JP2003533229A - てんかんに関係する突然変異 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｖ２８７Ｍトランジションを生成するニコチン性アセチルコリン受容体のβ２サブユニットにおける点突然変異は常染色体性優性夜間前頭葉てんかん（ＡＤＮＦＬＥ）に関連している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 技術分野 本発明は、特発性てんかん、特に常染色体性優性夜間前頭葉てんかん（ＡＤＮ
ＦＬＥ）に関係するニコチン性アセチルコリン受容体中の突然変異に関する。

【０００２】 背景技術 てんかんは人口の約３％がその人生のある時期に冒される多様な脳障害の総称
である（Ａｎｎｅｇｅｒｓ，１９９６）。てんかん発作は、中枢神経系のニュー
ロン集団の異常な発火によって起こる挙動の一時的変化と定義することができる
。これは様々な程度の不随意筋収縮を引き起し、意識消失を起こすことも多い。
てんかん症候群は、特徴的な症状、発作のタイプ、原因、発症年齢およびＥＥＧ
パターンに基づいて４０種類を超えるタイプに分類されている（国際抗てんかん
連盟の分類と用語に関する委員会（１９８９））。しかし、全ての症候群に共通
する一つの特徴は、不定期かつ予測不可能な形で発作として発現するニューロン
興奮性の持続的増加である。

【０００３】 てんかんの病因に対する遺伝子の寄与は患者の約４０％に存在すると見積もら
れている（Ｇａｒｄｉｎｅｒ，２０００）。てんかん発作は、最終的にニューロ
ンの同期性を混乱させる数多くの分子的異常のエンドポイントであると考えられ
るので、てんかんの遺伝的根拠は雑多であると思われる。表現型の一部にてんか
んが含まれるメンデル型遺伝病は２００を超える。これらの疾患では、発作は、
脳構造または脳機能の乱れなどといった神経学的疾患が基礎にあることを表す。
対照的に、てんかんがその患者における唯一の症状であるような「純粋な」てん
かん症候群も数多く存在する。これらは特発性と呼ばれ、てんかんの全症例の約
６０％を占める。

【０００４】 特発性てんかんはさらに部分型と全般型に細分されている。部分（焦点または
局所）てんかん発作は限局的な皮質発射に起因するので、一定の筋群だけが関与
し、意識はなくならないだろう（Ｓｕｔｔｏｎ，１９９０）。しかし全般てんか
んでは、ＥＥＧ発射が焦点を示さず、脳の全皮質下領域が関与する。全般てんか
んがしばしば遺伝するという知見は理解できるが、脳内でおそらく構成的に発現
される遺伝的欠損が部分発作を引き起す機序はよくわからない。主に単一遺伝子
性の病因を持つ稀な家系に関わる遺伝子の研究と単離は、関与する遺伝子のタイ
プおよび疾患過程全般の機序を理解するのに、間違いなく役立つだろう。

【０００５】 単純なメンデル形式の遺伝をするこのような形態の特発性部分てんかんの一つ
に、常染色体性優性夜間前頭葉てんかん（ＡＤＮＦＬＥ）と呼ばれるものがある
。１９９４年（Ｓｃｈｅｆｆｅｒら，１９９４）に初めて記載されたこのてんか
んは、睡眠中に起こる前頭葉運動発作の群発を特徴とし、通常、小児期に発症す
る。この病気は臨床的に特異であり、比較的均質である。ただし発作の重症度お
よび詳細な前頭葉発作症状は家系内でも様々である（Ｈａｙｍａｎら，１９９７
）。臨床医がＡＤＮＦＬＥを知らない場合は、悪夢、夜驚、ヒステリー、睡眠麻
痺、他の睡眠時異常行動、さらには精神障害と誤診されることもよくある。

【０００６】 この形態のてんかんを持つ大家系の連鎖解析により、染色体２０ｑ１３．２上
の遺伝子座が責任遺伝子を含む可能性が最も高いことが確認された（Ｐｈｉｌｌ
ｉｐｓら，１９９５）。位置的候補遺伝子法によると、中枢神経系（ＣＮＳ）の
コリン作動性シナプスにおける化学電気的伝達にニコチン性アセチルコリン受容
体（ｎＡＣｈＲ）が関与することと、ニューロンのニコチン性アセチルコリン受
容体α４サブユニット（ＣＨＲＮＡ４）が前頭皮質の全ての層で発現されるとい
う事実から、ＣＨＲＮＡ４は理想的な候補遺伝子だった（Ｗｅｖｅｒｓら，１９
９４）。

【０００７】 ｎＡＣｈＲは最高４種類のサブユニット（α、β、γ、δ）から構成される膜
貫通型五量体である。ｎＡＣｈＲは神経系だけでなく骨格筋にも見いだされるが
、神経細胞では２タイプのサブユニット（αおよびβ）だけが同定されている。
ニューロンのｎＡＣｈＲサブユニットをコードする遺伝子は現在までに１１種類
（α２〜α９およびβ２〜β４）が様々な種に見いだされており、哺乳類の脳で
最も豊富に存在するｎＡＣｈＲサブタイプは２つのα４と３つのβ２（ＣＨＲＮ
Ｂ２）とからなる（Ｓｃｈｏｅｐｆｅｒら，１９８８；Ｗｈｉｔｉｎｇら，１９
９１；Ｓａｒｇｅｎｔ，１９９３）。

【０００８】 ｎＡＣｈＲの各サブユニットはＮ末端の長い細胞外ドメインと、膜を横切るの
に十分な長さを持つ４つの疎水性セグメント（Ｍ１−Ｍ４）とからなっている（
Ｊａｃｋｓｏｎによる総説（１９９９）がある）。これらのサブユニットは一つ
に会合して、中央に水で満たされたポアを持つロゼット状の構造を形成する。こ
の膜貫通ポアは、５つのサブユニットのそれぞれのＭ２ドメインを構成する５つ
のαヘリックスセグメントによって裏打ちされている。これらのドメインは、神
経伝達物質ＡＣｈの不在下では膜の中央近くに集合して、チャネルのゲートを形
成しているようである。このゲートは、αサブユニット上の離れた部位にＡＣｈ
が結合すると開いてイオンがチャネルを通過できるようにし、シナプス間隙から
ＡＣｈが枯渇するか受容体の脱感作が起こると再び閉じる。このようにＭ２セグ
メントはチャネルのゲート開閉中にその作用の多くが起こる部位であり、このこ
とは、このドメインが受容体活性化の過程で中心的な役割を果たすことを示して
いる。

【０００９】 この遺伝子座への連鎖を示す罹患家族のＣＨＲＮＡ４遺伝子の突然変異解析に
より、コードされているタンパク質の第２膜貫通ドメイン（Ｍ２）中の高度に保
存されたアミノ酸であるコドン２４８のセリンをフェニルアラニンに置き換える
ミスセンス突然変異が確認された（Ｓｔｅｉｎｌｅｉｎら，１９９５）。この突
然変異は、上記家系の罹患家族２１人全員と４人の絶対保因者に存在し、３３３
人の健常対照被験者にはアミノ酸変化は見いだされなかった。この遺伝子中のも
う１つの突然変異は、同じ形態のてんかんを持つノルウェー人の家系に確認され
た。すなわち７７６位にロイシンをコードする３つのヌクレオチドの挿入である
（Ｓｔｅｉｎｌｅｉｎら，１９９７）。このアミノ酸挿入もＣＨＲＮＡ４タンパ
ク質のＭ２ドメインを変化させていた。対照α４サブユニットまたは突然変異型
α４サブユニットを使ってアフリカツメガエル卵母細胞で再構成されたヒトｎＡ
ＣｈＲの生理学的および薬学的研究により、どちらの突然変異も受容体に大きな
変化をもたらすが、その変化は異なることが立証された。Ｓ２４８Ｆ突然変異は
主として受容体の脱感作性に影響を及ぼし、ロイシン挿入は活性状態への移行の
確率を増加させた（Ｂｅｒｔｒａｎｄら，１９９８）。これらの突然変異は受容
体の性質に異なる影響を及ぼすようだったが、どちらの突然変異も、ＡＤＮＦＬ
Ｅ表現型の原因であるかもしれないカルシウムに対する透過性の低下と脱感作感
受性の増進をもたらす。

【００１０】 ＡＤＮＦＬＥを持つ他の家系の遺伝的連鎖研究では、被験家系が２０ｑ１３．
２にあるＣＨＲＮＡ４遺伝子座に対する連鎖を示さないことが示唆されている（
Ｂｅｒｋｏｖｉｃら，１９９５；Ｐｈｉｌｌｉｐｓら，１９９８）。あるＡＤＮ
ＦＬＥ家系は１５ｑ２４（ＣＨＲＮＡ３／ＣＨＲＮＡ５／ＣＨＲＮＢ４遺伝子ク
ラスターの近く）に対する連鎖を示したが、他の家系では１５ｑ２４も２０ｑ１
３．２もその可能性が排除されたことから、ＡＤＮＦＬＥの原因となる遺伝子が
少なくとも３種類は存在することが示された。実際、他の少なくとも３形態の単
一遺伝子性特発性てんかんでも、遺伝子座異質性が立証されている。これらのて
んかんには、２０ｑ１３．２および８ｑにマッピングされる良性家族性新生児痙
攣（ＢＦＮＣ）（Ｌｅｐｐｅｒｔら，１９８９；Ｌｅｗｉｓら，１９９３）、８
ｑ１３−ｑ２１および１９ｐ１３．３にマッピングされる家族性熱性痙攣（Ｗａ
ｌｌａｃｅら，１９９６；Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９８）、ならびに１９ｑおよ
び１６にマッピングされる良性家族性乳児痙攣（Ｇｕｉｐｐｏｎｉら，１９９７
；Ｓｚｅｐｅｔｏｗｓｋｉら，１９９７）が含まれる。ＢＦＮＣの場合、この疾
患を持つ個体で突然変異していることが見いだされた２０ｑ１３．２および８ｑ
責任領域に位置する遺伝子は、相同なカリウムチャネルだった（Ｂｉｅｒｖｅｒ
ｔら，１９９８；Ｃｈａｒｌｉｅｒら，１９９８；Ｓｉｎｇｈら，１９９８）。

【００１１】 発明の開示 本発明者らは、ＣＨＲＮＢ２遺伝子座が常染色体性優性夜間前頭葉てんかん（
ＡＤＮＦＬＥ）に関与することを見いだし、よってｎＡＣｈＲのβサブユニット
を特発性てんかんに関連づけた。

【００１２】 本発明は、その一側面として、哺乳類ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡ
ｃｈＲ）の突然変異型βサブユニットをコードする単離されたＤＮＡ分子であっ
て、点突然変異、欠失、挿入および再配列からなる群より選択される突然変異事
象が、前記哺乳類ニコチン性アセチルコリン受容体のβサブユニットのＭ２ドメ
インをコードするヌクレオチドに起こっており、前記突然変異事象が、前記βサ
ブユニットを含む集合した哺乳類ニコチン性アセチルコリン受容体の機能を、て
んかん表現型が生じるように混乱させることを特徴とする単離されたＤＮＡ分子
を提供する。

【００１３】 前記突然変異事象は点突然変異であることが好ましい。この突然変異により、
通例、バリン残基が置換される。このバリン残基は通例、より嵩高い側鎖および
／または水素原子だけで置換されたβ炭素原子を持つアミノ酸で置換され、なか
でもメチオニンとロイシンは好ましい。このバリン残基は通例、シナプス間隙へ
のチャネルの開口部の近傍にあってイオンチャネルの裏打ちの一部を形成する。

【００１４】 前記バリンはＮＣＢＩデータベースでの名称を使うとＶ２８７（Ｒｅｍｐｅｌ
ら（１９９８）の番号付与法ではＶ２６２）であって、配列番号１に示すように
塩基１０２５におけるＧからＡへのヌクレオチドトランジションの結果として起
こることが有利である。このＧからＡへのヌクレオチドトランジションによって
ＮｌａＩＩＩ制限酵素部位が生成する。

【００１５】 本発明は、点突然変異、欠失、挿入および再配列からなる群より選択される１
または複数のさらなる突然変異事象が起こっているＤＮＡ分子も包含する。この
ようなＤＮＡ分子はいずれも、てんかんに関係する上記突然変異を持ち、かつ機
能的であるだろうが、その他の点では、配列番号１に記載のＤＮＡ分子とはかな
り異なっていてもよい。

【００１６】 本発明のヌクレオチド配列は、当技術分野で受け入れられている方法を用いて
、様々な目的で操作することができる。これらの目的には、例えば遺伝子産物の
クローニング、プロセシングおよび／または発現の改変などが含まれるが、これ
らに限るわけではない。遺伝子断片のＰＣＲ再構成および合成オリゴヌクレオチ
ドの使用によって、本発明のヌクレオチド配列の操作が可能になる。例えばオリ
ゴヌクレオチドによる部位特異的突然変異誘発法を使って、新しい制限部位を生
成する突然変異をさらに導入し、発現パターンを変化させ、スプライス変異体を
産生させることなどができる。

【００１７】 遺伝コードは縮重しているので、数多くのポリヌクレオチド配列を作成するこ
とができ、その一部は自然界に存在する既知遺伝子のポリヌクレオチド配列とは
極めてわずかな類似性しか持たないだろう。したがって本発明は、考え得るコド
ン選択肢に基づいて組合わせを選択することによって作成することができるポリ
ヌクレオチド配列の異形を、考え得る限り全て包含する。これらの組合わせは本
発明のポリヌクレオチド配列に適用される標準トリプレット遺伝暗号に従って行
われ、それらの異形は全て具体的に開示されたものとみなすべきである。

【００１８】 本発明のＤＮＡ分子にはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成型および混成ポリマー
、センス鎖とアンチセンス鎖の両方が包含され、当業者には理解されるだろうが
、化学的または生化学的に修飾されていてもよいし、非天然ヌクレオチド塩基ま
たはヌクレオチド塩基誘導体を含んでもよい。そのような修飾にはラベル、メチ
ル化、インターカレーター、アルキル化剤、および改変された結合が含まれる。
本発明のポリヌクレオチド配列とは本質的に異なるコドン使用頻度を持つヌクレ
オチド配列を作ることが有利な場合もあるだろう。例えば、特定の原核宿主また
は真核宿主における当該ペプチドの発現速度が増加するように、その宿主が特定
のコドンを利用する頻度に合致するコドンを選択することができる。コードされ
るアミノ酸配列を変化させずにヌクレオチド配列を改変する他の理由としては、
例えば、自然界に存在する突然変異型配列から産生される転写物よりも望ましい
性質（例えば長い半減期）を持つＲＮＡ転写物の産生が挙げられる。

【００１９】 本発明はもっぱら合成化学によって行われる本発明のＤＮＡ配列の製造も包含
する。合成配列は、挿入されたコード配列の適当な宿主における転写および翻訳
制御に必要な要素を含む発現ベクターおよび細胞系に挿入することができる。こ
れらの要素には、調節配列、プロモーター、５’および３’非翻訳領域、ならび
に本発明のポリペプチドをコードする配列の翻訳効率を向上させる特異的開始シ
グナル（ＡＴＧ開始コドンおよびコザック共通配列など）を含めることができる
。開始コドンおよび上流調節配列を含む完全なコード配列が適当な発現ベクター
に挿入される場合は、さらなる制御シグナルは必要ないだろう。しかしコード配
列またはその断片だけを挿入する場合には、上述のような外来の翻訳制御シグナ
ルがベクターによって用意されるべきである。そのようなシグナルは様々な起源
を持つことができ、天然シグナルでも合成シグナルでもよい。使用する宿主細胞
系に適したエンハンサーを含めることによって発現効率を高めることができる（
Ｓｃｈａｒｆら，１９９４）。

【００２０】 本発明は本明細書に記載する配列の相補鎖である核酸分子も包含する。

【００２１】 また本発明は、もう一つの側面として、配列番号１に記載のヌクレオチド配列
を含む単離されたＤＮＡ分子を提供する。

【００２２】 本発明は、さらにもう一つの側面として、配列番号１に記載のヌクレオチド配
列からなる単離されたＤＮＡ分子を提供する。

【００２３】 本発明によれば、精製されたポリペプチドまたはタンパク質を本発明のポリヌ
クレオチドまたはその変異体から製造することが可能である。これを行うために
、宿主細胞を上記ＤＮＡ分子で形質転換することができる。通例、前記宿主細胞
には、本発明のＤＮＡ分子を含む発現ベクターがトランスフェクトされる。様々
な発現ベクター／宿主系を利用して、本発明のポリペプチドをコードする配列を
包含し、発現させることができる。これらの発現ベクター／宿主系には、例えば
プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌、酵母発現
ベクターで形質転換された酵母、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイル
ス）に感染させた昆虫細胞系、マウスもしくは他の動物またはヒトの組織細胞系
などがあるが、これらに限るわけではない。哺乳類細胞は、ワクシニアウイルス
発現系を使ってタンパク質を発現させるためにも使用することができる。本発明
は使用する宿主細胞による限定を受けない。

【００２４】 本発明のポリヌクレオチド配列またはその変異体は、哺乳類系で組換えタンパ
ク質を長期間にわたって製造することができるように、細胞株で安定に発現させ
ることができる。本発明のポリペプチドをコードする配列は発現ベクターを使っ
て細胞株に形質転換することができ、前記発現ベクターはウイルス複製起点およ
び／または内因性発現要素ならびに選択可能マーカー遺伝子を同じベクター上ま
たは別個のベクター上に含むことができる。選択可能マーカーは選択剤に対する
耐性を付与するものであり、これが存在することにより、導入した配列をうまく
発現させる細胞の成長と回収が可能になる。安定形質転換細胞の耐性クローンは
、その細胞タイプに適した組織培養技術を使って増殖させることができる。

【００２５】 また宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するその能力、または発現さ
れたタンパク質を望ましい形にプロセシングするその能力で選択することができ
る。ポリペプチドのそのような修飾には、例えばアセチル化、糖鎖付加、リン酸
化およびアシル化などがあるが、これらに限るわけではない。「プレプロ」型タ
ンパク質の翻訳後切断を、タンパク質のターゲティング、折りたたみおよび／ま
たは活性を指定するために使用することもできる。翻訳後活性に関して特殊な細
胞機構および特徴的な機序を持っている様々な宿主細胞（例えばＣＨＯまたはＨ
ｅＬａ細胞）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手することができ、外来タンパク質の正しい修飾お
よびプロセシングが確保されるように、それらの細胞を選択することができる。

【００２６】 抗体製造などの目的で大量の遺伝子が必要な場合は、このタンパク質の高レベ
ル発現を指示するベクター、例えばＴ５またはＴ７誘導性バクテリオファージプ
ロモーターを含むベクターなどを使用することができる。本発明は、上記タンパ
ク質の重要な機能ドメインを含む融合タンパク質の作製および単離における上記
発現系の使用も包含する。これらの融合タンパク質は結合研究、構造研究および
機能研究ならびに適当な抗体の作製に使用される。

【００２７】 上記タンパク質を融合タンパク質として発現させ精製するには、適当なｃＤＮ
Ａ配列を、別のペプチド（例えばグルタチオンスクシニルトランスフェラーゼ）
をコードするヌクレオチド配列を含むベクターに挿入する。融合タンパク質を原
核細胞または真核細胞から発現させ回収する。次に、融合タンパク質を、融合ベ
クター配列に基づくアフィニティークロマトグラフィーによって精製することが
できる。次に、融合タンパク質の酵素的切断によって、所望のタンパク質を得る
。

【００２８】 本発明ポリペプチドの断片は、固相法を用いる直接ペプチド合成によって製造
することもできる。自動合成はＡＢＩ４３１Ａペプチドシンセサイザー（Ｐｅｒ
ｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使って行うことができる。このタンパク質の様々な断片
を個別に合成した後、それらを組み合わせて完全長分子を製造することができる
。

【００２９】 本発明は、さらにもう一つの側面として、哺乳類ニコチン性アセチルコリン受
容体（ｎＡＣｈＲ）の突然変異型βサブユニットである単離されたポリペプチド
であって、置換、欠失、挿入および再配列からなる群より選択される突然変異事
象がＭ２ドメインで起こっており、前記突然変異事象が、集合した哺乳類ニコチ
ン性アセチルコリン受容体の機能を、てんかん表現型が生じるように混乱させる
ことを特徴とする単離されたポリペプチドを提供する。

【００３０】 通例、前記突然変異はバリン残基が関与する置換であり、バリン残基は一般的
には、より嵩高い側鎖および／または水素原子だけで置換されたβ炭素原子を持
つアミノ酸で置換される。通例、前記バリン残基はメチオニンまたはロイシンで
置換される。

【００３１】 上記置換は、配列番号２に示すようにＶ２８７Ｍトランジションであることが
好ましい。

【００３２】 本発明の単離されたポリペプチドは、てんかんに関係する突然変異の他にも、
置換、欠失、挿入および再配列からなる群より選択される１または複数の突然変
異を起こしていてもよい。これらの突然変異事象は典型的には保存的置換である
。

【００３３】 さらにもう一つの側面として、本発明は、配列番号２に記載の配列を含む単離
されたポリペプチドを提供する。

【００３４】 さらにもう一つの側面として、本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列か
らなるポリペプチドを提供する。

【００３５】 さらにもう一つの側面として、本発明は、少なくとも１つのαサブユニットと
少なくとも１つのβサブユニットとを含む集合した哺乳類ニコチン性アセチルコ
リン受容体である単離されたポリペプチドであって、置換、欠失、挿入および再
配列からなる群より選択される突然変異事象がβサブユニットのＭ２ドメインで
起こっており、前記突然変異事象が、集合した哺乳類ニコチン性アセチルコリン
受容体の機能を、てんかん表現型が生じるように混乱させることを特徴とする単
離されたポリペプチドを提供する。

【００３６】 集合したニコチン性アセチルコリン受容体は、単一のβサブユニットに突然変
異を含んでもよいし、複数のβサブユニットに当然変異を含んでもよい。脳内の
主な機能的ｎＡｃｈＲは、２つのα４サブユニットと３つのβ２サブユニットと
からなる五量体分子であり、突然変異事象はどのβ２サブユニットで起こってい
てもよく、また全てのβ２サブユニットで起こっていてもよい。

【００３７】 さらにもう一つの側面として、本発明は、哺乳類ニコチン性アセチルコリン受
容体の突然変異型βサブユニットであるポリペプチドを製造する方法であって、
（１）上記のＤＮＡ分子を含む発現ベクターでトランスフェクトした宿主細胞を
、ポリペプチド産生に有効な条件で培養する工程、および （２）突然変異型βサブユニットを収集する工程 を含む方法を提供する。

【００３８】 突然変異型βサブユニットを野生型βサブユニットおよびニコチン性アセチル
コリン受容体の他のサブユニットと集合させることによって、集合したｎＡＣｈ
Ｒを収集してもよい。

【００３９】 次に、実質的に精製されたタンパク質またはその断片をさらなる生化学的解析
に使用して、例えばタンパク質結晶のＸ線結晶解析またはＮＭＲなどにより、二
次構造および三次構造を確立することができる。構造の決定により、特定のサブ
ユニットタンパク質を介してｎＡＣｈＲと相互作用する医薬、ｎＡＣｈＲタンパ
ク質全体の電荷配置または他のタンパク質との電荷相互作用を変化させる医薬、
または細胞におけるその機能を変化させる医薬の合理的設計が可能になる。

【００４０】 これらのタンパク質にてんかん（ＡＤＮＦＬＥ）に関与する突然変異が同定さ
れたことで、正常型または突然変異型の遺伝子または遺伝子産物をスクリーニン
グしてその存在を検出するための様々なハイブリダイゼーションおよび免疫測定
法などといった他の応用にもｎＡＣｈＲが役立つことは理解されるだろう。

【００４１】 本発明により、てんかん、特にＡＤＮＦＬＥを処置する治療方法が可能になり
、また、特発性てんかんを診断する方法も可能になる。

【００４２】 さらにもう一つの側面として、本発明は、てんかんを処置する方法であって、
ニコチン性アセチルコリン受容体がβサブユニットのＭ２ドメインに突然変異を
含み、前記突然変異がてんかんの原因となる場合に、そのような処置を必要とす
る対象に、ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的アンタゴニストを投与する
ことを含む方法を提供する。

【００４３】 さらにもう一つの側面として、本発明は、ｎＡＣｈＲがβサブユニットのＭ２
ドメインに突然変異を含み、前記突然変異がてんかんの原因となる場合の、てん
かん処置用医薬の製造を目的とするｎＡＣｈＲの選択的アンタゴニストの使用を
提供する。

【００４４】 一側面として、突然変異型ｎＡＣｈＲに特異的に結合する抗体は、アンタゴニ
ストとして直接使用することができ、あるいはｎＡＣｈＲを発現させる細胞また
は組織に医薬を運ぶためのターゲティング機構またはデリバリー機構として間接
的に使用することもできる。

【００４５】 さらにもう一つの側面として、本発明は、上記のポリペプチドと免疫反応する
が、野生型ニコチン性アセチルコリン受容体またはそのサブユニットとは免疫反
応しない抗体を提供する。

【００４６】 特に、βサブユニットのＭ２ドメインにてんかんの原因となる突然変異を含ん
でいる集合したｎＡＣｈＲに対する抗体を提供する。当業者には理解されるであ
ろうが、この抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。

【００４７】 あるいは、一部の突然変異体では、第２の突然変異を内包しているもう１コピ
ーの相同サブユニット遺伝子を導入することによって疾患を予防するか、突然変
異を変化させるか、または別の遺伝子を使って負の効果を遮断することができる
だろう。

【００４８】 さらなる一側面として、本発明は、てんかんを処置する方法であって、上記Ｄ
ＮＡ分子のいずれか一つの相補鎖である単離されたＤＮＡ分子であり、かつｎＡ
ＣｈＲの突然変異型βサブユニットをコードするｍＲＮＡとハイブリダイズする
ｍＲＮＡをコードする前記単離されたＤＮＡ分子を、そのような処置を必要とす
る対象に投与することを含む方法を提供する。

【００４９】 さらにもう一つの側面として、本発明は、本発明のＤＮＡ分子の相補鎖である
単離されたＤＮＡ分子であり、かつｎＡＣｈＲの突然変異型βサブユニットをコ
ードするｍＲＮＡとハイブリダイズするｍＲＮＡをコードする前記単離されたＤ
ＮＡ分子の、てんかん処置用医薬の製造における使用を提供する。

【００５０】 典型的には、ｎＡＣｈＲを構成するサブユニットをコードするポリヌクレオチ
ドの相補鎖を発現させるベクターを、対象に投与して、てんかん、特にＡＤＮＦ
ＬＥを処置または予防することができる。アンチセンス法には、アンチセンスオ
リゴヌクレオチドの使用、アンチセンスＲＮＡの注入、およびアンチセンスＲＮ
Ａ発現ベクターのトランスフェクションを含む様々なアプローチを使用すること
ができる。細胞または組織にベクターを導入するには数多くの方法を利用するこ
とができ、それらはインビボ、インビトロおよびエクスビボでの使用に等しく適
している。エクスビボ治療法の場合は、患者から採取した幹細胞にベクターを導
入し、クローン増殖させて、自家移植によって同じ患者に戻すことができる。ト
ランスフェクション、リポソーム注射、またはポリカチオン性アミノポリマーに
よる送達は、当技術分野で周知の方法を用いて達成することができる（例えばＧ
ｏｌｄｍａｎら，１９９７を参照されたい）。

【００５１】 さらなる態様として、本発明のアンタゴニスト、抗体、相補配列またはベクタ
ーはいずれも、他の適当な治療薬と組み合わせて投与することができる。適当な
薬剤の選択は、通常の薬学的原理に従って、当業者が行うことができる。治療薬
の併用は相乗的に作用して、上述した様々な障害の処置または予防をもたらすだ
ろう。このようにして、各薬剤の投与量の減らしても治療効果を得ることができ
、よって有害な副作用の可能性を減らすことができる。

【００５２】 突然変異型ｎＡＣｈＲの選択的アンタゴニストは当技術分野で周知の方法を用
いて製造することができる。特に、突然変異型ｎＡＣｈＲを使用することにより
、特発性てんかんの原因となる突然変異型βサブユニットに特異的な抗体を製造
するか、医薬のライブラリーをスクリーニングして突然変異型ｎＡＣｈＲを特異
的に結合するものを同定することができる。そのような抗体には、例えばポリク
ローナル、モノクローナル、キメラおよび一本鎖抗体などがあるが、これらに限
るわけではない。

【００５３】 抗体を産生させるために、上記のポリペプチドまたはその任意の断片もしくは
オリゴペプチド（ただし本発明の突然変異を含むものとする）であって免疫原性
を持つものを注射することにより、ウサギ、ラット、ヤギ、マウス、ヒトなどを
含む様々な宿主を免疫化することができる。免疫応答を増大させるために様々な
アジュバントを使用することができる。アジュバントには、例えばフロインドア
ジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチンなどの界面活性
物質があるが、これらに限るわけではない。ヒトに使用されるアジュバントには
、例えばＢＣＧ（カルメット−ゲラン菌）およびコリネバクテリウム・パルブム
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）がある。

【００５４】 突然変異型ｎＡＣｈＲに対する抗体を誘導するために使用されるオリゴペプチ
ド、ペプチドまたは断片は、少なくとも約５アミノ酸、より好ましくは少なくと
も約１０アミノ酸からなるアミノ酸配列を持つことが好ましい。また、これらの
オリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部
と同一であって、小さい天然分子の全アミノ酸配列を含むことが好ましい。ｎＡ
ＣｈＲアミノ酸の短いストレッチを別のタンパク質（例えばＫＬＨ）のものに融
合し、そのキメラ分子に対する抗体を産生させてもよい。

【００５５】 突然変異型ｎＡＣｈＲに対する抗体は、培養連続継代性細胞系による抗体分子
の産生を可能にする任意の技術を使って製造することができる。これらの技術に
は、例えばハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ
−ハイブリドーマ技術などがあるが、これらに限るわけではない（例えばＫｏｈ
ｌｅｒら，１９７５；Ｋｏｚｂｏｒら，１９８５；Ｃｏｔｅら，１９８３；Ｃｏ
ｌｅら，１９８４を参照されたい）。

【００５６】 抗体は、リンパ球集団におけるインビボ産生を誘導するか、文献に開示されて
いる免疫グロブリンライブラリーまたは高度に特異的な結合試薬のパネルをスク
リーニングすることによって作製することもできる（例えばＯｒｌａｎｄｉら，
１９８９；Ｗｉｎｔｅｒら，１９９１）。

【００５７】 ｎＡＣｈＲに対する特異的結合部位を含む抗体断片も生成させることができる
。例えばそのような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成するＦ（ａ
ｂ’）２断片、およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド橋を還元することによ
って生成するＦａｂ断片がある。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して
、所望の特異性を持つモノクローナルＦａｂ断片を迅速かつ容易に同定できるよ
うにしてもよい（例えばＨｕｓｅら，１９８９を参照されたい）。

【００５８】 所望の特異性を持つ抗体を同定するためのスクリーニングには、様々な免疫測
定法を使用することができる。確立した特異性を持つポリクローナルまたはモノ
クローナル抗体を使用する競合結合測定法または免疫放射線測定法のプロトコー
ルは、当技術分野では数多く知られている。そのような免疫測定法では通例、ｎ
ＡＣｈＲとその特異的抗体との複合体形成が測定される。２つの非干渉ｎＡＣｈ
Ｒエピトープと反応するモノクローナル抗体を用いる２サイトモノクローナル免
疫測定法は好ましいが、競合結合測定法も使用することができる。

【００５９】 本発明のさらにもう一つの側面によれば、特に精製された突然変異型ｎＡＣｈ
Ｒポリペプチドおよびそれらを発現させる細胞は、様々な技術による候補医薬の
スクリーニングに有用である。ＡＤＮＦＬＥなどの特発性てんかんの処置に有用
な治療薬が本発明のポリペプチドに対して結合親和性を示しそうなことは理解さ
れるだろう。そのような技術には、例えば突然変異型ｎＡＣｈＲポリペプチドに
対して適切な結合親和性を持つ化合物のハイスループットスクリーニング（例え
ばＰＣＴ出願公開ＷＯ８４／０３５６４参照）があるが、これに限るわけではな
い。前記の技術では、多数の小ペプチド試験化合物を固体基板上で合成し、ｎＡ
ＣｈＲポリペプチド結合と洗浄によって検定することができる。結合したｎＡＣ
ｈＲポリペプチドは、当技術分野で周知の方法によって検出される。この技術の
変形として、本発明の精製ポリペプチドをプレートに直接コーティングして、相
互作用する試験化合物を同定することもできる。本発明では、突然変異型ｎＡＣ
ｈＲを特異的に結合する能力を持つ中和抗体が突然変異型ｎＡＣｈＲへの結合に
関して試験化合物と競合する競合薬物スクリーニング検定の使用も考えられる。
このようにして、抗体を使って、突然変異型ｎＡＣｈＲの１または複数の抗原決
定基を共有するペプチドの存在を検出することができる。

【００６０】 本発明は、形質転換細胞、トランスフェクト卵母細胞またはトランスジェニッ
ク動物内で本発明のポリペプチドを使って化合物をスクリーニングするのに、と
りわけ有用である。突然変異ｎＡＣｈＲを含む培養細胞またはトランスジェニッ
ク動物に特定の薬物を添加または投与し、受容体の電流に対する効果を、野生型
ｎＡＣｈＲを含む細胞または動物の電流と比較する。電流をより正常なレベルに
変化させる薬物候補は、ｎＡＣｈＲに関連する疾患の処置または予防に役立つ。

【００６１】 上記の治療方法はいずれも、そのような治療を必要とする例えばイヌ、ネコ、
ウシ、ウマ、ウサギ、サル、そして最も好ましくはヒトなどの哺乳動物を含む任
意の対象に適用することができる。

【００６２】 ｎＡＣｈＲをコードするポリヌクレオチド配列はＡＤＮＦＬＥなどの特発性て
んかんの診断に使用することができるので、てんかんまたはてんかんに対する素
因の診断に本発明のＤＮＡ分子を使用することも考えられる。

【００６３】 本発明のもう一つの態様として、診断目的に使用することができるポリヌクレ
オチドには、オリゴヌクレオチド配列、ゲノムＤＮＡ、ならびに相補ＲＮＡおよ
びＤＮＡ分子が包含される。これらのポリヌクレオチドを使用して、生物学的試
料中の遺伝子発現を検出および定量することができる。診断に使用されるゲノム
ＤＮＡは体細胞、例えば血中、組織生検、外科標本、または剖検材料中に存在す
る体細胞などから得ることができる。ＤＮＡを単離して特定の配列の検出に直接
使用してもよいし、分析に先だってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅して
もよい。同様に、ＲＮＡまたはｃＤＮＡも、ＰＣＲ増幅を行ってまたはＰＣＲ増
幅を行わずに使用することができる。特異的核酸配列の検出には、特異的オリゴ
ヌクレオチドを使ったハイブリダイゼーション、ＰＣＲマッピング、ＲＮアーゼ
保護、および他の様々な方法を使用することができる。例えば、本発明に記載の
ＣＨＲＮＢ２サブユニットにおけるＧからＡへの特異的突然変異には、制限酵素
消化および制限酵素マッピングを使用することができる。このサブユニットのＭ
２ドメインにおいてＧからＡへのトランジションが起こるとＮｌａＩＩＩ制限部
位が生成する。患者および健常対照から得たＤＮＡは、配列番号３および４に記
載のオリゴヌクレオチドを使って増幅することができる。次に増幅産物をＮｌａ
ＩＩＩで消化してフィンガープリントを作成し、それを野生型ＣＨＲＮＢ２のＤ
ＮＡフィンガープリントと比較することができる。また、ｎＡＣｈＲから得た増
幅産物の直接ヌクレオチド配列決定を使用することもできる。試料アンプリコン
の配列を野生型アンプリコンの配列と比較して、ヌクレオチドの相違の有無を決
定する。

【００６４】 さらなる一側面として、本発明は、てんかんの診断における上記ポリペプチド
の使用を提供する。

【００６５】 ｎＡＣｈＲを構成するタンパク質に基づいて診断測定を行う場合、様々なアプ
ローチが考えられる。例えば診断は、ｎＡＣｈＲを形成する正常タンパク質と突
然変異型タンパク質の電気泳動移動度の差をモニターすることによって達成する
ことができる。このようなアプローチは、電荷置換が存在する突然変異体の同定
、または挿入、欠失もしくは置換によって、結果として生じたタンパク質の電気
泳動移動度に、有意な変化が起こっている突然変異体の同定に、とりわけ役立つ
だろう。また診断は、正常タンパク質と突然変異型タンパク質とのタンパク質分
解による切断パターンの相違または様々なアミノ酸残基のモル比の相違に基づく
か、遺伝子産物の機能の変化を実証する機能測定によって行うこともできる。

【００６６】 もう一つの側面として、突然変異型ｎＡＣｈＲを特異的に結合する抗体をてん
かんの診断に使用したり、完全なｎＡＣｈＲまたはｎＡＣｈＲのアゴニスト、ア
ンタゴニストもしくは阻害剤で処置される患者をモニタリングするための測定法
に使用したりすることができる。診断目的に有用な抗体は、治療薬に関して上述
したものと同じ方法で製造することができる。ｎＡＣｈＲに関する診断測定法に
は、抗体とラベルとを利用してヒト体液中または細胞もしくは組織の抽出物中の
突然変異型ｎＡＣｈＲを検出する方法が含まれる。抗体は修飾を施してまたは修
飾を施さずに使用することができ、標識はレポーター分子の共有結合または非共
有結合によって行うことができる。

【００６７】 突然変異型ｎＡＣｈＲの存在を測定するためのプロトコルは、例えばＥＬＩＳ
Ａ、ＲＩＡおよびＦＡＣＳなど、当技術分野では種々知られており、ＡＤＮＦＬ
Ｅなどのてんかんを診断するための基礎になる。突然変異型受容体の発現は、哺
乳類試験対象（好ましくはヒト）から採取した体液または細胞抽出物を、その受
容体に対する抗体と、複合体の形成に適した条件で混合することによって立証さ
れる。複合体形成量は様々な方法、好ましくは光度測定手段によって定量するこ
とができる。突然変異型受容体に特異的な抗体は、前記突然変異型受容体を発現
させる個体にしか結合せず、野生型受容体だけを発現させる個体（すなわち正常
な個体）には結合しない。これはこの疾患を診断するための根拠となる。

【００６８】 患者がてんかんであると診断されたら、有効な処置を開始することができる。
これらの処置としては、突然変異型受容体に対する選択的アンタゴニスト、例え
ば上述の抗体または突然変異型相補鎖などの投与を挙げることができる。この治
療は、野生型受容体の導入（特に遺伝子治療法による導入）によって補助するこ
ともできる。通例、適当な完全長ｎＡＣｈＲサブユニットまたはその誘導体の断
片を発現させる能力を持つベクターを投与することができる。この発現ベクター
は、正常タンパク質のレベルが正常な受容体形成にとって十分になるように自分
自身の発現を駆動することができなくてはならない。

【００６９】 もう１つの治療補助法として、実質的に精製されたｎＡＣｈＲまたはｎＡＣｈ
Ｒサブユニットポリペプチドと医薬的に許容できる担体とを投与することができ
る。本発明の医薬組成物は、所望の純度を持つｎＡＣｈＲまたはｎＡＣｈＲサブ
ユニットポリペプチドまたはその活性断片もしくは変異体を、許容できる周知の
担体、賦形剤または安定剤と混合することによって製造される。許容できる担体
、賦形剤または安定剤は、使用される投与量および濃度で無毒性であり、例えば
リン酸、クエン酸および他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸などの酸化防
止剤、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン
または免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポ
リマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどの
アミノ酸、単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノースまたはデキストリン
を含む他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトールまたはソルビト
ールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン、および／またはＴ
ｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのノ
ニオン界面活性剤などが挙げられる。

【００７０】 本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、または
ベクターは、いずれも他の適当な治療薬と組み合わせて投与することができる。
適当な薬剤の選択は、通常の薬学的原理に従って、当業者が行うことができる。
治療薬の併用は相乗的に作用して、上述した様々な障害の処置または予防をもた
らすだろう。このようにして、各薬剤の投与量の減らしても治療効果を得ること
ができ、よって有害な副作用の可能性を減らすことができる。

【００７１】 さらなる態様として、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列のいずれかに由
来するオリゴヌクレオチド、またはさらに長い断片を、マイクロアレイにおける
ターゲットとして使用することもできる。マイクロアレイは、多数の遺伝子の発
現レベルを同時にモニタリングするためにすることができ、また遺伝子変異体、
突然変異および多型を同定するために使用することもできる。この情報は、遺伝
子機能の決定、疾患の遺伝的根拠の理解、ならびに治療薬の開発およびその活性
のモニタリングに使用することができる。マイクロアレイは、当技術分野で知ら
れる方法を使って製造、使用および解析することができる（例えばＳｃｈｅｎａ
ら，１９９６；Ｈｅｌｌｅｒら，１９９７を参照されたい）。

【００７２】 本発明は、本発明のＤＮＡ分子で形質転換された遺伝子改変（ノックアウトま
たはノックイン）非ヒト動物モデルも提供する。これらの動物は、ｎＡＣｈＲに
関係する疾患の機序を研究するためのｎＡＣｈＲ機能の研究、候補医薬化合物の
スクリーニング、突然変異型ｎＡＣｈＲを発現させる外植哺乳類細胞培養の作製
、および考え得る治療的介入の評価に役立つ。

【００７３】 本発明の動物モデルでの使用に適した動物種は、例えばラット、マウス、ハム
スター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタならびにサルお
よびチンパンジーなどの非ヒト霊長類であるが、これらに限るわけではない。初
期の研究には遺伝子改変マウスおよびラットが極めて望ましい。マウスやラット
は飼育が比較的容易であり、寿命が短いからである。研究によっては、トランス
ジェニック酵母またはトランスジェニック無脊椎動物が適当で好ましいかもしれ
ない。なぜならこれらは迅速なスクリーニングが可能であり、取り扱いがはるか
に容易だからである。長期の研究には、ヒトに類似していることから非ヒト霊長
類が望ましいだろう。

【００７４】 突然変異型ｎＡＣｈＲの動物モデルを作出するには、いくつかの方法を使用す
ることができる。これらの方法としては、例えば相同動物遺伝子における特異的
突然変異の生成、相同組換えによる野生型ヒト遺伝子および／またはヒト化動物
遺伝子の挿入、野生型もしくは突然変異型プロモーター配列または人工プロモー
ター配列を用いたゲノムコンストラクトまたはミニ遺伝子ｃＤＮＡコンストラク
トとしての突然変異型（単一または多重）ヒト遺伝子の挿入、または相同組換え
による内因性遺伝子の人工改変断片の挿入が挙げられる。改変には、突然変異型
停止コドンの挿入、ＤＮＡ配列の欠失、またはＣｒｅリコンビナーゼなどの酵素
によって認識される組換え配列（ｌｏｘ ｐ部位）の包含などがある。

【００７５】 好ましいトランスジェニックマウスを作出するために、標準的な卵母細胞マイ
クロインジェクション技術または胚性幹細胞へのトランスフェクションもしくは
マイクロインジェクションを用い、突然変異型の特定ｎＡＣｈＲサブユニットを
マウス生殖系列に挿入することができる。あるいは、内因性ｎＡＣｈＲサブユニ
ット遺伝子を不活化または置換することが望ましい場合には、胚性幹細胞を使っ
た相同組換えを適用することもできる。

【００７６】 卵母細胞注入の場合は、１または複数コピーの突然変異型ｎＡＣｈＲサブユニ
ット遺伝子を、受精直後のマウス卵母細胞の前核に挿入することができる。次に
、この卵母細胞を偽妊娠養母に再移植する。次に、生産マウスを、特定のヒトサ
ブユニット遺伝子配列の存在に関する尾ＤＮＡの分析によって、組み込まれた遺
伝子についてスクリーニングすることができる。導入遺伝子は、ＹＡＣ、ＢＡＣ
、ＰＡＣまたは他の染色体ＤＮＡ断片として注入された完全なゲノム配列である
か、天然プロモーターまたは異種プロモーターを持つｃＤＮＡであるか、または
コード領域および最適な発現に必要であることがわかった他の配列の全てを含む
ミニ遺伝子であることができる。

【００７７】 さらにもう一つの側面によれば、本発明は、候補医薬化合物のスクリーニング
を目的とする遺伝子改変非ヒト動物の使用を提供する。

【００７８】 本明細書では多数の従来技術刊行物を参照するが、この参照は、これらの文書
がオーストラリアまたは他の国において当技術分野に共通する一般知識の一部を
形成するという自白を構成するものでないことは、明瞭に理解されるだろう。

【００７９】 本明細書および本願特許請求の範囲の全体を通して、「を含む」という用語は
、文脈上別段の必要がない限り、非排他的な意味で使用される。

【００８０】 図面の簡単な説明 本発明の好ましい形態を一例として下記の実施例および添付の図面を参照して
説明する。 図１は、突然変異型ＣＨＲＮＢ２アミノ酸２８７（ｍで示す）を持つ家族を示
すスコットランド人家系の系統図である。 図２は、ｃ１０２５Ｇ→Ａトランジションを示すＣＨＲＮＢ２のＤＮＡ配列の
トレースである。上側のクロマトグラムは突然変異を示し、下側のクロマトグラ
ムは対照配列を示す。 図３は、Ｍ２ ＣＨＲＮＢ２ドメインにおけるホモロジーの比較が可能なよう
に様々な遺伝子の整列を示す図である。アミノ酸２８７を四角い枠で囲んである
。 図４は、図Ａの左側は、２つのα４サブユニットと３つのβ２サブユニットと
が集合することによって生成するニューロンα４β２ヘテロ五量体型受容体を表
す図である。右側は、α４β２を、２つの潜在的ＡＣｈ結合部位を持つ五量体と
して表した図である。「β２^＊」はＶ２８７Ｍアミノ酸置換を表す。ＡＣｈ受容
体は突然変異型β２サブユニットを含まずに集合するか（α４β２野生型受容体
）、または１、２もしくは３個の突然変異型β２^＊サブユニットを含んで集合す
ることができる。図Ｂの上側は、適用するＡＣｈ濃度（水平方向のバー）を４ま
たは５段階に連続して増加させることによって惹起された電流トレースを表す図
である。各バー上の値は細胞に適用したＡＣｈの濃度を示す。下側は、ＡＣｈ親
和性の相違をｌｏｇ−ｌｏｇプロットで強調した図である。電流（上側の図で測
定されたもの）の絶対値の対数Ｌｏｇ（−Ｉ）をＡＣｈ濃度の対数（Ｌｏｇ［Ａ
Ｃｈ］）の関数としてプロットしてある。−Ｉと［ＡＣｈ］の単位はそれぞれｎ
ＡおよびｎＭである。値は平均±ＳＥＭであり、ｎ＝９（α４β２）、ｎ＝１７
（α４β２^＊）およびｎ＝１０（α４［β２^＊＋β２］）である。実線は全デー
タポイントの最適な線形回帰である。図Ｃの上側の図は、野生型または突然変異
型β２サブユニットを発現させる卵母細胞で記録された代表的な巨視的電流であ
る。４種類のＡＣｈ濃度（０．１、０．２、０．８および８μＭ）によって誘発
された電流を重ね合わせてある。細胞は−１００ｍＶに保持し、１２０秒に１回
、ＡＣｈに曝露した（１０秒）。バーはＡＣｈ適用を示す。下側の図はα４β２
、α４β２^＊およびα４（β２^＊＋β２）に関するＡＣｈ活性化曲線である。用
量反応曲線は各細胞の最大電流強度に対して規格化した。値は平均±ＳＥＭであ
る。各ＡＣｈ濃度について３〜８回の独立した測定の平均をとった。

【００８１】 発明実施の形態 実施例１：罹患家族の臨床診断 正常知能の白人女性である発端者（Ｖ−１；図１）は１１歳の時に夜間発作を
呈した。これらの発作の典型は睡眠中に呼吸困難を感じて目覚めることである。
これは数秒間しか続かず、その後は息が止まっているように見え、呻吟する。時
にはすぐに回復して、泣いたり叫んだりする。また、場合によっては、左腕が強
直性伸展を起こしてボールのように丸くなることもある。これは数分間続き、こ
のエピソード全体が、典型的には１５分ほどの間隔で一晩中繰り返される。彼女
は上記の事象を全て明確に記憶している。このような事象は昼間の睡眠中にも起
こる。

【００８２】 ビデオＥＥＧ遠隔測定では、ＥＥＧトレースは筋アーチファクトによって著し
く不明瞭になったものの、発作中に変化は認められなかった。発作間欠期には、
右中心頭頂部にいくらかシャープな乱れが時折記録された。

【００８３】 彼女の発作は当初はカルバマゼピンで十分に抑制されたが、再発し、さらなる
抑制には多少の困難が伴うようになった。現在はフェニトインとトピラメートの
併用により、彼女の発作は起こらなくなっている。

【００８４】 この家系には、他にも４世代にわたって９人の罹患家族がいる。これらの個体
における症状は軽度だったために治療を受けることがなかったか、またはカルバ
マゼピンで症状を容易に抑制することができた。一部の家族では発作が自発的に
寛解したが、８１歳で最高齢の生存家族（ＩＩ−２；図１）は、フェニトインを
服用しているが、発作が時折起こる状態が続いている。

【００８５】 実施例２：ＣＨＲＮＢ２の突然変異解析 上記家系の８人の家族（患者６人、絶対保因者１人および罹患していないその
妻）から同意を得た上で採取したＤＮＡの直接シークエンシングによって、ＣＨ
ＲＮＢ２遺伝子の第２膜貫通ドメインをスクリーニングした（図１）。Ｗｙｍａ
ｎおよびＷｈｉｔｅの方法（１９８０）を改良した方法で、末梢血試料からＤＮ
Ａを抽出した。抽出したＤＮＡの増幅に使用したＣＨＲＮＢ２特異的プライマー
を配列番号３および４に示す。これらのプライマーはＣＨＲＮＢ２遺伝子のうち
Ｍ２ドメインを含む４６８塩基対のセグメントを増幅する。ＰＣＲ反応系は６７
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１６．５ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、６．５
μＭ ＥＤＴＡ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０％Ｄ
ＭＳＯ、０．１７ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、１
５μｇ／ｍｌの各プライマー、１００Ｕ／ｍｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼお
よび１０μｇ／ｍｌのゲノムＤＮＡを含んだ。ＰＣＲ反応は、９４℃で６０秒、
６０℃で９０秒、および７２℃で９０秒を１０サイクルした後、９４℃で６０秒
、５５℃で９０秒および７２℃で９０秒を２５サイクル実施した。続いて７２℃
で１０分間の最終伸長反応を行った。

【００８６】 ＰＣＲ増幅したテンプレートはＱｉａＱｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｒｅｐｓ（Ｑｉ
ａｇｅｎ）を使って製造者の方法に従って配列決定用に精製した。精製したＣＨ
ＲＮＢ２ ＰＣＲ断片を配列決定するために使用したプライマーは最初の増幅段
階に使用したプライマー（配列番号３および４）と同一である。各配列決定反応
につき、２５ｎｇのプライマーと１００ｎｇの精製ＰＣＲテンプレートとを使用
した。どの配列決定反応にも、ＢｉｇＤｙｅシークエンシングキット（ＡＢＩ）
を製造者の仕様書に従って使用した。生成物をＡＢＩ３７７シークエンサーにか
け、ＥｄｉｔＶｉｅｗプログラムを使って解析した。

【００８７】 この配列決定法により、発端者および突然変異の存在が明らかになった他の家
族（図１）では、ＣＨＲＮＢ２のＭ２ドメイン中にＧ→Ａトランジションが見つ
かった。突然変異型ＣＨＲＮＢ２遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号１によっ
て表される。ｃ１０２５Ｇ→Ａ突然変異（図２）により、ＮＣＢＩデータベース
での名称を使うと２８７位、Ｒｅｍｐｅｌら（１９９８）の番号付与法では２６
２位にある高度に保存されたバリンが、メチオニンで置換される。アミノ酸配列
は配列番号２によって表される。すべての患者および罹患していない絶対保因者
はこの突然変異を持っていた。

【００８８】 ＣＨＲＮサブユニットには、特に４つの膜貫通ドメイン中に、大きな種間およ
びサブユニット間ホモロジーがある。ＣＨＲＮＢサブユニットＣＨＲＮＢ２、Ｃ
ＨＲＮＢ３およびＣＨＲＮＢ４は全て脳内で発現される。ＣＨＲＮＢ３のＭ２ド
メインには他の２つと５９％のホモロジーしかなく、ラットのインビトロ研究に
より、単独でＣＨＲＮＡサブユニットと同時発現させると、ＣＮＲＮＢ３は機能
的な受容体に集合しないことがわかる。したがってβ３型サブユニットは、ニコ
チンおよびアセチルコリン以外のリガンドによって開閉されるイオンチャネルに
おいて、その機能を果たすのだろう（Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙら，１９９３）。Ｃ
ＨＲＮＢ２とＣＨＲＮＢ４のＭ２ドメイン同士はほとんど完全なホモロジーを持
ち、特にバリン２８７はこれらのサブユニットで完全に保存されているだけでな
く、他の多くの種でも保存されている（図３）。筋肉でのみ発現されるＣＨＲＮ
Ｂ１はこの位置にロイシンを持つ。これは、バリン２８７が脳における正常なイ
オンチャネル機能にとって不可欠であることを示しているのかもしれない。Ｖ２
８７Ｍ突然変異はイオンポアを裏打ちするＭ２ドメインの細胞外末端近くに位置
する（図４Ａ）。バリン２８７は開状態および閉状態のイオンチャネルのポアに
面しており（Ｄｅｖｉｌｌｉｅｒｓ−Ｔｈｉｅｒｙら，１９９３）、バリン２８
７をメチオニンで置換すると、Ａｃｈ親和性が見かけ上１０倍増加する。

【００８９】 実施例３：Ｖ２８７Ｍ突然変異の確認−制限酵素解析 上記Ｇ→ＡトランジションによってＮｌａＩＩＩ制限部位が生成する。配列番
号３および４で表されるプライマーを使用すると、正常対立遺伝子中に存在する
４つのＮｌａＩＩＩ部位を含む４６８塩基対の断片が増幅される。この正常アン
プリコンをＮｌａＩＩＩで消化すると３１８、７８、５４、９および９塩基対の
断片が生成するだろう。しかし上記Ｇ→Ａトランジションを含むアンプリコンを
ＮｌａＩＩＩで消化した場合には、２７３、７８、５４、４５、９および９塩基
対の断片が生成するだろう。３１８塩基対と２７３塩基対のバンドは２％アガロ
ースゲルで容易に検出することができるので、この系は罹患家族における突然変
異の存在を確認する仕組みになる。

【００９０】 実施例４：Ｖ２８７突然変異の確認−ＳＳＣＰ解析 ＣＨＲＮＢ２ Ｍ２ドメイン中に見いだされる観察されたアミノ酸置換が研究
対象家系の罹患家族に特異的であることを確認するために、１０２人の匿名オー
ストラリア献血者から集めたＤＮＡに対して、一本鎖高次構造多型解析を行った
。対照ドナー試料から得たＤＮＡと罹患家族から得たＤＮＡのＰＣＲ増幅に使用
したプライマーは配列番号４および５によって表される。これらのプライマーに
より、以下の条件で、２２０塩基対の産物が増幅された。すなわちＰＣＲ反応系
は６７ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１６．５ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、
６．５μＭ ＥＤＴＡ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１
０％ＤＭＳＯ、０．１７ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０ｍＭβ−メルカプトエタノー
ル、１５μｇ／ｍｌの各プライマー、２００μＣｉ／ｍｌ ［α−３２Ｐ］ｄＣ
ＴＰ、１００Ｕ／ｍｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよび１０μｇ／ｍｌのゲ
ノムＤＮＡを含んだ。ＰＣＲ反応は、９４℃で６０秒、６０℃で９０秒、および
７２℃で９０秒を１０サイクルした後、９４℃で６０秒、５５℃で９０秒および
７２℃で９０秒を２５サイクル実施した。続いて７２℃で１０分間の最終伸長反
応を行った。次に、反応が完了したＰＣＲ反応系を等体積のホルムアミドローデ
ィング緩衝液（９６％ホルムアミド、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ブロモフェノ
ールブルー；０．１％キシレンシアノール）と混合し、９５℃に３分間加熱した
後、氷で急冷した。次に５μｌの各試料を１０％（４９：１）ポリアクリルアミ
ド、５％グリセロールおよびＴＢＥを含むゲルに充填した。そのゲルを７００ボ
ルト、室温で２０時間泳動し、乾燥し、Ｘ線フィルムに露出した。

【００９１】 バンドシフトが確認されたが、シフトはＧ→Ａトランジションを持つ家族だけ
に観察され、１０２個の対照ＤＮＡ試料にはいずれにも観察されなかった。ＳＳ
ＣＰ解析によって検出されたバンドシフトはＧ→Ａトランジションだけに関連づ
けることができる。なぜならＰＣＲ産物中に他の塩基変化は検出されなかったか
らである。このヌクレオチド変化が罹患家族だけに認められ、健常対照群には認
められなかったという事実から、この変化は機能上の意義を持つことが示唆され
る。

【００９２】 実施例５：Ｖ２８７Ｍ突然変異の機能上の意義 β２ Ｖ２８７Ｍ突然変異がα４β２ｎＡＣｈＲの生理学的性質に及ぼす効果
を明らかにするために、ＮｅｌｓｏｎおよびＬｏｎｇ（１９８９）に記載のＰＣ
Ｒ法に従って、β２コード配列にＶ２８７Ｍアミノ酸置換を導入した。４１１塩
基対のＮｈｅＩ／ＰｍｌＩ突然変異導入カセットを配列決定して、Ｖ２８７Ｍ突
然変異の存在を確認した。標準的方法に基づいて、ステージＶまたはＶＩのアフ
リカツメガエル卵母細胞を単離し、２ｎｇのＤＮＡ溶液を核注入した（Ｂｅｒｔ
ｒａｎｄら，１９９１）。α４β２、α４β２Ｖ２８７Ｍおよびα４（β２＋β
２Ｖ２８７Ｍ）受容体の機能的再構成を行うために、ＣＨＲＮＡ４（Ｍｏｎｔｅ
ｇｇｉａら，１９９５）、ＣＨＲＮＢ２およびＣＨＲＮＢ２−Ｖ２８７Ｍサブユ
ニットをコードするｃＤＮＡをそれぞれ１：１、１：１および２：１：１のモル
比で混合した。ＤＮＡ注入後は、８８ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＫＣｌ、２．４
ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、０．８ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．３ｍＭ Ｃａ（ＮＯ_３）_２ 、０．４ｍＭ ＣａＣｌ_２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）を
含む標準Ｂａｒｔｈ溶液中で卵母細胞を２〜３日間１８℃に保ち、カナマイシン
（２０μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびストレプトマイシ
ン（１００μｇ／ｍｌ）を補足した。

【００９３】 巨視的電流は、ＧＥＮＥＣＬＡＭＰ５００増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔｓ）を使って、２電極電圧固定法により、１８℃で記録した。ホウケイ酸
塩電極に３Ｍ ＫＣｌを充填し、卵母細胞に、８２．５ｍＭ ＮａＣｌ、２．５
ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５μＭ硫酸
、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）を含む溶液を連続的に灌流適用
した。以降の実験にはＡｃｈ（Ｆｌｕｋａ）をこの溶液に希釈して使用した。重
力によって落ちる溶液を、コンピュータ制御の電磁弁を通して、記録槽に適用し
た。どの実験でも保持電位は−１００ｍＶとした。

【００９４】 飽和濃度のＡｃｈに曝露すると、α４β２含有受容体およびα４β２Ｖ２８７
Ｍ含有受容体は強い電流（＞５μＡ）を与えた。しかし低濃度のＡｃｈでは、こ
れら２タイプの受容体の間に相違が観察された。α４β２Ｖ２８７Ｍサブユニッ
トを含む卵母細胞の場合、信頼できるイオン電流（８１±２４ｎＡ、ｎ＝１８）
を活性化するには３ｎＭ Ａｃｈで既に十分であったが、野生型受容体では同じ
ような強度の電流（６５±２２ｎＡ、ｎ＝９）を誘発するのに５０ｎＭ Ａｃｈ
が必要だった（図４Ｂ）。

【００９５】 これらの相違をさらに特徴づけるために、非脱感作濃度またはわずかに脱感作
濃度のＡｃｈを４または５段階に分けて連続して増加させながら適用することに
よって誘発した電流を記録した。代表的な電流の記録結果を図４Ｂの上側に図に
示す。図４Ｂの下側の図は、Ａｃｈが誘発した電流（絶対値）の対数対アゴニス
ト濃度の対数のプロットを表し、予想される線形関係を示している。α４β２Ｖ
２８７ＭはＡｃｈ感度が野生型受容体よりも約１桁高く、突然変異型受容体の方
がＡｃｈに対して感受性が高いという初期の定性的観察結果が確認された。

【００９６】 Ａｃｈ感度をさらに調べるために、対照受容体と突然変異型受容体の両方につ
いて、用量反応関係を広い濃度範囲にわたって決定した。図４Ｃ（上図）は、０
．１、０．２、０．８および８μＭの外部Ａｃｈによって誘発される電流を重ね
合わせたものである。Ａｃｈ感度は、ピーク電流をアゴニスト濃度の対数に対し
てプロットすることによって決定した（図４Ｃ、下図）。α４β２活性化曲線を
よく観察すると、これらは２つのヒルの式の和によって最もうまく記述されるこ
とが示唆される（下記参照、図４Ｃの実線、下図）。Ａｃｈ活性化曲線の大半は
二相性で高親和性成分と低親和性成分があるらしく、そのため、Ａｃｈ用量反応
関係は、２つの実験的なヒルの式の和、すなわち Ｉ＝Ｉ_ｍａｘ｛［ａ／（１＋ＥＣ５０Ｈ／［ＡＣｈ］）^ｎＨ］＋（１−ａ）／（
１＋ＥＣ５０Ｌ／［ＡＣｈ］^ｎＬ）｝ にもっともうまくフィッティングされる（式中、Ｉ_ｍａｘはＡＣｈ適用によって
誘発される最大電流の強度であり、ＥＣ５０は半値電流活性化に必要なＡＣｈ濃
度であり、［ＡＣｈ］はＡｃｈの濃度であり、ｎはヒル係数である）。高親和性
成分と低親和性成分に関係するパラメーターは、それぞれＨおよびＬによって示
される。パラメータａは、当該濃度範囲における高親和性成分の全電流反応に対
する相対的寄与であり、高親和性部位の割合として表される。表１にこれらのパ
ラメーターの値を示す。データフィットに使用したモデルの範囲内でα４β２Ｖ
２８７Ｍ受容体はＥＣ５０の減少を示すと共に、高親和性成分の相対的寄与の増
加も示した。したがってｌｏｇ−ｌｏｇプロットと用量反応曲線はどちらも、β
２Ｖ２８７Ｍ突然変異に関係する見かけのＡＣｈ親和性の増大の説明になってい
る。

【００９７】 野生型受容体と突然変異型受容体とでは、ピーク電流とプラトー電流の比に、
大きな相違はなかった。このことはＶ２８７Ｍ突然変異が脱感作性に著しい変化
をもたらさないことを示している。

【００９８】 本研究の罹患家族はβ２遺伝子に関してヘテロ接合なので、これらの個体から
得られる細胞は全て、おそらくは野生型サブユニットと突然変異型サブユニット
の両方を発現させるだろう。したがって、野生型β２サブユニットと突然変異型
β２サブユニットの両方を同じ卵母細胞に同時注入した場合の効果を調べる実験
は不可欠である。その結果、同じバッチの卵母細胞内では、飽和ＡＣｈ濃度によ
って誘発される電流は、強度の点では識別することができなかった。対照的に、
見かけのＡＣｈ親和性については明白な相違が観察された。高ＥＣ５０値と低Ｅ
Ｃ５０値はどちらも３つのＶ２８７Ｍβ２サブユニットを含む受容体と同等だっ
た（表１）。また、α４（β２＋β２Ｖ２８７Ｍ）は、α４β２Ｖ２８７Ｍと同
様に、ｌｏｇ−ｌｏｇプロットで、より高い親和性を示した（図４Ｂ）。

【００９９】 これらの知見は、ＡＤＮＦＬＥの常染色体性優性形式の遺伝と合致する。図４
Ａは、野生型サブユニットと突然変異型サブユニットの両方が１つの細胞内で発
現されると、４種類のサブユニットの組合わせが考えられることを示している。
これによれば、受容体の７５％は突然変異型β２サブユニットを含むことになる
ので、突然変異の優性効果は容易に説明することができる。突然変異型β２サブ
ユニットをヘテロ接合体的またはホモ接合体的な組合わせで発現させる卵母細胞
は極めて似た性質を示すので、受容体複合体内にただ一つのβ２突然変異が存在
するだけで、Ｖ２８７Ｍ置換に関係する性質を付与するには十分なのだろう。

【０１００】 実施例６：ｎＡＣｈＲおよび受容体サブユニットの解析 ｎＡＣｈＲおよび受容体サブユニットの構造と機能は以下の方法を使って決定
される。

【０１０１】 分子生物学的研究 ｎＡＣｈＲが全体としてまたは個々のサブユニットを介して既知タンパク質ま
たは未知タンパク質を結合する能力を調べることができる。酵母ツーハイブリッ
ドシステムなどの手法を使って、機能的パートナーを発見し同定することができ
る。酵母ツーハイブリッド法の背後にある原理は、多くの真核転写活性化因子が
、酵母のものを含めて、２つの不連続なモジュラードメインからなっていること
である。第１のドメインはプロモーター配列に結合するＤＮＡ結合ドメインであ
り、第２のドメインはＤＮＡ結合部位の下流にある遺伝子を転写するようにＲＮ
ＡポリメラーゼＩＩ複合体に指示する活性化ドメインである。どちらのドメイン
も単独では転写を活性化することができないので、転写活性化には両方のドメイ
ンが必要である。酵母ツーハイブリッド法では、興味ある遺伝子またはその一部
（ベイト（ＢＡＩＴ））を、それがＤＮＡ結合ドメインを持つペプチドへの融合
物として発現されるような形でクローニングする。第２の遺伝子または遺伝子群
、例えばｃＤＮＡライブラリー由来の遺伝子など（ターゲット（ＴＡＲＧＥＴ）
）は、活性化ドメインへの融合物として発現されるようにクローニングする。興
味あるタンパク質がその結合パートナーと相互作用すると、ＤＮＡ結合ペプチド
と活性化ドメインとが一カ所に集まり、レポーター遺伝子の転写を開始する。第
１のレポーター遺伝子は相互作用タンパク質を含む酵母細胞を選択することにな
る（このレポーターは普通、選択培地での成長に必要な栄養遺伝子である）。第
２のレポーターは確認のために使用され、相互作用タンパク質に反応して発現さ
れるものの、普通、成長には必要でない。

【０１０２】 ｎＡＣｈＲと相互作用する遺伝子およびタンパク質の性質も研究することがで
きるので、これらのパートナーを創薬のターゲットとすることもできる。

【０１０３】 構造研究 ｎＡＣｈＲ組換えタンパク質は細菌、酵母、昆虫および／または哺乳類細胞で
生産し、結晶解析およびＮＭＲ研究に使用することができる。タンパク質の分子
モデリングと共に、構造に基づく創薬を容易にすることができる。

【０１０４】 実施例７：ｎＡＣｈＲサブユニットに対するポリクローナル抗体の作製 ＡＤＮＦＬＥにおけるｎＡＣｈＲのβ２サブユニット中の突然変異を同定し、
よってこの受容体がてんかんに関与することが確認されたので、突然変異型タン
パク質を特異的に結合し、突然変異型タンパク質と正常タンパク質とを識別する
ように、抗体を作製することができる。突然変異したエピトープに特異的な抗体
は、医薬で処置した細胞をスクリーニングしてその医薬の治療能力を評価する細
胞培養アッセイに、とりわけ有用である。

【０１０５】 ポリクローナル抗体を製造するために、特定のｎＡＣｈＲサブユニットアミノ
酸配列に相同な短いペプチドを設計することができる。そのようなペプチドは長
さが通例１０〜１５アミノ酸である。これらのペプチドは、モノクローナル抗体
産生などのさらに後続の実験で異種間相互作用が起こらないように、マウスオル
ソログに対して最もホモロジーの低い領域に設計すべきである。次に、ＰＩＥＲ
ＣＥ（商標）キット（ＰＩＥＲＣＥ）などの市販のキットと共に提供される標準
的プロトコールを用いて、合成ペプチドをビオチン（スルホ−ＮＨＳ−ＬＣビオ
チン）に結合することができる。次に、ビオチン化ペプチドを溶液中のアビジン
との複合体とし、各ペプチド複合体につき２匹のウサギを、投与間隔３週間の４
回の抗原投与（１回につき２００μｇ）によって免疫化する。最初の投与ではフ
ロイント完全アジュバントと混合するが、それ以降の投与ではフロイント不完全
アジュバントと混合する。免疫化が完了した後、ウサギから試験採血し、元のペ
プチドの連続希釈液を使ったドットブロット法によって血清の反応性を検定する
。ウサギが免疫前血清と比較して有意な反応性を示したら、そのウサギを屠殺し
、以降の実験のために免疫血清を分離することができるように、血液を集める。

【０１０６】 この手順を繰り返して野生型の受容体サブユニットに対する抗体を作製する。
これらの抗体は、突然変異型ｎＡＣｈＲサブユニットに対する抗体と共に、様々
な組織における突然変異型の存在および相対レベルを検出するために使用される
。

【０１０７】 実施例８：ｎＡＣｈＲサブユニットに特異的なモノクローナル抗体の作製 ｎＡＣｈＲサブユニットに対するモノクローナル抗体は以下の方法で作製する
ことができる。無傷のｎＡＣｈＲサブユニットタンパク質またはｎＡＣｈＲサブ
ユニットペプチド（野生型または突然変異型）を含む免疫原を、フロイントアジ
ュバントと混合して、マウスに注射する。各マウスには１０〜１００μｇの免疫
原を４回注射する。４回目の注射後にマウスから採取した血液試料を、上記免疫
原に対する抗体の存在について調べる。免疫マウスを屠殺し、脾臓を摘出し、単
細胞浮遊液を調製する（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８）。これらの脾
細胞はリンパ球の供給源として役立ち、そのリンパ球を永久に増殖する骨髄腫パ
ートナー細胞と融合する（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５）。
細胞を９６穴プレートに２×１０^５細胞／ウェルの密度で播種し、個々のウェル
を増殖に関して調べる。次に、これらのウェルを、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡによ
り、野生型または突然変異型サブユニットターゲットタンパク質を使って、ｎＡ
ＣｈＲサブユニット特異抗体の存在について試験する。陽性ウェルの細胞を増殖
させ、サブクローニングして、モノクローナル性を樹立し、確認する。所望の特
異性を持つクローンをマウスで腹水として増殖、成長させた後、プロテインＡセ
ファロースを使ったアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフィーまたはこれらの技術の変形および併用によって精製を行う。

【０１０８】 産業上の利用可能性 本発明はＡＤＮＦＬＥなどの特発性てんかんの診断および処置を可能にするも
のである。

【表１】

【参考文献】

【図面の簡単な説明】

【図１】 突然変異型ＣＨＲＮＢ２アミノ酸２８７（ｍで示す）を持つ家族を示すスコッ
トランド人家系の系統図である。

【図２】 ｃ１０２５Ｇ→Ａトランジションを示すＣＨＲＮＢ２のＤＮＡ配列のトレース
である。上側のクロマトグラムは突然変異を示し、下側のクロマトグラムは対照
配列を示す。

【図３】 Ｍ２ ＣＨＲＮＢ２ドメインにおけるホモロジーの比較が可能なように様々な
遺伝子の整列を示す図である。

【図４】 図Ａの左側は、２つのα４サブユニットと３つのβ２サブユニットとが集合す
ることによって生成するニューロンα４β２ヘテロ五量体型受容体を表す図であ
る。右側は、α４β２を、２つの潜在的ＡＣｈ結合部位を持つ五量体として表し
た図である。図Ｂの上側は、適用するＡＣｈ濃度（水平方向のバー）を４または
５段階に連続して増加させることによって惹起された電流トレースを表す図であ
る。各バー上の値は細胞に適用したＡＣｈの濃度を示す。下側は、ＡＣｈ親和性
の相違をｌｏｇ−ｌｏｇプロットで強調した図である。図Ｃの上側の図は、野生
型または突然変異型β２サブユニットを発現させる卵母細胞で記録された代表的
な巨視的電流である。下側の図はα４β２、α４β２^＊およびα４（β２^＊＋β
２）に関するＡＣｈ活性化曲線である。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ ４Ｃ０８５ Ａ６１Ｐ 25/08 Ｃ０７Ｋ 14/705 ４Ｈ０４５ 43/00 １１１ 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/28 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/21 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/68 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ， ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ Ｎ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ベルコヴィック， サミュエル， フラン ク オーストラリア， ビクトリア 3161， コールフィールド ノース， ポロ パレ ード ７ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA63 CA04 DA02 EA04 GA11 HA11 4B063 QA19 QQ43 QR32 QR55 QS34 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4B065 AA90X AA92X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 AA17 BA01 BA08 BA22 BA23 BA44 CA18 DC50 NA14 ZA061 ZC422 4C085 AA14 BB11 CC03 CC21 DD21 DD62 EE01 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA45 DA50 EA21 FA74

Claims (68)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 哺乳類ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡｃｈＲ）の突
   然変異型βサブユニットをコードする単離されたＤＮＡ分子であって、点突然変
   異、欠失、挿入および再配列からなる群より選択される突然変異事象が、前記哺
   乳類ニコチン性アセチルコリン受容体のβサブユニットのＭ２ドメインをコード
   するヌクレオチドに起こっており、前記突然変異事象が、βサブユニットを含む
   集合した哺乳類ニコチン性アセチルコリン受容体の機能を、てんかん表現型が生
   じるように混乱させることを特徴とする単離されたＤＮＡ分子。
2. 【請求項２】 前記突然変異事象が点突然変異である請求項１に記載の単離
   されたＤＮＡ分子。
3. 【請求項３】 前記点突然変異の結果としてバリン残基が置換される請求項
   ２に記載の単離されたＤＮＡ分子。
4. 【請求項４】 前記点突然変異の結果としてバリン残基がより嵩高い側鎖お
   よび／または水素原子だけで置換されたβ炭素原子を持つアミノ酸で置換される
   請求項３に記載の単離されたＤＮＡ分子。
5. 【請求項５】 前記点突然変異の結果としてバリン残基がメチオニンまたは
   ロイシンで置換される請求項４に記載の単離されたＤＮＡ分子。
6. 【請求項６】 前記点突然変異の結果としてβ２サブユニットのＶ２８７が
   置換される請求項５に記載の単離されたＤＮＡ分子。
7. 【請求項７】 前記点突然変異が、β２サブユニットでＶ２８７Ｍトランジ
   ションが起こるように、塩基１０２５におけるＧからＡへのヌクレオチドトラン
   ジションである請求項６に記載の単離されたＤＮＡ分子。
8. 【請求項８】 配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む請求項７に記載
   の単離されたＤＮＡ。
9. 【請求項９】 点突然変異、欠失、挿入および再配列からなる群より選択さ
   れる１または複数のさらなる突然変異事象が起こっている請求項１〜７のいずれ
   か一項に記載の単離されたＤＮＡ分子。
10. 【請求項１０】 前記１または複数のさらなる突然変異事象がβサブユニッ
    ト内に保存的アミノ酸置換をもたらす点突然変異である請求項９に記載の単離さ
    れたＤＮＡ分子。
11. 【請求項１１】 配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む単離されたＤ
    ＮＡ分子。
12. 【請求項１２】 配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなる単離された
    ＤＮＡ分子。
13. 【請求項１３】 哺乳類ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡｃｈＲ）の
    突然変異型βサブユニットである単離されたポリペプチドであって、置換、欠失
    、挿入および再配列からなる群より選択される突然変異事象がＭ２ドメインで起
    こっており、前記突然変異事象が、集合した哺乳類ニコチン性アセチルコリン受
    容体の機能を、てんかん表現型が生じるように混乱させることを特徴とする単離
    されたポリペプチド。
14. 【請求項１４】 前記突然変異事象が置換である請求項１３に記載の単離さ
    れたポリペプチド。
15. 【請求項１５】 バリン残基の置換が起こっている請求項１４に記載の単離
    されたポリペプチド。
16. 【請求項１６】 前記バリン残基がより嵩高い側鎖および／または水素原子
    だけで置換されたβ炭素原子を持つアミノ酸で置換される請求項１５に記載の単
    離されたポリペプチド。
17. 【請求項１７】 前記バリン残基がメチオニンまたはロイシンで置換される
    請求項１６に記載の単離されたポリペプチド。
18. 【請求項１８】 前記バリンがβ２サブユニットのＶ２８７である請求項１
    ７に記載の単離されたポリペプチド。
19. 【請求項１９】 置換がβ２サブユニットにおけるＶ２８７Ｍトランジショ
    ンである請求項１８に記載の単離されたポリペプチド。
20. 【請求項２０】 配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む請求項１９に記載
    の単離されたポリペプチド。
21. 【請求項２１】 置換、欠失、挿入および再配列からなる群より選択される
    １または複数のさらなる突然変異事象が起こっている請求項１３〜１９に記載の
    単離されたポリペプチド。
22. 【請求項２２】 前記１または複数の突然変異事象が保存的置換である請求
    項２１に記載の単離されたポリペプチド。
23. 【請求項２３】 配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む単離されたポリペ
    プチド。
24. 【請求項２４】 配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる単離されたポリ
    ペプチド。
25. 【請求項２５】 少なくとも１つのαサブユニットと少なくとも１つのβサ
    ブユニットとを含む集合した哺乳類ニコチン性アセチルコリン受容体である単離
    されたポリペプチドであって、置換、欠失、挿入および再配列からなる群より選
    択される突然変異事象がβサブユニットのＭ２ドメインで起こっており、前記突
    然変異事象が、前記集合した哺乳類ニコチン性アセチルコリン受容体の機能を、
    てんかん表現型が生じるように混乱させることを特徴とする単離されたポリペプ
    チド。
26. 【請求項２６】 前記突然変異事象が置換である請求項２５に記載の単離さ
    れたポリペプチド。
27. 【請求項２７】 バリン残基の置換が起こっている請求項２６に記載の単離
    されたポリペプチド。
28. 【請求項２８】 前記バリン残基がより嵩高い側鎖および／または水素原子
    だけで置換されたβ炭素原子を持つアミノ酸で置換される請求項２７に記載の単
    離されたポリペプチド。
29. 【請求項２９】 前記バリン残基がメチオニンまたはロイシンで置換される
    請求項２８に記載の単離されたポリペプチド。
30. 【請求項３０】 前記バリンがβ２サブユニットのＶ２８７である請求項２
    ９に記載の単離されたポリペプチド。
31. 【請求項３１】 置換がβ２サブユニットにおけるＶ２８７Ｍトランジショ
    ンである請求項３０に記載の単離されたポリペプチド。
32. 【請求項３２】 β２サブユニットが配列番号２に記載のアミノ酸配列を含
    む請求項３１に記載の単離されたポリペプチド。
33. 【請求項３３】 置換、欠失、挿入および再配列からなる群より選択される
    １または複数のさらなる突然変異事象が起こっている請求項２５〜３２に記載の
    単離されたポリペプチド。
34. 【請求項３４】 前記１または複数の突然変異事象が保存的置換である請求
    項３３に記載の単離されたポリペプチド。
35. 【請求項３５】 置換、欠失、挿入および再配列からなる群より選択される
    さらなる突然変異事象が少なくとも１つのさらなるβサブユニットのＭ２ドメイ
    ンで起こっており、前記さらなる突然変異事象が、前記集合した哺乳類ニコチン
    性アセチルコリン受容体の機能を、てんかん表現型が生じるように独立して混乱
    させる、請求項２５〜３４のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
36. 【請求項３６】 前記集合したニコチン性アセチルコリン受容体が複数のβ
    ２サブユニットを含み、そのうちのいずれか一つまたは全てに同一の突然変異事
    象が起こっている、請求項３５に記載の単離されたポリペプチド。
37. 【請求項３７】 前記集合したニコチン性アセチルコリン受容体が、３つの
    うちのいずれか１つまたは全てにＶ２８７Ｍ突然変異を含む３つのβ２サブユニ
    ットと、２つのα４サブユニットとからなる請求項３６に記載の単離されたポリ
    ペプチド。
38. 【請求項３８】 哺乳類ニコチン性アセチルコリン受容体の突然変異型βサ
    ブユニットであるポリペプチドを製造する方法であって、 （１）請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクターで
    トランスフェクトした宿主細胞を、ポリペプチド産生に有効な条件で培養する工
    程、および （２）突然変異型βサブユニットを収集する工程 を含む方法。
39. 【請求項３９】 突然変異型βサブユニットと、哺乳類ニコチン性アセチル
    コリン受容体の他のサブユニットとを、哺乳類ニコチン性アセチルコリン受容体
    に集合させ、集合した受容体を収集する工程をさらに含む請求項３８に記載の方
    法。
40. 【請求項４０】 請求項１３〜３７のいずれか一項に記載のポリペプチドと
    免疫反応するが、野生型ニコチン性アセチルコリン受容体またはそのサブユニッ
    トとは免疫反応しない抗体。
41. 【請求項４１】 モノクローナル抗体である請求項４０に記載の抗体。
42. 【請求項４２】 てんかんを処置する方法であって、ニコチン性アセチルコ
    リン受容体がβサブユニットのＭ２ドメインに突然変異を含み、前記突然変異が
    てんかんの原因となる場合に、そのような処置を必要とする対象に、ニコチン性
    アセチルコリン受容体の選択的アンタゴニストを投与することを含む方法。
43. 【請求項４３】 選択的アンタゴニストが抗体である請求項４２に記載の方
    法。
44. 【請求項４４】 抗体がモノクローナル抗体である請求項４３に記載の方法
    。
45. 【請求項４５】 前記対象に野生型ニコチン性アセチルコリン受容体を導入
    する工程をさらに含む請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
46. 【請求項４６】 野生型ニコチン性アセチルコリン受容体が遺伝子療法によ
    って導入される請求項４５に記載の方法。
47. 【請求項４７】 野生型ニコチン性アセチルコリン受容体が実質的に精製さ
    れた野生型ニコチン性アセチルコリン受容体またはニコチン性アセチルコリン受
    容体βサブユニットポリペプチドを投与することによって導入される請求項４５
    に記載の方法。
48. 【請求項４８】 ニコチン性アセチルコリン受容体がβサブユニットのＭ２
    ドメインに突然変異を含み、前記突然変異がてんかんの原因となる場合の、てん
    かん処置用医薬の製造におけるニコチン性アセチルコリン受容体の選択的アンタ
    ゴニストの使用。
49. 【請求項４９】 てんかんを処置する方法であって、請求項１〜１２に記載
    のＤＮＡ分子のいずれか一つの相補鎖である単離されたＤＮＡ分子であり、かつ
    ニコチン性アセチルコリン受容体のβサブユニットがＭ２ドメイン中にてんかん
    の原因となる突然変異を含む場合にそのβサブユニットをコードするｍＲＮＡと
    ハイブリダイズするｍＲＮＡをコードする前記単離されたＤＮＡ分子を、そのよ
    うな処置を必要とする対象に投与することを含む方法。
50. 【請求項５０】 野生型ニコチン性アセチルコリン受容体を前記対象に導入
    する工程をさらに含む請求項４９に記載の方法。
51. 【請求項５１】 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子の相補
    鎖である単離されたＤＮＡ分子であり、かつニコチン性アセチルコリン受容体の
    βサブユニットがＭ２ドメイン中にてんかんの原因となる突然変異を含む場合に
    そのβサブユニットをコードするｍＲＮＡとハイブリダイズするｍＲＮＡをコー
    ドする前記単離されたＤＮＡ分子のてんかん処置用医薬の製造における使用。
52. 【請求項５２】 てんかんの診断を目的とする請求項１〜１２のいずれか一
    項に記載の単離されたＤＮＡ分子の使用。
53. 【請求項５３】 てんかんの診断における請求項１３〜３７のいずれか一項
    に記載のポリペプチドの使用。
54. 【請求項５４】 てんかんの診断における請求項４０または４１に記載の抗
    体の使用。
55. 【請求項５５】 てんかんを診断する方法であって、 （１）てんかんが疑われる対象からＤＮＡを得る工程、 （２）前記ＤＮＡのニコチン性アセチルコリン受容体のβサブユニットのＤＮＡ
    配列を、野生型ニコチン性アセチルコリン受容体の対応するβサブユニットのＤ
    ＮＡ配列と比較する工程 を含む方法。
56. 【請求項５６】 各ＤＮＡ断片を配列決定して配列を比較する請求項５５に
    記載の方法。
57. 【請求項５７】 ＤＮＡ断片を制限酵素解析にかける請求項５５に記載の方
    法。
58. 【請求項５８】 ＤＮＡ断片をＳＳＣＰ解析にかける請求項５５に記載の方
    法。
59. 【請求項５９】 てんかんを診断する方法であって、 （１）てんかんが疑われる対象からニコチン性アセチルコリン受容体を得る工程
    、および （２）前記受容体のβサブユニットを野生型ニコチン性アセチルコリン受容体の
    対応するβサブユニットと比較する工程 を含む方法。
60. 【請求項６０】 候補医薬のスクリーニングにおける請求項１３〜３７のい
    ずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
61. 【請求項６１】 ハイスループットスクリーニング技術を使用する請求項６
    ０に記載の使用。
62. 【請求項６２】 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離されたＤＮＡ
    分子で形質転換された遺伝子改変非ヒト動物。
63. 【請求項６３】 動物がラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ
    、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタならびにサルおよびチンパンジーなどの非ヒ
    ト霊長類からなる群より選択される請求項６２に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
64. 【請求項６４】 動物がマウスである請求項６３の遺伝子改変非ヒト動物。
65. 【請求項６５】 候補医薬化合物のスクリーニングにおける請求項６２〜６
    ４のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物の使用。
66. 【請求項６６】 候補医薬のスクリーニングにおける請求項１〜１２のいず
    れか一項に記載のＤＮＡ分子で形質転換された細胞の使用。
67. 【請求項６７】 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子で形質
    転換された宿主細胞。
68. 【請求項６８】 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子を含む
    発現ベクター。