JP2011188837A - リーシークエンスｄｎａチップおよび最適抗てんかん薬決定方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】てんかんのように複数の遺伝的要因の関与が示唆されている疾患の場合でも複数の任意遺伝子型を一度の解析で同定でき、時間的、コスト的及び労力的に現実的なリーシークエンスＤＮＡチップおよび最適抗てんかん薬決定方法を提供する。
【解決手段】リーシークエンスＤＮＡチップが対応するてんかん責任遺伝子は、ナトリウムチャネル遺伝子、カリウムチャネル遺伝子、カルシウムチャネル遺伝子、塩素チャネル遺伝子、アセチルコリン受容体遺伝子及びγ−アミノ酪酸受容体遺伝子の６種類から選択した１４個のてんかん責任遺伝子である。リーシークエンスＤＮＡチップに搭載されたプローブは上記てんかん責任遺伝子から選択した１以上の責任部位を搭載している。リーシークエンスＤＮＡチップを用いててんかん患者のてんかん責任遺伝子を同定し、同定されたてんかん遺伝子に作用するＡＥＤを選択することにより、最適なＡＥＤを決定する。
【選択図】図１
【解決手段】リーシークエンスＤＮＡチップが対応するてんかん責任遺伝子は、ナトリウムチャネル遺伝子、カリウムチャネル遺伝子、カルシウムチャネル遺伝子、塩素チャネル遺伝子、アセチルコリン受容体遺伝子及びγ−アミノ酪酸受容体遺伝子の６種類から選択した１４個のてんかん責任遺伝子である。リーシークエンスＤＮＡチップに搭載されたプローブは上記てんかん責任遺伝子から選択した１以上の責任部位を搭載している。リーシークエンスＤＮＡチップを用いててんかん患者のてんかん責任遺伝子を同定し、同定されたてんかん遺伝子に作用するＡＥＤを選択することにより、最適なＡＥＤを決定する。
【選択図】図１
Description
本発明は、てんかん患者のてんかん責任遺伝子型を同定するプローブを搭載したリーシークエンスＤＮＡチップおよび当該リーシークエンスＤＮＡチップを用いた最適抗てんかん薬決定方法に関する。
てんかん患者は、人口の約１％と言われており、決してまれな病気ではない。てんかんの確定診断の後に治療が開始されており、従来、抗てんかん薬（antiepileptic drugs : ＡＥＤ）療法が中心となっている（非特許文献１参照）。しかし、ＡＥＤ治療は対症療法に過ぎず、服薬中止に至る症例は極めて少ないのが現状であると言われている。
てんかんは複数の遺伝的要因が関与している。しかし、現段階において、臨床的にてんかんにおける遺伝子診断は行なわれていない。このため、てんかんにおける遺伝子診断ツールは存在していない。一部他疾患、例えば先天的な酵素の異常によってフェニルアラニンの代謝が阻害されて起こるフェニルケトン尿症、先天性代謝異常症であるムコ多糖症、ステロイドホルモンを作成する過程に関与する酵素が先天的に欠損することで起きる先天性副腎皮質過形成等においては、遺伝子診断および出生前診断が行なわれている。これらの疾患のほとんどは責任遺伝子が１つしかない単一遺伝子疾患である。この場合、遺伝マーカー（疾患と関連のあるスニップ（Single nucleotide polymorphism : ＳＮＰ））またはキャピラリー型シークエンサーを用いた配列決定による遺伝子型の同定、あるいは抗体反応等の他の手法による簡易遺伝子診断キット等が、遺伝子診断ツールとして用いられている。
上述したキャピラリー型シークエンサーは、ＤＮＡ塩基配列決定法であるサンガー法（ジデオキシ法）を基本原理とし、ポリマーを充填されたガラスキャピラリーを用いて電気泳動を行なって塩基配列を決定する機器であり、ダイレクトシークエンスの一種である。シークエンスできる領域は５００bp（base pairs）程度であり、単回の解析では低コストでシークエンスを行うことができるため、単一遺伝子疾患における遺伝子診断には適していると考えられる。しかし、多くの遺伝子を解析する場合、何回も繰り返してシークエンスを行う必要があるため、時間、コストおよび労力が増加するという問題があった。特に、複数の遺伝的要因の関与が示唆されているてんかんに対して従来のキャピラリー型シークエンサーを用いて遺伝子診断を行なうことは、遺伝子上に散在する多くの領域のシークエンスが必要となるため、時間的、コスト的および労力的に現実的でないという問題があった。上述した簡易遺伝子診断キットの開発も困難である。
そこで、本発明の目的は、上記問題を解決するためになされたものであり、てんかんのように複数の遺伝的要因の関与が示唆されている疾患の場合であっても、複数の任意遺伝子型を一度の解析で同定することができ、時間的、コスト的および労力的に現実的な、リーシークエンスＤＮＡチップおよび最適抗てんかん薬決定方法を提供することにある。
この発明のリーシークエンスＤＮＡチップは、てんかん患者のてんかん責任遺伝子型を同定するプローブを搭載したリーシークエンスＤＮＡチップであって、該リーシークエンス用ＤＮＡチップが対応するてんかん責任遺伝子は、ナトリウムチャネル遺伝子、カリウムチャネル遺伝子、カルシウムチャネル遺伝子、塩素チャネル遺伝子、アセチルコリン受容体遺伝子及びγ−アミノ酪酸受容体遺伝子のいずれか１以上を含み、該プローブは該てんかん責任遺伝子から選択した１以上の責任部位を搭載したことを特徴とする。
ここで、この発明のリーシークエンスＤＮＡチップにおいて、前記ナトリウムチャネル遺伝子はＳＣＮ１Ａ遺伝子及びＳＣＮ１Ｂ遺伝子であり、前記プローブに搭載する責任部位は、（１）ＳＣＮ１Ａ遺伝子のエキソン１から２６、（２）ＳＣＮ１Ｂ遺伝子のエキソン３、から選択することができる。
ここで、この発明のリーシークエンスＤＮＡチップにおいて、前記カリウムチャネル遺伝子はＫＣＮＱ２遺伝子及びＫＣＮＱ３遺伝子であり、前記プローブに搭載する責任部位は、（１）ＫＣＮＱ２遺伝子のエキソン１、エキソン２、（２）ＫＣＮＱ２遺伝子のエキソン８、（３）ＫＣＮＱ３遺伝子のエキソン６、から選択することができる。
ここで、この発明のリーシークエンスＤＮＡチップにおいて、前記カルシウムチャネル遺伝子はＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子、ＣＡＣＮＡ１Ｈ遺伝子及びＣＡＣＮＢ４遺伝子であり、前記プローブに搭載する責任部位は、（１）ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のエキソン３、エキソン３３、エキソン３６、（２）ＣＡＣＮＡ１Ｈ遺伝子のエキソン４、エキソン７、エキソン９から１１、エキソン２３、（３）ＣＡＣＮＢ４遺伝子のエキソン１３、から選択することができる。
ここで、この発明のリーシークエンスＤＮＡチップにおいて、前記塩素チャネル遺伝子はＣＬＣＮ２遺伝子であり、前記プローブに搭載する責任部位は、（１）ＣＬＣＮ２遺伝子のエキソン５、エキソン１９から選択することができる。
ここで、この発明のリーシークエンスＤＮＡチップにおいて、前記アセチルコリン受容体遺伝子はＣＨＲＮＡ４遺伝子、ＣＨＲＮＡ７遺伝子及びＣＨＲＮＢ２遺伝子であり、前記プローブに搭載する責任部位は、（１）ＣＨＲＮＡ４遺伝子のエキソン５、（２）ＣＨＲＮＡ７遺伝子のエキソン１０、（３）ＣＨＲＮＢ２遺伝子のエキソン５、から選択することができる。
ここで、この発明のリーシークエンスＤＮＡチップにおいて、前記γ−アミノ酪酸受容体遺伝子はＧＡＢＲＡ１遺伝子、ＧＡＢＲＡＤ遺伝子及びＧＡＢＲＧ２遺伝子であり、前記プローブに搭載する責任部位は、（１）ＧＡＢＲＡ１遺伝子のエキソン１０、（２）ＧＡＢＲＡＤ遺伝子のエキソン５−６、（３）ＧＡＢＲＧ２遺伝子のエキソン２、エキソン４から選択することができる。
この発明のリーシークエンスＤＮＡチップにおいて、挿入／欠失（insertion/deletion）に対応する塩基配列に基づく他のプローブをさらに搭載することができる。
この発明のリーシークエンスＤＮＡチップにおいて、挿入／欠失（insertion/deletion）に対応する塩基配列に基づく他のプローブをさらに搭載することができる。
この発明の最適抗てんかん薬決定方法は、てんかん患者に最適な抗てんかん薬を決定する最適抗てんかん薬決定方法であって、本発明のいずれかのリーシークエンスＤＮＡチップを用いててんかん患者のてんかん責任遺伝子を同定し、同定されたてんかん遺伝子に作用する抗てんかん薬（ＡＥＤ）を選択することを特徴とする。
本発明のリーシークエンスアＤＮＡチップ等によれば、リーシークエンスＤＮＡチップが対応するてんかん責任遺伝子として、ナトリウムチャネル遺伝子、カリウムチャネル遺伝子、カルシウムチャネル遺伝子、塩素チャネル遺伝子、アセチルコリン受容体遺伝子及びγ−アミノ酪酸受容体遺伝子の６種類から選択した１４個のてんかん責任遺伝子が好適である。即ち、本発明のリーシークエンスＤＮＡチップによれば、一度の解析で１４個のてんかん責任遺伝子の責任部位のシークエンスを得ることが可能である。さらに、本発明のリーシークエンスＤＮＡチップによれば、てんかんのように複数の遺伝的要因の関与が示唆されている疾患の場合であっても、複数の任意遺伝子型を一度の解析で同定することができるため、時間的、コスト的および労力的に現実的な、リーシークエンスＤＮＡチップを提供することができるという効果がある。
本発明の最適抗てんかん薬決定方法によれば、本発明のリーシークエンスＤＮＡチップを用いることにより、てんかんのように複数の遺伝的要因の関与が示唆されている疾患の場合であっても、遺伝子診断が可能となる。当該遺伝子診断により、患者の病因に即したＡＥＤの選択が可能となる。即ち、本発明の最適抗てんかん薬決定方法によれば、上述した本発明のリーシークエンスＤＮＡチップを用いててんかん患者のてんかん責任遺伝子を同定し、同定されたてんかん遺伝子に作用するＡＥＤを選択することにより、最適なＡＥＤを決定することができる。さらに、個々人の代謝能（ＡＥＤ代謝関連遺伝子多型）からそれに見合った投与量を設定することが可能となるという効果がある。
概要．
リーシークエンシング（Resequencing）は、既知の配列と未知の配列とを比較することを意味し、遺伝子異常（変異）の同定に用いることができる。本発明では、Affymetrix（登録商標）Resequencing Arrayをベースにして、リーシークエンス（Resequence）ＤＮＡチップ上にてんかん責任遺伝子に対応するプローブを設計し搭載することにより、てんかんの遺伝子診断用リーシークエンスＤＮＡチップを開発した。てんかんは複数の遺伝的用要因（出願時点で２３個。責任遺伝子／３０５変異）が関与している。本発明のリーシークエンスＤＮＡチップに搭載しているプローブは、出願時点までに報告されているてんかん責任遺伝子の９１％をカバーしている。以下、各実施例について図面を参照して詳細に説明する。
リーシークエンシング（Resequencing）は、既知の配列と未知の配列とを比較することを意味し、遺伝子異常（変異）の同定に用いることができる。本発明では、Affymetrix（登録商標）Resequencing Arrayをベースにして、リーシークエンス（Resequence）ＤＮＡチップ上にてんかん責任遺伝子に対応するプローブを設計し搭載することにより、てんかんの遺伝子診断用リーシークエンスＤＮＡチップを開発した。てんかんは複数の遺伝的用要因（出願時点で２３個。責任遺伝子／３０５変異）が関与している。本発明のリーシークエンスＤＮＡチップに搭載しているプローブは、出願時点までに報告されているてんかん責任遺伝子の９１％をカバーしている。以下、各実施例について図面を参照して詳細に説明する。
図１は、本発明のリーシークエンスＤＮＡチップによる遺伝子診断の流れの概略を示す。まず、てんかんの遺伝子診断用リーシークエンスＤＮＡチップを開発する（リーシークエンスＤＮＡチップ開発ステップ。ステップＳ１０）。次に、人口の０．３％（〜１．０％）が罹患しているとされるてんかん患者から、末梢血を採血し、当該末梢血からＤＮＡを抽出する（ＤＮＡ抽出ステップ。ステップＳ２０、Ｓ２２、Ｓ２４）。抽出したＤＮＡを、開発したてんかんの遺伝子診断用リーシークエンスＤＮＡチップ上に搭載されたプローブとハイブリダイゼーション（hybridization）させ、各塩基に対応した蛍光シグナル強度を検出するリーシークエンシング実験を行なう(リーシークエンシング実験ステップ。ステップＳ３０)。検出した蛍光シグナル強度に基づき、てんかん患者における遺伝子変異の有無およびその領域を探索する(配列解析ステップ。ステップＳ４０)。図１には、配列解析ステップ（ステップＳ４０）に続き、ステップＳ５０として本発明の最適抗てんかん薬決定方法も示されている。即ち、変異部位から適切なＡＥＤを選択し、試行錯誤（Try & Error）を減少させ、患者の負担を軽減できる（ステップＳ５０）。以下、各ステップについて詳細に説明する。
１．リーシークエンスＤＮＡチップ開発ステップ（ステップＳ１０）
図２は、図１のリーシークエンスＤＮＡチップ開発ステップ（ステップＳ１０）を示す部分の拡大図である。図２において、符号１０はGeneChip（登録商標）CustomSeq（登録商標）Array、１２はGeneChip（登録商標）CustomSeq（登録商標）Array１０に設けられたリーシークエンスＤＮＡチップ、１２’はリーシークエンスＤＮＡチップ１２の拡大図である。図２に示されるリーシークエンスＤＮＡチップ１２’は、これまでに判明した既存の情報に基づくてんかんの原因（責任）遺伝子を網羅しており、全てんかん責任遺伝子の変異領域配列のプローブを搭載している。本発明における遺伝子型判定領域は１８Ｋベース（base）であるが、今後、新たな責任遺伝子が判明した場合でも３００Ｋベースまでは本発明のリーシークエンスＤＮＡチップ１２’に搭載可能である。図２に示されるリーシークエンスＤＮＡチップ１２’のサイズは１．２８ｃｍ×１．２８ｃｍであるが、これに限定されるものではなく、例えば８ｍｍ×８ｍｍであってもよい。符号１２ａはリーシークエンスＤＮＡチップ１２’の一部（プローブセル）の拡大図であり、ハイブリダイズされたプローブ１４が示されている。図２に示されるプローブセルのサイズは２４μｍ×２４μｍであるが、これに限定されるものではなく、例えば８μｍ×８μｍであってもよい。
図２は、図１のリーシークエンスＤＮＡチップ開発ステップ（ステップＳ１０）を示す部分の拡大図である。図２において、符号１０はGeneChip（登録商標）CustomSeq（登録商標）Array、１２はGeneChip（登録商標）CustomSeq（登録商標）Array１０に設けられたリーシークエンスＤＮＡチップ、１２’はリーシークエンスＤＮＡチップ１２の拡大図である。図２に示されるリーシークエンスＤＮＡチップ１２’は、これまでに判明した既存の情報に基づくてんかんの原因（責任）遺伝子を網羅しており、全てんかん責任遺伝子の変異領域配列のプローブを搭載している。本発明における遺伝子型判定領域は１８Ｋベース（base）であるが、今後、新たな責任遺伝子が判明した場合でも３００Ｋベースまでは本発明のリーシークエンスＤＮＡチップ１２’に搭載可能である。図２に示されるリーシークエンスＤＮＡチップ１２’のサイズは１．２８ｃｍ×１．２８ｃｍであるが、これに限定されるものではなく、例えば８ｍｍ×８ｍｍであってもよい。符号１２ａはリーシークエンスＤＮＡチップ１２’の一部（プローブセル）の拡大図であり、ハイブリダイズされたプローブ１４が示されている。図２に示されるプローブセルのサイズは２４μｍ×２４μｍであるが、これに限定されるものではなく、例えば８μｍ×８μｍであってもよい。
発明者らはてんかん責任遺伝子について鋭意研究を重ね、本発明のリーシークエンスＤＮＡチップ１２に搭載するてんかん責任遺伝子を見出した。図３は、本発明のリーシークエンスＤＮＡチップ１２に搭載したてんかん責任遺伝子の一覧表２０を示す。一覧表２０の左欄はてんかん責任遺伝子（Official Symbol）を示し、右欄はてんかん患者のてんかん責任遺伝子型を同定するプローブとして搭載した責任部位を示す。右欄に示される「exon」はタンパク質の情報を有する塩基配列の部分であるエキソンの意味であり、例えば「exon1-26」は「エキソン１から２６」を示し、「exon3」は「エキソン３」を示す。一覧表２０に示されるように、本発明のリーシークエンスＤＮＡチップが対応する（または備えた）てんかん責任遺伝子は、好適にはナトリウムチャネル遺伝子、カリウムチャネル遺伝子、カルシウムチャネル遺伝子、塩素チャネル遺伝子、アセチルコリン受容体遺伝子及びγ−アミノ酪酸受容体遺伝子の６種類から選択した１４個のてんかん責任遺伝子である。これらの６種類から選択した１４個のてんかん責任遺伝子は、出願時点で判明しているてんかん責任遺伝子のほとんどを含んでいる。本発明のリーシークエンスＤＮＡチップが対応するてんかん責任遺伝子は、上記６種類の遺伝子をすべて含むことが好適であるが、必ずしも上記６種類全てを含まずに、上記６種類のいずれか１種類以上を含んでいるものであってもよい。一方、技術的な理由により本発明のリーシークエンスＤＮＡチップに搭載しなかった遺伝子もあるため、本発明のリーシークエンスＤＮＡチップが対応するてんかん責任遺伝子に、上述した６種類−１４個のてんかん責任遺伝子以外の遺伝子を含めてもよいことは勿論である。実際に搭載したプローブは、上述した６種類−１４個のてんかん責任遺伝子から選択した１以上の責任部位を備えている。具体例は後述する。
以下、上述した各遺伝子について説明する。遺伝子の正確な名前（Official Name）、染色体の番号および位置等の詳細な内容は、例えばＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のEntrez gene(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)等のデータベースを参照されたい。上述したナトリウムチャネル（Ｎａ＋チャネル）遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子およびＳＣＮ１Ｂ遺伝子であり、プローブ１４に搭載する責任部位は、
（１）ＳＣＮ１Ａ遺伝子のエキソン１から２６、
（２）ＳＣＮ１Ｂ遺伝子のエキソン３、
から選択することが好適である。
（１）ＳＣＮ１Ａ遺伝子のエキソン１から２６、
（２）ＳＣＮ１Ｂ遺伝子のエキソン３、
から選択することが好適である。
上述したカリウムチャネル（Ｋ＋チャネル）遺伝子はＫＣＮＱ２遺伝子およびＫＣＮＱ３遺伝子であり、プローブ１４に搭載する責任部位は、
（１）ＫＣＮＱ２遺伝子のエキソン１、エキソン２、
（２）ＫＣＮＱ２遺伝子のエキソン８、
（３）ＫＣＮＱ３遺伝子のエキソン６、
から選択することが好適である。
（１）ＫＣＮＱ２遺伝子のエキソン１、エキソン２、
（２）ＫＣＮＱ２遺伝子のエキソン８、
（３）ＫＣＮＱ３遺伝子のエキソン６、
から選択することが好適である。
上述したカルシウムチャネル（Ｃａ２＋チャネル）遺伝子はＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子、ＣＡＣＮＡ１Ｈ遺伝子およびＣＡＣＮＢ４遺伝子であり、プローブ１４に搭載する責任部位は、
（１）ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のエキソン３、エキソン３３、エキソン３６、
（２）ＣＡＣＮＡ１Ｈ遺伝子のエキソン４、エキソン７、エキソン９から１１、エキソン２３、
（３）ＣＡＣＮＢ４遺伝子のエキソン１３、
から選択することが好適である。
（１）ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のエキソン３、エキソン３３、エキソン３６、
（２）ＣＡＣＮＡ１Ｈ遺伝子のエキソン４、エキソン７、エキソン９から１１、エキソン２３、
（３）ＣＡＣＮＢ４遺伝子のエキソン１３、
から選択することが好適である。
上述した塩素チャネル（電位依存性クロライドチャネル）遺伝子はＣＬＣＮ２遺伝子であり、プローブ１４に搭載する責任部位は、
（１）ＣＬＣＮ２遺伝子のエキソン５、エキソン１９
から選択することが好適である。
（１）ＣＬＣＮ２遺伝子のエキソン５、エキソン１９
から選択することが好適である。
上述した（ニコチン性）アセチルコリン受容体遺伝子はＣＨＲＮＡ４遺伝子、ＣＨＲＮＡ７遺伝子およびＣＨＲＮＢ２遺伝子であり、プローブ１４に搭載する責任部位は、
（１）ＣＨＲＮＡ４遺伝子のエキソン５、
（２）ＣＨＲＮＡ７遺伝子のエキソン１０、
（３）ＣＨＲＮＢ２遺伝子のエキソン５、
から選択することが好適である。
（１）ＣＨＲＮＡ４遺伝子のエキソン５、
（２）ＣＨＲＮＡ７遺伝子のエキソン１０、
（３）ＣＨＲＮＢ２遺伝子のエキソン５、
から選択することが好適である。
上述したγ−アミノ酪酸（gamma-aminobutyric acid : ＧＡＢＡ）受容体遺伝子はＧＡＢＲＡ１遺伝子、ＧＡＢＲＡＤ遺伝子およびＧＡＢＲＧ２遺伝子であり、プローブ１４に搭載する責任部位は、
（１）ＧＡＢＲＡ１遺伝子のエキソン１０、
（２）ＧＡＢＲＡＤ遺伝子のエキソン５−６、
（３）ＧＡＢＲＧ２遺伝子のエキソン２、エキソン４
から選択することが好適である。
（１）ＧＡＢＲＡ１遺伝子のエキソン１０、
（２）ＧＡＢＲＡＤ遺伝子のエキソン５−６、
（３）ＧＡＢＲＧ２遺伝子のエキソン２、エキソン４
から選択することが好適である。
次に、上述したGeneChip（登録商標）CustomSeq（登録商標）Array１０におけるリーシークエンスＤＮＡチップ１２のプローブ１４について説明する。図４は、GeneChip（登録商標）CustomSeq（登録商標）Array１０におけるリーシークエンスＤＮＡチップ１２のプローブ１４のタイリング（整列配置）を例示する。リーシークエンスＤＮＡチップ１２では、図４に示されるように、１スポット３０（１塩基に相当）にプローブ（患者の遺伝子とハイブリダイズする相補的塩基）が４種類（３０Ｔ、３０Ｇ、３０Ｃ、３０Ａ）ある。これら４種類のプローブ３０Ｔ、３０Ｇ、３０Ｃ、３０Ａは、読みたい任意の位置（３０−ｉ）のみＡ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）の４パターンの塩基となっている他は、同じ配列となっている。配列３２を読む際は、この４種類のプローブ３０Ｔ、３０Ｇ、３０Ｃ、３０Ａがハイブリダイズし、そのうちいずれか１種類が強くハイブリダイズする。例えば、任意の位置（３０−ｉ）でＡの蛍光が強く検出された場合、それと相補的な塩基のＴが強くハイブリダイズしたことになり、その結果、配列３２の位置（３２−ｊ）の塩基がＴであるとわかる。
しかし、insertion/deletion（挿入／欠失）があると、任意の位置（３０−ｉ）の４種のプローブ３０Ｔ、３０Ｇ、３０Ｃ、３０Ａのすべてとハイブリダイズしないということが起こり、スキャン結果（後述）として、Ｎ（No Call）を返す。そこで、本発明のリーシークエンスＤＮＡチップ１２では、同じてんかん責任遺伝子上の領域であっても、missense/nonsense（ミスセンス／ナンセンス）変異を判定するための通常のプローブを搭載すると共に、これまでに報告されているinsertion/deletionを考慮した塩基配列から設計した特異なプローブを別途用意して搭載している。この結果、シグナルコ−ルエラーとinsertion/deletionとを判別し、より正確な遺伝子診断が可能となっている。本発明のリーシークエンスＤＮＡチップ１２により任意位置での塩基を決定する原理は、上述した図４およびその説明に示す通りである。しかしながら、挿入／欠失がある場合、例えば、図４の３２−ｊのＴの塩基が欠失しているか、あるいは３２−ｊのＴの位置に他の塩基が挿入している場合、搭載されているプローブ３０Ｔ、３０Ｇ、３０Ｃ、３０Ａとはハイブリダイズしないことになる（塩基を判定できない）。従って、てんかんとの関わりが報告された挿入／欠失（insertion/deletion）がある遺伝子領域においては、挿入／欠失（insertion/deletion）を考慮したプローブを別途搭載している。例えば、図４に沿って考えると、３２−ｊのＴの塩基の欠失を判定するため、その状況に対応した３０−ｉの位置のＴ塩基を抜いたプローブを搭載している。
以上のように設計されたリーシークエンスＤＮＡチップ１２用のプローブ１４をAffymetrix（登録商標）社に注文して製作させた。具体的には、所定のデザイン・リクエスト・フォーム（Design Request Form）に必要事項を記載し、所定フォーマット化されたシークエンスおよび指示ファイルをAffymetrix（登録商標）社へ送る。その後、Affymetrix（登録商標）社が送られたデザインに基づきＤＮＡチップを設計するという段取りとなっている。注文の際の詳細な内容は、“GeneChip （登録商標）CustomSeq（登録商標）Custom Resequencing Array Design Guide”を参照されたい。以下では当該ガイドを適宜引用して、簡単に説明する。
シークエンスの選択．
対象としたいシークエンスは所望のデータベースからダウンロードされ、ＦＡＳＴＡフォーマット（上記所定フォーマット。１つのシーケンスのデータが、">"
で始まるヘッダ行（１行目）と２行目以降の実際のシークエンス文字列とで構成される。）へ変換する。アレイ容量（塩基数）はアレイフォーマットに応じて３種類用意されている。本実施例では、アレイフォーマット１６９を選択したため、アレイの最大容量は４７，９７４である。以下では「配列」および「アレイ」を慣用に合わせて使い分けしているが、両者共同じ意味である。
対象としたいシークエンスは所望のデータベースからダウンロードされ、ＦＡＳＴＡフォーマット（上記所定フォーマット。１つのシーケンスのデータが、">"
で始まるヘッダ行（１行目）と２行目以降の実際のシークエンス文字列とで構成される。）へ変換する。アレイ容量（塩基数）はアレイフォーマットに応じて３種類用意されている。本実施例では、アレイフォーマット１６９を選択したため、アレイの最大容量は４７，９７４である。以下では「配列」および「アレイ」を慣用に合わせて使い分けしているが、両者共同じ意味である。
アレイ制御．
標準的な設計オプションは以下の通りである。
１．ターゲット螺旋性（Target strandedness）：進行方向および逆方向
２．プローブセルサイズ（feature size）：８μｍ
３．プローブ長：２５−mer
４．設計：単一アレイまたはマルチアレイセット
５．アレイフォーマット：４９、１００、１６９
標準的な設計オプションは以下の通りである。
１．ターゲット螺旋性（Target strandedness）：進行方向および逆方向
２．プローブセルサイズ（feature size）：８μｍ
３．プローブ長：２５−mer
４．設計：単一アレイまたはマルチアレイセット
５．アレイフォーマット：４９、１００、１６９
シークエンス・ファイル．
上述したＦＡＳＴＡフォーマット化されたシークエンスは、シークエンス・ファイルに記録する。シークエンスには固有のシークエンス名を付けておく。上述した指示ファイルには、アレイ上に配置された各連続フラグメントについての開始および終了位置に関する情報等を記録する。開始はフラグメントの最初の塩基を指定し、終了は最後の塩基を指定する。所定のデザイン・リクエスト・フォーム等の詳細に関しては、上記ガイドを参照されたい。
上述したＦＡＳＴＡフォーマット化されたシークエンスは、シークエンス・ファイルに記録する。シークエンスには固有のシークエンス名を付けておく。上述した指示ファイルには、アレイ上に配置された各連続フラグメントについての開始および終了位置に関する情報等を記録する。開始はフラグメントの最初の塩基を指定し、終了は最後の塩基を指定する。所定のデザイン・リクエスト・フォーム等の詳細に関しては、上記ガイドを参照されたい。
２．ＤＮＡ抽出ステップ（ステップＳ２０、Ｓ２２、Ｓ２４）
次に、てんかん患者より採血した末梢血からＤＮＡを抽出する。発明者らは、QIAGEN（登録商標）社のQIAamp（登録商標）DNA Blood Maxi Kitを用いてＤＮＡ抽出を行なった。当該キットでは、スピンカラム操作法を使用して血液からＤＮＡを精製する。このため、ＤＮＡを精製するためのフェノール／クロロホルム抽出は不要である。詳細は、「QIAamp（登録商標）DNA Blood Midi/Maxi Kitプロトコールとトラブルシューティング」の「QIAamp（登録商標）Blood Maxi Kitを用いた全血からのＤＮＡ精製（スピンプロトコール）」を参照されたい。なお、ＤＮＡ抽出は上記スピンプロトコールに限定されるものではなく、他のプロトコールであってもよい。
次に、てんかん患者より採血した末梢血からＤＮＡを抽出する。発明者らは、QIAGEN（登録商標）社のQIAamp（登録商標）DNA Blood Maxi Kitを用いてＤＮＡ抽出を行なった。当該キットでは、スピンカラム操作法を使用して血液からＤＮＡを精製する。このため、ＤＮＡを精製するためのフェノール／クロロホルム抽出は不要である。詳細は、「QIAamp（登録商標）DNA Blood Midi/Maxi Kitプロトコールとトラブルシューティング」の「QIAamp（登録商標）Blood Maxi Kitを用いた全血からのＤＮＡ精製（スピンプロトコール）」を参照されたい。なお、ＤＮＡ抽出は上記スピンプロトコールに限定されるものではなく、他のプロトコールであってもよい。
３．リーシークエンシング実験ステップ（ステップＳ３０)．
ＤＮＡ抽出ステップ（ステップＳ２０、Ｓ２２、Ｓ２４）で抽出したＤＮＡを、上述したリーシークエンスＤＮＡチップ１２上に搭載されたプローブ１４とハイブリダイゼーションさせ、各塩基に対応した蛍光シグナル強度を検出する。図５は、リーシークエンス実験（ステップＳ３０）のプロトコールを示す。図５に示されるように、まず、配列を決定したいてんかんの原因遺伝子の各領域をポリメラーゼチェーンリアクション（Polymerase Chain Reaction : ＰＣＲ）で増幅する（ステップＳ３１）。次に、各増幅産物（amplicon：アンプリコン）を定量し、同じ濃度になるようにアンプリコンを１つのチューブにまとめ（pooling：プーリング）、精製する（ステップＳ３２）。その後、ハイブリダイズしやすいサイズになるようにアンプリコンを断片化（フラグメンテーション）させる（ステップＳ３３）。続いて、アンプリコンのラベリング（labeling）を行う（ステップＳ３４）。ラベリングされたアンプリコンとリーシークエンスＤＮＡチップ１２とのハイブリダイゼーションを行なう（ステップＳ３５）。この後、リーシークエンスＤＮＡチップ１２の洗浄、蛍光染色、検出（スキャニング）を行う（ステップＳ３６）。詳細は、“GeneChip （登録商標）CustomSeq（登録商標）Resequencing Array Protocol Version 2.1”を参照されたい。以下では当該プロトコールを適宜引用して、簡単に説明する。
ＤＮＡ抽出ステップ（ステップＳ２０、Ｓ２２、Ｓ２４）で抽出したＤＮＡを、上述したリーシークエンスＤＮＡチップ１２上に搭載されたプローブ１４とハイブリダイゼーションさせ、各塩基に対応した蛍光シグナル強度を検出する。図５は、リーシークエンス実験（ステップＳ３０）のプロトコールを示す。図５に示されるように、まず、配列を決定したいてんかんの原因遺伝子の各領域をポリメラーゼチェーンリアクション（Polymerase Chain Reaction : ＰＣＲ）で増幅する（ステップＳ３１）。次に、各増幅産物（amplicon：アンプリコン）を定量し、同じ濃度になるようにアンプリコンを１つのチューブにまとめ（pooling：プーリング）、精製する（ステップＳ３２）。その後、ハイブリダイズしやすいサイズになるようにアンプリコンを断片化（フラグメンテーション）させる（ステップＳ３３）。続いて、アンプリコンのラベリング（labeling）を行う（ステップＳ３４）。ラベリングされたアンプリコンとリーシークエンスＤＮＡチップ１２とのハイブリダイゼーションを行なう（ステップＳ３５）。この後、リーシークエンスＤＮＡチップ１２の洗浄、蛍光染色、検出（スキャニング）を行う（ステップＳ３６）。詳細は、“GeneChip （登録商標）CustomSeq（登録商標）Resequencing Array Protocol Version 2.1”を参照されたい。以下では当該プロトコールを適宜引用して、簡単に説明する。
（１）ＰＣＲによる増幅（ステップＳ３００）
（ｉ）試薬
後述するＰＣＲ条件１−４についてはTOYOBO（登録商標）Co., LTD.社のKOD FXを用い、後述するＰＣＲ条件５に対しては同社のKOD Plusを用いた。
（ｉｉ）サーマルサイクルプログラム
上記プロトコールに例示されているサーマルサイクラー（ブロック）を９４℃（２分）で初期熱変性した後、熱変性、アニールおよび伸長反応を所定数のサイクルで繰返し、伸長反応の延長を行なった（ＰＣＲ条件）。実際のＰＣＲ条件はプローブの種類により異なる。
（ｉ）試薬
後述するＰＣＲ条件１−４についてはTOYOBO（登録商標）Co., LTD.社のKOD FXを用い、後述するＰＣＲ条件５に対しては同社のKOD Plusを用いた。
（ｉｉ）サーマルサイクルプログラム
上記プロトコールに例示されているサーマルサイクラー（ブロック）を９４℃（２分）で初期熱変性した後、熱変性、アニールおよび伸長反応を所定数のサイクルで繰返し、伸長反応の延長を行なった（ＰＣＲ条件）。実際のＰＣＲ条件はプローブの種類により異なる。
発明者らは５種類のプローブ１４−１〜１４−５を使用した。図６（Ａ）はプローブ１４−１が備えたてんかん責任遺伝子の構成を示し、図６（Ｂ）はプローブ１４−１のＰＣＲ条件１を示す。図６（Ａ）で、例えばＳＣＮ１Ａ_ｅｘ３は図３のてんかん責任遺伝子の一覧表２０に示されるＳＣＮ１Ａ遺伝子のエキソン３を意味する。図６（Ａ）中の他の記号（および図７（Ａ）、８（Ａ）、９（Ａ）、１０（Ａ）の記号）も同様であるため、当該記号についての説明は以下では省略する。図６（Ａ）に示されるように、プローブ１４−１はてんかん遺伝子一覧表２０に掲げた１４個のてんかん遺伝子から選択した１８個の責任部位から構成されている。図６（Ｂ）に示されるように、サーマルサイクラー（ブロック）を９４℃（２分）で初期熱変性する（他のプローブ１４−２〜１４−５でも同様であるため、初期熱変性に関する説明は以下では省略する）。次に、熱変性（９８℃で１０秒）、アニール（５８℃で３０秒）および伸長反応（６８℃で３０秒）を３０サイクル実行する（図６（Ｂ）中の矢印で示される範囲）。その後、伸長反応の延長（６８℃で1分）を行なった。
図７（Ａ）はプローブ１４−２が備えたてんかん責任遺伝子の構成を示し、図７（Ｂ）はプローブ１４−２のＰＣＲ条件２を示す。図７（Ａ）に示されるように、プローブ１４−２はてんかん遺伝子一覧表２０に掲げた１４個のてんかん遺伝子から選択した２４個の責任部位から構成されている。図７（Ｂ）に示されるように、熱変性（９８℃で１０秒）、アニール（５８℃で３０秒）および伸長反応（６８℃で１分）を３０サイクル実行する（図７（Ｂ）中の矢印で示される範囲）。その後、伸長反応の延長（６８℃で３分）を行なった。
図８（Ａ）はプローブ１４−３が備えたてんかん責任遺伝子の構成を示し、図８（Ｂ）はプローブ１４−３のＰＣＲ条件３を示す。図８（Ａ）に示されるように、プローブ１４−３はてんかん遺伝子一覧表２０に掲げた１４個のてんかん遺伝子から選択した２個の責任部位から構成されている。図８（Ｂ）に示されるように、熱変性（９８℃で１０秒）、アニール（５８℃で３０秒）および伸長反応（６８℃で２分）を３０サイクル実行する（図８（Ｂ）中の矢印で示される範囲）。その後、伸長反応の延長（６８℃で３分）を行なった。
図９（Ａ）はプローブ１４−４が備えたてんかん責任遺伝子の構成を示し、図９（Ｂ）はプローブ１４−４のＰＣＲ条件４を示す。図９（Ａ）に示されるように、プローブ１４−４はてんかん遺伝子一覧表２０に掲げた１４個のてんかん遺伝子から選択した３個の責任部位から構成されている。図９（Ｂ）に示されるように、熱変性（９８℃で１０秒）およびアニール（６８℃で３分）を３０サイクル実行する（図９（Ｂ）中の矢印で示される範囲）。その後、伸長反応の延長（６８℃で３分）を行なった。
図１０（Ａ）はプローブ１４−５が備えたてんかん責任遺伝子の構成を示し、図１０（Ｂ）はプローブ１４−５のＰＣＲ条件５を示す。図１０（Ａ）に示されるように、プローブ１４−５はてんかん遺伝子一覧表２０に掲げた１４個のてんかん遺伝子から選択した１個の責任部位から構成されている。図１０（Ｂ）に示されるように、熱変性（９４℃で１５秒）、アニール（５８℃で３０秒）および伸長反応（６８℃で４分）を３０サイクル実行する（図１０（Ｂ）中の矢印で示される範囲）。その後、伸長反応の延長（６８℃で５分）を行なった。なお、プローブの種類は上記５種類に限定されるものではなく、てんかん遺伝子一覧表２０に掲げた１４個のてんかん遺伝子から選択した１以上の責任部位から構成された他のプローブであってもよい。
（２）アンプリコンの定量、プーリング、精製（ステップＳ３１０）
（ｉ）試薬および装置
アンプリコンの定量には、Invitrogen（登録商標）社のQuant-iT PicoGreen（登録商標）dsDNA Assay Kit等を用いた。詳細は上記プロトコールの表１．９を参照されたい。蛍光測定にはコロナ蛍光マイクロプレートリーダMTP-601Labを用いた（励起波長４８０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）。精製にはClontech（登録商標）社のDNA Amplification Clean-UP Kit等を用いた。詳細は上記プロトコールの表１．１２および１．１３を参照されたい。
（ｉｉ）定量
PicoGreen（登録商標）法により行なった。Resequencing Assay Workbookをダウンロードし、当該Workbookを用いて行なっていく。詳細は上記プロトコールのPicoGreen（登録商標）Methodを参照されたい。
（ｉｉｉ）プーリング
上記WorkbookのPG Standard Curveタブを選択し、PicoGreen（登録商標） Quantitation- Standard Curveワークシートを用いて行なう。詳細は上記プロトコールのPool the PCR Productsを参照されたい。
（ｉｖ）精製
詳細は上記プロトコールのPurificationを参照されたい。
（ｉ）試薬および装置
アンプリコンの定量には、Invitrogen（登録商標）社のQuant-iT PicoGreen（登録商標）dsDNA Assay Kit等を用いた。詳細は上記プロトコールの表１．９を参照されたい。蛍光測定にはコロナ蛍光マイクロプレートリーダMTP-601Labを用いた（励起波長４８０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）。精製にはClontech（登録商標）社のDNA Amplification Clean-UP Kit等を用いた。詳細は上記プロトコールの表１．１２および１．１３を参照されたい。
（ｉｉ）定量
PicoGreen（登録商標）法により行なった。Resequencing Assay Workbookをダウンロードし、当該Workbookを用いて行なっていく。詳細は上記プロトコールのPicoGreen（登録商標）Methodを参照されたい。
（ｉｉｉ）プーリング
上記WorkbookのPG Standard Curveタブを選択し、PicoGreen（登録商標） Quantitation- Standard Curveワークシートを用いて行なう。詳細は上記プロトコールのPool the PCR Productsを参照されたい。
（ｉｖ）精製
詳細は上記プロトコールのPurificationを参照されたい。
（３）アンプリコンのフラグメンテーション（ステップＳ３２０）
（ｉ）試薬
Affymetrix（登録商標）社のGeneChip（登録商標） Resequencing Assay Kit中のGeneChip（登録商標）Fragmentation Reagent等を用いた。詳細は上記プロトコールの表１．１４を参照されたい。
（ｉｉ）フラグメンテーション
詳細は上記プロトコールのFragment the Pooled PCR Productsを参照されたい。
（ｉ）試薬
Affymetrix（登録商標）社のGeneChip（登録商標） Resequencing Assay Kit中のGeneChip（登録商標）Fragmentation Reagent等を用いた。詳細は上記プロトコールの表１．１４を参照されたい。
（ｉｉ）フラグメンテーション
詳細は上記プロトコールのFragment the Pooled PCR Productsを参照されたい。
（４）アンプリコンのラベリング（ステップＳ３３０）
（ｉ）試薬
Affymetrix（登録商標）社のGeneChip（登録商標） Resequencing Assay Kit中のGeneChip（登録商標）DNA Labeling Reagent等を用いた。詳細は上記プロトコールの表１．１７を参照されたい。
（ｉｉ）ラベリング
ラベリングは２時間行なった。詳細は上記プロトコールのLabelingを参照されたい。
（ｉ）試薬
Affymetrix（登録商標）社のGeneChip（登録商標） Resequencing Assay Kit中のGeneChip（登録商標）DNA Labeling Reagent等を用いた。詳細は上記プロトコールの表１．１７を参照されたい。
（ｉｉ）ラベリング
ラベリングは２時間行なった。詳細は上記プロトコールのLabelingを参照されたい。
（５）ハイブリダイゼーション（ステップＳ３４０）
（ｉ）試薬
Affymetrix（登録商標）社のGeneChip（登録商標）Resequencing Assay Kit中のOligonucleotide Control Reagent等を用いた。詳細は上記プロトコールの表１．２０を参照されたい。
（ｉｉ）ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションは４９℃で１６時間行なった。詳細は上記プロトコールのhybridizationを参照されたい。
（ｉ）試薬
Affymetrix（登録商標）社のGeneChip（登録商標）Resequencing Assay Kit中のOligonucleotide Control Reagent等を用いた。詳細は上記プロトコールの表１．２０を参照されたい。
（ｉｉ）ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションは４９℃で１６時間行なった。詳細は上記プロトコールのhybridizationを参照されたい。
（６）ＤＮＡチップの洗浄、蛍光染色、スキャニング（ステップＳ３５０）
（ｉ）試薬および装置
ＤＮＡチップの洗浄、蛍光染色、スキャニングはGeneChip（登録商標）Operating Software（ＧＣＯＳ）を用いた。ＤＮＡチップの洗浄はGeneChip（登録商標） Fluidics Station 450等を用い、スキャニングはGeneChip（登録商標） Scanner 3000等を用いて行なった。染色にはＳＡＰＥ（Streptavidin Phycoerythrin）を使用した。詳細は上記プロトコールの表１．２５を参照されたい。
（ｉｉ）ＤＮＡチップの洗浄、蛍光染色、スキャニング
まず、Fluidics Stationのセットアップを行なう。即ち、上記ＧＣＯＳに新しい実験（実験名）の登録等を行なう。詳細は上記プロトコールのExperiment and Fluidics Station Setupを参照されたい。図１１は、染色プロトコールを示す。図１１で図２と同じ符号を付した箇所は同じ要素を示すため、説明は省略する。図１１に示されるように、ハイブリダイゼーションしたプローブ１４をビオチン標識し（ステップＳ３５１）、ビチオン標識されたＤＮＡをＳＡＰＥで染色する（ステップＳ３５２）。さらに、抗Streptavidin−ビオチン化抗体でビオチン標識し（ステップＳ３５３）、再びＳＡＰＥで染色する（ステップＳ３５４）。詳細は上記プロトコールのPrepare the Arrays for Washing and StainingからFluidics station Protocolsまでを参照されたい。洗浄・染色の過程は4アレイあたり約１時間半である。この後、スキャニングを行なって、蛍光シグナル強度を検出する。スキャナは上記ＧＣＯＳにより制御されている。詳細は上記プロトコールのScanning Arraysを参照されたい。スキャン時間は1アレイあたり５分程度である。検出後のアレイイメージはデータ解析用パーソナルコンピュータＰＣ（不図示）の画面上に表示される。図１２に、データ解析用パーソナルコンピュータＰＣの画面上に表示されたスキャン画像（検出後のアレイイメージ）を示す。上記表示は後述するソフトウェアＧＳＥＱにより行なわれる。
（ｉ）試薬および装置
ＤＮＡチップの洗浄、蛍光染色、スキャニングはGeneChip（登録商標）Operating Software（ＧＣＯＳ）を用いた。ＤＮＡチップの洗浄はGeneChip（登録商標） Fluidics Station 450等を用い、スキャニングはGeneChip（登録商標） Scanner 3000等を用いて行なった。染色にはＳＡＰＥ（Streptavidin Phycoerythrin）を使用した。詳細は上記プロトコールの表１．２５を参照されたい。
（ｉｉ）ＤＮＡチップの洗浄、蛍光染色、スキャニング
まず、Fluidics Stationのセットアップを行なう。即ち、上記ＧＣＯＳに新しい実験（実験名）の登録等を行なう。詳細は上記プロトコールのExperiment and Fluidics Station Setupを参照されたい。図１１は、染色プロトコールを示す。図１１で図２と同じ符号を付した箇所は同じ要素を示すため、説明は省略する。図１１に示されるように、ハイブリダイゼーションしたプローブ１４をビオチン標識し（ステップＳ３５１）、ビチオン標識されたＤＮＡをＳＡＰＥで染色する（ステップＳ３５２）。さらに、抗Streptavidin−ビオチン化抗体でビオチン標識し（ステップＳ３５３）、再びＳＡＰＥで染色する（ステップＳ３５４）。詳細は上記プロトコールのPrepare the Arrays for Washing and StainingからFluidics station Protocolsまでを参照されたい。洗浄・染色の過程は4アレイあたり約１時間半である。この後、スキャニングを行なって、蛍光シグナル強度を検出する。スキャナは上記ＧＣＯＳにより制御されている。詳細は上記プロトコールのScanning Arraysを参照されたい。スキャン時間は1アレイあたり５分程度である。検出後のアレイイメージはデータ解析用パーソナルコンピュータＰＣ（不図示）の画面上に表示される。図１２に、データ解析用パーソナルコンピュータＰＣの画面上に表示されたスキャン画像（検出後のアレイイメージ）を示す。上記表示は後述するソフトウェアＧＳＥＱにより行なわれる。
４．配列解析ステップ（ステップＳ４０)
上述のように検出した蛍光シグナル強度に基づき、てんかん患者における遺伝子変異の有無およびその領域を探索する。配列解析はAffymetrix（登録商標）GeneChip（登録商標）Sequence Analysis Software（ＧＳＥＱ）で行った。ＧＳＥＱはＧＣＯＳで検出されたデータに基づき配列解析を行なう。詳細はAffymetrix（登録商標）GeneChip（登録商標）Sequence Analysis Software User’s Guide Version 4.1を参照されたい。ＧＣＯＳとＧＳＥＱとの関連は上記ユーザガイドの第２章GETTING STARTEDに記載され、蛍光シグナル強度の解析は上記ユーザガイドの第３章ANALYZING CELLINTENSITY DATAに記載され、リーシークエンス解析は上記ユーザガイドの第４章RESEQUENCING ANALYSIS WINDOWに記載されている。各々参照されたい。
上述のように検出した蛍光シグナル強度に基づき、てんかん患者における遺伝子変異の有無およびその領域を探索する。配列解析はAffymetrix（登録商標）GeneChip（登録商標）Sequence Analysis Software（ＧＳＥＱ）で行った。ＧＳＥＱはＧＣＯＳで検出されたデータに基づき配列解析を行なう。詳細はAffymetrix（登録商標）GeneChip（登録商標）Sequence Analysis Software User’s Guide Version 4.1を参照されたい。ＧＣＯＳとＧＳＥＱとの関連は上記ユーザガイドの第２章GETTING STARTEDに記載され、蛍光シグナル強度の解析は上記ユーザガイドの第３章ANALYZING CELLINTENSITY DATAに記載され、リーシークエンス解析は上記ユーザガイドの第４章RESEQUENCING ANALYSIS WINDOWに記載されている。各々参照されたい。
従来のキャピラリー型シークエンサーにより同定された遺伝子変異を、本発明のリーシークエンスＤＮＡチップ１２により同定可能かどうか検討した。図１３は、従来のキャピラリー型シークエンサーによる同定と本発明のリーシークエンスＤＮＡチップ１２による同定との比較を示す。図１３に示されるように、患者（patient）はＳ１からＳ８８まで（Ｓに付された番号は不連続）の４８検体である。図１３の比較結果（Results）欄は、従来のキャピラリー型シークエンサーにより同定された遺伝子変異を本発明のリーシークエンスＤＮＡチップ１２により同定できた場合は○（Consistent）とし、同定できなかった場合は×（Inconsistent）と示してある。例えば、患者Ｓ１ではコーディング領域の４５４７番のＣ（シトシン）がＡ（アデニン）に変異しており、これを本発明のリーシークエンスＤＮＡチップ１２も同定できたため、○（Consistent）となっている。一方、患者Ｓ１４ではｃＤＮＡの２８０２番のＧ（グアニン）がＣ（シトシン）に変異しており、これを本発明のリーシークエンスＤＮＡチップ１２は同定できなかったため、×（Inconsistent）となっている。全体では、４８検体中４４検体が一致（○）し、９２％という高い精度で遺伝子変異を同定することができた。
以上より、本発明の実施例１によれば、リーシークエンスＤＮＡチップ１２が対応するてんかん責任遺伝子としては、好適にはナトリウムチャネル遺伝子、カリウムチャネル遺伝子、カルシウムチャネル遺伝子、塩素チャネル遺伝子、アセチルコリン受容体遺伝子及びγ−アミノ酪酸受容体遺伝子の６種類から選択した１４個のてんかん責任遺伝子である。即ち、本発明のリーシークエンスＤＮＡチップ１２によれば、一度の解析で１４個のてんかん責任遺伝子の責任部位のシークエンスを得ることが可能である。本発明のリーシークエンスＤＮＡチップ１２に搭載しているプローブ１４は、出願時点までに報告されているてんかん責任遺伝子の９１％をカバーしている。なお、異なる遺伝子でも相同な領域はクロスハイブリダイゼーション（cross hybridization）してしまうため、本発明のリーシークエンスＤＮＡチップ１２では一部相同領域を除いた。このため、１００％のカバー率は得られない。
従来のキャピラリー型シークエンサーにより同定された遺伝子変異を、本発明のリーシークエンスＤＮＡチップ１２により同定可能かどうか検討した。その結果、４８検体中４４検体が一致し、９２％という高い精度で遺伝子変異を同定することができた。以上より、本発明のリーシークエンスＤＮＡチップ１２によれば、てんかんのように複数の遺伝的要因の関与が示唆されている疾患の場合であっても、複数の任意遺伝子型を一度の解析で同定することができるため、時間的、コスト的および労力的に現実的な、リーシークエンスＤＮＡチップ１２を提供することができる。
上述したように、本発明のリーシークエンスＤＮＡチップ１２はAffymetrix（登録商標）Resequencing Arrayをベースにしたものである。しかし、本発明に係るリーシークエンスＤＮＡチップ１２はAffymetrix（登録商標）Resequencing Arrayに限定されるものではなく、ターゲットとなるＤＮＡの相補鎖を選択的に捕獲するように設計されたプローブを搭載した任意のタイプの平面支持体または固相支持体等であれば他のマイクロアレイであってもよい。
上述した本発明のリーシークエンスＤＮＡチップ１２を用いることにより、一度の解析で、従来判明しているてんかん全責任遺伝子領域の遺伝子型の判定が可能となる。この結果、てんかんのように複数の遺伝的要因の関与が示唆されている疾患の場合であっても、遺伝子診断が可能となる。当該遺伝子診断により、患者の病因に即したＡＥＤ選択が可能となる。即ち、本発明の最適抗てんかん薬決定方法によれば、上述した本発明のリーシークエンスＤＮＡチップ１２を用いててんかん患者のてんかん責任遺伝子を同定し、同定されたてんかん遺伝子に作用する抗てんかん薬（ＡＥＤ）を選択することにより、最適なＡＥＤを決定することができる。より具体的には、てんかん責任遺伝子およびＡＥＤ作用機序、作用部位でのＡＥＤ濃度を規定するＡＥＤ代謝関連遺伝子多型等の知見を基に、てんかん患者に対し遺伝子診断を行なう。従来、てんかん発作型・症候群分類からＡＥＤを判断していたが、上述した本発明のリーシークエンスＤＮＡチップ１２を用いててんかん患者のてんかん責任遺伝子を同定することにより、その患者のてんかんの原因（てんかん責任遺伝子変異）に最も適したＡＥＤを選択することができ、個々人の代謝能（ＡＥＤ代謝関連遺伝子多型）からそれに見合った投与量を設定することが可能となる。加えて、以上の遺伝子診断により、患者の予後予測を的確に行なうことが可能となる。
以上より、本発明の実施例２によれば、変異部位から適切なＡＥＤを選択し、試行錯誤（Try
& Error）を減少させ、患者の負担を軽減することができる（図１のステップＳ５０）。さらに、てんかん発作抑制率の向上につながり、仮性難治てんかんを防ぎ、ＡＥＤの副作用および社会的制約（運転免許の取得、職業等の制約）の軽減等により患者のＱＯＬを向上させることができ、医療経済的側面にも大きく貢献することができる。遺伝的なてんかん要因を持っていても、てんかん発症前の特定の時期に治療することにより、てんかん発症を抑制できる可能性が明らかになりつつある。従って、上述した最適ＡＥＤ決定方法によるてんかんの遺伝子診断は、将来的なてんかん根治治療において非常に重要である。
& Error）を減少させ、患者の負担を軽減することができる（図１のステップＳ５０）。さらに、てんかん発作抑制率の向上につながり、仮性難治てんかんを防ぎ、ＡＥＤの副作用および社会的制約（運転免許の取得、職業等の制約）の軽減等により患者のＱＯＬを向上させることができ、医療経済的側面にも大きく貢献することができる。遺伝的なてんかん要因を持っていても、てんかん発症前の特定の時期に治療することにより、てんかん発症を抑制できる可能性が明らかになりつつある。従って、上述した最適ＡＥＤ決定方法によるてんかんの遺伝子診断は、将来的なてんかん根治治療において非常に重要である。
発作を主調とするてんかんは、他の機能性神経精神疾患（統合失調症、うつ病）と比較して、脳内標的分子が判明しつつある。従って、本発明のリーシークエンスＤＮＡチップ１２（てんかん遺伝子診断チップ）の技術的思想は、薬物治療が主たる治療法である他の神経精神疾患における遺伝子診断チップに対しても適用可能であろう。
本発明の活用例として、てんかん患者のてんかん責任遺伝子型の同定、および薬物治療が主たる治療法である他の神経精神疾患における責任遺伝子型の同定等に適用することができる。
１０ GeneChip（登録商標）CustomSeq（登録商標）Array、 １２、１２’ リーシークエンスＤＮＡチップ、１２ａ リーシークエンスＤＮＡチップ１２’の一部、 １４、１４−１、１４−２、１４−３、１４−４、１４−５ プローブ、 ２０ てんかん責任遺伝子の一覧表、３０ スポット、３０Ｔ、３０Ｇ、３０Ｃ、３０Ａ スポット３０のプローブ、３０−ｉ、３２−ｊ 配列の位置、３２ 配列。
"てんかんテキスト〜はじめの一歩〜"、［online］、大日本住友製薬株式会社、［２０１０年２月９日掲載］、インターネット、<URL:http://http://ds-pharma.jp/medical/gakujutsu/tenkan/tenkan01/epilepsy/index.html>
Claims (9)
- てんかん患者のてんかん責任遺伝子型を同定するプローブを搭載したリーシークエンスＤＮＡチップであって、該リーシークエンス用ＤＮＡチップが対応するてんかん責任遺伝子は、ナトリウムチャネル遺伝子、カリウムチャネル遺伝子、カルシウムチャネル遺伝子、塩素チャネル遺伝子、アセチルコリン受容体遺伝子及びγ−アミノ酪酸受容体遺伝子のいずれか１以上を含み、該プローブは該てんかん責任遺伝子から選択した１以上の責任部位を搭載したことを特徴とするリーシークエンスＤＮＡチップ。
- 請求項１記載のリーシークエンスＤＮＡチップにおいて、前記ナトリウムチャネル遺伝子はＳＣＮ１Ａ遺伝子及びＳＣＮ１Ｂ遺伝子であり、前記プローブに搭載する責任部位は、
（１）ＳＣＮ１Ａ遺伝子のエキソン１から２６、
（２）ＳＣＮ１Ｂ遺伝子のエキソン３、
から選択することを特徴とするリーシークエンスＤＮＡチップ。 - 請求項１又は２記載のリーシークエンスＤＮＡチップにおいて、前記カリウムチャネル遺伝子はＫＣＮＱ２遺伝子及びＫＣＮＱ３遺伝子であり、前記プローブに搭載する責任部位は、
（１）ＫＣＮＱ２遺伝子のエキソン１、エキソン２、
（２）ＫＣＮＱ２遺伝子のエキソン８、
（３）ＫＣＮＱ３遺伝子のエキソン６、
から選択することを特徴とするリーシークエンスＤＮＡチップ。 - 請求項１乃至３のいずれかに記載のリーシークエンスＤＮＡチップにおいて、前記カルシウムチャネル遺伝子はＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子、ＣＡＣＮＡ１Ｈ遺伝子及びＣＡＣＮＢ４遺伝子であり、前記プローブに搭載する責任部位は、
（１）ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のエキソン３、エキソン３３、エキソン３６、
（２）ＣＡＣＮＡ１Ｈ遺伝子のエキソン４、エキソン７、エキソン９から１１、エキソン２３、
（３）ＣＡＣＮＢ４遺伝子のエキソン１３、
から選択することを特徴とするリーシークエンスＤＮＡチップ。 - 請求項１乃至４のいずれかに記載のリーシークエンスＤＮＡチップにおいて、前記塩素チャネル遺伝子はＣＬＣＮ２遺伝子であり、前記プローブに搭載する責任部位は、
（１）ＣＬＣＮ２遺伝子のエキソン５、エキソン１９
から選択することを特徴とするリーシークエンスＤＮＡチップ。 - 請求項１乃至５のいずれかに記載のリーシークエンスＤＮＡチップにおいて、前記アセチルコリン受容体遺伝子はＣＨＲＮＡ４遺伝子、ＣＨＲＮＡ７遺伝子及びＣＨＲＮＢ２遺伝子であり、前記プローブに搭載する責任部位は、
（１）ＣＨＲＮＡ４遺伝子のエキソン５、
（２）ＣＨＲＮＡ７遺伝子のエキソン１０、
（３）ＣＨＲＮＢ２遺伝子のエキソン５、
から選択することを特徴とするリーシークエンスＤＮＡチップ。 - 請求項１乃至６のいずれかに記載のリーシークエンスＤＮＡチップにおいて、前記γ−アミノ酪酸受容体遺伝子はＧＡＢＲＡ１遺伝子、ＧＡＢＲＡＤ遺伝子及びＧＡＢＲＧ２遺伝子であり、前記プローブに搭載する責任部位は、
（１）ＧＡＢＲＡ１遺伝子のエキソン１０、
（２）ＧＡＢＲＡＤ遺伝子のエキソン５−６、
（３）ＧＡＢＲＧ２遺伝子のエキソン２、エキソン４
から選択することを特徴とするリーシークエンスＤＮＡチップ。 - 請求項１乃至７のいずれかに記載のリーシークエンスＤＮＡチップにおいて、挿入／欠失（insertion/deletion）に対応する塩基配列に基づく他のプローブをさらに搭載したことを特徴とするリーシークエンスＤＮＡチップ。
- てんかん患者に最適な抗てんかん薬を決定する最適抗てんかん薬決定方法であって、請求項１乃至８のいずれかに記載したリーシークエンスＤＮＡチップを用いててんかん患者のてんかん責任遺伝子を同定し、同定されたてんかん遺伝子に作用する抗てんかん薬（ＡＥＤ）を選択することを特徴とする最適抗てんかん薬決定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010060019A JP2011188837A (ja) | 2010-03-16 | 2010-03-16 | リーシークエンスｄｎａチップおよび最適抗てんかん薬決定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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