WO2013191197A1 - 核酸の検出方法および核酸検出キット - Google Patents

核酸の検出方法および核酸検出キット Download PDF

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WO2013191197A1
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nucleic acid
target nucleic
capture probe
label
double
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中村　史夫
洋二 上田
隆文 有家
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東レ株式会社
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    • C12Q2565/50—Detection characterised by immobilisation to a surface
    • C12Q2565/549—Detection characterised by immobilisation to a surface characterised by the capture oligonucleotide being a reporter labelled capture oligonucleotide

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid detection method using hybridization between a capture probe and a nucleic acid.
  • nucleic acids various nucleic acids / nucleic acid complementarity such as Northern blotting or Southern blotting can be used to examine the relationship between various genes and their biological function expression.
  • proteins the function and expression of proteins can be examined using protein-protein reactions as represented by Western blotting.
  • a capture probe made of a nucleic acid is used for the purpose of detecting a nucleic acid (target nucleic acid) to be examined.
  • a capture probe made of a nucleic acid is used for simultaneous detection of a plurality of types of target nucleic acids using a DNA chip or a DNA microarray in which a large number of capture probes are immobilized on a support.
  • the sequence of the target nucleic acid can be examined by bringing the capture probe immobilized on the support into contact with the target nucleic acid and examining the complementarity depending on the presence or absence of hybridization between the capture probe and the target nucleic acid.
  • a method is generally used in which a label is introduced into the target nucleic acid and the signal of the label is detected after contact with the capture probe.
  • a method for introducing a label into a target nucleic acid there are a method of introducing before hybridization with a capture probe and a method of introducing after hybridization.
  • the latter is called post-dying method, and is a method of introducing a labeled body by bringing the hybridized target nucleic acid into contact with the labeled body. Since the labeled body is bound after hybridization, a relatively large-sized labeled body.
  • the labeling step can be repeated for detection signal amplification (Patent Documents 1 and 2).
  • a labeling solution containing a monovalent metal cation such as sodium ion having a high concentration of about 500 to 1000 mM.
  • divalent metal cations are known to be substances that activate various nucleolytic enzymes, they should not be actively used in nucleic acid detection methods using hybridization.
  • the technical idea of using a divalent metal cation in the labeling step of the post-dyeing method is not known.
  • the target nucleic acid hybridized to the capture probe is peeled off when the label is introduced into the target nucleic acid or when the label not introduced into the target nucleic acid is washed and removed. As a result, the problem that the detection signal was reduced was found.
  • the object of the present invention is to find a substance that suppresses the detachment of the target nucleic acid hybridized to the capture probe from the support in the labeling step in the post-dye method in addition to sodium ion, rather than sodium ion. It is an object of the present invention to provide a nucleic acid detection method capable of detecting a target nucleic acid at a low concentration and with a sensitivity equivalent to or higher.
  • the present inventor introduced the target nucleic acid into the target nucleic acid by using a solution containing a divalent metal cation that was avoided in the nucleic acid hybridization step in the labeling step of the target nucleic acid hybridized to the capture probe. It is possible to suppress the detachment of the target nucleic acid during washing / removal of the label that has not been performed, and as a result, it has been found that the detection signal can be made equal to or higher than when sodium ions are used, The present invention has been completed.
  • the present invention includes the following (1) to (13).
  • the divalent metal cation is at least one selected from the group consisting of magnesium ion, zinc ion, manganese ion and calcium ion.
  • the introduction of a label into the target nucleic acid causes the labeled antibody or antigen-binding fragment thereof that undergoes an antigen-antibody reaction with the hybridized double-stranded nucleic acid to react with the double-stranded nucleic acid with an antigen-antibody.
  • Immobilization of the double-stranded nucleic acid on the support comprises an antibody immobilized on the support or an antigen-binding fragment thereof, and the double-stranded nucleic acid, which reacts with the double-stranded nucleic acid by antigen-antibody reaction.
  • (9) A nucleic acid detection kit comprising a capture probe and a reagent containing a divalent metal cation having a concentration of 10 mM or more.
  • a nucleic acid detection kit comprising a support on which a capture probe is immobilized and a reagent containing a divalent metal cation having a concentration of 10 mM or more.
  • the target nucleic acid hybridized to the capture probe can be detected with high sensitivity and good reproducibility.
  • target nucleic acid used in the detection method of the present invention examples include, but are not limited to, genes such as pathogenic bacteria and viruses, causative genes of genetic diseases, and the like, and parts thereof.
  • Samples containing these target nucleic acids include body fluids such as blood, serum, plasma, urine, feces, spinal fluid, saliva, wipes, various tissue fluids, various tissues, paraffin-embedded samples (FFPE), and sections thereof.
  • body fluids such as blood, serum, plasma, urine, feces, spinal fluid, saliva, wipes, various tissue fluids, various tissues, paraffin-embedded samples (FFPE), and sections thereof.
  • FFPE paraffin-embedded samples
  • the target nucleic acid to be a test substance may be a nucleic acid extracted from blood or cells by a conventional method, and DNA or RNA extracted from a specimen can be used.
  • DNA examples include, but are not limited to, labeled DNA, viral DNA, bacteria, mold and other DNA, cDNA obtained by reverse transcription of RNA, and fragments that are a part thereof.
  • RNA messenger RNA (mRNA), ribosomal RNA (rRNA), small RNA, fragments that are a part thereof, and the like can be used, but are not limited thereto.
  • chemically synthesized DNA or RNA can be used as the target nucleic acid.
  • the support can be a slide glass, a resin substrate, a membrane, beads or the like.
  • the material of the support is not particularly limited, and examples thereof include inorganic materials such as glass, ceramic and silicon, and polymers such as polyethylene terephthalate, cellulose acetate, polycarbonate, polystyrene, polymethyl methacrylate and silicone rubber.
  • the capture probe means a substance that can directly and selectively bind to the target nucleic acid contained in the test sample.
  • nucleic acid derivatives such as DNA, RNA, PNA (Peptide Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid), ENA (Ethylene-Bridged Nucleic Acid) may be used. it can.
  • a derivative is a labeled derivative with a fluorescent substance, a modified nucleotide (for example, a halogen or an alkyl such as methyl, an alkoxy such as methoxy, an alkoxy such as methoxy, a nucleotide or a base containing a group such as carboxymethyl, It means a chemically modified derivative such as a derivative containing nucleotides subjected to saturation of double bonds, deamination, substitution of oxygen molecules with sulfur molecules, and the like.
  • a modified nucleotide for example, a halogen or an alkyl such as methyl, an alkoxy such as methoxy, an alkoxy such as methoxy, a nucleotide or a base containing a group such as carboxymethyl.
  • a single-stranded nucleic acid having a specific base sequence selectively hybridizes and binds to a single-stranded nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence or a part thereof.
  • the capture probe used in the present invention may be a commercially available probe or a probe obtained from a living cell. Particularly preferred as a capture probe is a nucleic acid.
  • nucleic acids called oligonucleic acids having a length of up to 200 bases can be easily artificially synthesized with a synthesizer.
  • the carrier is preferably made of a material resistant to the organic solvent.
  • the unevenness produced by using the method described in JP-T-10-503841 A glass support having a structure can be used.
  • the support is preferably made of a light-transmitting material.
  • the method of Hirota et al. Japanese Patent No. 3922454
  • a glass capillary can be used as a method for dropping and fixing the capture probe onto the upper surface of the support.
  • the glass capillary As an example of the glass capillary, a commercially available product such as a self-made glass capillary or a micropipette (manufactured by Micro Support Co., Ltd., MP-005) can be used, but the method is not limited to these methods.
  • the present invention relates to a method for detecting a nucleic acid by hybridizing a capture probe and a target nucleic acid, by contacting the nucleic acid hybridized to the capture probe with a solution containing a label and a divalent metal cation. It is characterized by introducing a label into the nucleic acid.
  • the hybridization step and the label introduction step will be described.
  • Hybridization between the capture probe and the target nucleic acid can be performed by a method known per se. It is known that the stringency during hybridization of a capture probe and target nucleic acid is a function of temperature, salt concentration, probe chain length, GC content of the probe nucleotide sequence, and the concentration of chaotropic agent in the hybridization buffer. For example, Sambrook, J. et al. et al. (1998) Molecular Cloning: Conditions described in A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Press, New York, and the like can be used. The stringent temperature condition is about 30 ° C. or higher, usually about 10 ° C. to 70 ° C.
  • conditions include hybridization time, detergent (for example, sodium dodecyl sulfate (SDS)) concentration, presence or absence of carrier DNA, etc.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • Various stringency can be set by combining these conditions. Can do.
  • Those skilled in the art may appropriately determine conditions for obtaining a function as a capture probe prepared for detection of a desired target nucleic acid.
  • Hybridization of the capture probe and the target nucleic acid may be carried out in a state where the capture probe is immobilized on a support, or may be immobilized on the support after hybridization.
  • a method for immobilizing a capture probe after hybridization for example, a solid-phase antibody or antigen-binding fragment thereof (Fab fragment or the like) that specifically binds to a duplex formed with a target nucleic acid (antigen-antibody reaction). It can be carried out using F (ab ′) 2 fragment or the like (see Examples below).
  • the label can be introduced into the target nucleic acid hybridized with the capture probe by a method known per se, for example, after contacting the target nucleic acid with a solution containing the label and the divalent metal cation.
  • a method of introducing a label by chemical reaction, enzyme reaction, nucleic acid hybridization, etc., or a reactive functional group is introduced into the target nucleic acid by chemical reaction, enzyme reaction, nucleic acid hybridization, etc. And a solution containing the metal cation is brought into contact and then reacted with the functional group of the label to introduce it.
  • a labeled body can be introduced by introducing a nucleic acid having an amino group into a target nucleic acid by an enzyme reaction and reacting with a labeled body having a succinimide group that reacts with the amino group.
  • the labeled product can be introduced through the avidin-biotin reaction. It is also possible to introduce a label by contacting an intercalator-type label inserted into a double-stranded part formed by hybridization of the target nucleic acid and the probe nucleic acid.
  • it can be performed using an antibody that reacts with a double chain for an antigen-antibody reaction or an antigen-binding fragment thereof (Fab fragment, F (ab ′) 2 fragment, etc.) (see Examples below).
  • Examples of the label that can be used in the present invention include organic fluorescent dyes, phosphorescent dyes, quantum dots, fluorescent proteins such as fluorescent proteins, redox species capable of transferring electrons, alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, and the like. Those bound with an enzyme such as can be used. Of these labels, phosphors can be preferably used from the viewpoint of detection sensitivity and simplicity.
  • organic fluorescent dyes examples include cyanine (cyanine 2), aminomethylcoumarin, fluorescein, indocarbocyanine (cyanine 3), cyanine 3.5, tetramethylrhodamine, rhodamine red, Texas red, indocarbocyanine (cyanine 5), Examples include cyanine 5.5, cyanine 7, oyster, and BODIPY dyes.
  • intercalator-type fluorescent dyes include ethidium bromide and acridine orange.
  • fluorescent proteins include phycoerythrin (PE), allophycocyanin (APC), green fluorescent protein (GFP), and red fluorescence.
  • Well-known fluorescent substance, such as protein (RFP) is mentioned.
  • a semiconductor fine particle having a light emitting property may be used as the phosphor.
  • semiconductor fine particles include cadmium selenide (CdSe), cadmium sulfide (CdS), cadmium telluride (CdTe), indium gallium phosphide (InGaP), chalcopyrite fine particles, silicon (Si), and the like.
  • the fluorescence signal can be detected by a fluorescence microscope or a fluorescence scanner.
  • the labeled body is removed using a solution containing the labeled body and a divalent metal cation.
  • the divalent metal cation means an element / complex capable of releasing two electrons in a solution to become a divalent cation.
  • Monoatomic ions composed of alkaline earth metal ions such as ions, transition metals such as manganese ions, cobalt ions, zinc ions, thiocyanoiron (III) ions, tetraammine zinc (II) ions, hexaammine nickel (II) ions And complex ions.
  • At least one selected from the group consisting of magnesium ion, zinc ion, manganese ion and calcium ion is preferable, and considering the binding stability to double-stranded nucleic acid Magnesium ions and manganese ions are particularly preferred.
  • the concentration of the divalent metal cation in the solution is 10 mM or more, preferably 50 mM or more, more preferably 100 mM or more from the viewpoint of nucleic acid detection signal intensity. Moreover, it is preferable to set it as less than 500 mM from a viewpoint of the noise increase by reduction of a reagent amount and precipitation of the metal cation in a solution.
  • washing and removing step itself can be performed by a method known per se.
  • a buffer solution for example, a citrate buffer solution such as SSC
  • a surfactant preferably a nonionic surfactant such as Tween (trade name) series
  • Washing can be performed at a low temperature of about 10 to 10 ° C. for 1 to 10 minutes.
  • the detection step itself can be performed by a well-known method, and can be performed by detecting the signal of the label introduced into the double-stranded nucleic acid.
  • the detected signal is compared with ambient noise.
  • the signal value obtained from the position where the capture probe is fixed is compared with the signal value obtained from other positions, and the target nucleic acid is detected when the former value is exceeded To do.
  • the measurement of the signal value can be performed by a well-known method for each label, and various apparatuses for that purpose are commercially available, and can be easily performed using a commercially available measuring apparatus.
  • the label is a fluorescent label, it can be easily performed using a commercially available DNA chip scanner or the like.
  • the target nucleic acid may be quantified by measuring the signal value.
  • the present invention can be used even when the target nucleic acid is quantified. It is included in the detection method.
  • the nucleic acid detection kit of the present invention includes at least a capture probe and a reagent containing a divalent metal cation.
  • the reagent containing a divalent metal cation is preferably a reagent containing the divalent metal cation and a label.
  • the capture probe may be immobilized on a support.
  • the support on which the capture probe contained in the detection kit of the present invention is immobilized is a support in which the capture probe is immobilized on the support.
  • the reagent containing a divalent metal cation contained in the kit of the present invention may be in a dry state or in a solution state, and when it is in a dry state, a solvent for dissolving it may be included.
  • the reagent that can be included in the detection kit of the present invention includes a reagent containing the label, a reagent for adjusting pH, a surfactant, a reagent containing a protein or nucleic acid for preventing the label from adsorbing to the support. These may be in a dry state or in a solution state, and may be independent reagents or appropriately mixed reagents. If they are in a dry state, they are dissolved. Solvent may be included.
  • Example 1 (1) Preparation of DNA chip
  • the capture probe was synthesized by commissioning Operon's oligo DNA modified at the 5 'end with an amino group. Table 1 shows the base sequence of the capture probe. This capture probe was fixed to a “3D-Gene” substrate (256-column substrate) manufactured by Toray Industries, Inc. and used as an evaluation DNA chip.
  • a 30-base oligo DNA (Table 1) having a sequence complementary to a capture probe and having biotin introduced at the 5 'end was commissioned and synthesized by Operon. Table 1 shows the base sequence of the target nucleic acid.
  • the oligo DNA was diluted with 1 ⁇ hybridization solution (described later) to 200 fmol / l to obtain a sample DNA.
  • Hybridization In 5 ⁇ l of sample DNA, 1 ⁇ hybridization solution (1 wt% BSA (bovine serum albumin), 5 ⁇ SSC, 1 wt% SDS (sodium dodecyl sulfate), 50 ng / ml salmon sperm DNA solution, 5 wt% 35 ⁇ l of dextran sulfate sodium (30% formamide) was added to obtain a hybridization solution. The whole amount was injected into a DNA chip and set in an incubator heated at 32 ° C. Hybridization was performed at 32 ° C. for 2 hours while swirling at 250 rpm according to the standard protocol of “3D-gene”.
  • the DNA chip was washed with a washing solution (0.5 ⁇ SSC, 0.1 wt% SDS (sodium dodecyl sulfate)) heated to 30 ° C. for 5 minutes, and then used with a spin dryer (Wakken Yakuhin). Dried.
  • a washing solution 0.5 ⁇ SSC, 0.1 wt% SDS (sodium dodecyl sulfate)
  • Magnesium ions were added as divalent metal cations to be added at the time of sample DNA labeling.
  • Phosphor-containing buffer solution for labeling sample DNA with 1M magnesium chloride hexahydrate 50 ng / ⁇ l SAPE (streptavidin phycoerythrin, Prozyme), 100 mM MES (2-morpholinoethanesulfonic acid sodium salt), 0 .05 wt% Tween 20 (trade name), 2 mg / ml BSA (bovine serum albumin)) and adjusted so that the final concentration of magnesium ions is 10, 20, 50, 100, 200, 300, and 500 mM, respectively. And used as a labeling solution.
  • the sodium ion concentration derived from MES was 74 mM. These labeling solutions were dropped on the DNA chip and incubated at 35 ° C. for 5 minutes. After washing with a washing liquid (6 ⁇ SSPE buffer solution, 0.01 wt% Tween 20 (trade name)) heated to 30 ° C. for 5 minutes, it was dried using a spin dryer (Wakken Yakuhin). The labeled DNA chip detected a fluorescent signal using a DNA chip scanner (Toray Industries, Inc.). The scanner was set to 100% laser output and 70% photomultiplier voltage.
  • Comparative Example 1 When the sample DNA is labeled, a divalent metal cation is not added, and a phosphor-containing buffer solution for labeling the sample DNA (50 ng / ⁇ l SAPE (streptavidin phycoerythrin, Prozyme), 100 mM MES (2- Morpholinoethanesulfonic acid sodium salt), 0.05 wt% Tween 20 (trade name), 2 mg / ml BSA (bovine serum albumin)) was used as a labeling solution. The sodium ion concentration derived from MES was 74 mM. This labeling solution was dropped on the DNA chip and incubated at 35 ° C. for 5 minutes.
  • SAPE streptavidin phycoerythrin, Prozyme
  • 100 mM MES (2- Morpholinoethanesulfonic acid sodium salt 0.05 wt% Tween 20 (trade name)
  • the sodium ion concentration derived from MES was
  • Reference example 1 A predetermined amount of sodium chloride was added to a phosphor-containing buffer (50 ng / ⁇ l SAPE (Streptavidin Phycoerythrin, Prozyme), 100 mM MES (2-morpholinoethanesulfonic acid sodium salt), 0.05 wt% Tween 20 (trade name) A solution added to 2 mg / ml BSA (bovine serum albumin)) was prepared. At this time, the final concentration of sodium ions was adjusted to 500 or 1000 mM to obtain a labeling solution. These labeling solutions were dropped on the DNA chip and incubated at 35 ° C. for 5 minutes.
  • SAPE Streptavidin Phycoerythrin, Prozyme
  • MES 2-morpholinoethanesulfonic acid sodium salt
  • Tween 20 trade name
  • Table 2 shows the results of Example 1, Comparative Example 1, and Reference Example 1. From the results of Example 1 and Comparative Example 1, the detection signal increased by adding magnesium ions to the sample DNA labeling reagent. Further, from the results of Example 1 and Reference Example 1, when magnesium ions were added to the sample DNA labeling reagent, a detection signal equal to or higher than that when sodium ions were added was observed at a lower concentration, in particular, magnesium. It was found that the detection signal was greatly improved when the ion concentration was 50 mM or more. The detection signal (noise) of the spot where the capture probe was not immobilized was 230 to 270.
  • Reference example 2 (1) Measurement of melting temperature (Tm) of double-stranded DNA As a mechanism for improving the detection signal by adding a divalent metal cation at the time of labeling of sample DNA, simply by increasing the salt concentration during hybridization It was expected that the stability of the double-stranded DNA formed by the hybridization of the capture probe and the sample DNA was increased, that is, simply due to an increase in Tm. Therefore, in order to evaluate the duplex stability of double-stranded DNA under cation addition conditions, Tm of double-stranded DNA under various cation concentrations was measured.
  • Tm melting temperature
  • Tm measurement solution was prepared by adding 1 M magnesium chloride hexahydrate aqueous solution to 500 ⁇ l of 100 mM MES so that final concentrations of magnesium ions were 0, 10, 20, 50, 100, 200, 300, and 500 mM, 100 mM MES itself, 5 mM sodium chloride was added to 500 ⁇ l of 100 mM MES, and the final concentration of sodium ions was adjusted to 500 and 1000 mM was prepared.
  • 1 mM oligo 1 and oligo 2 (the sequences of oligo 1 and oligo 2 are complementary) listed in Table 3 were added so that the final concentration was 2 ⁇ M. Heavy chain DNA was formed.
  • Tm measurement of double-stranded DNA in the measurement solution was performed with a Tm analysis system (manufactured by Shimadzu Corporation, TMSPC-8) and an ultraviolet-visible near-infrared spectrophotometer (manufactured by Shimadzu Corporation, UV-1650PC).
  • Analytical software manufactured by Shimadzu Corporation was used to measure the data obtained using an 8-span micro multicell (optical path length: 10 mm) (measurement temperature range is 20 to 95 ° C, heating rate is 1.0 ° C / min). , Lab Solution).
  • Table 4 shows the results of Tm measurement under various cation concentrations. From this result, Tm was increased by adding magnesium ion as compared with the case where magnesium ion was not added, but Tm hardly changed when the concentration of magnesium ion was 10 mM or more. It was also found that when 500 mM and 1000 mM sodium ions were added, the Tm was the same as when 10 mM or more magnesium ions were added. That is, it has been clarified that the addition of a divalent metal cation increases the Tm value of the double-stranded DNA to some extent, but the increase in the Tm value does not contribute to the improvement of the detection signal.
  • Example 2 Calcium ions, manganese ions, or zinc ions were added as divalent metal cations to be added at the time of sample DNA labeling.
  • phosphor-containing buffer 50 ng / ⁇ l SAPE (streptavidin phycoerythrin, Prozyme)
  • Table 5 shows the detection results. Similarly to the magnesium ion in Example 1, even when calcium ion or manganese ion was added, the detection signal was improved as compared with the case where no divalent metal cation was added (Comparative Example 1). In addition, even when the sodium ion concentration shown in Reference Example 1 was 500 or 1000 mM, significant signal improvement was shown. The detection signal (noise) of the spot where the capture probe was not immobilized was 230 to 270.
  • Example 3 the variation in detection signal by adding a divalent metal cation was verified.
  • Magnesium ions were added as a divalent metal cation to be added at the time of sample DNA labeling.
  • 1M magnesium chloride hexahydrate is used as a fluorescent substance-containing buffer for labeling sample DNA (50 ng / ⁇ l SAPE (streptavidin phycoerythrin, Prozyme), 100 mM MES (2-morpholinoethanesulfonic acid sodium salt), 0 .05 wt% Tween 20 (trade name), 2 mg / ml BSA (bovine serum albumin)) was adjusted so that the final concentration of magnesium ions was 100 mM to obtain a labeling solution.
  • SAPE streptavidin phycoerythrin, Prozyme
  • MES 2-morpholinoethanesulfonic acid sodium salt
  • 0 .05 wt% Tween 20 trade name
  • the sodium ion concentration derived from MES was 74 mM. These labeling solutions were dropped on the DNA chip and incubated at 35 ° C. for 5 minutes. The plate was washed with a washing solution (6 ⁇ SSPE buffer, 0.01 wt% Tween 20 (trade name)) heated to 30 ° C. for 5 minutes and then dried using a spin dryer (Wakken). The labeled DNA chip detected a fluorescent signal using a DNA chip scanner (Toray Industries, Inc.). The scanner was set to 100% laser output and 70% photomultiplier voltage. Table 6 shows the index CV value of the variation of the detection signal in the DNA chip. The CV value was calculated by (standard deviation of 4 spots) / (signal average value of 4 spots) ⁇ 100.
  • Comparative Example 3 Sample DNA was hybridized and labeled in the same manner as in Comparative Example 1.
  • Table 6 shows the index CV value of the variation of the detection signal in the DNA chip. The calculation of the CV value was performed in the same manner as in Example 3.
  • Reference example 3 A predetermined amount of sodium chloride was added to a phosphor-containing buffer (50 ng / ⁇ l SAPE (Streptavidin Phycoerythrin, Prozyme), 100 mM MES (2-morpholinoethanesulfonic acid sodium salt), 0.05 wt% Tween 20 (trade name) A solution added to 2 mg / ml BSA (bovine serum albumin)) was prepared. At this time, the final concentration of sodium ions was adjusted to 1000 mM to obtain a labeling solution. These labeling solutions were dropped on the DNA chip and incubated at 35 ° C. for 5 minutes.
  • SAPE Streptavidin Phycoerythrin, Prozyme
  • MES 2-morpholinoethanesulfonic acid sodium salt
  • Tween 20 trade name
  • Example 1 Fluorescence signal was detected.
  • Table 6 shows the index CV value of the variation of the detection signal in the DNA chip. The calculation of the CV value was performed in the same manner as in Example 3.
  • Table 6 shows that the CV value is remarkably improved when 100 mM of magnesium is added and when magnesium is not added or when 1000 mM of sodium is added. That is, it was shown that the variation between spots was improved.
  • Example 4 and Comparative Example 4 In this example, whether or not the detection sensitivity is improved by adding magnesium chloride to the detection reagent 1 for labeling the DNA / RNA duplex, in which the target nucleic acid is hybridized to the capture probe not fixed to the support, is verified. went.
  • the effect of the present invention was verified using Hybrid Capture 2 (trade name, Qiagen), which detects HPV (human papillomavirus) by forming a DNA / RNA duplex.
  • Hybrid Capture 2 (trade name, Qiagen)
  • complementary RNA is hybridized to HPV DNA, and then captured (captured) on a substrate using an antibody that recognizes a DNA / RNA duplex.
  • Hybrid Capture 2 (trade name) was performed according to the attached manual.
  • pHPV16 in which genomic DNA of human papillomavirus was cloned, was purchased from the Human Science Research Resource Bank as the specimen DNA. pHPV16 had a total length of 16,600 base pairs. 25 ⁇ l of sample extraction reagent was added to the sample solution adjusted to contain 1 amol of pHPV16 and the sample solution adjusted to contain 0.01 amol. After stirring with a vortex mixer, the mixture was reacted for 45 minutes in a water bath set at 65 ° C.
  • Hybrid capture product name 100 ⁇ l of the hybridization reaction solution was transferred to the well of the capture plate and reacted by shaking for 60 minutes at 25 ° C. using a rotary shaker (1,100 rpm). After the reaction, the supernatant was removed.
  • Detection reaction 75 ⁇ l of detection reagent 1 (alkaline phosphatase-labeled anti-DNA / RNA complex mouse monoclonal antibody) was dispensed and reacted at 25 ° C. for 30 minutes. At this time, detection reagent 1 was prepared with magnesium chloride added to a final concentration of 100 mM (with Mg) and not added (without Mg), and each was used for the reaction.
  • detection reagent 1 alkaline phosphatase-labeled anti-DNA / RNA complex mouse monoclonal antibody
  • detection reagent 2 sodium 2-chloro-5- (4-methoxyspiro ⁇ 1,2-dioxethane-3,2 '-(5'-chloro) tricycle [3.3.11] decan ⁇ - 4-yl) -1-phenyl phosphatase solution
  • detection reagent 2 sodium 2-chloro-5- (4-methoxyspiro ⁇ 1,2-dioxethane-3,2 '-(5'-chloro) tricycle [3.3.11] decan ⁇ - 4-yl) -1-phenyl phosphatase solution
  • the present invention can be used for nucleic acid detection such as genetic diagnosis, identification of pathogenic bacteria, or detection of single nucleotide polymorphisms.

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Abstract

要約　後染め法での標識化工程において捕捉プローブにハイブリダイズした標的核酸の、支持体からの脱離を抑制し、ナトリウムイオンを用いる方法よりも低濃度でかつ同等以上の感度で標的核酸を検出することが可能な核酸の検出方法が開示されている。標的核酸の検出方法は、（１）捕捉プローブと標的核酸をハイブリダイズさせて二重鎖核酸を形成する工程と、形成された二重鎖核酸を、標識体および濃度１０ｍＭ以上の二価の金属カチオンを含む溶液と接触させて、該二重鎖核酸に該標識体を導入する工程と、前記二重鎖核酸に導入された前記標識体を検出する工程とを含む。

Description

核酸の検出方法および核酸検出キット
　本発明は、捕捉プローブと核酸のハイブリダイゼーションを利用した核酸の検出方法に関する。
　各種生物の遺伝情報解析の研究が始められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの生体高分子の機能については、様々な方法で調べることができる。主なものとしては、核酸についてはノーザンブロッティング、あるいはサザンブロッティングのような、各種の核酸／核酸間の相補性を利用して各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。蛋白質については、ウエスタンブロッティングに代表されるような、タンパク質－タンパク質間の反応を利用しタンパク質の機能および発現について調べることができる。
　特に、遺伝子診断や病原菌の特定、あるいは一塩基多型の検出等、調べたい核酸(標的核酸)を検出する目的では、核酸からなる捕捉プローブが用いられる。近年、多数の捕捉プローブを支持体に固定したＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイを用いて、複数種の標的核酸の同時検出に使用されている。具体的には、支持体に固定化された捕捉プローブと標的核酸とを接触させ、捕捉プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションの有無による相補性を調べることにより標的核酸の配列を調べることができる。標的核酸のハイブリダイゼーションは、例えば、標的核酸に標識体を導入し、捕捉プローブとの接触後に、その標識体のシグナルを検出する方法が一般的に用いられている。
　標的核酸への標識体の導入方法として、捕捉プローブとハイブリダイズさせる前に導入する方法と、ハイブリダイゼーション後に導入する方法がある。この中で、後者は後染め法と言われ、ハイブリダイズした標的核酸と標識体を接触させて標識体を導入する方法で、ハイブリダイゼーション後に標識体を結合させるため、比較的大きなサイズの標識体を用いることができ、また、検出シグナル増幅のため標識化工程を繰り返し行うことができる（特許文献１、２）。そして、後染め法の標識化工程では、５００～１０００ｍＭ程度の高濃度のナトリウムイオンなどの一価の金属カチオンを含有する標識液を使用することが知られている。
　一方で、二価の金属カチオンは各種核酸分解酵素を活性化する物質であることが知られているため、ハイブリダイゼーションを利用する核酸の検出方法の際に積極的に使用することは忌避されており、後染め法の標識化工程においても二価の金属カチオンを使用する技術思想は知られていない。
特開２０１１－１８８８３７号公報 特開２００３－５２３８３号公報
　後染め法による標的核酸の標識化では、標的核酸に導入されなかった標識体を洗浄・除去する必要があるが、本発明者が従来の後染め法による支持体に固定化した捕捉プローブにハイブリダイズした標的核酸の標識化について検証した結果、標的核酸への標識体を導入の際または標的核酸に導入されなかった標識体を洗浄・除去する際に捕捉プローブにハイブリダイズした標的核酸が剥がれ落ち、その結果、検出シグナルが低減するという問題点が見いだされた。
　また、本発明者の検討の結果、従来の標識液に含まれる５００～１０００ｍＭ程度の高濃度ナトリウムイオンによってある程度の標的核酸の剥がれ落ちを抑制することができることが見いだされたが、試薬量の削減や検出感度の向上の観点からナトリウムイオンよりも低濃度で同等以上の標的核酸の剥がれ落ちを抑制できるような物質を見いだすことが課題となった。
　すなわち本発明の目的は、ナトリウムイオンの他に後染め法での標識化工程において捕捉プローブにハイブリダイズした標的核酸の、支持体からの脱離を抑制するような物質を見いだし、ナトリウムイオンよりも低濃度でかつ同等以上の感度で標的核酸を検出することが可能な核酸の検出方法を提供することである。
　本発明者は鋭意研究の結果、捕捉プローブにハイブリダイズした標的核酸の標識化工程において、核酸のハイブリダイゼーション工程において忌避されていた二価の金属カチオンを含む溶液を用いることによって、標的核酸に導入されなかった標識体の洗浄・除去の際の標的核酸の脱離を抑制することができ、その結果、ナトリウムイオンを用いる場合と比較して、検出シグナルを同等以上にすることができることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（１３）で構成される。
（１）捕捉プローブと標的核酸をハイブリダイズさせて二重鎖核酸を形成する工程と、
　形成された二重鎖核酸を、標識体および濃度１０ｍＭ以上の二価の金属カチオンを含む溶液と接触させて、該二重鎖核酸に該標識体を導入する工程と、
　前記二重鎖核酸に導入された前記標識体を検出する工程とを含む、標的核酸の検出方法。
（２）前記捕捉プローブが支持体に固定化されている、(１)に記載の方法。
（３）前記二価の金属カチオンがマグネシウムイオン、亜鉛イオン、マンガンイオンおよびカルシウムイオンからなる群から選択される少なくとも１種類である、（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記溶液中の二価の金属カチオン濃度が５０ｍＭ以上である、（１）～（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）前記標識体が蛍光体である、（１）～（４）のいずれか１項に記載の方法。
（６）前記標的核酸への前記標識体の導入が、アビジン－ビオチン相互作用を利用して行われる、（１）～（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）前記標的核酸がビオチン化されており、前記標識体の導入は、標識アビジン又は標識ストレプトアビジンと前記標的核酸上のビオチンとを相互作用させることにより行われる（６）記載の方法。
（８）前記標的核酸への標識体の導入が、前記ハイブリダイズした二重鎖核酸と抗原抗体反応する標識された抗体又はその抗原結合性断片を、前記二重鎖核酸と抗原抗体反応させることにより行われる（１）～（５）のいずれか１項に記載の方法。
（９）前記捕捉プローブと、前記標的核酸とをハイブリダイズさせる工程においては、前記捕捉プローブは支持体に固定されていない遊離の状態にあり、前記捕捉プローブと前記標的核酸とがハイブリダイズした二重鎖核酸を支持体に固定化する、（１）、（３）～（７）のいずれか１項に記載の方法。
（１０）前記二重鎖核酸の前記支持体への固定化は、該二重鎖核酸と抗原抗体反応する、支持体上に固定化された抗体又はその抗原結合性断片と前記二重鎖核酸とを抗原抗体反応させることにより行われる（９）記載の方法。
（１１）捕捉プローブおよび濃度１０ｍＭ以上の二価の金属カチオンを含む試薬を含む、核酸検出キット。
（１２）捕捉プローブを固定した支持体および濃度１０ｍＭ以上の二価の金属カチオンを含む試薬を含む、核酸検出キット。
（１３）二価の金属カチオンを含む前記試薬が、該二価の金属カチオンと標識体とを含む（１１）又は（１２）記載のキット。
　本発明によれば、捕捉プローブにハイブリダイズした標的核酸を高感度かつ再現性良く検出することが可能となる。
　本発明の検出方法に供せられる標的核酸としては、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、これらの標的核酸を含む検体としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、ぬぐい液、各種組織液等の体液や、各種組織、パラフィン包埋検体（ＦＦＰＥ）およびその切片、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、被検物質となる標的核酸は、血液や細胞から常法により抽出した核酸であってもよく、検体から抽出したＤＮＡやＲＮＡなどを用いることができる。ＤＮＡとしては、標識化ＤＮＡ，ウイルスＤＮＡ，細菌、カビ等のＤＮＡ、ＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡ，それらの一部である断片などを用いることができるがこれらに限定されるものではない。ＲＮＡとしては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ｓｍａｌｌ　ＲＮＡやそれらの一部である断片などを用いることができるがこれらに限定されるものではない。また、化学的に合成したＤＮＡ、あるいはＲＮＡ等も標的核酸として用いることができる。
　支持体はスライドガラスや樹脂基板、メンブレン、ビーズなどを用いることができる。支持体の材質は、特に限定されないが、ガラス、セラミック、シリコンなどの無機材料、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリコーンゴム等のポリマーなどを挙げることができる。
　捕捉プローブとは、被験試料に含まれる標的核酸と直接的に、選択的に結合し得る物質を意味する。本発明の標的核酸を検出する方法においては、具体的にはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ‐Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）などの核酸誘導体を用いることができる。ここで誘導体とは、核酸の場合、蛍光体などによる標識化誘導体、修飾ヌクレオチド(例えばハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど)を含む誘導体などの化学修飾誘導体を意味する。
　特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイゼーションして結合するので、本発明でいう捕捉プローブに該当する。本発明に用いる捕捉プローブは、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。捕捉プローブとして、特に好ましいものは、核酸である。この核酸の中でも、オリゴ核酸と呼ばれる、長さが２００塩基までの核酸は、合成機で容易に人工的に合成が可能である。
　支持体に捕捉プローブを固定化する方法としては、支持体上面部で捕捉プローブを合成する方法と、あらかじめ合成しておいた捕捉プローブを支持体上面部へ滴下し固定する方法が知られている。支持体上面部で捕捉プローブを合成する方法としては、Ｒｏｎａｌｄらの方法（米国特許第５７０５６１０号明細書）、Ｍｉｃｈｅｌらの方法（米国特許第６１４２２６６号明細書）、Ｆｒａｎｃｅｓｃｏらの方法（米国特許第７０３７６５９号明細書）がある。これらの方法では捕捉プローブ合成反応時に有機溶媒を用いるため、担体は有機溶媒に耐性のある材質であることが望ましく、例えば、特表平１０－５０３８４１号公報に記載の方法を用いて作製した凹凸構造を有したガラス支持体を用いることができる。特にＦｒａｎｃｅｓｃｏらの方法においては支持体の裏面から光を照射し、捕捉プローブの合成を制御するため、支持体は透光性を有する材質であることが好ましい。捕捉プローブを支持体上面部へ滴下し固定する方法としては、廣田らの方法（特許第３９２２４５４号明細書）やガラスキャピラリーを用いることができる。ガラスキャピラリーの一例としては、自作したガラスキャピラリーやマイクロピペット（株式会社マイクロサポート製、ＭＰ－００５）などの市販製品を用いることができるが、これらの方法に限定されるものではない。
　本発明は、捕捉プローブと標的核酸をハイブリダイズさせることによる核酸の検出方法において、捕捉プローブにハイブリダイズした核酸を、標識体および二価の金属カチオンを含む溶液と接触させることによって、該ハイブリダイズした核酸に標識体を導入することを特徴とする。以下、ハイブリダイゼーション工程と標識体の導入工程について説明する。
　捕捉プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションは、それ自体周知の方法により行うことができる。捕捉プローブと標的核酸のハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プローブの鎖長、プローブのヌクレオチド配列のＧＣ含量及びハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（１９９８）　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（２ｎｄ　ｅｄ．），Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋに記載された条件などを用いることができる。ストリンジェントな温度条件は、約３０℃以上であり、通常、１０℃～７０℃程度である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））の濃度、及びキャリアＤＮＡの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。当業者は、所望する標的核酸の検出のために用意した捕捉プローブとしての機能を得るための条件を適宜決定すればよい。
　捕捉プローブと標的核酸のハイブリダイゼーションは、捕捉プローブを支持体に固定化した状態で行っても良いし、また、ハイブリダイゼーション後に支持体に固定化しても良い。ハイブリダイゼーション後の捕捉プローブの固定化方法として、例えば、標的核酸と形成した二重鎖に特異的に結合する（抗原抗体反応する）、固相化した抗体又はその抗原結合性断片(Fab断片やF(ab')2断片等を用いて行うことができる（下記実施例参照）。
　捕捉プローブとハイブリダイズした標的核酸への標識体の導入方法は、それ自体周知の方法により行うことができ、例えば、標的核酸に標識体と二価の金属カチオンを含む溶液を接触させた上で化学反応や酵素反応や核酸ハイブリダイゼーションなどで標識体を導入する方法や、標的核酸に反応性官能基を化学反応や酵素反応や核酸ハイブリダイゼーションなどで導入し、その官能基に標識体と二価の金属カチオンを含む溶液を接触させた上で標識体の官能基と反応させて導入する方法が挙げられる。例えば、標的核酸に酵素反応でアミノ基を有する核酸を導入し、そのアミノ基と反応するスクシンイミド基を有する標識体と反応させることで、標識体を導入することが可能となる。また、同様の手法でビオチンを、標的核酸を含む二重鎖核酸に導入し、標識したアビジン又はストレプトアビジンと接触させることにより、アビジン－ビオチン反応を介して標識体の導入が可能となる。また、標的核酸とプローブ核酸のハイブリダイゼーションにより形成した二重鎖部分に挿入するインターカレーター型の標識体を接触させることにより、標識体を導入することが可能である。さらには、二重鎖と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片(Fab断片やF(ab')2断片等を用いて行うことができる（下記実施例参照）。
　本発明において使用できる標識体としては、有機蛍光色素、りん光色素、量子ドット、蛍光タンパクなどの蛍光体や放射性同位体、電子の授受が可能な酸化還元種、また、アルカリフォスファターゼやホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素が結合したものを用いることができる。また、これら標識体の中で、検出の感度面や簡便性から蛍光体が好ましく用いることができる。
　有機蛍光色素としては、シアニン（シアニン２）、アミノメチルクマリン、フルオロセイン、インドカルボシアニン（シアニン３）、シアニン３．５、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、インドカルボシアニン（シアニン５）、シアニン５．５、シアニン７、オイスター、ＢＯＤＩＰＹ系色素などが挙げられる。また、インターカレーター型の蛍光色素のとしては、エチジウムブロマイドやアクリジンオレンジなどが挙げられ、蛍光性タンパク質としては、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）などの公知の蛍光体が挙げられる。
　また、蛍光体として発光性を有する半導体微粒子を用いてもよい。このような半導体微粒子としては、例えばセレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）、硫化カドミウム（ＣｄＳ）、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）、インジウムガリウムリン（ＩｎＧａＰ）、カルコパイライト系微粒子、シリコン（Si）、などが挙げられる。蛍光シグナルの検出は、蛍光顕微鏡や蛍光スキャナーなどにより行うことができる。
　後述の通り、二重鎖核酸への標識体導入後は、二重鎖核酸に導入されなかった標識体を洗浄・除去する必要があり、標識体の洗浄・除去の際に標識体が導入された二重鎖核酸からの標的核酸の脱離を抑制することが検出感度の向上の観点で重要であるが、本発明では、標識体と二価の金属カチオンを含む溶液を用いて標識体を導入することにより、標識体の洗浄・除去による標的核酸の脱離を顕著に抑制することが可能となる。
　二価の金属カチオンとは、溶液中で２個の電子を放出して二価の陽イオンになり得る元素・錯体を意味し、ベリリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン、ラジウムイオンなどのアルカリ土類金属イオンやマンガンイオン、コバルトイオン、亜鉛イオンなどの遷移金属からなる単原子イオン、また、チオシアノ鉄（ＩＩＩ）イオン、テトラアンミン亜鉛（ＩＩ）イオン、ヘキサアンミンニッケル（ＩＩ）イオンなどの錯体イオンが挙げられる。中でも水への溶解性や環境負荷を考慮すると、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、マンガンイオンおよびカルシウムイオンからなる群から選択される少なくとも１種類以上が好ましく、二重鎖核酸への結合安定性を考慮するとマグネシウムイオン、マンガンイオンが特に好ましい。
　前記溶液中の二価の金属カチオン濃度は１０ｍＭ以上であるが、核酸の検出シグナル強度の観点から５０ｍＭ以上が好ましく、１００ｍＭ以上がより好ましい。また、試薬量削減ならびに溶液中での金属カチオンの析出によるノイズ増加の観点から、５００ｍＭ未満とすることが好ましい。
　次に、二重鎖核酸に導入されなかった標識体を洗浄除去することが好ましい。この洗浄除去工程自体はそれ自体周知の方法により行うことができる。例えば、界面活性剤（好ましくはTween（商品名）シリーズ等の非イオン性界面活性剤）を含む緩衝液（例えばSSC等のクエン酸緩衝液）を洗浄液として用い、ハイブリダイゼーションの温度よりも通常３℃～１０℃程度低温で、１分間～１０分間洗浄を行うことができる。
　次に、二重鎖核酸に導入された標識体を検出する。検出工程自体は周知の方法により行うことができ、二重鎖核酸に導入された標識体のシグナルを検出することにより可能となる。検出されたシグナルは、周辺ノイズと比較される。具体的には、捕捉プローブが固定されている位置から得られたシグナル値と、それ以外の位置から得られたシグナル値を比較し、前者の数値が上回っている場合に標的核酸が検出されたとする。シグナル値の測定は、各標識について周知の方法により行うことができ、そのための装置も種々市販されているので、市販の測定装置を用いて容易に行うことができる。例えば、標識が蛍光標識である場合には、市販のＤＮＡチップスキャナ等を用いて容易に行うことができる。なお、シグナル値を測定することにより、標的核酸の定量も可能になる場合があるが、標的核酸の定量は、必然的に標的核酸の検出を伴うので、標的核酸を定量する場合も、本発明の検出方法に包含される。
　次に、本発明の核酸の検出キットの好適な実施形態について説明する。本発明の核酸の検出キットは、少なくとも捕捉プローブおよび二価の金属カチオンを含む試薬を備えている。二価の金属カチオンを含む前記試薬は、好ましくは、該二価の金属カチオンと標識体とを含む試薬である。また、捕捉プローブは支持体に固定化されていても良い。本発明の検出キットに含まれる捕捉プローブを固定化した支持体とは、前記捕捉プローブを前記支持体に固定化したものである。また、本発明のキットに含まれる二価の金属カチオンを含む試薬は乾燥状態であっても溶液状態であってもよく、乾燥状態である場合はそれを溶解する溶媒が含まれうる。その他、本発明の検出キットに含まれうる試薬としては、前記標識体を含む試薬、ｐＨ調整用試薬、界面活性化剤、標識体の支持体への吸着防止のためのタンパク質や核酸を含む試薬などが挙げられ、これらは乾燥状態であっても溶液状態であってもよく、それぞれ独立した試薬であっても、適宜混合された試薬であってもよく、乾燥状態である場合はそれらを溶解する溶媒が含まれうる。
　本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。但し、本発明はこれら実施例により技術的範囲が限定されるものではない。
実施例１
(1)　ＤＮＡチップの作製
　捕捉プローブは５’末端にアミノ基修飾したオリゴＤＮＡをオペロン社にて委託合成した。表１に捕捉プローブの塩基配列を示す。この捕捉プローブを東レ株式会社製の“３Ｄ－Ｇｅｎｅ”基板（２５６柱基板）に固定して、評価用ＤＮＡチップとして用いた。
(2)　標的核酸の調製
　標的核酸として、捕捉プローブと相補的な配列を有し、５’末端にビオチンを導入した３０塩基のオリゴＤＮＡ（表１）をオペロン社にて委託合成した。表１に標的核酸の塩基配列を示す。当該オリゴＤＮＡを２００ｆｍｏｌ／ｌとなるまで１×ハイブリダイゼーション溶液（後述）で希釈して検体ＤＮＡとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
(3)　ハイブリダイゼーション
　検体ＤＮＡ５μｌに１×ハイブリダイゼーション溶液（１重量％　ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ、１重量％　ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、５０ｎｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡの溶液、５重量％　デキストラン硫酸ナトリウム、３０％　フォルムアミド）を３５μｌ加え、ハイブリダイゼーション溶液とした。全量をＤＮＡチップに注入し、３２℃で加温したインキュベータにセットした。ハイブリダイゼーションは、“３Ｄ－ｇｅｎｅ”の標準プロトコールに従い、２５０ｒｐｍで旋回撹拌をしながら、３２℃で２時間行った。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡチップを３０℃に加温した洗浄液（０．５×ＳＳＣ、０．１重量％　ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム））で５分間洗浄したのち、スピンドライヤー（和研薬）を用いて乾燥した。
　検体ＤＮＡ標識化の際に添加する二価の金属カチオンとして、マグネシウムイオンを添加した。１Ｍ　塩化マグネシウム六水和物を検体ＤＮＡ標識化のための蛍光体含有緩衝液（５０ｎｇ／μｌ　ＳＡＰＥ（ストレプトアビジンフィコエリスリン、プロザイム社）、１００ｍＭ　ＭＥＳ（２－モルホリノエタンスルホン酸ナトリウム塩）、０．０５重量％　Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）、２ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン））に添加して、マグネシウムイオンの終濃度がそれぞれ１０、２０、５０、１００、２００、３００、５００ｍＭとなるように調整し、標識液とした。なお、ＭＥＳ由来のナトリウムイオン濃度は７４ｍＭであった。これら標識液をＤＮＡチップ上に滴下し、３５℃で５分間インキュベーションした。３０℃に加温した洗浄液（６×ＳＳＰＥ緩衝液、０．０１重量％　Ｔｗｅｅｎ２０（商品名））で５分間洗浄したのち、スピンドライヤー（和研薬）を用いて乾燥した。標識済みのＤＮＡチップは、ＤＮＡチップスキャナー（東レ株式会社製）を用いて蛍光シグナルを検出した。スキャナーの設定は、レーザー出力１００％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を７０％にした。
比較例１
　検体ＤＮＡ標識化の際に二価の金属カチオンを添加せず、検体ＤＮＡ標識化のための蛍光体含有緩衝液（５０ｎｇ／μｌ　ＳＡＰＥ（ストレプトアビジンフィコエリスリン、プロザイム社）、１００ｍＭ　ＭＥＳ（２－モルホリノエタンスルホン酸ナトリウム塩）、０．０５重量％　Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）、２ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン））をそのまま標識液とした。なお、ＭＥＳ由来のナトリウムイオン濃度は７４ｍＭであった。この標識液をＤＮＡチップ上に滴下し、３５℃で５分間インキュベーションした。３０℃に加温した洗浄液（６×ＳＳＰＥ、０．０１重量％　Ｔｗｅｅｎ２０（商品名））で５分間洗浄したのち、スピンドライヤー（和研薬）を用いて乾燥し、実施例１と同様の条件で蛍光シグナルを検出した。
参考例１
　所定量の塩化ナトリウムを蛍光体含有緩衝液（５０ｎｇ／μｌ　ＳＡＰＥ（ストレプトアビジンフィコエリスリン、プロザイム社）、１００ｍＭ　ＭＥＳ（２－モルホリノエタンスルホン酸ナトリウム塩）、０．０５重量％　Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）、２ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン））に添加した溶液を用意した。この際、ナトリウムイオンの終濃度が５００または１０００ｍＭとなるように調整し、標識液とした。これら標識液をＤＮＡチップ上に滴下し、３５℃で５分間インキュベーションした。３０℃に加温した洗浄液（６×ＳＳＰＥ、０．０１重量％　Ｔｗｅｅｎ２０（商品名））で５分間洗浄したのち、スピンドライヤー（和研薬）を用いて乾燥し、実施例１と同様の条件で蛍光シグナルを検出した。
　実施例１、比較例１および参考例１の結果を表２に示す。実施例１と比較例１の結果から、検体ＤＮＡの標識化試薬にマグネシウムイオンを添加することにより検出シグナルが上昇した。また、実施例１と参考例１の結果から、検体ＤＮＡの標識化試薬にマグネシウムイオンを添加した場合はナトリウムイオンを添加した場合よりも低濃度で同等以上の検出シグナルが観察され、特に、マグネシウムイオンの濃度が５０ｍＭ以上で大幅に検出シグナルが改善することが分かった。なお、捕捉プローブが固定化されていないスポットの検出シグナル（ノイズ）は２３０～２７０であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
参考例２
(1)　二重鎖ＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）測定
　検体ＤＮＡの標識化の際に二価の金属カチオンを添加することによって検出シグナルが改善するメカニズムとして、単にハイブリダイゼーション時の塩濃度の上昇によって捕捉プローブと検体ＤＮＡのハイブリダイゼーションで形成される二重鎖ＤＮＡの安定性が増す、すなわち、単にＴｍが上昇することによるものである可能性が予想された。そこで、カチオン添加条件下での二重鎖ＤＮＡの二重鎖安定性を評価するため、様々なカチオン濃度下での二重鎖ＤＮＡのＴｍの測定を行った。
　Ｔｍ測定溶液は１００ｍＭのＭＥＳ５００μｌに１Ｍ塩化マグネシウム六水和物水溶液を添加してマグネシウムイオンの終濃度がそれぞれ０、１０、２０、５０、１００、２００、３００、５００ｍＭとなるように調整したもの、１００ｍＭのＭＥＳそのもの、１００ｍＭのＭＥＳ５００μｌに５Ｍの塩化ナトリウムを添加し、ナトリウムイオンの終濃度が５００、１０００ｍＭとなるように調整したものを準備した。それぞれのＴｍ測定溶液に、表３に記載の１ｍＭのオリゴ１とオリゴ２（オリゴ１とオリゴ２の配列は相補的である。）の合成ＤＮＡを終濃度が２μＭになるように添加して二重鎖ＤＮＡを形成させた。測定溶液中の二重鎖ＤＮＡのＴｍ測定は、Ｔｍ解析システム（株式会社島津製作所製、ＴＭＳＰＣ－８）および紫外可視近赤外分光光度計（株式会社島津製作所製、ＵＶ－１６５０ＰＣ）により行い、８連マイクロマルチセル（光路長１０ｍｍ）を用いて測定（測定温度範囲は２０～９５℃、昇温速度は１．０℃／ｍｉｎ。）して得られたデータを解析ソフト（株式会社島津製作所製、Ｌａｂ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて積分法にて決定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　様々なカチオン濃度下でのＴｍ測定の結果を表４に示す。この結果からマグネシウムイオンを添加していない場合と比較して、マグネシウムイオンを添加することによりTmが上昇していたが、マグネシウムイオンの濃度が１０ｍＭ以上で殆どＴｍが変化しておらず、また、ナトリウムイオンを５００ｍＭ、１０００ｍＭを添加した際にも、マグネシウムイオンを１０ｍＭ以上添加した際と同等のＴｍであることも分かった。すなわち、二価の金属カチオンを添加することによって二重鎖ＤＮＡのＴｍ値はある程度上昇するものの、Ｔｍ値の上昇が検出シグナルの改善に寄与するものではないことが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例２
　検体ＤＮＡ標識化の際に添加する二価の金属カチオンとして、カルシウムイオン、マンガンイオンまたは亜鉛イオンを添加した。１Ｍ　塩化カルシウム二水和物、１Ｍ　塩化マンガン水溶液、１Ｍ　塩化亜鉛水溶液を蛍光体含有緩衝液（５０ｎｇ／μｌ　ＳＡＰＥ（ストレプトアビジンフィコエリスリン、プロザイム社）、１００ｍＭ　ＭＥＳ（２－モルホリノエタンスルホン酸ナトリウム塩）、０．０５重量％　Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）、２ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン））に添加して、カルシウムイオン、マンガンイオンの終濃度がそれぞれ１００もしくは５００ｍＭとなるように調整したものを標識液とした。これら標識液をＤＮＡチップ上に滴下し、３５℃で５分間インキュベーションした。３０℃に加温した洗浄液（６×ＳＳＰＥ、０．０１重量％　Ｔｗｅｅｎ２０（商品名））で５分間洗浄したのち、スピンドライヤー（和研薬）を用いて乾燥し、実施例１と同様の条件で蛍光シグナルを検出した。
　検出結果を表５に示す。実施例１でのマグネシウムイオンと同様に、カルシウムイオンまたはマンガンイオンを添加した場合でも、二価の金属カチオンを添加しない場合（比較例１）と比較して検出シグナルが改善した。また、参考例１で示したナトリウムイオンの濃度が５００または１０００ｍＭの場合と比較しても顕著なシグナル改善が示された。なお、捕捉プローブが固定化されていないスポットの検出シグナル（ノイズ）は２３０～２７０であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例３
　本実施例では二価金属カチオンを添加することによる検出シグナルのばらつきの検証を行った。検体ＤＮＡ標識化の際に添加する二価の金属カチオンとして、マグネシウムイオンを添加した。１Ｍ　塩化マグネシウム六水和物を検体ＤＮＡ標識化のための蛍光体含有緩衝液（５０ｎｇ／μｌ　ＳＡＰＥ（ストレプトアビジンフィコエリスリン、プロザイム社）、１００ｍＭ　ＭＥＳ（２－モルホリノエタンスルホン酸ナトリウム塩）、０．０５重量％　Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）、２ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン））に添加して、マグネシウムイオンの終濃度が１００ｍＭとなるように調整し、標識液とした。なお、ＭＥＳ由来のナトリウムイオン濃度は７４ｍＭであった。これら標識液をＤＮＡチップ上に滴下し、３５℃で５分間インキュベーションした。３０℃に加温した洗浄液（６×ＳＳＰＥ緩衝液、０．０１重量％　Ｔｗｅｅｎ２０（商品名））で５分間洗浄したのち、スピンドライヤー（和研薬）を用いて乾燥した。標識済みのＤＮＡチップは、ＤＮＡチップスキャナー（東レ株式会社製）を用いて蛍光シグナルを検出した。スキャナーの設定は、レーザー出力１００％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を７０％にした。ＤＮＡチップ内の検出シグナルのばらつきの指標ＣＶ値を表６に示す。なお、ＣＶ値は、（４つのスポットの標準偏差）／（４つスポットのシグナル平均値）×１００で算出した。
比較例３
　比較例１と同様の方法で検体ＤＮＡのハイブリダイゼーションおよび標識化を行った。ＤＮＡチップ内の検出シグナルのばらつきの指標ＣＶ値を表６に示す。ＣＶ値の算出は実施例３と同様の方法で行った。
参考例３
　所定量の塩化ナトリウムを蛍光体含有緩衝液（５０ｎｇ／μｌ　ＳＡＰＥ（ストレプトアビジンフィコエリスリン、プロザイム社）、１００ｍＭ　ＭＥＳ（２－モルホリノエタンスルホン酸ナトリウム塩）、０．０５重量％　Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）、２ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン））に添加した溶液を用意した。この際、ナトリウムイオンの終濃度が１０００ｍＭとなるように調整し、標識液とした。これら標識液をＤＮＡチップ上に滴下し、３５℃で５分間インキュベーションした。３０℃に加温した洗浄液（６×ＳＳＰＥ、０．０１重量％　Ｔｗｅｅｎ２０（商品名））で５分間洗浄したのち、スピンドライヤー（和研薬）を用いて乾燥し、実施例１と同様の条件で蛍光シグナルを検出した。ＤＮＡチップ内の検出シグナルのばらつきの指標ＣＶ値を表６に示す。ＣＶ値の算出は実施例３と同様の方法で行った。
　表６からマグネシウム１００ｍＭ添加した場合、マグネシウムを添加しなかった場合やナトリウム１０００ｍＭ添加と比較して、ＣＶ値が顕著に改善していることが示された。すなわちスポット間のバラツキが改善していることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実施例４、比較例４
　本実施例では、支持体に固定していない捕捉プローブに標的核酸がハイブリダイズした、ＤＮＡ・ＲＮＡ二重鎖を標識する検出試薬１に塩化マグネシウムを添加することで検出感度が向上するか検証を行った。ＤＮＡ・ＲＮＡ二重鎖を形成させることでＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）を検出するハイブリッドキャプチャー２（商品名、キアゲン社）を用いて本発明の効果を検証した。ハイブリッドキャプチャー２（商品名）は、ＨＰＶのＤＮＡに、相補ＲＮＡをハイブリダイズさせた後、ＤＮＡ・ＲＮＡ二重鎖を認識する抗体を用いて、基材上にキャプチャー（捕捉）する。さらに標識ずみＤＮＡ・ＲＮＡ二重鎖を認識する抗体を結合させることで標識し、検出する原理である。標識反応時に塩化マグネシウム溶液を添加することで、検出感度が向上するか検証した。ハイブリッドキャプチャー２（商品名）の反応は、添付マニュアルに従って実施した。
(1)　検体の調製
　検体ＤＮＡとして、ヒトパピローマウイルスのゲノムＤＮＡがクローニングされた組み替えプラスミドｐＨＰＶ１６をヒューマンサイエンス研究資源バンクより購入し用いた。ｐＨＰＶ１６は全長１６，６００塩基対であった。ｐＨＰＶ１６が１ａｍｏｌ含まれるように調整した検体溶液、及び０．０１ａｍｏｌ含まれるように調整した検体溶液に、検体抽出試薬２５μｌを添加した。ボルテックスミキサーで撹拌した後、６５℃に設定したウォーターバスで４５分間反応させた。
(2)　ハイブリダイゼーション
　マニュアルに従って調整したプローブ液２５μｌに、検体７５μｌを添加し、ロータリーシェーカー（１１００ｒｐｍ）で 約3 分間振とう攪拌させた。次に６５℃のハイブリオーブン内で６０分間反応させた。
(3)　ハイブリッドキャプチャー（商品名）
　ハイブリダイゼーション反応溶液１００μｌを、キャプチャープレートのウェルに移し、ロータリーシェーカー（１，１００ｒｐｍ）を用いて２５℃で６０分間振とうし、反応させた。反応後、上清を取り除いた。
検出反応
　検出試薬１（アルカリフォスファターゼ標識抗ＤＮＡ・ＲＮＡ複合体マウスモノクローナル抗体）７５μｌを分注し、２５℃で３０分間反応させた。このとき、検出試薬１に塩化マグネシウムが終濃度１００ｍＭになるように添加したもの（Ｍｇ有り）と添加しなかったもの（Ｍｇなし）を用意し、それぞれ反応に用いた。反応後、洗浄液で洗浄し、検出試薬2（disodium  2-chloro-5-(4-methoxyspiro{1,2-dioxethane-3,2'-(5'-chloro)tricycle[3.3.11]decan}-4-yl)-1-phenyl phosphatase溶液）を添加し、２５℃で１５分間反応させた。反応後、発光量はルミノメーターを用いて測定した。検出結果を表７に示した。
　その結果、マグネシウムを添加した場合、添加しなかった場合に比べて、発光シグナルが向上することが分かった。なお、同時に測定した陰性コントロールの発光シグナルは３７３０であった。以上のように、ハイブリッドキャプチャー２（商品名）の検出反応において、マグネシウムを添加することが、感度向上に有効であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　本発明は、遺伝子診断や病原菌の特定、あるいは一塩基多型の検出等の核酸の検出に利用することができる。

Claims (13)

  1. 　捕捉プローブと標的核酸をハイブリダイズさせて二重鎖核酸を形成する工程と、
    　形成された二重鎖核酸を、標識体および濃度１０ｍＭ以上の二価の金属カチオンを含む溶液と接触させて、該二重鎖核酸に該標識体を導入する工程と、
    　前記二重鎖核酸に導入された前記標識体を検出する工程とを含む、標的核酸の検出方法。
  2. 　前記捕捉プローブが支持体に固定化されている、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記二価の金属カチオンがマグネシウムイオン、亜鉛イオン、マンガンイオンおよびカルシウムイオンからなる群から選択される少なくとも１種類である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記溶液中の二価の金属カチオン濃度が５０ｍＭ以上である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記標識体が蛍光体である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記標的核酸への前記標識体の導入が、アビジン－ビオチン相互作用を利用して行われる、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記標的核酸がビオチン化されており、前記標識体の導入は、標識アビジン又は標識ストレプトアビジンと前記標的核酸上のビオチンとを相互作用させることにより行われる請求項６記載の方法。
  8. 　前記標的核酸への標識体の導入が、前記ハイブリダイズした二重鎖核酸と抗原抗体反応する標識された抗体又はその抗原結合性断片を、前記二重鎖核酸と抗原抗体反応させることにより行われる請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記捕捉プローブと、前記標的核酸とをハイブリダイズさせる工程においては、前記捕捉プローブは支持体に固定されていない遊離の状態にあり、前記捕捉プローブと前記標的核酸とがハイブリダイズした二重鎖核酸を支持体に固定化する、請求項１、３～７のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記二重鎖核酸の前記支持体への固定化は、該二重鎖核酸と抗原抗体反応する、支持体上に固定化された抗体又はその抗原結合性断片と前記二重鎖核酸とを抗原抗体反応させることにより行われる請求項９記載の方法。
  11. 　捕捉プローブおよび濃度１０ｍＭ以上の二価の金属カチオンを含む試薬を含む、核酸検出キット。
  12. 　捕捉プローブを固定した支持体および濃度１０ｍＭ以上の二価の金属カチオンを含む試薬を含む、核酸検出キット。
  13. 　二価の金属カチオンを含む前記試薬が、該二価の金属カチオンと標識体とを含む請求項１１又は１２記載のキット。
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