レベルにおいてさえｍＢＣＮＧ−１での重複分布を示す（Ｓｈｅｎ
ｇら、１９９４；Ｗａｎｇ他、１９９４）。
【０２５７】 ポリＡ＋ｍＲＮＡとの共発現 もしもう１つの蛋白質がＢＣＮＧチャンネル蛋白質とで機能的ヘテロマルチマ
ーを形成できるならば、（ノーザンブロット分析によって示されるごとく）適当
なＢＣＮＧサブユニットが発現される組織（例えば、心臓、脳、筋肉または腎臓
）からのサイズ分画ｍＲＮＡとの共発現の結果、ＢＣＮＧ ＲＮＡを組織からの
ｍＲＮＡと一緒に注入した場合、電気生理学的電流中にユニークな電流が生じる
。
【０２５８】 発現されたＢＣＮＧチャンネルの機能的特性を修飾するサブユニットをクロー
ンするための別の戦略は、ＢＣＮＧ遺伝子に由来するヌクレオチドプローブを用
いる適当なライブラリーの低ストリンジェンシー相同性スクリーニングまたはＢ
ＣＮＧ遺伝子に基づく縮重オリゴヌクレオチドを用いるゲノムまたはｃＤＮＡか
らのＰＣＲ増幅を含む。
【０２５９】 同定されたＢＣＮＧファミリーメンバーとで組み立てることができる他のチャ
ンネルサブユニット蛋白質を担持するためのさらにもう一つの方法は、酵母２ハ
イブリッド系を用いることである（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｕｇ，１９８９）。
この系をまず用いて、ｎ−ＳＲＧ ＳＨ３ドメインとのその相互作用に基づいて
ｍＢＣＮＧ−１をクローンする（例１参照）。ＢＣＮＧチャンネル蛋白質からの
保存された細胞質Ｎ−およびＣ−末端ドメインを酵母２ハイブリッド系において
「餌」として用いる。Ｎ−およびＣ−末端断片を適当なプラスミド（例えば、ｐ
ＥＧ２０２）にサブクローンする（Ｚｅｒｖｏｓら、１９８３）。ＢＣＮＧファミリーメンバーの配列：マウス及びヒトのＢＣＮＧクローンのＤＮ Ａ及び予測されるアミノ酸配列 マウスの配列 ｍＢＣＮＧ−１のＤＮＡ及び予測されるアミノ酸配列 これらのマウスの配列は、得られたオリジナルのＤＮＡ及び予測されたアミノ
酸配列とＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＡＦ０２８７３７のＤＮＡ及びアミノ酸配列で
ある。
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【化２３】
【化２４】
【化２５】
【化２６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｍＢＣＮＧ−１の一次構造を示す図（ｍＢＣＮＧ−１ ｃＤＮＡによってコー
ドされる推定アミノ酸配列（配列番号２）。Ｋ＋チャンネルの６つの膜貫通ドメ
イン（Ｓ１−Ｓ６）及びポア（Ｐ）と相同な７つの疎水性ドメインが示されてい
る（ ）。推定環状ヌクレオチド結合部位（ＣＮＢ）が、（− − −）によっ
てマークされており、Ｃ末端のプロリン（．．．）、推定細胞外局在部（＊）を
有するコンセンサスＮグリコシル化部位もマークされている）。
【図２】 ｍＢＣＮＧ−１の一次構造を示す図（ｍＢＣＮＧ−１の推定アミノ酸配列のＫ
ｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパチープロット。該プロフィールは、７
アミノ酸のウィンドウサイズで、ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｅｌｅの方法によっ
て作成した。一番上の線の上にある数字は、ｍＢＣＮＧ−１配列中の位置を示し
ている。Ｓ１〜Ｓ６に対応する疎水性領域とＰ領域は、ゼロ線より下にあるが、
Ｎ−グリコシル化部位（＊）は、Ｓ５とＰの間の疎水性領域にある。数字（一番
上の線）は、ｍＢＣＮＧ−１配列中の位置を示している。７残基のウィンドウサ
イズで作成されたプロフィール。）。
【図３】 ｍＢＣＮＧ−１の推定Ｐ領域とショウジョウバエＥａｇ（ＤＥＡＧ）、マウス
Ｅａｇ（ＭＥＡＧ）、ヒトＥｒｇ（ＨＥＲＧ）の推定Ｐ領域、ウシ網膜ＣＮＧチ
ャンネル（ＢＲＥＴ−１）のαサブユニット、及びヒト網膜ＣＮＧチャンネル（
ＨＥＲＴ−２）のβサブユニットとを複数並置した図（矢印は、残基３４４と３
５２をマークしている（例１参照））、及びＢＣＮＧ−１の（ＣＮＢ）とラット
の嗅覚ＣＮＧチャンネル（ＲＯＬＦ−１）、ウシｃＧＭＰ依存性プロテインキナ
ーゼ（ＰＫＧ）、ウシｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）、及び大腸
菌のカタボライトアクチベータータンパク質（ＣＡＰ）の対応する部位とを並置
した図（実線は、ＣＡＰの二次構造エレメントのαヘリックス（α）及びβスト
ランド（β）エレメントを示しており、アスタリスクは、ＣＡＰ結晶構造中でｃ
ＡＭＰ分子と近接して存在していると思われる特定のアミノ酸を示している）。
【図４】 ｍＢＣＮＧは、１３２ｋＤａのグリコシル化されたタンパク質である。マウス
脳抽出物中のＢＣＮＧ−１タンパク質のウェスタンブロット分析を示す図（スト
リップごとに全脳ＳＤＳ抽出物１０μｇをロードした後、αｑ１（１）若しくは
αｑ２（３）抗血清でプローブし、又はＧＳＴ−ｄ５融合タンパク質を予め吸着
させた抗血清αｑ１（２）若しくはαｑ２（４）でストリップ２をプローブした
。矢印は、ネイティブｍＢＣＮＧ−１タンパク質に対応する特定のシグナルの位
置をマークしている。）、及びαｑ１抗血清を用いた、全脳抽出物（１）、Ｎ−
グリコシダーゼＦで前処理した全脳抽出物（２）、及びインビトロ翻訳されたｍ
ＢＣＮＧ−１タンパク質（３）に対するウェスタンブロットを示す図（分子量標
準の位置が、左側に示されている。ｍＢＣＮＧ−１に対する抗血清でテストされ
、マウス脳中のｍＢＣＮＧ−１タンパク質の広範な発現を示している、表記され
ている各脳組織からのタンパク質１０μｇを含有するウェスタンブロットも示さ
れている。）。
【図５】 αｑ１との反応性を示す図、及びαｑ２との反応性を示す図。
【図６】 様々なマウス組織におけるｍＢＣＮＧ−１発現のノーザンブロット分析を示す
図（以下の各組織から得たポリ（Ａ）＋ＲＮＡ２μｇを使用した：心臓（Ｈ）、
脳（Ｂ）、脾臓（Ｓ）、肺（Ｌｕ）、肝臓（Ｌｉ）、骨格筋（Ｍ）、腎臓（Ｋ）
、及び精巣（Ｔ）をロードした。ｍＢＣＮＧ−１配列のアミノ酸６−１３１をコ
ードするＤＮＡ断片を用いて、該フィルターをプローブした。アミノ酸５９４−
７２０に対応するプローブは、同じバンドを認識し、λｇｔ１０及びｐＪＧ４−
５ライブラリーから単離されたｃＤＮＡ断片が、隣接するｍＲＮＡ配列から得ら
れたことが確認された。分子量標準の位置は、左側に示されている。）。
【図７】 脳中でのｍＢＣＮＧ−１発現のインシチュハイブリダイゼーション分析を示す
図（ｍＢＣＮＧ−１配列のアミノ酸６４８−６５７に対応するｍＲＮＡ領域に対
して誘導されたアンチセンスオリゴヌクレオチドでプローブしたマウス脳の側矢
状切片。略号：ｎＣｔｘ，新皮質；Ｈｐ，海馬；Ｃｒｂ，小脳；ＢｒＳｔ，脳幹
）。
【図８】 脳中でのｍＢＣＮＧ−１発現の免疫組織化学分析を示す図（マウス脳の側矢状
切片は、αｑ１とαｑ２抗血清で染色された。二つの異なる抗血清を用いて検出
されたｍＢＣＮＧ−１発現のパターンは同一であり、両ケースともに、ＧＳＴ−
ｄ５融合タンパク質に血清を予め吸着させることによって、染色は、完全に消滅
した。）大脳皮質でのｍＢＣＮＧ−１の免疫反応性を示す図、海馬でのｍＢＣＮ
Ｇ−１免疫反応性を示す図（図５Ｃ−５Ｄ）（図５Ｃでは、矢印は、海馬溝の位
置を示している；ＣＡ１、ＣＡ３領域、及び歯状回（ＤＧ）がラベルされている
。）、及びＣＡ３領域の錐体層の詳細を示す図（図５Ｄ）。
【図９】 小脳でのｍＢＣＮＧ−１の免疫反応性を示す図（図５Ａ、図５Ｃ、図５Ｅ：６
０×；図５Ｂ、図５Ｄ、図５Ｆ：１００×拡大）。
【図１０】 マウスのゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を示す図（マウスゲノムＤＮＡ４
μｇを各レーンにロードした後、ＥｃｏＲＩ（１）、ＨｉｎｄＩＩＩ（２）、Ｂ
ａｍＨＩ（３）、ＰｓｔＩ（４）、又はＢｇｌＩＩ（５）で消化した。高（図６
Ａ）及び（図６Ｂ）低ストリンジェンシーで、ＢＣＮＧ−１配列のアミノ酸２６
９−４６２をコードするＤＮＡ断片を用いて、該フィルターをプローブした。分
子量標準の位置が、左側に示されている。）。
【図１１】 マウスとヒトのＢＣＮＧクローンを図示した図、６つの膜貫通ドメイン（Ｓ１
−Ｓ６）、ポア領域（Ｐ）、環状ヌクレオチド結合部位（ＣＮＢ）、及びポリグ
ルタミン伸長部（Ｑ）を含む長Ｃ末端テールを有するｍＢＣＮＧ−１の予想構造
（Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。３つの他のマウス及び２つのヒ
トＢＣＮＧ遺伝子の部分ｃＤＮＡクローンによってコードされる予想配列が、仮
のｍＢＣＮＧ−１への並置に示されている。両側に矢印が付いた配列上の線は、
断片が、ｃＤＮＡ（λｇｔ１０又はｐＪＧ４−５）、ＲＴ−ＰＣＲ反応、又はＥ
ＳＴデータベースから得られたかどうかを示している。両側に矢印が付いた配列
の下の破線は、ここで使用したプローブの位置を示している（実験の詳細の部の
例１−５参照）。ｍＢＣＮＧ−４の５‘領域中のハッチングされたボックスは、
Ｍ２８−ＥＳＴクローン中のイントロン候補の位置を示す。）。
【図１２】 マウスとヒトのＢＣＮＧ遺伝子との配列類似性のパーセントを示す図（並置は
、アミノ酸１１１−４１９（番号は、ｍＢＣＮＧ−１に従っている、図８参照）
に対応し、膜貫通ドメインＳ１−Ｓ６を含むタンパク質のコア領域のみを比較す
ることによって行った。ｍＢＣＮＧ−４配列は、この並置には含まれていなかっ
た。しかしながら、入手可能なｍＢＣＮＧ−４の環状ヌクレオチド結合ドメイン
配列内部（ｍＢＣＮＧ−１に従って、ａａ５２９−５９２と番号を付した、図８
参照）に限定した並置では、ｍＢＣＮＧ−１に対して７９％の類似性を示してい
る。）
【図１３】 マウスとヒトのＢＣＮＧタンパク質の並置、４つのマウス（ｍＢＣＮＧ−１、
２、３、及び４）に対する予想アミノ酸配列と２つのヒト遺伝子（ｈＢＣＮＧ−
１及び２）を仮に並置した図（タンパク質の推定構造特性（膜貫通領域候補、ポ
ア領域、及び環状ヌクレオチド結合部位）が示されている（図５も参照）。（−
）は、ｍＢＣＮＧ−１と同一の残基を示す。他には、多様な残基が、報告されて
いる。（．）は、並置された配列中のギャップ（又は欠失）を示している。配列
の末端の（＊）は、停止コドンを示している。３２７位の上の（＊）は、ｍＢＣ
ＮＧ−１のＮ−グリコシル化部位をマークしている。矢印は、ＢＣＮＧ−１及び
ＢＣＮＧ−２中に存在する単一のコンセンサスＰＫＡリン酸化部位をマークして
いる）。
【図１４】 マウスとヒトのＢＣＮＧタンパク質の並置、４つのマウス（ｍＢＣＮＧ−１、
２、３、及び４）に対する予想アミノ酸配列と２つのヒト遺伝子（ｈＢＣＮＧ−
１及び２）を仮に並置した図（タンパク質の推定構造特性（膜貫通領域候補、ポ
ア領域、及び環状ヌクレオチド結合部位）が示されている（図５も参照）。（−
）は、ｍＢＣＮＧ−１と同一の残基を示す。他には、多様な残基が、報告されて
いる。（．）は、並置された配列中のギャップ（又は欠失）を示している。配列
の末端の（＊）は、停止コドンを示している。３２７位の上の（＊）は、ｍＢＣ
ＮＧ−１のＮ−グリコシル化部位をマークしている。矢印は、ＢＣＮＧ−１及び
ＢＣＮＧ−２中に存在する単一のコンセンサスＰＫＡリン酸化部位をマークして
いる）。
【図１５】 マウスＢＣＮＧ遺伝子発現のノーザンブロット分析（以下の各マウス組織：心
臓（Ｈｅ）、脳（Ｂｒ）、脾臓（Ｓｐ）、肺（Ｌｕ）、肝臓（Ｌｉ）、骨格筋（
Ｍ）、腎臓（Ｋ）、及び精巣（Ｔ）から得たポリＡ＋ＲＮＡ２μｇを含有する複
数組織ノーザンブロットを表記のＢＣＮＧ遺伝子に対応するＤＮＡ断片にハイブ
リダイズさせた。分子サイズマーカーは、左側に示されている。）。
【図１６】 ヒトＢＣＮＧ遺伝子発現のノーザンブロット分析を示す図（以下の各組織：心
臓（Ｈｅ）、脳（Ｂｒ）、胎盤（Ｐｌ）、肺（Ｌｕ）、肝臓（Ｌｉ）、骨格筋（
Ｍう）、腎臓（Ｋ）、及び膵臓（Ｐａ）から得たポリＡ＋ＲＮＡ２ｍｇを含有す
る複数ヒト組織ノーザンブロットを表記のＢＣＮＧ遺伝子に対応するＤＮＡ断片
にハイブリダイズさせた（図１０Ａ−Ｂ）；以下の各組織：扁桃体（Ａｍ）、尾
状核（Ｃｎ）、脳梁（ＣＣ）、海馬（Ｈｉ）、全脳（Ｂｒ）、黒質（ＳＮ）、視
床下核（Ｓｎ）、及び視床（Ｔｈ）から得たポリＡ＋ＲＮＡ２μｇを含有する複
数のヒト脳組織ブロットをプローブするために、同じ断片を使用した。分子サイ
ズマーカーは、左側に示されている。）。
【図１７】 ボルテージゲーティッドＫ＋チャンネルと環状ヌクレオチドゲーティッドチャ
ンネルとの相同性に基くＢＣＮＧチャンネルタンパク質の一般構造を示す図。
【図１８】 典型的なボルテージゲーティッドＫ＋チャンネルシェーカー及び環状ヌクレオ
チドゲーティッドチャンネルｂＲＥＴ１のＳ４電圧感受領域とｍＢＣＮＧ−１の
Ｓ４配列（配列番号２）を並置した図（四角に囲ってある残基は、一以上のＳ４
配列中に存在する正に帯電したアミノ酸である。星印は、ｂＲＥＴ１配列中に存
在する負に帯電した酸性側鎖を有するアミノ酸の位置を示している。）。
【図１９】 カタボライトアクチベーティングタンパク質（ＣＡＰ、Ａｉｂａ ｅｔ ａｌ
．，１９８２；Ｃｏｓｓａｒｔ ＆ Ｇｉｃｑｕｅｌ、１９８２）の機能的環状
ヌクレオチド結合部位、組換えウシＲ１αのＡ及びＢ部位（ＰＫＡａ及びＰＫＡ
ｂ、Ｔｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８４）、ウシ網膜チャンネルαサブユニ
ット（ｂＲＥＴ１、Ｋａｕｐｐ、ｅｔ ａｌ．，１９８９）、及びナマズの嗅覚
αサブユニット（ｆＯＬＦ１、Ｇｏｕｌｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２）の
機能的環状ヌクレオチド結合部位の配列とショウジョウバエのＥｔｈｅｒ−ａ−
ｇｏｇｏ（ｄＥＡＧ、Ｗａｒｍｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、シロイヌナズ
ナのＫ輸送タンパク質（ＫＡＴ１、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９２）
、及びｍＢＣＮＧ−１（配列番号２）（本明細書に記載されている）の推定環状
ヌクレオチド結合部位の配列とを並置した図（その機能的な能力が、明確に確認
されている結合部位の全てを横切って完全に保存された６つの残基が、アスタリ
スクによってマークされている。環状ヌクレオチドとイオン結合を形成している
保存されたアルギニンは、矢印でラベルされたＲ５５９によって示されている。
ｃＧＭＡの結合に対して、ｃＡＭＰへの活性化の共役に影響を与えることが示さ
れた三番目のαヘリックス（Ｃ）中の残基は、矢印を付したＤ６０４によって示
されている（ｂＲＥＴ１中のｃＧＭＰ選択的な置換）。
【図２０】 結合部位と環状ヌクレオチドとの不可欠な相互作用を示しているｂＲＥＴ１の
環状ヌクレオチド結合部位を示した図（結合ポケットの該モデルは、ＣＡＰとウ
シＲ１αの結晶構造に基づいている。ｃＧＭＰが、伸長又はアンチ型で、アルギ
ニン５５９（ｂＲＥＴ１のナンバリング）及び該ｃＧＭＰ選択的チャンネル中の
Ｄ６０４と好ましい接触を形成しているプリン環とイオン結合を作っている環状
化ホスフェートと結合している様子が示されている。）。
【図２１】 典型的なボルテージゲーティッドＫ＋チャンネルシェーカー及び環状ヌクレオ
チドゲーティッドチャンネルｂＲＥＴ１のＰループポア形成領域とｍＢＣＮＧ１
のＳ４配列を並置した図（並置されたチャンネルは、ｍＢＣＮＧ−１（配列番号
２）、シェーカー（ＳＨＡＫ、Ｐａｐａｚｉａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｋ
ａｍｂ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＳＨＡＷ Ｗｅｉ， ｅｔ ａｌ．，１９９
０）、カルシウム活性化Ｋチャンネル（ＭＳＬＯ、Ｐａｌｌａｎｃｋ及びＧａｎ
ｅｔｚｋｙ、１９９４）、植物内向き整流物質（ｉｎｗａｒｄ ｒｅｃｔｉｆｉ
ｅｒ）（ＡＫＴ Ｓｅｎｔｅｎａｃ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、ショウジョウ
バエとマウスのｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏｇｏ（ＤＥＡＧ，Ｗａｒｍｋｅ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９１；ＭＥＡＧ，Ｗａｒｍｋｅ ａｎｄ Ｇａｎｅｔｚｋｙ、１９９
４）、ヒトｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏｇｏ関連遺伝子（ＨＥＲＧ、Ｗａｒｍｋｅ ａ
ｎｄ Ｇａｎｅｔｚｋｙ、１９９４）、ウシ網膜αサブユニット（ｂＲＥＴ１、
Ｋａｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、及びヒト網膜βサブユニット（ＨＲＥ
Ｔ−２、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）である。矢印は、ＢＣＮＧチャン
ネルが、Ｋ選択的チャンネルに通常みられるモチーフの配列中の顕著で、潜在的
に重要な変化を示している位置をマークしている。
【図２２】 ペースメーカーニューロンの反復的な発火、及びそれがリズムのある発火パタ
ーンの生成及び調節に関わっていることを示す図（図１５Ａ；活動電位後の過分
極中のＩｈ活性化とを示している。これは、非選択的な陽イオン電流なので、こ
れらの電圧では、内向き電流を運び、次の活動電位の発火に対する閾値まで、細
胞の脱分極をもたらす：図１５Ｂ；洞房結節−心臓のペースメーカー領域の心筋
細胞の活性に対する交感及び迷走刺激の作用を示している。ノルエピネフリン（
ＮＥ）は、Ｉｈの活性化をより脱分極された電位の方にシフトさせる。該シフト
は、活性電位の発火閾値への復帰を加速する。このため、発火速度の活性化がも
たらされる。対照的に、アセチルコリン（ＡＣｈ）は、Ｉｈの活性化をより過分
極された電位にシフトさせる。このため、電流は、再分極フェーズの間に、遅れ
て通電し、閾値への復帰を遅延させる−細胞の発火速度は、このため遅れるであ
ろう。Ｉｈの活性化特性におけるこれらの変化は、ＡＣｈコリンがその濃度を低
下させ、ＮＥがその濃度を増加させるｃＡＭＰ濃度の変化によるものであると考
えられており、ｃＡＭＰ濃度の変化は、Ｉｈの活性化特性を変化させることが示
されている（「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｌａ Ｓｃｉｅｎｃｅ」
ｂｙ Ｋａｎｄｅｌ、Ｓｃｈｗａｒｔｚ、ａｎｄ Ｊｅｓｓｅｌｌ １９９１）
。
【図２３】 ｍＢＣＮＧ−１発現が、ネイティブの神経ペースメーカー電流に似た過分極−
活性化された電流を生じることを示す図（−４０ｍＶの固定電圧から−６０〜―
１３０ｍＶの範囲の５ｍＶずつ増加する電位への３ｓの過分極によって発生した
電流(図１６Ａ)；過分極ステップの最後の定常電流とパッチ電圧との関係を示す
図（図１６Ｂ）；様々な試験電圧への過分極後の−４０ｍＶへの復帰時に記録さ
れた尾電流。尾電流を強調するために拡大された時間軸に対して示された記録（
図１６Ｃ）；過分極ステップ時の尾電流の大きさと電圧との平均的な関係。各パ
ッチに対して、尾電流データが、ボルツマンの方程式へのフィッティングから得
られた最大尾電流の大きさに対して標準化されている（例４、実験の詳細の部参
照）。次に、５つのパッチに対して、標準化された尾電流を平均した。平均Ｖ１
／２＝−１００．０ｍＶ、傾き＝５．８ｍＶ（図１６Ｄ））。
【図２４】 ｍＢＣＮＧ−１発現が、ネイティブの神経ペースメーカー電流に似た過分極−
活性化された電流を生じることを示す図(ｍＢＣＮＧ−１電流の活性化の経時変 化。５ｋＨＺでデータを採取し、初期のラグを考慮して、−１０５〜ー１３０ｍ
Ｖの電圧段階中の電流を単指数関数によってフィッティングした（滑らかな線）
活性化と電圧の平均時定数との関係。上記の実験では、細胞外溶液は、ＫＣｌ／
ＮａＣｌ／ＣａＣｌ２（例４、実験操作参照）)であり、細胞内溶液は、ＫＣｌ ／ＮａＣｌ−ＥＧＴＡであった）。
【図２５】 ｍＢＣＮＧ−１が、ナトリウムよりもカリウムに対して弱い選択性を示す陽イ
オンチャンネルであることを示す図（ｍＢＣＮＧ−１電流を活性化するために−
１３０ｍＶまで０．３秒のステップを与えた後に、様々な試験電位への脱分極ス
テップ時に得られた尾電流。試験電位は、５ｍＶの増加で、−６０ｍＶ〜＋２０
ｍＶの範囲であった（交流電流のトレースの隣に示されている）。細胞外溶液は
、ＮａＣｌ−ＥＧＴＡであったのに対して、細胞内溶液は、ＫＣｌ−ＥＧＴＡで
あった（図１７Ａ）。槽内を低Ｃｌ、Ｋアスパラギン酸−ＥＧＴＡ溶液にスイッ
チした後に、逆電位(ｒｅｖｅｒｓａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ)を測定するために
、類似の尾電流プロトコールを使用した(図１７Ｂ)。）。
【図２６】 ｍＢＣＮＧ−１が、ナトリウムよりもカリウムに対して弱い選択性を示す陽
イオンチャンネルであることを示す図（尾期間中の膜電圧の関数としての尾電流
の大きさ。白抜きの記号は、槽中のＫＣｌ−ＥＧＴＡ溶液を用いて決定された電
流の大きさを表している（○、初期の測定、Ｅｒｅｖ＝−３２．８±２．５、ｎ
＝３；□、Ｋアスパラギン酸−ＥＧＴＡ溶液の洗浄除去後、Ｅｒｅｖ＝−３１．
２±１．６、ｎ＝３）。黒丸は、Ｋアスパラギン酸溶液の存在下でなされた測定
を表している(Ｅｒｅｖ＝−２８．２±１．６、ｎ＝４)。３つのパネル全てで、
ゼロ電流レベルが、水平破線によって示されている）。
【図２７】 ネイティブのペースメーカーチャンネルと同様に外部ＣｓによってｍＢＣＮＧ
−１チャンネルはブロックされるが、外部Ｂａによってはブロックされないこと
を示す図（アイトサイド−アウトパッチからのｍＢＣＮＧ−１電流記録。図１８
Ａ〜Ｂでは、固定電離(−４０ｍＶ)での電流と１３０ｍＶへの過分極に応答した
電流とは、重なっている。アイトサイド−アウトパッチからのｍＢＣＮＧ−１電
流記録。固定電離(−４０ｍＶ)での電流とー１３０ｍＶへのステップに応答した
電流とは重なっている。細胞外表面が、ＫＣｌ／ＮａＣｌ−ＣａＣｌ２溶液(対 照又は２ｍＭ ＣｓＣｌで等張的にＮａＣｌを置換した溶液、又は１ｍＭ Ｂａ
Ｃｌ２でＣａＣｌ２を置換した溶液に晒されたときには、順次の記録を得た。細
胞内溶液は、ＫＣｌ／ＮａＣｌ−ＥＧＴＡであった。）
【図２８】 ＣｓによるｍＢＣＮＧ−１電流の阻害に対する用量応答関係を示す図(データ は、６つのパッチからの平均である（各濃度において全て測定したわけではない
）。実線は、ヒルの方程式(Ｉ／Ｉｍａｘ＝１／｛１＋（ＩＣ５０／［Ｃｓ］） ｎ ｝、ここで［Ｃｓ］は、Ｃｓ濃度であり、ＩＣ５０は、Ｃｓの半最大阻害濃度
であり、ｎは、ヒル係数であり、Ｉは、Ｃｓの存在下での電流であり、Ｉｍａｘ
は、阻害されていない電流である)へのフィッティングを示している。)フィッテ
ィングにより、２０１μＭのＩＣ５０と１．０８のヒル係数を得る。）。
【図２９】 ｍＢＣＮＧ−１チャンネルが、細胞質のｃＡＭＰによって直接調節されること
を示す図（細胞内溶液中に１μＭのｃＡＭＰが存在していない、又は存在してい
る下での、−１００ｍＶへの過分極に応答したインサイドアウトパッチからのｍ
ＢＣＮＧ−１電流記録（ＫＣｌ−ＥＧＴＡ）。細胞外溶液は、ＫＣｌ−ＣａＣｌ
２であった（図１９Ａ）。３０μＭのｃＡＭＰの非存在及び存在下での別のパッ
チからの記録（Ａと同じ溶液）。
【図３０】 ｍＢＣＮＧ−１チャンネルが、細胞質のｃＡＭＰによって直接調節されること
を示す図（（左側のパネル）図Ａに示されたパッチに対する１μＭのｃＡＭＰの
非存在及び存在下での尾電流活性化曲線。図１Ｄに記載されているように、デー
タを分析し、プロットした。以下のパラメーター：0μＭ ｃＡＭＰ：Ｖ１／２ ＝−１００ｍＶ、傾き＝５．４ｍＶ、及びＩｔａｉｌ、ｍａｘ＝−３３．８ｐＡ
；１μＭ ｃＡＭＰ：Ｖ１／２＝−９８ｍＶ、傾き＝５．３、及びＩｔａｉｌ、 ｍａｘ ＝−３３．７ｐＡを用いたボルツマンの関係によるカーブフィッティング
。(右側のパネル)ｃＡＭＰの非存在（白塗り丸）及び存在（白抜き丸）下での、
パッチに対する平均尾電流活性化曲線。データは、５パッチからの平均。ｃＡＭ
Ｐ、Ｖ１／２＝−９８．３ｍＶ、傾き＝６ｍＶに対して、ｃＡＭＰ濃度は、１〜
３０００μＭの範囲。）。
【図３１】 ｍＢＣＮＧ−２が、心臓の洞房結節に発現されていることを示す図（ウサギの
心臓の心室、心房、心房結節からのポリＡ＋ＲＮＡ試料は、ｍＢＣＮＧ−２又は
３転写物の存在について、ＲＴ−ＰＣＲによってテストした。レーン：１）分子
量マーカー；２）逆転写酵素の非存在下で実施した反応；３）心室ＲＮＡ；４）
心房ＲＮＡ；５）洞房結節のＲＮＡ）；６）ｍＢＣＮＧ−１ ｃＤＮＡを含有す
るプラスミド上でのＰＣＲ反応；７）ｍＢＣＮＧ−２ ｃＤＮＡを含有するプラ
スミド上でのＰＣＲ反応；８）ｍＢＣＮＧ−３ ｃＤＮＡを含有するプラスミド
上でのＰＣＲ反応。分子サイズマーカーは、左側に示されている。右側の矢印は
、予想される３４０ｂｐの増幅産物を示している（図２０Ａ）。ｍＢＣＮＧ−２
に対するプローブを用いた、Ａに示されたゲルのサザンブロット分析（図２０Ｂ
）。ｍＢＣＮＧ−３に対するプローブを用いたＡのゲルのサザンブロット分析（
図２０Ｃ）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 9/00 ４Ｃ０７６ Ａ６１Ｐ 9/00 25/08 ４Ｃ０８４ 25/08 25/16 ４Ｈ０４５ 25/16 25/28 25/28 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 33/566 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 21/08 5/00 Ｂ Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｊ Ｐ，ＭＸ (72)発明者 カンデル、エリック・アール アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10471 リバーデイル、シグマ・プレイス・ナン バー９ (72)発明者 サントロ、ビーナ イタリア国、アイ−00186 ローマ、ビ ア・デル・コルソ 12 (72)発明者 バーチ、デュサン アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10027 ニューヨーク、リバーサイド・ドライブ 560、アパートメント・ナンバー17ディ ー (72)発明者 シーゲルバウム、スティーブン アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10025 ニューヨーク、ウエスト・ワンハンドレ ッドサーティーンス・ストリート 605 (72)発明者 ティブス、ギャレス アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10025 ニューヨーク、ウエスト・ワンハンドレ ッドフィフティーンス・ストリート 601、 アパートメント・ナンバー102エー (72)発明者 グラント、セス イギリス国、イーエイチ９−２エヌダブリ ュ、エジンバラ、ファインドホーン・プレ イス 58、フラット１エフ２ Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 AA40 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FA36 FB01 FB02 FB03 FB07 FB08 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02 EA04 GA11 GA18 HA01 HA12 HA15 4B063 QA01 QA18 QQ20 QQ42 QQ79 QR56 QR62 QR77 QR80 QS25 QS34 QX04 QX07 4B064 AG01 AG27 CA02 CA05 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 BA25 CA24 CA44 CA46 4C076 AA12 AA13 AA24 AA36 AA42 AA53 BB01 BB22 CC01 CC11 CC15 CC16 CC17 DD27 DD41 DD67 EE38 EE42 EE53 EE55 EE58 FF04 FF15 FF16 FF21 4C084 AA17 MA13 MA17 NA14 ZA022 ZA062 ZA152 ZA162 ZA362 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 DA86 EA20 EA21 EA50 FA74

Claims (62)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＢＣＮＧタンパク質又はその一部をコードする単離された核
    酸。
  2. 【請求項２】 ＢＣＮＧ関連タンパク質又はその一部をコードする単離され
    た核酸。
  3. 【請求項３】 前記ＢＣＮＧタンパク質が、ｍＢＣＮＧ−１（ＡＴＣＣ受付
    番号２０９７８１）（配列番号１）、ｍＢＣＮＧ−２（配列番号５）、ｍＢＣＮ
    Ｇ−３（配列番号９）、ｍＢＣＮＧ−４（配列番号１１）、ｈＢＣＮＧ−１（Ａ
    ＴＣＣ受付番号２０９８２７）（配列番号３）、又はｈＢＣＮＧ−２（配列番号
    ７）に示された配列によってコードされる請求項１の核酸。
  4. 【請求項４】 前記核酸が、ＤＮＡ又はＲＮＡである請求項１又は２の核酸
    。
  5. 【請求項５】 前記核酸がｃＤＮＡである請求項１又は２の核酸。
  6. 【請求項６】 前記ｃＤＮＡが、ｍＢＣＮＧ−１（ＡＴＣＣ受付番号２０９
    ７８１号）に対する配列番号１、ｈＢＣＮＧ−１に対する配列番号３、ｍＢＣＮ
    Ｇ−２に対する配列番号５、ｈＢＣＮＧ−２に対する配列番号７、ｍＢＣＮＧ−
    ３に対する配列番号９、又はｍＢＣＮＧ−４に対する配列番号１１に示されたヌ
    クレオチド配列を有する請求項５の核酸。
  7. 【請求項７】 請求項１又は２の核酸を含むベクター。
  8. 【請求項８】 前記ベクターがウイルス又はプラスミドＤＮＡを含む請求項
    ７のベクター。
  9. 【請求項９】 請求項１又は２の核酸と調節要素を含む発現ベクター。
  10. 【請求項１０】 適切な宿主中に請求項９の発現ベクターを含む宿主ベクタ
    ー系。
  11. 【請求項１１】 ｍＢＣＮＧ−１（ＡＴＣＣ受付番号２０９７８１）をコー
    ドするｃＤＮＡを含むベクター。
  12. 【請求項１２】 ｈＢＣＮＧ−１（ＡＴＣＣ受付番号２０９８２７）をコー
    ドするｃＤＮＡを含むベクター。
  13. 【請求項１３】 前記適切な宿主が、細菌細胞、真核細胞、哺乳類細胞、又
    は昆虫細胞である請求項１０の宿主ベクター系。
  14. 【請求項１４】 単離されたＢＣＮＧタンパク質。
  15. 【請求項１５】 単離されたＢＣＮＧ関連タンパク質。
  16. 【請求項１６】 前記ＢＣＮＧタンパク質が、ｍＢＣＮＧ−１に対する配列
    番号２（図８Ａ）、ｍＢＣＮＧ−２に対する配列番号６（図８Ａ）、ｍＢＣＮＧ
    −３に対する配列番号１０（図８Ａ）、ｍＢＣＮＧ−４に対する配列番号１２（
    図８Ａ）、ｈＢＣＮＧ−１に対する配列番号４（図８Ａ）、ｈＢＣＮＧ−２に対
    する配列番号８（図８Ａ）又はその一部と実質的に同一のアミノ酸配列を有する
    請求項１４のタンパク質。
  17. 【請求項１７】 前記ＢＣＮＧ関連タンパク質が、ｍＢＣＮＧ−１配列番号
    ２（図８Ａ）、ｍＢＣＮＧ−２に対する配列番号６（図８Ａ）、ｍＢＣＮＧ−３
    に対する配列番号１０（図８Ａ）、ｍＢＣＮＧ−４に対する配列番号１２（図８
    Ａ）、ｈＢＣＮＧ−１に対する配列番号４（図８Ａ）、ｈＢＣＮＧ−２に対する
    配列番号８（図８Ａ）又はその一部と実質的に同一のアミノ酸配列を有する請求
    項１４のタンパク質。
  18. 【請求項１８】 ＢＣＮＧタンパク質若しくはＢＣＮＧ関連タンパク質、又
    はその一部をコードする核酸と担体を含む組成物。
  19. 【請求項１９】 前記核酸が、ｍＢＣＮＧ−１に対する配列番号１、ｈＢＣ
    ＮＧ−１に対する配列番号３、ｍＢＣＮＧ−２に対する配列番号５、ｈＢＣＮＧ
    −２に対する配列番号７、ｍＢＣＮＧ−３に対する配列番号９、ｍＢＣＮＧ−４
    に対する配列番号１１に示されたコード配列又はその一部と実質的に同じコード
    配列を含む請求項１８の組成物。
  20. 【請求項２０】 ＢＣＮＧタンパク質若しくはＢＣＮＧ関連タンパク質、又
    はその一部と担体を含む組成物。
  21. 【請求項２１】 前記ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質が、
    配列番号２ｍＢＣＮＧ−１（図８Ａ）、ｍＢＣＮＧ−２に対する配列番号６（図
    ８Ａ）、ｍＢＣＮＧ−３に対する配列番号１０（図８Ａ）、ｍＢＣＮＧ−４に対
    する配列番号１２（図８Ａ）、ｈＢＣＮＧ−１に対する配列番号４（図８Ａ）、
    ｈＢＣＮＧ−２に対する配列番号８（図８Ａ）に示されたアミノ酸配列又はその
    一部と実質的に同一のアミノ酸配列を含む請求項２０の組成物。
  22. 【請求項２２】 ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質をコード
    する核酸と特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブ。
  23. 【請求項２３】 請求項１の核酸と特異的にハイブリダイズできる核酸プロ
    ーブ。
  24. 【請求項２４】 前記プローブが、以下の配列番号１３、配列番号１４、配
    列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列
    番号２０、配列番号２１、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番
    号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号
    ２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３
    ４、配列番号３５、配列番号３６から選択された配列を含む請求項２２の核酸プ
    ローブ。
  25. 【請求項２５】 ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質をコード
    する試料中の核酸を同定する方法であって、 （ａ）試料中で核酸プローブとＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク
    質をコードする核酸との間で複合体を形成させることが可能な条件下で、ＢＣＮ
    Ｇタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリ
    ダイズできる核酸プローブと前記試料を接触させる工程と； （ｂ）工程（ａ）で形成された複合体の量を決定する工程と； （ｃ）任意の配列を用いて形成された複合体の量と工程（ｂ）で決定された複
    合体の量を比較する工程と を備え、ＢＣＮＧ特異的なプローブによって形成された複合体の量のほうが多い
    ことが、前記試料中にＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質をコード
    する核酸が存在することの指標となる方法。
  26. 【請求項２６】 工程（ａ）が、さらに、ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ
    関連タンパク質をコードする核酸分子を増幅することを含む請求項２５の方法。
  27. 【請求項２７】 前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応に適した条件下で、前
    記試料からの前記核酸分子を、ｍＢＣＮＧ−１（配列番号１）、ｍＢＣＮＧ−２
    （配列番号５）、ｍＢＣＮＧ−３（配列番号９）、ｍＢＣＮＧ−４（配列番号１
    １）、ｈＢＣＮＧ−１（配列番号３）、又はｈＢＣＮＧ−２（配列番号７）と特
    異的にハイブリダイズできる少なくとも１つの増幅プライマーに接触させること
    を含む請求項２６の方法。
  28. 【請求項２８】 前記ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質をコ
    ードする前記増幅された核酸分子が、サイズ分画によって検出される請求項２６
    の方法。
  29. 【請求項２９】 さらに、サイズ分画によって複合体を単離することを含む
    請求項２５の方法。
  30. 【請求項３０】 前記核酸プローブは、検出可能なマーカーでラベルされる
    請求項２５の方法。
  31. 【請求項３１】 前記検出可能なマーカーが、放射能ラベルされた分子、蛍
    光分子、酵素、リガンド、磁気ビーズである請求項３０の方法。
  32. 【請求項３２】 前記プローブが、以下の配列番号１３、配列番号１４、配
    列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列
    番号２０、配列番号２１、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番
    号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号
    ２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、又は配列番
    号３４、配列番号３５、配列番号３６から選択された配列を含む請求項２５の方
    法。
  33. 【請求項３３】 前記核酸プローブが、ｍＢＣＮＧ−１（配列番号１）、ｍ
    ＢＣＮＧ−２（配列番号５）、ｍＢＣＮＧ−３（配列番号９）、ｍＢＣＮＧ−４
    （配列番号１１）、ｈＢＣＮＧ−１（配列番号３）、又はｈＢＣＮＧ−２（配列
    番号７）と特異的にハイブリダイズできる請求項２５の方法。
  34. 【請求項３４】 請求項２５の方法によって同定された以前には未知であっ
    た単離された核酸。
  35. 【請求項３５】 ある化合物が、ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タン
    パク質の発現に影響を与えるかどうかをテストする方法であって、 （ａ）ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質を発現する試料を化合
    物と接触させる工程と； （ｂ）前記試料中のＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質の発現量
    を決定する工程と； （ｃ）工程（ｂ）で決定されたＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク
    質の発現量を前記化合物の非存在下で決定された量と比較する工程と を備えた方法。
  36. 【請求項３６】 ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質と相互作
    用できる化合物を同定する方法であって、 （ａ）前記化合物とＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質をコード
    する核酸との複合体を形成させることが可能な条件下で、ＢＣＮＧタンパク質又
    はＢＣＮＧ関連タンパク質を発現している試料を化合物と接触させる工程と； （ｂ）前記化合物と前記ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質との
    間で形成された複合体の量を決定する工程と； （ｃ）工程（ｂ）で形成された複合体の量を前記化合物の非存在下で形成され
    た量と比較する工程と を備え、前記化合物の存在下で形成された複合体の量のほうが多いことが、ＢＣ
    ＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質と相互作用できる化合物の存在の指
    標となる方法。
  37. 【請求項３７】 ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質活性を調
    節できる化合物を同定する方法であって、 （ａ）ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質を発現している試料を
    化合物と接触させる工程と； （ｂ）前記試料中のＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質の活性量
    を決定する工程と； （ｃ）工程（ｂ）で決定されたＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク
    質の活性量を前記化合物の非存在下で決定された量と比較する工程と を備え、活性の増加又は減少が、ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク
    質の活性を調節できる化合物の存在の指標となる方法。
  38. 【請求項３８】 工程（ａ）が、まず、ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関
    連タンパク質をコードする核酸を発現システムに導入して、ＢＣＮＧタンパク質
    又はＢＣＮＧ関連タンパク質が産生される条件下で、前記発現システムに前記核
    酸の発現せしめることを備えた請求項３７の方法。
  39. 【請求項３９】 工程（ｂ）が、化合物の存在下でチャネル電流又は細胞内
    カルシウムレベルを測定することを備えた請求項３７の方法。
  40. 【請求項４０】 前記発現システムが、培養された宿主細胞を含む請求項３
    ８の方法。
  41. 【請求項４１】 請求項３５、３６、又は３７の方法によって同定される以
    前は未知であった化合物。
  42. 【請求項４２】 前記ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質が、
    、ｍＢＣＮＧ−１（配列番号２）、ｍＢＣＮＧ−２（配列番号６）、ｍＢＣＮＧ
    −３（配列番号１０）、ｍＢＣＮＧ−４（配列番号１２）、ｈＢＣＮＧ−１（配
    列番号４）、又はｈＢＣＮＧ−２（配列番号８）又はその一部を含む請求項２５
    、３５、３６、又は３７の方法。
  43. 【請求項４３】 前記試料が、細胞、細胞溶解物、又は無細胞翻訳を含む請
    求項２５、３５、３６、又は３７の方法。
  44. 【請求項４４】 前記細胞が、心臓細胞、腎臓細胞、肝細胞、気道上皮細胞
    、筋肉細胞、神経細胞、グリア細胞、ミクログリア細胞、上皮細胞、単核細胞、
    腫瘍細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、又はアフリカツメガエルの卵母細胞である請
    求項４３の方法。
  45. 【請求項４５】 請求項３５、３６、又は３７の方法によって同定された以
    前は未知であった化合物。
  46. 【請求項４６】 前記化合物が、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、ポリマ
    ー、又は小分子である請求項３５、３６、又は３７の方法。
  47. 【請求項４７】 前記化合物が、固相支持体に結合されている請求項３５、
    ３６、又は３７の方法。
  48. 【請求項４８】 前記ＢＣＮＧタンパク質又はＢＣＮＧ関連タンパク質が、
    イオンチャネルタンパク質又はイオンチャネルサブユニットタンパク質である請
    求項２５、３５、３６、又は３７の方法。
  49. 【請求項４９】 前記化合物が、イオンチャネル活性のアゴニスト又はアン
    タゴニストである請求項３５、３６、又は３７の方法。
  50. 【請求項５０】 前記調節が、増加したイオンのフロー速度又は減少したイ
    オンのフロー速度である請求項３７の方法。
  51. 【請求項５１】 前記調節が、増加したイオンの許容性又は減少したイオン
    の許容性である請求項３７の方法。
  52. 【請求項５２】 試料中のＢＣＮＧ又はＢＣＮＧ関連タンパク質活性を調節
    する方法であって、前記試料を請求項４１の化合物と接触させる方法。
  53. 【請求項５３】 患者の症状を治療する方法であって、前記患者に、前記症
    状を治療するのに有効な、ある量の請求項４１の化合物を投与することを備えた
    方法。
  54. 【請求項５４】 請求項４１の化合物と薬学的許容される担体とを備えた薬
    学的組成物。
  55. 【請求項５５】 前記担体が、賦形剤、エアロゾル、局所担体、水溶液、非
    水溶液、又は固相担体である請求項５４の薬学的組成物。
  56. 【請求項５６】 患者の症状を治療する方法であって、前記患者の前記症状
    を治療するのに有効な、ある量の提供された薬学的組成物を前記患者に投与する
    ことを備えた方法。
  57. 【請求項５７】 前記症状が、神経、腎臓、肺、肝臓、又は心血管症状であ
    る請求項５３又は５６の方法。
  58. 【請求項５８】 前記症状が、てんかん、アルツハイマー病、パーキンソン
    病、長ＱＴ症候群、洞不全症候群、加齢に伴う記憶喪失、嚢胞性繊維症、突然死
    症候群、又はペースメーカーリズム機能不全である請求項５７の方法。
  59. 【請求項５９】 前記患者がヒトである請求項５３又は５６の方法。
  60. 【請求項６０】 請求項１４又は１５のタンパク質に特異的に結合する抗体
    。
  61. 【請求項６１】 請求項６０の抗体を産生することができる細胞。
  62. 【請求項６２】 試料中の請求項１４又は請求項１５のタンパク質を同定す
    る方法であって、 ａ）請求項５８の抗体と前記タンパク質との複合体を形成することが可能な条
    件下で、前記試料を前記抗体と接触させる工程と； ｂ）形成された複合体の前記量を決定する工程と； ｃ）工程（ｂ）で形成された複合体の量と前記抗体の非存在下で形成された複
    合体の量を比較する工程とを備え、 前記抗体の存在下で形成された複合体の量が増加して存在することが、前記試
    料中に前記タンパク質を同定したことの指標となる方法。
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