JP2003052383A - ゲノム分析方法 - Google Patents

ゲノム分析方法

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JP2003052383A JP2002099196A JP2002099196A JP2003052383A JP 2003052383 A JP2003052383 A JP 2003052383A JP 2002099196 A JP2002099196 A JP 2002099196A JP 2002099196 A JP2002099196 A JP 2002099196A JP 2003052383 A JP2003052383 A JP 2003052383A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】ヒトゲノム分析方法の提供。 【解決手段】本発明は、ヒトゲノムにおいて生じる変異
を同定するための方法、ならびにこれらの変異を疾患お
よび薬物応答の遺伝的根拠に関連付ける方法に関する。
特に本発明は、個々のＳＮＰを同定し、ＳＮＰハプロタ
イプブロックおよびパターンを決定し、そして更に、該
ＳＮＰハプロタイプブロックおよびパターンを用いて疾
患および薬物応答の遺伝的根拠を詳細に分析することに
関する。本発明の方法は、全ゲノムの分析に有用であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】(関連出願に対する相互参照)
本発明は、２００１年３月３０日に出願された米国仮特
許出願番号第６０／２８０，５３０号、２００１年８月
１７日に出願された米国仮特許出願番号第６０／３１
３，２６４号、２００１年１０月５日に出願された米国
仮特許出願番号第６０／３２７，００６号（全て「ヒト
ＳＮＰハプロタイプの同定、情報提供ＳＮＰおよびその
使用（Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｈｕｍａｎ ＳＮＰ
Ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ， Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ Ｓ
ＮＰｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ）」と題す
る）、および２００１年１１月２６日に出願された米国
仮特許出願番号第６０／３３２，５５０号（「ゲノム分
析方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ａ
ｎａｌｙｓｉｓ）」と題する）を基に優先権主張を行
う。これら全ての開示内容は本明細書中に参考として特
に組み込まれるものとする。
【０００２】
【従来の技術】ヒト染色体を構成するＤＮＡは、体内の
全てのタンパク質の産生を指揮するインストラクション
を提供する。これらのタンパク質は、生命に不可欠な機
能を発揮する。タンパク質をコードするＤＮＡの配列が
変化すると、これによりコードされるタンパク質に変化
または突然変異が生じて、細胞の正常な機能に影響を及
ぼす。環境は疾患においてしばしば大きな役割を担う
が、個体のＤＮＡにおける変化や突然変異は、感染性疾
患、癌および自己免疫異常を含むほぼ全てのヒト疾患に
直接関係する。さらに、遺伝学（特にヒト遺伝学）の知
識により、多くの疾患は、幾つかの遺伝子もしくは遺伝
子産物の複雑な相互作用から、または１つの遺伝子内で
起こる任意の数の突然変異から生じるということが分か
った。例えば、Ｉ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病は、多数
の遺伝子（各遺伝子は独自の突然変異パターンを有す
る）に関連付けられた。これに対し、嚢胞性線維症は、
１つの遺伝子内における３００を超える様々な突然変異
のいずれかにより引き起こされ得る。
【０００３】さらに、薬物応答（薬理遺伝学の分野）に
関しては、ヒト遺伝学の知識は、個体間の差異の理解の
範囲を限られたものとした。半世紀以上前、有害薬物応
答は、血漿コリンエステラーゼおよびグルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼという２つの薬物代謝酵素にお
けるアミノ酸の変化と関連付けられた。それ以来、入念
な遺伝学的分析により、３５を超える薬物代謝酵素、２
５の薬物標的および５つの薬物トランスポーター（ｄｒ
ｕｇ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）の中の配列多型（変
異）を薬物の効力または安全性の折衷レベルに関連付け
た（ＥｖａｎｓおよびＲｅｌｌｉｎｇ， Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２９６： ４８７−９１（１９９９））。診療所で
は、このような情報は、薬物毒性を防ぐために使用され
ている。例えば、患者は、６−メルカプトプリンまたは
アザチオプリンの代謝を低下させるチオプリンメチルト
ランスフェラーゼ遺伝子の中の遺伝的差異について慣習
的にスクリーニングされる。しかし現在までのところ、
観察された薬物毒性のうちの僅かしか、薬理遺伝学マー
カーのセットによって十分に説明されていない。毒性の
問題よりもより一般的なのは、ある個体に対して安全且
つ／もしくは効力があることが示された薬物が、他の個
体においては十分な治療的効能を持たない、または予期
しがたい副作用を持つことが判明した事例である。
【０００４】ヒトの遺伝子構成における変異の影響を理
解する重要性に加え、他の非ヒト生物（特に病原体）の
遺伝子構成における変異の影響を理解することは、これ
らのヒトへの影響またはヒトとの相互作用を理解する上
で重要である。例えば、病原性細菌またはウイルスによ
る毒性因子の発現は、このような生物に接触したヒトに
おける感染率および感染程度に多大な影響を及ぼす。さ
らに、実験動物（すなわちマウス、ラットなど）の遺伝
子構成の詳細な理解もまた大きな価値がある。例えば、
治療の評価のためのモデル系として使用される動物の遺
伝子構成の変異を理解することは、これらの系を用いて
得たテスト結果およびこれらをヒトに使用した場合の予
測値を理解するために重要である。
【０００５】任意の２人のヒトはその遺伝子構成におい
て９９．９％類似しているので、彼等のゲノムＤＮＡ配
列の大部分は同一である。しかし、個体間ではＤＮＡ配
列に変異がある。例えば、ＤＮＡの多数塩基ストレッチ
の欠失、ＤＮＡストレッチの挿入、および非コード領域
における反復ＤＮＡエレメントの数の変異、ならびに
「一塩基多型（ＳＮＰ）」と呼ばれるゲノム内の１つの
窒素含有塩基位置における変化がある。ヒトＤＮＡ配列
変異は、個体間で観察された差異（疾患への感受性を含
む）の大部分を説明する。
【０００６】大部分のＳＮＰは稀なものではあるが、ヒ
ト間のＤＮＡ配列の違いの大部分を説明する一般的なＳ
ＮＰ（各ＳＮＰの頻度は１０〜５０％）は５３０万個あ
ると推定されている。このようなＳＮＰはヒトゲノム中
に６００塩基対毎に１回存在する（Ｋｒｕｇｌｙａｋお
よびＮｉｃｋｅｒｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅ
ｔ． ２７：２３５（２００２））。物理的に近くに存
在するこのようなＳＮＰのブロックを構成する対立遺伝
子（変異体）はしばしば相関関係を有し、その結果、遺
伝的変異性（ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔ
ｙ）は低下し、限られた数の「ＳＮＰハプロタイプ」
（各々は１つの古来先祖の染色体からの遺伝継承を反映
する：Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎら、Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ．
Ｇｅｎｅｔ．６７：８８１（２０００））を定義す
る。
【０００７】ヒトゲノムにおける局所的ハプロタイプ構
造の複雑性、および個々のハプロタイプが広がっている
距離は、殆ど定義されていない。異なる集団におけるヒ
トゲノムの異なるセグメントを調査する経験主義的な調
査により、局所的ハプロタイプ構造において大きな変異
性があることが分かった。これらの調査は、突然変異、
組換え、選択、個体群の歴史および確率的事象の、ハプ
ロタイプ構造への相互的な寄与が、予測不可能な形で変
化することを示しており、その結果、あるハプロタイプ
はわずか数千塩基（ｋｂ）の長さしかないものとなり、
またあるハプロタイプは１００ｋｂを超える長さのもの
となる（Ａ．Ｇ． Ｃｌａｒｋら、Ａｍ． Ｊ． Ｈｕ
ｍ． Ｇｅｎｅｔ． ６３：５９５（１９９８））。
【０００８】これらの知見は、ヒトゲノムのハプロタイ
プ構造（一般的ＳＮＰにより定義される）を包括的に説
明するには、ヒトゲノムの沢山の独立したコピーにおけ
るＳＮＰの稠密なセットの経験的な分析を必要とするこ
とを示唆している。このような全ゲノム分析は、かなり
精密な遺伝子マッピングを提供し、および具体的な連鎖
領域の位置を正確に示すであろう。しかし本発明以前
は、適度なサイズの個体群の各個体の３，０００，００
０ を超えるＳＮＰの遺伝子タイピングを行わなければ
ならないこと及びこれにかかるコストにより、この試み
は実行不能であった。本発明は、様々な用途の中でも特
に、ＳＮＰハプロタイプを用いた個体群の全ゲノム関連
付け分析（ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ ａｓｓｏｃｉａ
ｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ）を可能とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、ヒトゲノムに
おいて生じる変異を同定するための方法、およびこれら
の変異を、疾患への耐性、疾患への感受性または薬物応
答などの表現型の遺伝的根拠（ｇｅｎｅｔｉｃ ｂａｓ
ｅ）に関連付けるための方法に関する。「疾患」とは、
変化が望まれる、生物の任意の状態、体質および特性を
含むが、これらに限定されない。例えば、状態とは、身
体的、生理学的または心理的なものであってもよく、ま
た症状性のものであっても無症状性のものであってもよ
い。この方法は、変異体の同定、ＳＮＰの同定、ＳＮＰ
ハプロタイプブロックの決定、ＳＮＰハプロタイプパタ
ーンの決定、およびさらに各パターンの情報提供ＳＮＰ
の同定（遺伝子データの圧縮を提供する）を可能とす
る。
【００１０】このように、本発明の１つの態様は、デー
タ分析に有用なＳＮＰハプロタイプパターンの選択方法
を提供する。このような選択は、複数の個体から実質的
に同じ（相同な）核酸鎖を単離し、各核酸鎖の中のＳＮ
Ｐ位置を決定し、核酸鎖の中の連鎖したＳＮＰ位置を同
定し（連鎖したＳＮＰ位置はＳＮＰハプロタイプブロッ
クを形成する）、孤立した（ｉｓｏｌａｔｅ）ＳＮＰハ
プロタイプブロックを同定し、各ハプロタイプブロック
中に生じるＳＮＰハプロタイプパターンを同定し、およ
び実質的に同じ複数の核酸鎖のうちの少なくとも２つに
おいて生じる同定されたＳＮＰハプロタイプパターンを
選択することにより、行うことができる。１つの好適な
実施形態において、少なくとも１０の異なる個体または
起源から得た核酸鎖が用いられる。より好適な実施形態
において、少なくとも１６の異なる起源から得た核酸鎖
が用いられる。さらに好適な実施形態において、少なく
とも２５の異なる起源から得た核酸鎖が用いられ、より
更に好適な実施形態において、少なくとも５０の異なる
起源から得た核酸鎖が用いられる。さらに、より好適な
実施形態は、少なくとも約１００の異なる起源から得た
核酸鎖の中のＳＮＰ位置を決定する。さらに、この方法
は、実質的に同じ複数の核酸鎖中で最も頻繁に生じるＳ
ＮＰハプロタイプを選択する工程、これらの実質的に同
じ複数の核酸鎖中で次に最も頻繁に生じるＳＮＰハプロ
タイプを選択する工程、および選択されたＳＮＰハプロ
タイプパターンがこれらの実質的に同じ複数の核酸鎖の
目的の一部分を同定するまでこの選択工程を繰返す工
程、をさらに含む。好適な実施形態において、目的の一
部分とは、該実質的に同じ核酸鎖の７０％〜９９％であ
り、より好適な実施形態において、目的の一部分は該実
質的に同じ核酸鎖の約８０％である。あるいは、ＳＮＰ
ハプロタイプパターンの選択を、１つのＳＮＰハプロタ
イプブロックにつき約３個以下のＳＮＰハプロタイプパ
ターンに限定したい場合もある。
【００１１】さらに本発明は、データ分析のためにＳＮ
Ｐハプロタイプブロックのデータセットを選択するため
の方法であって、情報提供性（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ
ｎｅｓｓ）についてＳＮＰハプロタイプブロックを比較
する工程、高い情報提供性を有する第１のＳＮＰハプロ
タイプブロックを選択する工程、該第１ＳＮＰハプロタ
イプブロックを該データセットに追加する工程、高い情
報提供性を有する第２のＳＮＰハプロタイプブロックを
選択する工程、選択された該第２ＳＮＰハプロタイプブ
ロックを該データセットに追加する工程、およびＤＮＡ
鎖の目的の領域がカバーされるまでこの選択工程および
追加工程を繰返す工程を含むことを特徴とする上記方法
を提供する。好適な実施形態において、選択されるＳＮ
Ｐハプロタイプブロックは重複しない。
【００１２】本発明はさらに、ＳＮＰハプロタイプパタ
ーンにおける少なくとも１つの情報提供ＳＮＰを決定す
るための方法であって、まず、あるＳＮＰハプロタイプ
ブロックのＳＮＰハプロタイプパターンを決定し、次に
そのＳＮＰハプロタイプブロックの中の目的の各ＳＮＰ
ハプロタイプパターンをそのＳＮＰハプロタイプブロッ
クの中の目的の他のＳＮＰハプロタイプパターンと比較
し、そして該ＳＮＰハプロタイプブロックの中のこの目
的のＳＮＰハプロタイプパターンを他のＳＮＰハプロタ
イプパターンと区別する各ＳＮＰハプロタイプパターン
の中の少なくとも１つのＳＮＰを選択する上記方法を提
供する。選択された１以上のＳＮＰは、そのＳＮＰハプ
ロタイプパターンの情報提供ＳＮＰである。
【００１３】また本発明は、ゲノム領域の高速スキャニ
ングを可能とし、疾患に関連する遺伝子座または薬理遺
伝学に関係する遺伝子座の配列または位置についての事
前知識無しで、このような疾患に関連する遺伝子座また
は薬理遺伝学的に関係する遺伝子座を決定するための方
法を提供する。これは、対照集団の中の個体からＳＮＰ
ハプロタイプパターンを決定した後、実験集団の中の個
体（例えば疾患に罹った集団の中の個体または薬物を投
与したときに特定の反応を示す個体）からＳＮＰハプロ
タイプパターンを決定することによって行うことができ
る。対照集団のＳＮＰハプロタイプパターンの頻度を、
実験集団のＳＮＰハプロタイプパターンの頻度と比較す
る。これらの頻度における差は、疾患に関連する遺伝子
座または薬理遺伝学的に関連する遺伝子剤の位置を示
す。
【００１４】本発明の他の態様は、ＳＮＰハプロタイプ
パターンと目的の表現型特徴とを関連付ける方法であっ
て、本発明の方法によって対照個体のＳＮＰハプロタイ
プパターンのベースラインを作製し、目的の共通の表現
型特徴を有する臨床集団から全ゲノムＤＮＡをプール
し、および目的の表現型特徴に関係するＳＮＰハプロタ
イプパターンを同定する、上記方法を提供する。このよ
うに、本発明は、表現型に関係する複数のハプロタイプ
ブロックを同定するためのゲノムスキャニングを可能と
し、これは特に多遺伝子性の特徴（ｐｏｌｙｇｅｎｉｃ
ｔｒａｉｔ）を調査する際に有用である。
【００１５】また本発明は、薬剤発見標的（ｄｒｕｇ
ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｔａｒｇｅｔ）を同定するための
方法であって、ＳＮＰハプロタイプパターンを疾患と関
連付け、関連付けられたＳＮＰハプロタイプパターンの
染色体位置を同定し、染色体位置と前記疾患との関係の
性質を同定し、およびその染色体位置の遺伝子または遺
伝子産物を薬剤発見標的として用いることを特徴とする
上記方法を提供する。
【００１６】添付の図面は本明細書の一部をなし、本発
明のある態様をさらに説明するために含まれる。本発明
は、本明細書中に提供される具体的な実施形態の詳細な
説明と一緒に、これらの図面の１以上を参照することに
よってより理解を深めることができる。
【００１７】本発明は、ヒトゲノムにおいて生じる変異
を同定し、これらの変異を疾患の遺伝的根拠および薬物
応答に関連付けるための方法に関する。特に本発明は、
個々のＳＮＰの同定、ＳＮＰハプロタイプブロックおよ
びＳＮＰハプロタイプパターンの決定、ならびにさら
に、疾患の遺伝的根拠および薬物応答を詳細に分析する
ためのＳＮＰハプロタイプブロックおよびＳＮＰハプロ
タイプパターンの使用に関する。本発明の方法は、全ゲ
ノムの分析に有用である。
【００１８】
【発明の実施の形態】当業者であれば、本発明の範囲お
よび精神を逸脱することなく、本願に開示された発明に
対して様々な実施形態および修正を実施することができ
ることは自明であろう。本明細書中に記載された全ての
公表文献は、本発明に関して使用され得る試薬、方法論
および概念を説明および開示するために引用される。本
明細書中に記載されるいかなる文献も、これらの参考文
献が本明細書中に記載された発明の先行技術であるとい
うことを認めるものではない。
【００１９】本明細書において、特に数が指定されてい
ない場合は１以上のものを指すものとする。特許請求の
範囲において「含む」という用語に関連して記載された
物質および事柄について特に数を明記していない限り、
１以上の物質および事柄を含むことを意味する。本明細
書中において「他の」とは少なくとも２つ目以降の物質
または事柄を指す。
【００２０】本明細書において、「異なる起源」という
用語が使用される場合、この用語は異なる生物から得た
ＤＮＡ鎖が異なる起源に由来する事実を指す。さらに、
１つの生物のゲノム中の各ＤＮＡ鎖は異なる起源に由来
する。二倍体生物において、個々の生物のゲノムは、実
質的に同じＤＮＡ鎖の複数の対からなるセットで構成さ
れる。つまり、１つの個体は２つの異なる起源に由来す
る実質的に同じＤＮＡ鎖を有する（その対の一方のＤＮ
Ａ鎖は母方起源に由来し、その対の他方のＤＮＡ鎖は父
方起源に由来する）。２以上の核酸配列（例えば２以上
のＤＮＡ鎖）は、これらがヌクレオチドレベルで少なく
とも約７０％、好ましくは約７５％、より好ましくは約
８０％、さらに好ましくは約８５％、もっと好ましくは
約９０％、よりさらに好ましくは約９５％の配列同一性
を示す場合、実質的に同じであると考えられる。またも
っとさらに好ましくは、ヌクレオチド配列は、これらが
ヌクレオチドレベルで少なくとも約９８％の配列同一性
を示す場合、実質的に同じであるとみなされる。２以上
の核酸配列間に関する配列同一性の程度は、それらの核
酸の宿主起源によって異なる。例えば、同じ種の比較を
見るときは９５％を超える配列同一性が適当であるが、
種間比較を行うときには７０％以下の配列同一性が適当
である。もちろん、本明細書中においてＤＮＡについて
言及する場合、このような言及はアンプリコン、ＲＮＡ
転写体、核酸模倣体等のＤＮＡ誘導体を含み得る。
【００２１】本明細書で使用される「個体」とは、単一
の動物、ヒト、昆虫、細菌等の特定の単一生物を指す。
【００２２】本明細書で使用されるＳＮＰハプロタイプ
ブロックの「情報提供性（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅｎｅ
ｓｓ）」とは、あるＳＮＰハプロタイプブロックが遺伝
子領域についての情報を提供する程度として定義され
る。
【００２３】本明細書で使用される「情報提供ＳＮＰ
（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ ＳＮＰ）」という用語は、
ＳＮＰハプロタイプブロックの中の１つのＳＮＰハプロ
タイプパターンを他のＳＮＰハプロタイプパターンと区
別する傾向を示すＳＮＰまたは（２以上の）ＳＮＰから
なるサブセットなどの遺伝子変異体（ｇｅｎｅｔｉｃｖ
ａｒｉａｎｔ）を指す。
【００２４】本明細書で使用される「孤立したＳＮＰブ
ロック（ｉｓｏｌａｔｅ ＳＮＰｂｌｏｃｋ）」という
用語は、１つのＳＮＰからなるＳＮＰハプロタイプブロ
ックを指す。
【００２５】本明細書で使用される「連鎖不均衡（ｌｉ
ｎｋａｇｅ ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）」、「連
鎖した（ｌｉｎｋｅｄ）」または「ＬＤ」という用語
は、世代から世代へと一緒に受け継がれる傾向がある遺
伝子座、例えば非無作為に継承される遺伝子座等を指
す。
【００２６】本明細書で使用される「シングルトンＳＮ
Ｐハプロタイプ（ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ＳＮＰ ｈａｐ
ｌｏｔｙｐｅ）」または「シングルトンＳＮＰ」という
用語は、その集団のある一定の割合未満で生じる特定の
ＳＮＰ対立遺伝子または変異体を指す。
【００２７】本明細書で使用される「ＳＮＰ」または
「単一ヌクレオチド多型」という用語は、個体間の遺伝
子変異（例えば生物のＤＮＡの中の変異性の（ｖａｒｉ
ａｂｌｅ）単一の窒素含有塩基位置など）を指す。本明
細書中で使用される「ＳＮＰｓ」とは複数のＳＮＰであ
る。もちろん、本明細書中でＤＮＡについて言及する場
合、このような言及はアンプリコンやＲＮＡ転写体等の
ＤＮＡ誘導体を含み得る。
【００２８】本明細書で使用される「ＳＮＰハプロタイ
プブロック」という用語は、別々に組換えが起こらない
と思われる変異体もしくはＳＮＰ位置のグループであっ
て、変異体もしくはＳＮＰのブロックの中に一緒にグル
ープ化され得る上記グループを意味する。
【００２９】本明細書で使用される「ＳＮＰハプロタイ
プパターン」という用語は、単一のＤＮＡ鎖の中のＳＮ
Ｐハプロタイプブロック中のＳＮＰの遺伝子型のセット
を指す。
【００３０】本明細書で使用される「ＳＮＰ位置」とい
う用語は、ＤＮＡ配列中のＳＮＰが生じる部位である。
【００３１】本明細書で使用される「ＳＮＰハプロタイ
プ配列」とは、少なくとも１つのＳＮＰ位置を含むＤＮ
Ａ鎖中のＤＮＡ配列である。
【００３２】分析用核酸の調製 当業者に公知である任意の手法を用いて、分析用に核酸
分子を調製することができる。好ましくはこのような手
法によって、その核酸分子中の１以上の位置における１
以上の変異の存在または不在を決定するのに十分な純度
の核酸分子を産生する。このような手法は、例えばＳａ
ｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９８９）およびＡｕｓｕ
ｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｊｏｈｎ Ｗ
ｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）
（１９９７）（本明細書中に参考として組み込まれる）
に記載されている。
【００３３】目的の核酸が細胞内に存在する場合、まず
その細胞の抽出物を調製した後、更なる工程（すなわち
ディファレンシャル沈降（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ
ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、カラムクロマトグラフ
ィー、有機溶媒を用いた抽出など）を行って十分な純度
の核酸調製物を得ることが必要である。抽出物は、当分
野における標準的な手法、例えば細胞の化学的もしくは
機械的溶解によって調製することができる。次に抽出物
は、例えば濾過および／または遠心分離により、および
／またはカオトロピック塩（例えばグアニジニウムイソ
チオシアナートや尿素等）を用いて、または有機溶媒
（例えばフェノールおよび／またはＨＣＣｌ3等）を用
いて処理を行い、任意の汚染タンパク質および邪魔にな
る可能性のあるタンパク質を変性させることができる。
カオトロピック塩を用いる場合、その核酸含有サンプル
からカオトロピック塩を除去することが望ましい。これ
は、当分野における標準的な手法、例えば沈殿法、濾過
法、サイズ排除クロマトグラフィー等を用いて行うこと
ができる。
【００３４】幾つかの例では、細胞からメッセンジャー
ＲＮＡを抽出および分離することが望ましい場合があ
る。このような目的ための手法および材料は当業者に公
知であり、固相支持体（ビーズやプラスチック表面な
ど）に固定されたオリゴｄＴの使用などが挙げられる。
好適な条件および材料は当業者に公知であり、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋおよびＡｕｓｕｂｅｌの上記参考文献に記載さ
れている。例えば逆転写酵素を用いてｍＲＮＡをｃＤＮ
Ａへと逆転写することが望ましい場合もある。好適な酵
素は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｌｓｂａｄ
ＣＡ）から市販されている。その後、場合により、ｍＲ
ＮＡから調製したｃＤＮＡを増幅してもよい。
【００３５】ハプロタイプパターンおよびハプロタイプ
ブロックの調査に特に適した１つの方法は、体細胞の遺
伝学的特質を利用して染色体を二倍体状態から一倍体状
態へと分離するものである。１つの実施形態において、
二倍体であるヒトリンパ芽球細胞系を同じく二倍体であ
るハムスター線維芽細胞系に、該ヒト染色体が該ハムス
ター細胞中に導入されて細胞ハイブリッドを産生するよ
うに、融合することができる。得られた細胞ハイブリッ
ドを調べてどのヒト染色体が導入されたか、および（あ
れば）導入されたヒト染色体のどれが一倍体状態である
かを決定する（例えばＰａｔｔｅｒｓｏｎら、Ａｎｎａ
ｌ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ， ３９６：６９−８１（１９８２））。
【００３６】この手法の概略図を図１０に示す。図１０
は、チミジンキナーゼ遺伝子中に突然変異を含む二倍体
ハムスター繊維芽細胞系に融合された、チミジンキナー
ゼ遺伝子について野生型である二倍体ヒトリンパ芽球細
胞系を示す。得られた細胞の部分集団において、ヒト染
色体はハイブリッド中に存在する。ヒトＤＮＡ含有ハイ
ブリッド細胞の選択は、ＨＡＴ培地（選択培地）を利用
して行われる。野生型ヒトチミジンキナーゼ遺伝子を有
するヒトＤＮＡ鎖が安定に組み込まれたハイブリッド細
胞のみが、ＨＡＴを含む細胞培養培地中で増殖する。得
られたハイブリッドのうち、幾つかのハイブリッドは、
幾つかのヒト染色体の両方のコピーを含むか、ヒト染色
体の１つのコピーのみを含むか、または特定のヒト染色
体のコピーを持たない。例えば、ＡまたはＢ対立遺伝子
を持つ遺伝子座を有するヒト第２２番染色体の場合、得
られるハイブリッド細胞には、一方のヒト第２２番染色
体変異体（例えば「Ａ」変異体）またはその一部を含む
もの、他方のヒト第２２番染色体変異体（「Ｂ」変異
体）またはその一部を含むもの、これら両方のヒト第２
２染色体変異体またはこれらの一部を含むもの、または
ヒト第２２番染色体変異体のどの部分も含まないものが
ある。図１０において、得られるハイブリッド集団のう
ち２つのみを示す。適当なハイブリッドを選択したら、
これらのハイブリッドから得た核酸を例えば上記に記載
した手法によって単離し、その後にＳＮＰ発見、そして
本発明のハプロタイプブロックおよびハプロタイプパタ
ーンの分析にかけることができる。
【００３７】増幅手法 核酸内の１以上の変異の存在もしくは不在を決定する前
に、１以上の目的の核酸を増幅することが望ましい場合
がある。核酸増幅は目的の核酸配列のコピー数を増や
す。当業者に公知である任意の増幅手法（例えばポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手法があるがこれに限定され
ない）を本発明と一緒に用いることができる。ＰＣＲは
当業者に公知の材料および方法を用いて実施することが
できる。
【００３８】ＰＣＲ増幅は一般に、鋳型として核酸配列
の一方の鎖を用いてその配列に相補的な多数の相補体を
産生する。この鋳型を、その鋳型配列の一部に相補的な
配列を有するプライマーにハイブリダイズさせ、ｄＮＴ
Ｐおよびポリメラーゼ酵素を含む好適な反応混合物に接
触させる。プライマーはポリメラーゼ酵素により伸長さ
れ、もとの鋳型に相補的な核酸が産生される。
【００３９】二本鎖核酸分子の両方の鎖を増幅するため
には、２つのプライマー（各々はその核酸のそれぞれ一
方の鎖の一部に相補的な配列を有する）が用いられる。
ポリメラーゼ酵素によるプライマーの伸長により、二本
鎖核酸分子（各鎖は鋳型鎖および新しく合成された相補
的な鎖を含む）が産生される。プライマーの配列は典型
的には、該プライマーの各々の伸長方向が、その核酸分
子の中の他方のプライマーがハイブリダイズする部位に
向かうように選択される。
【００４０】核酸分子の鎖を例えば加熱により変性し、
プロセスを繰返す。このとき、前回の工程で新しく合成
された鎖は後続工程において鋳型として使われる。ＰＣ
Ｒ増幅プロトコールは、変性、ハイブリダイゼーショ
ン、および伸長反応を数回以上繰返して、十分な量の所
望の核酸を産生するものである。
【００４１】ＰＣＲ法は、典型的には熱を用いて鎖の変
性を行い、後のプライマーのハイブリダイゼーションを
可能とするが、核酸をプライマーにハイブリダイズでき
るようにする任意の手段を用いることができる。このよ
うな手法は、物理的、化学的、または酵素による手段、
例えばヘリカーゼの封入（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｏｆｈ
ｅｌｉｃａｓｅ）（Ｒａｄｄｉｎｇ， Ａｎｎ． Ｒｅ
ｖ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：４０５−４３６（１９
８２）を参照されたい）や電気化学手段（国際特許出願
公開番号ＷＯ９２／０４４７０号およびＷＯ９５／２５
１７７号を参照されたい）を含むが、これらに限定され
ない。
【００４２】ＰＣＲにおける鋳型依存的なプライマーの
伸長は、適当な塩、金属陰イオン、およびｐＨ緩衝系を
含む反応培地中において、少なくとも４つのデオキシリ
ボヌクエオチド３リン酸（典型的にはｄＡＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰおよびｄＴＴＰから選択され
る）の存在下で、ポリメラーゼ酵素により触媒される。
好適なポリメラーゼ酵素は当業者に公知であり、天然起
源からクローニングまたは単離することができ、これ
は、その酵素の天然形態または突然変異形態であっても
よい。その酵素がプライマーを伸長する能力を維持する
限り、これらの酵素は本発明の増幅反応に使用すること
ができる。
【００４３】本発明の方法において使用される核酸は、
後の工程での検出を容易とするために標識することがで
きる。１以上の標識したヌクレオチド３リン酸および／
または１以上の標識したプライマーを増幅配列中に組み
込むことによって、増幅反応中に標識を行うことができ
る。核酸は、増幅後に、例えば１以上の検出可能基を共
有結合させることにより標識してもよい。当業者に公知
である任意の検出可能基、例えば蛍光基、リガンドおよ
び／または放射能基を用いることができる。好適な標識
手法の例としては、末端デオキシヌクレオチジルトラン
スフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素を用いて目的の核酸中に標
識を含むヌクレオチドを導入する手法である。例えば、
標識を含むヌクレオチド（好ましくはジデオキシヌクレ
オチド）を、標識しようとする核酸および該ヌクレオチ
ドを導入するのに十分な量のＴｄＴと一緒にインキュベ
ートする。好適なヌクレオチドは、ビオチン標識を結合
させた、ジデオキシヌクレオチドすなわちｄｄＡＴＰ、
ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ等である。
【００４４】長い配列の増幅を最適化する手法を用いる
ことができる。このような手法はゲノム配列に対して非
常に有効である。２００１年９月５日に出願された継続
中の米国特許出願番号６０／３１７，３１１号、２００
２年１月９日に出願された「Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆ
ｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｉｍｅｒ Ｐａ
ｉｒｓ」と題した代理人整理番号１０１１Ｎ−１（出願
番号は未定）、および２００２年１月９日に出願された
「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」と題した代理
人整理番号１０１１Ｎ１Ｄ１（出願番号は決定済み）に
開示された方法は、本発明の方法で使用されるゲノムＤ
ＮＡの増幅に特に適している。
【００４５】増幅された配列は、標識する前または後
に、他の増幅後処理にかけることができる。例えば、幾
つかのケースにおいて、ヌクレオチドアレイにハイブリ
ダイズさせる前に増幅配列を断片化することが望まし
い。核酸の断片化は、当分野で公知である物理的方法、
化学的方法または酵素による方法によって実施すること
ができる。好適な手法としては、該核酸を含む液体サン
プルを狭い開口部に通過させて増幅配列をせん断力にか
けるもの、またはＰＣＲ産物をヌクレアーゼ酵素で消化
するもの等が挙げられるが、これらに限定されない。好
適なヌクレアーゼ酵素の１つの例は、ＤＮアーゼＩであ
る。増幅後、適当なサイズの断片を産生するように設定
された一定時間の間、ＰＣＲ産物をヌクレアーゼの存在
下でインキュベートする。断片サイズは、例えばヌクレ
アーゼの量やインキュベーション時間を増やしてより小
さな断片を産生させたり、またはヌクレアーゼの量やイ
ンキュベーション時間を減らしてより大きな断片を産生
させたりして、好きなように変えることができる。所望
のサイズの断片を産生するための消化条件の調節は、当
業者の能力の範囲内である。このように産生された断片
を上記のように標識する。
【００４６】ＳＮＰの検出方法（ＳＮＰ発見） 核酸中の１以上の変異の存在または不在の決定は、当業
者に公知である任意の手法を用いて行うことができる。
変異の正確な決定を可能とする任意の手法を用いること
ができる。好適な手法は、最小限のサンプルの扱いのみ
で複数の変異の迅速且つ正確な決定を可能とする。好適
な手法の幾つかの例を以下に挙げる。
【００４７】幾つかのＤＮＡ配列決定法は当分野におい
て周知且つ一般に利用可能であり、ゲノム中のＳＮＰの
位置を決定するために用いることができる。例えばＳａ
ｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９８９）およびＡｕ
ｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ）（１９９７）を参照されたい（これらの文献は本明
細書中に参考として組み込まれる）。このような方法
は、異なるＤＮＡ鎖に由来する同じゲノム領域の配列を
決定するために使用され得る。次にこれらの配列は比較
され、その差（鎖間の変異）が調べられる。ＤＮＡ配列
決定法は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、シー
クエナーゼ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒ
ｐ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， Ｏｈｉｏ．）、Ｔａｑポ
リメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、熱安定性Ｔ
Ｐポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｃｈｉｃａｇ
ｏ， Ｉｌｌ．）またはポリメラーゼとプルーフリーデ
ィング（校正）エキソヌクレアーゼ（例えばＧｉｂｃｏ
／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， Ｍｄ．）によ
り市販されている伸長酵素増幅システム（Ｅｌｏｎｇａ
ｓｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）に
見られるものなど）等の酵素を使用する。好ましくは、
このプロセスはＨａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｌａｂ
２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ， Ｎｅ
ｖ．）、Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅ
ｒ （ＰＴＣ２００； ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗ
ａｔｅｒｔｏｗｎ， Ｍａｓｓ．）およびＡＢＩ Ｃａ
ｔａｌｙｓｔ、ならびに３７３および３７７ＤＮＡシー
ケンサ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｗｅｌｌｅｓｌ
ｅｙ， ＭＡ）等の機械により自動化される。
【００４８】さらに、市販されているキャピラリー電気
泳動システムを用いて変異もしくはＳＮＰの分析を行う
ことができる。特にキャピラリー配列決定は、電気泳動
による分離のための流動可能なポリマー、レーザーによ
り活性化される４つの異なる蛍光染料（各ヌクレオチド
毎に１つ）、およびＣＣＤカメラによる発光波長の検出
を用いることができる。出力／光強度は、適当なソフト
ウェア（例えばＧｅｎｏｔｙｐｅｒ ａｎｄ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ Ｎａｖｉｇａｔｏｒ， Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ
ｍｅｒ， Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ， ＭＡ）を用いて電気
信号に変換され、サンプルを入れてからコンピュータ分
析および電子データ表示までの全プロセスはコンピュー
タにより制御することができる。またこの方法は、異な
るＤＮＡ鎖に由来する同じゲノム領域の配列を決定する
ために使用することもできる。これらの配列は後に比較
され、その差（鎖間の変異）が調べられる。
【００４９】選択肢として、１つの基準ＤＮＡ鎖に由来
するゲノム配列を配列決定により決定したら、この基準
鎖と他のＤＮＡ鎖との配列の変異を決定するためにハイ
ブリダイゼーション手法を用いることが可能である。こ
れらの変異はＳＮＰであり得る。好適なハイブリダイゼ
ーション手法の１つの例は、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉ
ｘ， Ｉｎｃ． Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡより
入手可能なもの等のＤＮＡチップ（オリゴヌクレオチド
アレイ）の使用を含む。例えばＳＮＰ検出のためのＤＮ
Ａチップの使用についての詳細については、Ｌｉｐｓｈ
ｕｌｔｚ等に付与された米国特許第６，３００，０６３
号およびＣｈｅｅらに付与された米国特許第５，８３
７，８３２号、ＨｕＳＮＰ Ｍａｐｐｉｎｇ Ａｓｓａ
ｙの試薬キットおよびユーザマニュアル、Ａｆｆｙｍｅ
ｔｒｉｘ Ｐａｒｔ Ｎｏ． ９００９４（Ａｆｆｙｍ
ｅｔｒｉｘ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）を参
照されたい（これらは全て本明細書中に参考として組み
込まれる）。
【００５０】好適な実施形態において、基準配列および
他のＤＮＡ鎖の１０，０００を超える塩基を、変異体に
ついて調べる。より好適な実施形態において、基準配列
および他のＤＮＡ鎖の１×１０6を超える塩基を変異体
について調べ、より好ましくは基準配列および他のＤＮ
Ａ鎖の２×１０6を超える塩基を調べ、さらに好ましく
は１×１０7を超える塩基を調べ、もっと好ましくは１
×１０8を超える塩基を調べ、さらに好ましくは基準配
列および他のＤＮＡ鎖の１×１０9を超える塩基を変異
体について調べる。好適な実施形態において、少なくと
もエキソンを変異体について調べ、より好適な実施形態
においては、イントロンおよびエキソンの両方を変異体
について調べる。さらに好適な実施形態において、イン
トロン、エキソンおよび遺伝子間配列を変異体について
調べる。好適な実施形態において、調べられる核酸はゲ
ノムＤＮＡ（コード領域および非コード領域の両方を含
む）である。最も好適な実施形態において、このような
ＤＮＡは、ヒト等の哺乳動物生物に由来する。好適な実
施形態において、その生物に由来するゲノムＤＮＡの１
０％を超える部分について調べ、より好適な実施形態に
おいて、その生物のゲノムＤＮＡの２５％を超える部分
について調べ、さらに好適な実施形態において、その生
物に由来するゲノムＤＮＡの５０％を超える部分につい
て調べ、最も好適な実施形態において、ゲノムＤＮＡの
７５％を超える部分について調べる。本発明の幾つかの
実施形態において、ゲノムの既知の反復領域については
調べず、調べるゲノムＤＮＡのパーセンテージには入れ
ない。このような既知の反復領域には、短い散在性の反
復配列（Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｎ
ｕｃｌｅａｒ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ， ＳＩＮＥ、例えば
ａｌｕおよびＭＩＲ配列等）、長い散在性の反復配列
（Ｌｏｎｇ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｎｕｃｌｅａ
ｒ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ， ＬＩＮＥ、例えばＬＩＮＥ１
およびＬＩＮＥ２配列等）、長い末端反復配列（Ｌｏｎ
ｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔｓ， ＬＴＲ、例
えばＭａＬＲ、ＲｅｔｒｏｖおよびＭＥＲ４配列等）、
トランスポゾン、ＭＥＲ１配列およびＭＥＲ２配列が含
まれる。
【００５１】要約すると、１つの実施形態において、好
適な溶液中の標識した核酸を、例えば９５℃に加熱して
変性させ、変性した核酸を含む溶液をＤＮＡチップと共
にインキュベートする。インキュベーション後、溶液を
除去し、チップを好適な洗浄液で洗浄してハイブリダイ
ズしなかった核酸を除去し、チップ上のハイブリダイズ
した核酸の存在を検出する。洗浄条件のストリンジェン
シーは、安定なシグナル生成するのに必要なだけ調節す
ることができる。ハイブリダイズした核酸の検出は直接
行うことができる。例えば核酸が蛍光レポーター基を含
む場合、蛍光は直接検出され得る。核酸上の標識が直接
検出できないもの（例えばビオチンなど）である場合、
検出前に、検出可能標識（例えばフィコエリトリンに結
合したストレプトアビジン）を含む溶液を加えることが
できる。また、シグナルレベルを高めるよう設計された
他の試薬を検出前に加えることもできる。例えばストレ
プトアビジンに特異的なビオチン化抗体を、該ビオチン
・ストレプトアビジン−フィコエリトリン検出システム
と一緒に用いることもできる。幾つかの実施形態におい
て、本発明の方法で用いられるオリゴヌクレオチドアレ
イは、アレイ１つあたり少なくとも１×１０6プローブ
を含む。好適な実施形態において、本発明の方法で使用
されるオリゴヌクレオチドアレイは、アレイ１つあたり
少なくとも１０×１０6プローブを含む。より好適な実
施形態において、本発明の方法で使用されるオリゴヌク
レオチドアレイは、アレイ１つあたり少なくとも５０×
１０6プローブを含む。
【００５２】例えば配列決定またはマイクロアレイ分析
を用いて変異体の位置を決定したら（ＳＮＰ発見）、対
照集団およびサンプル集団のＳＮＰを遺伝子タイピング
することが必要となる。上記ハイブリダイゼーション方
法は、この目的に非常に役立ち、複数サンプルにおける
ＳＮＰの検出および遺伝子タイピングのための正確且つ
高速な技術を提供する。さらに、増幅を行わないゲノム
ＤＮＡ中のＳＮＰ検出に適した手法は、Ｔｈｉｒｄ Ｗ
ａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｍ
ａｄｉｓｏｎ， ＷＩから入手可能なＩｎｖａｄｅｒテ
クノロジーである。ＳＮＰを検出するためのこのテクノ
ロジーの使用については、例えばＨｅｓｓｎｅｒら、Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４６（８）：
１０５１−５６（２０００）；Ｈａｌｌら、ＰＮＡＳ
９７（１５）：８２７２−７７（２０００）； Ａｇａ
ｒｗａｌら、Ｄｉａｇ． Ｍｏｌｅｃ． Ｐａｔｈ．
９（３）：１５８−６４（２０００）；およびＣｏｏｋ
ｓｅｙら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｎｄ Ｃｈ
ｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４４（５）：１２９６−１３０
１（２０００）に記載されている。Ｉｎｖａｄｅｒプロ
セスでは、２つの短いＤＮＡプローブが標的核酸にハイ
ブリダイズして、ヌクレアーゼ酵素により認識される構
造を形成する。ＳＮＰ分析のために、２つの別々の反
応、つまり各ＳＮＰ変異体毎に１つの反応が行われる。
プローブのうちの一方がその配列に相補的である場合、
ヌクレアーゼはこれを切断して、「フラップ（ｆｌａ
ｐ）」と呼ばれる短いＤＮＡ断片を放出する。フラップ
は、蛍光標識したプローブに結合して、ヌクレアーゼ酵
素により認識される他の構造を形成する。この酵素が標
識プローブを切断すると、プローブは検出可能な蛍光シ
グナルを発することにより、どのＳＮＰ変異体が存在す
るかを示す。
【００５３】Ｉｎｖａｄｅｒテクノロジーの代替法であ
るローリングサークル型増幅は、環状ＤＮＡ鋳型に相補
的なオリゴヌクレオチドを利用して増幅シグナルを生成
する（例えばＬｉｚａｒｄｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ １９（３）：２２５−３２（１９９８）；
およびＺｈｏｎｇら、ＰＮＡＳ ９８（７）：９９４０
−４５（２００１）を参照されたい）。オリゴヌクレオ
チドの伸長により、長いコンカテマー中に該環状鋳型の
多重コピーが生成される。典型的には、検出可能標識
は、伸長反応中に伸長されたオリゴヌクレオチド中に導
入される。伸長反応は検出可能な量の伸長産物が合成さ
れるまで進められる。
【００５４】ローリングサークル型増幅を用いてＳＮＰ
を検出するためには、３つのプローブおよび２つの環状
ＤＮＡ鋳型を用いることができる。第１プローブ（標的
特異的プローブ）は、該プローブの５’側末端が、標的
核酸中のＳＮＰ部位の５’側に隣接したヌクレオチドに
ハイブリダイズするように、該標的核酸分子に相補的と
なるよう構築される。このＳＮＰ部位は、第１プローブ
と塩基対を形成しない。
【００５５】他の２つのプローブ（ローリングサークル
型プローブ）は、２つの３’側末端を持つように構築さ
れる。これは、様々な方法で（例えばこれらのプローブ
の中央部分に５’−５’結合を導入してそのポイントで
該ヌクレオチド配列の極性を逆転させることにより）行
うことができる。これらのプローブの各々の一方の端部
は、異なる環状鋳型分子の一部分に相補的な配列を有す
るが、他方の端部は、標的核酸配列の一部分に相補的で
ある。この標的配列相補的末端は、最も３’側のヌクレ
オチドがＳＮＰ部位のヌクレオチドと揃えられるように
構築される。これらのプローブの一方は、標的配列中の
ＳＮＰ部位のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含
むが、他方は相補的でないヌクレオチドを含む。ＳＮＰ
の２以上の変異体がその集団の中に存在する場合、プロ
ーブは、検出される変異体に相補的な３’側ヌクレオチ
ドを有するよう構築される。
【００５６】プローブ（標的特異的プローブおよびロー
リングサークル型プローブの両方）を標的配列にハイブ
リダイズさせ、リガーゼ酵素に接触させる。ローリング
サークル型プローブの最も３’側のヌクレオチドがＳＮ
Ｐ部位のヌクレオチドと塩基対を形成すると、これら２
つのプローブ（標的特異的プローブおよびローリングサ
ークル型プローブ）は効率的に連結される。ローリング
サークル型プローブの最も３’側のヌクレオチドが標的
中のＳＮＰ部位にあるヌクレオチドと塩基対を形成でき
ない場合、プローブは連結されない。連結されなかった
プローブを洗い流し、サンプルを鋳型環状体、ポリメラ
ーゼおよび標識したヌクレオチド３リン酸に接触させ
る。
【００５７】ＳＮＰの検出に適した他の手法は、プロー
ブ分子を消化して蛍光標識されたヌクレオチドを放出す
ることによりシグナルを生成するＤＮＡポリメラーゼの
５’側エキソヌクレアーゼ活性を利用する。このアッセ
イはしばしばＴａｑｍａｎアッセイと呼ばれる（例えば
Ａｒｎｏｌｄら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２５
（１）：９８−１０６（１９９８）；およびＢｅｃｋｅ
ｒら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １０：２５５
９−６６（１９９９）を参照されたい）。ＳＮＰを含む
標的ＤＮＡを、そのＳＮＰ部位にハイブリダイズするプ
ローブ分子の存在下で増幅する。このプローブ分子は、
５’側末端に蛍光レポーター標識ヌクレオチド、および
３’側末端に消光剤標識ヌクレオチドを両方含む。この
プローブ配列は、正しくマッチしたプローブとミスマッ
チプローブとの融解温度の差を最大とするために、標的
ＤＮＡの中のＳＮＰ部位に揃えられるそのプローブの中
のヌクレオチドができるだけそのプローブの中央に近く
なるように選択される。ＰＣＲ反応が行われるとき、正
しくマッチしたプローブは標的ＤＮＡ中のＳＮＰ部位に
ハイブリダイズし、ＰＣＲアッセイで用いられるＴａｑ
ポリメラーゼによって消化される。この消化により、蛍
光標識されたヌクレオチドは消光剤から物理的に分離さ
れ、それに伴い蛍光が増大する。ミスマッチプローブは
ＰＣＲ反応の伸長工程の間はハイブリダイズしたままで
はないので消化はされず、蛍光標識されたヌクレオチド
は消光されたままとなる。
【００５８】ポリスチレン−ジビニルベンゼン逆相カラ
ムおよびイオン・ペアリング移動相（ｉｏｎ−ｐａｉｒ
ｉｎｇ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ）を用いた変性ＨＰ
ＬＣを用いて、ＳＮＰを同定することができる。ＳＮＰ
を含むＤＮＡセグメントをＰＣＲ増幅する。増幅後、Ｐ
ＣＲ産物を加熱して変性させ、ＳＮＰ位置に既知のヌク
レオチドを有する第２の変性ＰＣＲ産物と混合する。Ｐ
ＣＲ産物をアニーリングし、高温にてＨＰＬＣにより分
析する。温度は、ＳＮＰ位置にミスマッチを含む二本鎖
分子（ｄｕｐｌｅｘ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を変性させ且
つ完全にマッチした二本鎖分子を変性させないよう選択
される。このような条件下において、ヘテロ二本鎖分子
は典型的にはホモ二本鎖分子の前に溶離する。このよう
な手法の使用例については、Ｋｏｔａら、Ｇｅｎｏｍｅ
４４（４）：５２３−２８（２００１）を参照された
い。
【００５９】固相増幅および増幅産物のミクロ配列決定
を用いてＳＮＰを検出することができる。プライマーを
共有結合させたビーズを用いて、増幅反応を行う。プラ
イマーは、ＩＩ型制限酵素の認識部位を含むように設計
される。増幅（これによりＰＣＲ産物がビーズに結合す
る）後、産物を制限酵素で消化する。制限酵素による産
物の切断により、ＳＮＰ部位および３’−ＯＨ（伸長さ
れてその一本鎖部分を埋めることができる）を含む一本
鎖部分が産生される。伸長反応にｄｄＮＴＰを含めるこ
とにより、産物の直接的な配列決定が可能となる。ＳＮ
Ｐを同定するためのこの手法の使用例については、Ｓｈ
ａｐｅｒｏら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１
（１１）：１９２６−３４（２００１）を参照された
い。
【００６０】データ分析 図１は、本発明の方法の１つの実施形態の工程を示す概
略図である。例えば上記方法によってＳＮＰ（変異体）
を位置付けまたは発見したら（図１のステップ１１
０）、ＳＮＰハプロタイプブロック、各ＳＮＰハプロタ
イプブロックの中のＳＮＰハプロタイプパターン、およ
びそのＳＮＰハプロタイプパターンの情報提供ＳＮＰを
決定することができる。位置付けされた全てのＳＮＰま
たは変異体を使用しても良いし、あるいは位置付けされ
たＳＮＰの一部のみについて分析を行っても良い。例え
ば分析されるＳＮＰのセットは、Ｃｇ＜−＞Ｔｇまたは
ｃＧ＜−＞ｃＡの転位ＳＮＰ（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ
ＳＮＰ）を除外してもよい。さらに、本発明の１つの実
施形態において、注目されるのは共通ＳＮＰである。共
通ＳＮＰは、そのより一般的でない形態が所与の集団に
おいて最少頻度で存在するこれらのＳＮＰである。例え
ば、共通ＳＮＰは、その集団の少なくとも約２％〜２５
％で見られるこれらのＳＮＰである。好適な実施形態に
おいて、共通ＳＮＰは、その集団の少なくとも約５％〜
１５％で見られるこれらのＳＮＰである。より好適な実
施形態において、共通ＳＮＰは、その集団の少なくとも
約１０％において見られるＳＮＰである。共通ＳＮＰ
は、ヒトの進化過程において初期に生じた突然変異から
生じたものであると思われる。共通ＳＮＰに焦点を絞る
ことにより、疾患または薬物応答に関連すると思われ且
つ移住歴（ｍｉｇｒａｔｏｒｙｈｉｓｔｏｒｙ）または
交配（ｍａｔｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）によっての
み生じる、実験集団および対照集団における系統的な対
立遺伝子または変異体の差を最少にする。すなわち、共
通ＳＮＰに注目することによって、近年の集団の変則性
（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｏｍａｌｙ）から生じる
偽陽性が減る。さらに共通ＳＮＰは、ヒト人口の大部分
に関係があり、このことは、本発明を、疾患および薬物
応答の調査により広く応用できるようにしている。これ
にならい、本発明の幾つかの実施形態（例えばシングル
トンＳＮＰなど）において、変異体が１回だけ観察され
るＳＮＰを分析から排除してもよい。しかし、特に移住
歴等の影響を受けた特定の部分集団または集団を見る場
合に、これらのシングルトンＳＮＰの一部または全てを
含むある種の分析を行ってもよい。
【００６１】図１のステップ１２０では、目的の変異体
またはＳＮＰをハプロタイプブロックに割り当てて評価
する。全ゲノムまたは染色体から得た変異体またはＳＮ
Ｐを分析し、ＳＮＰハプロタイプブロックに割り当てる
ことができる。あるいは、ある疾患または薬物応答メカ
ニズムに特異的な特定のゲノム領域のみからの変異体を
ＳＮＰハプロタイプブロックに割り当てることができ
る。
【００６２】図２は、ゲノム内のハプロタイプブロック
中において変異体（通常はＳＮＰ）がどのように生じる
のか、および１以上のハプロタイプパターンが各ハプロ
タイプブロック内で起こり得ることを示す１つの例であ
る。ＳＮＰハプロタイプパターンが完全に無作為である
場合、Ｎ個のＳＮＰからなるＳＮＰハプロタイプブロッ
クについて観察される可能なＳＮＰハプロタイプパター
ンの数は２N個であると推測される。しかし、本発明の
方法を実施した際に、ＳＮＰは連鎖しているため、各Ｓ
ＮＰハプロタイプブロックにおけるＳＮＰハプロタイプ
パターンの数は、２N個より少ないことが分かった（変
異体は最も一般的にはｂｉａｌｌｅｌｉｃである、すな
わち４つのヌクレオチド塩基の可能性全てではなく２つ
の形態のうち一方の形態でのみ生じるので、４Nではな
い）。あるＳＮＰハプロタイプパターンは、非連鎖ケー
スで予想される頻度よりはるかに高い頻度で観察され
た。したがって、ＳＮＰハプロタイプブロックは、ユニ
ットとして継承される傾向がある染色体領域であり、比
較的少ない数の共通パターンを有する。図２中の各行
は、異なる個体の一倍体ゲノム配列の一部を表す。図２
に示すように、個体Ｗは、２４１位に「Ａ」を、２４２
位に「Ｇ」を、および２４３位に「Ａ」を有する。個体
Ｘは、２４１位、２４２位および２４３位に同じ塩基を
有する。これに対し、個体Ｙは、２４１位および２４３
位にＴを有し２４２位にはＡを有する。個体Ｚは２４１
位、２４２位および２４３位に個体Ｙと同じ塩基を有す
る。ブロック２６１における変異体は、一緒に生じる傾
向がある。同様に、ブロック２６２における変異体は一
緒に生じる傾向があり、ブロック２６３中における変異
体も同様である。もちろん、ゲノム中の少数の塩基しか
図２に表されていない。実際、多くの塩基は２４５位お
よび２４８位の塩基と同様であり、個体間でばらつきは
ない。
【００６３】ＳＮＰハプロタイプブロックへのＳＮＰの
割り当て（図１のステップ１２０）は、あるケースで
は、目的のゲノム領域に沿ったＳＮＰ位置からのＳＮＰ
ハプロタイプブロックの構築を含む反復プロセスであ
る。１つの実施形態において、最初のＳＮＰハプロタイ
プブロックを構築したら、その構築されたＳＮＰハプロ
タイプブロックの中に存在するＳＮＰハプロタイプパタ
ーンを決定する（図１のステップ１３０）。幾つかの具
体的な実施形態において、ステップ１３０において各Ｓ
ＮＰハプロタイプブロック毎に選択されたＳＮＰハプロ
タイプパターンの数は、約５未満である。他の具体的な
実施形態において、各ＳＮＰハプロタイプブロック毎に
選択されたＳＮＰハプロタイプパターンの数は、分析さ
れるＤＮＡ鎖の５０％を超える中のＳＮＰハプロタイプ
パターンを同定するのに必要なＳＮＰハプロタイプパタ
ーンの数に等しい。言い換えると、十分なＳＮＰハプロ
タイプパターンが選択される。例えば、分析されるＤＮ
Ａ鎖の少なくとも半分が、各ＳＮＰハプロタイプブロッ
クで選択された４つのパターンのうちの１つにマッチす
るＳＮＰハプロタイプパターンを有するように、１ブロ
ックあたり４つのパターンが選択される。好適な実施形
態において、各ＳＮＰハプロタイプブロックにつき選択
されたＳＮＰハプロタイプパターンの数は、分析される
ＤＮＡ鎖の７０％を超える中のＳＮＰハプロタイプパタ
ーンを同定するのに必要なＳＮＰハプロタイプパターン
の数に等しい。１つの好適な実施形態において、各ＳＮ
Ｐハプロタイプブロックにつき選択されたＳＮＰハプロ
タイプパターンの数は、分析されるＤＮＡ鎖の８０％を
超える中のＳＮＰハプロタイプパターンを同定するのに
必要なＳＮＰハプロタイプパターンの数に等しい。さら
に、発明の幾つかの実施形態において、分析されるＤＮ
Ａ鎖のある一定割合未満で生じるＳＮＰハプロタイプパ
ターンは、分析から排除される。例えば、１つの実施形
態において、１０本のＤＮＡ鎖を分析する場合、１０本
のうち１本のサンプルにおいてのみ生じることが分かっ
たＳＮＰハプロタイプパターンは、分析から排除され
る。
【００６４】目的のＳＮＰハプロタイプパターンを選択
したら、これらのＳＮＰハプロタイプパターンのための
情報提供ＳＮＰを決定する（図１のステップ１４０）。
ブロックのこの最初のセットから、情報提供性について
の一定の基準を満たす候補ＳＮＰブロックのセットを作
製する（図１のステップ１５０）。図４および図５は、
ステップ１２０、１３０、１４０および１５０について
より詳細に記載している。
【００６５】図３において、ステップ３１０では、評価
のためにＳＮＰの新しいブロックが選択される。１つの
実施形態において、選択された第１ブロックは、ＳＮＰ
ハプロタイプ配列の中の第１ＳＮＰのみを含む。したが
ってステップ３２０では、最初の１つのＳＮＰがブロッ
クに追加される。ステップ３３０では、このブロックの
情報提供性が決定される。
【００６６】１つの実施形態において、ＳＮＰハプロタ
イプブロックの「情報提供性」は、そのブロックが遺伝
子領域についての情報を提供する程度として定義され
る。例えば、本発明の１つの実施形態において、情報提
供性は、あるＳＮＰハプロタイプブロックの中のＳＮＰ
位置の数を、考慮される各ＳＮＰハプロタイプパターン
をそのブロックの中の考慮される他のＳＮＰハプロタイ
プパターンと区別するのに必要なＳＮＰの数（情報提供
ＳＮＰの数）で割った比として計算することができる。
情報提供性の他の測度は、そのブロックの中の情報提供
ＳＮＰの数である。当業者であれば、情報提供性は、色
々な方法で決定することができることが分かるであろ
う。
【００６７】再び図２を参照すると、ＳＮＰハプロタイ
プブロック２６１は３つのＳＮＰおよび２つのＳＮＰハ
プロタイプパターン（ＡＧＡおよびＴＡＴ）を含む。存
在するこの３つのＳＮＰのどれを使用してもこれらのパ
ターンを見分けることができるので、これらのＳＮＰの
うち任意の１つを、このＳＮＰハプロタイプパラーンの
ための情報提供ＳＮＰとして選択することができる。例
えば、あるサンプル核酸が第１位置にＴを含むと決定さ
れた場合、そのサンプルは第２位置にＡおよび第３位置
にＴを含む。第２サンプルにおいて第２位置のＳＮＰが
Ｇであると決定された場合、第１および第３のＳＮＰは
Ａである。このように、情報提供性の１つの測度とし
て、この第１ブロックの情報提供性値は３である（全Ｓ
ＮＰの数３を、該パターンを互いから区別するのに必要
な情報提供ＳＮＰの数１で割った）。同様に、ＳＮＰハ
プロタイプブロック２６２は、３つのＳＮＰ（２つの位
置は変異体を持たない）および２つのハプロタイプパタ
ーン（ＴＣＧおよびＣＡＣ）を含む。前に分析したブロ
ックを用いて、該３つのＳＮＰのうちのどれか１つを評
価して１つのパターンを他のパターンと区別することが
できる。したがって、このブロックの情報提供性は３で
ある（全ＳＮＰの数３を、パターンを区別するのに必要
な情報提供ＳＮＰの数１で割った）。ＳＮＰハプロタイ
プブロック２６３は、５つのＳＮＰおよび２つのＳＮＰ
パターン（ＴＡＡＣＧおよびＡＴＣＡＣ）を含む。この
場合も、５つのＳＮＰのうちのどれか１つを用いて１つ
のパターンを他のパターンと区別することができる。し
たがって、このブロックの情報提供性は、５である（全
ＳＮＰの数５を、パターンを区別するのに必要な情報提
供ＳＮＰの数１で割った）。
【００６８】図２は、遺伝子分析の単純な例を提供す
る。幾つかのＳＮＰハプロタイプパターンが１つのブロ
ックの中に存在する場合、情報提供ＳＮＰとして２以上
のＳＮＰを用いることが必要となる場合がある。例え
ば、１つのブロックが例えば６つのＳＮＰを含み且つ目
的のパターンを区別するために２つのＳＮＰが必要であ
る場合、そのブロックの情報提供性は３である（全ＳＮ
Ｐの数６を、パターンを区別するのに必要な情報提供Ｓ
ＮＰの数２で割った）。一般的に言うと、適切に選択さ
れたＮ個のＳＮＰの遺伝子タイプを用いて、２N個もの
異なるＳＮＰハプロタイプパターンを区別することがで
きる。したがって、そのＳＮＰハプロタイプブロックの
中にたった２つのＳＮＰハプロタイプパターンしか存在
しない場合、１つのＳＮＰはその２つを差別化できなけ
ればならない。３もしくは４つのパターンがある場合、
少なくとも２つのＳＮＰが必要となるであろう。
【００６９】図３のステップ３４０において、ＳＮＰハ
プロタイプブロックの情報提供性が決定されたら、テス
トが行われる。このテストは本質的に、選択された基準
（例えばあるブロックが情報提供性の閾値を満たすか否
か）に基づいてＳＮＰハプロタイプブロックを評価し、
テスト結果は、例えば他のＳＮＰが分析のためにそのブ
ロックに追加されるか否か、またはその分析が異なるＳ
ＮＰ位置で始まる新しいブロックを用いて進行するか否
かを決定する。図４は、このプロセスの１つの実施形態
を示す。
【００７０】図４では、６つのＳＮＰ位置を有するＤＮ
Ａ配列があると想定する。上記のＳＮＰハプロタイプブ
ロック分析は、以下のように行うことができる：ＳＮＰ
位置１にあるＳＮＰのみを含むＳＮＰハプロタイプブロ
ックＡが選択される（図３のステップ３１０および３２
０）。このブロックの情報提供性を計算し（ステップ３
３０）、このブロックの情報提供性が情報提供性の閾値
を満たすか否かを決定する（ステップ３４０）。この場
合、これは「合格」し、２つの事が起こる。まず第１
に、１つのＳＮＰ（ＳＮＰ位置１）のこのブロックを候
補ＳＮＰハプロタイプブロックのセットに追加する（ス
テップ３５０）。第２に、他のＳＮＰ（ここではＳＮＰ
位置２）をこのブロックに追加し（ステップ３２０）、
ＳＮＰ位置１および２を含む新しいブロックＢを作製
し、次にこれを分析する。この例では、ブロックＢも情
報提供性の閾値を満たすので（ステップ３４０）、候補
ＳＮＰハプロタイプブロックのセットに追加され（ステ
ップ３５０）、他のＳＮＰ（この場合はＳＮＰ位置３）
がこのブロックに追加されて（ステップ３２０）、ＳＮ
Ｐ位置１、２および３を含む新しいブロックＣが作製さ
れ、次にこれを分析する。この例では、Ｃも情報提供性
の閾値を満たすので、候補ＳＮＰハプロタイプブロック
のセットに追加され（ステップ３５０）、他のＳＮＰ
（この場合はＳＮＰ位置４）がこのブロックに追加され
て（ステップ３２０）、ＳＮＰ位置１、２、３および４
を含む新しいブロックＤが作製され、次にこれを分析す
る。図４の例では、ＳＮＰブロックＤは情報提供性の閾
値を満たさない。ＳＮＰブロックＤは候補ＳＮＰハプロ
タイプブロックのセットに追加されず（ステップ３５
０）、また他のＳＮＰが分析のためにブロックＤに追加
されることもない。その代わりに、新しいＳＮＰ位置が
選択され、これについてＳＮＰブロック評価が行われ
る。
【００７１】図４では、ブロックＤが情報提供性の閾値
を満たさないと分かった後、位置２にのみＳＮＰを含む
新しいブロックＥが選択される。ブロックＥの情報提供
性について評価し、閾値を満たすことが分かり、候補Ｓ
ＮＰハプロタイプブロックのセットに追加され（ステッ
プ３５０）、および他のＳＮＰ（この場合ＳＮＰ位置
３）がこのブロックに追加されて（ステップ３２０）、
ＳＮＰ位置２および３を含む新しいブロックＦを作製
し、次にこれが分析され、上記工程がまた繰返される。
ここで、ブロックＨは情報提供性の閾値を満たさず、候
補ＳＮＰハプロタイプブロックのセットに追加されず
（ステップ３５０）、また他のＳＮＰが分析のためにブ
ロックＨに追加されることもない。その代わり、位置３
のＳＮＰのみを含む新しいブロックＩが選択されて、上
記工程が繰返される。
【００７２】候補ＳＮＰブロックのセットが作製された
ら（図３のステップ３５０）、このセットに対して分析
が行われ、ＳＮＰブロックの最終セットが選択される
（図１のステップ１６０）。ＳＮＰブロックの最終セッ
トの選択は、様々な方法で行うことができる。例えば、
再び図４を参照すると、閾値テストを合格するＳＮＰ位
置１を含む最も大きなブロック（ＳＮＰ１、２および３
を含むブロックＣ）を選択し、同じＳＮＰを含むより小
さなブロック（ブロックＡおよびＢ）を破棄することが
できる。そして、次に選択されるブロックは、情報提供
性についての閾値テストに合格する最も大きなブロック
であるＳＮＰ位置４で始まる次のブロック（ブロック
Ｇ）であり、同じＳＮＰを含むより小さなブロック（ブ
ロックＥおよびＦ）は破棄される。このような方法によ
り、目的のゲノム領域にまたがり、目的のＳＮＰを含
み、且つ高レベルの情報提供性を有する、最終的な非重
複ＳＮＰハプロタイプブロックのセットが得られる。こ
のように、全ての候補ＳＮＰハプロタイプブロックが評
価されたら、結果は、好適な実施形態において、元のセ
ットの中の全てのＳＮＰを包含する非重複ＳＮＰハプロ
タイプブロックのセットである。孤立体（ｉｓｏｌａｔ
ｅ）と呼ばれる幾つかのグループはたった１つのＳＮＰ
からなり、定義により情報提供性は１である。他のグル
ープは、１００以上のＳＮＰからなり、情報提供性は３
０を超え得る。
【００７３】ＳＮＰハプロタイプブロックの最終セット
を選択するための他の方法を図５Ａおよび図５Ｂに示
す。まず図５Ａのステップ５１０を見ると、候補ＳＮＰ
ハプロタイプブロックセット（例えば本願の図３および
図４に記載された方法により作製されたもの）の情報提
供性について分析する。ステップ５２０において、その
候補セット全体の中で最も高い情報提供性を有する候補
ＳＮＰハプロタイプブロックを選択して、最終ＳＮＰハ
プロタイプブロックセットに追加する（ステップ５３
０）。この候補ＳＮＰハプロタイプブロックを最終ＳＮ
Ｐハプロタイプブロックセットのメンバーとして選択し
たら、このブロックを候補ブロックセットから削除し
（ステップ５４０）、この選択されたブロックと重複す
る全ての他の候補ＳＮＰハプロタイプブロックをこの候
補ＳＮＰハプロタイプブロックセットから削除する（ス
テップ５５０）。次に、該候補セットの中に残っている
候補ＳＮＰハプロタイプブロックの情報提供性について
分析し（ステップ５１０）、最も高い情報提供性を有す
る候補ＳＮＰハプロタイプブロックセットを選択して最
終ハプロタイプブロックセットに追加する（ステップ５
２０および５３０）。先に記載したように、このＳＮＰ
ハプロタイプブロックを最終ＳＮＰハプロタイプブロッ
クセットのメンバーとして選択したら、このブロックを
候補ブロックセットから削除し（ステップ５４０）、こ
の選択されたブロックと重複する全ての他の候補ＳＮＰ
ハプロタイプブロックをこの候補ＳＮＰハプロタイプブ
ロックセットから削除する（ステップ５５０）。このプ
ロセスは、元のセットの中の全てのＳＮＰを包含する非
重複ＳＮＰハプロタイプブロックの最終セットが作製さ
れるまで続けられる。
【００７４】図５Ｂは、図５Ａに記載されたＳＮＰハプ
ロタイプブロックの最終セットの選択方法の単純な使用
例を示す。図５Ｂにおいて、本発明の方法に従い、配列
５’側〜３’側を、ＳＮＰ、ＳＮＰハプロタイプパター
ンおよび候補ＳＮＰハプロタイプブロックについて分析
する。この配列中に含まれる候補ＳＮＰハプロタイプブ
ロックは、その配列の下のこれらの配置により示され、
文字によって指定される。さらに、文字の後に各ブロッ
クの情報提供性が示される。例えば、候補ＳＮＰハプロ
タイプブロックＡは、その配列の最も５’側端部に位置
し、情報提供性は１である。候補ＳＮＰハプロタイプブ
ロックＲは、その配列の最も３’側末端に位置し、情報
提供性は２である。
【００７５】図５Ａに従い、第１ステップ５１０におい
て、候補ＳＮＰハプロタイプブロックの情報提供性につ
いて分析し、ステップ５２０で、最も高い情報提供性を
有するＳＮＰハプロタイプブロックを選択して、最終Ｓ
ＮＰハプロタイプブロックセットに追加する（ステップ
５２０および５３０）。図５Ｂの場合、情報提供性が６
である候補ＳＮＰハプロタイプブロックＭが、最終ＳＮ
Ｐハプロタイプブロックセットに追加するために選択さ
れた最初の候補ＳＮＰハプロタイプブロックである。Ｓ
ＮＰハプロタイプブロックＭを選択したら、このブロッ
クはＳＮＰハプロタイプブロックの候補セットから削除
もしくは除外され（ステップ５４０）、ＳＮＰハプロタ
イプブロックＭと重複する全ての他の候補ＳＮＰハプロ
タイプブロック（ブロックＪ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｏおよび
Ｐ）は、候補ＳＮＰハプロタイプブロックセットから削
除される（ステップ５５０）。次に、候補ＳＮＰハプロ
タイプブロックセットの残りのブロック、つまりＳＮＰ
ハプロタイプブロックＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、
Ｈ、Ｉ、ＱおよびＲの情報提供性について分析し、およ
びステップ５２０において、最も高い情報提供性（情報
提供性５）を有する残りのＳＮＰハプロタイプブロック
Ｉを選択して最終ＳＮＰハプロタイプブロックセットに
追加し（５３０）、ＳＮＰハプロタイプブロックの候補
セットから削除または除外する（ステップ５４０）。次
に、ステップ５５０でＳＮＰハプロタイプブロックＩと
重複する全ての他の候補ＳＮＰハプロタイプブロック
（この場合はブロックＨ）が、候補ＳＮＰハプロタイプ
ブロックセットから削除される。この場合も、候補ＳＮ
Ｐハプロタイプブロックセットの残りのブロック、つま
りＳＮＰハプロタイプブロックＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、
Ｆ、Ｇ、ＱおよびＲの情報提供性について分析する。ス
テップ５２０では、最も高い情報提供性（情報提供性
４）を有する残りのＳＮＰハプロタイプブロック（ブロ
ックＦ）を選択して最終ＳＮＰハプロタイプブロックセ
ットに追加し（５３０）、ＳＮＰハプロタイプブロック
の候補セットから削除または除外する（ステップ５４
０）。次に、ＳＮＰハプロタイプブロックＦと重複する
全ての他の候補ＳＮＰハプロタイプブロック（この場合
はブロックＥ、Ｇ、ＣおよびＤ）が、候補ＳＮＰハプロ
タイプブロックセットから削除され、候補ＳＮＰハプロ
タイプブロックセットの残りのブロック、つまりＳＮＰ
ハプロタイプブロックＡ、Ｂ、ＱおよびＲの情報提供性
について分析する。このように上記工程が繰返される。
【００７６】他の方法を用いて、候補ＳＮＰハプロタイ
プブロックのセットから分析用のＳＮＰハプロタイプブ
ロックの最終セットを選択することができる（図１のス
テップ１６０）。例えば、当分野で公知のアルゴリズム
をこの目的で応用することができる。例えば、最短路ア
ルゴリズムを用いることができる（一般にＣｏｒｍｅ
ｎ， ＬｅｉｓｅｒｓｏｎおよびＲｉｖｅｓｔ， Ｉｎ
ｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ（Ｍ
ＩＴ Ｐｒｅｓｓ） ｐｐ．５１４−７８（１９９４）
を参照されたい）。最短路問題において、辺を実数値の
重みにマッピングする重み関数ｗ：Ｅ→Ｒが重みとして
与えられた有向グラフＧ＝（Ｖ，Ｅ）が与えられる。路
ｐ＝（ｖ0，ｖ1，．．．ｖk）の重みはその構成辺の重
みの総和である。
【００７７】
【数１】
【００７８】μからνまでの路がある場合、ｕからνま
での最短路の重みはδ（ｕ，ｖ）＝ｍｉｎ ｗ（ｐ）ｕ
→ｖであり、そうでない場合はδ（ｕｓ，ｖ）＝∞であ
る、として定義される。次に、頂点ｕから頂点ｖまでの
最短路は、重みｗ（ｐ）＝δ（ｕ，ｖ）が与えられた任
意の路ｐとして定義される。辺の重みは、様々な測定基
準、例えば距離、時間、費用、ペナルティ、損失、また
は最小にしたい路に沿って線形に蓄積する任意の他の数
量として解釈することができる。本発明の用途で使用さ
れる最短路アルゴリズムの実施形態において、各ＳＮＰ
ハプロタイプブロックは、そのブロックの各境界毎に画
定された「辺」を有する「頂点」であると考えられる。
各ＳＮＰハプロタイプブロックは、他の各ＳＮＰハプロ
タイプブロックとの関係を有し、各エッジ毎に「費用」
を有する。費用は、一般に好まれるパラメータ、例えば
頂点の重複（もしくは重複の程度）または頂点間のギャ
ップ等により決定される。
【００７９】単一出発点最短路問題は、所与の出発点で
ある頂点ｓεＶから全ての頂点ｖεＶまでの最短路を決
定する所与のグラフＧ＝（Ｖ，Ｅ）に焦点を当てる。更
に、単一出発点アルゴリズムの異形を応用することもで
きる。例えば、全ての頂点ｖから所与の到達点である頂
点ｔまでの最短路を見つける単一到達点最短路解決法を
応用してもよい。グラフの中の各辺の向きを反対にする
と、この問題が単一出発点問題に還元される。あるい
は、所与の頂点ｕおよびｖのためのｕからｖまでの最短
路を見つける単一ペア最短路問題を応用してもよい。出
発点が頂点ｕである単一出発点問題を解決すれば、単一
出発点最短路問題も解決する。また、全ペア最短路法を
使用してもよい。この場合、頂点ｕおよび頂点ｖの全て
のペアのためのｕからｖまでの最短路が見つかる、つま
り、単一出発点アルゴリズムは各頂点から実行される。
【００８０】本発明の方法で用いることができる１つの
単一出発点最短路アルゴリズムは、ダイクストラ法であ
る。ダイクストラのアルゴリズムは、全ての辺の重みが
非負である場合、重みが与えられた有向グラフＧ＝
（Ｖ，Ｅ）に対して単一出発点最短路問題を解決する。
ダイクストラのアルゴリズムは、出発点ｓから最終的な
最短路の重みが既に決定された頂点のセットＳを維持す
る。つまり、全ての頂点ｖはＳ，ｄ［ｖ］＝δ（ｓ，
ｖ）の要素である。このアルゴリズムは最小最短路推定
値を有するＶ−Ｓの要素として頂点ｕを繰返し選択し、
ｕをＳに挿入し、ｕから出ている全ての辺を緩和する。
１つの処理系において、Ｖ−Ｓの中の全ての頂点を含む
（それらのｄ値によりキーイングされた）優先順位付き
待ち行列Ｑが維持される。この処理系は、グラフＧが隣
接リストにより表されると想定する。
【００８１】
【数２】
【００８２】このように、この場合のＧは分析されるゲ
ノム配列の線状網羅度（ｌｉｎｅａｒ ｃｏｖｅｒａｇ
ｅ）のグラフであり、Ｓは選択された頂点のセットであ
る。ゲノム配列の特定の領域を網羅する１つの頂点が選
択されたら、この配列と重複する他の頂点を破棄するこ
とができる。
【００８３】ＳＮＰハプロタイプブロックを選択するた
めに使用することができる他のアルゴリズムとしては、
欲張り法アルゴリズムが挙げられる（再びＣｏｒｍｅ
ｎ，ＬｅｉｓｅｒｓｏｎおよびＲｉｖｅｓｔ， Ｉｎｔ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏＡｌｇｏｒｉｔｈｍｓ （Ｍ
ＩＴ Ｐｒｅｓｓ） ｐｐ．３２９−５５（１９９４）
を参照されたい）。欲張りアルゴリズムは、選択肢のシ
ーケンスを作製することにより、ある問題に対する最適
解を得る。このアルゴリズムにおける各決定ポイント毎
に、その時点で最良であると思われる選択肢が選択され
る。このヒューリスティック法は、いつも最適解をもた
らすわけではない。ダイナミックプログラミングにおい
て、選択は各ステップで行われるがその選択は部分問題
に対する解に依存するという意味において、欲張りアル
ゴリズムはダイナミックプログラミングとは異なる。欲
張りアルゴリズムにおいて、その時点でどの選択肢が最
良に見えたとしても、その選択が行われた後に生じる部
分問題は解決される。このように、欲張りアルゴリズム
によってなされた選択は、それまでになされた選択に依
存するが、将来の選択または部分問題に対する解に依存
することはできない。欲張りアルゴリズムの１つの変形
は、ハフマン記号である。ハフマンの欲張りアルゴリズ
ムは、最適な語頭条件を満足する符号を作成し、このア
ルゴリズムは、その最適符号に対応するボトムアップ式
の木Ｔを構築する。このアルゴリズムは｜Ｃ｜葉のセッ
トから始まって｜Ｃ｜−１「マージング」演算のシーケ
ンスを実行し、最終的な木を作成する。例えば、Ｃがｎ
個の文字からなるセットであり、各文字ｃεＣは決めら
れた頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）ｆ［ｃ］を有するオブ
ジェクトであると仮定すると、ｆについてキーイングさ
れた優先順位付き待ち行列Ｑを用いて２つの最少頻度オ
ブジェクトを同定し、これらをマージングする。２つの
オブジェクトがマージングされたもの（マージャー、ｍ
ｅｒｇｅｒ）の結果は、マージングされたこれら２つの
オブジェクトの頻度の合計である頻度を有する新しいオ
ブジェクトである。例えば：
【００８４】
【数３】
【００８５】２行目は、Ｃの中の文字を用いて優先順位
付き待ち行列Ｑを開始する。３〜８行目のｆｏｒループ
は、この待ち行列から最低頻度の２つの節点ｘおよびｙ
を繰返し抽出し、この待ち行列の中のこれらの節点を、
これらのマージャーを表す新しい節点ｚ点に置き換え
る。ｚの頻度は７行目でｘおよびｙの頻度の総和として
算出される。節点ｚはその左側の子としてｘをおよびそ
の右側の子としてｙを有する。ｎ−１個のマージャーの
後、９行目において、その待ち行列の中に残った１つの
節点（その符号木の根）が戻される。
【００８６】また、これらの方法によっても、特定のゲ
ノム領域の中で評価された全てのＳＮＰを包含する最終
的な非重複ＳＮＰハプロタイプブロックのセットが得ら
れる。本発明の方法に従ってＳＮＰ、ＳＮＰハプロタイ
プブロックおよびＳＮＰハプロタイプパターンを選択し
て得られる結果として重要なのは、幾つかの実施形態に
おいてＳＮＰハプロタイプブロックの情報提供性の計算
中に、各ＳＮＰハプロタイプブロックおよびパターン毎
の情報提供ＳＮＰが決定されることである。情報提供Ｓ
ＮＰは、データ圧縮を可能とする。本発明の１つの実施
形態において、ｐ個のパターンを含む各グループから少
なくともｌｏｇ2ｐ個のＳＮＰを選択する（最も近い整
数に切り上げる）ことにより、遺伝子型／表現型の関連
を予測するのに非常に有力な情報提供ＳＮＰからなる１
つのセットが提供される。当業者であれば、他の分析に
おいて、このような部分集合を決定するために空間的に
連続的な基を用いる必要はないことが分かる。例えば、
本発明の幾つかの実施形態において、ＳＮＰハプロタイ
プブロックのそれと同じように統計学的に進められる非
隣接ＳＮＰのセットはそのＤＮＡ鎖上で空間的に連続し
ていないが、それらを同定することが望ましい。
【００８７】関連付け調査で使用されるＳＮＰハプロタ
イプブロックを正確に決定する（ＳＮＰ、ＳＮＰハプロ
タイプブロックおよびＳＮＰハプロタイプパターンの正
確なベースラインを作製する）ためには、２〜３以上の
個体ＤＮＡ鎖を調べる必要がある。図６は、ＳＮＰハプ
ロタイプブロックを決定するためおよび情報提供ＳＮＰ
の選択のために少なくとも約５つの異なるＤＮＡ鎖を調
べることの重要性を示す。図６の一番上の部分は、ＤＮ
Ａの仮定的なストレッチの配列を示すとともに、変異体
の位置を示し、変異体ブロックの境界が引かれている。
しかし、ＳＮＰハプロタイプブロックの境界は最初から
分かっているわけではない。配列決定の結果６１０は、
３つの個体の一倍体ＤＮＡを配列決定した結果を表す。
図示したように、一般に、比較的少数の個体を配列決定
した後に、共通ＳＮＰの大きなフラクションを同定する
ことが可能である。図６の場合、図６の一番上の部分に
チェックマークで示した各位置のＳＮＰを同定した。
【００８８】しかし、更なる個体を評価しない場合、ブ
ロックの境界は、この段階では正しく同定されない。例
えば、この段階でブロック６２０とブロック６３０との
間にブロック境界線を引くことができるが（それぞれ最
初のＣからＧへの変異は最初のＧからＡへの変異を予言
し、最初のＣからＴへの変異は第２のＣからＴへの変異
を予言している）、この段階ではブロック６３０とブロ
ック６４０とを区別することはできない。この段階で
は、最初のＣからＴへの変異は第１および第２のＴから
Ａへの変異を予言するようである。従って、このブロッ
ク境界線を引くためには、より統計的に有意なサンプル
セットが必要となる。例えば、本発明の方法において、
ＳＮＰハプロタイプブロック、ＳＮＰハプロタイプパタ
ーンおよび／または情報提供ＳＮＰを決定するために分
析されるＤＮＡ鎖の数は、複数（例えば少なくとも約５
個または少なくとも約１０個）である。好適な実施形態
において、ＤＮＡ鎖の数は少なくとも１６である。より
好適な実施形態において、ＳＮＰハプロタイプブロッ
ク、ＳＮＰハプロタイプパターンおよび／または情報提
供ＳＮＰを決定するために分析されるＤＮＡ鎖の数は、
少なくとも２５個である。しかし、関連するＳＮＰを同
定してしまえば（即ちＳＮＰ発見を行ってしまえば）、
ゲノムＤＮＡの全ストレッチを配列決定しなくても、残
りのサンプル中の変異体位置のみを遺伝子タイピングし
てブロック境界を同定するプロセスを完了することが可
能となる。このような方法の例については、２００２年
１月６日に出願された米国特許出願第１０／０４２，８
１９号（代理人整理番号１０１６Ｎ−１、発明の名称
「全ゲノムの走査」）を参照されたい。
【００８９】他の仮定的なゲノムサンプルの中のＳＮＰ
のみについて遺伝子タイピングプロセスを行った結果
を、図６の６５０に示す。図示されるように、この追加
的な遺伝子タイピングステップを実行することによっ
て、ブロック６３０とブロック６４０とを区別すること
が可能となったことが分かる。特に、第１のＣからＴへ
の変異が第１および第２のＴからＡへの変異を伴わない
（ｎｏｔ ｔｒａｃｋ ｗｉｔｈ）が、その代わりに、
最初のＣからＴへの変異は第２のＣからＴへの変異のみ
を予言するのに用いることができ（またその逆も可能で
ある）、および最初のＴからＡへの変異は、第２のＴか
らＡへの変異を予言するためだけに使用することができ
る（またその逆も可能である）。
【００９０】本発明の上記態様に加え、本発明の特定の
実施形態は、データ解析のために曖昧なＳＮＰハプロタ
イプ配列を解決するために使用することができることで
ある。例えば、ゲル配列決定操作またはアレイハイブリ
ダイゼーション実験から得たデータでは、はっきりした
結果が得られないので、ＳＮＰは曖昧である。この場合
の「解決する」とは、ＳＮＰハプロタイプ配列を、その
ＳＮＰハプロタイプ配列が最も密接に関係するＳＮＰハ
プロタイプパターンにマッチングすることにより、ＳＮ
Ｐハプロタイプ配列中の曖昧なＳＮＰ位置を解決するこ
とを意味する。さらに、「解決する」とは、データ分析
から曖昧なＳＮＰハプロタイプ配列を削除することを意
味する。
【００９１】曖昧なＳＮＰハプロタイプ配列を解決する
１つの実施形態において、ＳＮＰハプロタイプ配列は、
パターンセットに追加することが可能となるようデータ
セット中に配置される。このデータセットは、ＳＮＰハ
プロタイプパターンへの可能な割当てについて評価しよ
うとする全てのＳＮＰハプロタイプ配列を含む。ここで
図７Ａを参照すると、ステップ７１０において、データ
セット中のＳＮＰハプロタイプ配列は、そのパターンセ
ット中のパターン配列と１つずつ比較される。最初はそ
のパターンセットの中にパターンが１つもないこともあ
るし、幾つかまたは全てのパターン配列が予め分かって
いる場合もある。ステップ７２０において、「データセ
ットからのＳＮＰハプロタイプ配列はそのパターンセッ
トの中のパターン配列と一致するか？」という問合せが
行われる。答えが「いいえ」である場合、ステップ７３
０で、評価されているＳＮＰハプロタイプ配列はそのパ
ターンセットに追加される。答えが「はい」である場
合、他の問合せ「データセットからのＳＮＰハプロタイ
プ配列はそのパターンセットの中の２以上のパターン配
列と一致するか？」が行われる（７４０）。
【００９２】答えが「ＹＥＳ」である場合、データセッ
トからのＳＮＰ配列は破棄されるか、または幾つかの実
施形態において、更なるもしくは異なる分析のために保
持される（ステップ７５０）。２番目の問合せに対する
答えが「ＮＯ」である場合、ステップ７６０において、
そのデータセットからのそのＳＮＰ配列は、パターンセ
ットからのそれが一致するパターン配列と比較される。
これらの２つの配列から、曖昧性の数が最も少ないＳＮ
Ｐが選択され、そのパターンセットの中に配置される
（７７０）。より多い曖昧性を含むＳＮＰ配列は破棄し
てもいし、または幾つかの実施形態において、更なるも
しくは異なるタイプの分析のために保持してもよい。
【００９３】解決プロセスは、図７Ａおよび図７Ｂを参
照することにより更に理解することができる。図７Ｂに
おいて、最初のＳＮＰ配列ＴＴＣＧＡが、そのパターン
セットの中に含まれる配列と比較される（ステップ７１
０）。この時点で、そのパターンセットの中にパターン
配列が１つも含まれていない場合、ＴＴＣＧＡはそのパ
ターンセットの中のどのパターン配列とも一致しないこ
とになる。従って、このＳＮＰ配列ＴＴＣＧＡの存在は
そのデータセットから削除され（または他の分析用に保
持され）、そのパターンセットに追加される（７３
０）。これで、そのパターンセットは１つのパターン配
列ＴＴＣＧＡを有することになる。
【００９４】再び図７Ｂを見ると、そのデータセットの
中の第２のＳＮＰ配列「Ｔ？Ｃ？？」が、そのパターン
セットの中に含まれる配列と比較される（ステップ７１
０）。この時、そのパターンセットの中には１つのパタ
ーン配列「ＴＴＣＧＡ」があり、そして「Ｔ？Ｃ？？」
はこの配列に一致する（ステップ７２０）。このときそ
のパターンセットの中には１つのパターン配列「ＴＴＣ
ＧＡ」しかないので、２番目の問合せ「ＳＮＰ配列「Ｔ
？Ｃ？？」はそのパターンセットの中の２以上のパター
ン配列と一致するか？」（７４０）に対する答えは「い
いえ」である。ステップ７６０で、「Ｔ？Ｃ？？」は
「ＴＴＣＧＡ」と比較され、どちらの配列がより多い曖
昧性を有するかを決定する。これは明らかに「Ｔ？Ｃ？
？」なので、「ＴＴＣＧＡ」はそのパターンセットの中
に保持され（７７０）、「Ｔ？Ｃ？？」は破棄されるか
または更なる分析のために保持される。
【００９５】図７Ｂのデータセットの３番目の配列は
「Ｃ？？？？」である。「Ｃ？？？？」はまずＴＴＣＧ
Ａと比較され（ステップ７１０）、「ＴＴＣＧＡ」とは
一致しないことが分かったので（７２０）、そのパター
ンセットに追加される（７３０）。図７Ｂの中の４番目
の配列は「ＣＴＡＣＡ」である。「ＣＴＡＣＡ」は「Ｔ
ＴＣＧＡ」および「Ｃ？？？？」（そのパターンセット
の中のパターン配列）と比較され（ステップ７１０）、
そして「Ｃ？？？？」と一致することが分かる（７２
０）。ここで２番目の問合せ「「ＣＴＡＣＡ」は「Ｃ？
？？？」および「ＴＴＣＧＡ」の両方に一致するか？」
が行われる（７４０）。答えは「いいえ」なので、次に
「Ｃ？？？？」および「ＣＴＡＣＡ」が比較され（７６
０）、曖昧性が最も少ない配列（この場合「ＣＴＡＣ
Ａ」）がそのパターンセットの中に保持され、「Ｃ？？
？？」は破棄（分析から削除）されるかまたは更なる分
析用に保持される（７７０）。
【００９６】図７Ｂのデータセット中の５番目のＳＮＰ
配列は「？Ｔ？？Ａ」である。このＳＮＰ配列はパター
ン配列「ＴＴＣＧＡ」および「ＣＴＡＣＡ」と比較され
（７１０）、「ＴＴＣＧＡ」および「ＣＴＡＣＡ」の両
方と一致することが分かる。従って、問合せ「「？Ｔ？
？Ａ」はそのパターンセットの中の２以上のパターン配
列と一致するか？」（７４０）に対する答えは「ＹＥ
Ｓ」である。ステップ７５０において、ＳＮＰ配列「？
Ｔ？？Ａ」は、更なる分析のために保持されるか、また
は破棄（分析から削除）される。他の解決方法は、例え
ばもし１つのパターン配列が「ＣＣＡＴＴ？」でありデ
ータセットからのＳＮＰ配列が「Ｃ？ＡＴＴＧ」である
場合、これらの配列を曖昧性を解決するために「組み合
わせ」（ＣＣＡＴＴＧ）、この「組み合わせ」た配列を
そのパターンセットに追加することを可能とする。更な
るアレイハイブリダイゼーション、配列決定法、または
当分野において公知である他の手法を用いて、曖昧なＳ
ＮＰヌクレオチド位置を分析することができる。
【００９７】ＳＮＰハプロタイプブロックおよびパター
ンと表現型との関連付け 同定されたＳＮＰハプロタイプブロック、ＳＮＰハプロ
タイプパターンおよび／または情報提供ＳＮＰは、様々
な遺伝子分析に用いることができる。例えば、情報提供
ＳＮＰを同定してしまえば、これらを関連付け調査のた
めの様々なアッセイにおいて用いることができる。例え
ば、これらの情報提供ＳＮＰを尋問するマイクロアレイ
用のプローブを設計することができる。他の例示的アッ
セイとしては、例えばＴａｑｍａｎアッセイおよびＩｎ
ｖａｄｅｒアッセイ（上記に記載）ならびに従来のＰＣ
Ｒおよび／または配列決定手法が挙げられる。
【００９８】幾つかの実施形態において、図１のステッ
プ１７０に記載したように、同定されたハプロタイプパ
ターンを上記アッセイで用いて、関連付け調査を行うこ
とができる。これは、目的の表現型を有する個体（例え
ば特定の疾患を示す個体または薬物の投与に対して特定
の反応を示す個体）においてハプロタイプパターンを決
定し、これらの個体におけるそのハプロタイプパターン
の頻度を、対照個体群における該ハプロタイプパターン
の頻度と比較することにより、達成することができる。
好ましくは、このようなＳＮＰハプロタイプパターンの
決定は、ゲノム全体で行われるが、ゲノムの特定の領域
のみに関心がある場合は、これらの特定の領域のＳＮＰ
ハプロタイプパターンが用いられる。本発明の方法の本
明細書中に開示される他の実施形態に加え、これらの方
法はさらに、表現型の「詳細な分析（ｄｉｓｓｅｃｔｉ
ｏｎ）」も可能とする。つまり、特定の表現型は２以上
の異なる遺伝的根拠から生じる場合がある。例えば、あ
る個体における肥満は、Ｘ遺伝子中のある欠陥により生
じたものかもしれないが、他の個体における肥満表現型
は、Ｙ遺伝子およびＺ遺伝子における突然変異により生
じたものである場合もある。このように、本発明のゲノ
ム走査能力（ｇｅｎｏｍｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃａｐ
ａｂｉｌｉｔｙ）により、類似した表現型についての様
々な遺伝的根拠の吟味を可能とする。ゲノムの特定の領
域が特定の表現型と関連性があることが同定されたな
ら、これらの領域は薬剤発見標的として（図１のステッ
プ１８０）、または診断マーカーとして（図１のステッ
プ１９０）使用することができる。
【００９９】先の段落に記載したように、関連付け調査
を行う１つの方法は、目的の表現型を示す個体における
ＳＮＰハプロタイプパターンの頻度を、対照個体群にお
けるＳＮＰハプロタイプパターンの頻度と比較すること
である。好適な実施形態において、情報提供ＳＮＰは、
ＳＮＰハプロタイプパターン比較を行うために用いられ
る。情報提供ＳＮＰを用いるアプローチは、現在までに
当分野で公知である他の全ゲノム走査もしくは遺伝子タ
イピング法よりも大きな利点を有する。というのは、各
個体のゲノムの３０億個の塩基全てを読み取る（または
見つけられる３００〜４００万個の共通ＳＮＰを読む）
代わりに、サンプル集団からの情報提供ＳＮＰのみを決
定すれば良いからである。これらの特定の情報提供ＳＮ
Ｐを読み取れば、上記のような特定の実験集団からの統
計学的に正確な関連付けデータの抽出を可能するのに十
分な情報が得られる。
【０１００】図８は、本発明の方法を用いて遺伝学的関
連性を決定する１つの方法のある実施形態を示す。ステ
ップ８００では、対照集団のゲノムについて情報提供Ｓ
ＮＰの頻度を決定する。ステップ８１０では、臨床集団
のゲノムについて情報提供ＳＮＰの頻度を決定する。ス
テップ８００および８１０は、個体の集団において情報
提供ＳＮＰを分析するための上記ＳＮＰアッセイを用い
ることにより行うことができる。ステップ８２０におい
て、ステップ８００および８１０から得た情報提供限定
ＳＮＰの頻度が比較される。頻度の比較は、例えば各集
団における各情報提供性ＳＮＰ位置におけるマイナーな
対立遺伝子の頻度（特定のマイナー対立遺伝子を有する
個体数を全個体数で割った）を決定し、これらのマイナ
ー対立遺伝子頻度を比較することにより行うことができ
る。ステップ８３０において、対照集団および臨床集団
における発生頻度の差を示す情報提供ＳＮＰを選択して
分析する。情報提供ＳＮＰを選択したら、この情報提供
ＳＮＰを含むＳＮＰハプロタイプブロックが同定され、
これを用いて目的のゲノム領域を同定する（ステップ８
４０）。これらのゲノム領域を当分野で公知の遺伝学的
方法または生物学的方法により分析し（ステップ８５
０）、そしてこれらの領域が薬剤発見標的として（ステ
ップ８６０）または診断マーカーとして（ステップ８７
０）使用することができるかどうかについて分析する
（以下に詳細に説明する）。
【０１０１】同定したゲノム配列の使用 ゲノム中の１以上の遺伝子座を特定の表現型特徴、例え
ば疾患罹患性遺伝子座等に関連付けたら、その特徴に関
係のあるこれらの遺伝子または調節エレメントを同定す
ることができる。次にこれらの遺伝子または調節エレメ
ントは、疾患の治療のための治療標的として用いること
ができる（図１のステップ１８０または図８のステップ
８６０に記載）。本発明の方法により同定されたゲノム
配列は、遺伝子配列（ｇｅｎｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
または非遺伝子配列（ｎｏｎｇｅｎｉｃ ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅ）であっても良い。「遺伝子」という用語は、特定
のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレ
ーム（ＯＲＦ）、イントロン領域、ならびに該コード領
域の範囲を超えて最長で約１０ｋｂにもなる遺伝子の発
現の調節に関与する隣接する５’および３’側の非コー
ドヌクレオチド配列（ただし、いずれかの方向にもっと
長く延びる場合もある）を意味するものとする。同定さ
れた遺伝子のＯＲＦは、タンパク質構造に影響を及ぼす
ことにより疾患の状態に影響を及ぼし得る。あるいは、
同定された遺伝子の非コード配列または非遺伝子配列
は、タンパク質の発現レベルまたは発現特異性に影響す
ることにより、疾患の状態に影響を及ぼし得る。一般
に、ゲノム配列は、同定された遺伝子を、該遺伝子配列
を含まない他の核酸配列を実質的に含まないように単離
することによって、調査される。該ＤＮＡ配列は、様々
に利用することができる。例えば、該ＤＮＡを用いて生
物学的試料における該遺伝子の発現を検出または定量す
ることができる。特定のヌクレオチド配列の存在につい
て細胞を走査する方法は、文献に十分に記載されてお
り、ここで詳細に述べる必要がないが、例えばＳａｍｂ
ｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９８９）を参照された
い。
【０１０２】さらに、該遺伝子の配列（フランキングプ
ロモーター領域およびコード領域を含む）を当分野で公
知である様々な方法で突然変異させて、コードされるタ
ンパク質の発現レベルまたは配列等に、意図する変化を
もたらすことができる。この配列変化は、置換、挿入、
トランスロケーションまたは欠失であってもよい。欠失
は、あるドメインまたはエキソンの全体的欠失などの大
きな変化を含み得る。クローニングされた遺伝子のイン
ビトロ突然変異誘発法は公知である。部位特異的突然変
異誘発のためのプロトコールの例は、Ｇｕｓｔｉｎら、
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：２２（１９９
３）； Ｂａｒａｎｙ， Ｇｅｎｅ ３７：１１１−２
３（１９８５）； Ｃｏｌｉｃｅｌｌｉら、Ｍｏｌ．
Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １９９： ５３７−９（１９
８５）； Ｐｒｅｎｔｋｉら、Ｇｅｎｅ ２９：３０３
−１３（１９８４）； Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ） ｐｐ． １５．３−１５．１
０８（１９８９）； Ｗｅｉｎｅｒら、Ｇｅｎｅ １２
６：３５−４１（１９９３）； Ｓａｙｅｒｓら、Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：５９２：６（１９９
２）； ＪｏｎｅｓおよびＷｉｎｉｓｔｏｒｆｅｒ，
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２：５２８−３０（１
９９２）；およびＢａｒｔｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：７３４９−５５（１９９
０）に記載されている。このような突然変異遺伝子を用
いて、そのタンパク質産物の構造／機能の関係を調査し
たり、またはその機能または調節に影響を及ぼす該タン
パク質の特性を変更したりすることができる。
【０１０３】同定された遺伝子を用いて、得られるポリ
ペプチドの全てまたは一部を産生することができる。タ
ンパク質産物を発現するために、同定された遺伝子を組
み込む発現カセットを用いても良い。発現カセットまた
はベクターは、一般には転写および翻訳開始領域（誘導
可能または構成的なもの）を提供し、この場合、コード
領域は、転写開始領域ならびに転写および翻訳停止領域
の転写制御下において機能上連結されている。これらの
制御領域は、同定された遺伝子にもともと備わっている
ものであっても良いし、また外来起源に由来するもので
あってもよい。
【０１０４】該ペプチドは、従来法に従って、発現の目
的に応じて原核生物または真核生物内で発現させること
ができる。該タンパク質の大規模生産を行う場合、大腸
菌、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ等の単細胞生物、バキュロウイルスベクターと一緒
に用いた昆虫細胞、または脊椎動物（特に哺乳動物）等
のより高等な生物の細胞（例えばＣＯＳ７細胞）を発現
宿主細胞として用いることができる。多くの状況におい
て、真核生物中で該遺伝子を発現させることが望まし
い。なぜなら、真核生物では、該遺伝子は天然の折畳み
構造および翻訳後修飾による恩恵を得るであろうからで
ある。また、小さなペプチドは実験室で合成することも
できる。タンパク質またはその断片が入手できれば、従
来方法に従って、そのタンパク質を単離および精製する
ことができる。発現宿主のライゼートを調製し、ＨＰＬ
Ｃ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、アフィ
ニティークロマトグラフィーまたは他の精製手法を用い
て、該タンパク質もしくはその断片を精製することがで
きる。
【０１０５】発現されたタンパク質を抗体産生に用いる
ことができる。この場合、短い断片は特定のポリペプチ
ドに対して特異的な抗体（モノクローナル抗体）の発現
を誘導し、より大きな断片または全タンパク質は、該ポ
リペプチドの全長に対する抗体（ポリクローナル抗体）
の産生を可能とする。抗体は従来法に従って調製され、
この場合、発現されたポリペプチドまたはタンパク質
は、そのまま、もしくは既知の免疫原性キャリア（例え
ばＫＬＨ、ｐｒｅ−Ｓ ＨＢｓＡｇ、他のウイルスタン
パク質または真核生物タンパク質等）とコンジュゲート
させて、免疫原として用いられる。様々なアジュバント
を適当に、一連の注射を注射と共に用いることができ
る。モノクローナル抗体の場合、１以上の追加抗原刺激
注射後に、脾臓を単離し、リンパ球を細胞融合により不
死化させ、親和性の高い抗体結合についてスクリーニン
グする。次に、所望の抗体を産生する不死化細胞（すな
わちハイブリドーマ）を増殖する。さらに詳しいことに
ついてはＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒ
ｌｏｗおよびＬａｎｅ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）（１９８
８）を参照されたい。所望により、重鎖および軽鎖をコ
ードするｍＲＮＡを単離し、大腸菌内でのクローニング
により突然変異させて、これらの重鎖および軽鎖を混合
して該抗体の親和性を更に強化することができる。イン
ビボでの免疫化に代わる抗体の作製方法としては、ファ
ージ「提示」ライブラリーへの結合（通常はインビトロ
・アフィニティー熟成を伴う）が挙げられる。
【０１０６】同定された遺伝子、遺伝子断片またはこれ
にコードされるタンパク質もしくはタンパク質断片は、
変性疾患および他の疾患を治療するための遺伝子療法に
おいて有用であり得る。例えば、発現ベクターを用いて
同定された遺伝子を細胞内に導入することができる。こ
のようなベクターは一般に、プロモーター配列近くに位
置する、受容者（即ち宿主）のゲノム中への核酸配列の
挿入をもたらすに便利な制限部位を有する。転写開始領
域、標的遺伝子もしくはその断片、および転写終結領域
を含む転写カセットを調製することができる。転写カセ
ットは、例えばプラスミド、レトロウイルス（レンチウ
イルス等）、アデノウイルス等の様々なベクターの中に
導入することができ、該ベクターは、細胞内で一時的ま
たは安定に維持されることができる。該遺伝子またはタ
ンパク質産物は、様々な経路（例えばウイルス感染、マ
イクロインジェクションまたは小胞の融合（ｆｕｓｉｏ
ｎｏｆ ｖｅｓｉｃｌｅ）等）により組織または宿主細
胞中に直接導入することができる。また筋肉内投与のた
めにジェット注射を用いることもできる（Ｆｕｒｔｈ
ら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ， ２０５：３６５−
６８（１９９２）に記載）。あるいは、ＤＮＡを金微粒
子にコーティングして、粒子衝撃デバイス（ｐａｒｔｉ
ｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｄｅｖｉｃｅ）また
は「遺伝子銃」（文献記載）により皮内に送達すること
ができる（例えばＴａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ， ３５
６：１５２−５４（１９９２）を参照されたい）。
【０１０７】アンチセンス分子を用いて、細胞内におけ
る同定遺伝子の発現をダウンレギュレートすることがで
きる。アンチセンス試薬は、アンチセンスオリゴヌクレ
オチド、特に化学修飾を施した合成アンチセンスオリゴ
ヌクレオチド、またはこのようなアンチセンス分子を発
現する核酸構築物（ＲＮＡなど）であってもよい。アン
チセンス分子の組合せ（この組合せは多数の異なる配列
を含み得る）を投与することもできる。
【０１０８】アンチセンスインヒビターの代わりに、触
媒的核酸化合物（例えばリボザイムやアンチセンスコン
ジュゲートなど）を用いて遺伝子発現を阻害することが
できる。リボザイムをインビトロで合成して患者に投与
しても良いし、または発現ベクター上にコードさせて、
そこからリボザイムを標的細胞内で合成してもよい（例
えば国際特許出願公開番号ＷＯ９５／２３２２５号）お
よびＢｅｉｇｅｌｍａｎら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ． ２３：４４３４−４２（１９９５）を参照さ
れたい）。触媒活性を有するオリゴヌクレオチドの例
は、国際特許出願公開番号第ＷＯ９５／０６７６４号に
記載されている。金属錯体とアンチセンスオリゴヌクレ
オチドとのコンジュゲート（例えばｍＲＮＡの加水分解
を媒介することができるｔ−ピリジルＣｕ（ＩＩ）（ｔ
ｅｒｐｙｒｉｄｙｌ Ｃｕ（ＩＩ））等）は、Ｂａｓｈ
ｋｉｎら、Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ． ５４：４３−５６（１９９５）に記載さ
れている。同定された遺伝子配列は遺伝子療法のために
用いる以外に、同定された核酸を用いて遺伝子修飾され
た非ヒト動物を作製して疾患動物モデルを作製したり、
またはタンパク質の機能および調節を調査するために細
胞系において部位特異的遺伝子修飾を行うことができ
る。「トランスジェニック」という用語は、宿主細胞中
に安定に送達された外来遺伝子を有する遺伝子修飾され
た動物を含むものとする。この場合、宿主細胞中におい
て、例えば、修飾タンパク質を産生するために該遺伝子
の配列を変更してもよいし、または該遺伝子は外来プロ
モーターに機能上連結されたレポーター遺伝子であって
もよい。内因性性遺伝子座を変化、置き換えまたは破壊
する相同性組換えにより、トランスゲニック動物を作製
しても良い。あるいは、核酸構築物を無作為にゲノム中
に組み込んでも良い。安定な組込みのためのベクターと
しては、プラスミド、レトロウイルスおよび他の動物ウ
イルス、ＹＡＣ等が挙げられる。関心が持たれるものと
しては、トランスジェニック哺乳動物（例えばウシ、ブ
タ、ヤギ、ウマ等、および特にラットやマウス等のげっ
歯類）である。
【０１０９】また遺伝子機能の調査は、非哺乳動物モデ
ル、特に生物学的および遺伝学的に十分に特徴付けられ
ている非哺乳類生物（例えばＣ． ｅｌｅｇａｎｓ、
Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＳ． ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ等）を用いることもできる。タンパク質の機
能に関与する生理学的および生化学的経路を決定するた
めに、対象となる遺伝子配列を用いて、対応する遺伝子
機能をノックアウトしたり、または明らかにされた遺伝
子病変を補うことができる。例えば変性疾患の進行を調
査したり、治療法をテストしたり、または薬剤発見のた
めに、補足もしくはノックアウト調査と共に、薬物スク
リーニングを行ってもよい。
【０１１０】更に、改変された細胞または動物は、タン
パク質の機能および調節の調査において有用である。例
えば、同定された遺伝子の中で一連の小さな欠失および
／または置換を行い、酵素活性、細胞輸送または局在化
などにおける異なるドメインの役割を決定することがで
きる。目的の具体的な構築物としては、遺伝子発現、ド
ミナント−ネガティブ遺伝子突然変異の発現、および同
定遺伝子の過剰発現を遮断するアンチセンス構築物が挙
げられるがこれらに限定されない。また、ある細胞もし
くは組織内において通常は発現されないまたは異常な発
生時期において発現される同定遺伝子またはその変異体
を、該細胞もしくは組織内で発現させることもできる。
さらに、ある細胞の中でその細胞中では通常は産生され
ないタンパク質を発現させることにより、そのタンパク
質の正常な機能に関する情報を提供する細胞内挙動の変
化を誘導することができる。
【０１１１】構造／機能パラメータを調査するためにタ
ンパク質分子を分析することができる。例えば、ある同
定遺伝子のタンパク質産物を大量に産生することによ
り、そのタンパク質産物に結合するまたは該タンパク質
産物の機能をモジュレートもしくは模倣する基質または
リガンドを同定することができる。薬物スクリーニング
により、例えば影響を受けた細胞内におけるタンパク質
機能に取って代わるもしくは増強する薬剤、またはタン
パク質機能をモジュレートもしくは取り消す薬剤が同定
される。本明細書中で用いられる「薬剤」という用語
は、同定遺伝子または遺伝子産物の生理学的機能を直接
または間接的に変更、模倣またはマスキングすることが
できるあらゆる分子（例えばタンパク質や小分子等）を
指す。一般に、様々な濃度に応じて異なる反応を得るた
めに、複数のアッセイ混合物を異なる濃度の薬剤と平行
に泳動させる。典型的には、これらの濃度の１つが陰性
対照（即ちゼロ濃度または検出レベル未満）として使用
される。
【０１１２】この目的のために、標識インビトロタンパ
ク質／タンパク質結合アッセイ、タンパク質−ＤＮＡ結
合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク
質結合のイムノアッセイ等を含む様々なアッセイを使用
することができる。また、精製されたタンパク質の全て
またはその断片を用いて、三次元結晶構造を決定するこ
ともできる。この三次元結晶構造は、タンパク質または
その一部の生物学的機能を決定するため、分子間の相互
作用をモデリングするため、または膜融合等のために使
用することができる。
【０１１３】候補となる薬剤は、多くの化学クラスを包
含するが、典型的には、このような薬剤は有機分子や複
合体（好ましくは分子量が５０ダルトンを超え且つ約
２，５００ダルトン未満である小さな有機化合物）であ
る。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用に必要
な官能基、特に水素結合を含み、典型的には、少なくと
も１つのアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカ
ルボニル基、およびしばしばこれらの官能性化学基のう
ちの少なくと２つを含む。候補薬剤はしばしば、炭素環
または複素環式構造および／または芳香族もしくは多環
芳香族構造が、１以上の上記官能基で置換されている。
また候補薬剤は、生体分子（ペプチド、糖類、脂肪酸、
ステロイド、プリン、ピリミジン、およびこれらの誘導
体、構造的類似体または組合せ等を含むがこれらに限定
されない）の中にも見られる。
【０１１４】候補薬剤は、合成もしくは天然化合物のラ
イブラリーを含む様々な起源から得られる。例えば、種
々の有機化合物および生体分子を無作為的および特異的
に合成するためには、無作為なオリゴヌクレオチドおよ
びオリゴペプチドの発現を含む様々な手段が利用可能で
ある。あるいは、細菌、真菌、植物および動物のエキス
といった形態の天然化合物のライブラリーが入手可能で
あり、また簡単に生成することができる。更に、天然の
または合成したライブラリーおよび化合物を、従来の化
学的、物理的および生化学的手段により簡単に修飾し、
これを用いてコンビナトリアルライブラリーを作製する
ことができる。既知の薬物を、特異的もしくは無作為な
化学修飾（例えばアシル化、アルキル化、エステル化、
アミド化等）にかけて構造的類似体を作製することがで
きる。
【０１１５】スクリーニングアッセイが結合アッセイで
ある場合、該分子の１以上を、検出可能シグナルを直接
もしくは間接的に発することができる標識に結合させる
ことができる。様々な標識として、放射性同位体、蛍光
体、化学発光体、酵素、特異的結合分子、粒子（例えば
磁性粒子）等が挙げられる。特異的結合分子としては、
ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンと抗ジゴキ
シン抗体等のペアが挙げられる。特異的結合メンバーの
場合、通常は相補的メンバーを、既知の手法によって検
出され得る分子で標識する。種々の他の試薬をスクリー
ニングアッセイに含めることができる。これらには、最
適なタンパク質−タンパク質結合を容易とするため、お
よび／または非特異的もしくはバックグラウンド相互作
用を低減するために使用される、塩、中性タンパク質
（例えばアルブミン等）、洗浄剤等の試薬が含まれる。
アッセイの効率を上げる試薬（例えばプロテアーゼイン
ヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤等）を使
用してもよい。
【０１１６】薬剤は、薬学的に許容される担体（あらゆ
る全ての溶剤、分散媒、コーティング、抗酸化剤、等張
性剤、吸収遅延剤等と組み合わせても良い。薬学的に活
性な物質のためのこのような媒体および物質の使用は、
当分野において周知である。該活性物質に対して従来の
媒体または薬剤がいずれも適合しない場合でない限り、
本明細書中に記載される治療的組成物および治療方法に
おいて該活性物質が使用できると考えられる。また、組
成物中に補助的な活性成分を組み込むこともできる。
【０１１７】様々な投与法で使用するための製剤を調製
することができる。製剤は、経口投与、吸入、または注
射（例えば静脈内、腫瘍内、皮下内、腹膜内、筋肉内
等）により投与することができる。治療製剤の投薬量
は、疾患の性質、投与頻度、投与方法、宿主からの薬剤
のクリアランス等に応じて広く異なる。最初の投与量を
多くして、後により少ない維持量を投与してもよい。有
効な投薬レベルを維持するために、用量を１週間または
２週間に１回といった少ない頻度で投与しても良いし、
あるいは用量を小分けにして、毎日または週２回等で投
与してもよい。幾つかのケースにおいて、経口投与は静
脈内投与の場合とは異なる用量を必要とする。本発明の
同定薬剤は、様々な治療投与用製剤に組み込むことがで
きる。より具体的には、適切な薬学的に許容される担体
もしくは希釈剤と組合せた複合体を医薬組成物として調
製し、および固体、半固体、液体または気体状の調製物
（例えば錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐
剤、注射液、吸入剤、ゲル、微小球、エアロゾル等）と
して製剤化することができる。このように、該薬剤の投
与は様々な方法で行うことができる。薬剤は、投与後に
全身をめぐるものであってもよいし、また内植した部位
に活性用量を維持する働きをするインプラントを用いて
局所化させてもよい。
【０１１８】以下の方法および賦形剤は単に例示的なも
のであり、限定的なものではない。経口用調製物の場
合、薬剤を単独または適当な添加物（例えばラクトー
ス、マンニトール、コーンスターチまたはポテトスター
チ等の従来添加物；結晶セルロース、セルロース誘導
体、アカシアゴム、コーンスターチまたはゼラチン等の
結合剤；コーンスターチ、ポテトスターチまたはカルボ
キシルメチルセルロースナトリウム等の崩壊剤；タルク
またはステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ならび
に、場合により、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤およ
び着香料等）と一緒に使用して、錠剤、粉末、顆粒また
はカプセルを作製することができる。
【０１１９】さらに、薬剤は、水系もしくは非水系溶剤
（例えば植物油や他の類似油、合成脂肪族系酸グリセリ
ド、高級脂肪族系酸のエステルまたはプロピレングリコ
ール等）中にこれらを溶解、懸濁または乳化し、場合に
より従来添加物（例えば可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳
化剤、安定化剤および保存剤）を添加することによっ
て、注射用調製物として製剤化してもよい。さらに薬剤
は、吸入により投与されるエアロゾル製剤に入れて使用
してもよい。本発明により同定された物質は、圧縮され
た許容可能な推進剤（例えばジクロロジフルオロメタ
ン、プロパン、窒素等）中に製剤化することができる。
あるいは、薬剤は様々な基剤（例えば乳化基剤や水溶性
基剤等）と混合して坐剤として調製してもよい。さら
に、本発明の同定物質は、坐剤として直腸内に投与する
ことができる。坐剤は、ココアバター、カーボワックス
およびポリエチレングリコールなどのビヒクル（体温で
溶け且つ室温では固化する）を含み得る。
【０１２０】持続放出性製剤用のインプラントは当分野
において周知である。インプラントは、生分解性もしく
は非生分解性高分子を用いて微小球、スラブ等として製
剤化される。例えば、乳酸および／グリコール酸のポリ
マーは、宿主による寛容性が高い侵食性ポリマーを形成
する。本発明の同定薬剤を含むインプラントは、薬剤の
局所濃度が身体の他の部分に比べて高くなるように、作
用部位の近くに設置することができる。シロップ、エリ
キシルおよび懸濁液等の、経口もしくは直腸内投与用の
単位用量剤形を提供することができる。この場合、各投
与ユニット（例えばティースプーン１杯分、テーブルス
プーン１杯分、ゲルカプセル、錠剤または坐剤等）は所
定量の本発明の組成物を含む。同様に、注射または静脈
内投与用の単位用量剤形は、滅菌水、食塩水、または他
の製薬上許容可能な担体中の溶液としての組成物中に本
発明の組成物を含み得る。本発明の新規な単位用量剤形
のための仕様は、使用される具体的な化合物、達成した
い効果、ならびに宿主中における各活性薬剤に関係する
薬理学的作用に応じて異なる。
【０１２１】薬学的に許容される賦形剤（例えばビヒク
ル、アジュバント、担体または希釈剤等）は一般に簡単
に入手可能である。さらに、薬学的に許容される補助剤
（例えばｐＨ調節および緩衝剤等、張度調節剤、安定化
剤、浸潤剤等）も、一般に簡単に入手可能である。
【０１２２】同定薬剤の治療的用量を、疾患または障害
を患う宿主に投与する。投与は、具体的な疾患に応じ
て、表面塗布または局所もしくは全身投与であってもよ
い。化合物は、適当な期間の間その疾患の進行が実質的
に抑えられるような有効用量で投与される。インビボで
使用する場合は、組成物は医師の指導にもとに獲得およ
び使用されるものとする。用量は使用される特定の薬剤
および製剤、疾患のタイプ、患者の状態等に応じて、副
作用を最小限に抑えつつその疾患もしくは症状を緩和す
るのに十分な量として選択される。治療は短期的なもの
（例えば外傷後の治療等）であっても長期的なもの（例
えば精神分裂病の予防または治療等）であってもよい。
【０１２３】本発明により同定されるＳＮＰを用いて、
関連する遺伝子の発現パターンおよびその生物の表現型
特徴（例えば疾患罹患性または薬物応答性）に関係のあ
る発現パターンを分析することができる。様々な組織に
おける発現パターンを決定し、遍在的な発現パターン、
組織特異的発現パターン、一時的発現パターン、および
様々な外的刺激（例えば化学物質または電磁放射等）に
より誘導される発現パターンを同定するために使用する
ことができる。このような決定は、その遺伝子および／
またはそのタンパク質産物の機能に関する情報を提供す
る。
【０１２４】また新しく同定された配列は、診断マーカ
ーとして（すなわち疾患疾患罹患性または薬物応答性な
どの表現型特徴を予測するために）使用することもでき
る。さらに、本発明の方法は、臨床実験のために集団を
等級別に分類するために使用することができる。したが
って、該遺伝子またはその断片は、テストされている生
物のゲノム中に同じ核酸配列が存在するか否かを決定す
るためのプローブとして用いることができる。さらに該
プローブは、その生物の特定の表現型特徴に相関性を有
し得るマーカーの発現レベルを決定するために、テスト
される生物の体内またはその一部（例えば特定の組織や
器官等）におけるＲＮＡもしくはｍＲＮＡレベルをモニ
ターするために用いることができる。同様に、該マーカ
ーは、免疫学的方法（ウェスタンブロットや放射線免疫
沈降法等）等の慣習的手法、または遺伝子産物に関係す
る活性を測定するための活性ベースのアッセイを用い
て、タンパク質レベルで分析することができる。さら
に、異なる遺伝的根拠を有する類似疾患の間で表現型が
明確に区別できない場合、本発明の方法を用いてその疾
患を正確に同定することができる。
【０１２５】また、本発明の方法をヒト以外の生物に対
して用いることができることも明白であろう。例えば、
その生物が動物である場合、本発明の方法は、例えば疾
患に対する耐性／もしくは疾患罹患性、環境耐性（ｅｎ
ｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、薬物
応答などに関係する遺伝子座を同定するために使用する
ことができる。またその生物が植物である場合、本発明
の方法は、疾患に対する耐性／もしくは疾患罹患性、環
境耐性、および／または除草剤耐性などに関係する遺伝
子座を同定するために使用することができる。
【０１２６】本発明は、記載された特定の方法論、プロ
トコール、細胞系、動物の種や属、ならびに試薬に限定
されず、様々である、ということを理解されたい。ま
た、本明細書中で使用される用語は、単に特定の実施形
態を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定
することを意図するものではなく、本発明の範囲は特許
請求の範囲によってのみ限定されるものとする。
【０１２７】データベース 本発明は、変異に関する情報、例えばＳＮＰ、ＳＮＰハ
プロタイプブロック、ＳＮＰハプロタイプパターンおよ
び情報提供ＳＮＰに関する情報を含むデータベースを含
む。幾つかの実施形態において、本発明のデータベース
は、１以上の表現型特性に関係のある１以上のハプロタ
イプパターンについての情報を含み得る。またデータベ
ースは、所与の変異に関する情報、例えば変異が生じる
全体的な（ｇｅｎｅｒａｌ）ゲノム領域についての記述
的情報（例えば変異が既知の遺伝子の中に位置するか否
か、近くに既知の遺伝子、遺伝子相同体または調節領域
があるか否か等）等も含み得る。
【０１２８】本発明のデータベースに含まれ得る他の情
報には、ＳＮＰ配列情報、ＳＮＰハプロタイプパターン
について分析される組織サンプルの臨床状態に関する記
述的情報、またはそのサンプルが由来する患者の臨床状
態が含まれるが、これらに限定されない。データベース
は、異なるパーツ、例えば変異データベース、ＳＮＰデ
ータベース、ＳＮＰハプロタイプブロックもしくはＳＮ
Ｐハプロタイプパターンデータベース、および情報提供
ＳＮＰデータベース等を含むように設計することができ
る。データベースの構成および構築法は広く入手可能で
あり、例えばＡｋｅｒｂｌｏｍら（１９９９）、米国特
許第５，９５３，７２７号（本明細書中に参考として全
て組み込まれる）を参照されたい。
【０１２９】本発明のデータベースは、外側または外部
のデータベースにリンクされていてもよい。図９は、該
データベースに適しおよび本発明のソフトウェアを実行
するコンピュータネットワークの例を示す。コンピュー
タワークステーション９０２は、イーサネット（登録商
標）９０５等のローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）
を介してアプリケーション／データサーバ９０６に接続
される。プリンタ９０４はワークステーションに直接ま
たはイーサネット９０５に接続されていてもよい。ＬＡ
Ｎは、ゲートウェイサーバ９０７（ＷＡＮ９０８とＬＡ
Ｎ９０５との間でファイアウォールとしても機能し得
る）を介してインターネット９０８などの広域ネットワ
ーク（ＷＡＮ）に接続され得る。好適な実施形態におい
て、ワークステーションは、インターネット９０８を介
してＴｈｅ ＳＮＰ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ （ＴＳ
Ｃ）またはｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ
ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａ
ｔｉｏｎ ９０９等の外部のデータソースと通信れてい
てもよい。
【０１３０】任意の適当なコンピュータプラットフォー
ムを用いて、ＳＮＰハプロタイプブロックもしくはパタ
ーン、関連する表現型、そのデータベースの中の他の情
報または入力された情報の間で必要な比較を行うことが
できる。例えば、様々な製造業者から多数のコンピュー
タワークステーションが入手可能であり、例えばＳｉｌ
ｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓから入手可能なものがあ
る。また、クライアント・サーバ環境、データベースサ
ーバおよびネットワークも広く入手可能であり、本発明
のデータベースに適したプラットフォームである。
【０１３１】また、本発明のデータベースは、個体にお
けるＳＮＰハプロタイプパターンを同定する情報を提供
するために用いることができ、このように提供された情
報は、その個体の１以上の表現型特性を予測するために
用いることができる。このような方法を用いて、個体の
疾患に対する罹患性／抵抗性および／または薬物応答を
予測することができる。さらに、本発明のデータベース
は、本発明の変異に関係がある１以上の遺伝子の発現レ
ベルに関する情報を含み得る。
【０１３２】以下の実施例は、本発明の具体的な実施形
態を説明するものであり、材料および方法は本発明を例
示するものであり、本発明の範囲を限定するものではな
い。
【０１３３】（実施例１） 体細胞ハイブリッドの調製 体細胞遺伝学における標準的な方法を用いて、ヒトＤＮ
Ａ鎖（染色体）を分離して二倍体の状態から一倍体の状
態とした。この場合、チミジンキナーゼ遺伝子について
野生型である二倍体ヒトリンパ芽球細胞系を、チミジン
キナーゼ遺伝子中に突然変異を含む二倍体ハムスター線
維芽細胞系に融合した。得られた細胞の部分集団は、ヒ
ト染色体を含むハイブリッド細胞であった。１０％ウシ
胎児血清（ＦＢＳ）＋１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ＋１０％
グルタミンを加えた１０ｍｌ ＤＭＥＭを含む遠心分離
管の中に、ハムスター細胞系Ａ２３細胞をピペッティン
グし、５分間１５００ｒｐｍにて遠心分離し、５ｍｌの
ＲＰＭＩ中に再懸濁し、１５ｍｌのＲＰＭＩ培地を含む
組織培養フラスコ中にピペッティングした。リンパ芽球
細胞を３７℃にてコンフルエントになるまで増殖させ
た。同時に、１５％ＦＢＣＳ＋１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ
＋１０％グルタミンを加えた１０ｍｌ ＲＰＭＩを含む
遠心分離管の中に、ヒトリンパ芽球細胞をピペッティン
グし、５分間１５００ｒｐｍにて遠心分離し、５ｍｌの
ＲＰＭＩ中に再懸濁し、１５ｍｌのＲＰＭＩを含む組織
培養フラスコ中にピペッティングした。リンパ芽球細胞
を３７℃にてコンフルエントになるまで増殖させた。
【０１３４】Ａ２３ハムスター細胞を調製するために、
増殖培地を吸引し、細胞を１０ｍｌのＰＢＳで濯いだ。
次に細胞を２ｍｌのトリプシンで処理し、新しい培地
（ＨＡＴを含まないＤＭＥＭ）を含む３〜５個のプレー
トに分け、３７℃にてインキュベートした。培地を遠心
分離管に移し、５分間１５００ｒｐｍにて遠心分離し、
増殖培地を吸引し、細胞を５ｍｌのＲＰＭＩ中に再懸濁
し、細胞１〜３ｍｌを、２０ｍｌのＲＰＭＩを含む２つ
のフラスコにピペッティングすることにより、リンパ芽
球細胞を調製した。
【０１３５】細胞融合を行うために、約８〜１０×１０
6個のリンパ芽球細胞を１５００ｒｐｍにて５分間遠心
分離した。次に、細胞をＤＭＥＭ中に再懸濁し、再びこ
れらを遠心分離してからＤＭＥＭを吸引することによ
り、細胞ペレットをＤＭＥＭで濯いだ。次にリンパ芽球
細胞を５ｍｌの新しいＤＭＥＭ中に再懸濁した。受容者
であるＡ２３ハムスター細胞をコンフルエントになるま
で増殖させ、融合する３〜４日前に分裂させ、この時点
で５０〜８０％コンフルエントであった。古い培地を除
去し、細胞をＤＭＥＭで３回濯ぎ、トリプシン処理し、
最後に５ｍｌのＤＭＥＭに懸濁した。リンパ芽球細胞を
受容者であるＡ２３細胞上にゆっくりピペッティング
し、合わせた培養物をゆっくりかき混ぜてから３７℃に
て１時間インキュベートした。インキュベーション後、
Ａ２３細胞から培地を静かに吸引し、片手でプレートを
回しながらプレートのエッジをピペットに付けてＰＥＧ
をプレートにゆっくり加えることにより、２ｍｌのＰＥ
Ｇ１５００（室温）を加えた。プレートを１回転させる
間に全てのＰＥＧを加えるのに約１分かかった。次に、
プレートをゆっくり回しながら８ｍｌのＤＭＥＭをプレ
ートのエッジに加えた。細胞からＰＥＧ／ＤＭＥＭ混合
物を静かに吸引した後、８ｍｌのＤＭＥＭを用いて細胞
を濯いだ。このＤＭＥＭを除去し、１０ｍｌの新鮮なＤ
ＭＥＭを加えて、細胞を３７℃にて３０分間インキュベ
ートした。細胞から再びＤＭＥＭを吸引し、１０％ Ｆ
ＢＣＳおよび１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを加えた１０ｍｌ
のＤＭＥＭを細胞に加えた後、一晩インキュベートさせ
た。
【０１３６】インキュベーション後、培地を吸引し、細
胞をＰＢＳで濯いだ。次に細胞をトリプシン処理し、各
プレートに約１００，０００細胞が入るように、選択培
地（１０％ ＦＢＳ＋１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ＋１×Ｈ
ＡＴを加えたＤＭＥＭ）を含む複数のプレートに分け
た。プレートに入れた後３日目に培地を取り替えた。コ
ロニーが肉眼で見えるようになったら（９〜１４日目）
コロニーを取り出して２４ウェルプレートに入れた。取
り出したコロニーが５日以内にコンフルエントになった
ら、そのコロニーは健全であるとみなされ、細胞をトリ
プシン処理して６ウェルプレートに移した。
【０１３７】６ウェルプレート培養物から得た細胞か
ら、ＤＮＡおよびストックハイブリッド細胞培養物を調
製した。細胞をトリプシン処理し、１０ｍｌの選択培地
を含む容量１００ｍｍのプレートとエッペンドルフ試験
管とに分けた。試験管内の細胞をペレット化し、２００
μｌのＰＢＸ中に再懸濁し、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡミニ
キットを用いてスピンカラム１つあたり細胞５００万未
満の濃度でＤＮＡを単離した。該１００ｍｍプレートを
コンフルエントになるまで増殖させ、細胞を培養し続け
るかまたは冷凍した。
【０１３８】（実施例２） 一倍体ハイブリッドの選択 単一チップのハイブリダイゼーションにおいて１４９４
個のマーカーを評点することができる、Ａｆｆｙｍｅｔ
ｒｉｘ， ＨｕＳＮＰ遺伝子チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒ
ｉｘ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， Ｃ
Ａ， ＨｕＳＮＰマッピングアッセイ、試薬キットおよ
びユーザマニュアル， Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｐａｒ
ｔ Ｎｏ． ９００１９４）を用いて、各ハイブリッド
中のヒト染色体の存在、不在および二倍体／一倍体状態
の評点を行った。ＨｕＳＮＰチップハイブリダイゼーシ
ョンアッセイを用いて、対照としてハムスターおよびヒ
ト二倍体リンパ芽球細胞系をスクリーニングした。親リ
ンパ芽球二倍体細胞系中でヘテロ接合性であるＳＮＰ
を、各融合細胞系中における一倍体状態（ｈａｐｌｏｉ
ｄｙ）について評点した。「Ａ」および「Ｂ」は各ＳＮ
Ｐ位置における二者択一の変異体であると仮定する。親
二倍体細胞系において「ＡＢ」ヘテロ接合性として存在
するマーカーを、ハイブリッド中において「Ａ」または
「Ｂ」（半接合性）として存在する同じマーカーと比較
することにより、各ハイブリッド系において一倍体状態
であるヒトＤＮＡ鎖を決定した。
【０１３９】図１１は、２種類のヒト／ハムスター細胞
ハイブリッド（ハイブリッド１およびハイブリッド２）
を、ヒト第２１番染色体上の選択されたマーカーについ
てテストした結果を示す。一列目は、ＨｕＳＮＰチップ
マーカーの名称を示す。２列目は、ハムスター細胞核酸
（融合なし）をＨｕＳＮＰチップとのハイブリダイゼー
ションに用いた場合にシグナルが得られたか否かを示
す。予想通り、ハムスター細胞サンプル中のどのマーカ
ーにもシグナルは見られなかった。三列目は、二倍体親
ヒトリンパ芽球細胞系ＣＰＤ１７において各マーカー毎
にどの変異体が検出されたか（「Ａ」、「Ｂ」または
「ＡＢ」）を示す。幾つかのケースでは、Ａ変異体のみ
が存在し、幾つかのケースではＢ変異体のみが存在し、
また幾つかのケースではＣＰＤ１７細胞がこれらの変異
体についてへテロ接合性（「ＡＢ」）であった。最後の
二列は、２種類のヒト／ハムスターハイブリッド（ハイ
ブリッド１およびハイブリッド２）から得た核酸サンプ
ルをＨｕＳＮＰチップとハイブリダイズさせた結果を示
す。親ＣＰＤ１７細胞系中にＡ変異体のみが存在する場
合において、Ａ変異体のみが融合体に伝えられたことに
留意されたい。親ＣＰＤ１７細胞系においてＢ変体のみ
が存在する場合は、Ｂ変異体のみが融合体に伝えられ
た。ＣＰＤ１７細胞系がヘテロ接合性である場合は、あ
る融合クローンにはＡ変異体は伝えられ、他の融合クロ
ーンにはＢ変異体が伝えられた。ただし、しばしば、こ
の融合プロセスから得られるハイブリッド細胞系の中に
おいて染色体の一部しか存在しないこと、幾つかのハイ
ブリッドは幾つかのヒト染色体もしくはその一部につい
て二倍体であること、幾つかのハイブリッドは他のヒト
染色体もしくはその一部について一倍体であること、な
らびに幾つかのハイブリッドは幾つかの染色体のいずれ
の変異体も持たない場合があること、を理解されたい。
特定のヒト染色体（例えば第２１番染色体）の１つの変
異体のみを含むハイブリッドを選択して分析した。さら
に好ましくは、（染色体の一部のみではなく）ある染色
体全体を含むハイブリッドを選択して分析した。
【０１４０】（実施例３） 長領域ＰＣＲ（ｌｏｎｇ−
ｒａｎｇｅ ＰＣＲ） ハムスター／ヒト細胞ハイブリッドから得たＤＮＡを用
いて長領域ＰＣＲアッセイを行った。長領域ＰＣＲアッ
セイは当分野において一般公知であり、例えばベーリン
ガー・マンハイム社のＥｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｒａｎ
ｇｅ ＰＣＲキットの標準的な長領域ＰＣＲプロトコー
ル（参考としてまたは全ての目的のために本明細書中に
組み込まれる）に記載されている。
【０１４１】増幅反応に使用されるプライマーを、以下
の通り設計した：所与の配列、例えば第２１番染色体上
の２３×１０6塩基のコンティグを、ゲノム中で繰返さ
れる配列（例えばＡｌｕおよびＬｉｎｅエレメントな
ど）を認識する当分野で公知のソフトウェアプログラム
（本明細書中において「リピート・マスカー（ｒｅｐｅ
ａｔ ｍａｓｋｅｒ）」と呼ぶ）に入力した（Ａ．Ｆ．
Ａ． ＳｍｉｔおよびＰ．Ｇｒｅｅｎ， ｗｗｗ． ｇ
ｅｎｏｍｅ． ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ． ｅｄｕ／ｕｗ
ｇｃ／ａｎａｌｙｓｉｓｔｏｏｌｓ／ｒｅｐｅａｔｍａ
ｓｋを参照されたい。これは本明細書中に参考として組
み込まれる）。このプログラムにより、反復配列の各特
定のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ）を「Ｎ」に置
換することにより、反復配列を「マスキング」した。次
に、この反復マスキング置換を行った後の配列の出力結
果を、市販されているプライマー設計プログラム（Ｏｌ
ｉｇｏ ６．２３）に供給し、長さが３０ヌクレオチド
を超え且つ融解温度が６５℃を超えるプライマーを選択
した。次に、Ｏｌｉｇｏ ６．２３から出力された設計
されプライマーを、ゲノムの所与の領域をＰＣＲ増幅し
且つ隣接するＰＣ産物と重複する部分が最も少ないプラ
イマー対を「選択する」プログラムに供給した。市販さ
れているプロトコールおよびこのプライマー設計を用い
た長領域ＰＣＲの成功率は少なくとも８０％であり、ま
たヒト染色体のある部分については９５％を超える成功
率が得られた。
【０１４２】長領域ＰＣＲの１つの例示的なプロトコー
ルは、ベーリンガー・マンハイム社のＥｘｐａｎｄ Ｌ
ｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、カ
タログＮｏ．１６８１ ８３４、１６８１ ８４２また
は１７５９ ０６０を用いる。この手法では、各５０μ
ＬのＰＣＲ反応に２つのマスターミックス（ｍａｓｔｅ
ｒ ｍｉｘ）を要する。ある具体的な実施例では、各反
応につき、氷上の１．５ｍｌの微量遠心機試験管の中で
Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １を調製した。Ｍａｓｔｅｒ
Ｍｉｘ １は、最終体積で１９μＬのＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｇｒａｄｅ Ｗａｔｅｒ（Ｂｉｏ
Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、カタログＮｏ．１６−００１
Ｙ）、２．５μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰセット（ｄＡＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含む、各１０
ｍＭ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ
Ｎｏ．１０２９７−０１８）（各ｄＮＴＰの最終濃度は
４００μＭ）、および５０ｎｇのＤＮＡ鋳型を含む。
【０１４３】全ての反応のためにＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
２を調製し、氷上に維持した。各ＰＣＲ反応につき、
Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ２は最終体積で２５μＬのＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｇｒａｄｅ Ｗａｔ
ｅｒ（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、２２．５０ｍＭ
ＭｇＣｌ2を含む５μＬの１０×ＰＣＲ緩衝液３（Ｓ
ｉｇｍａ、カタログＮｏ． Ｍ １０２８９）、２．５
μＬの１０ｍＭ ＭｇＣｌ2（最終ＭｇＣｌ2濃度は２．
７５ｍＭ）、および０．７５μＬの酵素ミックス（最後
に加える）を含む。
【０１４４】予め混合した６μＬのプライマー（２．５
μＬのＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １を含む）を適当な試験
管に加えた後、２５μＬのＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ２を
各試験管に加えた。試験管にキャップをし、混合し、短
時間遠心分離をしてから氷に戻した。この時点で、以下
のプログラムに従ってＰＣＲサイクルを開始した：ステ
ップ１＝９４℃で３分間鋳型を変性させる；ステップ２
＝９４℃で３０分間；ステップ３＝使用したプライマー
に適した温度で３０秒間アニーリングする；ステップ４
＝６８℃にて生成物１ｋｂあたり１分間伸長を行う；ス
テップ５＝ステップ２〜４までを３８回繰返し、全部で
３９サイクル行う；ステップ６＝９４℃にて３０秒間；
ステップ７＝３０秒間アニーリングする；ステップ８＝
６８℃にて生成物１ｋｂあたり１分間＋さらに５分間伸
長を行う；およびステップ９＝４℃に保つ。あるいは、
２段階ＰＣＲを行ってもよい：ステップ１＝９４℃にて
３分間鋳型を変性させる；ステップ２＝９４℃にて３０
秒間；ステップ３＝６８℃にて生成物１ｋｂあたり１分
間アニーリングおよび伸長を行う；ステップ４＝ステッ
プ２〜３を３８回繰返し、全部で３９サイクル行う；ス
テップ５＝９４℃にて３０秒間；ステップ６＝６８℃に
て生成物１ｋｂあたり１分間＋さらに５分間アニーリン
グおよび伸長を行う；およびステップ７＝４℃に保つ。
【０１４５】ヒト第１４番および２２番染色体上の様々
な領域の長領域ＰＣＲ増幅反応の結果を、臭化エチジウ
ムで染色したアガロースゲル上で可視化した（図１
２）。本発明の長領域ＰＣＲ増幅法は、平均サイズが約
８ｋｂである増幅断片を常套的に生成し、ゲノム領域の
増幅に失敗したのは極めて稀なケースのようであった
（第２２番染色体ゲル上のＧ１１を参照されたい）。
【０１４６】（実施例４） ウェハの設計、製造、ハイ
ブリダイゼーションおよび走査 オリゴヌクレオチドアレイ（チップまたはウェハ）に入
れるオリゴヌクレオチドプローブのセットは、問い合わ
せするヒトＤＮＡ鎖配列に基づいて決定した。該オリゴ
ヌクレオチド配列は、一般的に利用可能なデータベース
に報告されているコンセンサス配列に基づいて決定し
た。プローブ配列を決定したら、コンピュータアルゴリ
ズムを用いて、プローブ含有アレイを製造するために使
用される写真平版マスク（ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａ
ｐｈｉｃ ｍａｓｋ）を設計した。アレイは、固相化学
合成を写真平版製造手法と組み合わせた光誘導化学合成
プロセスにより製造した。例えば国際特許出願公開ＷＯ
９２／１００９２号または米国特許第５，１４３，８５
４号；第５，３８４，２６１号；第５，４０５，７８３
号；第５，４１２，０８７号；第５，４２４，１８６
号；第５，４４５，９３４号；第５，７４４，３０５
号；第５，８００，９９２号；第６，０４０，１３８
号；および第６，０４０，１９３号（あらゆる目的のた
めに、本明細書中に参考として全て組み込まれる）を参
照されたい。一連の写真平版マスクを用いてガラス基板
（ウェハ）上に露光部位を画定した後、特定の化学合成
ステップを行い、このプロセスで、オリゴヌクレオチド
プローブの高密度領域をアレイ上に作製した（各プロー
ブは所定の位置にある）。多数のプローブ領域を同時且
つ平行して合成した。
【０１４７】この合成プロセスでは、写真平版マスクに
光を通過させて非保護領域中の化学基をこの光により活
性化させることにより、光保護されたガラス基板を選択
的に照射した。次に、選択的に活性化された基板ウェハ
を選択したヌクレオチドと共にインキュベートし、ウェ
ハ上の活性化位置において化学結合を生じさせた。結合
が起こったら、新しいマスクパターンをあてがい、他の
選択されたヌクレオチドを用いて結合ステップを繰返し
た。所望のプローブセットが得られるまでこのプロセス
を繰返した。１つの具体的な実施例において、１３番目
の塩基が問い合わせしようとする塩基である場合、２５
−ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブを用いた。４つの
プローブを用いて、各配列中に存在する各ヌクレオチド
に問い合わせしたところ、１つのプローブが該配列に相
補的であり、３つのミスマッチプローブは、１３番目の
塩基を除いて該相補的プローブと同じであった。幾つか
のケースにおいて、少なくとも１０×１０6個のプロー
ブが各アレイ上に存在した。
【０１４８】アレイを製造したら、このアレイを、ハム
スター／ヒト細胞ハイブリッドに対して行った長領域Ｐ
ＣＲ反応により得た生成物にハイブリダイズさせた。分
析しようとするサンプルを標識し、該アレイと共にイン
キュベートして、該サンプルをウェハ上のプローブにハ
イブリダイズさせた。
【０１４９】ハイブリダイゼーション後、アレイを共焦
高速スキャナ（ｃｏｎｆｏｃａｌｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏ
ｒｍａｎｃｅ ｓｃａｎｎｅｒ）に入れて、ハイブリダ
イゼーションのパターンを検出した。そのサンプルのＰ
ＣＲ産物中に既に組み込まれた蛍光レポーター基（プロ
ーブに結合した）から発せられる光として、ハイブリダ
イゼーションデータを収集した。サンプル中に存在する
ウェハ上のプローブに相補的な配列は、ミスマッチを含
むこれらの配列に比べ、より強力にウェハにハイブリダ
イズし、またより強力なシグナルを生成した。アレイ上
の各プローブの配列および位置は分かっているので、相
補性により、プローブアレイに加えたサンプル核酸にお
ける変異の正体を同定した。本発明で用いられるスキャ
ナおよび走査手法は、当業者には公知であり、例えば米
国特許第５，９８１，９５６号（マイクロアレイチップ
について）、米国特許第６，２６２，８３８号および米
国特許第５，４５９，３２５に開示されている。さら
に、２０００年８月３日に出願された米国特許仮出願番
号第６０／２２３，２７８号および米国特許仮出願番号
第６０／２２３，２７８号を基に優先権主張し２００１
年８月３日に出願された非仮出願（全ウェハ走査のため
のスキャナおよび手法について）もまた、全ての目的の
ために参考として本明細書中に全て組み込まれる。
【０１５０】（実施例５） ヒト第２１番染色体上のＳ
ＮＰハプロタイプの決定 アフリカ人、アジア人およびカフカス人の染色体の第２
１番染色体の２０個の独立したコピーを、ＳＮＰ発見の
ためおよびハプロタイプ構造について分析した。各個体
から得た第２１番染色体の２つのコピーを、げっ歯類／
ヒト体細胞ハイブリッド手法（図１０）を用いて物理的
に分離した（上記記載）。この分析のための基準配列
は、３２，３９７，４３９塩基からなるヒト第２１番染
色体ゲノムＤＮＡ配列からなるものであった。この基準
配列の反復配列をマスキングし、得られた２１，６７
６，８６８塩基（６７％）のユニーク配列を、高密度オ
リゴヌクレオチドアレイを用いて変異について分析し
た。８つのユニークオリゴヌクレオチド（各々は２５塩
基長）を用いて、ユニークサンプル第２１番染色体塩基
の各々（合計で１．７×１０8個の異なるオリゴヌクレ
オチド）を問い合わせした。これらのオリゴヌクレオチ
ドを、過去に記載されたタイリング法（ｔｉｌｉｎｇ
ｓｔｒａｔｅｇｙ）（Ｃｈｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
７４：６１０（１９９６））を用いて、全部で８個の異
なる設計のウェハに分配した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，
Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）より購
入した５インチ四方のガラスウェハ上で、オリゴヌクレ
オチドの光誘導化学合成を行った。
【０１５１】３２．４Ｍｂの第２１番染色体の連続的Ｄ
ＮＡにまたがる平均１０ｋｂ長の、重複が最少である３
２５３個の長領域ＰＣＲ（ＬＲＰＣＲ）産物を作成する
ために、ユニークオリゴヌクレオチドを設計し、上記の
ように調製した。各ウェハのハイブリダイゼーション毎
に、対応するＬＲＰＣＲ産物をプールし、Ｑｉａｇｅｎ
チップ５００（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。３７
μｌの１０×Ｏｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ緩衝液ＰＬＵＳ
（Ｐｒｏｍｅｇａ）および全量３７０μｌのＤＮＡアー
ゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）１ユニットを用いて、３７℃にて１０分間
かけて、全部で２８０μｇの精製ＤＮＡを断片化した
後、９９℃にて１０分間加熱により不活化した。５００
ユニットのＴｄｔ（ベーリンガー・マンハイム社）およ
び２０ｎｍｏｌのビオチン−Ｎ６−ｄｄＡＴＰ（ＤｕＰ
ｏｎｔ ＮＥＮ）を用いて３７℃にて９０分間かけて断
片化生成物の末端を標識し、９５℃にて１０分間加熱す
ることにより不活化した。標識したサンプルを、１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８）、３Ｍ塩化テトラメチ
ルアンモニウム、０．０１％ Ｔｘ−１００、１０μｇ
／ｍｌ変性ニシン精子ＤＮＡを含むウェハ（ウェハ１つ
あたり全量１４ｍｌ）に５０℃にて１４〜１６時間ハイ
ブリダイズさせた。ウェハを４×ＳＳＰＥ中で手早く濯
ぎ、６×ＳＳＰＥで１０分間ずつ３回洗浄し、ストレプ
トアビジンＲ−フィコエリトリン（ＳＡＰＥ、５ｎｇ／
ｍｌ）を用いて室温にて１０分間染色した。ストレプト
アビジンに対する抗体（１．２５ｎｇ／ｍｌ）で染色す
ることにより、およびＳＡＰＥを用いた染色ステップを
繰返すことにより、シグナルを増幅した。
【０１５２】１つのウェハ上に存在する塩基に対応する
ＰＣＲ産物をプールし、１回の反応としてウェハにハイ
ブリダイズさせた。１６０個のウェハ上で合計３．４×
１０ 9個のオリゴヌクレオチドを合成し、ヒト第２１番
染色体の２０個の独立コピーをＤＮＡ配列変異について
走査した。長範囲ＰＣＲを用いてげっ歯類／ヒトハイブ
リッド細胞系から各ユニーク第２１番染色体を増幅し
た。ＬＲＰＣＲアッセイは、Ｏｌｉｇｏ６．２３プライ
マー設計ソフトウェアと高〜中程度のストリンジェンシ
ーパラメータとを用いて設計した。得られたプライマー
は、典型的には３０ヌクレオチド長であり、融解温度は
６５℃を超えるものであった。アンプリコンサイズの範
囲は３ｋｂ〜１４ｋｂであった。その染色体全体のプラ
イマーデータベースを作製し、ソフトウェア（ｐＰｃｉ
ｋｅｒ）を用いて、隣同士のアンプリコンの間の重複が
最少であり第２１番染色体配列を最大限にカバーする非
冗長プライマーの最少セットを選択した。あるいは、本
明細書中の実施例３に記載したプライマー選択法を用い
た。若干の変更を加えたＥｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅ
ｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハ
イム社）を用いて、ＬＲＰＣＲ反応を行った。特注の共
焦スキャナを用いてウェハを走査した。
【０１５３】パターン認識アルゴリズムを用いてハイブ
リダイゼーションの変化としてＳＮＰを検出した。過去
に記載されたアルゴリズムの組合せ（Ｗａｎｇら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２８０：１０７７（１９９８））を用い
て、変化したハイブリダイゼーションパターンに基づい
てＳＮＰを検出した。２０個の染色体からなる該サンプ
ルにおいて、全部で３５，９８９個のＳＮＰが同定され
た。これらのヒト多型の位置および配列は、ＧｅｎＢａ
ｎｋのＳＮＰｄｂに寄託されている。ジデオキシ配列決
定を用いて、元のＤＮＡサンプル中のこれらのＳＮＰの
うちの２２７個の無作為に選んだサンプルを評価し、分
析したＳＮＰのうち２２０個（９７％）を確認した。こ
の３％という低い偽陽性ＳＮＰ率を達成するためには、
ウェハ上でのＳＮＰ検出のために、高い偽陰性率をもた
らすストリンジェント閾値が必要であった。ウェハ上に
存在する全ての塩基の約６５％は、ＳＮＰ検出で使用す
るのに十分高品質なデータを生成し、３５％は偽陰性と
して破棄した。分析した全てのサンプルにおいて一貫し
て失敗した長範囲ＰＣＲは、この３５％の偽陰性率のう
ちの１５％を占める。残りの２０％の偽陰性は、高品質
データを生成しない塩基（１０％）と分析した第２０番
染色体の画分のみに高品質データを生成する塩基（１０
％）との間に分布している。一般に、ある塩基が高品質
データを生成するか否かを指令するのはその塩基の配列
における前後関係である。全塩基のうちの約２０％が一
貫して質の悪いデータをもたらすという知見は、５００
塩基の１回のジデオキシ配列決定読取りにおいて塩基の
約３０％が信頼性の高いＳＮＰ検出にとっては低過ぎる
品質スコアを有するという知見に非常によく似ている
（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ４０７：５
１３（２０００））。分析されるサンプルのうちの限ら
れた数しか所与の塩基についての高品質データを生成し
ない場合、より頻繁に見られるＳＮＰに比べて稀少なＳ
ＮＰを発見するための能力は格段に低下する。その結
果、この方法によるＳＮＰ発見は、共通ＳＮＰにとって
有利なものである。
【０１５４】図１３Ａは、全体的に多様な染色体のサン
プル中で発見された３５，９８９個全てのＳＮＰのマイ
ナー対立遺伝子頻度の分布を表す。ヌクレオチド多様性
の２つの測度（π＝１つの部位あたりの平均ヘテロ接合
性；およびθ＝集団突然変異パラメータ（ｔｈｅ ｐｏ
ｐｕｌａｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｐａｒａｍｅｔ
ｅｒ））を用いて、遺伝学的変異（サンプル中の染色体
の数について正規化した）を推定した（Ｈａｒｔｌおよ
びＣｌａｒｋ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆＰｏｐｕ
ｌａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （Ｓｉｎａｕｅｒ，
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ， １９９７）を参照さ
れたい）。配列決定が完了したゲノム第２１番染色体Ｄ
ＮＡの３２，３９７，４３９塩基を２００，０００塩基
対セグメントに分け、各セグメントにおけるＳＮＰ発見
に使用される高品質塩基対を調べた。これらの塩基の観
察されたヘテロ接合性を用いて、各セグメント毎に平均
ヌクレオチド多様性（π）を算出した。全データセット
の平均ヌクレオチド多様性の推定（π＝０．０００７２
３およびθ＝０．０００７９８）ならびにヌクレオチド
多様性の分布（第２１番染色体の連続的な２００，００
０塩基対ｂｉｎｓで測定）（図１３）は、過去に記載さ
れた値の範囲内であった（Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ ＳＮＰ Ｍａｐ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕ
ｐ， Ｎａｔｕｒｅ ４０９：９２８−３３（２００
１））。
【０１５５】Ｔｈｅ ＳＮＰ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ
（ＴＳＣ）により発見された第２１番染色体の１５，５
４９個のＳＮＰの重複の度合いを、この調査で発見され
たＳＮＰと比較した。ＴＳＣ ＳＮＰのうち、５，０８
７個は反復ＤＮＡの中にあることが分かり、ウェハ上で
タイリングされなかった。残りの１０，４６２個のＴＳ
Ｃ ＳＮＰのうち、４７０５個（４５％）を同定した。
θの推定値は、分析した連続的ＤＮＡ配列の１６２ ２
００−ｋｂ ｂｉｎｓの１２９についてπ□の推定値よ
りも大きいことが分かった。この差は、近年のヒト人口
の増大と一致し、ヒト遺伝子におけるヌクレオチド多様
性の最近の研究結果と類似している（Ｓｔｅｐｈｅｎ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：４８９（２００１））。
この発見された量のヌクレオチド多様性の場合、４３％
のシングルトンが得られるというニュートラルモデルの
期待値（ＦｕおよびＬｉ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３
３：６９３（１９９３））と比較して、ＳＮＰのうち１
１，６０３個（３２％）が、サンプル中において１回観
察されるマイナー対立遺伝子（シングルトン）を有して
いたことが分かった。観測値と期待値との差は、上記の
ようなこの調査における共通ＳＮＰに比べて稀少ＳＮＰ
を同定する能力が低下したことによるものと思われる。
【０１５６】全部で、３２．４Ｍｂのヒトゲノム中に存
在すると推定される１０％以上の対立遺伝子頻度を有す
る５３，０００個の共通ＳＮＰのうち４７％が同定され
た。これは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＳＮＰ Ｍ
ａｐｐｉｎｇ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐおよびｔｈ
ｅ ＳＮＰ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍにより作製されたコ
レクション中に存在する全てのこのような共通ＳＮＰの
うちの１８〜２０％の推定に匹敵する。網羅度の差は、
本調査がＳＮＰ発見のためにより多数の染色体を用いた
ことにより説明される。この知見の反復可能性（ｒｅｐ
ｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ）を評価するために、元のサンプ
ルセットと同じ多様性パネルから得た第２１番染色体の
さらに１９個のコピーを含む１つのウェハ設計につい
て、ＳＮＰ発見を行った。２つのサンプルセットを用い
て、全部で７１８８個のＳＮＰを同定した。サンプルの
一方のセットで発見された全てのＳＮＰのうち平均で６
６％が第２セットで発見されたが、これは、過去の知見
と一致するものであった（Ｍａｒｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔ． ２７：３７１（２００１）およびＹａ
ｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２６：１３（２
０００））。予想通り、第２のサンプルセットにおける
ＳＮＰの反復（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）の失敗は、対立遺
伝子頻度に大きく依存する。一方のサンプルセットにお
いて２回以上存在するマイナーな対立遺伝子を有するＳ
ＮＰの８０％は第２のサンプルセットにおいても発見さ
れたのに対して、１回だけ存在するマイナー対立遺伝子
を有するＳＮＰは第２サンプルセットにおいてその３２
％しか発見されないことが分かった。これらの知見は、
２回以上現れるマイナー対立遺伝子を有する該コレクシ
ョン中の２４，０４７個のＳＮＰは、異なる総合的サン
プルにおいて反復率が高いこと、およびこのＳＮＰセッ
トは共通総合ハプロタイプ（ｃｏｍｍｏｎ ｇｌｏｂａ
ｌ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）を定義するのに有用であるこ
とを示唆する。ＳＮＰ発見の過程において、３以上の対
立遺伝子を有すると思われる３３９個のＳＮＰを同定し
た。これらのＳＮＰはこの分析に含めなかった。
【０１５７】異なるサンプル中におけるＳＮＰの反復可
能性に加え、ＳＮＰのあるコレクションの中の連続的Ｓ
ＮＰ間の距離は、意味深いハプロタイプ構造を画定する
ために非常に重要である。ハプロタイプブロック（数ｋ
ｂという短いものであってもよい）は、あるコレクショ
ンの中の連続的ＳＮＰ間の距離が実際のハプロタイプブ
ロックのサイズに比べて大きい場合、認識されない場合
がある。ＳＮＰ発見プロセスに反復配列を含めなかった
が、この調査におけるＳＮＰのコレクションは、染色体
全体に非常に均一に分布されていた。図１３Ｃは、完了
した第２１番染色体ＤＮＡ配列の３２，３９７，４３９
塩基にまたがるＳＮＰ網羅度の分布を示す。インターバ
ルは連続的ＳＮＰ間の距離である。全ＳＮＰセットでは
全部で３５，９８８個のインターバルがあり、共通ＳＮ
Ｐ（すなわちサンプル中に２回以上存在するマイナー対
立遺伝子を有するＳＮＰ）セットでは全部で２４，０４
６個のインターバルがある。連続的ＳＮＰ間の平均距離
は、全てのＳＮＰを考慮した場合は９００塩基であり、
２４，０４７個の共通ＳＮＰのみを考慮した場合は１３
００塩基であった。この共通ＳＮＰセットの場合、ゲノ
ムＤＮＡ（反復ＤＮＡを含む）中の連続的ＳＮＰ間のイ
ンターバルのうち９３％は４０００塩基以下であった
（再び図１３Ｃを参照されたい）。
【０１５８】二倍体データからのハプロタイプブロック
またはパターンの作製は、任意の２つのヘテロ接合性Ｓ
ＮＰの対立遺伝子間の関係を直接観察することができな
いため、複雑になっている。第２１番染色体の２つのコ
ピーおよび２つの対立遺伝子ＡおよびＧを１つの第２１
番染色体ＳＮＰに、ならびに２つの対立遺伝子Ａおよび
Ｇを第２の第２１番染色体ＳＮＰに有する個体を考え
る。このようなケースでは、第２１番染色体の一方のコ
ピーが第１ＳＮＰに対立遺伝子Ａおよび第２ＳＮＰに対
立遺伝子Ａを含み且つ第２１番染色体の他方のコピーが
第１ＳＮＰに対立遺伝子Ｇおよび第２ＳＮＰに対立遺伝
子Ｇを含むか否か、あるいは第２１番染色体の一方のコ
ピーが第１ＳＮＰに対立遺伝子Ａおよび第２ＳＮＰに対
立遺伝子Ｇを含み且つ第２１番染色体の他方のコピーが
第１ＳＮＰに対立遺伝子Ｇおよび第２ＳＮＰに対立遺伝
子Ａを含むか否か、は明らかではない。この問題を回避
するために用いられる現在の方法は、ハプロタイプ頻度
の統計的推測、ファミリーデータからの直接的な妨害、
および短いセグメントに対する対立遺伝子特異的ＰＣＲ
増幅を含む。
【０１５９】これらの複雑性を回避するために、本発明
は、げっ歯類／ヒト体細胞ハイブリッド中で単離された
第２１番染色体の一倍体コピー上のＳＮＰを特徴付け
て、これらの染色体の完全ハプロタイプを直接決定でき
るようにした。データセットの中で２回以上現れるマイ
ナー対立遺伝子を有する２４，０４７個のＳＮＰからな
るセットを用いて、図１４に示すハプロタイプ構造を画
定した。１４７個の共通ヒト第２１番染色体ＳＮＰによ
り定義される２０個の独立した全体的に多様な染色体の
ハプロタイプパターンが示されている。１４７個のＳＮ
ＰがゲノムＤＮＡ配列の１０６ｋｂにまたがっている。
色付きのボックスの各行は単一のＳＮＰを表す。各行の
黒いボックスはそのＳＮＰのメジャーな対立遺伝子を表
し、白いボックスはマイナー対立遺伝子を表す。行の中
のどこにもボックスがなければ、欠測データであること
を示す。色付きボックスの各列は、単一の染色体を表
し、その染色体上の物理的な順番に従ってＳＮＰが並ん
でいる。連続的ＳＮＰ間の不変塩基は図中に表わされて
いない。１４７個のＳＮＰを１８個のブロック（黒い水
平のラインにより画定されている）に分ける。第２１番
染色体ゲノムＤＮＡ配列の中の、１つのブロックの始ま
りとそれに隣接するブロックの終りとを画定する塩基の
位置は、垂直な黒いラインの左側の数字で示されてい
る。図の右側の拡大ボックスは、ゲノムＤＮＡの１９ｋ
ｂにまたがる２６個の共通ＳＮＰにより画定されるＳＮ
Ｐブロックを表す。サンプル中に現れる７つの異なるハ
プロタイプパターンのうち、４つの最も共通するパター
ンは、サンプリングした２０個の染色体のうちの１６個
（すなわちそのサンプルの８０％）を含む。黒丸および
白丸は、２つの情報提供ＳＮＰの対立遺伝子パターン
（これはこのブロックの中の４つの共通ハプロタイプ間
を明白に区別する）を示す。どの２つの染色体も、これ
ら１４７個のＳＮＰについて同一ハプロタイプパターン
を共有していなかったが、多数の染色体が共通パターン
を共有する領域が沢山ある。より詳細に分析するため
に、１つのこのような領域（１９ｋｂにまたがる２６個
のＳＮＰにより画定される）を拡大する（再び図１４の
拡大領域を参照されたい）。このブロックは、第２０番
染色体中の７つのユニークなハプロタイプパターンを画
定する。データ品質の閾値を合格しなかったためにある
データが欠けているにもかかわらず、全てのケースにお
いて、所与の染色体はこの７つのハプロタイプのうちの
１つに明白に割り当てることができる。４つの最も頻繁
なハプロタイプ（各々は３以上の染色体により表され
る）はそのサンプル中の全ての染色体の８０％を占め
る。全部で２６個のうちの２つの「情報提供」ＳＮＰの
みが、該４つの最も頻繁なハプロタイプを区別するのに
必要である。この例では、これら２つの情報提供ＳＮＰ
のみから得た情報を用いることにより、頻度の低いハプ
ロタイプを有する４つの染色体が共通ハプロタイプとし
て誤って分類される。にもかかわらず、全ての総合サン
プルのハプロタイプ構造の８０％がそのブロックの中の
全ＳＮＰの１０％未満により定義されるということは注
目すべきことである。４つの共通ハプロタイプの各々が
単一のＳＮＰにより唯一定義されるように３つの情報提
供ＳＮＰを選択することができる、幾つかの異なる可能
性がある。これら「３つのＳＮＰ」の選択肢のうち１つ
は、プールしたサンプルの遺伝子タイピングを含む実験
において２つのＳＮＰ組合せよりも好ましいであろう。
なぜなら、このような状況において、この２つのＳＮＰ
の組合せでは４つの共通ハプロタイプの頻度が決定でき
ないからである。従って、本発明は、無作為なＳＮＰマ
ッピングの選択方法に比べて大幅な進歩を提供する。
【０１６０】まとめると、この特定のアプリケーション
は、ハプロタイプ情報を捕捉するために情報提供ＳＮＰ
の選択を命令し得るが、そのサンプルの中のハプロタイ
プ情報の大半は、全てのＳＮＰのある非常に小さなサブ
セットの中に含まれることは明白である。また、このＳ
ＮＰブロックからの２つまたは３つの情報提供ＳＮＰを
無作為に選択しても、多くの場合は、該４つの共通ハプ
ロタイプのうちの１つに染色体を唯一割り当てるための
十分な情報が得られない。
【０１６１】１つの問題は、そのハプロタイプ構造を画
定するのに必要なＳＮＰの合計数を最小限に抑えながら
第２１番染色体の全３２．４Ｍｂに広がる連続的なＳＮ
Ｐブロックのセットをどのように画定するかということ
である。１つの実施形態において、この問題を解決する
ために「欲張り」法に基づく最適化アルゴリズムを用い
た。サイズが１ＳＮＰ以上である物理的に連続するＳＮ
Ｐからなる全ての可能なブロックについて考慮した。曖
昧なハプロタイプパターンは欠測データとして扱い、網
羅度のパーセンテージを算出する際には含めなかった。
残りの重複ブロックを同時に考慮し、そのブロックの中
に２回以上現れるハプロタイプを唯一識別するのに必要
なＳＮＰの最小数に対するそのブロックの中の全ＳＮＰ
の比が最大であるブロックを選択した。選択されたブロ
ックと物理的に重複する残りのブロックを捨て、ギャッ
プを持たず且つ全てのＳＮＰがブロックに割り当てられ
た、第２１番染色体の３２．４Ｍｂをカバーする連続的
な非重複ブロックのセットが選択されるまで、このプロ
セスを繰返した。サンプルのサイズを染色体２０個とす
ると、このアルゴリズムは、ブロック１つあたり最大で
１０個の共通ハプロタイプパターン（各々は２つの独立
染色体により表される）を生成する。
【０１６２】このアルゴリズムを２４，０４７個の共通
ＳＮＰからなるデータセットに適用し、第２１番染色体
にまたがる４，１３５個のＳＮＰブロックを画定した。
全部で５８９個のブロック（全ブロックの１４％を占め
る）は、ブロック１つあたり１１以上のＳＮＰを含み、
全３２．４Ｍｂの４４％を含む。これに対し、２，１３
８ブロック（全ブロックの５２％を占める）は、ブロッ
ク１つあたり３個未満のＳＮＰを含み、該染色体の物理
的長さのたった２０％しか構成しない。最も長いブロッ
クは１１４個の共通ＳＮＰを含み、ゲノムＤＮＡの１１
５ｋｂにまたがる。全般的にみて、１つのブロックの平
均物理的サイズは７．８ｋｂである。ブロックのサイズ
は染色体上におけるその順序には関係が無く、染色体の
全長に沿って、大きなブロックの間には小さなブロック
が散在している。ブロック１つあたり平均２．７個の共
通ハプロタイプパターン（複数の染色体上で観察される
ハプロタイプパターンとして定義される）がある。平均
で、あるブロックの中の最も頻度が高いハプロタイプパ
ターンは、サンプル中の２０個の染色体のうち９．６個
の染色体によって表され、２番目に頻度の高いハプロタ
イプパターンは、４．２個の染色体によって表され、
（あれば）３番目に頻度の高いハプロタイプパターン
は、２．１個の染色体によって表される。全体的に多様
な染色体のこのような大きな割合は、このように限定さ
れたハプロタイプの多様性によって表されるという事実
は、注目に値する。この知見は、ハプロタイプパターン
頻度を考慮したときに、３１３個のヒト遺伝子からなる
コレクションの中で観察されるハプロタイプパターンの
８２％が全ての人種グループにおいて観察される一方
で、ハプロタイプの８％のみは集団特異的である、とい
う観察結果と一致する（Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２９３：４８９−９３（２００１））。得られ
たブロックパターンに対して及ぼす該ハプロタイプアル
ゴリズムのパラメータの影響を測定するために幾つかの
実験を行った。共通ハプロタイプにより網羅される必要
がある染色体の割合は様々であり、最初は８０％から、
７０％および９０％であった。予測した通り、より完全
な網羅度を必要とすると、多少大きな数のより短いブロ
ックができる。そのサンプル中のマイナー対立遺伝子の
頻度が少なくとも２０％である１６，５０３個のＳＮＰ
のみを用いたところ、ある程度長いブロックになった
が、ブロック１つあたりのＳＮＰの数はそれほど変わら
なかった。約３Ｍｂの１つの領域について、この２０個
染色体分析に匹敵させるために、少なくとも１０％の頻
度を有する共通ハプロタイプおよびＳＮＰについての３
８個の染色体のより奥行きのあるサンプルを分析した。
得られたブロックサイズの分布は、最初の結果とほぼ一
致していた。また、各ＳＮＰにある非曖昧対立遺伝子の
順序を変えた（ｐｅｒｍｕｔｅ）後にハプロタイプブロ
ック発見に使用するという無作為なテストを行った。こ
の分析では、ブロックの９４％が３個未満のＳＮＰを含
み、１つのブロックのみが６個以上のＳＮＰを含んでい
た。これは、データ中に見られる大きなブロックは、偶
然（ｂｙ ｃｈａｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
ｓ）、または本発明のブロック選択法のアーチファクト
としては生成され得ない、ということを立証するもので
ある。
【０１６３】大きなブロックおよび小さなブロックの両
方において遺伝子が比例的に現れるか否かを決定するた
めに、１１個以上のＳＮＰ、３〜１０個のＳＮＰ、およ
び３個未満のＳＮＰをそれぞれ含むブロックにおけるエ
キソン塩基の数で決定を行った。エキソン塩基は、３〜
１０個のＳＮＰを含むブロック中の全塩基に比べてある
程度過剰に表れる（ｏｖｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅ
ｄ）（並べ替えテスト（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｅ
ｓｔ）で測定したところ、ｐ＜０．０５）。
【０１６４】共通ハプロタイプ情報（全３２．４Ｍｂに
わたる該サンプルの８０％を超える部分を含み且つ該サ
ンプル内に２回以上存在するハプロタイプの完全な情報
として定義される）の所望の割合を捕捉するために、ブ
ロック内のハプロタイプ構造の知識に基づいて、２４，
０４７個の共通ＳＮＰのサブセットを選択することがで
きる。図１５は、第２１番染色体の３２．４Ｍｂについ
ての共通ハプロタイプ情報を捕捉するために必要なＳＮ
Ｐの数を表す。各ＳＮＰブロック毎に、２回以上存在す
るそのブロックの中のハプロタイプを明白に識別するの
に必要なＳＮＰの最小数（すなわち共通ハプロタイプ情
報）を決定した。これらのＳＮＰは、そのブロックによ
り画定される合計物理的距離の割合についての共通ハプ
ロタイプ情報を提供する。最も大きな物理的距離につい
ての共通ハプロタイプ情報を提供するＳＮＰから始め
て、物理的網羅度（すなわちカバーされる割合）の累進
的増加を、追加したＳＮＰ（すなわち必要なＳＮＰ）の
数に関してプロットする。遺伝子ＤＮＡ（ｇｅｎｉｃ
ＤＮＡ）は各既知の第２１番染色体遺伝子の最初のエキ
ソンの５’側の１０ｋｂから始まりその遺伝子の最後の
エキソンの３’側の１０ｋｂに延びる全てのゲノムＤＮ
Ａを含む。例えば、全ての共通ハプロタイプ情報を捕捉
するには最低でも４，５６３個のＳＮＰが必要とされる
が、３個以上のＳＮＰを含むブロック内の共通ハプロタ
イプ情報（３２．４Ｍｂの８１％をカバーする）を捕捉
するためには２７９３個のＳＮＰしか必要としない。遺
伝子ＤＮＡ中の全ての共通ハプロタイプ情報（約２２０
個の異なる遺伝子を表す）を捕捉するためには、合計１
７９４個のＳＮＰが必要である。
【０１６５】本発明は、共通疾患遺伝子（ｃｏｍｍｏｎ
ｄｉｓｅａｓｅ ｇｅｎｅ）等の表現型をマッピング
する全ゲノムの関連付け調査に特に適している。このア
プローチは、共通する遺伝子変異体が共通する疾患に対
する罹患性に関与するという仮説に基づく（Ｒｉｓｃｈ
およびＭｅｒｉｋａｎｇａｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７
３：１５１６（１９９６）， Ｌａｎｄｅｒ， Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２７４：５３６（１９９６））。非関連ケー
スおよび対照における遺伝子変異体の頻度を比較するこ
とにより、遺伝学的関連付け調査は、疾患において重要
な役割を果たすヒトゲノム中の特定のハプロタイプを同
定することができる。このアプローチは単一候補遺伝子
を疾患に関連付けることに成功したが（Ａｌｔｓｃｈｕ
ｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２６：７６
（２０００））、ヒトＤＮＡ配列が近年入手可能となっ
たことにより、全ゲノムを調査することが可能となり、
遺伝学的関連付け分析の能力を大幅に飛躍させた（Ｋｒ
ｕｇｌｙａｋ， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２２：
１３９（１９９９））。この方法の実施を制限する主な
要因は、ヒトゲノムのハプロタイプ構造の知識（これ
は、分析用の適当な遺伝子変異体を選択するために必要
である）に乏しいことであった。本発明は、高密度オリ
ゴヌクレオチドアレイと体細胞の遺伝子サンプルの調製
とを組み合わせることにより、ヒトゲノムの共通ハプロ
タイプ構造を経験的に画定する高分解能アプローチ（ｈ
ｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈ）を
提供することを示す。
【０１６６】単純なハプロタイプ構造を有するゲノム領
域の長さは非常にまちまちであるが、共通ＳＮＰの稠密
セットにより、世界人口の８０％がたった３つの共通ハ
プロタイプにより描写されるヒトゲノムのブロックを定
義する体系的なアプローチを可能とする。一般に、この
実施形態に用いられる特定のアルゴリズムを適用する場
合、任意のブロックの中で最も一般的なハプロタイプ
は、個体の５０％において見られ、２番目に一般的なハ
プロタイプは個体の２５％において見られ、および３番
目に一般的なハプロタイプは個体の１２．５％において
見られる。ブロックはその遺伝子情報の内容に基づいて
定義されるのであって、この情報がどのように生じたの
かということや何故存在するのかということについての
知識に基づくものではない、ということに留意すること
は重要である。従って、ブロックは絶対的な境界を持た
ず、特定の用途に応じて様々な方法で画定することがで
きる。この実施形態におけるアルゴリズムは、沢山の可
能なアプローチのうちのたった１つを提供するに過ぎな
い。これらの結果は、全ての共通ハプロタイプ情報を捕
捉するために、ＳＮＰの非常に稠密なセットが必要であ
ることを示している。しかし一方では、この方法を用い
て、総合的な全ゲノムの関連付け調査に有用なＳＮＰの
もっと小さな部分集合を同定することができる。
【０１６７】当業者であれば、ヒト第２１番染色体に適
用された手法をヒトゲノムの全ての染色体に適用するこ
とができることが容易に分かるであろう。本発明の好適
な実施形態において、ヒト種（ｈｕｍａｎ ｓｐｅｃｉ
ｅｓ）を多様な集団の代表の多数の全ゲノムを用いて、
ヒト種の全てまたは大部分のメンバーに共通するＳＮＰ
ハプロタイプブロックを同定する。幾つかの実施形態に
おいて、ＳＮＰハプロタイプブロックは、低い頻度で現
れるＳＮＰを除外することにより、古来のＳＮＰ（ａｎ
ｃｉｅｎｔ ＳＮＰ）に基づく。古来のＳＮＰは、その
ＳＮＰを保有する生物に何らかの選択的利益を与えるた
め、ゲノム中で保存されているので重要であると思われ
る。
【０１６８】（実施例６） 遺伝子治療および薬剤発見
に関連遺伝子を用いる 本発明の方法を用いるための１つの例を、この予想実施
例（ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ ｅｘａｍｐｌｅ）で概説す
る。２０個の一倍体ゲノムに対してＳＮＰ発見を行い、
ＳＮＰハプロタイプブロック、ＳＮＰハプロタイプパタ
ーン、情報提供ＳＮＰおよび各情報提供ＳＮＰのマイナ
ー対立遺伝子の頻度を決定するための本発明の方法によ
り、５０個の一倍体ゲノムを分析する。これら５０個の
一倍体ゲノムは、この調査の対照ゲノムである（図１３
のステップ１３００を参照されたい）。
【０１６９】次に、肥満表現型を有する５００個の個体
から得たゲノムＤＮＡを、上記のように長距離（ｌｏｎ
ｇ ｄｉｓｔａｎｃｅ）ＰＣＲおよびマイクロアッセイ
を用いて、変異体について分析し（Ｌｉｐｓｈｕｔｚら
に付与された米国特許第６，３００，０６３号、および
Ｃｈｅｅらに発行された米国特許第５，８３７，８３２
号も参照されたい）、各情報提供ＳＮＰのマイナー対立
遺伝子の頻度をこの臨床集団について決定する（図１３
のステップ１３１０を参照されたい）。これら２つの集
団の情報提供ＳＮＰのマイナー対立遺伝子頻度を比較
し、対照集団および臨床集団が、３つの情報提供ＳＮＰ
位置において統計的に有意な差を有することを決定する
（ステップ１３２０および１３３０）。対照集団および
臨床集団のマイナー対立遺伝子頻度の差が最も大きなＳ
ＮＰ位置を選択して分析する。
【０１７０】選択された情報提供位置は、レプチン遺伝
子のコード領域（４ｋｂ）および該コード領域の５’側
の非コード配列（１ｋｂ）にまたがることが判明したＳ
ＮＰハプロタイプブロックの中に含まれる（ステップ１
３４０）。この領域内に含まれる変異の分析は、この領
域の中のあるＳＮＰ位置にあるＧがレプチン遺伝子のプ
ロモーターの破壊に関与しており、レプチンタンパク質
の発現がこれに比例して低下していることを示す。
【０１７１】皮膚生検により被験者から繊維芽細胞を得
る。得られた組織を組織培養培地中に入れ、小片に分け
る。この組織小片を、培地を含む組織培養フラスコの湿
った表面の底に入れる。室温にて２４時間後、新しい培
地（例えば１０％ ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプ
トマイシンを加えたＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地）を加え
る。次に組織を３７℃にて約１週間インキュベートす
る。このとき、新しい培地を加え、続いて数日おきに新
しい培地に換える。さらに２週間培養した後、繊維芽細
胞の単層が現れる。この単層をトリプシン処理し、大き
なフラスコに移す。
【０１７２】モロニーネズミ白血病ウイルスから得たベ
クター（このベクターはカナマイシン耐性遺伝子を含
む）を制限酵素で消化し、発現させる断片をクローニン
グする。消化されたベクターを仔ウシ腸ホスファターゼ
で処理し、自己ライゲーションを防ぐ。脱リン酸化した
線状ベクターをアガロースゲル上で分離・精製する。レ
プチンｃＤＮＡ（活性レプチンタンパク質産物を発現す
ることができる）を単離する。断片の末端を修飾し、必
要であればベクター中にクローニングする。等モル量の
モロニーネズミ白血病ウイルスの線状主鎖（ｂａｃｋｂ
ｏｎｅ）およびレプチン遺伝子断片を混ぜ合わせ、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用いてつなげる。このライゲーショ
ン混合物を用いて大腸菌を形質転換した後、この細菌
を、カナマイシン含有寒天上に接種する。カナマイシン
の表現型および制限分析により、このベクターの中にレ
プチン遺伝子がきちんと挿入されたか否かを確かめる。
【０１７３】１０％仔ウシ血清、ペニシリンおよびスト
レプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地
（ＤＭＥＭ）中で組織培養を行い、パッケージング細胞
をコンフルエントな密度になるまで増殖させる。レプチ
ン遺伝子を含むベクターを標準的手法によりパッケージ
ング細胞中に導入する。このパッケージング細胞に新し
い培地を加え、適当な時間インキュベートした後、コン
フルエントなパッケージング細胞のプレートから培地を
回収する。感染性ウイルス粒子を含む培地をＭｉｌｌｉ
ｐｏｒｅフィルタで濾過して剥離したパッケージング細
胞を除去した後、線維芽細胞を感染させるために用い
る。線維芽細胞が準コンフルエント状態のプレートから
培地を除去し、濾過した培地に素早く取り替える。形質
導入を容易とするためにポリブレン（Ａｌｄｒｉｃｈ）
を培地に入れても良い。適当な時間インキュベートを行
った後、培地を除去して新しい培地に取り替える。ウイ
ルス力価が高ければ、事実上全ての線維芽細胞が感染し
ており、選択の必要はない。力価が低ければ、選択マー
カー（例えばｎｅｏやｈｉｓ等）を有するレトロウイル
スベクターを用いて、増殖するための形質導入細胞を選
択する必要がある。
【０１７４】次に、遺伝子操作した線維芽細胞を、単独
で、またはマイクロキャリアビーズ（例えばｃｙｔｏｄ
ｅｘ ３ビーズなど）上でコンフルエントになるまで増
殖した後、個体中に導入する。注入された線維芽細胞は
レプチン産物を生成し、該タンパク質の生物学的作用が
その宿主に伝達される。
【０１７５】代替的にまたは更に、レプチン遺伝子を単
離し、発現ベクター中にクローニングして、レプチンポ
リペプチドを産生するために使用する。発現ベクターは
上記に開示したように、適切な転写および翻訳開始領域
ならびに転写および翻訳停止領域を含む。単離したレプ
チンタンパク質をこのように産生して、該タンパク質に
結合する物質を同定するか、あるいは遺伝子操作された
レプチン遺伝子およびタンパク質を発現する細胞を、物
質を同定するアッセイで用いる。このような物質は、例
えば候補物質を単離したレプチンポリペプチドに、ポリ
ペプチド／化合物複合体を形成するのに十分な時間接触
させ、そして該複合体を検出することによって同定され
る。ポリペプチド／化合物複合体が検出されたら、レプ
チンポリペプチドに結合する化合物を同定する。この方
法によって同定された物質は、レプチンの活性をモジュ
レートする化合物を含み得る。このようにスクリーニン
グされた物質は、ペプチド、炭水化物、ビタミン誘導
体、および他の小分子または医薬物質である。物質を同
定するための生物学的アッセイに加え、物質を、レプチ
ンタンパク質の立体構造に基づいて、タンパク質モデリ
ング手法を用いて選択された候補物質を選択することに
よって予めスクリーニングしてもよい。
【０１７６】レプチンタンパク質に結合する物質の同定
に加え、レプチン遺伝子に結合して遺伝子発現を制御す
る配列特異的またはエレメント特異的物質も同定され
る。核酸結合物質の１つのクラスは、レプチンｍＲＮＡ
にハイブリダイズして翻訳を遮断する塩基残基を含む物
質である（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド
等）。核酸結合物質の他のクラスは、ＤＮＡと３重らせ
んを形成して転写を遮断するものである（３本鎖オリゴ
ヌクレオチド（ｔｒｉｐｌｅｘ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅｓ））。このような物質は通常２０〜４０個
の塩基を含み、古典的なホスホジエステル、リボ核酸主
鎖に基づくものであるか、或いは塩基結合能を有する種
々のスルフヒドリル誘導体またはポリマー誘導体であっ
てもよい。
【０１７７】更に、レプチン遺伝子に特異的にハイブリ
ダイズする対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドおよび
／または変異体レプチンタンパク質に特異的に結合する
物質（例えば変異体特異的抗体）を診断薬として用いる
ことができる。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを
調製および使用するための方法、ならびに抗体の調製方
法は上記に記載済みであり、当分野において公知であ
る。
【０１７８】この明細書中に記載した全ての特許および
出版物は、本発明が属する分野において通常の知識を有
する者のレベルを示す。全ての特許および出版物は、各
々の出版物が特に且つ個々に本明細書中に組み込まれる
ものとする旨を注記したものとして、本明細書中に組み
込まれる。
【０１７９】本発明は、個々の変異を同定し、ＳＮＰハ
プロタイプブロックを決定し、ハプロタイプパターンを
決定し、そしてさらにこのＳＮＰハプロタイプパターン
を用いて情報提供ＳＮＰを同定することによってゲノム
全域の関連付け調査を行うための非常に進歩した方法を
提供する。従来公知でない実用的且つコストが低い方法
で、該情報提供ＳＮＰを用いて疾患および薬物応答の遺
伝的根拠を詳細に分析することができる。上記説明は例
示的なものであって限定的なものではないことを理解さ
れたい。上記説明を読めば当業者には多くの実施形態が
自明であろう。従って本発明の範囲は、上記説明を参照
して決定されるのではなく、特許請求の範囲を参照して
決定されるべきものであり、このような特許請求の範囲
の権利が及ぶ同等物の全ての範囲を含むものとする。
【０１８０】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Perlegen Sciences, Inc. PATIL, Nila COX, David R. BERNO, Anthony J. HINDS, David A. FODOR, Stephen P. A. <120> Methods for Genomic Analysis <130> 054801-5001 <150> US 60/280,530 <151> 2001-03-30 <150> US 60/313,264 <151> 2001-08-17 <150> US 60/327,006 <151> 2001-10-05 <150> US 60/332,550 <151> 2001-11-26 <160> 7 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sample SNP Haplotype: W <400> 1 agattcgata acg 13 <210> 2 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sample SNP Haplotype: X <400> 2 agactacata acg 13 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sample SNP Haplotype: Y <400> 3 tatttcgata acg 13 <210> 4 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sample SNP Haplotype: Z <400> 4 tatctacaat cac 13 <210> 5 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> SNP sequence <400> 5 agtaacccct ttt 13 <210> 6 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> SNP sequence <400> 6 actgacccct ttt 13 <210> 7 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> SNP sequence <400> 7 agtgactctt taa 13
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法の１つの実施形態の概略図であ
り、変異体の位置の同定から変異体と表現型との関連付
け、薬剤発見標的を同定するためまたは診断マーカーと
してこの関連付けの使用を示している。
【図２】本発明に従ったサンプルＳＮＰハプロタイプブ
ロックおよびＳＮＰハプロタイプパターンを示す。
【図３】ＳＮＰハプロタイプブロックの選択方法の一実
施形態を示す概略図である。
【図４】図３に示した方法の一実施形態の単純な使用を
示す。
【図５Ａ】ＳＮＰハプロタイプブロックの最終セットを
選択するための方法の一実施形態の概略図である。
【図５Ｂ】図５Ａに示した方法の簡単な使用であり、図
中に示した「文字：数字」は、各ブロックの「ハプロタ
イプブロックＩＤ：情報提供値」を示す。
【図６】本発明の一実施形態に従って情報提供ＳＮＰが
どのように選択されるのかを示す例である。
【図７Ａ】変異体の曖昧性および／またはＳＮＰハプロ
タイプパターンの曖昧性を解決する一実施形態を示す概
略図である。
【図７Ｂ】図７Ａに示した方法の簡単な使用を示す。
【図８】関係付けの調査における本発明の方法の使用の
一実施形態の概略図である。
【図９】本発明の幾つかの実施形態を実行するのに適し
た例示的なコンピュータネットワークシステムを示す。
【図１０】体細胞ハイブリッドの構築を示す概略図であ
る。
【図１１】Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｉｎｃ社のＨｕＳ
ＮＰ遺伝子チップを用いたハムスター／ヒト細胞ハイブ
リッドのスクリーニングにより得た結果の一部を示す表
である。
【図１２】長範囲ＰＣＲを用いたヒト第２２番染色体お
よびヒト第１４番染色体のゲノムＤＮＡの様々な増幅ゲ
ノム領域の例を示す。
【図１３Ａ】ＳＮＰのマイナー対立遺伝子（変異体）の
頻度に対してプロットしたＳＮＰのパーセンテージを示
す棒グラフである。
【図１３Ｂ】２００ｋｂインターバルにおけるヌクレオ
チドの多様性の関数として該インターバルのパーセンテ
ージを示すグラフである。
【図１３Ｃ】インターバルの長さに対してプロットした
全てのインターバルのパーセンテージを示す棒グラフで
ある。
【図１４】１４７個の共通ヒト第２１番染色体ＳＮＰに
より定義される２０個の独立した全体的に多様な染色体
のハプロタイプパターンを示す。
【図１５】網羅される染色体の割合を、その網羅度に必
要なＳＮＰの数の関数としたプロットである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ６０／３３２５５０ (32)優先日 平成13年11月26日(2001．11．26) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 ニラ パティル アメリカ合衆国， カリフォルニア州， マウンテン ヴュー， スティアリン コ ート 2021 パーレジェン サイエンシー ズ インコーポレイテッド内 (72)発明者 デヴィッド アール． コックス アメリカ合衆国， カリフォルニア州， マウンテン ヴュー， スティアリン コ ート 2021 パーレジェン サイエンシー ズ インコーポレイテッド内 (72)発明者 アンソニー ジェイ． バーノ アメリカ合衆国， カリフォルニア州， マウンテン ヴュー， スティアリン コ ート 2021 パーレジェン サイエンシー ズ インコーポレイテッド内 (72)発明者 デヴィッド エー． ハインズ アメリカ合衆国， カリフォルニア州， マウンテン ヴュー， スティアリン コ ート 2021 パーレジェン サイエンシー ズ インコーポレイテッド内

Claims (49)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＳＮＰハプロタイプパターンを選択する
    ための方法であって、 複数の異なる起源から実質的に同じ核酸鎖を単離して分
    析する工程、 各核酸鎖の中の２以上のＳＮＰ位置を決定する工程、 ＳＮＰハプロタイプブロックを形成する、前記核酸鎖の
    中の連鎖したＳＮＰ位置を同定する工程、 孤立したＳＮＰハプロタイプブロックを同定する工程、 各ＳＮＰハプロタイプブロックおよび孤立したＳＮＰハ
    プロタイプブロック中に生じるＳＮＰハプロタイプパタ
    ーンを同定する工程、ならびに異なる起源源から得た前
    記実質的に同じ核酸鎖の少なくとも２つにおいて生じる
    各同定されたＳＮＰハプロタイプパターンを選択する工
    程、を含む、上記方法。
  2. 【請求項２】 前記第１の同定工程が、欲張りアルゴリ
    ズムまたは最短路アルゴリズムにより決定される、請求
    項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記ＳＮＰハプロタイプブロックが重複
    しない、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記実質的に同じ核酸鎖が少なくとも約
    １０〜約１００個の異なる起源に由来する、請求項１記
    載の方法。
  5. 【請求項５】 前記実質的に同じ核酸鎖が少なくとも約
    １６個の異なる起源に由来する、請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記実質的に同じ核酸鎖が少なくとも約
    ２５個の異なる起源に由来する、請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記実質的に同じ核酸鎖が少なくとも約
    ５０個の異なる起源に由来する、請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記実質的に同じ核酸鎖がゲノムＤＮＡ
    鎖である、請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】 ある生物に由来するゲノムＤＮＡの少な
    くとも１０％が単離および分析される、請求項１記載の
    方法。
  10. 【請求項１０】 前記実質的に同じ核酸鎖から得た少な
    くとも１×１０8個の塩基が単離および分析される、請
    求項１記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記実質的に同じ核酸鎖から選択され
    た反復領域は分析されない、請求項１記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記決定工程の後に、前記複数の同じ
    核酸鎖の中に１回しか生じないＳＮＰ位置を同定する工
    程、および前記１回しか生じないＳＮＰ位置を分析から
    除外する工程、をさらに含む、請求項１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記実質的に同じ核酸鎖の中で最も頻
    繁に生じるＳＮＰハプロタイプパターンを選択する工
    程、 前記実質的に同じ核酸鎖の中で次に最も頻繁に生じるＳ
    ＮＰハプロタイプパターンを選択する工程、および前記
    選択されたＳＮＰハプロタイプパターンが前記実質的に
    同じ核酸鎖の一部分を同定するまで前記第２選択ステッ
    プを繰返す工程、をさらに含む、請求項１記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記一部分が前記実質的に同じ核酸鎖
    の約７０％〜９９％である、請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記一部分が前記実質的に同じ核酸鎖
    の少なくとも約８０％である、請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 約３個以下のＳＮＰハプロタイプパタ
    ーンが選択される、請求項１３記載の方法。
  17. 【請求項１７】 データ分析のためのＳＮＰハプロタイ
    プブロックのデータセットを選択するための方法であっ
    て、 情報提供性についてＳＮＰハプロタイプブロックを比較
    する工程、 高い情報提供性を有する第１ＳＮＰハプロタイプブロッ
    クを選択する工程、 前記第１ＳＮＰハプロタイプブロックを前記データセッ
    トに追加する工程、 高い情報提供性を有する第２のＳＮＰハプロタイプブロ
    ックを選択する工程、 前記第２の選択されたＳＮＰハプロタイプブロックを前
    記データセットに追加する工程、および核酸鎖の目的の
    領域がカバーされるまで前記選択および追加工程を繰返
    す工程、を含む、上記選択方法。
  18. 【請求項１８】 前記選択されたＳＮＰハプロタイプブ
    ロックが重複しない、請求項１７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 欲張りアルゴリズムを用いて前記選択
    工程を実行する、請求項１７記載の方法。
  20. 【請求項２０】 ＳＮＰハプロタイプパターンの中の情
    報提供ＳＮＰを決定するための方法であって、 ＳＮＰハプロタイプブロックのＳＮＰハプロタイプパタ
    ーンを決定する工程、前記ＳＮＰハプロタイプブロック
    の中の目的の各ＳＮＰハプロタイプパターンを、前記Ｓ
    ＮＰハプロタイプブロックの中の目的の他のＳＮＰハプ
    ロタイプパターンと比較する工程、および目的の第１Ｓ
    ＮＰハプロタイプパターンの中の少なくとも１つのＳＮ
    Ｐを選択する工程であって、前記ＳＮＰハプロタイプブ
    ロックの中の他の目的のＳＮＰハプロタイプパターンか
    らこのような目的の第１ＳＮＰハプロタイプパターンを
    識別する工程、を含み、前記選択された少なくとも１つ
    のＳＮＰが、前記ＳＮＰハプロタイプブロックの中の前
    記第１ＳＮＰハプロタイプパターンの情報提供ＳＮＰで
    ある、上記方法。
  21. 【請求項２１】 ＳＮＰハプロタイプブロックの中のＳ
    ＮＰハプロタイプパターンの一部分を識別するために十
    分な数の情報提供ＳＮＰが選択されるまで前記選択工程
    を繰返す工程を更に含む、請求項２０記載の方法。
  22. 【請求項２２】 ＳＮＰハプロタイプパターンの前記選
    択された一部分が、前記ＳＮＰハプロタイプブロックの
    中のＳＮＰハプロタイプパターンの約７０％〜約９９％
    である、請求項２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 ＳＮＰハプロタイプパターンの前記選
    択された一部分が目的の疾患の同定を可能とする、請求
    項２１記載の方法。
  24. 【請求項２４】 ＳＮＰハプロタイプブロックの情報提
    供性を決定するための方法であって、 前記ＳＮＰハプロタイプブロックの中のＳＮＰ位置の数
    を決定する工程、 前記ＳＮＰハプロタイプブロックの中の目的のＳＮＰハ
    プロタイプパターンを識別するのに必要な情報提供ＳＮ
    Ｐの数を決定する工程、および前記ＳＮＰ位置の数を前
    記情報提供ＳＮＰの数で割って商を生成する工程、を含
    み、前記商が前記ＳＮＰハプロタイプブロックの前記情
    報提供性である、上記方法。
  25. 【請求項２５】 ＳＮＰハプロタイプブロックの情報提
    供性を決定する方法であって、 前記ＳＮＰハプロタイプブロックの中のＳＮＰ位置の数
    を決定する工程、および前記ＳＮＰハプロタイプブロッ
    クの中の目的のＳＮＰハプロタイプパターンを互いに区
    別するのに必要な情報提供ＳＮＰの数を決定する工程、
    を含み、目的のＳＮＰハプロタイプパターンを区別する
    のに必要な前記情報提供ＳＮＰの数が、前記ＳＮＰハプ
    ロタイプブロックの前記情報提供性である、上記方法。
  26. 【請求項２６】 疾患関連遺伝子の配列または該遺伝子
    座の位置の事前知識もなく、該疾患関連遺伝子を決定す
    るための方法であって、対照集団の少なくとも１６個体
    からＳＮＰハプロタイプパターンを決定する工程、 疾患に罹った集団の個体からＳＮＰハプロタイプパター
    ンを決定する工程、および前記対照集団の前記ＳＮＰハ
    プロタイプパターンの頻度を、前記疾患に罹った集団の
    前記ＳＮＰハプロタイプパターンの頻度と比較する工程
    を含み、前記頻度の差が疾患関連遺伝子座を示す、上記
    方法。
  27. 【請求項２７】 前記ＳＮＰハプロタイプパターンが、
    対照集団の少なくとも５０個体において決定される、請
    求項２６記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記集団からの前記ＳＮＰハプロタイ
    プパターンが情報提供ＳＮＰを用いて決定される、請求
    項２６記載の方法。
  29. 【請求項２９】 複数の全ゲノムを用いてＳＮＰハプロ
    タイプブロックのマップを作製する方法であって、 前記全ゲノムの少なくとも約１０％において見られるＳ
    ＮＰをＳＮＰハプロタイプブロックの中に並べる工程を
    含む、上記方法。
  30. 【請求項３０】 ＳＮＰハプロタイプパターンと目的の
    表現型特性とを関連付ける方法であって、 本発明の方法によってＳＮＰハプロタイプパターンのベ
    ースラインを作製する工程、 目的の共通表現型特性を有する集団から得た全ゲノムＤ
    ＮＡをプールする工程、および前記目的の表現型特性に
    関連付けられたＳＮＰハプロタイプパターンを同定する
    工程、を含む、上記方法。
  31. 【請求項３１】 前記作製工程および前記同定工程に情
    報提供ＳＮＰが使用される、請求項３０記載の方法。
  32. 【請求項３２】 請求項２０記載の情報提供ＳＮＰを同
    定する工程を含み、前記情報提供ＳＮＰが関連付けに基
    づく診断マーカーである、診断マーカーの同定方法。
  33. 【請求項３３】 薬剤発見標的を同定するための方法で
    あって、 ＳＮＰハプロタイプパターンを疾患と関連付ける工程、 前記関連付けられたＳＮＰハプロタイプパターンの染色
    体位置を同定する工程、 前記染色体位置と前記疾患との前記関連付けの性質を決
    定する工程、および前記疾患に関連付けられた染色体位
    置またはその染色体位置の発現産物を選択する工程、を
    含み、前記疾患に関連付けられた前記選択された染色体
    位置またはその染色体位置の発現産物が薬剤発見標的で
    ある、上記方法。
  34. 【請求項３４】 高度保存領域中の位置と遺伝子間領域
    中の位置とを含む判断基準のセットに基づいた薬剤発見
    標的に対して、前記関連付けられた染色体位置が優先さ
    せられる、請求項３３記載の方法。
  35. 【請求項３５】 情報提供ＳＮＰが前記関連付け工程で
    使用される、請求項３３記載の方法。
  36. 【請求項３６】 個体のＳＮＰハプロタイプパターンを
    決定する方法であって、少なくとも１つの情報提供ＳＮ
    Ｐを分析する工程を含む、上記方法。
  37. 【請求項３７】 ある種または種の部分集団のＳＮＰハ
    プロタイプパターンを画定するための方法であって、 前記種の多数の生物のゲノム中に存在するＳＮＰを同定
    する工程、 曖昧位置の数が少ないＳＮＰハプロタイプパターンを反
    復的に選択することにより前記ＳＮＰをＳＮＰハプロタ
    イプブロック中に並べる工程、を含む上記方法。
  38. 【請求項３８】 多数の生物のゲノムから得たＳＮＰハ
    プロタイプブロックを含むデータベースであって、前記
    データベースが少なくとも１つの情報提供ＳＮＰを同定
    し、前記データベースがコンピュータが判読可能な媒体
    上にある、上記データベース。
  39. 【請求項３９】 １以上の特定の表現型特性に関連する
    ものとして同定されるＳＮＰハプロタイプパターンを含
    むコンピュータが判読可能な媒体上のデータベース。
  40. 【請求項４０】 １以上の特定の表現型特性に関連する
    ものとして同定される情報提供ＳＮＰを含むコンピュー
    タが判読可能な媒体上のデータベース。
  41. 【請求項４１】 環境要因、他の遺伝的要因、関連する
    要因からなる群より選択される１以上の要因についての
    情報をさらに含み、前記要因は生化学的マーカー、行動
    および／または他の多型を含むがこれらに限定されず、
    前記多型は例えば低頻度ＳＮＰ、繰返し、挿入および欠
    失を含むがこれらに限定されない、請求項３８、３９ま
    たは４０に記載のデータベース。
  42. 【請求項４２】 疾患、疾患に対する罹患性、または治
    療応答の診断キットであって、患者から得たゲノムＤＮ
    Ａのサンプル中のＳＮＰハプロタイプパターンまたは情
    報提供ＳＮＰの存在または不在を検出するための手段
    と、前記ＳＮＰハプロタイプパターンまたは情報提供Ｓ
    ＮＰと１以上の特異的表現型特性との関連付けのデータ
    セットと、をコンピュータが判読可能な媒体上に含む、
    上記診断キット。
  43. 【請求項４３】 少なくとも１つの情報提供ＳＮＰを含
    む単離核酸であって、前記情報提供ＳＮＰは本発明の方
    法に従って決定されたＳＮＰハプロタイプパターンを示
    し、前記情報提供ＳＮＰが表現型特性に関連付けられ
    る、上記単離核酸。
  44. 【請求項４４】 複数の個体中の遺伝学的変異を同定す
    る工程、 前記遺伝学的変異のうちの少なくともある他の変異と共
    に生じる個体中の前記遺伝学的変異の少なくとも幾つか
    を同定する工程、およびある表現型状態と相関する、前
    記遺伝学的変異のうちの少なくともある他の変異と共に
    生じる前記遺伝学的変異の全てではなく幾つかを用いる
    工程、を含む、方法。
  45. 【請求項４５】 ある生物の配列を決定する工程、 前記生物の他の個体を前記配列の変異体について走査す
    る工程、 第１グループにおいて前記変異体のうちの他の変異体と
    共に生じる前記変異体の幾つかを同定する工程、 第２グループにおいて前記変異体のうちの他の変異体と
    共に生じる前記変異体の幾つかを同定する工程、および
    前記第１グループおよび第２グループにおける前記変異
    体の全てではなく幾つかを用いて、前記グループをある
    表現型状態に関係付ける工程、を含む、方法。
  46. 【請求項４６】 ゲノム分析において有用なＳＮＰハプ
    ロタイプブロックを選択するための方法であって、 少なくとも約５つの異なる起源から実質的に同じＤＮＡ
    鎖を分析用に単離する工程、 少なくとも約５つの異なる起源から得た前記実質的に同
    じＤＮＡ鎖の各々から少なくとも約１×１０6塩基を分
    析する工程、 各ＤＮＡ鎖の中の２以上のＳＮＰ位置を決定する工程、 前記ＤＮＡ鎖の中の連鎖したＳＮＰ位置を同定する工程
    であって、前記連鎖したＳＮＰ位置がＳＮＰハプロタイ
    プブロックを形成する工程、 各ＳＮＰハプロタイプ中において生じるＳＮＰハプロタ
    イプパターンを同定する工程、および異なる起源から得
    た前記実質的に同じＤＮＡのいずれかにおいて生じる各
    同定されたＳＮＰハプロタイプパターンを選択する工
    程、を含む、上記方法。
  47. 【請求項４７】 薬理遺伝学に関連する遺伝子座の配列
    または位置についての事前知識も無く、前記薬理遺伝学
    に関連する遺伝子座を決定するための方法であって、前
    記方法が、 対照集団の少なくとも１６個体からＳＮＰハプロタイプ
    パターンを決定する工程、 ある物質の投与に対して変わった反応を示す個体からＳ
    ＮＰハプロタイプパターンを決定する工程、および前記
    対照集団の前記ＳＮＰハプロタイプパターンの頻度を、
    ある物質の投与に対して変わった反応を示す前記個体の
    前記ＳＮＰハプロタイプパターンの頻度と比較する工程
    を含み、前記頻度の差が薬理遺伝学に関連する遺伝子座
    の位置を示す、上記方法。
  48. 【請求項４８】 前記ＳＮＰハプロタイプパターンが、
    対照集団の少なくとも５０個体において決定される、請
    求項４７記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記集団から得た前記ＳＮＰハプロタ
    イプパターンが情報提供ＳＮＰを用いて決定される、請
    求項４７記載の方法。
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