CN101225432A

CN101225432A - 核酸三联探针和核酸四联探针

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Publication number: CN101225432A
Application number: CNA2007100006900A
Authority: CN
Inventors: 钟国庆; 丁永明
Original assignee: FUYANG JINXIN INVESTMENT Co Ltd
Current assignee: FUYANG JINXIN INVESTMENT Co Ltd
Priority date: 2007-01-17
Filing date: 2007-01-17
Publication date: 2008-07-23

Abstract

核酸三联探针和核酸四联探针，由三个或四个核酸串联探针构成，每个核酸串联探针均有三个核酸片段的正链或负链，其中至少含有一个核酸片段能够与靶序列互补配对，在进一步的杂交过程中，三个或四个核酸串联探针，通过相邻核酸串联探针间的互补核酸片段碱基配对，产生带有三个核酸单链分支的Y型核酸三联探针或四个核酸单链分支的十字型核酸四联探针，在应用时，由配对使用的两种核酸三联探针间或同种核酸四联探针间的互补单链分支碱基配对，并最终形成网络状的核酸探针聚合体。应用磁珠连接捕获探针与靶序列和核酸三联探针或核酸四联探针间的杂交技术，可方便地检测到10个左右拷贝的靶序列。

Description

核酸三联探针和核酸四联探针

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，具体地说是在核酸的分子杂交检测中，应用本发明的核酸三联探针或核酸四联探针，通过分子杂交，使核酸三联探针或核酸四联探针间形成网络状的探针聚合体，和磁珠连接的捕获探针在与靶序列和探针聚合体杂交时，使用常规荧光染料染色，可方便地定量或半定量确定靶序列含量。采用本发明技术检测靶序列，检测的敏感度可以达到10拷贝靶序列水平。

技术背景

在生物学，医学临床微生物，环境微生物和遗传病研究中，以及法医学和环境科学等研究中，核酸检测是常用的技术手段，由于具有高特异性，高灵敏度和可靠性，核酸检测不仅应用在理论研究中，也应用于临床致病微生物和遗传病的病因分析与检测。

分子杂交技术虽然在敏感度方面比酶扩增反应低一些，但是这种特性也使分子杂交同时具备了一种优点，在临床上进行检测时，对样品处理过程中的气溶胶污染不敏感，同时RNA和DNA检测处理上完全一样，提高分子杂交技术的检测敏感度，对于临床应用分子检测技术，具有实际应用价值。

核酸分子杂交在临床应用早期主要是斑点杂交，但过程比较复杂。目前国外已出现了商品化的三明治杂交试剂盒，利用连接在基质上(酶标板孔内)的捕获探针，与靶序列杂交后，使靶序列通过捕获探针连接在基质上，同时标记探针在靶序列的其他位置上杂交，因此杂交的特异性更强，操作也更简便，与免疫试剂操作类似。但该方法的是一种固液相的杂交，杂交效率会有一定影响，也很难进行自动化检测。与三明治杂交类似的方法，是应用磁珠连接的捕获探针，被检模板靶核酸和标记探针三者在液相中进行杂交，杂交的效率高，操作简便。随着相关技术研究的进展，应用磁珠的核酸提取的自动化设备已有商品出售，应用磁珠的核酸分子杂交自动化设备国内外也都有相关专利报道，随着分子杂交技术的研究进展，便捷的应用磁珠的自动化杂交设备的出现也是可预期的。

核酸分子杂交检测的敏感度，与探针的设计和标记检测方法有关。在非同位素标记检测中，其中敏感度较高的DNA分支探针(美国专利US5614362)，是通过在探针上连接树枝状的标记的相关结构，进一步通过增加连接酶标抗体数量达到增强反应显示。树枝状的标记结构，是经化学合成后连接有单链核酸序列，形成带有树枝状分枝的探针。日本学者发明的二联探针，通过两个探针间的互补核酸片段正链或负链碱基配对，形成探针聚合体，使检测的敏感度提高到单拷贝的程度(中国专利公开号CN 1484697，中国专利公开号CN 1364199A，美国专利US 6261846)。二联探针互补配对形成的聚合体，与化学合成的树枝状标记结构比较，设计和制备更简单，敏感度也更高，达到单拷贝靶序列的检测水平。

本发明设计的探针，使不同核酸串联探针间的端部与中部互补核酸片断配对，形成三联和四联探针。两个不同的三联探针间的互补单链分支核酸片断配对，可以形成网络状探针聚合体结构。+字型的四联核酸探针间单链分支的互补核酸片段正链或负链碱基配对，也可以形成网络状探针聚合体结构，核酸四联探针的空间构型中，其四个单链分支端部应位于正四面体的四个角部位，构成的探针聚合体是立体的三维网络结构。立体的三维网络结构的探针聚合体外侧是未配对的单链分支，因此四联核酸探针聚合体与靶序列碱基互补配对连接的效率更高。构成核酸四联探针的四个核酸串联探针中，相邻的两个核酸串联探针含有连锁的靶序列核酸片段正链或负链(每个靶序列分成两个连锁的核酸片段)，在核酸四联探针与靶序列杂交时，将有两个相邻的核酸串联探针共同与靶序列互补配对，同时两个核酸串联探针间的互补核酸片段正链或负链碱基配对，使核酸串联探针与靶序列的杂交温度提高，错配的可能性减低而杂交的可靠性更强。应用磁珠连接捕获探针，与靶序列和核酸四联探针杂交，通过荧光染料染色或酶标显色可以检测出单拷贝靶序列。

发明内容

本发明提供一种核酸三联探针和核酸四联探针，分别由六个或四个核酸串联探针构成两个三联探针或核酸四联探针。核酸串联探针由三个核酸片段正链或负链连接而成，核酸片段正链或负链可以是人工序列或靶序列核酸片段正链或负链。在用三个靶序列核酸片段正链或负链构成核酸串联探针时，三个靶序列核酸片段在靶序列的位置需间隔距离在30至50个核苷酸以上(双链DNA或RNA)。在构成核酸三联探针和核酸四联探针的核酸串联探针中，只需其中一个核酸串联探针中含有一个靶序列核酸片段正链或负链即可。应用六个或四个核酸串联探针，通过相邻的核酸串联探针的互补核酸片段正链或负链碱基配对，产生核酸三联探针或核酸四联探针。根据核酸三联探针和核酸四联探针外侧单链分支，可以分为两种类型，分别是5’端单链分支和3’端单链分支的核酸三联探针和四联探针。

1、核酸三联探针

由三个核酸串联探针构成。每个核酸串联探针均有三个核酸片段正链或负链构成，构成核酸串联探针的核酸片段正链或负链中至少有一个核酸片段正链或负链能够与靶序列互补配对。能够与每种核酸片段正链或负链互补配对的靶序列位置各不相同，彼此间距离较远没有连锁(即相邻的片段)的现象。构成三联探针的核酸串联探针，通过互补核酸片段正链或负链碱基配对，形成核酸三联探针。根据形成核酸三联探针和核酸探针聚合体的单链分支可分为两种类型，即具有3’单链分支和5’单链分支的两种核酸三联探针。

核酸三联探针必须成对使用，两个互补核酸三联探针是指构成核酸三联探针的中心互补配对核酸片段正链或负链完全不同外，外侧的单链分支可以互补配对(见图2，图3)。在杂交形成聚合体时，由六个核酸三联探针，两种核酸三联探针各三个，间隔排列并通过单链分支碱基互补配对，形成六边形的环状结构。在六边形环状结构的外侧有六个核酸单链分支，与核酸三联探针的互补片段配对，可形成以六边形环状为基础的核酸三联探针网络聚合体(见图4，图5)。

2、核酸四联探针

由四个核酸串联探针构成。每个探针均有三个核酸片段正链或负链构成，构成核酸串联探针的核酸片段正链或负链中至少有一个核酸片段正链或负链能够与靶序列互补配对。根据形成核酸四联探针和核酸探针聚合体的单链分支可分为两种类型，即具有3’单链分支和5’单链分支的两种核酸四联探针。

(1).3’单链分支核酸四联探针

在杂交时，四个核酸串联探针的5’的端部核酸片段正链或负链，与相邻核酸串联探针的中间互补核酸片段正链或负链配对，即1号核酸串联探针5’端部的A核酸片段与2号核酸串联探针中间的A’核酸片段反方向平行互补配对，2号核酸串联探针5’端部的D核酸片段与4号核酸串联探针中间的D’核酸片段反方向平行互补配对，3号核酸串联探针5’端部的B’核酸片段与1号核酸串联探针的中间B核酸片段反方向平行互补配对，4号核酸串联探针5’端部的E’核酸片段与3号核酸串联探针中间的E核酸片段反方向平行互补配对，四条核酸串联探针间的互补核酸片段正链或负链的交互配对，形成由四个核酸串联探针构成的+字型探针聚合体(见图6)。

(2).5’单链分支核酸四联探针

在杂交时，四个核酸串联探针的3’端部核酸片段正链或负链，与相邻核酸串联探针的中间互补核酸片段正链或负链配对，即1号核酸串联探针3’端部的C核酸片段与2号核酸串联探针中间的C’核酸片段反方向平行互补配对，2号核酸串联探针3’端部的D核酸片段与4号核酸串联探针中间的D’核酸片段反方向平行互补配对，3号核酸串联探针3’端部的B’核酸片段与1号核酸串联探针的中间B核酸片段反方向平行互补配对，4号核酸串联探针3’端部的E’核酸片段与3号核酸串联探针中间的E核酸片段反方向平行互补配对，四条核酸串联探针间的互补核酸片段正链或负链的互补配对，形成由四个核酸串联探针构成的+字型四联探针(见图8)。

由四种核酸串联探针的互补核酸片段正链或负链碱基配对形成的+字型四联探针，通过不同四联探针间单链分支的核酸片段正链或负链互补配对，四个四联探针可形成四边形环状结构，通过进一步与四联探针的互补配对连接，最终形成以四边形环状结构为基础的网络结构(见图7，图9)；

3、核酸三联探针和核酸四联探针的应用

核酸三联探针必须成对使用，两个互补核酸三联探针是指构成核酸三联探针的中心互补配对核酸片段正链或负链完全不同，外侧的单链分支可以互补配对(见图2-7，图2-8；图3-7，图3-8)。两个核酸三联探针由六个核酸串联探针构成，每个核酸串联探针由三个核酸片段正链或负链构成，共计18种核酸片段正链或负链，其中包含了每种核酸片段的正链和互补负链，因此共有9种核酸片段正链和负链构成。对于要求高敏感度的检测来说，核酸三联探针技术在单个靶序列核酸片断设计情况下，可检测到10个左右的靶序列拷贝数，用靶序列中不同位置的9种核酸片段构成的两种核酸三联探针，已完全足够了，对于靶序列中少于9种核酸片段正链或负链的情况，可以采用人工设计序列来代替。

核酸四联探针由四个核酸串联探针构成。每个核酸串联探针均有三个核酸片段正链或负链构成，共计有12个核酸片段正链或负链，由6种核酸片段的正链和负链构成，构成核酸串联探针的核酸片段正链或负链中至少有一种核酸片段的正负链与靶序列互补配对。杂交时由同一种核酸四联探针，通过不同核酸四联探针间的单链分支的核酸片段正链或负链互补配对，四个四联探针形成四边形环状结构，通过进一步与四联探针的互补配对连接，最终形成以四边形环状结构为基础的网络结构(见图7，图9)，6种核酸片段正链或负链既可以由靶序列构成，也可以由人工设计序列构成。

核酸四联探针由6种核酸片段正链或负链构成，即6种核酸片段正链或负链完全由靶序列中完全不连锁的核酸片段正链或负链构成，以达到高敏感度检测靶序列目的，同时在需要高敏感和高可靠性检测中，即利用连锁的两个靶序列构成相邻的核酸串联探针的核酸片段正链或负链。在核酸四联探针的十字型互补配对构型中，配对的横向和竖向核酸片段正链或负链分别可由两组不同的连锁核酸片段正链或负链构成，横向或竖向核酸片段正链或负链分别构成相邻两个核酸串联探针核酸片段正链或负链(见图10，图11)，即由靶序列上两个连锁的核酸片段正链或负链构成核酸四联探针的十字型互补配对构型中的横向互补配对核酸片段正链或负链，而由靶序列其他位置上连锁的两个核酸片段正链或负链构成核酸四联探针的十字型互补配对构型中的竖向互补配对核酸片段正链或负链。由此构成的核酸四联探针虽然只有靶序列两个位置上的四个核酸片段正链或负链，其余的核酸片段正链或负链可采用人工设计序列。采用这种设计的核酸四联探针，在与靶序列杂交时，将产生两个相邻核酸串联探针互补的核酸片段正链或负链配对外，同时两个相邻核酸串联探针与靶序列互补的核酸片段正链或负链配对(见图10，图11)。这样在核酸串联探针之间和两个相邻核酸串联探针与靶序列之间，存在三个互补配对的核酸片段正链或负链。其中每个核酸串联探针，有两个互补配对的核酸片段正链或负链，杂交时的Tm值相对较高，同时Tm值受到两个核酸串联探针的核酸片段正链或负链与靶序列互补配对的影响。

核酸三联探针也可以应用如权利1.F所述，两个不同的核酸串联探针含有的核酸片段正链或负链，其互补配对的靶序列可以是连锁的，构成核酸三联探针的第三个核酸串联探针，将有两个连锁的核酸片段的正链或负链构成。与核酸四联探针不同的是只有一条链(正链或负链)的靶序列核酸片段互补链配对结合有两条核酸串联探针。由于核酸三联探针成对使用，因此靶序列有两个不同位置产生该种情况(见图12，图13)。

4、核酸串联探针的Tm值与核酸片段正链或负链的Tm值

在进行分子杂交时，杂交温度一般都低于探针Tm值10-15℃左右，在接近Tm值的温度杂交，即杂交温度越高，探针与靶序列互补配对的要求也就越严格。构成核酸三联探针和核酸四联探针的核酸串联探针，由三个核酸片段正链或负链构成，核酸片段正链或负链的长度约为核酸串联探针的1/3长度，因此两者的Tm值完全不同，核酸片段正链或负链的长度与Tm值影响核酸串联探针的应用方式。核酸片段正链或负链在＞30-35bp时，核酸片段正链或负链的Tm值接近于核酸串联探针的Tm值，核酸串联探针可以构成核酸三联探针。即构成核酸串联探针的核酸片段正链或负链(靶序列)之间，在核酸串联探针内和构成三联探针的核酸串联探针间，无相互连锁的核酸片段正链或负链。核酸片段正链或负链在＜20-25bp时，核酸片段正链或负链的Tm值与核酸串联探针的Tm值具有较大的差异，由此构成的核酸串联探针，只能应用权力6所述的核酸四联探针设计，在核酸四联探针的十字型互补配对构型中，配对的横向和竖向核酸片段正链或负链分别可由两个不同位置的靶序列核酸片段正链或负链构成，每个靶序列核酸片段正链或负链分成两个连锁的核酸片段正链或负链，横向或竖向核酸片段正链或负链分别构成相邻两个核酸串联探针核酸片段正链或负链(见图10，图11)。在杂交时，两个相邻核酸串联探针与靶序列之间，存在三个互补配对的核酸片段正链或负链。其中对每个核酸串联探针而言，有两个互补配对的核酸片段正链或负链，而靶序列也有两个连锁的核酸片段正链或负链，分别与两个核酸串联探针互补核酸片段正链或负链碱基配对，杂交时的Tm值接近于连锁的两个核酸片段正链或负链作为完整核酸片段正链或负链的Tm值，因而相对较高，同时Tm值受到两个核酸串联探针的核酸片段正链或负链与靶序列互补配对的影响。

5、杂交缓冲液

如权力10所述的杂交缓冲液，采用0.5-6×SSPE(1×SSPE，由0.15M氯化钠，10mM磷酸二氢钠，1.25mM EDTA构成，pH 7.5)，0.5-50mM氯化镁或硫酸镁和0.3-30mM硫酸锰或氯化锰，用于促进核酸探针聚合体的形成，使核酸三联探针和核酸四联探针能够更快更有效地聚合，其中核酸三联探针只能在该缓冲液中聚合(见图17，图19)。

附图说明

图1.三个核酸片段正链或负链构成的核酸串联探针，图1-1.表示位于被检测生物体核酸中不同位置的靶序列，A，B和C，彼此间无连锁现象；图1-2.靶序列核酸片段A，B和C通过连接形成的核酸串联探针。

图2.3’单链分支的核酸三联探针与相关的核酸串联探针，图2-1、图2-2、图2-3、图2-4、图2-5、图2-6表示构成两种核酸三联探针的核酸串联探针；图2-7、图2-8表示两种核酸三联探针；图2-9由两种核酸三联探针图2-7型和图2-8型(各三个)构成的六边形基本框架结构。

图3.5’单链分支的核酸三联探针与相关的核酸串联探针，图3-1、图3-2、图3-3、图3-4、图3-5、图3-6表示构成两种核酸三联探针的核酸串联探针；图3-7、图3-8表示两种核酸三联探针；图3-9由两种核酸三联探针图3-7型和图3-8型(各三个)构成的六边形基本框架结构。

图4.具有3’单链分支的两种核酸三联探针互补配对形成的核酸探针聚合体。

图5.具有5’单链分支的两种核酸三联探针互补配对形成的核酸探针聚合体。

图6.3’单链分支的核酸四联探针与相关的核酸串联探针，图6-1、图6-2、图6-3、图6-4表示构成3’单链分支的核酸四联探针的核酸串联探针；图6-5.3’单链分支的四联核酸探针；图6-6.由四个核酸四联探针构成的具有3’单链分支的四边形基本框架结构。

图7.具有3’单链分支的核酸四联探针互补配对形成的聚合体。

图8.5’单链分支的核酸四联探针与相关的核酸串联探针，图8-1、图8-2、图8-3、图8-4表示构成5’单链分支的四联核酸探针的核酸串联探针；图8-5.5’单链分支的四联核酸探针；图8-6.由四个核酸四联探针构成的具有5’单链分支的四边形基本框架结构。

图9.具有5’单链分支的核酸四联探针互补配对形成的聚合体。

图10.(具有3’单链分支的核酸四联探针)具有连锁靶序列核酸片段正链或负链构成的核酸串联探针与靶序列的互补配对。

图11.(具有5’单链分支的核酸四联探针)具有连锁靶序列核酸片段正链或负链构成的核酸串联探针与靶序列的互补配对。

图12.(具有3’单链分支的核酸三联探针)具有连锁靶序列核酸片段正链或负链构成的核酸串联探针与靶序列的互补配对。

图12-1.具有连锁靶序列核酸片段正链或负链构成的核酸串联探针与靶序列的互补配对。I.捕获探针序列；II.连接有捕获探针的磁珠；III.靶序列；IV.两个核酸串联探针与靶序列互补配对区域。

图12-2具有连锁靶序列核酸片段正链或负链构成的核酸串联探针与靶序列的互补配对。

图13.(具有5’单链分支的核酸三联探针)具有连锁靶序列核酸片段正链或负链构成的核酸串联探针与靶序列的互补配对。

图13-1表示具有连锁靶序列核酸片段正链或负链构成的核酸串联探针与靶序列的互补配对。I.捕获探针序列；II.连接有捕获探针的磁珠；III.靶序列；IV.两个核酸串联探针与靶序列互补配对区域。

图13-2表示具有连锁靶序列核酸片段正链或负链构成的核酸串联探针与靶序列的互补配对。

图14.核酸三联探针序列，图14-1、图14-2、图14-3、图14-4、图14-5、图14-6表示构成两种核酸三联探针的六个核酸串联探针序列；图14-7、图14-8表示通过序列碱基互补配对构成两个核酸三联探针。

图15.HBV核酸四联探针序列，图15-1、图15-2、图15-3、图15-4表示构成核酸四联探针的四个核酸串联探针序列；图15-5表示通过序列碱基互补配对构成核酸四联探针。

图16.3’单链分支的核酸四联探针聚合体与靶序列和磁珠杂交。(1)圆球体为磁珠与捕获探针；(2).被检生物体核酸靶序列；(3).由核酸串联探针通过互补碱基配对形成的核酸串联探针聚合体。

图17.核酸三联探针和核酸四联探针杂交产物电泳图谱

核酸三联探针I和II在3至7泳道的不同温度的杂交，产生的杂交片段在250bp-3000bp之间，未在点样孔附近出现核酸探针聚合体。核酸四联探针在8和13泳道的不同温度的杂交，产生的杂交片段在250bp至点样孔之间，其中10和11泳道在点样孔附近出现大量核酸探针聚合体。

图18.HBV核酸四联探针杂交产物电泳图谱

HBV核酸四联探针在2至8泳道的不同温度的杂交，产生的杂交片段在250bp至点样孔之间，其中4和7泳道在点样孔附近出现大量核酸探针聚合体。

图19.核酸探针聚合杂交缓冲液

杂交缓冲液：4mM MnSO₄，12mM MgCl₂，2×SSPE，0.05％明胶，杂交温度66℃。

1.Marker(购至上海生工，产地BBI，编号MSM22)；

2.核酸四联探针由X060701，X060813，X060820和X060821构成(总量1000ng，每种探针250ng)；

3.单链X060721(总量1000ng)作为对照；

4.探针为X060701，X060813，X060814，X060816，X060817，X060818(总量1000ng)成对使用的两个核酸三联探针I和II；

5.探针为X060701，X060813，X060814(总量1000ng，每种探针333ng)核酸三联探针I；

6.探针为X060816，X060817，X060818(总量1000ng，每种探针333ng)核酸三联探针II；

7.Marker(购至上海生工，产地MBI，编号SM0231)；

其中，序号1，2，3，4，5，6，7对应图13中的电泳泳道。

图20.HBV检测敏感度

1号离心管模板为0拷贝；

2号离心管模板为10拷贝；

3号离心管模板为100拷贝；

4号离心管模板为1000拷贝；

5号离心管模板为10000拷贝；

6号离心管模板为100000拷贝；

荧光染色液为GelRed(购至上海开发科技发展有限公司，Biotium出品)母液稀释1000倍，稀释溶液为2×SSPE。磁珠，Dynal生产，M-270亲和素类型。

具体实施方式

1.核酸三联探针和核酸四联探针的设计

(1).核酸三联探针设计

采用自主(人工)设计的DNA序列，9个DNA片段序列如下；

用字母A，B，C，D，E，F，G，H和I代表不同核酸片段序列的正链，用字母A’，B’，C’，D’，E’，F’，G’，H’和I’，代表核酸片段的负链。

A 5’-gcgagcctga gctgtccga-3’

3’-cgctcggact cgacaggct-5’

A’5’-tcggacagc tcaggctcgc-3’

B 5’-cgcaggctct ggaccagca-3’

3’-gcgtccgaga cctggtcgt-5’

B’5’-tgctggtcc agagcctgcg-3’

C 5’-ggcacgcagt ccaggtcct-3’

3’-ccgtgcgtca ggtccagga-5’

C’5’-aggacctgg actgcgtgcc-3’

D 5’-acacgtagca cgtgctgctg-3’

3’-tgtgcatcgt gcacgacgac-5’

D’5’-cagcagcacg tgctacgtgt-3’

E 5’-gacgtcgagc accacgtgg-3’

3’-ctgcagctcg tggtgcacc-5’

E’5’-ccacgtggt gctcgacgtc-3’

F 5’-ggaccacctg ctgcagctg-3’

3’-cctggtggac gacgtcgac-5’

F’5’-cagctgcag caggtggtcc-3’

G 5’-gctcgtccac gaggagctg-3’

3’-cgagcaggtg ctcctcgac-5’

G’5’-cagctcctc gtggacgagc-3’

H 5’-gcaccagctg gaccacgtc-3’

3’-cgtggtcgac ctggtgcag-5’

H’5’-gacgtggtc cagctggtgc-3’

I 5’-aggagaccac cacgtggaca-3’

3’-tcctctggtg gtgcacctgt-5’

I’5’-tgtccacgtg gtggtctcct-3’

如权力1，2和3所述，上述9个核酸片段的正负链构成如下6个核酸串联探针，进一步可形成2个核酸三联探针。即第一号，第二号和第三号核酸串联探针互补配对形成I型核酸三联探针。第四号，第五号和第六号核酸串联探针互补配对形成II型核酸三联探针(见图14)。

第一号核酸串联探针 5’-A-B-C-3’ 以合成X060701

5’- gcgagcctga gctgtccga - cgcaggctct ggaccagca - ggcacgcagt ccaggtcct-3’

A B C

第二号核酸串联探针 5’-D-A’-F-3’ X060813

5’- acacgtagca cgtgctgctg - tcggacagc tcaggctcgc - ggaccacctg ctgcagctg-3’

D A’ F

第三号核酸串联探针 5’-B’-D’-E-3’ X060814

5’- tgctggtcc agagcctgcg - cagcagcacg tgctacgtgt - gacgtcgagc accacgtgg-3’

B’ D’ E

第四号核酸串联探针 5’-H’-I’-C’-3’ X060816

5’- gacgtggtc cagctggtgc - tgtccacgtg gtggtctcct - aggacctgg actgcgtgcc-3’

H’ I’ C’

第五号核酸串联探针 5’-G-H-E’-3’ X060817

5’- gctcgtccac gaggagctg - gcaccagctg gaccacgtc - ccacgtggt gctcgacgtc-3’

G H E’

第六号核酸串联探针 5’-I-G’-F’-3’ X060818

5’- aggagaccac cacgtggaca - cagctcctc gtggacgagc - cagctgcag caggtggtcc-3’

I G’ F’

(2).HBV型肝炎病毒检测核酸四联探针设计

对于乙肝病毒DNA检测用探针设计，根据DNA数据库的相关序列资料，分析同种病毒序列，选取保守序列作为靶核酸片段，其中两个靶核酸片段的碱基序列分别位于378-416靶核酸片段I和434-475靶核酸片段II。每个靶核酸片段分成两个连锁的核酸片段，分别是靶核酸片段I-1，靶核酸片段I-2和靶核酸片段II-1，靶核酸片段II-2。如权力1，4和5所述，核酸四联探针构成共有6个核酸片段正链或负链，连接成四个核酸串联探针，经互补核酸片段正链或负链碱基配对后形成核酸四联探针。如权力6所述，在核酸四联探针的十字型互补配对构型中，配对的横向和竖向核酸片段正链或负链分别可由两个不同位置的靶核酸片段正链或负链构成，即横向两个互补配对的核酸片段正链或负链由靶序列分成两个连锁的核酸片段正链或负链构成，而竖向两个互补配对的核酸片段正链或负链由另一位点靶序列分成两个连锁的核酸片段正链或负链构成。靶序列I和II的四个核酸片段正链或负链分别构成核酸四联探针的十字型互补配对构型中的横向和竖向配对核酸片段正链或负链，核酸四联探针的未配对核酸片段正链或负链分别由上述(1)的C和F核酸片段正链或负链构成(见图15)。

核酸片段序列和核酸串联探针如下；

靶序列I位于HBV全序列碱基378-416

5’-ggatgtgtct gcggcgttt-tatcatcttc ctctgcatcc t-3’

靶序列I-1a 靶序列I-2e

靶序列II位于HBV全序列碱基434-475

5’-ttcttgt tggttcttct ggac-tatcaa ggtatgttgc ccgtt-3’

靶序列II-1d 靶序列II-2b

靶序列I-1a

a(I-1) 5’-gat gtg tct gcg gcg ttt-3’

3’-cta cac aga cgc cgc aaa-5’

a’(I-1)’5’-aaa cgc cgc aga cac atc-3’

靶序列I-2e

e(I-2) 5’-tat cat ctt cct ctg cat cc-3’

3’-ata gta gaa gga gac gta gg-5’

e’(I-2)’5’-gga tgc aga gga aga tga ta-3’

靶序列II-1d

d(II-1) 5’-cttgt tggttcttct ggac-3’

3’-gaaca accaagaaga cctg-5’

d’(II-1)’5’-gtcc agaagaacca acaag-3’

靶序列II-2b

b(II-2) 5’-tatcaa ggtatgttgc ccg-3’

3’-atagtt ccatacaacg ggc-5’

b’(II-2)’5’-cgg gcaacatacc ttgata-3’

第七号核酸串联探针5’-a(I-1)-b(II-2)-C-3’HX060901

5’-ga tgtgtctgcg gcgttt-tatcaa ggtatgttgcccg-ggcacgcagt ccaggtcct-3’

a(I-1) b(II-2) C

第八号核酸串联探针5’-d(II-1)-a’(I-1)’-F-3’HX060902

5’-cttgt tggttcttct ggac-aaacgc cgcagacaca tc-ggaccacctg ctgcagctg-3’

d(II-1) a’(I-1)’ F

第九号核酸串联探针5’-b’(II-2)’-e(I-2)-F’-3’HX060903

5’-cgg gcaacatacc ttgata-tatc atcttcctct gcatcc-cagctgcag caggtggtcc-3’

b’(II-2)’ e(I-2) F’

第十号核酸串联探针5’-e’(I-2)’-d’(II-1)’-C’-3’HX060904

5’-ggatgc agaggaagat gata-gtcc agaagaacca acaag-aggacctgg actgcgtgcc-3’

e’(I-2)’ d’(II-1)’ C’

(3)TB结核杆菌核酸四联探针设计

根据美国专利(US 5547842)提出的人型和牛型结核杆菌rRNA的探针序列，在共计4个核酸探针片段中，采用23s rRNA的三个核酸探针，并结合Genbank中牛型结核杆菌的全序列中的rRNA基因序列分析略作改动，其中相当于大肠杆菌23S rRNA碱基540-575位的核酸探针片段用于捕获探针连接。其中相当于大肠杆菌23S rRNA碱基1155-1190位和碱基2195-2235位的两个探针核酸片段，每个靶核酸片段分成两个连锁的核酸片段，分别是靶核酸片段III-1，靶核酸片段III-2和靶核酸片段IV-1，靶核酸片段IV-2。如权力1，4和5所述，核酸四联探针构成共有6个核酸片段正链和负链，连接成四个核酸串联探针，经互补核酸片段正链和负链碱基配对后形成核酸四联探针。如权力6所述，在核酸四联探针的十字型互补配对构型中，配对的横向和竖向核酸片段正链和负链分别可由两个不同位置的靶核酸片段正链和负链构成，即横向两个互补配对的核酸片段正链和负链由靶序列分成两个连锁的核酸片段正链和负链构成，而竖向两个互补配对的核酸片段正链和负链由另一位点靶序列分成两个连锁的核酸片段正链和负链构成(见图10，图11)。靶序列I和II的四个核酸片段正链和负链分别构成核酸四联探针的十字型互补配对构型中的横向和竖向配对核酸片段正链和负链，核酸四联探针的未配对核酸片段正链和负链分别由上述发明实施1.(1)的C和F核酸片段正链和负链构成。

核酸片段序列和核酸串联探针序列如下；

III靶核酸片段相当于大肠杆菌23S rRNA碱基1153-1193

5’-gctgccctacccacacc-caccacaaggtgatgtcag-3’

III-1 III-2

IV靶核酸片段相当于大肠杆菌23S rRNA碱基2194-2235

5’-gctgtccctaaacccgattc-agggttcgaggttagatgc-3’

IV-1 IV-2

捕获探针相当于大肠杆菌23S rRNA碱基540-575位

5’-ccatcaccaccctcctccggagaggaaaagg-3’

靶序列III-1

a(III-1) 5’-gctgccctacccacacc-3’

3’-cgacgggatgggtgtgg-5’

a’(III-1)’5’-ggtgtgggtagggcagc-3’

靶序列III-2

e(III-2) 5’-caccacaaggtgatgtcag-3’

3’-gtggtgttccactacagtc-5’

e’(III-2)’5’-ctgacatcaccttgtggtg-3’

靶序列IV-1

d(IV-1) 5’-gctgtccctaaacccgattc-3’

3’-cgacagggatttgggctaag-5’

d’(IV-1)’5’-gaatcgggtttagggacagc-3’

靶序列IV-2

b(IV-2) 5’-agggttcgaggttagatgc-3’

3’-tcccaagctccaatctacg-3’

b’(IV-2)’5’-gcatctaacctcgaaccct-3’

第十一号核酸串联探针5’-a(III-1)-b(IV-2)-C-3’TX060901

5’-gctgccctacccacacc-agggttcgaggttagatgc-ggcacgcagt ccaggtcct-3’

a(III-1) b(IV-2) C

第十二号核酸串联探针5’-d(IV-1)-a’(III-1)’-F-3’TX060902

5’-gctgtccctaaacccgattc-ggtgtgggtagggcagc-ggaccacctg ctgcagctg-3’

d(IV-1) a’(III-1)’ F

第十三号核酸串联探针5’-b’(IV-2)’-e(III-2)-F’-3’TX060903

5’-gcatctaacctcgaaccct-caccacaaggtgatgtcag-cagctgcag caggtggtcc-3’

b’(IV-2)’ e(III-2) F’

第十四号核酸串联探针5’-e’(III-2)’-d’(IV-1)’-C’-3’TX060904

5’-ctgacatcaccttgtggtg-gaatcgggtttagggacagc-aggacctgg actgcgtgcc-3’

e’(III-2)’ d’(IV-1)’ C’

2.实施案例

例1核酸四联探针杂交后形成的聚合体长度

通过探针组的杂交，形成探针聚合体，依据探针杂交的复性温度可以确定杂交的效率，具体的方法如下：

1.依据本发明的核酸串联探针组。

2.20×SSC(1×SSC，由0.15M氯化钠，15mM柠檬酸三钠组成，pH7.0)。

3.探针5ul(总量1000ng)，浓度10的13次方拷贝/ul，加入已灭菌的0.2ml离心管中，同时加入40ul 20×SSC，盖上管盖，94℃30秒，杂交保温50℃，52℃，54℃，56℃，58℃，60℃，62℃，64℃，66℃，68℃，70℃，共11个处理，保温时间2小时。

4.杂交保温产物，经0.5％琼脂糖电泳，DNA MARKER应用30000-40000bp。

多聚体的长度与杂交温度密切相关，通过梯度温度处理，筛选多聚体长度和产量最高的温度和处理时间。筛选的的依据是根据电泳的显示结果。

例2.磁珠杂交步骤(Gel Red显色)

1)将1mg磁珠(北美基因股份有限公司，xMagTM异硫氰酸根末端磁性微粒)连接完成后，去上清，加入100ul双蒸水；

2)将2ul磁珠加入到离心管中，加入10ul模板，加入MnSO₄，MgCl₂，20×SSPE，双蒸水，使其终浓度为：3mmol/L MnSO₄，MgCl₂9mmol/L，2×SSPE；

3)将上述溶液在60℃条件下杂交2小时，期间要注意磁珠沉淀的产生；

4)杂交完成后，用磁铁将磁珠吸附在一起，去掉上清；

5)加入预先杂交完成的探针溶液〔3mmol/L MnSO₄，MgCl₂9mmol/L，2×SSPE，每20ul杂交液中，各含有2ul HX060901，HX060902，HX060903，HX060904(四种探针的浓度为10pmol/L)，在66℃下杂交2小时〕20ul，在60℃条件下杂交2小时；

6)杂交完成后，用磁铁将磁珠吸附在一起，去掉上清。用2×SSPE清洗液50ul在45℃下清洗磁珠5分钟；

7)磁铁吸附，磁性分离，去上清。用2×SSPE清洗液50ul在45℃下清洗磁珠5分钟；

8)磁铁吸附，磁性分离，去上清。用2×SSPE清洗液50ul在50℃下清洗磁珠5分钟；

9)磁铁吸附，磁性分离，去上清。加入1∶10000的Gel Red溶液30ul，在310nm紫外光下观察。

例三Dynal M-270磁珠杂交步骤(Gel Red显色)

1)加入探针HX060901，HX060902，HX060903，HX060904(四种探针的浓度为10pmol/ul)各2ul，和一定量的MnSO₄，MgCl₂，20×SSPE，双蒸水，使其终浓度为3mmol/L MnSO₄，9mmol/L MgCl₂，2×S SPE；

2)将上述溶液在66℃下杂交4小时；

3)杂交完成后，加入10ul的模板，1ul的带生物素的捕获探针(捕获探针浓度为33ng/ul)；

4)将上述溶液在60℃下杂交1小时；

5)杂交完成后，在原体系中加入Dynal M-270磁珠2ul，在25℃下结合30分钟；

6)结合完成后，用磁铁将磁珠吸附在一起，去掉上清。加入50ul的2×SSPE，在40℃下清洗磁珠5分钟；

7)磁铁吸附，磁性分离，去上清。加入50ul的2×SSPE，在45℃下清洗磁珠5分钟；

8)磁铁吸附，磁性分离，去上清。加入1∶10000的Gel Red溶液30ul，在310nm紫外光下观察。

序列表

<110>富阳市金信投资有限公司

<120>核酸三联探针和核酸四联探针

<140>2007100006900

<141>2007-01-17

<160>49

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工片段A，与其它片段连接形成三联或四联核酸串联探针

<400>1

gcgagcctga gctgtccga 19

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工片段A’，与其它片段连接形成三联或四联核酸串联探针

<400>2

tcggacagct caggctcgc 19

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工片段B，与其它片段连接形成三联或四联核酸串联探针

<400>3

cgcaggctct ggaccagca 19

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工片段B’，与其它片段连接形成三联或四联核酸串联探针

<400>4

tgctggtcca gagcctgcg 19

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工片段C，与其它片段连接形成三联或四联核酸串联探针

<400>5

ggcacgcagt ccaggtcct 19

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工片段C’，与其它片段连接形成三联或四联核酸串联探针

<400>6

aggacctgga ctgcgtgcc 19

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工片段D，与其它片段连接形成三联或四联核酸串联探针

<400>7

acacgtagca cgtgctgctg 20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工片段D’，与其它片段连接形成三联或四联核酸串联探针

<400>8

cagcagcacg tgctacgtgt 20

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工片段E，与其它片段连接形成三联或四联核酸串联探针

<400>9

gacgtcgagc accacgtgg 19

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工片段E’，与其它片段连接形成三联或四联核酸串联探针

<400>10

ccacgtggtg ctcgacgtc 19

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工片段F，与其它片段连接形成三联或四联核酸串联探针

<400>11

ggaccacctg ctgcagctg 19

<210>12

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工片段F’，与其它片段连接形成三联或四联核酸串联探针

<400>12

cagctgcagc aggtggtcc 19

<210>13

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工片段G，与其它片段连接形成三联或四联核酸串联探针

<400>13

gctcgtccac gaggagctg 19

<210>14

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工片段G’，与其它片段连接形成三联或四联核酸串联探针

<400>14

cagctcctcg tggacgagc 19

<210>15

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工片段H，与其它片段连接形成三联或四联核酸串联探针

<400>15

gcaccagctg gaccacgtc 19

<210>16

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工片段H’，与其它片段连接形成三联或四联核酸串联探针

<400>16

gacgtggtcc agctggtgc 19

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工片段I，与其它片段连接形成三联或四联核酸串联探针

<400>17

aggagaccac cacgtggaca 20

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工片段I’，与其它片段连接形成三联或四联核酸串联探针

<400>18

tgtccacgtg gtggtctcct 20

<210>19

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针X060701：由人工片段A、B、C串联合成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(38)

<220>

<221>misc_feature

<222>(39)..(57)

<400>19

gcgagcctga gctgtccgac gcaggctctg gaccagcagg cacgcagtcc aggtcct 57

<210>20

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针X060813：由人工片段D、A’、F串联合成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(39)

<220>

<221>misc_feature

<222>(40)..(58)

<400>20

acacgtagca cgtgctgctg tcggacagct caggctcgcg gaccacctgc tgcagctg 58

<210>21

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针X060814：由人工片段B’、D’、E串联合成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(39)

<220>

<221>misc_feature

<222>(40)..(58)

<400>21

tgctggtcca gagcctgcgc agcagcacgt gctacgtgtg acgtcgagca ccacgtgg 58

<210>22

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针X060816：由人工片段H’、I’、C’串联合成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(39)

<220>

<221>misc_feature

<222>(40)..(58)

<400>22

gacgtggtcc agctggtgct gtccacgtgg tggtctccta ggacctggac tgcgtgcc 58

<210>23

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针X060817：由人工片段G、H、E’串联合成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(39)

<220>

<221>misc_feature

<222>(40)..(57)

<400>23

gctcgtccac gaggagctgg caccagctgg accacgtccc acgtggtgct cgacgtc 57

<210>24

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针X060818：由人工片段I、G’、F’串联合成

<400>24

aggagaccac cacgtggaca cagctcctcg tggacgagcc agctgcagca ggtggtcc 58

<210>25

<211>40

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(40)

<400>25

ggatgtgtct gcggcgtttt atcatcttcc tctgcatcct 40

<210>26

<211>42

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(42)

<400>26

ttcttgttgg ttcttctgga ctatcaaggt atgttgcccg tt 42

<210>27

<211>18

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)

<400>27

aaacgccgca gacacatc 18

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)

<400>28

ggatgcagag gaagatgata 20

<210>29

<211>19

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)

<400>29

gtecagaaga accaacaag 19

<210>30

<211>19

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)

<400>30

cgggcaacat accttgata 19

<210>31

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>核酸探针HX060901：靶序列位点a(I-1)、e(I-2)和人工片段C相互连接形成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(18)

<220>

<221>misc_feature

<222>(19)..(37)

<220>

<221>misc_feature

<222>(38)..(56)

<400>31

gatgtgtctg cggcgtttta tcaaggtatg ttgcccgggc acgcagtcca ggtcct 56

<210>32

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>核酸探针HX060902：靶序列位点d(II-1)、a’(I-1)’和人工片段F相互连接形成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(37)

<220>

<221>misc_feature

<222>(38)..(56)

<400>32

cttgttggtt cttctggaca aacgccgcag acacatcgga ccacctgctg cagctg 56

<210>33

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>核酸探针HX060903：靶序列位点b’(II-2)’、e(I-2)和人工片段F’相互连接形成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(39)

<220>

<221>misc_feature

<222>(40)..(58)

<400>33

cgggcaacat accttgatat atcatcttcc tctgcatccc agctgcagca ggtggtcc 58

<210>34

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>核酸探针HX060904：靶序列位点e’(I-2)’、d’(II-1)’和人工片段C’相互连接形成的

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(39)

<220>

<221>misc_feature

<222>(40)..(58)

<400>34

ggatgcagag gaagatgata gtccagaaga accaacaaga ggacctggac tgcgtgcc 58

<210>35

<211>36

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(17)

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)..(36)

<400>35

gctgccctac ccacacccac cacaaggtga tgtcag 36

<210>36

<211>39

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(39)

<400>36

gctgtcccta aacccgattc agggttcgag gttagatgc 39

<210>37

<211>31

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>5’末端BIO修饰

<400>37

ccatcaccac cctcctccgg agaggaaaag g 31

<210>38

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>靶序列III-1中的DNA片段a(III-1)

<400>38

gctgccctac ccacacc 17

<210>39

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>靶序列III-1中DNA片段a(III-1)的互补DNA片段a’(III-1)’

<400>39

ggtgtgggta gggcagc 17

<210>40

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>靶序列III-2中的DNA片段e(III-2)

<400>40

caccacaagg tgatgtcag 19

<210>41

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>靶序列III-2中DNA片段e(III-2)的互补DNA片段e’(III-2)’

<400>41

ctgacatcac cttgtggtg 19

<210>42

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>靶序列IV-1的DNA片段d(IV-1)

<400>42

gctgtcccta aacccgattc 20

<210>43

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>靶序列IV-1中DNA片段d(IV-1)的互补DNA片段d’(IV-1)’

<400>43

gaatcgggtt tagggacagc 20

<210>44

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>靶序列IV-2中的DNA片段b(IV-2)

<400>44

agggttcgag gttagatgc 19

<210>45

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>靶序列IV-2中DNA片段b(IV-2)的互补DNA片段b’(IV-2)’

<400>45

gcatctaacc tcgaaccct 19

<210>46

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>核酸串联探针TX060901：由人工片段a(III-1)、b(IV-2)和C相互连接形成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(17)

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)..(36)

<220>

<221>misc_feature

<222>(37)..(55)

<400>46

gctgccctac ccacaccagg gttcgaggtt agatgcggca cgcagtccag gtcct 55

<210>47

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>核酸串联探针TX060902：由人工片段d(IV-1)、a’(III-1)’和F相互连接形成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(37)

<220>

<221>misc_feature

<222>(38)..(56)

<400>47

gctgtcccta aacccgattc ggtgtgggta gggcagcgga ccacctgctg cagctg 56

<210>48

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>核酸串联探针TX060903：由人工片段b’(IV-2)’、e(III-2)、F’相互连接形成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(38)

<220>

<221>misc_feature

<222>(39)..(57)

<400>48

gcatctaacc tcgaaccctc accacaaggt gatgtcagca gctgcagcag gtggtcc 57

<210>49

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>核酸串联探针TX060904：由人工片段e’(III-2)’、d’(IV-1)’、C’相互连接形成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(39)

<220>

<221>misc_feature

<222>(40)..(58)

<400>49

ctgacatcac cttgtggtgg aatcgggttt agggacagca ggacctggac tgcgtgcc 58

Claims

1.构成核酸三联探针或核酸四联探针的核酸串联探针，具有如下的共同特征；

A.每个核酸串联探针均由三个核酸片段的正链或负链构成，由字母A，B，C分别代表不同的核酸片段正链，A’，B’ 和C’分别代表核酸片段的负链，正链5’-A-B-C-3’与负链3’-A’-B’-C’-5’完全反方向平行碱基互补配对，形成双链DNA或RNA，这是公知的分子生物学知识；

B.权利1.A所述的核酸片段，是指含有正链和负链并反方向平行碱基互补配对的双链核酸序列，核酸片段正链和负链是靶序列中的部分序列，也可由人工序列替代；

C.如权利1.B所述，构成核酸串联探针的核酸序列，可以是靶序列中的核酸片段正链或负链，也可以是人工设计的核酸序列，但在核酸三联探针和核酸四联探针中必须含有一个以上靶序列核酸片段正链和负链；

D.构成核酸串联探针三个核酸片段的正链或负链，其碱基互补配对的靶序列核酸片段正链或负链位置各不相同，在不同的核酸串联探针中，分别含有同一种核酸片段的正链和负链；

E.核酸三联探针或核酸四联探针由三个或四个核酸串联探针构成，可以形成5’单链分支和3’单链分支两种类型；

F.核酸三联探针或核酸四联探针中的两个不同的核酸串联探针含有的核酸片段正链或负链，其碱基互补配对的靶序列也可以是连锁的；

G.核酸三联探针或核酸四联探针中的不同核酸串联探针，由完全不同的核酸片段正链或负链构成，相邻的核酸串联探针间具有互补的核酸片段正链或负链，三个或四个核酸串联探针通过互补的核酸片段正链或负链的碱基配对，形成核酸三联探针或核酸四联探针；

H.如权力1.A，1.B，1.C，1.D，1.E，1.F和1.G所述，在核酸三联探针或核酸四联探针中，构成核酸串联探针的所有核酸片段正链或负链，分别位于不同核酸串联探针的端部和中部；

I.如权力1.A，1.B，1.C，1.D，1.E，1.F，1.G和1.H所述，核酸串联探针可以完全由核酸片段正链同方向连接形成，也可以完全由核酸片段负链同方向连接形成和由核酸片段的正链和负链同方向混合连接形成，核酸序列同方向连接是公知的分子生物学知识；

J.构成核酸串联探针的核酸片段正链或负链长度在5-500个核苷酸。

2.3’单链分支的三联核酸探针；

A.如权力1所述，由字母A，B，C，D，E，F，G，H和I分别代表不同的核酸片段正链，A’，B’，C’，D’，E’，F’，G’，H’和I’分别代表核酸片段的负链，构成不同的核酸串联探针；

B.如权力2.A所述，使用六个核酸串联探针，核酸片段正链或负链构成分别为1号核酸串联探针5’-A-B-C-3’，2号核酸串联探针5’-D-A’-F-3’，3号核酸串联探针5’-B’-D’-E-3’，4号核酸串联探针5’-H’-I’-C’-3’，5号核酸串联探针5’-I-G’-F’-3’，6号核酸串联探针5’-G-H-E’-3’；

C.如权力1.G，1.H，2.A和2.B所述，在杂交时，三个核酸串联探针的5’的端部核酸片段正链或负链，与相邻核酸串联探针的中间核酸片段正链或负链的碱基互补配对，即1号核酸串联探针5’端部的A核酸片段正链与2号核酸串联探针中间的A’核酸片段负链反方向平行碱基互补配对，2号核酸串联探针5’端部的D’核酸片段负链与3号核酸串联探针中间的D核酸片段正链反方向平行碱基互补配对，3号核酸串联探针5’端部的B’核酸片段负链与1号核酸串联探针的中间B核酸片段正链反方向平行碱基互补配对，三条核酸串联探针间的核酸片段正链或负链的碱基互补配对，形成由三个核酸串联探针构成的Y型I核酸三联探针；

4号核酸串联探针5’端部的H’核酸片段负链与6号核酸串联探针中间的H核酸片段正链反方向平行碱基互补配对，5号核酸串联探针5’端部的I核酸片段正链与4号核酸串联探针中间的I’核酸片段负链反方向平行碱基互补配对，6号核酸串联探针5’端部的G’核酸片段负链与5号核酸串联探针中间的G核酸片段正链反方向平行碱基互补配对，三条核酸串联探针间的核酸片段正链或负链的碱基互补配对，形成由三个核酸串联探针构成的Y型II核酸三联探针；

D.如权力1.G，1.H，2.A，2.B和2.C所述，三条核酸串联探针间的核酸片段正链或负链的碱基互补配对，形成由三个核酸串联探针构成的Y型核酸三联探针，其中核酸串联探针5’端在Y型核酸三联探针的中央，而3’形成外侧的单链分支；

E.如权力1.G，1.H，2A，2B，2C和2D所述，由三种核酸串联探针的核酸片段正链或负链碱基互补配对形成的Y型核酸三联探针，I和II型两种核酸三联探针间的3’单链分支的核酸片段正链或负链的碱基反方向平行碱基互补配对，六个核酸三联探针可形成具有六个分支链的六边形环状结构，通过进一步与核酸三联探针的单链分支间碱基互补配对连接，最终形成以六边形环状结构为基础的网络结构；

F.如1.F所述，两个不同的核酸串联探针含有的核酸片段正链或负链，其碱基互补配对的靶序列也可以是连锁的，构成核酸三联探针的第三个核酸串联探针，有两个连锁的核酸片段的正链或负链构成。

3.5’单链分支的三联核酸探针；

A.如权力1所述，由字母J，K，L，M，N，O，P，Q和R分别代表不同的核酸片段正链，J’，K’，L’，M’，N’，O’，P’，Q’和R’分别代表核酸片段的负链，构成不同的核酸串联探针；

B.如权力3.A所述，使用六个核酸串联探针，核酸片段正链或负链构成分别为1号核酸串联探针5’-J-K-L-3’，2号核酸串联探针5’-M-N-K’-3’，3号核酸串联探针5’-O-L’-N’-3’，4号核酸串联探针5’-O’-P-Q-3’，5号核酸串联探针5’-J’-R-P’-3’，6号核酸串联探针5’-M’-Q’-R’-3’；

C.权力1.G，1.H，3.A和3.B所述，在杂交时，三个核酸串联探针的3’的端部核酸片段正链或负链，与相邻核酸串联探针的中间核酸片段正链或负链的碱基互补配对，即1号核酸串联探针3’端部的L核酸片段正链与3号核酸串联探针中间的L’核酸片段负链反方向平行碱基互补配对，2号核酸串联探针3’端部的K’核酸片段负链与1号核酸串联探针中间的K核酸片段正链反方向平行碱基互补配对，3号核酸串联探针3’端部的N’核酸片段负链与2号核酸串联探针的中间N核酸片段正链反方向平行碱基互补配对，三条核酸串联探针间核酸片段的正链与负链互补碱基配对，形成由三个核酸串联探针构成的Y型III核酸三联探针；

4号核酸串联探针3’端部的Q核酸片段正链与6号核酸串联探针中间的Q’核酸片段负链反方向平行碱基互补配对，5号核酸串联探针3’端部的P’核酸片段负链与4号核酸串联探针中间的P核酸片段正链反方向平行碱基互补配对，6号核酸串联探针3’端部的R’核酸片段负链与5号核酸串联探针中间的R核酸片段正链反方向平行碱基互补配对，三条核酸串联探针间的核酸片段正链或负链的碱基互补配对，形成由三个核酸串联探针构成的Y型IV核酸三联探针；

D.如权力1.G，1.H，3.A，3.B和3.C所述，三条核酸串联探针间的核酸片段正链或负链的碱基互补配对，形成由三个核酸串联探针构成的Y型核酸三联探针，其中核酸串联探针3’端在Y型核酸三联探针的中央，而5’形成外侧的单链分支；

E.如权力1.G，1.H，3.A，3.B，3.C和3.D所述，由三种核酸串联探针的核酸片段正链或负链碱基互补配对形成的Y型核酸三联探针，III和IV型两种核酸三联探针间的3’单链分支的核酸片段正链或负链反方向平行碱基互补配对，六个核酸三联探针可形成具有六个分支链的六边形环状结构，通过进一步与核酸三联探针的单链分支碱基互补配对连接，最终形成以六边形环状结构为基础的网络结构；

F.如1.F所述，两个不同的核酸串联探针含有的核酸片段正链或负链，其碱基互补配对的靶序列也可以是连锁的，构成核酸三联探针的第三个核酸串联探针，将有两个连锁的核酸片段的正链或负链构成；。

4.具有3’单链分支的四联核酸探针；

A.如权力1所述，由字母A，B，C，D，E和F分别代表不同的核酸片段正链，A’，B’，C’，D’，E’ 和F’分别代表核酸片段的负链，构成不同的核酸串联探针；

B.如权力4.A所述，使用四个核酸串联探针，核酸片段正链或负链构成分别为1号核酸串联探针5’-A-B-C-3’，2号核酸串联探针5’-D-A’-F-3’，3号核酸串联探针5’-B’-E-F’-3’和4号核酸串联探针5’-E’-D’-C’-3’；

C.如权力1.G，1.H和4.B所述，在杂交时，四个核酸串联探针的5’的端部核酸片段正链或负链，与相邻核酸串联探针的中间核酸片段正链或负链的碱基互补配对，即1号核酸串联探针5’端部的A核酸片段正链与2号核酸串联探针中间的A’核酸片段负链反方向平行碱基互补配对，2号核酸串联探针5’端部的D核酸片段正链与4号核酸串联探针中间的D’核酸片段负链反方向平行碱基互补配对，3号核酸串联探针5’端部的B’核酸片段负链与1号核酸串联探针的中间B核酸片段正链反方向平行碱基互补配对，4号核酸串联探针5’端部的E’核酸片段负链与3号核酸串联探针中间的E核酸片段正链反方向平行碱基互补配对，四条核酸串联探针间的核酸片段正链与负链的互补碱基配对，形成由四个核酸串联探针构成的十字型探针聚合体；

D.如权力1.G，1.H，4.A，4.B和4.C所述，四条核酸串联探针间的核酸片段正链或负链的碱基互补配对，形成由四个核酸串联探针构成的十字型探针聚合体，其中核酸串联探针5’端在大十字型聚合体的中央，而3’形成外侧的四个单链分支；

E.如权力1.G，1.H，4.A，4.B，4.C和4.D所述，由四种核酸串联探针的核酸片段正链或负链碱基互补配对形成的十字型四联探针，通过同种四联探针间的3’单链分支的核酸片段正链和负链的碱基互补配对，四个核酸四联探针可形成带有八个单链分支的四边形环状结构，通过进一步与四联探针的3’单链分支的核酸片段正链和负链的碱基互补配对连接，最终形成以四边形环状结构为基础的网络结构。

5.具有5’单链分支的四联核酸探针；

B.权力5.A所述，使用四个核酸串联探针，核酸片段正链或负链构成分别为1号核酸串联探针5’-A-B-C-3’， 2号核酸串联探针5’-F-C’-D-3’，3号核酸串联探针5’-F’-E-B’-3’和4号核酸串联探针5’-A’-D’-E’-3’；

C.如权力1.G，1.H和5.B所述，在杂交时，四个核酸串联探针的3’端部核酸片段正链或负链，与相邻核酸串联探针的中间核酸片段正链或负链的碱基互补配对，即1号核酸串联探针3’端部的C核酸片段正链与2号核酸串联探针中间的C’核酸片段负链反方向平行碱基互补配对，2号核酸串联探针3’端部的D核酸片段正链与4号核酸串联探针中间的D’核酸片段负链反方向平行碱基互补配对，3号核酸串联探针3’端部的B’核酸片段负链与1号核酸串联探针的中间B核酸片段正链反方向平行碱基互补配对，4号核酸串联探针3’端部的E’核酸片段负链与3号核酸串联探针中间的E核酸片段正链反方向平行碱基互补配对，四条核酸串联探针间核酸片段正链与负链的碱基互补配对，形成由四个核酸串联探针构成的十字型核酸四联探针；

D.如权力1.G，1.H，5.A，5B和5.C所述，四条核酸串联探针间的核酸片段正链或负链的碱基互补配对，形成由四个核酸串联探针构成的十字型四联探针，其中核酸串联探针3’端在大十字型聚合体的中央，而5’形成外侧四个单链分支；

E.如权力1.G，1.H，5.A，5.B，5.C和5.D所述，由四种核酸串联探针的核酸片段正链或负链碱基互补配对形成的十字型四联探针，通过不同四联探针间的5’单链分支的核酸片段正链或负链碱基互补配对，四个核酸四联探针可形成带有八个单链分支的四边形环状结构，通过进一步与四联探针的5’单链分支的核酸片段正链或负链碱基互补配对连接，最终形成以四边形环状结构为基础的网络结构。

6.如权力1.D，1.F，权力4和权力5所述，在核酸四联探针的十字型配对构型中，配对的横向和竖向核酸片段正链或负链分别可由两个不同位置的靶序列核酸片段正链或负链构成，即横向两个碱基互补配对的核酸片段正链或负链由一个靶序列核酸片段正链或负链分成两个连锁的核酸片段正链或负链构成，而竖向两个碱基互补配对的核酸片段正链或负链由另一位点的一个靶序列核酸片段正链或负链分成两个连锁的核酸片段正链或负链构成。

7.如权利1所述，核酸串联探针可以是单链DNA，双链DNA，单链RNA或双链RNA构成。

8.核酸串联探针的产生，可采用公知的分子生物学方法，如化学合成，克隆到质粒，PCR扩增，RNA聚合酶转录探针等。

9.如权利1所述，靶序列是指被检生物体的DNA或RNA，可直接固着在固相介质(尼龙膜，硝酸纤维素膜，PVDF膜，磁珠，玻璃和塑料等)上，也可通过捕获探针间接连接在介质上

10.杂交缓冲液由0.5-6×SSPE(1×SSPE，由0.15M氯化钠，10mM磷酸二氢钠，1.25mM EDTA，pH 7.5)，0.5-50mM氯化镁或硫酸镁和0.3-30mM硫酸锰或氯化锰构成。