JP2013520195A - Ｙ字型プローブ及びその変形型、並びこれを利用したｄｎａマイクロアレイ、キット及び遺伝子分析方法 - Google Patents

Ｙ字型プローブ及びその変形型、並びこれを利用したｄｎａマイクロアレイ、キット及び遺伝子分析方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、遺伝子型の検査及び分析の際に、敏感度、特異度及び正確度を改善して診断に広く使われることができる、一つの本体内に２個のプローブ部位を有するＹ字型ヌクレオチドプローブ及びこれを利用したＤＮＡマイクロアレイ、キット及び遺伝子分析方法に関する。本発明のＹ字型プローブの構造は、左側プローブ部分、左側幹部分、リンカー(ｌｉｎｋｅｒ)、右側幹部分、右側プローブ部分の５種の部位からなる。本発明のＤＮＡマイクロアレイは、同一遺伝子を同時に重複検索するか相異である２個の標的遺伝子を同時に検索することで、検査の正確度を高めることができる。特に、標的遺伝子と対照遺伝子を一つのスポット(ｓｐｏｔ)で同時に検索することで、分析時のエラーを減らすことができ、定量的な分析が可能であり、標準化が容易である。本発明のＹ字型プローブは遺伝子型分析と遺伝子発現分析、突然変異やＳＮＰ分析に利用可能であり、疾病診断と予測、治療方針決定など遺伝子診断に広く使われることができる。

Description

本発明は、遺伝子型の検査及び分析の際に、敏感度、特異度及び正確度を改善して診断に広く使われることができる、一つの本体内に２個のプローブ部位を有するＹ字型ヌクレオチドプローブ及びその変形型(ｄ字型またはｂ字型プローブ)、並びこれを利用したＤＮＡマイクロアレイ、キット及び遺伝子分析方法に関する。
ＤＮＡマイクロアレイまたはＤＮＡチップは、スライドガラスのような固型支持体(ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ)上に数十乃至数十億個の遺伝子プローブをスポット(ｓｐｏｔ)で集積しておいたものである。ＤＮＡマイクロアレイ上に、組職や細胞、体液などの検体から抽出した後蛍光物質(ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ)などで標識したＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、 ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ)産物などの核酸を乗せて、ハイブリダイゼーション反応やシークエンシング(ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ)反応を実行し、その反応から現われる標識物質のシグナルを蛍光スキャナなどの装備で分析することができる。これによれば、一回の実験で大単位遺伝子の発現変化や遺伝子型(ｇｅｎｏｔｙｐｅ)を調査することができる。今日、ＤＮＡマイクロアレイは、遺伝子関連研究や臨床診療において必要不可欠な道具として、遺伝子の機能と遺伝体研究など基礎科学研究だけではなく、遺伝子疾患の機序を把握して診断指針を立てて、特定薬物の作用機序と副作用を糾明し、疾患の治療方針を決めるなど臨床診療にも多方面に利用される(Ｐｅｔｒｉｋ Ｊ. Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ. Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ. ２００６; １６: ２３３−２４７;Ｗｈｅｅｌａｎ ＳＪ、Ｍｕｒｉｌｌｏ ＦＭ ａｎｄ Ｂｏｅｋｅ ＪＤ. Ｔｈｅ ｉｎｃｒｅｄｉｂｌｅ ｓｈｒｉｎｋｉｎｇ ｗｏｒｌｄ ｏｆ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ. Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓｔ. ２００８; ４(７):７２６−７３２; Ｌｉ Ｘ、Ｑｕｉｇｇ ＲＪ、Ｚｈｏｕ Ｊ、Ｇｕ Ｗ、Ｎａｇｅｓｈ Ｒａｏ Ｐ、Ｒｅｅｄ ＥＦ. Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ: ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ, ｅｘｉｓｔｉｎｇ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｏｕｔｌｏｏｋ. Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ. ２００８ ; ９(７):４６６−７４)。
ＤＮＡマイクロアレイは、その上に置くかスポット(ｓｐｏｔｔｉｎｇ)されるプローブの種類によって、オリゴヌクレオチドマイクロアレイと、ｃＤＮＡやＰＣＲ産物を乗せる２種類のその他マイクロアレイに分けられる。現在、商業化されたマイクロアレイでは、オリゴヌクレオチドマイクロアレイが主に使われる。このオリゴヌクレオチドマイクロアレイは、その製作方法によって大きく２種類に分けられる。一つは、固型支持体の上で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法として、フォトリソグラフィ(ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｙ)方式のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のチップ、インクジェット方式のＡｇｉｌｅｎｔ社のチップ、電子合成方式のＣｏｍｂｉｍａｔｒｉｘ社のチップ、光化学合成方式のＮｉｍｂｌｅｇｅｎ社のチップなどがある。他の一つは、別にあらかじめ製作したオリゴヌクレオチドプローブを固型支持体上に集積(ｓｐｏｔｔｉｎｇ)する方法である。後者がより一層広く使われており、代表的な例では、ＡＢＩ(Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ.)社の製品、Ｃｏｄｅｌ ｉｎｋ社の製品、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社の製品などがある。これらマイクロアレイ製品には、長さが１８個乃至７５個の塩基(ｂｐ)の単一らせんの直線型(ｌｉｎｅｒ、ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ)のオリゴヌクレオチドプローブが集積され、スポットの数字は、少なくは１２,０００個から多くは１０億７２００万個で多様である(Ｗｈｅｅｌａｎ ＳＪ、Ｍｕｒｉｌｌｏ ＦＭ ａｎｄ Ｂｏｅｋｅ ＪＤ. Ｔｈｅ ｉｎｃｒｅｄｉｂｌｅ ｓｈｒｉｎｋｉｎｇ ｗｏｒｌｄ ｏｆ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ. Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓｔ. ２００８; ４(７):７２６−７３２)。
ＤＮＡマイクロアレイは、過去に遺伝子検査で行われてきた通常的な三つの作業を実行するものである。但し、一度に多数の遺伝子をいわゆるハイ−スループット(ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ)で検査することができる点、これを通じて時間とコストを大きく節減し、臨床診断に適用可能にする点において、従来の遺伝子検査法と異なる。
ＤＮＡマイクロアレイを利用する一番目の検査法は、特定塩基配列の遺伝子が検体内に存在するか否かを探知する定性的検査(ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ)である。例えば、疾病の原因になる細菌の固有遺伝子の塩基配列をプローブとしてマイクロアレイを製作し、その上で検体の核酸を利用してハイブリダイゼーション反応を実行することで、わら束から針を探すように標的遺伝子を探して原因細菌を診断する方法である。このような、いわゆる遺伝子型分析(ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ)を利用して、子宮頸部癌の原因であるヒト乳頭腫ウイルス(ＨＰＶ：ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ)やフルーの原因菌であるインフルエンザウイルス(ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ)、性感染原因菌をその種だけではなく菌株(ｓｔｒａｉｎ)及び亜種まで正確に把握することができる。また、各々の癌に固有な遺伝子の存在有無を把握することで特定癌の診断が可能であり、検査する細菌や癌の悪性度や予後、薬物反応及び副作用の有無も予測可能である。これは低密度(ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ)マイクロアレイでも可能である。また、製作が容易で且つ費用が安価であり、臨床診療に有用であると長所があり、商業化に一番容易な形態のＤＮＡチップである(Ｙｏｏ ＳＭ、 Ｃｈｏｉ ＪＨ、 Ｌｅｅ ＳＹ、 Ｙｏｏ ＮＣ. Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ DNA ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ. Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. ２００９; １９(７):６３５−４６)。
ＤＮＡマイクロアレイを利用する二番目の検査法は、特定塩基配列の遺伝子が検体内にどのくらい存在するかを確認する定量的検査(ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ)である。これは最初に登場したｃＤＮＡマイクロアレイが示した検査法である(Ｓｈｅｎａ Ｍ、Ｓｈａｌｏｎ D、Ｄａｖｉｓ ＲＷ、Ｂｒｏｉｗｎ ＰＯ. Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｗｉｔｈ ａ ａｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ. Ｓｃｉｅｎｃｅ. １９９５; ２７０:４６７−４７０)。マイクロアレイ内に多数の調査する遺伝子のプローブを集積しておいて、標的物質及び標的疾患と対照物質及び対照群のＲＮＡやｃＤＮＡ、ｃＲＮＡを各々相異である蛍光染料(ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ)で標識した後、マイクロアレイ上でハイブリダイゼーション反応を実行して、両群の間での遺伝子発現の差を把握する方法である。
ＤＮＡマイクロアレイを利用する三番目の検査法は、遺伝子の塩基配列の変化を確認することで、具体的には、ＳＮＰ(ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ)、点突然変異(ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ)または欠失(ｄｅｌｅｔｉｏｎ)を検査する方法として、特定遺伝子の数(ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ)を確認することも可能である。通常的に、分析する塩基に対して各々の単一塩基を相異にする、すなわち、オリゴヌクレオチドプローブを野生型(ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ)と変異型(ｍｕｔａｎｔ ｏｒ ｖａｒｉａｎｔ ｔｙｐｅ)の２個にするか、あるいはＡ，Ｃ、Ｇ、Ｔの４個の種類として、マイクロアレイ上に集積してＤＮＡチップを製作する。以後、その上で検体ＤＮＡやｃＤＮＡ、あるいはＰＣＲ産物を利用してハイブリダイゼーション反応を非常に厳格な条件(ｈｉｇｈｌｙ ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ)で実行して完璧に一致するプローブを探す方法が利用される。すなわち、ＡＳＨ(ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ)又はＳＢＨ(ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ)方法をマイクロアレイ上で使用する。相当数の企業が人間の全体又は重要ＳＮＰをＡＳＨ方式で検査するマイクロアレイを販売している。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＳＮＰチップの場合、一つのＳＮＰに対して２０個乃至２８個の多様な完全一致型(ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ ｔｙｐｅ)及び不一致型(ｍｉｓｍａｔｃｈ ｔｙｐｅ)のオリゴヌクレオチドプローブをマイクロアレイに利用している(Ｒａｂｂｅｅ Ｎ ａｎｄ Ｓｐｅｅｄ ＴＰ. Ａ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｃａｌｌｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＳＮＰ ａｒｒａｙｓ. Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００６; ２２: ７−１２; Ｌｉｕ ＷＭ, Ｘ. Ｙａｎｇ ＸＤＧ、Ｍａｔｓｕｚａｋｉ Ｈ, Ｈｕａｎｇ Ｊ、Ｍｅｉ Ｒ、Ｒｙｄｅｒ ＴＢ, Ｗｅｂｓｔｅｒ ＴＡ、Ｄｏｎｇ Ｓ, Ｌｉｕ G, Ｋ.Ｗ. Ｊｏｎｅｓ ＫＷ、Ｇ.Ｃ. Ｋｅｎｎｅｄｙ ＧＣ ａｎｄ Ｋｕｌｐ Ｄ. Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ-ｓｃａｌｅ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ２００３; １９: ２３９７−２４０３)。
しかし、実際に多数の標的に対してその単一塩基の差をＤＮＡマイクロアレイで正確に判別することは困難である。したがって、最近にはＤＮＡマイクロアレイに対して強力な競争製品も出ている。例えば、ギガベース(ｇｉｇａ ｂａｓｅ)の塩基を一度に読み出す、いわゆるハイ−スループット(ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ)の塩基配列分析装備であるＩｌｌｕｍａｎｉａ社のＳｏｌｅｘａとＨｅｌｉｃｏｓ、Ｒｏｃｈｅ社の４５４装備、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＳＯＬｉＤがその例である。実際に、これらは塩基配列分析の量においてＤＮＡマイクロアレイの分析量を追い越し、ヒトゲノムの全体塩基配列を数日内に判読することができる(Ｗｈｅｅｌａｎ ＳＪ、Ｍｕｒｉｌｌｏ ＦＭ ａｎｄ Ｂｏｅｋｅ ＪＤ. Ｔｈｅ ｉｎｃｒｅｄｉｂｌｅ ｓｈｒｉｎｋｉｎｇ ｗｏｒｌｄ ｏｆ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ. Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓｔ. ２００８; ４(７):７２６−７３２)。
マイクロアレイは、１９９５年Ｓｈｅｎｎａの最初の発表以後その歴史が長いにもかかわらず、実際臨床に使われる製品は少数に過ぎない。アメリカの場合、薬物遺伝体(ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ)検査製品であるＡｍｐｌｉＣｈｉｐ ＣＹＰ４５０と乳房癌診断チップであるＭａｍｍａＰｒｉｎｔ、ｐ５３突然変異を検査するＡｍｐｌｉＣｈｉｐ ｐ５３検査法、癌の根源を調査するＰａｔｈｗｏｒｋ Ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｏｒｉｇｉｎ検査法、染色体異常を調査するＢＡＣ ａｒｒａｙ検査法、がアメリカＦＤＡの承認を受けて使われている(Ｌｉ Ｘ、Ｑｕｉｇｇ ＲＪ、Ｚｈｏｕ Ｊ、Ｇｕ Ｗ、Ｎａｇｅｓｈ Ｒａｏ Ｐ、Ｒｅｅｄ ＥＦ. Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ: ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ、ｅｘｉｓｔｉｎｇ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｏｕｔｌｏｏｋ. Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ. ２００８ ; ９(７):４６６−７４; Ｈｅｌｌｅｒ Ｔ、Ｋｉｒｃｈｈｅｉｎｅｒ Ｊ、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ＶＷ、Ｌｕｔｈｅ Ｈ、Ｔｚｖｅｔｋｏｖ Ｍ、Ｂｒｏｃｋｍｏｌｌｅｒ Ｊ、Ｏｅｌｌｅｒｉｃｈ Ｍ. ＡｍｐｌｉＣｈｉｐ ＣＹＰ４５０ ＧｅｎｅＣｈｉｐ: ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ ｔｈａｔ ａｌｌｏｗｓ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ＣＹＰ２Ｄ６ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ. Ｔｈｅｒ. Ｄｒｕｇ Ｍｏｎｉｔ. ２００６; ２８:６７３−６７７; Ｍｏｏｋ Ｓ、Ｖａｎ'ｔ Ｖｅｅｒ ＬＪ、Ｒｕｔｇｅｒｓ ＥＪ、Ｐｉｃｃａｒｔ−Ｇｅｂｈａｒｔ ＭＪ、Ｃａｒｄｏｓｏ Ｆ. Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ Ｍａｍｍａｐｒｉｎｔ: ｆｒｏｍ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｔｏ ｔｈｅ ＭＩＮＤＡＣＴ Ｔｒｉａｌ. Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ. ２００７;４:１４７−１５５; Ｌａｗｒｅｎｃｅ ＨＪ、Ｔｒｕｏｎｇ Ｓ、Ｐａｔｔｅｎ Ｎ、Ｎａｋａｏ Ａ、Ｗｕ Ｌ. ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｂｙ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｃｈｉｐ p５３ ｔｅｓｔ)。また、韓国とヨーロッパなどではＨＰＶの遺伝子型を診断するチップが食品医薬品安全庁の承認を受けて販売されている。
ＤＮＡマイクロアレイが臨床診断に広く使われるためには解決すべき課題が多い。全ての形態のＤＮＡマイクロアレイで共通的にシグナルの分析時に発生する非特異的信号、いわゆるバックグラウンドノイズ(ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｎｏｉｓｅ)が問題となる。これは、分析や製品の標準化を難しくする。これによって、ＤＮＡマイクロアレイの正確度や価値に対して実際に深刻な議論が提起されている(Ａｌｌｉｓｏｎ ＤＢ、Ｃｕｉ ＸＱ、Ｐａｇｅ ＧＰ ａｎｄ Ｓａｂｒｉｐｏｕ Ｍ. Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ: Ｆｒｏｍ ｄｉｓａｒｒａｙ ｔｏ ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ. ２００６; ７: ５５−６５; Ｄｒａｇｈｉｃｉ ＳＰ、Ｅｋｌｕｎｄ ＳＰＫ ａｎｄ Ｅｋｌｕｎｄ ａｎｄ Ｓｚａｌｌａｓｉ Ｚ. Ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ. Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ. ２００６; ２２: ｐｐ. １０１−１０９; Ｋｏｔｈａｐａｌｌｉ Ｒ、Ｙｏｄｅｒ ＳＪ、Ｍａｎｅ Ｓ ａｎｄ Ｌｏｕｇｈｒａｎ ＴＰ、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｒｅｓｕｌｔｓ: Ｈｏｗ ａｃｃｕｒａｔｅ ａｒｅ ｔｈｅｙ . BMC Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ２００２; ３: ２２)。
ＤＮＡマイクロアレイは、多数のスポットで一度に多くの検査を行い、その資料を処理すべきであるが、実際には、正確な資料分析と統計処理が容易ではないという問題点を有している。通常的に、検査結果の統計分析時、ｐ ｖａｌｕｅを０.０５で取って、それ未満の５％未満のエラーは受け入れる方法を取っている。しかし、マイクロアレイ上で数千万から１０億余個のスポットを分析してその中で約５％である数百乃至数千万のスポットの資料が偽陽性や偽陰性であれば、これは深刻な大規模のエラーになる。これを避けるために多数個のマイクロアレイを分析する方法が提案されているが、個別マイクロアレイの価格が高価である点を勘案する時、費用の側面で困難である。実際に、マイクロアレイを利用する実験時に、実験する度に結果が変動され、個々のマイクロアレイごとに結果に差の大きい場合が少なくない。場合によっては、同一な一つのマイクロアレイ内でもスポット別に差を示す。このような問題点の最も大きい要因の中で一つは、実験の対照群(ｃｏｎｔｒｏｌ)がはっきりと定立されていないという点である。言い換えれば、ＤＮＡマイクロアレイ上のハイブリダイゼーション実験時に、スポット別に内部参照物質(ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ)が明確に設定されていない。
ＤＮＡマイクロアレイの実験時に発生可能なエラーは、各実験の検体や目的による特有のエラーとマイクロアレイ自体又は検査過程によるエラーの二つがある。前者は、検体の不均一性(ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ)と多様性、生理的状態による変化、遺伝子と環境の相互作用などが関与する。後者はＤＮＡマイクロアレイ自体から出るエラー(ｓｌｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔ)で、例えば、ＤＮＡマイクロアレイの製作時の固型支持体、すなわち、スライドガラスの種類と表面化学、プローブを集積する際に使うピン、各スポットごとに集積されるプローブの量、プローブとスライドガラスの相互作用、プローブがスライドガラスによく固定されるか否かなどがある。また、ハイブリダイゼーション反応がよく行われるかも重要であり、これは、温度、時間及び緩衝液の条件に左右される。検体核酸に標識物質がよく標識(ｌａｂｅｌｉｎｇ)されているかも重要である(Ｂａｋａｙ Ｍ、Ｃｈｅｎ ＹＷ、Ｂｏｒｕｐ Ｒ、Ｚｈａｏ Ｐ、Ｎａｇａｒａｊｕ Ｋ ａｎｄ Ｅ.Ｐ. Ｈｏｆｆｍａｎ ＥＰ. Ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｄａｔａ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ. ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ２００２; ３: ４; Ｈａｎ ＥＳ、Ｗｕ Ｙ、ＭｃＣａｒｔｅｒ Ｒ、Ｎｅｌｓｏｎ ＪＦ、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ Ａ ａｎｄ Ｈｉｌｓｅｎｂｅｃｋ ＳＳ. Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ、ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ、ｐｏｏｌｉｎｇ、ａｎｄ ｓａｍｐｌｅ ｓｉｚｅ: Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ. ２００４; ５９: ３０６−３１５; Ｈｕｂｅｒ Ｗ、Ｈｅｙｄｅｂｒｅｃｋ Ａ、Ｓｕｌｔｍａｎｎ Ｈ、Ｐｏｕｓｔｋａ Ａ ａｎｄ Ｖｉｎｇｒｏｎ Ｍ、Ｖａｒｉａｎｃｅ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｄａｔａ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ２００２; １８: ９６−１０４; Ｍｏｌｌｏｙ ＭＰ、Ｂｒｚｅｚｉｎｓｋｉ ＥＥ、Ｈａｎｇ ＪＱ、ＭｃＤｏｗｅｌｌ ＭＴ ａｎｄ ＶａｎＢｏｇｅｌｅｎ ＲＡ. Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ. Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ. ２００３; ３: １９１２−１９１９; Ｏｌｅｋｓｉａｋ ＭＦ、Ｇ.Ａ. Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ ＧＡ ａｎｄ Ｄ.Ｌ. Ｃｒａｗｆｏｒｄ、Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈｉｎ ａｎｄ ａｍｏｎｇ ｎａｔｕｒａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｖｓ. ２００２; ３２: ２６１−２６６; Ｓｐｒｕｉｌｌ ＳＥ、Ｈａｒｄｙ ＪＬＳ ａｎｄ Ｗｅｉｒ Ｂ. Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ. ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ. ２００２: ９１６−９２３; Ｗｈｉｔｎｅｙ ＡＲ、Ｄｉｅｈｎ Ｍ、Ｐｏｐｐｅｒ ＳＪ、Ａｌｉｚａｄｅｈ ＡＡ、Ｊ.Ｃ. Ｂｏｌｄｒｉｃｋ ＪＣ、Ｒｅｌｍａｎ ＤＡ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ ＰＯ. Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｔｙ ａｎｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ、Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ. ２００３; １００: １８９６−１９０１; Ｚａｋｈａｒｋｉｎ ＳＯ、Ｋｉｍ Ｋ、Ｍｅｈｔａ Ｔ、Ｃｈｅｎ Ｌ、Ｂａｒｎｅｓ Ｓ、Ｓｃｈｅｉｒｅｒ ＫＥ、Ｐａｒｒｉｓｈ ＲＳ、Ａｌｌｉｓｏｎ ＤＢ ａｎｄ Ｐａｇｅ ＧＰ. Ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ. ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ２００５; ６: ２１４)。
ＤＮＡマイクロアレイの実験時に発生するもう一つの問題はプローブと関連する。前述したように、現在のＤＮＡマイクロアレイは大多数が直線型の単一らせんオリゴヌクレオチドプローブを使用する。しかし、これらプローブは、固型支持体上でのハイブリダイゼーション反応時に、液状状態でのハイブリダイゼーションと異なり適正条件を合わせることが困難である。したがって、適正オリゴヌクレオチドプローブをデザインして製作することがオリゴヌクレオチドマイクロアレイの『アキレス腱』であると同時に成功の要件である。
したがって、既存の直線型オリゴヌクレオチドプローブの問題点を改善する目的で多様な変形プローブのデザイン方法が提示されている。例えば、天然の核酸をその塩基や糖環(ｓｕｇａｒ ｒｉｎｇ)あるいはホスホジエステル骨格(ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ ｂａｃｋｂｏｎｅ)で構造を変えた、いわゆる核酸誘導体(ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇ)や類似体(ｍｉｍｉｃ)が提案される。代表的な例では、ペプチド核酸(ＰＮＡ：ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ)とロックド核酸(ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ)、モルポリノ(ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ)などがある。ＰＮＡやＬＮＡは、その溶融温度(Ｔｍ)が通常のオリゴヌクレオシチドと格段な差があって、特に単一塩基のＳＮＰや突然変異を分析するにおいて優れるという長所がある(Ｋａｒｋａｒｅ Ｓ、Ｂｈａｔｎａｇａｒ Ｄ. Ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｓ ａｎｄ ｍｉｍｉｃｓ: ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＰＮＡ、ＬＮＡ、ａｎｄ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ. Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. ２００６; ７１(５):５７５−８６; Ｔｏｌｓｔｒｕｐ Ｎ、Ｎｉｅｌｓｅｎ ＰＳ、Ｋｏｌｂｅｒｇ ＪＧ、Ｆｒａｎｋｅｌ ＡＭ、Ｖｉｓｓｉｎｇ Ｈ、Ｋａｕｐｐｉｎｅｎ Ｓ. ＯｌｉｇｏＤｅｓｉｇｎ: Ｏｐｔｉｍａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＬＮＡ(ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ) ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃａｐｔｕｒｅ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ. Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. ２００３; ３１(１３):３７５８−６２; Ｎｈａｋｅｅｌ Ｓ、Ｋａｒｉｍ Ｓ ａｎｄ Ａｌｉ Ａ. Ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ(ＰＮＡ)−ａ ｒｅｖｉｅｗ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. ２００６; ８１:８９２-８９９)。しかし、多数の遺伝子の発現を分析するには広く使われておらず、本発明のＹ字型プローブのように内部に追加の対照標準物質遺伝子のプローブを一緒に結合した形態では開発されていない。
多様な変形プローブの他の例としてＯＬＩＧＯＳＰＡＷＮがある。これは、発現配列タグ(ＥＳＴ：Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ)の大規模のｕｎｉｇｅｎｅデータベースからオーバーラップオリゴヌクレオチドプローブ(Ｏｖｅｒｇｏ ｐｒｏｂｅ)をデザインする方法である(Ｚｈｅｎｇ Ｊ、Ｓｖｅｎｓｓｏｎ ＪＴ、Ｍａｄｉｓｈｅｔｔｙ Ｋ、Ｃｌｏｓｅ ＴＪ、Ｊｉａｎｇ Ｔ、Ｌｏｎａｒｄｉ Ｓ. ＯｌｉｇｏＳｐａｗｎ: ａ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｏｖｅｒｇｏ ｐｒｏｂｅｓ ｆｒｏｍ ｌａｒｇｅ ｕｎｉｇｅｎｅ ｄａｔａｓｅｔｓ. ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ２００６ Ｊａｎ ９;７:７)。これは迅速にオリゴヌクレオチドプローブをデザインすることにおいては有用であるが、本発明のＹ字型プローブのように内部に追加の対照標準物質遺伝子のプローブを一緒に結合した形態では開発されていない。
多様な変形プローブの他の例として、ゲノムＤＮＡタイリングアレイ(Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｔｉｌｉｎｇ ａｒｒａｙ)も活発に提案されれている(Ｂｅｒｔｏｎｅ Ｐ、Ｔｒｉｆｏｎｏｖ Ｖ、Ｒｏｚｏｗｓｋｙ ＪＳ、Ｓｃｈｕｂｅｒｔ Ｆ、Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ Ｏ、Ｋａｒｒｏ Ｊ、Ｋａｏ ＭＹ、Ｓｎｙｄｅｒ Ｍ、Ｇｅｒｓｔｅｉｎ Ｍ. Ｄｅｓｉｇｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｔｉｌｉｎｇ ａｒｒａｙｓ. Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ. ２００６; １６(２):２７１−８１; Ｗｈｅｅｌａｎ ＳＪ、Ｍｕｒｉｌｌｏ ＦＭ ａｎｄ Ｂｏｅｋｅ ＪＤ. Ｔｈｅ ｉｎｃｒｅｄｉｂｌｅ ｓｈｒｉｎｋｉｎｇ ｗｏｒｌｄ ｏｆ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ. Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓｔ. ２００８; ４(７):７２６−７３２)。ゲノムＤＮＡタイリングアレイは一つのプローブに複数のサブプローブを入れて、これによってマイクロアレイの一つのスポット内に複数のプローブを植えて一度に多数の遺伝子検査を行うファイリング方式のオリゴヌクレオチドマイクロアレイ(ｍｕｌｔｉ−ｔｉｌｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ)である。これは一つのプローブ内に類似な位置にある多数のオリゴヌクレオチドを一度に連結して積む形態のプローブで、巨大遺伝体の全体の遺伝子発現を確認することにおいて有用である。しかし、これは単純に多数個のオリゴヌクレオチドを長い直線で連結したものに過ぎないので、一つのタイリング(ｔｉｌｉｎｇ)プローブ内に入る個々のオリゴヌクレオチドとサブプローブを別に識別することは不可能である。これは検査遺伝子の数をふやすには効率的であるが、本発明のＹ字型プローブのように内部対照参照物質が含まれるものではなく、画期的に検査の敏感度や特異度、再現性が増加されるとはいえない。
以上で記述したように、ＤＮＡマイクロアレイが臨床診断に広く使われるためには、これに使われるオリゴヌクレオチドプローブが一層改善される必要があり、検査法と結果判読の標準化が重要である。特に、標準化のために各スポット別に内部参考又は対照物質(ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ)のプローブを追加する必要がある。これは各々のスポットとマイクロアレイ、スライドガラス、ハイブリダイゼーション反応別に差異とエラーを解決するために必須である。
したがって、本発明は上述したような従来技術の問題点を解決するためになされたもので、その目的は、各スポットに検査する標的遺伝子だけではなく対照標準物質の遺伝子を一緒にプローブで作り入れた新規なＹ字型プローブ及びその変形型を提供することで、従来オリゴヌクレオチドプローブを改善し、既存のオリゴヌクレオチドマイクロアレイの問題点を解決し、臨床診断に実際に適用することにある。
本発明者らは、上述した既存のオリゴヌクレオチドマイクロアレイの問題点を解決するため、一つのプローブ、一つのスポット内に検査する標的遺伝子だけではなく対照遺伝子を一緒にプローブで作って入れる方法を講ずるようになった。
もし、標的遺伝子のプローブと対照遺伝子のプローブを一緒に結合させて一つのプローブで作り、これをマイクロアレイに統計的に十分な数字(例えば、２０個以上)で集積した後、その上で検体核酸、すなわち、ＤＮＡやＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ ＲＮＡなどを利用してハイブリダイゼーション反応を行う時、標的遺伝子と対照遺伝子の標識を各々Ｃｙ−３及びＣｙ−５で相違にすれば、各スポットからバックグラウンドシグナルを除外した後のシグナルで対照遺伝子に対する標的遺伝子のシグナルの比(Ｃｙ３/Ｃｙ５)が測定され、これを多数のスポットで検索してその平均及び標準偏差を計算すれば、一層正確な統計分析が可能になる。これは各スポットごとに対照群を入れて実験することで、これによって、偽陽性と偽陰性を最小化し、スポット間の差による発生するエラーを除去して円滑なノーマル化(ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ)が可能である。したがって、上述のスライド効果、すなわち、ＤＮＡマイクロアレイによるエラーを最小化し、少数のマイクロアレイの実験のみで統計的に有意な資料を得ることができるので、各実験に必要なコストと時間も画期的に減らすことができる。
これで、本発明者らは、一つの本体内に二つのオリゴヌクレオチドプローブ部位をＹ字形態で形成する本発明のＹ字型プローブと、これを固型支持体上に集積する方法を発明した。また、Ｙ字型プローブの中で一方を非対称的に短くする変形、すなわち、ｄ字型やｂ字型のプローブも考案するようになった。
本発明のプローブは、一度に二つのオリゴヌクレオチドプローブあるいはペプチド核酸(ＰＮＡ)プローブが含まれてＹ字形態からなるので、含まれた各プローブが各々の相補性塩基配列の核酸と反応して同時に２個のハイブリダイゼーション反応が行われるようになり、この反応時にお互いに異なる二つの検索用染料(dye)を入れてその反応を分析することができる。本発明者らは、このようなＹ字型二重オリゴヌクレオチドプローブ(Ｙ−ｓｈａｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅ、以下、「Ｙ字型プローブ」という)を開発及び製作し、これを利用して遺伝子を検査し、これを臨床診断に応用する方法も開発した。
本発明のプローブは、左側プローブ部分(ｌｅｆｔ ｓｉｄｅ ｐｒｏｂｅ)、左側幹部分(ｌｅｆｔ ｓｉｄｅ ｓｔｅｍ)、右側幹部分、右側プローブ部分、リンカー(ｌｉｎｋｅｒ)(またはスペーサ(ｓｐａｃｅｒ))部分の５位からまる。本プローブの左側及び右側プローブ部分は、最大１５０個までのオリゴヌクレオチドやあるいはＰＮＡからなり、目的によって、多様な塩基配列が適用可能である。但し、両側のオリゴヌクレオチドプローブは、その塩基配列が、一方は順方向(５’→３')、他の一方は逆方向(３'→５’)で方向を異にする。幹部分は、最大４０個までの相補性オリゴヌクレオチドからなり、上方へ連結される両側プローブを支持する役目をする。幹部分の塩基配列はすべてのものが可能であり、テロメア塩基順序を使えば便利である。リンカーは、両側のプローブと幹をスライドガラスのような固型支持台上に固定させる役目をする。ＤＮＡマイクロアレイの支持台としてはアルデヒドで処理されたスライドガラスが広く使われて、この場合、リンカーでは内部アミノ基が変形された多数の炭素基グループ(ｉＡｍＭＣｎＴ：ｉｎｔｅｒｎａｌ Ａｍｉｎｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃｎ ｄＴ)を使用できる。この他にも末端にビオチン(ｂｉｏｔｉｎ)が付いている多数の炭素基グループをリンカーで使用し、これを利用してストレブトアビジン(ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ)でコーティングされた支持台に固定させることもできる。
本発明のＹ字型プローブをａｒｒａｙｅｒを利用してスライドガラスなどの支持台に集積すれば、ＤＮＡマイクロアレイが完成される。ここに、検査する標的核酸、すなわち、ＤＮＡや ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、マイクロＲＮＡなどを蛍光染料(ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ)などで標識した後に乗せてハイブリダイゼーション反応を実行した後、現われる蛍光シグナルを蛍光スキャナで分析する。この時のスキャナは、検査目的と方法によって単色、２色、または４色のスキャナを選択することができる。
本発明のＹ字型オリゴヌクレオチドプローブは、単一直線型プローブに比べて優秀な長所が多い。１）一つの全体プローブ内に二つのプローブ部位が含まれているので、二重で検索して一層正確に分析することができる。２）対照標準物質又は内部参照物質を一緒に検索することで偽陰性結果(ｆａｌｓｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔ)と偽陽性結果(ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔ)を最小化し、それによって、検査の敏感度と特異度を改善することができる。３）スポット間のエラーを防止することで一層正確な統計分析が可能である。４）対照物質対比標的物質の相対的量的計測が可能である。５）幹部位の存在により溶融温度(Ｔｍ)やアニーリング温度において熱力学的に一層差別化させることができ、これは単一塩基の変異を対立遺伝子特異ハイブリダイゼーション方式で分析する際に一層明確に変化を把握することで期待される。６）幹部位がその上のプローブ部位とリンカー及びスライドガラス支持体の間に位置することで、空間的妨害や電気磁場的妨害を減らし、ハイブリダイゼーション反応がさらによく行われるようにする。
本発明によれば、１）診断しようとする疾患及び各遺伝子のＤＮＡまたはＲＮＡの特定シーケンスの有無を分析することができるＹ字型プローブ及びそれのデザインと製作方法を提供し、２）Ｙ字型プローブを集積したバイオチップ及びそれの製作方法を提供し、３）前記バイオチップに効果的に反応させることができるようにするＰＣＲ方法と蛍光標識方法を提供し、４）前記バイオチップを利用して標的遺伝子を探知し、遺伝子型と遺伝子発現程度、遺伝子塩基配列の変異の分析方法を提供し、５）これを臨床に使うことができる方法を提供することができる。
発明の要旨
本発明は、一つの本体に２個のプローブ部位を有するＹ字型のヌクレオチドプローブを提供する。
好ましくは、本発明の前記プローブは、５’→３'の方向に、そして左側上方から右側上方への方向に順に、(１)左側プローブ部位、(２)左側幹部位、(３)リンカー部位、(４)右側幹部位、(５)右側プローブ部位からなる。
本発明は、前記Ｙ字型プローブの、(１)左側プローブ部位は除去され、(２)左側幹部位、(３)リンカー部位、(４)右側幹部位、(５)右側プローブ部位からなるｄ字型のヌクレオチドプローブを提供する。
本発明は、前記Ｙ字型プローブの、(５)右側プローブ部位は除去され、(１)左側プローブ部位、(２)左側幹部位、(３)リンカー部位、(４)右側幹部位からなるｂ字型のヌクレオチドプローブを提供する。
好ましくは、本発明の前記Ｙ字型、ｄ字形、ｂ字型のプローブは、前記左側幹部位と右側幹部位はお互いに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで結合した構造であり、前記左側幹部位または右側幹部位は、各々に対する全体の塩基配列のうちＧ塩基が半分以上含まれる。
好ましくは、本発明の前記左側幹部位と右側幹部位は、お互いに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで結合した構造であり、幹部位の塩基配列がテロメアの塩基配列を含む。
好ましくは、本発明の前記左側幹部位または右側幹部位は、下記の塩基単位体からなる群より選択される塩基単位体が１回以上繰り返してなる。
ＴＴＧＧＧ、
ＴＡＧＧＧ、
ＴＴＧＧＧＧ、
ＴＴＴＧＧＧ、
ＴＴＡＧＧＧ、
ＴＴＴＧＧＧＧ、
ＴＴＴＡＧＧＧ、
ＴＴＴＴＧＧＧＧ、
ＴＴＴＡＧＧＧＧ。
好ましくは、本発明の前記左側プローブ部位または右側プロブ部位は、標的遺伝子に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
好ましくは、本発明の前記左側プローブ部位または右側プロブ部位は、１５個乃至１５０個の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
好ましくは、本発明の前記左側プローブ部位は、上方から下方への塩基配列が５’→３'の手順に配列され、前記右側プローブ部位は、下方から上方への塩基配列が５’→３'の手順に配列される。
好ましくは、本発明の前記リンカー部位は、アルデヒドコーディングされた固体支持体に結合するために、アミノ変形ジデオキシチミジンとしてＣ６ｄＴ、Ｃ３ｄＴ、Ｃ１２ｄＴまたはＣ１８ｄＴで構成される。
好ましくは、本発明の前記プローブは、ペプチド核酸(ＰＮＡ)からなる。
好ましくは、本発明の前記プローブは、１)脱トリチル段階(ｄｅｔｒｉｔｙｌａｔｉｏｎ)、２)カップリング段階(ｃｏｕｐｌｉｎｇ)、３)キャッピング段階(ｃａｐｐｉｎｇ)、４)酸化段階(ｏｘｉｄａｔｉｏｎ)を含む合成方法により製造される。
好ましくは、本発明の前記左側プローブ部位と右側プローブ部位は、一つの標的遺伝子内の２個の相違である部位に対して各々相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる。
好ましくは、本発明の前記左側プローブ部位と右側プローブ部位は、各々一つの標的遺伝子内の同一な部位に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる。
好ましくは、本発明の前記左側プローブ部位と右側プローブ部位は、相違である標的遺伝子に対して各々相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる。
好ましくは、本発明の前記左側プローブ部位と右側プローブ部位の中で、一方のプローブ部位は、標的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、残り一方のプローブ部位は、対照遺伝子に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる。
好ましくは、本発明の前記対照遺伝子は、標的遺伝子と相補性がなく、検体で存在または発現されない。
好ましくは、本発明の前記対照遺伝子は、大膓菌のｍｏｔＤ遺伝子である。
好ましくは、本発明の前記プローブは、配列番号５乃至５０中で一つ以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
本発明は、前記プローブが固型支持体に集積(ｓｐｏｔｔｉｎｇ)されてなるＤＮＡマイクロアレイを提供する。
好ましくは、本発明の前記固型支持体は、スライドガラス、ビーズ、マイクロプレートウェル、シリコーンウェハ及びナイロンメンブレンからなる群より選択される。
好ましくは、本発明の前記ＤＮＡマイクロアレイは、ヒトベータグロビン遺伝子がさらに集積されている。
好ましくは、本発明の前記プローブの集積部位としてウェル(ｗｅｌｌ)が８個で区画されている。
好ましくは、本発明の前記プローブは、配列番号５乃至５０の中で一つ以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、ＨＰＶの探知及び遺伝子型分析用である。
好ましくは、本発明の前記プローブは、５’末端がＣｙ５で標識された配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと、５’末端がＣｙ３で標識された配列番号１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと相補的に結合する。
好ましくは、本発明の前記プローブは、配列番号５１乃至５５の中で一つ以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、性感染疾患(ＳＴＤ)の原因菌として、各々淋菌(ＮＧ)、クラミジアトラコマチス(ＣＴ)、ヘルペスシンプレックスウイルス(ＨＳＶ)、トレポネマパリダム(ＴＰ)及びヘモフィルスデュクレイ(ＨＤ)の探知及び遺伝子型分析用である。
好ましくは、本発明の前記プローブは、配列番号５６乃至１９９の中で一つ以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、インフルエンザウイルスの探知及び遺伝子型分析用である。
好ましくは、本発明の前記プローブは、配列番号２１２乃至２１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、上皮細胞成長因子受容体(ＥＧＦＲ)とβ−アクチン遺伝子の発現分析用である。
好ましくは、本発明の前記プローブは、左側プローブ部位と右側プローブ部位の中でいずれの一方が標的核酸のセンスストランドの単一ヌクレオチド多形成(ＳＮＰ)部位に対して相補的なオリゴヌクレオチドからなり、残りの一方が標的核酸のアンチセンスストランドのＳＮＰ部位がない部位に対して相補的なオリゴヌクレオチドからなり、ＳＮＰ分析用である。
好ましくは、本発明の前記プローブは、配列番号２２０乃至２３９の中で一つ以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、ＡＣＥ、ＡＤＲＢ２、Ａｐｏ Ｅ、ＣＥＴＰ、ＣＦＨ、ＥＳＲ１、ＩＬ１Ａ、ＭＴＨＦＲまたはＮＯＳ３遺伝子のＳＮＰ分析用である。
好ましくは、本発明の前記プローブは、配列番号２５８乃至２７２の中で一つ以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の突然変異分析用である。
好ましくは、本発明の前記ｄ字型プローブは、右側プローブ部位がＡ、Ｃ、ＧまたはＴの点突然変異に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、この時、点突然変異に相補的な塩基を右側プローブ部位の中心部位に位置させて、右側プローブ部位の長さは、１５乃至３０ｂｐであり、点突然変異分析用である。
本発明は、前記ＤＮＡマイクロアレイ、検体の標的遺伝子に対するＰＣＲ反応用プライマーセットとバッファー及びハイブリダイゼーション反応用バッファーを含む検体の遺伝子分析用キットを提供する。
好ましくは、本発明の前記ＰＣＲ反応用プライマーセットは、インフルエンザウイルスＡ型の遺伝子増幅用として、配列番号２０８乃至２１１の中で選択される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
好ましくは、本発明の前記ＰＣＲ反応用プライマーセットは、β-アクチンとＥＧＦＲ遺伝子の定量型リアルタイムＰＣＲ用として、配列番号２１４乃至２１９の塩基配列を有するオリゴヌクレオデドである。
好ましくは、本発明の前記ＰＣＲ反応用プライマーセットは、ＳＮＰ検出用として、配列番号２４０乃至２５７の中で２個以上選択される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
好ましくは、本発明の前記キットは、疾病の診断、予防、予測またはオーダーメイド治療用である。
本発明は、前記ＤＮＡマイクロアレイ上に、標識物質で標識された検体の標的核酸を乗せて、前記プローブと標的核酸をハイブリダイゼーションさせる段階を含む遺伝子分析方法を提供する。
好ましくは、本発明の前記標識物質は、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５.５、Ｂｏｄｉｐｙ、Ａｌｅｘａ ４８８、Ａｌｅｘａ ５３２、Ａｌｅｘａ ５４６、Ａｌｅｘａ ５６８、Ａｌｅｘａ ５９４、Ａｌｅｘａ ６６０、ロダミン(Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ)、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、Ｆｌｕｏｒ Ｘ、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｏｒａｎｇｅ ｇｒｅｅｎ ４８８Ｘ、Ｏｒａｎｇｅ ｇｒｅｅｎ ５１４Ｘ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、Ｏｙｓｔｅｒ ５５６、Ｏｙｓｔｅｒ ６４５、Ｂｏｄｉｐｙ ６３０/６５０、Ｂｏｄｉｐｙ ６５０/６６５、Ｃａｌｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５４６、Ｃａｌｆｌｕｏｒ ｒｅｄ ６１０、Ｑｕａｓａｒ ６７０及びビオチンからなる群より一つ以上選択される。
好ましくは、本発明の前記標的核酸は、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲまたは試験管内転写(ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ)方法を利用して標識物質で標識される。
好ましくは、本発明の前記ハイブリダイゼーション反応後に蛍光スキャナを利用して標識物質のシグナルを分析し、標的核酸の発現程度を調査する段階をさらに含む。
好ましくは、本発明の前記シグナル分析は、正常化過程(ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ)を経て分析する。
好ましくは、本発明の前記正常化過程は、各スポットでバックグラウンドのノイズシグナルを除外してＣｙ５とＣｙ３のシグナルを調査し、更にハウスキーピング遺伝子としてβ−アクチン遺伝子のＣｙ３シグナルと比較する３重の正常化過程である。
好ましくは、本発明の前記標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡからなる群より選択される。
好ましくは、本発明の前記ｃＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＴを通じてＣｙ３で標識して、前記ｃＲＮＡは、試験管内転写を通じてＣｙ３で標識する。
好ましくは、本発明の前記Ｃｙ３で標識されたｃＤＮＡまたはｃＲＮＡに、外部対照物質(ｅｘｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ)として大膓菌のｍｏｔＤ遺伝子をＣｙ５で標識したものを混合して得た混合物をハイブリダイゼーションする。
また、本発明は、次の段階を含んで行われるＹ字型プローブを利用した臨床診断方法に関する。
第１の段階：Ｙ字型プローブをデザインする段階。
第２の段階：Ｙ字型プローブを合成する段階。
第３の段階：Ｙ字型プローブを利用してＤＮＡマイクロアレイを製作する段階。
第４の段階：マイクロアレイ上に乗せる核酸検体を準備し、これにＰＣＲやｉｎ ｖｉｔｒｏ転写などの方法で標識物質(ｌａｂｅｌｉｎｇ ｄｙｅ)を付ける段階。
第５の段階：ＤＮＡマイクロアレイに検体を乗せてハイブリダイゼーション反応を行う段階。
第６の段階：ＤＮＡマイクロアレイ上でハイブリダイゼーション反応後、そのシグナルを判読及び分析する段階。
第７の段階：Ｙ字型プローブを利用して標的遺伝子及び対照遺伝子の存在有無とその量を把握する段階。
第８の段階：Ｙ字型プローブを利用して多様な遺伝子型分析を行い、臨床診療に適用する段階として、具体的には、ＨＰＶやインフルエンザ、性感染の原因菌を診断してその類型を判別することで疾病診断と治療方針を決定する段階。
第９の段階：Ｙ字型プローブを利用して多数の遺伝子の発現程度を分析する段階。
第１０の段階：Ｙ字型プローブを利用して特定塩基配列の変異、すなわち、ＳＮＰや点突然変異などを分析する段階。
第１１の段階：Ｙ字型プローブを利用して臨床診断に適用する段階として、具体的には、ＳＮＰ分析を通じて疾病発病の危険を予測してあらかじめ予防するか、ＳＮＰ分析を通じて薬物効果及び副作用を予測してオーダーメイド式で薬物を選択するか、突然変異分析及び遺伝子発現分析を通じて疾病をスクリーニング(ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ)又は診断するか、または薬物効果を予測してオーダーメイド式で薬物を選択する段階。
本発明のＹ字型プローブ及びその変形型を利用した遺伝子分析用ＤＮＡマイクロアレイ(チップ)及びキットによれば、特定遺伝子の存在とその型及び発現程度と塩基配列の変化を正確に分析することができ、感染と癌など各種疾患を迅速で正確に診断するだけではなく、病気を分類して深刻度と予後を予測し、治療方針を決定し、オーダーメイド式で薬物を決定するなど、臨床診療に非常に有用である。
図１は、本発明のＹ字型プローブの一例を示す模式図である。
図２は、本発明のＹ字型プローブをチップ表面に結合させるための反応物質であるｉＡｍＭＣ６Ｔ(ｉｎｔｅｒｎａｌ Ａｍｉｎｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ ｄＴ)の化学構造である。
図３は、子宮頸部癌誘発原であるウイルス(ＨＰＶ)とヒトベータグロビン(ＨＢＢ：ｈｕｍａｎ ｂｅｔａ ｇｌｏｂｉｎ)遺伝子をＰＣＲ増幅して電気泳動した写真である(実施例５)。ＨＰＶ−１６ Ｌ１遺伝子をＣｙ５で標識し、ＨＢＢ遺伝子はＣｙ３で標識して、Ｃａｓｋｉ細胞株(ＨＰＶ−１６型標準物質)から公知の方法でＤＮＡを抽出して、表１のＬ１遺伝子とＨＢＢ遺伝子各々のプライマーでＰＣＲを実行して、０.８％アガローズゲルで電気泳動を実行した結果である。Ｌａｎｅ Ｍ：１００ｂｐサイズマーカー、Ｌａｎｅ １：陰性対照群、Ｌａｎｅ ２：ＨＰＶ−１６ Ｌ１遺伝子のＰＣＲ産物(１８５ｂｐ)、Ｌａｎｅ ３：ＨＢＢ遺伝子のＰＣＲ産物(１０２ｂｐ)である。
図４は、子宮頸部癌誘発原であるウイルス(ＨＰＶ)を診断することができるＤＮＡバイオチップの各ウェル(ｗｅｌｌ)内に示したグリッド(ｇｒｉｄ)である(実施例４)。赤色部分は、ＨＰＶのうち高危険群タイプをスポッティングしたものであり、緑色部分は、ＨＰＶのうち危険群タイプをスポッティングしたものであり、黄色部分は、ＨＢＢ遺伝子をスポッティングしたものであり、空色部分は、本発明のＹ字型プローブの一種であるＹＰ１６ＳとＹＰ１６ＡＳをスポッティングしたものである。
図５は、 度４のグリッドを利用して製作した２２種のＨＰＶチップの上に本発明のＹ字型プローブを同時にスポッティングし、ＨＰＶ−１６(Ｃｙ５標識)とＨＢＢ(Ｃｙ３標識)を利用してハイブリダイゼーションした後のスキャニング写真である(実施例５)。Ｗｅｌｌ １＆２：ＨＰＶ １６−Ｃｙ５＆ＨＢＢ―Ｃｙ５標識された検体、Ｗｅｌｌ ３＆４：ＨＢＢ−ＣＹ５標識した検体、Ｗｅｌｌ ５＆６：ＨＰＶ １６−Ｃｙ５＆ＨＢＢの順方向プライマーにＣｙ３標識された検体、Ｗｅｌｌ ７＆８：ＨＰＶ １６−Ｃｙ５＆ＨＢＢの逆方向プライマーにＣｙ３標識された検体である。
図６は、ＨＢＢ順方向−Ｃｙ３ ＰＣＲ産物を利用してハイブリダイゼーションしたチップから一つのウェルのみを５３２ｎｍでスキャニングしたイメージである(実施例６)。
図７は、ＳＴＤチップ用標準物質を利用してＰＣＲを実行した産物を３％アガローズゲルで電気泳動した写真である。Ｍ：１００ｂｐ ＤＮＡサイズマーカー、Ｌａｎｅ １乃至６は、単一ＰＣＲをしたもので、各々ヘモフィルスデュクレイのＰＣＲ産物(４４０ｂｐ)、ヘルペスウイルス１型のＰＣＲ産物(３８４ｂｐ)、ヘルペスウイルス２型のＰＣＲ産物(４００ｂｐ)、クラメジアトラコマティスのＰＣＲ産物(３２１ｂｐ)、淋菌のＰＣＲ産物(２８４ｂｐ)、梅毒のＰＣＲ産物(２６０ｂｐ)で示されたし、Ｌａｎｅ ７は、前記５個の標準物質を使用して実施例９の方法でマルチプレックスＰＣＲを実行した産物で、５個の遺伝子が全てＰＣＲされることが確認できた。
図８は、Ｙ字型プローブを利用したＳＲＴＤチップ上で淋菌を陽性物質でハイブリダイゼーションした結果をスキャニングしたイメージである(実施例９)。
図９は、Ｙ字型プローブを利用したＳＴＤチップ上でクラメジアトラコマティスを陽性物質でハイブリダイゼーションした結果をスキャニングしたイメージである(実施例９)。
図１０は、Ｙ字型プローブを利用したＳＴＤチップ上でトレポネマパリダムを陽性物質でハイブリダイゼーションした結果をスキャニングしたイメージである(実施例９)。
図１１は、Ｙ字型プローブを利用したＳＴＤチップ上でヘモフィルスデュクレイを陽性物質でハイブリダイゼーションした結果をスキャニングしたイメージである(実施例９)。
図１２は、Ｙ字型プローブを利用したＳＴＤチップ上でヘルペスシンプレックスウイルスを陽性物質でハイブリダイゼーションした結果をスキャニングしたイメージである(実施例９)。
図１３は、Ｙ字型プローブを利用したインフルエンザウイルスＡチップのグリッドを示したものである(実施例１０)。
図１４は、インフルエンザウイルスＡチップに標準物質を利用してハイブリダイゼーションした結果をスキャニングしたイメージである(実施例１０)。Ｈ遺伝子はＣｙ５で標識し、Ｎ遺伝子はＣｙ３で標識し、ＲＰＰ、ＳＷＨ１、ＳＷ ｉｎｆＡ及びｉｎｆＡはＣｙ５で標識した。一番目の写真は、本発明のＹ字型プローブを利用して５３２ｎｍと６３５ｎｍを全て利用してスキャニングしたイメージとして、ｓｗｉｎｅインフルエンザ(Ｈ１Ｎ１)のウイルスは、本発明のチップのＨ１Ｎ１、Ｈ１０Ｎ１、ｉｎｆＡ、ＲＰＰ、ｓｗＨ１、ｓｗｉｎｆＡのスポットでのみシグナルを示して、二番目の６３５ｎｍ波長では、Ｎ１遺伝子でのみシグナルを示して、三番目の５３２ｎｍ波長では、Ｈ１Ｎ１、ｉｎｆＡ、ＲＰＰ、ｓｗＨ１、ｓｗｉｎｆＡのスポットでのみシグナルを示した。したがって、本発明のチップで使用したＹ字型プローブがｓｗｉｎｅインフルエンザウイルス遺伝子に各々ハイブリダイゼーションすることを立証した。
図１５の(ａ)は、ＴａｑＭａｎプローブを利用して各々のＲＮａｓｅＰ、ＳＷＨ１、ＳＷ ｉｎｆＡ、ｉｎｆＡ遺伝子をＯｎｅ ｓｔｅｐ Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲした後、ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ ６.０ソフトウェアを使用して分析した結果である。ｎｃ(ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ)、ｐｃ(ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；新種インフルエンザ陽性ｖｉｒａｌ ＲＮＡ)及び患者の検体から抽出したＲＮＡを使用してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実行したもので、３個の患者検体はＲＮａｓｅＰでのみ検出されて陰性で判読されて、ｐｃは、ＳＷＨ１、ＳＷ ｉｎｆＡ、ｉｎｆＡとＲＮａｓｅＰ遺伝子の全ての遺伝子で増幅されることを確認した。
図１５の(ｂ)は、ＴａｑＭａｎプローブを利用して各々のＲＮａｓｅＰとＳＷＨ１遺伝子のみを７個の臨床検体を使用して分析した結果である。７個の検体のうち２個の検体だけがＳＷＨ１とＲＮａｓｅＰから検出されて陽性で判読された。残りの４個の検体は、ＲＮａｓｅＰ遺伝子だけが全ての検体で増幅されたので陰性であり、一つの検体は、ＲＮａｓｅＰ遺伝子も増幅されなくて再検を進行した。
図１６は、Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲを実行して得た結果物の中でＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子とＳＷＨ１遺伝子のＰＣＲ産物を２％アガローズゲルで電気泳動した写真である。本写真から確認できるように、実際の検体の場合、ＰＣＲ産物のサイズのみで電気泳動上で陽性と陰性を区分することが大変なので、Ｈ１Ｎ１の場合には、本発明のＤＮＡチップやあるいはＲｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ方法を使用して確認する検査を実行する。Ｍ：１００ｂｐ ＤＮＡサイズマーカー、Ｎ：Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｌａｎｅ １乃至６：患者の検体を利用して得たＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ：新種インフルエンザ陽性物質のｃＤＮＡ。
図１７は、本発明の遺伝子発現検査用Ｙ字型プローブの基本構造と、これを集積したマイクロアレイ上で検体と対照物質のｃＲＮＡをハイブリダイゼーションする模式図である。
図１８は、Ｙ字型プローブを利用した遺伝子発現分析時の外部対照物質を示した模式図である。具体的に、実施例１１に使われたＴ７プローモーターとｐｏｌｙ Ａ ｔａｉｌ、Ｅ. ｃｏｌｉ ｍｏｔＤ遺伝子を含む合成オリゴヌクレオチド(Ａ)とプラズミド(Ｂ)シーケンスを示した図である。これを鋳型(ｔｅｍｐｌａｔｅ)で使用してＣｙ−５を入れてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写して蛍光で標識されたターゲットを作った後、検体から得たｃＲＮＡと混合してＤＮＡマイクロアレイ上でハイブリダイゼーション反応を行うのに使用する。
図１９は、正常人と患者の検体からＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡを合成してＥＧＦＲ遺伝子とβ−ａｃｔｉｎ遺伝子の発現をＹ字型プローブマイクロアレイで分析した写真である(実施例１１)。
図２０は、正常人と患者の検体からＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡを合成してＥＧＦＲ遺伝子とβ−ａｃｔｉｎ遺伝子の発現をｑＲＴ−ＰＣＲで分析した結果である(実施例１１)。β−ａｃｔｉｎ遺伝子のＣｔ値は、二つの検体の間で差がほとんどないが、ＥＧＦＲ遺伝子は、患者では発現されるが正常人では発現されないことが分かる。
図２１は、Ｙ字型プローブを含んだＳＮＰ遺伝形質分析(Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ)チップを利用して遺伝子を検査した結果として、２色(ｄｕａｌ ｃｏｌｏｒ)蛍光スキャナを利用したイメージである。各スポットからバックグラウンドシグナルを除去した後、Ｃｙ５−５対比Ｃｙ−３の、正常化処理したシグナル(ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｓｉｇｎａｌ)を調査し、これに基づいて完全に一致するスポットのプローブを探した。その結果、ＣＦＨ、ＣＥＴＰ、ＭＴＨＦＲ遺伝子に対して不利な(ｕｎｆａｖｏｒａｂｌｅ、ｈｉｇｈ ｒｉｓｋ)ＳＮＰを示した。すなわち、各遺伝子のＣｙ３で標識されたＰＣＲ反応物質と交雑して示されるリポーター遺伝子は、ＳＮＰがある場合には、スキャニング時に緑色で示され、Ｃｙ５で標識されたＰＣＲ反応物質と交雑してされるレファレンス遺伝子は、ＳＮＰがない部分だからスキャニング時にいつも赤色で示される。したがって、一つの遺伝子においてＹ字型プローブは、各遺伝子にＳＮＰ部分がない場合には全てＣｙ５で現われ、ＳＮＰ部分があれば、補色で現われる。したがって、本検体では、ＣＦＨ(Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ Ｈ)遺伝子の４０２番目のコドンにＳＮＰ(Ｙ４０２Ｈ、ｒｓ１０６１１７０)が現われたし、ＣＥＴＰ(Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｅｓｔｅｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ)遺伝子の１５５３番目の塩基にＳＮＰ(Ｇ１５３３Ａ)が現われた。また、ＭＴＨＦＲ(Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ)の６７７番目の塩基にＳＮＰ(Ｃ６７７Ｔ、Ａｌａ２２２Ｖａｌ)が各々現われた。
図２２は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２番のＧＴＴ(Ｇｌｙ)とＡＧＴ(Ｓｅｒ)に対するｄ字型プローブの構造を示した模式図である。
図２３は、Ｋ−ｒａｓ ＤＮＡマイクロアレイのスキャニングイメージである。肺癌患者の血液検体を分析した結果、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２番がＧＴＴからＡＧＴ(Ｇｌｙ１２Ｓｅｒ)に突然変異したことが分かる。
以下、本発明の実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、下記実施例は、本発明の構成及び効果を立証するための一例に過ぎず、本発明は、下記の実施例に限定されるものではない。
Ｙ字型プローブのデザイン
ＤＮＡチップの開発において一番根幹になる過程として、本発明のＹ字形態のデュプレックスオリゴヌクレオチドプローブの構造を考案する過程である。ここには、このプローブを支持台(ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ、ｆｅａｔｕｒｅｓ)に乗せるためのリンカーを付ける工程と、スペーサ(ｓｐａｃｅｒ)を付けてシグナルを確認するために標識物質(ｌａｂｅｌｉｎｇ ｄｙｅ)を付ける工程も含まれる。
本発明のＹ字型プローブは、連続された一つのオリゴヌクレタイドからなっており、２個の相異なるオリゴヌクレオチドプローブをＹ字型の枝形態で幹の上に乗せた木のような構造になっている。この木を地、すなわち、スライドガラスのような固定支持台上に植える根があり、これをリンカー、あるいはスペーサと言う。この木の上に検体がまるで雪のように下りて、その検体の中で木の２個の枝のプローブと相補性の配列を有したＤＮＡやＲＮＡが選択的に結合すれば、ハイブリダイゼーション反応が起き、残りの雪は洗われる。このハイブリダイゼーション反応に標識物質を付けてそのシグナルを判読する。
本発明のＹ字型プローブは、文献に出ているいわゆる分子ビーコン(ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ)やヘアピンプローブ(ｈａｉｒｐｉｎ ｐｒｏｂｅ)とは異なり、構造上いわゆるループ(ｌｏｏｐ)部分がなくて、クエンチャープローブ(ｑｕｅｎｃｈｅｒ ｐｒｏｂｅ)も使わない(Ｗａｎｇ Ｋ、Ｔａｎｇ Ｚ、Ｙａｎｇ ＣＪ、Ｋｉｍ Ｙ、Ｆａｎｇ Ｘ、Ｌｉ Ｗ、Ｗｕ Ｙ、Ｍｅｄｌｅｙ ＣＤ、Ｃａｏ Ｚ ａｎｄ Ｌｉ Ｊ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ: Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ. Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ. ２００９; ４８(４５): ８５６−８７０; Ｌｉ Ｙ、Ｚｈｏｕ Ｘ ａｎｄ Ｙｅ Ｄ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ: ａｎ ｏｐｔｉｍａｌ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｏｌｅ. Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｎｃａｔｉｏｎ. ２００８; ３７３: ４５７−４６１; Ｙａｏ ＧＹ ａｎｄ Ｔａｎ Ｗ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｂｅａｃｏｎ−ｂａｓｅｄ ａｒｒａｙ ｆｏｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ. Ａｎａｋｙｔｉｃａｌ Ｂｉｉｃｈｅｍｉｓｔｒｙ. ２００４; ３３１:２１６−２２３; Ｂｒｏｕｄｅ ＮＥ. Ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ: ａ ｒｏｂｕｓｔ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. ２００２; ２０(６): ２４９−２５６)。したがって、ビーコンとは全然異なるプローブである。また、そのほかの文献に出るビーコン変形のプローブとも全然構造や作用方法が異なる(Ｔｓｏｕｒｋａｓ Ａ、Ｂｅｈｌｋｅ ＭＡ ａｎｄ Ｂａｏ Ｇ. Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｓｈａｒｅｄ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ. Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ. ２００２; ３０(１９): ４２０８−４２１５; Ｍｉｓｒａ Ａ、Ｋｕｍａｒ P ａｎｄ Ｇｕｐｔａ ＫＣ. Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｈａｉｒｐｉｎ ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｉｓ−match ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ. Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ. ２００７; ５１: ３１１−３１２; Ｒｉｃｃｅｌｌｉ ＲＶ、Ｍｅｒａｎｔｅ Ｆ、Ｌｅｕｎｇ ＫＴ、Ｂｏｒｔｏｌｉｎ Ｓ、Ｚａｓｔａｗｎｙ ＲＬ、Ｊａｎｅｃｚｋｏ Ｒ ａｎｄ Ｂｅｎｉｇｈｔ ＡＳ. Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ. ２００１; ２９(４): ９９６−１００４)。
図１から分かるように、本発明のＹ字型プローブは、５’→３'方向から見る時、また、左側上方から始めて右側上方へ見る時、(１) 左側プローブ部位(ｌｅｆｔ ｓｉｄｅ ｐｒｏｂｅ、Ａ部位)、(２) 左側幹部位(ｌｅｆｔ ｓｉｄｅ ｓｔｅｍ、Ｂ部位)、(３) リンカー乃至スペーサ部位(Ｃ部位)、(４)右側幹部位(ｒｉｇｈｔ ｓｉｄｅ ｓｔｅｍ、Ｄ部位)、(５) 右側プローブ部位(ｒｉｇｈｔ ｓｉｄｅ ｐｒｏｂｅ、Ｅ部位)からなる。
以下、各部位の構造をより詳細に説明すれば、次のようである。
(１) 幹部位(ｓｔｅｍ ｐａｒｔ)
本発明のＹ字型プローブが適切に位置するためには、これを支持する幹部分がまず適切に作られる必要がある。幹はお互いに相補性の配列を有するオリゴヌクレオタイが結合した構造になっており、堅く結合するためには、Ｃ−Ｇ塩基が半分以上を占めなければならず、その間にＴまたはＡ塩基が割りこんでいた方がよい。例えば、ＧｎＴＧｍＴＧｏの形態である。多様な塩基配列の構造が可能であるが、できるだけ生体内に自然に存在するものを利用した方がよい。有核生物の染色体端には繰り返された塩基配列からなったテロメア(ｔｅｌｏｍｅｒｅ)が存在し、その配列は人間など哺乳類の場合、ＴＴＡＧＧＧやＴＴＴＡＧＧＧ、あるいはＴ１−３(Ｔ/Ａ)Ｇ３−が繰り返しており、その他の生物の場合、ＴＴＧＧＧＧやＴＴＴＴＧＧＧＧが繰り返す構造を示す。免疫グロブリンのスイッチ部位(ｓｗｉｔｃｈ ｐｏｒｔｉｏｎ)にも類似な構造が示される(Ｂａｌａｇｕｒｕｍｏｏｔｈｙ Ｐ、Ｂｒａｈｍａｃｈａｒｉ ＳＫ、Ｍｏｈｎａｔｙ Ｄ、Ｂａｎｓａｌ Ｍ ａｎｄ Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ Ｖ. Ｈａｉｒｐｉｎ ａｎｄ ｐａｒａｌｌｅｌ ｑｕａｒｔｅｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ. Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ. １９９２; ２０(１５): ４０６１−４０６７; Ｂａｌａｇｕｒｕｍｏｏｔｈｙ P ａｎｄ Ｂｒａｈｍａｃｈａｒｉ ＳＫ. Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ. １９９４; ２６９(３４): ２１８５８−２１８６９)。
本発明の幹部位は、次のように、その一方のらせんに次に記載された塩基が一回または二回以上繰り返される構造で作ることが好ましい。
例)
１．ＴＴＧＧＧ、
２．ＴＡＧＧＧ、
３．ＴＴＧＧＧＧ、
４．ＴＴＴＧＧＧ、
５．ＴＴＡＧＧＧ、
６．ＴＴＴＧＧＧＧ、
７．ＴＴＴＡＧＧＧ、
８．ＴＴＴＴＧＧＧＧ、
９．ＴＴＴＡＧＧＧＧ
すなわち、短くは５個乃至９個のオリゴヌクレオチドが相補的に結合したものになり、これを増やすことができる。経済的費用と効率から見る時、ＴＴＡＧＧＧ−ＡＡＴＣＣＣの塩基配列からなった人体のテロメアの最小単位を利用すれば簡便である。しかし、その長さはいくらでも変形が可能である。通常的には、Ｃ６、Ｃ１２またはＣ１８程度であればよい。
(２) 左側及び右側プローブ部分
ここでのオリゴヌクレオチドプローブは、検査しようとする標的遺伝子に相補性になるようにデザインし、どのような塩基配列も可能である。但し、左側及び右側プローブのオリゴヌクレオチドの塩基配列と長さを適切にデザインすることが必要である。プローブ選択の優先的な基本原則は、左側と右側のオリゴヌクレオチドがお互いに相補性を持って結合しないように、また、各々二次構造を作らないように注意する。
Ｙ字型プローブのデザインにおいて、もう一つ重要なことは方向である。左側プローブ(Ａ部位)は、逆方向の３'→５’順のシーケンスを含み、右側プローブ(Ｅ部位)は、順方向の５’→３'順のシーケンスを構成すべきである。
左右側の各プローブ部位の長さは、通常的に１５乃至７５ｂｐ程度が好ましいが、用途によって、１５０ｂｐ内外まで長くなるかあるいは逆に１５ｂｐ未満に短くなってもよい。各プローブの正確な長さは、実験目的と、標的遺伝子の構造及び塩基配列上の特徴、検査の敏感度と特異度、再現性、ノイズ、バイアス(ｂｉａｓ)をどのように決定するかによって変わる。特異度を高める時には、短く通常的に１５乃至２５ｂｐのものを使用する。敏感度に焦点を置く時は、長く通常的に４０乃至７０ｂｐのものを使用する。ＳＮＰや突然変異を調査するために対立遺伝子特異ハイブリダイゼーション分析を行おうとする時は、プローブ長さを１５個乃至２２個程度にし、その中心部の１個塩基あるいは２〜３個の塩基の差を識別することができる程度に考案しなければならない。検体が特定遺伝子に対するＰＣＲ産物であり、その産物から特定塩基配列の存在を探して遺伝子型を分析しようとする時は、例えば、ウイルスや細菌感染の正確な種と亜種の遺伝子型を分析しようとする時は、プローブの長さを２０個内外にし、最小３塩基以上が特に中心部に差があるように選択する。配列によっては、使用できないものがある。
左側と右側のプローブの長さが対称的になる必要はなく、目的と用途によって左側のプローブの長さが極端的に短くなって、図２２のように、ｄ字型のようになってもよい。また、右側のプローブが極端的に短くなって、ｂ字型のようになってもよい。
オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列及び長さの決定は、公知の方法を参照する。すなわち、検査する標的遺伝子の部位の中で非標的(ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ)遺伝子と相補性が一番少ない特異部位を選択する。次に、ハイブリダイゼーション温度に合わせてプローブの融解温度(Ｔｍ)の範囲を適正範囲内でデザインする。この時、Ｃ＋Ｇの百分率とプローブ長さを入れて計算する。２次構造を作らないようにし、自分のフォールディングエネルギー(ｓｅｌｆ ｆｏｌｄｉｎｇ ｅｎｅｒｇｙ)を分析した方が良い。候補プローブ集合をスライディングウィンドウ(ｓｌｉｄｉｎｇ ｗｉｎｄｏｗ)方式で抽出した後、その候補群を基にして目標遺伝子との相補結合以外の多くの条件などを考慮してハイブリダイゼーションが一番よく発生する可能性が高いプローブを最終的に選択する方法がよく利用される。仮想交雑モジュール(ｖｉｒｔｕａｌ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌｅ)を通じて最適のプローブを選定してもよい。プローブ集合設計は、ハイブリダイゼーションが発生する可能性が高い配列を探す最適化として見られ、このような観点から進化演算技法を使用することもある。また、人工神経網などの学習技法を利用することもある(Ｄａｖｉｄ Ｐ. Ｋｒｅｉｌ、Ｒｏｓｌｉｎ Ｒ. Ｒｕｓｓｅｌｌ ａｎｄ Ｓｔｅｖｅｎ Ｒｕｓｓｅｌｌ. Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ. Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２００６; ４１０:７３−９８; Ｌｅｍｏｌｉｎｅ Ｓ、Ｃｏｍｂｅｓ Ｆ ａｎｄ Ｌｅ Ｃｒｏｍ Ｓ. Ａｎ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｓｔｏｍ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ: ｔｈｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ. Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ. ２００９; ３７(６):１７２６−１７３９)。
簡便な方法では、商業化して市販されるオリゴヌクレオチドプローブデザインプログラムを使用することである。例えば、ＡｒｒａｙＯｌｉｇｏＳｅｌｅｃｔｏｒ、ＣｏｍｍＯｌｉｇｏ、ＨＰＤ、Ｍｐｒｉｍｅ、ＯｌｉＤ、ＯｌｉｇｏＡｒｒａｙ、Ｏｌｉｇｏｄｂ、ＯｌｉｇｏＦａｋｔｏｒｙ、ＯｌｉｇｏＰｉｃｋｅｒ、ＰｏｌｉｇｏＷｉｚ、Ｏｌｉｚ、Ｏｓｐｅｒｙ、ＰＩＣＫＹ、ＰＲＯＢＥｍｅｒ、Ｐｒｏｂｅｓｅｌ、ＰｒｏｂｅＳｅｌｅｃｔ、ＲＯＳＯ、ＳＥＰＯＮ、ＹＯＤＡなどがある。これらは、大部分クロスハイブリダイゼーション(ｃｒｏｓｓ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ)分析、適正プローブ数の分析、いわゆるｌｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｚｏｎｅを避ける方法、方向設定など必要な基本情報を提供する(Ｂｏｚｄｅｃｈ Ｚ、Ｚｈｕ Ｊ、Ｊｏａｃｈｉｍｉａｋ ＭＰ、Ｃｏｈｅｎ ＦＥ、Ｐｕｌｌｉａｍ Ｂ、ＤｅＲｉｓｉ ＪＬ. Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｓｃｈｉｚｏｎｔ ａｎｄ ｔｒｏｐｈｏｚｏｉｔｅ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｗｉｔｈ a ｌｏｎｇ−ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ. Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ. ２００３;４:Ｒ９; Ｌｉ Ｘ、Ｈｅ Ｚ、Ｚｈｏｕ Ｊ. Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｐｔｉｍａｌ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｕｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ、ｇｌｏｂａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ. Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. ２００５;３３:６１１４−６１２３; Ｒｉｍｏｕｒ Ｓ、Ｈｉｌｌ Ｄ、Ｍｉｌｉｔｏｎ Ｃ、Ｐｅｙｒｅｔ Ｐ. ＧｏＡｒｒａｙｓ: ｈｉｇｈｌｙ ｄｙｎａｍｉｃ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｐｒｏｂｅ ｄｅｓｉｇｎ. Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ２００５;２１:１０９４−１１０３; Ｃｈｕｎｇ ＷＨ、Ｒｈｅｅ ＳＫ、Ｗａｎ ＸＦ、Ｂａｅ ＪＷ、Ｑｕａｎ ＺＸ、Ｐａｒｋ ＹＨ. Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｌｏｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ. Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ２００５;２１:４０９２−４１００; Ｒｏｕｃｈｋａ ＥＣ、Ｋｈａｌｙｆａ Ａ、Ｃｏｏｐｅｒ ＮＧ. ＭＰｒｉｍｅ: ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｉｍｅｒ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ ｇｅｎｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ. ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ２００５;６:１７５; Ｔａｌｌａ Ｅ、Ｔｅｋａｉａ Ｆ、Ｂｒｉｎｏ Ｌ、Ｄｕｊｏｎ Ｂ、Ａ ｎｏｖｅｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｗｈｉｃｈ ｍｉｎｉｍｉｚｅｓ ｃｒｏｓｓ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ. ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ. ２００３;４:３８; Ｒｏｕｉｌｌａｒｄ ＪＭ、Ｚｕｋｅｒ Ｍ、Ｇｕｌａｒｉ Ｅ. ＯｌｉｇｏＡｒｒａｙ ２.０: ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ. Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. ２００３;３１:３０５７−３０６２; Ｍｒｏｗｋａ Ｒ、Ｓｃｈｕｃｈｈａｒｄｔ Ｊ、Ｇｉｌｌｅ Ｃ. Ｏｌｉｇｏｄｂ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏ ＤＮＡ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｓ. Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ２００２;１８:１６８６−１６８７; Ｓｃｈｒｅｔｔｅｒ Ｃ、Ｍｉｌｉｎｋｏｖｉｔｃｈ ＭＣ. ＯｌｉｇｏＦａｋｔｏｒｙ: ａ ｖｉｓｕａｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎ. Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ２００６;２２:１１５−１１６; Ｗａｎｇ Ｘ、Ｓｅｅｄ Ｂ. Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ. Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ２００３;１９:７９６−８０２; Ｗｅｒｎｅｒｓｓｏｎ Ｒ、Ｎｉｅｌｓｅｎ ＨＢ. ＯｌｉｇｏＷｉｚ ２.０−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｅａｔｕｒｅ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｐｒｏｂｅｓ. Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. ２００５;３３:Ｗ６１１−Ｗ６１;Ｃｈｅｎ Ｈ、Ｓｈａｒｐ ＢＭ. Ｏｌｉｚ、ａ ｓｕｉｔｅ ｏｆ Ｐｅｒｌ ｓｃｒｉｐｔｓ ｔｈａｔ ａｓｓｉｓｔ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｕｓｉｎｇ ５０ｍｅｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ３´ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ. ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ２００２;３:２７;Ｇｏｒｄｏｎ ＰＭ、Ｓｅｎｓｅｎ ＣＷ. Ｏｓｐｒｅｙ: ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｔｏｏｌ ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ. Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. ２００４;３２:ｅ１３３; Ｃｈｏｕ ＨＨ、Ｈｓｉａ ＡＰ、Ｍｏｏｎｅｙ ＤＬ、Ｓｃｈｎａｂｌｅ ＰＳ. Ｐｉｃｋｙ: ｏｌｉｇｏ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ ｇｅｎｏｍｅｓ. Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ２００４;２０:２８９３−２９０２; Ｅｍｒｉｃｈ ＳＪ、Ｌｏｗｅ Ｍ、Ｄｅｌｃｈｅｒ ＡＬ. ＰＲＯＢＥｍｅｒ: ａ ｗｅｂ−ｂａｓｅｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｏｐｔｉｍａｌ ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｓ. Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. ２００３;３１:３７４６−３７５０; Ｋａｄｅｒａｌｉ Ｌ、Ｓｃｈｌｉｅｐ Ａ. Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ａｒｒａｙｓ. Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ２００２;１８:１３４０−１３４９; Ｌｉ Ｆ、Ｓｔｏｒｍｏ ＧＤ. Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｐｔｉｍａｌ ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｒｒａｙｓ. Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ２００１;１７:１０６７−１０７６; Ｒｅｙｍｏｎｄ Ｎ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｈ、Ｄｕｒｅｔ Ｌ、Ｃａｌｅｖｒｏ Ｆ、Ｂｅｓｌｏｎ Ｇ、Ｆａｙａｒｄ ＪＭ. ＲＯＳＯ: ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ. Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ２００４;２０:２７１２７３; Ｈｏｒｎｓｈｏｊ Ｈ、Ｓｔｅｎｇａａｒｄ Ｈ、Ｐａｎｉｔｚ Ｆ、Ｂｅｎｄｉｘｅｎ Ｃ. ＳＥＰＯＮ、ａ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｐｉｐｅｌｉｎｅ ｆｏｒ ＯｌｉｇｏＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＥＳＴｓ ｗｉｔｈ ａ ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔ Ｔｍ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｃｒｏｓｓ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ. Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ２００４;２０:４２８−４２９; Ｎｏｒｄｂｅｒｇ ＥＫ. ＹＯＤＡ: ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ. Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ２００５;２１:１３６５−１３７０)。
本発明のＹ字型プローブとそれの変形体であるｄ字型プローブにおいて、左側と右側プローブの組み合わせは、検査目的によって多様に考案することができる。代表的な組み合わせでは、次のものなどが挙げられる。
１) 本発明のＹ字型プローブにおいて、標的物質から標的遺伝子を１次選択した後、一つの遺伝子内に相異なる部位を２個選択して各々に対してプローブをデザインする。これによって、一つの遺伝子に対して二重検索することで、一つのプローブで一度だけ検査する既存のプローブより敏感度を一層高めることができる。例えば、実施例９に示したように、性感染の原因菌をこのような特殊Ｙ字型プローブを利用してより正確に検査することができる。
２) 本発明のＹ字型プローブにおいて、標的物質から２個の標的遺伝子を選択して各々に対してプローブをデザインする。これによって、一つの疾患に対して２個の遺伝子を二重検索することで、一つのプローブで一つの遺伝子のみを検査する既存のプローブより正確度を一層高めることができ、検査を簡便にし、コストも減らすことができる。例えば、インフルエンザの正確な遺伝子型診断のためには、ヘマグルチニン(ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ)遺伝子とノイラミニダーゼ(Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ)遺伝子の両方を一緒に検査しなければならない。実施例１０に示したように、この両方の遺伝子をＹ字型プローブを利用して同時に把握することで、診断が一層容易で且つ簡便になる。
３) 本発明のＹ字型プローブにおいて、一方(例、左側)は、調査する標的遺伝子に対してプローブを組成し、他の一方(例、右側)は、対照標準物質の遺伝子内のプローブを選択して、各々に対してプローブをデザインする。例えば、実施例３乃至８に示したように、ＨＰＶの遺伝子型を分析しようとする時、Ｙ字型プローブの一方は、Ｌ１遺伝子内でＨＰＶの類型別に特異なプローブ(ＨＰＶ ｓｕｂｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｂｅ)を入れて、他の一方は、全ての人体検体に存在する標準物質遺伝子(ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ)に特異なプローブを入れると、偽陽性や偽陰性の発生を防止しながらＨＰＶの存在有無及びその遺伝子型を正確に把握することができる。または、Ｙ字型プローブの一方は、Ｌ１遺伝子内でＨＰＶの類型別に特異なプローブを入れて、他の一方は、Ｌ２遺伝子内で全ての型のＨＰＶに共通されたプローブで入れて検査することができる。または、Ｙ字型プローブの一方は、Ｌ１遺伝子内でＨＰＶの類型別に特異なプローブを入れて、他の一方は、Ｅ６/Ｅ７やＬ２遺伝子でＨＰＶの類型別に特異なプローブを入れて検査してもよい。このような新しい概念のＨＰＶマイクロアレイは、ＨＰＶ感染診断と子宮頸部癌、肛門癌、頭頸部癌などの早期診断において大きく役に立つ。
４) 本発明のＹ字型プローブにおいて、一方は調査する標的遺伝子に対してプローブを組成し、他の一方はハウスキーピング遺伝子(ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ)のプローブを組成して、Ｙ字型プローブとマイクロアレイを製作して、検体内の標的及び対照ハウスキーピング遺伝子各々に対して蛍光標識を各々Ｃｙ−３及びＣｙ−５で相異にして、逆転写増幅(ＲＴ−ＰＣＲ：ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ)した後、マイクロアレイ上に乗せてハイブリダイゼーションする。以後、各スポットからバックグラウンドのノイズシグナルを除外してＣｙ−３及びＣｙ−５のシグナルを調査し、これを正常化過程(ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ)を経て分析した後、各スポット内で標的遺伝子のハウスキーピング遺伝子対比シグナル(Ｃｙ３/Ｃｙ５)を測定し、これを多様なスポットで検索してその平均及び標準偏差を求めて標的遺伝子の相対的発現度を統計分析する。
５) 本発明のＹ字型プローブを一度に多数遺伝子の発現を分析するために利用する。例えば、実施例１１のように、Ｙ字型プローブにおいて、一方は調査する多数の標的遺伝子に対して各々プローブを組成し、他の一方は内部対照遺伝子を選択してプローブを組成して、これらを集積してマイクロアレイを製作する。以後、検体を２個で準備する。一つは本当に検査する検体からｃＲＮＡを準備し、この時、試験管内転写(ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ)過程のうち蛍光染料(例えば、Ｃｙ−３)を入れて標識する。これと別に、内部対照遺伝子に対して蛍光染料(Ｃｙ５)を標識しながら試験管内転写を実行して対照検体のｃＲＮＡを準備する。この両方、すなわち、検査する検体のｃＲＮＡと対照遺伝子のｃＲＮＡを混合した後、マイクロアレイ上に乗せてハイブリダイゼーションする。以後、各スポットからバックグラウンドのノイズシグナルを除外してＣｙ−３及びＣｙ−５のシグナルを調査し、これを正常化過程を経て分析した後、各スポット内で対照遺伝子対比標的遺伝子のシグナル比(Ｃｙ−３/Ｃｙ−５)を測定し、これを通じて検体において多数標的遺伝子の相対的発現度を統計分析する。これによって、理論的にすべての知られた人体遺伝子に対して大単位(ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ)遺伝子発現分析が可能である。実施例１１に示したように、この方法を利用して癌患者においてＥＧＦＲ(ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ)の発現を調査すれば、ＥＧＦ受容体(ｒｅｃｅｐｔｏｒ)遮断薬剤や抗体薬剤を投与する適応基準になって、効果的な経過を期待することができる(Ｅｌｌｉｓ ＬＭ ａｎｄ Ｈｉｃｋｌｉｎ ＤＪ. Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ: ｒｅｆｉｎｉｎｇ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ ｅｒａ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｏｎｃｏｌｏｇｙ. Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ. ２００９; １５(２４): ７４７１−７４７８)。
６) 本発明のＹ字型プローブにおいて、左側は、調査する標的遺伝子のセンスストランド(ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ)のＳＮＰ部位に対してプローブを組成し、右側は、標的遺伝子のアンチセンスストランド(ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ)のＳＮＰがない部位で対照プローブを入れてＹ字型プローブを準備することで、マイクロアレイを製作する。この時、左側プローブには、野生乃至正常型、変異型に各々特異なプローブを準備し、両方の差がある塩基はプローブの中心部位において、プローブの長さは、１５−３０ｂｐ程度にする。以後、標的遺伝子のセンスストランドはＣｙ−３で標識し、アンチセンスストランドはＣｙ−５で標識してＰＣＲを実行し、その産物を前記マイクロアレイ上に乗せてハイブリダイゼーションする。以後、各スポットからバックグラウンドシグナルを除去した後、Ｃｙ５対比Ｃｙ３の正常化処理したシグナル(ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｓｉｇｎａｌ)を調査し、これに基づいて完全に一致するスポットのプローブを探す。これによって、野生型であるか変異型であるかを確認することができ、混合型(ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ)も把握可能である。本発明の実施例１２に示したように、もし、ＳＮＰ検索でｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ−Ｈ遺伝子の変異型(Ｙ４０２Ｈ)が確認されると、老化関連黄斑変性(ＡＲＭＤ：ａｇｉｎｇ ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ)の危険度を予測することができ、その予防のために抗酸化機能が高い野菜をたくさん食べて、必ず禁煙し、太陽光が熱い時はサングラスを着するように指示することができる。すなわち、本発明のＤＮＡマイクロアレイを利用したＳＮＰ検査を通じて疾病予測及び予防に役に立つ。
７) 本発明のＹ字型プローブにおいて、変形型のＹ字型プローブを突然変異検索に利用する。Ｙ字型プローブの右側は、調査する標的遺伝子の突然変異部位に対してプローブを組成し、左側は、ほとんど除去したｄ字型のプローブを準備して、これを利用してマイクロアレイを製作する。この時、突然変異可否を検査する塩基別にＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの各々の塩基を分析することができる特異プローブを作り、変異部位の塩基をプローブの中心部位において、プローブの長さは、１５−２５ｐ程度にする。標的遺伝子に対して標識をＣｙ−３でもＣＹ−５でも同一にしてハイブリダイゼーションして完全に一致(ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ)するスポットのプローブを探す。これによって、変異を確認する塩基配列がＡであるか、Ｃであるか、Ｇであるか、Ｔであるかを確認することができる。実施例１３に示したように、この方法を利用してＫ−ＲＡＳ遺伝子の突然変異可否を把握することができ、これは肺癌診断に役に立つ。この場合の肺癌患者は予後が不良であることを予測することができ、さらにＥＧＦＲ遮断薬剤や抗体薬剤は耐性が高いのでこのような薬剤を避けるように指示することができる(Ｅｌｌｉｓ ＬＭ ａｎｄ Ｈｉｃｋｌｉｎ ＤＪ. Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ: ｒｅｆｉｎｉｎｇ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ ｅｒａ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｏｎｃｏｌｏｇｙ. Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ. ２００９; １５(２４): ７４７１-７４７８)。すなわち、本発明のＤＮＡマイクロアレイを利用した突然変異検査は、疾病診断と予後評価、治療方針決定に役に立つ。
以上、上述したように、本発明のＹ字型プローブは、多様に変形が可能であり、ほとんど全ての遺伝子検査に利用することができる。
(３) リンカー(スペーサ)部位
本発明のＹ字型プローブは、多様な支持台(ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ)上に集積(ｓｐｏｔｔｉｎｇ)するようになる。支持台では、スライドガラスを含み、ビーズ(Ｘ−ＭＡＰ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ)、マイクロプレートウェル(ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｗｅｌｌ)、シリコンウエハ(ｓｉｌｉｃｏｎ ｗａｆｅｒ)なども使用可能である。経済性と容易性、多様な試みと経験のため、表面を特殊処理して活性化させたスライドガラス上に集積する方法が優先して考慮される。この時、Ｙ字型プローブに多数の炭素基を有した電荷がない両親媒性(ｔｅｒｍｉｎａｌ ｕｎｃｈａｒｇｅｄ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｃ)のリンカーまたはスペーサを連結し、これをスライドに付着する。プローブをリンカー(スペーサ)なしにそのまま支持台に付ければ、支持台の空間的妨害や静電気的影響のためハイブリダイゼーションがよく起きないところ、リンカーはこれを解決するために必要である(Ｋｅｒｉｌ ＤＰ、Ｒｕｓｓｅｌｌ ＲＲ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｓ. Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ. Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ. ２００６; ４１０: ７３−９８)。
本発明では、その数(ｎ)が最小３個から６０個までのアミノ変形ジデオキシチミジン(ｄｉｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ)(ｉＡｍＭＣｎＴ：ｉｎｔｅｒｎａｌ ａｍｉｎｏ ｍｏｄｉｆｉｅｒ ＣｎｄＴ)を入れる。経済的効率によって炭素数が６個で短いｉＡｍＭＣ６Ｔを使ってもよい。この時、ｉＡｍＭＣ６Ｔの５’末端には、左側幹(ｌｅｆｔ ｓｔｅｍ)を変形させたＣ６アミンリンカーが、スライドガラス表面にコーティングされたアルデハイド基と３'末端のＡ塩基と右側幹(ｒｉｇｈｔ ｓｔｅｍ)の５’末端のＴ塩基と結合し、ｉＡｍＭＣ６Ｔのリボース(ｒｉｂｏｓｅ)に結合してチップ上にＹ字型プローブを固定させる。代表的な例として、ｉＡｍＭＣ６Ｔの化学構造を図２に示した。その他に、Ｃ３、Ｃ１２、Ｃ１８、Ｃ２４なども使用可能である。
(４) 標識物質
プローブの標識物質では、公知のさまざまな物質を使用することができる。例えば、Ｃｙ５、ＢｏｄｉｐｙとＣｙ３、Ａｌｅｘａ ５３２、Ａｌｅｘａ ５４６、Ｒｏｄａｍｉｎ、ＴＡＭＲＡだけではなく、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、ＦｌｕｏｒＸ、Ａｌｅｘａ ４８８とＡｌｅｘａ ５６８、ＲＯＸ、Ｔｅａｘａｓ Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ ５９４を使用することができる。また、ビオチン(ｂｉｏｔｉｎ)とアビジン(ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅ)の結合物質を使用して標識することも可能である。例えば、ＰＣＲ産物を増幅する時使用したプライマー末端にビオチン標識するか、またはビオチンが標識されたｄＮＴＰｓを使用してＰＣＲ増幅されたターゲットに前記言及した蛍光標識されたアビジン(ストレプトアビジン)を使用して検出する方法も可能である。以外にもＡｕＮＰまたは銀などのようなナノ粒子で標識する方法も可能である。
本発明では、Ｙ字型プローブには標識物質を付けないで、代わりに検体核酸に標識物質を付けてＤＮＡマイクロアレイ上に乗せて、Ｙ字型プローブとハイブリダイゼーション反応を行う。しかし、用途と目的によってＹ字型プローブに直接標識物質を付けて検体核酸と反応させてもよい。この場合、標識物質は、普通、右側プローブ部位の３'末端に付けるが、左側プローブ部位の５’末端に付けるか、右側プローブ部位の３'末端と左側プローブ部位の５’末端の両方に付けてもよい。また、両側プローブの末端ではないその内部に付けてもよい。ここで、プローブの標識物質では、公知のさまざまな標識物質を使うことができる。例えば、 Ｃｙ５、ＢｏｄｉｐｙとＣｙ３、Ａｌｅｘａ ５３２、Ａｌｅｘａ ５４６、Ｒｏｄａｍｉｎ、ＴＡＭＲＡだけではなく、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、ＦｌｕｏｒＸ、Ａｌｅｘａ ４８８とＡｌｅｘａ ５６８、ＲＯＸ、Ｔｅａｘａｓ Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ ５９４を使用することができる。
Ｙ字型プローブの合成
実施例１のようにデザインされたＹ字型プローブは、次の過程を通じて合成が可能である。Ｙ字型オリゴヌクレオチドプローブの合成過程は、１) 脱トリチル段階(ｄｅｔｒｉｔｙｌａｔｉｏｎ、ＤＭＴ除去)、２) カップリング、３)キャッピング(ＣＡＰＰＩＮＧ)、４) 酸化(ｏｘｉｄａｔｉｏｎ)に分けられ、１周期の間１個のヌクレオチドが結合する。したがって、合成しようとする塩基配列順にｄＡ、ｄＧ、ｄＴ、ｄＣを手順に各反応に参加させてオリゴマーを合成することができる。合成が完了すれば、酸化アンモニウム(ａｍｍｏｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ)を入れて支持体からオリゴマーを分離する(ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ)。オリゴヌクレオチドは、３'末端のヌクレオチドを動かないように固型支持体に結合した後コラムで反応させることで合成が行われる。したがって、合成は３'から５’の方向へ実施される。支持体は、ＣＰＧ(ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ)やポリスチレンを使用する。ポリスチレンは疎水性が強い支持体としてＣＰＧより合成効率がよい。ｓｔａｔｉｏｎａｒｙヌクレオシドは、ジメトキシトリチル基(ＤＭＴ)により保護される自由５’末端を有し、ＤＭＴが除去され、溶液を通じて注入される他のヌクレオチドの活性化された３'方のリン酸気と結合してヌクレオチドリンクを形成する。各々のヌクレオシドは、溶液でコラムに注入されるので、コラムでモノマーヌクレオシド(ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ)結合が起きる５’末端を保護するためにＤＭＴが結合されている。したがって、オリゴ鎖は、ＤＭＴを除去した後、他の単量体ヌクレオシドを３'から５’方向へ進行する。
１) 脱トリチル(ＤＭＴ除去)：卜リクロロ酢酸(ＴＣＡ)を注入して５’のＤＭＴを陽イオンで作って分離し、ドレーン(ｄｒａｉｎ)を通じて除去する。この時、無水条件により可逆反応が進行される。
２) カップリング：ホスホアミダイト(ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ)は、化学的に変形されたヌクレオシドとして、下記４種の化合物の酸化還元反応によりカップリングが起きる。テトラゾール(ＴＥＴ)とホスホアミダイトはテトラゾールリルホスホアミダイトという活性化された中間物質を通じて支持体の５’ヒドロキシ基と反応してインタヌクレオチドホスファイト(ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ)を形成する。
［１］ ジイソプロピルアミノ−ホスホアミダイト
［２］ ３'−Ｂ−シアノエチル保護基
［３］ ５’−ヒドロキシ基にあるジメトキシトリチル保護基
［４］ ＡとＣの環外アミンのベンゾイル保護基、Ｇの環外アミンにあるイソブチル保護基、Ｔは環外基がない。
３) キャッピング：５’−ヒドロキシ基の２％程度はカップリングすることができないので、次の反応で塩基が結合しないようにする必要があり、このような過程をキャッピングと言う。それはアセチル化により完結される。
４) 酸化：新たに形成されたヌクレオチド連結基は、３価亜リン酸トリエステル結合で不安定なので安定的な５価亜リン酸トリエステルに酸化される。
５) 脱保護(ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ)：合成が終了すれば、ＤＭＴをアセトニトリルで清浄して除去し、支持体をコラムから分離する。ＣＰＧに結合されている合成されたＤＮＡを分離するために酸化アンモニウムで５５℃で８〜１５時間脱保護する。
６) 精製：合成されたオリゴマーは、正常的な配列を有したものとｄＮＴＰとカップリングされなくてキャッピングされたオリゴマーとが混合している。したがって、希望するオリゴマーのみを抽出するために精製しなければならない。精製は、ｐｒｅｐ.に使用する樹脂(ｒｅｓｉｎ)によってゲルコラム精製法と、精製方法によってＰＡＧＥ、ＨＰＬＣなどがある。
前記過程をより詳しく説明すれば、次のようである。
ＤＮＡの化学的合成は、ＤＮＡ重合酵素による生体または試験管で起きる酵素的合成とは異なり化学的な一連の反応であり、３’→５’方向に進行される。この化学的ＤＮＡ合成において考慮する点は、４種の塩基、リン酸基、５’水酸基など多くの作用基である。したがって、各段階で希望する化学反応のみが起きるように他の作用基を保護基で塞ぐ必要がある。
１) 作用基の保護
［１］ 塩基のアミノ基
ＤＮＡ塩基に存在するアミノ基は全て保護しなければならない。そうでなければ、合成過程のうちアセチル化、リン酸化反応などがアミノ基にも起きるようになる。一般的に、酸に安定してアルカリから除去しやすい保護基が使われる。チミン(Ｔ)を除外したアデニン(Ａ)とシトシン(Ｃ)のアミノ基はベンゾイル基で保護し、グアニン(Ｇ)のアミノ基はイソブチルで各々保護する。
［２］ ５’水酸基の保護
５’−ＯＨは、縮合反応、キャッピング反応、酸化反応中には保護され、次のヌクレオチドがカップリングされるすぐ直前には弱酸(ＴＣＡ)により除去されなければならない。このような目的に適合な保護基でジメチルトリチル(ＤＭＴ：ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｒｉｔｙｌ)が使われている。
［３］ リン酸基の保護
リン酸基は、ＣＨ３基で保護されてチオフェノールで室温で除去させたが、最近には、濃アンモニア水で手軽く除去できるβ−シアノエチル保護基を使用している。
２) ＤＮＡの合成周期
ＤＮＡ合成は、３'→ ５’の方向に進行され、最初にはヌクレオチドの３'水酸基を樹脂に付けておいて、一塩基が添加されるうちに大きく４段階の化学反応、すなわち、５’−末端の脱トリチル(ＤＭＴ除去)、新しい塩基の付加反応(ｃｏｕｐｌｉｎｇ)、付加反応が起きないＤＮＡ鎖のキャッピング反応、リン酸基の酸化反応を繰り返す。反応が終わると、保護基を除去し、合成されたオリゴヌクレオチドを樹脂から引き離す。
このように樹脂に付けておいたまま合成すれば、多くの段階の反応を容易に進行させることができる。このようにしなければ、各反応が終わる時ごとに希望する物質を精製すべきであり、この過程での損失も非常に大きくなる。
［１］ 脱トリチル(ＤＭＴ除去)
ＤＮＡ合成の初段階では支持体に付着されたヌクレオチド誘導体の５’−ＯＨを保護しているＤＭＴ基をＴＣＡで処理して除去する。その結果、次のカップリング段階でホスホアミダイトと反応できるガラス５’−ＯＨを得ることができ、この過程を脱トリチルと言う。この時、ＤＭＴ基は、副産物で生成されてカップリング効率など段階別に合成効率を測定することに利用される。
［２］ カップリング
ホスホアミダイトは、ヌクレノシドの誘導体であり、３'−Ｐ位置にあるジイソプロリルアミン基は３'−Ｐの安定化に関与してテトラゾールと反応しやすい化合物である。３'−Ｐは、β−シアノエチル基に保護されているため副反応(ｓｉｄｅ ｒｅａｃｔｉｏ n)を塞いで、合成後に濃アンモニア処理で容易に保護基を除去できる。５’−ＯＨに結合されたＤＭＴ基は５’−ＯＨ基を保護する。ホスホアミダイトＴを除外してホスホアミダイトＣ、ＡまたはＧのアミノ基は、ベンゾイル基またはイソブチル基が各々結合されている。
カップリングに関与する反応物は、５’−ＯＨ基と量的に迅速に反応が行われる必要があり、合成が容易でかつ精製過程が簡便であるだけでなく、Ｈ２ＯとＯ２と反応しない安定した化合物である必要がある。したがって、カップリングの前に、支持体はアセトニトリルでよく洗浄してヌクレオシドと親和性がある物質を除去する。残余アセトニトリルはアルゴンガスを逆流して乾燥除去する。カップリング反応は、ホスホアミダイト１番、２番、３番、４番、５番の試薬組とテトラゾールが、伝達管を通じてコラムに到着するとすぐ混合体になって弱酸性(ｐＫａ＝４.８)を示し、テトラゾールは、３'−Ｐに位置したジイソブチル基の窒素分子にＨ＋を転移する。Ｈ＋を受けたアミンは、５’−ＯＨにヌクレオシドになりやすい親和性物質になる。この結果、中間ヌクレオチド連結基は、３価のリン酸が形成されて付加反応が行われる。
［３］ キャッピング(Ｃａｐｐｉｎｇ)
カップリングはいつも定量的ではないので支持体に付着された少量(普通０−２％)のヌクレオチドは付加反応に関与しないこともある。このように反応しなかったＤＮＡ鎖が次の付加反応で伸張しなように残存ガラス５’−ＯＨ基をアセチル化させてキャッピングしなければならない。アセット無水物とＮ−メチルイミダゾール(ＮＭＩ)が同量、同一モル濃度で同時にコラムに伝達されると、強力なアセチル化試薬と５’−ＯＨ基が反応して不活性化してキャッピングされる。
［４］ 酸化反応(ｏｘｉｄａｔｉｏｎ)
新たに作られたヌクレオチド結合は、３価のホスファイトのトリエステルである。ホスファイト結合は不安定なので酸と反応すれば切断されやすい。したがって、キャッピング後に３価ホスファイトトリエステルを安定的な５価ホスファイトトリエステルに酸化させる。ｉｏｄｉｎｅは酸素の供与体である水とテトラヒドロフラン(ＴＨＦ)溶液で弱酸化剤として作用する。Ｉｏｄｉｎｅ−ｗａｔｅｒ−ｌｕｔｉｄｉｎｅ−ＴＨＦがカラム（Column）に到逹すれば、３価のリン酸を３０秒以内に５価に酸化させる。この過程を酸化反応と言う。Ｉｏｄｉｎｅ溶液は、次の化学反応で有害なのでアセトニトリルで除去する。酸化反応後、１個のヌクレオチド添加が１回の合成週期である。
合成するオリゴヌクレオチドの塩基配列によって前記４段階別に反応を繰り返して合成が完結されると、５’−末端には相変らずＤＭＴ基が残っている状態になり、合成ＤＮＡの精製方法によってトリチル基が付着された状態または除去された状態で合成を終結する。すなわち、合成されるＹ字型プローブの順序はシーケンスによって３'−Ｅ(右側プローブ) →Ｄ(右側幹) → Ｃ(リンカー) → Ｂ(左側幹) → Ａ(左側プローブ)−５’の順に合成される。
［５］ 合成後の処理過程
合成後の精製過程は、用途によって異なる。精製後に乾燥させて小さい容器に保管する。合成したオリゴヌクレオチドは、使用前に量を測定する。また、実際の使用に適合に適切な濃度でＤＮａｓｅがない滅菌数(ｐＨ７)やＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ(ＴＥ、ｐＨ７)の緩衝溶液に溶かす。一般的に、１ｍｇ/ｍｌの濃度が適当であり、それより低い濃度ではオリゴヌクレオチドが破壊されやすい。オリゴヌクレオチドの量は、ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒでＵＶ吸光度を測定することで一番正確で且つ容易に分かることができる。
１ＯＤ ｕｎｉｔ＝３３ｕｇ/ｍｌの単一幹オリゴデオキシヌクレオチド(ＤＮＡ)
１ｍｇ ＤＮＡオリゴヌクレオチド＝３０(ＯＤ)
１ｕｍｏｌ ＤＮＡオリゴヌクレオチド＝１０(ＯＤ)
例えば、合成したオリゴヌクレオチドの吸光度がＯＤ２６０＝３.３である場合は、０.１１ｍｇのプローブが合成されることが分かる。
前記過程は、ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒという機器を使って自動的に実行することもできる。通常的に、ＡＢＩのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、ＢｉｏＬｙｔｉｃの Ｄｒ.Ｏｌｉｇｏ １９２ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｏｌｉｇｏ ＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒやＢｅｃｋｍａｎのＢｅｃｋＭａｎ Ｏｌｉｇｏ １０００Ｍ装備などを使用し、合成単価を低めるため、主に並列アレイ合成(ｐａｒａｌｌｅｌ ａｒｒａｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ)技術を使用すれば、機器一台で９６ウェルプレート(ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ)を使用して一度に１９２個のオリゴヌクレオチドを同時に合成することができる。
実施例１でデザインされたＹ字型プローブは、ＰＮＡ合成過程を通じても合成が可能である。このように作られたＹ字型プローブは、ＰＮＡが有する長所、すなわち、ＰＮＡ/ＤＮＡ二重体がＤＮＡ/ＤＮＡ二重体より強く結合するする長所を有する。これは、ＰＮＡが電気的中性である特性によりターゲットＤＮＡとの反発力が低くなるからである。このような強い結合力はＰＮＡ/ＤＮＡ二重体の熱安全性を高めてＴｍ値が高くなる効果を提供する。ＰＮＡ/ＤＮＡ二重体のＴｍ値は塩基対当たり約１℃ずつ高くなる。したがって、一般的にチップに適用される１５個のＰＮＡプローブの場合、約１５℃高いＴｍ値を有するようになる。また、単一塩基が一致しない場合、Ｔｍ値が大きく落ちて、塩基配列変異の検索能力も一層大きくなる。ＰＮＡは核酸分解酵素やタンパク質分解酵素に対して安定的である。その理由は、生物学的酵素はＰＮＡの独特なアマイド骨格を認識することができないからである。したがって、このような生物学的安全性はＤＮＡまたはＲＮＡサンプルの準備過程及び長期保存中に発生する問題点を予防することができる。また、ＰＮＡは電気的に中性であり、強い共有結合からなっているので、多様なｐＨ範囲及び温度条件でも安定的である。これはＤＮＡが酸性条件(ｐＨ４.５〜６.５)で脱プリン化(Ｄｅｐｕｒｉｎａｔｉｏｎ)される不安定性とは異なり、ＰＮＡは酸性及びアルカリ条件で化学的に安定であるという長所を有するので多様な目的でも使用が可能である。
実施例３〜８：ＨＰＶ診断用ＤＮＡマイクロアレイの開発
本発明は、Ｙ字型プローブを集積したＤＮＡマイクロアレイを利用してＨＰＶ(ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ)感染を診断する新しい方法に関する。本実施例３乃至８は、ＨＰＶ診断を例として、Ｙ字型プローブを準備する段階(実施例３)、これをスポッティング(ｓｐｏｔｔｉｎｇ)あるいは集積してＤＮＡマイクロアレイを製作する段階(実施例４)、検体ＤＮＡを分離した後標識して準備する段階(実施例５)、ハイブリダイゼーション反応段階(実施例６)、反応後そのシグナルを分析する段階(実施例７)、本発明のＤＮＡマイクロアレイを臨床診断に利用する段階(実施例８)からなる。本実施例３乃至８は、Ｙ字型プローブの利用方法に関する一例を示し、Ｙ字型プローブを利用したＤＮＡマイクロアレイが重要疾患の診断に有用であることを示す。
ＨＰＶは、誘電体が２重らせんＤＮＡからなっており、その中には、Ｅ１からＥ７までの初期(ｅａｒｌｙ)タンパク質遺伝子とＬ１及びＬ２の後期(ｌａｔｅ)タンパク質遺伝子が存在する。Ｌ１とＬ２は、誘電体を包んで保護するカプシドタンパク質(ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ)を暗号化する。Ｌ１の中で約１０％あるいはそれ以上の塩基配列はＨＰＶの各タイプ別に差があり、これを判読すれば、ＨＰＶの遺伝子型が分かる。ＨＰＶは、人体の皮膚及び粘膜の上皮を侵犯して炎症及び過増殖を誘発し、激しくは癌を誘発する特徴を有している(Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｏｆ ＳＴＤ/ＨＩＶ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ。Ｇｅｎｉｔａｌ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ。Ｆｅｂ ２００８)。
ＨＰＶには、その遺伝子型によって約１２０余個の型があり、約４０余種が 肛門と陰部、すなわち、膣と子宮頸部、尿道、陰茎の皮膚及び粘膜を侵犯するいわゆる肛門陰部型(ａｎｏｇｅｎｉｔａｌ ｔｙｐｅ ＨＰＶ)である。ＨＰＶ感染の大部分は症状なしに潜伏されているが、一部はいぼ(ｗａｒｔ)を誘発する。また他の一部は高等級扁平上皮内病変(ＳＩＬ：ｈｉｇｈ ｇｒａｄｅ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｌｅｓｉｏｎ)や上皮内腫瘍(ｃｅｒｖｉｃａｌ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｍ)のような前癌病変を誘発し、この中で一部は癌に進行する。前癌病変と癌を誘発するＨＰＶ型を高危険型(ｈｉｇｈ ｒｉｓｋ ｔｙｐｅ)ＨＰＶと言い、そうではないＨＰＶ型を低危険型(ｌｏｗ ｒｉｓｋ ｔｙｐｅ)ＨＰＶと言う。高危険型ＨＰＶでは、ＨＰＶタイプ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、８２がある。これに対して低危険型ＨＰＶでは、ＨＰＶタイプ６、１１、３４、４０、４２、４３、４４、５４、５５、６１、６２、７２、８１が含まれる。高危険で疑心されるかまだ確立されない型(ｐｒｏｂａｂｌｅ ｈｉｇｈ ｒｉｓｋ ｔｙｐｅ)では、ＨＰＶタイプ２６、５３、６６、６７、６９、７０、７３がある。その他に正確に分類されなかったその他型では、ＨＰＶタイプ７、１０、２７、３０、３２、５７、８３、８４、９１がある。高危険型ＨＰＶの場合、その遺伝体の中でＥ６/Ｅ７遺伝子がいわゆる発癌遺伝子として作用し、これらは人体の一番重要な腫瘍抑制遺伝子であるｐ５３及び網膜芽細胞腫(Ｒｂ：ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ)遺伝子と結合して非活性化させることで癌化(ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ)を触発する。子宮頸部癌の場合、９９％以上が高危険型ＨＰＶにより発病し、ほとんど癌細胞の遺伝体内でＥ６/Ｅ７などＨＰＶの遺伝子切れが発見される(Ｍｕｎｏｚ Ｎ、Ｂｏｓｃｈ ＦＸ、ｄｅ Ｓａｎｊｏｓｅ Ｓ、Ｈｅｒｒｅｒｏ Ｒ、Ｃａｓｔｅｌｌｓａｇｕｅ Ｘ、Ｓｈａｈ ＫＶ、Ｓｎｉｊｄｅｒｓ ＰＪ、Ｍｅｉｊｅｒ ＣＪ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ. Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ. Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ. ２００３; ３４８: ５１８−５２７)。
ＨＰＶ感染は、培養や染色、組職検査、免疫学的検査では診断が難しくて、遺伝子検査のみで正確な診断が可能である。ＨＰＶの遺伝子検査には、３種類がある。１．単純にＨＰＶの存在有無を確認する検査である。代表的な例としてＨＰＶの遺伝子のコンセンサスシーケンス(ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ)、すなわち、変化がない部位の塩基配列をＰＣＲで増幅した後電気泳動などで確認する方法である。２．ＨＰＶの存在有無だけではなくそのタイプを一緒に確認するいわゆる遺伝子型分析検査(ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ)である。その黄金標準率的検査(ｇｏｌｄｅｎ ｓｔａｎｄａｒｄ ｔｅｓｔ)は、ＰＣＲ後にその産物を自動塩基配列分析するかあるいはシークェンシングして遺伝子型を分析する方法である。しかし、これは費用と時間、人力が多く必要となるので、最近には、ＨＰＶ ＤＮＡマイクロアレイに対置される傾向である。これは多数のＨＰＶ型に特異なプローブを集積した固型支持体上に検体ＤＮＡのＰＣＲ産物を乗せてハイブリダイゼーション反応を実行してスキャナで分析する方法である。３．両方の中間になる検査で、Ｈｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ Ａｓｓａｙ(Ｄｉｇｅｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ, Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ)がこれに該当し、ＨＰＶの存在有無を把握し、存在するＨＰＶが高危険群であるか低危険群であるかを判読することができるが、正確な遺伝子型は判読不可であるという短所がある。また、１３個の高危険型ＨＰＶと７個の低危険型ＨＰＶのみを分析するので、これに含まれない２０余個型のＨＰＶは把握できないという問題がある(Ｋｉｍ ＫＨ、Ｙｏｏｎ ＭＳ、Ｎａ ＹＪ、Ｐａｒｋ ＣＳ、Ｏｈ ＭＲ、Ｍｏｏｎ ＷＣ. Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ＤＮＡ ｃｈｉｐ. Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ. ２００６; １００(１):３８−４３; Ｓｅｌｖａ Ｌ、Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｂｏｓｑｕｅｔ ａ Ｅ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐｌａｔａ ＭＴ、Ｅｓｔｅｖａ Ｃ、Ｓｕｎｏｌ Ｍ ａｎｄ Ｍｕｎｏｚ−Ａｌｍａｇｒｏ Ｃ. Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｗｏｍｅｎ ａｔｔｅｎｄｉｎｇ ａ ｃｏｌｐｏｓｃｏｐｙ ｃｌｉｎｉｃ. Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ. ２００９; ６４: ４１６−４２１)。
ＨＰＶ遺伝子検査は、医学分野だけではなく社会経済的でも非常に重要な意味を有する。これには次のような理由がある。
１．ＨＰＶ感染は、人間において一番よく見られる性伝播性感染(Ｓｅｘｕａｌｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ)である。ＨＰＶ感染は単一要因から見る時一番有病率(ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｒａｔｅ)が高い性感染として、アメリカの１４から５９歳の間の女性の２６.８％からＨＰＶ感染が発見され、全体女性の中で８０％が生涯一回以上感染されると推定されている。特に、性的活動期、可妊期の女性においてよく好発し、発病率が増加することで推測されている。すなわち、ＨＰＶの市場は非常に広くて、ＨＰＶ検査の経済的価値も非常に大きい(Ｕ.Ｓ. ＤＥＰＡＲＴＭＥＮＴ ＯＦ ＨＥＡＬＴＨ ＡＮＤ ＨＵＭＡＮ ＳＥＲＶＩＣＥＳ、Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ＨＩＶ/ＡＩＤＳ、Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ、ＳＴＤ、ａｎｄ ＴＢ. Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＳＴＤ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ. Ｓｅｘｕａｌｌｙ Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ２００８. Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＳＴＤ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ. ２００９: Ｎｏｖｅｍｂｅｒ; Ｔｃｈｅｒｎｅｖ Ｇ. Ｓｅｘｕａｌｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ: ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ、ｃｌｉｎｉｃ、ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ、ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｓｐｅｃｔｓ、ｃｕｒｒｅｎｔ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｐｔｉｏｎｓ. Ａｎ Ｂｒａｓ Ｄｅｒｍａｔｏｌ. ２００９; ８４(４): ３７７−８９)。
２．ＨＰＶは人間において癌を誘発すると明白に立証されたウイルスである。ほとんど全ての子宮頸部癌は、ＨＰＶ、特に高危険型のＨＰＶにより始まることで確認されている。全世界的に毎年約５０万人の女性が子宮頸部癌に罹患され、２７万人以上がこれにより死亡する。さらに、肛門癌の大部分、また口腔癌や咽頭癌、喉頭癌の相当数がＨＰＶにより直間接的に誘発されることが最近確実視されている。ＨＰＶは、癌を誘発して死亡に至るようにする点でその重要性が大きく、一方ではＨＰＶを検査すれば、子宮頸部及び肛門などの癌と前癌病変を早期診断することができる。実際にＨＰＶ検査は子宮頸部癌早期検診の標準検査であるパパニコロー(Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ)細胞検査(Ｐａｐ ｓｍｅａｒ)より子宮頸部癌の予測敏感度が一層に優秀であると判明されており、これによって、アメリカＦＤＡなど多くの国家から子宮頸部癌選別検査で認められている(Ｐａｒｋｉｎ Ｍ、Ｆ. Ｂｒａｙ Ｆ、Ｊ. Ｆｅｒｌａｙ Ｊ ａｎｄ Ｐ. Ｐｉｓａｎｉ Ｐ. Ｇｌｏｂａｌ ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、２００２. Ｃ.Ａ. Ｃａｎｃｅｒ Ｊ. Ｃｌｉｎ. ２００５; Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｏｆ ＳＴＤ/ＨＩＶ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ. Ｇｅｎｉｔａｌ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ. Ｆｅｂ ２００８)。
３．ＨＰＶ感染による子宮頸部癌は、最近ワクチンが開発されることによってウイルスの予防とともにウイルスによる癌の予防が可能になった最初の例になっている。現在、市販されるＨＰＶ予防ワクチンには２種類がある。一つは、ＧａｒｄａｓｉｌR (Ｍｅｒｃｋ & Ｃｏ. Ｉｎｃ., Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ)として、これは、タイプ１６と１８、６、１１の４種のＨＰＶを予防するために作われた４価ワクチンである。また、他の一つは、ＣｅｒｖａｒｉｘR (ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ)として、タイプ１６と１８の２種のＨＰＶを予防するために作られた２価ワクチンである。これらワクチンは、性関係を有する前の青少年期の女性に一番効果的であり、以前にＨＰＶ１６やＨＰＶ１８に感染したことがある女性の場合は効果が低下される。そのため、大人女性に対する適応可否に難点があるが、ＨＰＶに感染したことがあってもその型がタイプ１６や１８ではない場合、ＨＰＶワクチンが適応する可能性がある。したがって、ＨＰＶの感染有無だけではなくその型(ｔｙｐｅ)も正確に分かることが一層重要になっている(Ｓｅｌｖａ Ｌ、Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｂｏｓｑｕｅｔ Ｅ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ-Plata a ＭＴ、Ｅｓｔｅｖａ Ｃ、Ｓｕｎｏｌ Ｍ ａｎｄ Ｍｕｎｏｚ−Ａｌｍａｇｒｏ Ｃ. Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｗｏｍｅｎ ａｔｔｅｎｄｉｎｇ ａ ｃｏｌｐｏｓｃｏｐｙ ｃｌｉｎｉｃ. Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ. ２００９; ６４: ４１６−４２１; Ｒｅｙｎａｌｅｓ−Ｓｈｉｇｅｍａｔｓｕ ＬＭ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ＥＲ、Ｌａｚｃａｎｏ−Ｐｏｎｃｅ Ｅ. Ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ Ｍｅｘｉｃｏ. Ａｒｃｈ Ｍｅｄ Ｒｅｓ. ２００９ Ａｕｇ;４０(６):５０３−１３)。
上記文献の分析によって、ＨＰＶの存在可否と、その遺伝子型を正確で且つ迅速で、最小費用で、そして大単位で検索が可能な検査が要求されていることが分かる。そのために一番有望な検査はＤＮＡマイクロアレイである。
市中にはＨＰＶ ＤＮＡマイクロアレイ製品がいくつか市販されている。代表的な製品は、ＨＰＶ ＤＮＡチップテスト(ＭｙＧｅｎｅ Ｃｏ. ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｌａｂ Ｃｏ., Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ)とＧＧ ＨＰＶ ＤＮＡチップ(Ｇｏｏｄｇｅｎｅ Ｉｎｃ., Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ)、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｒｒａｙｓ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｈｕｍａｎｏチップ(ＣＡＰＨチップ、Ｇｅｎｏｍｉｃａ Ｓ.Ａ.Ｕ., Ｍａｄｒｉｄ、Ｓｐａｉｎ)などである。これら製品は、全てＨＰＶのＬ１乃至Ｅ６/Ｅ７遺伝子のコンセンサスシーケンスを標的として、２２乃至４４種の肛門陰部型ＨＰＶに特異なＨＰＶのオリゴヌクレオチドプローブをスライドガラスに集積した点で類似である。そのうちＧＧ ＨＰＶチップとＣＡＰＨチップは、内部参照遺伝子としてヒューマンベータグロビンの遺伝子プローブを一緒に集積する点に長所がある。しかし、既存のマイクロアレイは、前述した既存のオリゴヌクレオチドの限界、すなわち、ノイズの処理と正常化過程、シグナルの分析と統計分析、品質管理などが完璧であると見にくい。例えば、特定型のＨＰＶのスポットにシグナルが陽性で現われることはあるが、そのシグナルが弱い時、あるいはシグナルが強くてもバックグラウンドシグナルも強く現われると、これが真性陽性(ｔｒｕｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ)であるかあるいは偽陽性であるか分かりにくい。また、偽陰性可否を正確に把握することも容易ではなくて、再現性、品質管理など解決されない問題が多い。
本発明のＨＰＶ ＤＮＡマイクロアレイは、既存のＨＰＶ ＤＮＡチップの上記した問題点を解決するためにＹ字型プローブを使用した。Ｙ字型プローブの一方には、Ｌ１遺伝子内でＨＰＶの類型別に特異なプローブ(ＨＰＶ ｓｕｂｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｂｅ)を入れて、他の一方には、内部参照(ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ)遺伝子であるヒトベータグロビンに対するプローブを入れてマイクロアレイを製作した。以後、ＨＰＶ Ｌ１とヒトベータグロビンに対して各々Ｃｙ−５とＣｙ−３などで相異に蛍光標識してＰＣＲ増幅した後、その産物をマイクロアレイ上に乗せてハイブリダイゼーション反応を実行し、その結果を蛍光スキャナで分析する。この時、バックグラウンドノイズを除去した後各々のスポットで正常化(ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ)処理したＣｙ−５対比Ｃｙ−３シグナルの値を分析することで、これが真性陽性であるか確認する。これによって、偽陽性と偽陰性を極小化でき、スポット間のエラー、判読及び統計分析、品質管理がより適切に行われる。本発明の製品と同一な方式のＨＰＶ ＤＮＡマイクロアレイ製品に対しては報告されたことがない。
本発明のＨＰＶ ＤＮＡマイクロアレイは、ＨＰＶ自体の診断だけではなく、ＨＰＶにより発病する子宮頸部癌など各種癌の選別(ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ)、早期検診、予防、治療においてまで大きく役に立つと期待される。具体的には、子宮頸部癌、肛門癌、口腔癌などＨＰＶにより続発される癌の早期検診に最適の検査になり、ＨＰＶの予防ワクチンの適応可否を把握することにも役に立つ。また、癌患者から発見される特定遺伝子型のＨＰＶにオーダーメイド式でそれに独特なＤＮＡワクチンや樹枝状細胞(ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ)ワクチンをデザインすることにも役に立つ。これらワクチンは、予防目的のワクチンと異なり、ＨＰＶに対する細胞媒介性免疫(ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ)を発動させて、Ｔ細胞がＨＰＶだけではなくＨＰＶに感染された非正常的細胞を死滅させて坑癌治療効果を示す(Ｍｏｎｉｅ Ａ、Ｔｓｅｎ ＳＷ、Ｈｕｎｇ ＣＦ、Ｗｕ ＴＣ. Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＨＰＶ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ. Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ. ２００９ ;８(９): １２２１−３５)。
本発明のＨＰＶ ＤＮＡマイクロアレイ製品には、マイクロアレイだけではなく、ＰＣＲ試薬、ハイブリダイゼーション反応試薬、製品採取キット、スキャナでの判読に必要な指針書まで含まれる。
ＨＰＶに対するＹ字型プローブの準備
この段階は、ＨＰＶ遺伝子型分析(ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ)のためのＹ字型プローブとＰＣＲプライマーをデザインする段階である。
まず、ＨＰＶの遺伝体の中で、コンセンサスシーケンスであると共に、一方では多様なＨＰＶ型によって最小３個以上の塩基配列の差があって判別が可能な部分を選択した。これは、ＨＰＶ Ｌ１遺伝子の標準塩基配列の中で１０２４番目から１２０５番目までのシーケンスである。これをＰＣＲで増幅できるようにプライマーをデザインし、更にＰＣＲ産物内で各々のＨＰＶ型に一番適合な部位を選択し、これに相補性塩基配列でＹ字型プローブの右側部位プローブを設計した。同様な方法で内部参照遺伝子であるヒトベータグロビン(ＨＢＢ)遺伝子のＰＣＲに必要なプライマーをデザインし、更にＰＣＲ産物内で一番適合な部位を選択し、これに相補性塩基配列でＹ字型プローブの左側部位プローブを設計した。
３.１. ＨＰＶに対するＰＣＲプライマーのデザイン
本発明のＤＮＡチップキットには、配列番号１乃至配列番号４の塩基配列からなる群より選択されたＨＰＶタイプ別の増幅用プライマーとヒトベータグロビンプライマーが含まれる。検査しようとするＨＰＶウイルスのＬ１遺伝子及びヒトベータグロビン遺伝子のＰＣＲ増幅に必要なオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを、下記表１に整理した。
表１ ＰＣＲのためのオリゴヌクレオチドプライマー
前記プライマーは、多様な標識物質で標識される。その標識手段は、公知されたさまざまな標識物を使用することができる。例えば、Ｃｙ−５、ＢｏｄｉｐｓｙとＣｙ−３、Ａｌｅｘａ ５３２、Ａｌｅｘａ ５４６、Ｒｏｄａｍｉｎ、ＴＡＭＲＡだけではなく、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、ＦｌｕｏｒＸ、Ａｌｅｘａ ４８８とＡｌｅｘａ ５６８、ＲＯＸ、Ｔｅａｘａｓ Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ ５９４を使用することができる。
３.２. ＨＰＶに対するＹ字型プローブのデザイン
実施例１で記述したＹ字型プローブのデザイン規則に従ってＨＰＶの遺伝子型を検査するために、次のようにＹ字型プローブをデザインした。
３.２.１. 左側及び右側プローブ部位(図１のＡ及びＥ部位)
Ｙ字型プローブの左側プローブ部位(図１のＡ部位)には、ヒトベータグロビン遺伝子のシーケンス(ＣＧＧ ＣＡＧ ＡＣＴ ＴＣＴ ＣＣＴ Ｃ)をプローブとして逆方向に配列した。右側プローブ部位(図１のＥ部位)には、ＨＰＶ Ｌ１遺伝子のシーケンスを順方向に配列した。但し、これを各ＨＰＶタイプ別に相異にデザインした。
３.２.２. 幹部位(図１のＢ部位)
左側幹部位(図１のＢ部位)には、人体テロメアシーケンスの逆方向であるＣＣＣＴＡＡを入れて、これと相補的に結合するシーケンスである人体テロメアシーケンスの順方向であるＴＴＡＧＧＧを右側幹部位(図１のＤ部位)としてデザインした。
３.２.３. リンカー部位(図１のＣ部位)
Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ａｍｉｎｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ ｄＴ(ｉＡｍＭＣ６Ｔ)を利用してリンカーをデザインした。子宮頸部を侵犯すると知られた４４個型のＨＰＶに対していずれもＹ字型プローブを設計し、以後、実施例２の方法によってこれを製作して準備した。ＨＰＶ用Ｙ字型プローブの名称と配列番号及び遺伝子型は、下記表２に整理した。
しかし、前記Ｙ字型プローブは、一つの例であるだけで、目的と用途によって多様に変形が可能である。右側プローブは、ＨＰＶの各タイプ別に独特なＬ１遺伝子のシーケンスを入れて、左側は変更することができる。例えば、左側のプローブに全ての型のＨＰＶに共通されたシーケンス(ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ)をＬ１やＬ２などから選択して配列することができる。
左側のプローブにＨＰＶ Ｌ２遺伝子各々のＨＰＶタイプに特有なシーケンスを入れて二重で検索することができる。但し、この場合、右側のプローブ部分と同一なＨＰＶタイプのシーケンスでなければならない。左側のプローブにＨＰＶ Ｅ６/Ｅ７遺伝子各々のＨＰＶタイプに特有なシーケンスを入れて二重で検索することができる。但し、この場合、右側のプローブ部分と同一なＨＰＶタイプのシーケンスでなければならない。
表２ ＨＰＶ ＤＮＡチップの製作のためのＹ字型プローブ配列
Ｙ字型ＨＰＶプローブを利用したＤＮＡマイクロアレイ(チップ)の製作
前記表２の塩基配列のとおり、実施例２の方法によって製作されたＹ字型プローブを適正試薬と混合した後、アレイヤ(ａｒｒａｙｅｒ)を利用して顕微鏡用スライドガラス上に集積(ｓｐｏｔｔｉｎｇ)してＨＰＶの遺伝子型を診断するＤＮＡマイクロアレイまたはＤＮＡチップを、下記順序及び方法で製作した。
４.１. ＨＰＶのＬ１遺伝子とヒトベータグロビン遺伝子に対するＤＮＡチップ上のプローブ集積
本発明では、チップ上でハイブリダイゼーション反応を行った後、ＨＰＶの遺伝子型によって現われる蛍光信号を見て該当ウイルスタイプを容易に把握するようにグループ化してグリッド(ｇｒｉｄ)を製作した。
プローブの順序及びグリッドの配列模式図を図４に示した。また、図４は、表２のＹ字型プローブのうちＨＰＶの各種タイプの中で一番重要な２２種のＬ１遺伝子の遺伝子型のみを検索することができるＤＮＡプローブの集積順序及び位置を示す。図５は、本発明の製品化されたＨＰＶ ＤＮＡチップとして、１個のスライド上に８個のウェル(ｗｅｌｌ)が存在して各々のウェルに一つの図４のグリッドのプローブが集積されており、ここに各々相異なる検体を乗せて８個の検体を同時に検査する。
各々のＹ字型プローブは、アレイヤを利用してスポッティング(集積)した。この時、同一なプローブを二重(ｄｕｐｌｉｃａｔｅ)で集積して各々の菌株の遺伝子型が最小２回、最大４回ずつ出るように考案した。
４.２. オリゴヌクレオチドプローブをチップ上にスポッティングする溶液の製造とマスタープレート(ｍａｓｔｅｒ ｐｌａｔｅ)への分株
実施例３によって内部Ｃ６ｄＴ部位にアミンを付けて合成したＹ字型プローブを高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を利用して精製した後、滅菌された３次蒸溜水に最終濃度が２００ｐＭになるように溶かした。このように準備したプローブをスポッティング溶液であるマイクロスポッティング溶液と４.３倍の割合で混ぜて最終濃度が３８ｐＭになるようにした。その後、この混合物を各々順に３８４ウェルマスタープレートに分株した。
４.３. プローブの集積及び固定化
Ｑアレイヤ２(Ｇｅｎｅｔｉｘｓ、ＵＫ)やそれに準ずるアレイヤ装備を利用して前記マスタープレートからプローブ含有スポッティング溶液を移して、アルデヒド基でコーティングされたスライドガラス上に一つのプローブ当たり二重(ｄｕｐｌｉｃａｔｅ、ｄｏｕｂｌｅ ｈｉｔ)で集積した。この時のスライドガラスでは、Ｌｕｍｉｎａｎｏ ａｌｄｅｈｙｄｅ ＬＳＡＬ−Ａまたはシリコンフェハ製品やあるいはこれに相応する製品であれば十分である。一つのスポットの大きさは１０μm乃至２００μm程度で集積が可能である。上述のように、スライドガラスにプローブを集積して製作したＤＮＡチップを、湿度８０％で維持されるガラスジャー(ｇｌａｓｓ ｊａｒ)内に入れて１５分間室温で反応させた後、公知の方法を使用して後処理を行った(Zammatteo, N., L. Jeanmart, S. Hamels, S. Courtois, P. Louette, L. Hevesi, and J. Remacle. 2000. Comparison between different strategies of covalent attachment of DNA to glass surfaces to build DNA microarrays. Anal. Biochem. 280:143-150.)。
４.４. マイクロアレイの洗浄及び保管
後処理過程反応が終わった後、固定化されたスライドを乾燥器(ｄｒｙ ｏｖｅｎ)に入れて１２０℃で１時間３０分間ベーキング(ｂａｋｉｎｇ)した後、スライドを０.２％のドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ：ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ)溶液で２分間２回洗浄した後、３次蒸溜水に移して２分間２回洗浄した。以後、９５℃で加熱した３次蒸溜水に３分間浸けてスライドに付いているオリゴヌクレオチドプローブを変性(ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ)させて、更に３次蒸溜水に移して１分間洗浄した。洗浄を終えたスライドは、還元溶液(ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１ｇ ＮａＢＨ４、３００ｍｌ ＰＢＳ、１００ｍｌエチルアルコール)で１５分間還元させて、０.２％ＳＤＳ溶液で２分間２回洗浄した後、３次蒸溜水に移して２分間２回洗浄し、８００ｒｐｍで１分３０秒間遠心分離器を利用してスライドの水気を除去した後、スライド箱に入れてデシケーターに入れて室温で保管した。
以上の過程を経て製作された本発明のチップは、次の実施例５に記述された方法を利用して反応を実行した。
検体の準備
次のように、各検体外の陽性標準物質からＤＮＡを分離して検査しようとするＨＰＶウイルスのＬ１遺伝子と対照遺伝子であるヒトベータグロビン遺伝子に対してＰＣＲを実行しながら蛍光染料(ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ)を標識した。
５.１. 検体からのＤＮＡ分離
対照物質と臨床検体からＤＮＡを分離した。陽性対照物質(ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ)としてＨＰＶ１６のｃＤＮＡを含む子宮頸部癌細胞株であるＣａｓｋｉをＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ(ＡＴＣＣ)から購入した。人体の子宮頸部組職、子宮頸部スワブ(ｃｅｒｖｉｃａｌ ｓｗａｂ)、子宮頸部及び膣の洗浄液などを得て、それから各々ＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ(Ｑｉａｇｅｎｅ)方法で全体ＤＮＡを分離した。
５.２. ＰＣＲ
ＨＰＶのＰＣＲ増幅用プライマーには、配列番号１乃至配列番号４の塩基配列からなった群より選択されたＨＰＶタイプ増幅用プライマーとヒトベータグロビンプリマーが含まれる。ＰＣＲ増幅反応は、次のように行った。
ＨＰＶ感染可否検出のためのＰＣＲ反応組成は、スーパーバイオ社(Ｓｕｐｅｒ Ｂｉｏ、ソウル、大韓民国)から購入したＳｕｐｅｒＴａｑ ｐｌｕｓ ｐｒｅ−ｍｉｘ(１０×ｂｕｆｆｅｒ ２.５ｕｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ ３.７５ｕｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０.５ｕｌ、Ｔａｑ重合酵素０.５ｕｌ)１５ｕｌに、表１に記載したように、Ｌ１ＦとＬ１Ｒ及びＨ１とＨ２プライマーを各々1ｕｌ(１０ｐｍｏｌｅｓ/ｕｌ)ずつ入れた。ここに、検体の鋳型ＤＮＡ４.０ｕｌ(１５０ｎｇ/ｕｌ)を追加して蒸溜水で全体反応液を総量で３０ｕｌに調整した。
ヒトベータグロビン遺伝子のＰＣＲのために、そのプライマーが入った反応液を９５℃で５分間予備変性(ｐｒｅｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ)した後、９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で３０秒として４０サイクル繰り返して、７２℃で５分間延長(ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ)して実行した。ＨＰＶのＨ１とＨ２プライマーが入った反応液は、９５℃で５分間予備変性した後、９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で３０秒として４０サイクル繰り返して、７２℃で５分間延長して実行した。
５.３. ＰＣＲ結果の確認
ＨＰＶのＬ１遺伝子はＣｙ−５で標識し、ＨＢＢ遺伝子はＣｙ−３で標識して各々ＰＣＲを実行して、その産物を０.８％アガローズゲルで電気泳動を実行して確認した。図３は、ＨＰＶ Ｌ１遺伝子とヒトベータグロビン遺伝子をＰＣＲ増幅して電気泳動した写真である。
ハイブリダイゼーション反応
次のようにマイクロアレイでハイブリダイゼーションを実行した。
６.１. ハイブリダイゼーション反応
Ｙ字型プローブを集積させたスライドチップ上に検体ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物を各々１０μlずつ混合して最終容積が５０μlになるようにし、これを９５℃で５分間変性させた後すぐに氷に３分間放置した。以後、ハイブリダイゼーション反応溶液５０μlを添加して最終容積を１００μlに調整した後、４５℃でスライドに固定されたプローブと３０分間反応させた。この時、ハイブリダイゼーション反応溶液は、２０Ｘ ＳＳＣ ２ｍｌ、９０％グリセロール １.７ｍｌ、５０ｍＭリン酸緩衝溶液６.３ｍｌを混合して最終１０ｍｌで組成した。
６.２. 洗浄(ｗａｓｈｉｎｇ)
ハイブリダイゼーション反応の終了後、ＤＮＡチップから区画カバー(ｗｅｌｌ ｃｏｖｅｒ)を除去し、チップを３Ｘ ＳＳＰＥ溶液(ＮａＣｌ(２６.２９５ｇ)、ＮａＨ２ＰＯ４−１Ｈ２Ｏ(４.１４ｇ)、Ｎａ２ＥＤＴＡ(１.１１ｇ)を１リットルの蒸溜水で溶かして１０Ｎ ＮＡＯＨでｐＨ７.４に合わせる)に浸した後室温で２分間洗浄し、更に１Ｘ ＳＳＰＥ(ＮａＣｌ(８.７６５ｇ)、ＮａＨ２ＰＯ４−１Ｈ２Ｏ(１.３８ｇ)、Ｎａ２ＥＤＴＡ(０.３７ｇ)を１リットルの蒸溜水で溶かして１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７.４に合わせる)溶液で常温で２分間洗浄した後、常温で８００ｒｐｍ で１分３０秒間遠心分離して乾燥させた。
ハイブリダイゼーション反応後の結果確認
ハイブリダイゼーション反応後洗浄を通じて非特異的な信号を最大限除去した後、乾燥されたスライドは蛍光スキャナを利用してその蛍光信号とイメージを分析した。この時のスキャナでは、二重色(ｄｕａｌ ｃｏｌｏｒ)スキャナが必要であり、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ Ｓｃａｎｎｅｒ(Ａｘｏｎ、ＵＳＡ)やＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｌｉｔｅ(Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ)、またはこれに準ずる装備であれば十分である。
ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ６.０プログラムを利用する場合、スキャニング後の結果を次のように判読する。６３５ｎｍと５３２ｎｍで各々スキャンされたイメージ上でＨＰＶチップグリッドを固定させて『Ａｌｉｇｎ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｉｎ Ａｌｌ Ｂｌｏｃｋｓ』を実行して、『Ａｎａｌｙｚｅ』を行った後、 『Ｒｅｓｕｌｔｓ』をｇｒｓファイル形態で保存アイコンを実行させて保存する。保存されたｇｒｓファイル結果をエクセルプログラムから呼び出して、ＳＢＲ(各スポット映像の画素と画素を取り囲んだ背景映像の画素値比、Ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｇｒａｙ ｌｅｖｅｌ Ｒａｔｉｏ)値を次の数式(ＨＰＶタイプ ＳＢＲ ＝ Ｆ５３２ Ｍｅｄｉａｎ÷Ｂ５３２ Ｍｅｄｉａｎ)/(ＨＢＢ ＳＢＲ ＝ Ｆ６３５ Ｍｅｄｉａｎ÷Ｂ６３５ Ｍｅｄｉａｎ)で計算して求める。この時、必ずＨＰＶ遺伝型ごとに２個以上のスポットに対するＳＢＲ値を求める。スポットにおいて対照遺伝子であるＨＢＢのＳＢＲ値が２.５以上であれば、ＨＰＶＬ１のスポットのＳＢＲをＨＢＢのＳＢＲで分けた値が１以上である場合に限って真性陽性(ｔｒｕｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ)で認めて判読する。但し、このようなカットオフレベル(ｃｕｔ ｏｆｆ ｌｅｖｅｌ)と判読基準は、マイクロアレイの種類によって変わることができ、この基準が全てのマイクロアレイにそのまま適用されるものではない。
図５には、実施例の中の一つで、ＨＰＶタイプ１６に感染された子宮頸部検体から得たスキャンイメージを示した。図５は、図４のグリッドを利用して製作した２２種のＨＰＶに対して本発明のＹ字型プローブをスポッティングして製作したチップ上に、ＨＰＶ１６のＬ１遺伝子をＣｙ−５で標識し、ヒトベータグロビン(ＨＢＢ)遺伝子をＣｙ−３で標識しながら、ＰＣＲして得た産物を乗せてハイブリダイゼーション過程を経て得られたシグナルを蛍光スキャナで検索するため得たイメージである。すなわち、同一なチップをスキャニングした図として、左側はＣｙ−５を検出することができる６３５ｎｍ波長でスキャニングした結果であり、右側はＣｙ−３を検出することができる５３２ｎｍでスキャニングした結果である。図５において、一番上部ウェルの左側を１番とし、その右側にあるウェルを２番として番号を設定した。ウェル１と２は、ＨＰＶ１６ Ｌ１−Ｃｙ−５とＨＢＢ−Ｃｙ−５が標識された検体であり、ウェル３と４は、ＨＢＢ−Ｃｙ−５が標識された検体であり、ウェル５と６は、ＨＰＶ１６ Ｌ１−Ｃｙ−５とＨＢＢの順方向プライマーにＣｙ−３が標識された検体であり、ウェル７と８は、ＨＰＶ１６ Ｌ１−Ｃｙ−５とＨＢＢの逆方向プライマーにＣｙ−３が標識された検体である。
図５から分かるように、Ｙ字型プローブの部位Ａに含まれたＨＢＢ遺伝子がアンチセンス(ａｎｔｉｓｅｎｓｅ)に入っているので、それと結合するプライマーは、正方向プライマーにＣｙ−３が入ったＰＣＲ産物が結合し、部位Ｅに該当するＨＰＶ Ｌ１遺伝子は、センス(ｓｅｎｓｅ)方向にシーケンスが入っているかので、それと結合するプライマーは、逆方向プライマーにＣｙ−５が標識されたＰＣＲ産物が結合できることが証明された。
すなわち、ウェル１と２では、ＨＰＶ１６とＨＢＢがいずれもＣｙ−５で標識されたＰＣＲ産物は、Ｃｙ−５のみを検出することができる６３５ｎｍ波長でスキャニングした場合にのみ各グリッド位置に該当するスポットから検出され、Ｃｙ−３のみを検出することができる５３２ｎｍでは検出されないことを確認した。
ウェル３と４では、ＨＢＢのみＣｙ−５で標識されたＰＣＲ産物は、Ｃｙ−５のみを検出することができる６３５ｎｍ波長でスキャニングした場合にだけ各グリッド位置に該当するスポットで検出され、Ｃｙ−３のみを検出することができる５３２ｎｍでは検出されないことを確認した。
ウェル５と６では、ＨＰＶ１６は、ＣＹ−５で標識され、ＨＢＢの順方向プライマーにＣｙ−３で標識れたＰＣＲ産物は、Ｃｙ−５のみを検出することができる６３５ｎｍ波長でスキャニングした場合には、 ＨＰＶ１６とＹＰ１６ＡＳスポットでだけ検出され、Ｃｙ−３のみを検出することができる５３２ｎｍでは、ＹＰ１６ＡＳスポットでだけ検出されることを確認した。
ウェル７と８では、ＨＰＶ１６は、Ｃｙ−５で標識されて、ＨＢＢの逆方向プライマーにＣｙ−３で標識れたＰＣＲ産物は、Ｃｙ−５のみを検出することができる６３５ｎｍ波長でスキャニングした場合には、ＨＰＶ１６、ＹＰ１６ＳとＹＰ１６ＡＳスポットの全てから検出されたが、Ｃｙ−３のみを検出することができる５３２ｎｍではＨＢＢスポットでだけ検出されることを確認した。
各ウェルのうちＨＰＶ１６は、Ｃｙ−５で標識されて、ＨＢＢの順方向プライマーにＣｙ−３で標識されたＰＣＲ産物は、ＣＹ−５のみを検出することができる６３５ｎｍ波長でスキャニングした場合には、ＨＰＶ１６とＹＰ１６ＡＳスポットでだけ検出され、Ｃｙ−３のみを検出することができる５３２ｎｍでは、ＹＰ１６ＡＳスポットでだけ検出されることを確認した。
図６は、５３２ｎｍでスキャニングしたイメージとして、ＨＢＢ順方向−Ｃｙ−３ＰＣＲ産物を利用してハイブリダイゼーションしたチップで一つのウェルをスキャニングしたイメージである。
ＨＰＶに対するＤＮＡマイクロアレイの臨床診断への適用
本実施例は、本発明のＹ字型プローブを利用したＨＰＶ ＤＮＡマイクロアレイを子宮頸部検体の診断に適用した実例である。その一番目の目的は、ＨＰＶ ＤＮＡチップがＨＰＶ感染の有無診断と遺伝子型把握にどの程度正確であるかを把握することであり、その二番目の目的は、癌と前癌病変などの重要子宮頸部病変を予測するにどの程度役に立つかを把握することである。このために、子宮頸部のＨＰＶ感染及び病変が疑心されて細胞病理学的診断が出た韓国女性の子宮頸部スワプ(ｃｅｒｖｉｃａｌ ｓｗａｂ)検体を対象として、検体からＤＮＡを分離し、(１) 本発明のＨＰＶ ＤＮＡマイクロアレイ検査と (２) ＨＰＶのＬ１遺伝子のＰＣＲ後その産物の塩基配列分析(ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ)及び、(３) アメリカＦＤＡ公認ＨＰＶ ＤＮＡ検査であるＨｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ Ａｓｓａｙ−ＩＩ(ＨＣＡ−ＩＩ、Ｄｉｇｅｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ)の ３種の検査を行って比較分析した。
本発明のＨＰＶに対するＤＮＡチップは、人体の子宮頸部や肛門、口腔などを侵犯する４３個種類のＨＰＶを全部発見する検査として、ＨＣＡ−ＩＩは１２種の高危険型ＨＰＶを把握する検査である。比較分析は、 (１) ＨＰＶ感染有無の診断敏感度と特異度、(２) ＨＰＶ遺伝子型の診断正確度及び、(３) 子宮頸部の癌と前癌病変など重症病変の予測正確度の三つの側面に焦点を合わせて実行した。ＨＰＶ ＤＮＡマイクロアレイの分析方法は、前の実施例５から７までの方法を使用し、ＰＣＲ及び塩基配列分析は、公知の方法を使用した(Ｋｉｍ ＫＨ、Ｙｏｏｎ ＭＳ、Ｎａ ＹＪ、Ｐａｒｋ ＣＳ、Ｏｈ ＭＲ、Ｍｏｏｎ ＷＣ. Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ＤＮＡ ｃｈｉｐ. Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ. ２００６; １００(１):３８−４３)。ＨＣＡ−ＩＩ検査は市販社のマニュアルによって施行した。
本比較研究の対象の２０１名の年齢は、１８歳から８１歳、平均年齢５２.４歳であった。標準検査であるＨＰＶ Ｌ１遺伝子のＰＣＲ後の塩基配列分析結果を表３に整理した。２０１例の中で１９１例においてＨＰＶ感染が確認された。そのうち１４９例は、高危険群のＨＰＶを示し、７２例は、一種類以上のＨＰＶによる混合感染を示した。
本発明のＨＰＶ ＤＮＡマイクロアレイの分析結果をＨＣＡ−ＩＩ分析結果と比較した(表４と表５)。本発明のＨＰＶ ＤＮＡマイクロアレイ分析で、ＨＰＶ感染陽性例である１９１例は全部(１００％)正確に診断された。そのうち１７４例(９１.１％)では、ＨＰＶの遺伝子型分析(ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ)が正確に行われた。高危険群の１４９例は、全て正確に把握したが、本発明のチップに含まれなかった珍しい型のＨＰＶは把握することができなかった。これに対して、ＨＣＡ−ＩＩは、１９１例のＨＰＶ陽性検体の中で４０例からＨＰＶを見つけることができなかったし、１４９個の高危険ＨＰＶ感染検体の中で１２例(８.１％)を検出することができなかった。本発明のＨＰＶ ＤＮＡチップは、癌と前癌病変である高度の上皮内腫瘍(ＣＩＮ：ｃｅｒｖｉｃａｌ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｍ)及び高等級扁平上皮内病変(ＨＳＩＬ)を含んで高危険型子宮頸部病変を全て正確に予測することができた。これに対して、ＨＣＡ−ＩＩ検査は、子宮頸部癌の８例の中で１例を検出しなかったし、ＨＳＩＬの１２例の中で１例を検出することができなかった。また、本発明のＨＰＶチップがＨＣＡ−ＩＩより低等級ＳＩＬ検出においても一層優秀であることが分かった(９２.２％：５６.９％、ｐ<０.０５、表６)。
以上の結果は、本発明のＨＰＶ ＤＮＡチップがＨＰＶ感染の有無診断と遺伝子型の把握、特に高危険群ＨＰＶ把握において１００％近くの敏感度を有する検査であり、子宮頸部癌と前癌病変の予測においても卓越な検査であることを立証する結果である。また、既存のＨＣＡ−ＩＩ検査より一層優れることが分かる。
表３ ＨＰＶの遺伝子型の分析結果
表４ ＨＰＶ遺伝子型分析チップとＨＣＡ−ＩＩの比較
表５ ＨＣＡ−ＩＩ方法で検出に失敗した場合の分析
表６ 子宮頸部癌と前癌病変においてＨＰＶ遺伝子型分析チップとＨＣＡ−ＩＩ方法を使用して比較分析した結果
性感染診断ＤＮＡマイクロアレイの開発
本発明は、Ｙ字型プローブを集積したＤＮＡマイクロアレイを利用して性伝播疾患(ＳＴＤ：ｓｅｘｕａｌｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅｓ)又は性伝播感染(ＳＴＩ：ｓｅｘｕａｌｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ)の遺伝子型を把握して診断する新しい方法に関する。本実施例は、Ｙ字型プローブのまた他の利用方法を示し、Ｙ字型プローブを利用したＤＮＡマイクロアレイが重要疾患の診断に有用であることを立証するまた一つの実例である。
人類において一番重要な疾患の中で一つが性伝播感染である。まず、発病率が高くて人類の生の質と社会経済にかける影響が非常に大きい。人体発病率が一番高い１０大感染のうち５個が性感染である。世界的に、その有病率が増加している実情であり、これによる社会経済的損失が大きい。代表的な性感染疾患では、クラミジアトラコマチス感染(ＣＴ：Ｃｈｌａｍｙｄｉａ Ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ)と淋菌(ＮＧ：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ)による感染、すなわち淋疾、ヘルペスシンプレックスウイルス(ＨＳＶ：ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ)、特に、ＨＳＶ ｔｙｐｅ２(ＨＳＶ−２)による陰部又は外性器ヘルペス(ｇｅｎｉｔａｌ ｈｅｒｐｅｓ)、ヒト乳頭腫ウイルス(ＨＰＶ)感染、トレポネマパリダム(ＴＰ：Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ Ｐａｌｌｉｄｕｍ)による梅毒、ヘモフィルスデュクレイ(Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｄｕｃｒｅｙｉ)による軟性下疳(ｃｈｎａｃｒｏｉｄ)、トリコモナス(Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ)感染、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)による後天性兔疫欠乏症(ＡＩＤＳ)などがある。この中でクラミジア感染と淋菌感染は、男女とも尿道炎、男性の場合は副睾丸炎及び不妊、女性の場合は子宮頸部染、骨盤炎症性疾患ｐｅｌｖｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ)及び不妊を誘発する。また、梅毒と軟性下疳、陰部ヘルペスの場合は陰部及び外性器に潰瘍(ｇｅｎｉｔａｌ ｕｌｃｅｒ)で現われる(Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、ＵＳＡ. Ｓｅｘｕａｌｌｙ Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ. Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ、２００６. Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐｏｒｔ. Ａｕｇｕｓｔ ４、２００６ / Ｖｏｌ. ５５ / Ｎｏ. ＲＲ１１)。
アメリカ疾病管理本部の２００９年報告によると、一番有病率が高い感染はクラミジア感染として、アメリカ国民１０万名当たり３６０名がこれに感染されており、過去２０年の間３倍以上急増したことで報告された。淋疾は、１０万名当たり１５０名が感染されたことで報告されている。ＣＴ感染と淋菌感染は２００８年にのみ約１５０万名の新規患者が報告された。特に、１５歳から２４歳の間の青少年や若い女性層で最も発病率が高くて、急速に拡散する傾向にあって、社会問題化されている。梅毒は、発病率が激減してから最近更に増加する傾向であり、２００８年にのみ１３,５００の患者が新たに報告された。陰部ヘルペスは、報告例が１９６８年の年２万例から２００８年には４０万例に急増する傾向を示している。ヒト乳頭腫ウイルス感染は、単一要因で見る時、一番有病率が高い性感染として、アメリカの１４から５９歳の間の女性の２６.８％においてＨＰＶ感染が発見される(Ｕ.Ｓ. Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ. Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ＨＩＶ/ＡＩＤＳ、Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ、ＳＴＤ、ａｎｄ ＴＢ. ＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎＤｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＳＴＤ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ. Ｓｅｘｕａｌｌｙ Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ２００８. Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＳＴＤ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００９; Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、ＵＳＡ. Ｓｅｘｕａｌｌｙ Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ. Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ、２００６. Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐｏｒｔ. Ａｕｇｕｓｔ ４、２００６ / Ｖｏｌ. ５５ / Ｎｏ. ＲＲ−１１)。
これら性感染の診療は、大部分の原因菌株が既存の染色や培養、免疫学的検査では診断が難しくて、多くの時間とコストが必要である。また、性感染が複合感染の形態で発生する場合が多くて、これを同時に検査して治療することが必須であるが、現在、このような検査が存在しない。最近には、遺伝子検査が性感染診断の新しい標準的検査として注目されている。例えば、クラミジア感染と淋菌感染を診断するためにＰＣＲ方式のＣＯＢＡＳ Ａｍｐｌｉｃｏｒ ｔｅｓｔ(Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ)とＧｅｎＰｒｏｂｅ ＡＰＴＩＭＡ ａｓｓａｙ(Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ)、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ(Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ)、ｈｙｂｒｉｄ ｃａｐｔｕｒｅ ａｓｓａｙ(Ｄｉｇｅｎｅ)及び、ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ方式のＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ(Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ)などが商業化されて使われている。また、各実験室別に自家(ｉｎ ｈｏｕｓｅ)製造の形態で多様なＰＣＲ検査法やＰＣＲ後マイクロプレートでハイブリダイゼーションで把握する方法などが使われている。しかし、全ての重要性感染原因菌を同時に正確で且つ迅速であり、経済的に把握することができる遺伝子検査法、特に、ＤＮＡマイクロアレイ製品は、まだ商用化されていない。本発明のＤＮＡマイクロアレイは、細菌の遺伝子変異による薬剤耐性を把握することに利用することもできる。薬物耐性は、性感染の治療時に深刻な問題になっているので、薬物の選択前に薬物耐性を把握することが重要である(Ｃｏｏｋ ＲＬ、Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ ＳＬ、φｓｔｅｒｇａａｒｄ L、Ｂｒａｉｔｈｗａｉｔｅ ＲＳ、Ｎｅｓｓ ＲＢ. Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ: ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ａｎｄ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ. Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ. ２００５; １４２(１１):９１４−２５; Ｍａｓｅｋ ＢＪ、Ａｒｏｒａ Ｎ、Ｑｕｉｎｎ N、Ａｕｍａｋｈａｎ Ｂ、Ｈｏｌｄｅｎ Ｊ、Ｈａｒｄｉｃｋ Ａ、Ａｇｒｅｄａ Ｐ、Ｂａｒｎｅｓ Ｍ、Ｇａｙｄｏｓ ＣＡ. Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ａｎｄ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ｓｅｌｆ−ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｖａｇｉｎａｌ ｓｗａｂｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｖｉａ ａｎ Ｉｎｔｅｒｎｅｔ−ｂａｓｅｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ. ２００９; ４７(６):１６６３−７; Ｇｄｏｕｒａ Ｒ、Ｋｃｈａｏｕ Ｗ、Ａｍｍａｒ−Ｋｅｓｋｅｓ Ｌ、Ｃｈａｋｒｏｕｎ Ｎ、Ｓｅｌｌｅｍｉ Ａ、Ｚｎａｚｅｎ Ａ、Ｒｅｂａｉ Ｔ、Ｈａｍｍａｍｉ Ａ. Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ、ａｎｄ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ ｉｎ ｓｅｍｅｎ ａｎｄ ｆｉｒｓｔ ｖｏｉｄ ｕｒｉｎｅ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｏｆ ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｍａｌｅ ｐａｒｔｎｅｒｓ ｏｆ ｉｎｆｅｒｔｉｌｅ ｃｏｕｐｌｅｓ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ. ２００８; ２９(２):１９８−２０６; ＭｃＫｅｃｈｎｉｅ ＭＬ、Ｈｉｌｌｍａｎ Ｒ、Ｃｏｕｌｄｗｅｌｌ Ｄ、Ｋｏｎｇ Ｆ、Ｆｒｅｅｄｍａｎ Ｅ、Ｗａｎｇ Ｈ、Ｇｉｌｂｅｒｔ ＧＬ. Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ １４ ｇｅｎｉｔａｌ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｕｒｉｎｅ ｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｌｉｎｅ ｂｌｏｔ ａｓｓａｙ. Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ２００９; ４７(６):１８７１−７; Ｍｉｃｈｅｌｌｅ Ａ. Ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ. Ｃａｎ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Med Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ２００; １６(１): ３１−３４)。
本発明は、全ての重要性感染原因菌を同時に正確で且つ迅速であり、最小費用で検査することができるＤＮＡマイクロアレイを開発することにその目的がある。
本発明のＤＮＡマイクロアレイは、各標的細菌別に検索に一番適合な標的遺伝子を選択した後、各遺伝子に対して各々相異である２個の部位でオリゴヌクレオチドプローブを準備し、この両方を一度に利用する完全に新規な形態のＹ字型プローブを集積した製品である。これは、一つの遺伝子に対して２個のプローブを有して２重検索することで、診断敏感度を極大化させることを目的として考案された。既存に性感染診断ＤＮＡチップが少数報告されたことがあるが、このような方式のＤＮＡマイクロアレイ製品は報告されたことがない(Ｓｈｉ Ｇ、Ｗｅｎ ＳＹ、Ｃｈｅｎ ＳＨ、Ｗａｎｇ ＳＱ. Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ａｎｄ Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ. Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ. ２００５; ６２(２):２４５−５６)。
本発明の性感染ＤＮＡマイクロアレイは、代表的な性感染疾患であるクラミジアトラコマチス感染と淋菌感染、ヘルペスシンプレックスウイルスタイプ２(ＨＳＶ−２)感染、トレポネマパリダムによる梅毒感染、ヘモフィルスデュクレイによる軟性下疳をいずれも診断することができる。本発明には、ＳＴＤ検査用Ｙ字型プローブ及び対照標準物質遺伝子のプローブが集積されたマイクロアレイだけではなく、ＰＣＲ試薬、ハイブリダイゼーション反応試薬、製品採取キット、スキャナでの判読に必要な指針まで全て含まれる。本発明の詳細内容は次のようである。
９.１. ＳＴＤの遺伝子型分析(ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ)のためのＹ字型プローブのデザイン
本発明のＤＮＡマイクロアレイは、性伝播性疾患誘発の原因菌株のうち一番重要な５大原因菌である淋菌、クラミジアトラコマチス、トレポネマパリダム、ヘモフィルスデュクレイ、ヘルペスシンプレックスウイルスの遺伝子型を検査して診断することを目的で製作された。このために、特殊なＹ字型プローブを次のようにデザインした。
１) 左側プローブ(図１のＡ部位)と右側プローブ(図１のＥ部位)
各原因菌別に診断に一番役に立つ特定の標的遺伝子を選択し、これをＰＣＲで増幅して、そのＰＣＲ産物内で相異なる２個の部位からオリゴヌクレオチドプローブを選択して左側及び右側プローブに入るように考案した。ここで、左側及び右側プローブは希望によって変わることができる。
例えば、淋菌の場合、右側プローブの塩基配列は、Ｇ ＡＴ ＡＴＴ ＴＴＴ ＣＣＧ ＴＡＡ ＣＧＴ ＣＴＣ ＴＡＡ ＧＴＣ Ｔであり、左側プローブの塩基配列は、ＣＡＡ ＣＡＡ ＡＣＧ ＡＡＡ ＧＣＡ ＧＡＣ ＴＴＡ ＧＡＧ ＡＣＣ である。
クラミジアトラコマチスの場合、右側プローブの塩基配列は、ＴＴＴ ＴＣＴ ＴＣＧ ＴＣＡ ＧＴＴ ＡＡＡ ＣＣＴ ＴＣＣ Ｃであり、左側プローブの塩基配列は、ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＧＴ ＡＧＡ ＧＣＣ ＡＴＧ ＴＣＣ ＴＡＴ ＣＣである。
ヘルペスシンプレックスウイルス２型の場合、右側プローブの塩基配列は、ＡＣＣ ＣＣＡ ＣＣＡ ＧＣＣ ＣＧＧ ＡＣであり、左側プローブの塩基配列は、ＧＣＣ ＣＣＣ ＧＧＧ ＧＴＣ ＧＧＡ ＡＧＣである。
トレポネマパリダムの場合、右側プロブの塩基配列は、ＡＣＧ ＴＧＣ ＡＧＡ ＡＡＡ ＡＣＴ ＡＴＣ ＣＴＣ ＡＧＴ Ｇであり、左側プローブの塩基配列は、ＡＣＧ ＴＡＡ ＧＧＴ ＡＡＧ ＣＡＧ ＣＡＴ ＧＧＡ ＧＡＣである。
ヘモフィルスデュクレイの場合、右側プロブの塩基配列は、ＧＴＧ ＡＧＴ ＡＡＴ ＧＣＴ ＴＧＧ ＧＡＡ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＴであり、左側プロブの塩基配列は、ＧＡＡ ＧＡＴ ＡＴＴ ＡＣＧ ＣＧＧ ＴＡＴ ＴＡＧ ＣＴＡ ＣＡＣである。
２) 幹部位(図１の部位ＢとＤ)
左側幹部位(図１のＢ部位)には、人体テロメアシーケンスの逆方向であるＣＣＣＴＡＡを入れて、これと相補的に結合するシーケンスである人体テロメアシーケンスの順方向であるＴＴＡＧＧＧを右側幹部位(図１のＤ部位)に入れてデザインした。
３) リンカー部位(図１のＣ 部位)
Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ａｍｉｎｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ ｄＴ(ｉＡｍＭＣ６Ｔ)を入れてリンカーをデザインした。トータルで５種類の型の性感染菌の遺伝子型のＹ字型プローブを設計して、このプローブを前の実施例に記述した方法のどおりスライドガラスに集積してＳＴＤ遺伝子型分析ＤＮＡチップを製作した。一つのチップで８個までの検体を分析することができるように製作した。これらプローブの名称と配列番号及び遺伝子型を、下記表７に整理した。
各菌株別に標準物質を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ(ＡＴＣＣ)社から菌株又はプラスミドクローンを購入した後、標的遺伝子を公知の方法どおりクローニングして準備した(表８)。このように準備した検査標的遺伝子のプラスミドクローンを多様な数のコピー(ｃｏｐｙ)で混合して、本発明のＤＮＡマイクロアレイ上に乗せて、ハイブリダイゼーション反応を行ってＹ字型プローブの適正可否を確認した。
表７ ＳＴＤ ＤＮＡチップの製作のためのＹ字型プローブの配列
表８ 陽性対照群の 菌株乃至プラスミドクローン
９.２. 検体の準備とＰＣＲ
公知の方法によって男女の小便を得て、これと共に女性の場合、子宮頸部及び膣からスワブスミア(ｓｗａｂ ｓｍｅａｒ)で検体を得た。また、外性器皮膚、特に、潰よう部位から検体を得てｔｏｔａｌ ＤＮＡを分離した(Ｍａｓｅｋ ＢＪ、Ａｒｏｒａ Ｎ、Ｑｕｉｎｎ Ｎ、Ａｕｍａｋｈａｎ Ｂ、Ｈｏｌｄｅｎ Ｊ、Ｈａｒｄｉｃｋ Ａ、Ａｇｒｅｄａ Ｐ、Ｂａｒｎｅｓ Ｍ、Ｇａｙｄｏｓ ＣＡ. Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ａｎｄ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ｓｅｌｆ−ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｖａｇｉｎａｌ ｓｗａｂｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｖｉａ ａｎ Ｉｎｔｅｒｎｅｔ−ｂａｓｅｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ. ２００９; ４７(６):１６６３−７; Ｇｄｏｕｒａ Ｒ、Ｋｃｈａｏｕ Ｗ、Ａｍｍａｒ−Ｋｅｓｋｅｓ Ｌ、Ｃｈａｋｒｏｕｎ Ｎ、Ｓｅｌｌｅｍｉ Ａ、Ｚｎａｚｅｎ Ａ、Ｒｅｂａｉ Ｔ、Ｈａｍｍａｍｉ Ａ. Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ、ａｎｄ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ ｉｎ ｓｅｍｅｎ ａｎｄ ｆｉｒｓｔ ｖｏｉｄ ｕｒｉｎｅ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｏｆ ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｍａｌｅ ｐａｒｔｎｅｒｓ ｏｆ ｉｎｆｅｒｔｉｌｅ ｃｏｕｐｌｅｓ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ. ２００８; ２９(２):１９８２０６; ＭｃＫｅｃｈｎｉｅ ＭＬ、Ｈｉｌｌｍａｎ Ｒ、Ｃｏｕｌｄｗｅｌｌ Ｄ、Ｋｏｎｇ Ｆ、Ｆｒｅｅｄｍａｎ Ｅ、Ｗａｎｇ Ｈ、Ｇｉｌｂｅｒｔ ＧＬ. Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ １４ ｇｅｎｉｔａｌ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ in ｕｒｉｎｅ ｂｙ ｕｓｅ ｏｆ a ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｌｉｎｅ ｂｌｏｔ ａｓｓａｙ. Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ２００９; ４７(６):１８７１−７)。
以後、公知の方法によって次のようにＰＣＲを実行した。この時、ＰＣＲ産物は、Ｃｙ５またはＣｙ３で標識した。ＰＣＲは、個別でも実行し、同時にマルチプレックス(ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ)でも実行した。その条件は次のようである。
マルチプレックスＰＣＲでの反応液の組成と反応条件は、表９に整理した。このマルチプレックスＰＣＲを行った後、その産物は、１.５-２.０％のアガローズゲルで電気泳動して確認する。図７のＰＣＲ産物の電気泳動イメージは、まず上からヘモフィルスデュクレイ(ＨＤ)のＰＣＲ産物が４４０ｂｐ、ヘルペスシンプレックスウイルス(ＨＳＶ)１型のＰＣＲ産物が３８４ｂｐ、ヘルペスシンプレックスウイルス(ＨＳＶ)２型のＰＣＲ産物が４００ｂｐ、クラミジアトラコマチス(ＣＴ)のＰＣＲ産物が３２１ｂｐ、淋菌(ＮＧ)のＰＣＲ産物が２８４ｂｐ、梅毒(ＴＰ)のＰＣＲ産物が２６０ｂｐで各々示された。したがって、本方法によれば、５個原因菌遺伝子のＤＮＡが多様に混合された全ての場合に一度のマルチプレックスＰＣＲで検索が可能であることが分かる。
表９ マルチプレックスＰＣＲの条件
９.３. ハイブリダイゼーション反応及び分析方法
オリゴヌクレオチドプローブをスポッティングさせたスライドチップ上に、検体のＤＮＡを鋳型として淋菌とクラミジアトラコマチスの潜在プラスミド(ｃｒｙｐｔｉｃ ｐｌａｓｍｉｄ)とヘモフィルスデュクレイ、ヘルペスウイルス、クラミジアトラコマチス、梅毒の遺伝子のＰＣＲ増幅産物を、各々１０μlずつ混合して、最終容積が５０μlになるようにし、これを９５℃で５分間変性させた後、直ちに氷に３分間放置した。以後、ハイブリダイゼーション反応溶液５０μlを添加して最終容積を１００ μlに調整した後、４５℃でスライドに固定されたプローブと３０分間反応させる。この時、ハイブリダイゼーション反応溶液は、２０Ｘ ＳＳＣ ２ｍｌと９０％グリセロール１.７ｍｌ、５０ｍＭのリン酸緩衝溶液６.３ ｍｌを混合して最終１０ ｍｌで作って組成した。
ハイブリダイゼーション反応の終了後、ＤＮＡチップから区画カバー(ｗｅｌｌ ｃｏｖｅｒ)を除去し、チップを３Ｘ ＳＳＰＥ 溶液(ＮａＣｌ(２６.２９５ｇ)、ＮａＨ２ＰＯ４−１Ｈ２Ｏ(４.１４ｇ)、Ｎａ２ＥＤＴＡ(１.１１ｇ)を蒸溜水１リットルに溶かして１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７.４に合わせる)に浸した後、室温で２分間洗浄し、更に１Ｘ ＳＳＰＥ(ＮａＣｌ(８.７６５ｇ)、ＮａＨ２ＰＯ４−１Ｈ２Ｏ(１.３８ｇ)、Ｎａ２ＥＤＴＡ(０.３７ｇ)を蒸溜水１リットルに溶かして１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７.４に合わせる)溶液で、常温で２分間洗浄した後、常温で８００ｒｐｍで１分３０秒間遠心分離して乾燥させた。
９.４. スキャニング分析(ｓｃａｎｎｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ)
ハイブリダイゼーション反応後、洗浄を通じて非特異的な信号(ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｇｎａｌ)は除去して、乾燥されたスライドは蛍光スキャナ(ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｃａｎｎｅｒ)を利用してその蛍光信号とイメージを分析する。この時のスキャナでは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ Ｓｃａｎｎｅｒ(Ａｘｏｎ、ＵＳＡ)や ＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｌｉｔｅ(Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ)、またはこれに準ずる装備であれば十分である。
用意された検査標的遺伝子のプラスミドクローンを多様な数のコピー(ｃｏｐｙ)で混合してＰＣＲを行った後、ＤＮＡマイクロアレイ上に乗せてハイブリダイゼーション反応を行って、本ＤＮＡマイクロアレイの敏感度を確認した。本スパイク実験の結果、検体１ｍｌ当たり１０個乃至１００個以上のコピーの相異なる細菌遺伝子のプラスミドクローンが含まれていれば、いつも識別が可能であることを確認した。
２００８年１月から２００９年１０月の間に性感染が疑心されて依頼された大韓民国の大人男性１２５２名と女性６８０名に対して、各々本発明のＤＮＡマイクロアレイを用いて分析した。そのうち１０８４例ではＰＣＲ後シークエンシング方法と比較することが可能であった。比較結果、１０７５例(９９％)において両方の結果が一致して、本発明のＳＴＤ ＤＮＡマイクロアレイの優秀性を確認することができた。図８から図１２までは、本発明のＳＴＤチップをハイブリダイゼーションした後スキャナで分析した結果のイメージを例として提示した。
図８は、Ｙ字型プローブを利用したＳＴＤチップ上で淋菌を陽性物質でハイブリダイゼーションした後スキャニングした結果である。図９は、Ｙ字型プローブを利用したＳＴＤチップ上でクラミジアトラコマチスを陽性物質でハイブリダイゼーションした後スキャニングした結果である。図１０は、Ｙ字型プローブを利用したＳＴＤチップ上でトレポネマパリダムを陽性物質でハイブリダイゼーションした後スキャニングした結果である。図１１は、Ｙ字型プローブを利用したＳＴＤチップ上でヘモフィルスデュクレイを陽性物質でハイブリダイゼーションした後スキャニングした結果である。図１２は、Ｙ字型プローブを利用したＳＴＤチップ上でヘルペスシンプレックスウイルスを陽性物質でハイブリダイゼーションした後スキャニングした結果である。
検体を受けて本発明の前記方法を利用した結果までは約３−４時間が必要であった。２−３名の研究者が約１２０個のチップで一日に約１０００個の検体を検査することができた。
インフルエンザウイルスの遺伝子診断
本発明は、Ｙ字型プローブを集積したＤＮＡマイクロアレイを利用してインフルエンザ感染を診断し、その原因になるインフルエンザウイルスの型(ｔｙｐｅ)と亜種(ｓｕｂｔｙｐｅ)乃至菌株(ｓｔｒａｉｎ)を正確に遺伝子型分析(ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ)する新しい方法に関する。本実施例は、本発明のＹ字型プローブが重要疾患の診断に有用であることを示すまた一つの実例である。
人類において、一番歴史が古くて発病率が高くて、致死率も高い疾患がインフルエンザ(ｉｎｆｌｕｅｎｚａ)あるいはフルー(ｆｌｕ)である。インフルエンザウイルスは、多様な宿主を侵犯し、ゲノムがＲＮＡになっているので続いて変異(ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｓｈｉｆｔ)を起こして、多くの種のウイルスの遺伝子が再区分(ｒｅ−ａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ)されて新しい変種が反復して現われる現象を示す。そのため、治療とワクチン開発が難しい(Ｒａｖｉ Ｖ. Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ Ｈ１Ｎ１ ａｓ ａ ｐａｎｄｅｍｉｃ ａｇｅｎｔ. Ｉｎｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ. ２００９; ２７(３): １７９−１８１)。インフルエンザは、単純風邪とはその原因菌が異なって、呼吸器の深部を一層深く侵犯して症状が一層ひどくて肺炎に発展することがあり、その余病により死亡に至ることもある。集団感染(ｅｐｉｄｅｍｉｃ)で毎年秋から冬の間に集中発病する(Ｂｅｅｒｓ ＭＨ、Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ＡＪ、Ｊｏｎｅｓ ＴＶ、Ｐｏｒｔｅｒ Ｒ. Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ. Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ. Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ. ２００３: １１５９−１１６０)。アメリカ疾病管理本部(ＣＤＣ)の統計によると、毎年２０万名以上がインフルエンザに感染され、そのうち、３６,０００名がこれにより死亡する(http://www.cdcc.gov/flu/abput/disease.htm)。
インフルエンザウイルスは、Ａ、Ｂ、Ｃの３種の型があり、そのうちＡとＢがフルーを起こす。特に、Ａ型が人体でフルーの主要原因菌である。インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニン(ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、ＨＡ、Ｈ)とノイラミニダーゼ(Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ、ＮＡ、Ｎ)の２種のウイルスタンパク質及び遺伝子の類型によって再分類される。ヘマグルチニンには、ヘマグルチニン１型(Ｈ１)からヘマグルチニン１６型(Ｈ１６)までの１６種の類型があり、ノイラミニダーゼは、ノイラミニダーゼ１型(Ｎ１)からノイラミニダーゼ９型(Ｎ９)まで９種の類型がある。これによって、インフルエンザウイルスは、Ｈ１−１６Ｎ１−９でその亜型が表記される。Ａ型インフルエンザウイルスでは、主にＨ１、Ｈ２、Ｈ３とＮ１、Ｎ２が発見される。すなわち、インフルエンザウイルスＡ型にはＨ１−３Ｎ１−２の６種の主亜型があり、ここに集団発病場所によってスペイン風邪、香港風邪などの名前を付け加えるか、発病宿主によってトリインフルエンザなどの名称を付け加える。今まで３種の亜型、すなわち、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２が人類に深刻な集団感染を起こした事がある。Ｈ１Ｎ１は、スペイン風邪と言う名前で、１９１８年頃大流行して全世界で２０００乃至５０００万名が死亡した。以後、１９５７年には、Ｈ２Ｎ２型が、そして、その後では、主にＨ３Ｎ２が問題を起こした。１９９８年には、いわゆるトリインフルエンザである変形Ｈ３Ｎ２感染が大流行した事がある。最近には、Ｈ１Ｎ１が問題になっている。特に、人体型と鳥型、豚型が混合されて変形で現われて、豚から発病して人体へ拡散される変種又は新種フルーでＨ１Ｎ１(ｓｗｉｎｅ ｆｌｕ Ａ/Ｈ１Ｎ１)が現われて全世界的に深刻な問題を起こしている(Ｇａｒｔｅｎ ＲＪ、Ｄａｖｉｓ ＣＴ、Ｒｕｓｓｅｌｌ ＣＡ、Ｓｈｕ Ｂ、Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ Ｓ、Ｂａｌｉｓｈ Ａ、Ｓｅｓｓｉｏｎｓ ＷＭ、Ｘｕ Ｘ、Ｓｋｅｐｎｅｒ Ｅ、Ｄｅｙｄｅ Ｖ、Ｏｋｏｍｏ−Ａｄｈｉａｍｂｏ Ｍ、Ｇｕｂａｒｅｖａ Ｌ、Ｂａｒｎｅｓ Ｊ、Ｓｍｉｔｈ ＣＢ、Ｅｍｅｒｙ ＳＬ、Ｈｉｌｌｍａｎ ＭＪ、Ｒｉｖａｉｌｌｅｒ Ｐ、Ｓｍａｇａｌａ Ｊ、ｄｅ Ｇｒａａｆ Ｍ、Ｂｕｒｋｅ ＤＦ、Ｆｏｕｃｈｉｅｒ ＲＡ、Ｐａｐｐａｓ Ｃ、Ａｌｐｕｃｈｅ−Ａｒａｎｄａ ＣＭ、Ｌｏｐｅｚ−Ｇａｔｅｌｌ Ｈ、Ｏｌｉｖｅｒａ Ｈ、Ｌｏｐｅｚ Ｉ、Ｍｙｅｒｓ ＣＡ、Ｆａｉｘ Ｄ、Ｂｌａｉｒ ＰＪ、Ｙｕ Ｃ、Ｋｅｅｎｅ ＫＭ、Ｄｏｔｓｏｎ ＰＤ Ｊｒ、Ｂｏｘｒｕｄ Ｄ、Ｓａｍｂｏｌ ＡＲ、Ａｂｉｄ ＳＨ、Ｓｔ Ｇｅｏｒｇｅ Ｋ、Ｂａｎｎｅｒｍａｎ Ｔ、Ｍｏｏｒｅ ＡＬ、Ｓｔｒｉｎｇｅｒ ＤＪ、Ｂｌｅｖｉｎｓ Ｐ、Ｄｅｍｍｌｅｒ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＧＪ、Ｇｉｎｓｂｅｒｇ Ｍ、Ｋｒｉｎｅｒ Ｐ、Ｗａｔｅｒｍａｎ Ｓ、Ｓｍｏｌｅ Ｓ、Ｇｕｅｖａｒａ ＨＦ、Ｂｅｌｏｎｇｉａ ＥＡ、Ｃｌａｒｋ ＰＡ、Ｂｅａｔｒｉｃｅ ＳＴ、Ｄｏｎｉｓ Ｒ、Ｋａｔｚ Ｊ、Ｆｉｎｅｌｌｉ Ｌ、Ｂｒｉｄｇｅｓ ＣＢ、Ｓｈａｗ Ｍ、Ｊｅｒｎｉｇａｎ ＤＢ、Ｕｙｅｋｉ ＴＭ、Ｓｍｉｔｈ ＤＪ、Ｋｌｉｍｏｖ ＡＩ、Ｃｏｘ ＮＪ. Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｓｗｉｎｅ−ｏｒｉｇｉｎ ２００９ Ａ(Ｈ１Ｎ１) ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ. Ｓｃｉｅｎｃｅ. ２００９; １０;３２５(５９３７):１９７−２０１; Ｎｅｌｓｏｎ ＭＩ、Ｖｉｂｏｕｄ Ｃ、Ｓｉｍｏｎｓｅｎ Ｌ、Ｂｅｎｎｅｔｔ ＲＴ、Ｇｒｉｅｓｅｍｅｒ ＳＢ、Ｓｔ Ｇｅｏｒｇｅ Ｋ、Ｔａｙｌｏｒ Ｊ、Ｓｐｉｒｏ ＤＪ、Ｓｅｎｇａｍａｌａｙ ＮＡ、Ｇｈｅｄｉｎ Ｅ、Ｔａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒ ＪＫ、Ｈｏｌｍｅｓ ＥＣ. Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ Ｈ１Ｎ１ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｓｉｎｃｅ １９１８. ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ. ２００８; ２９;４(２):ｅ１００００１２; Ｖｉｎｋｎｏｒ Ｍ、Ｓｔｅｖｅｎｓ Ｊ、Ｎａｗｒｕｃｋｉ Ｊ、Ｓｉｎｇｈ Ｋ. Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ: ｐａｒａｄｉｇｍ ｓｈｉｆｔ ｉｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ. ２００９; ４７(９):３０５５−３０５６; Ｒａｖｉ Ｖ. Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ Ｈ１Ｎ１ ａｓ ａ ｐａｎｄｅｍｉｃ ａｇｅｎｔ. Ｉｎｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ. ２００９; ２７(３): １７９−１８１)。
インフルエンザウイルスの詳細亜型を正確に把握することは、その感染の正確な診断だけではなく予防と治療、疫学調査のために必須である。特に、臨床診療では迅速で且つ正確な診断が重要である。インフルエンザウイルスの診断方法では、従来ウイルスを培養した後ＨＡタンパク質を検査する方法が使われたが、これは時間とコストにおいて問題があって、最近は、遺伝子検査に代替されている。例えば、逆転写ＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲ)とリアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ後に酵素結合免疫分析(ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｇｂｅｎｔ ａｓｓａｙ)する方法などが行われており、特に世界保健機関(ＷＨＯ)によりリアルタイムＰＣＲが新種フルーの標準検査方法で推薦されている。しかし、これら方法は、Ａ型インフルエンザウイルスの迅速な診断には有用であるが、それが正確にどのような亜型であるかは鑑別できない短所がある(Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ Ｂ、Ｚａｄｏｗ Ｉ、Ｈｅｃｋｌｅｒ Ｒ、Ｔｉｍｍ Ｈ、Ｐａｕｌｉ Ｇ. Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓａｍｐｌｅｓ. Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ２０００ ; ３８(４): １５５２−８; Ｖｉｎｋｎｏｒ Ｍ、Ｓｔｅｖｅｎｓ Ｊ、Ｎａｗｒｕｃｋｉ Ｊ、Ｓｉｎｇｈ Ｋ. Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ: ｐａｒａｄｉｇｍ ｓｈｉｆｔ ｉｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ. ２００９; ４７(９):３０５５−３０５６; Ｈｕａｎｇ Ｙ、Ｔａｎｇ Ｈ、Ｄｕｆｆｙ Ｓ、Ｈｏｎｇ Ｙ、Ｎｏｒｍａｎ Ｓ、Ｇｈｏｓｈ Ｍ、Ｈｅ Ｊ、Ｂｏｓｅ Ｍ、Ｈｅｎｒｉｃｋｓｏｎ ＫＪ、Ｆａｎ Ｊ、Ｋｒａｆｔ ＡＪ、Ｗｅｉｓｂｕｒｇ ＷＧ、Ｍａｔｈｅｒ ＥＬ. Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ａｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ microarray. Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ２００９; ４７(２):３９０−６)。
しかし、ＤＮＡマイクロアレイは、インフルエンザウイルスの診断だけではなくその亜型まで正確に把握が可能である。さらに、ＤＮＡマイクロアレイは、Ｍ２タンパク質のＳ３１Ｎ突然変異など、インフルエンザウイルスの遺伝子変異による薬剤耐性の把握にも利用することができる。薬物耐性は、インフルエンザの治療時に深刻な問題になるので、薬物の選択前になるべく薬物耐性を確認することが重要である(Ｈａｎ Ｘ、Ｌｉｎ Ｘ、Ｌｉｕ Ｂ、Ｈｏｕ Ｙ、Ｈｕａｎｇ Ｊ、Ｗｕ Ｓ、Ｌｉｕ Ｊ、Ｍｅｉ Ｌ、Ｊｉａ Ｇ、Ｚｈｕ Ｑ. Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ａｌｌ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ using ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ. Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ. ２００８; １５２(１−２):１１７−２１; Ｈｕａｎｇ Ｙ、Ｔａｎｇ Ｈ、Ｄｕｆｆｙ Ｓ、Ｈｏｎｇ Ｙ、Ｎｏｒｍａｎ Ｓ、Ｇｈｏｓｈ Ｍ、Ｈｅ Ｊ、Ｂｏｓｅ Ｍ、Ｈｅｎｒｉｃｋｓｏｎ ＫＪ、Ｆａｎ Ｊ、Ｋｒａｆｔ ＡＪ、Ｗｅｉｓｂｕｒｇ ＷＧ、Ｍａｔｈｅｒ ＥＬ. Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ａｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ. Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ２００９; ４７(２):３９０−６; Ｎｅｌｓｏｎ ＭＩ、Ｓｉｍｏｎｓｅｎ Ｌ、Ｖｉｂｏｕｄ Ｃ、Ｍｉｌｌｅｒ ＭＡ、Ｈｏｌｍｅｓ ＥＣ. Ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｇｌｏｂａｌ ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ａｄａｍａｎｔａｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａ/Ｈ３Ｎ２ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ. Ｖｉｒｏｌｏｇｙ. ２００９; ３８８(２):２７０−８)。
本発明のＹ字型プローブを利用したＤＮＡマイクロアレイは、一つのスポット内にヘマグルチニン遺伝子とノイラミニダーゼ遺伝子のプローブが一緒に含まれている新しい形態である。従来、インフルエンザウイルス診断ＤＮＡチップが報告されているが、本願発明のような方式のＤＮＡマイクロアレイや製品に対しては報告されたことがない(Ｈｕａｎｇ Ｙ、Ｔａｎｇ Ｈ、Ｄｕｆｆｙ Ｓ、Ｈｏｎｇ Ｙ、Ｎｏｒｍａｎ Ｓ、Ｇｈｏｓｈ Ｍ、Ｈｅ Ｊ、Ｂｏｓｅ Ｍ、Ｈｅｎｒｉｃｋｓｏｎ ＫＪ、Ｆａｎ Ｊ、Ｋｒａｆｔ ＡＪ、Ｗｅｉｓｂｕｒｇ ＷＧ、Ｍａｔｈｅｒ ＥＬ. Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ａｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ. Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ２００９; ４７(２):３９０−６; Ｌｉｎ Ｂ、Ｍａｌａｎｏｓｋｉ ＡＰ、Ｗａｎｇ Ｚ、Ｂｌａｎｅｙ ＫＭ、Ｌｏｎｇ ＮＣ、Ｍｅａｄｏｒ ＣＥ、Ｍｅｔｚｇａｒ Ｄ、Ｍｙｅｒｓ ＣＡ、Ｙｉｎｇｓｔ ＳＬ、Ｍｏｎｔｅｖｉｌｌｅ ＭＲ、Ｓａａｄ ＭＤ、Ｓｃｈｎｕｒ ＪＭ、Ｔｉｂｂｅｔｔｓ Ｃ、Ｓｔｅｎｇｅｒ ＤＡ. Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ. Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ２００９; ４７(４):９８８−９３; Ｈａｎ Ｘ、Ｌｉｎ Ｘ、Ｌｉｕ Ｂ、Ｈｏｕ Ｙ、Ｈｕａｎｇ Ｊ、Ｗｕ Ｓ、Ｌｉｕ Ｊ、Ｍｅｉ Ｌ、Ｊｉａ Ｇ、Ｚｈｕ Ｑ. Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ａｌｌ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ. Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ. ２００８; １５２(１−２):１１７−２１)。
本発明のインフルエンザＤＮＡマイクロアレイは、Ｈ１−１６Ｎ１−９の、全体で１４４個類型の、存在可能な全てのインフルエンザウイルスの類型を診断することができる。本発明には、これら１４４個プローブ及び対照標準物質遺伝子のプローブが集積されたマイクロアレイだけではなく、ＲＴ−ＰＣＲ試薬、ハイブリダイゼーション反応試薬、製品採取キット、スキャナでの判読に必要な指針までが含まれる。
１０.１. インフルエンザウイルスの遺伝子型分析のためのＹ字型プローブのデザイン
本発明のＹ字型プローブデザイン方法によって、フルー原因ウイルスであるインフルエンザＡウイルスを遺伝子型分析するために使用可能なＹ字型プローブは、次のようにデザインした。これは、公知のインフルエンザウイルスのヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ遺伝子の塩基配列を基礎としている(Ｈａｎ Ｘ、Ｌｉｎ Ｘ、Ｌｉｕ Ｂ、Ｈｏｕ Ｙ、Ｈｕａｎｇ Ｊ、Ｗｕ Ｓ、Ｌｉｕ Ｊ、Ｍｅｉ Ｌ、Ｊｉａ Ｇ、Ｚｈｕ Ｑ. Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ａｌｌ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ. Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ. ２００８; １５２(１−２):１１７−２１; Ｈｕａｎｇ Ｙ、Ｔａｎｇ Ｈ、Ｄｕｆｆｙ Ｓ、Ｈｏｎｇ Ｙ、Ｎｏｒｍａｎ Ｓ、Ｇｈｏｓｈ Ｍ、Ｈｅ Ｊ、Ｂｏｓｅ Ｍ、Ｈｅｎｒｉｃｋｓｏｎ ＫＪ、Ｆａｎ Ｊ、Ｋｒａｆｔ ＡＪ、Ｗｅｉｓｂｕｒｇ ＷＧ、Ｍａｔｈｅｒ ＥＬ. Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ａｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ. Ｊ Clin Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ２００９; ４７(２):３９０−６)。
１) 左側及び右側プローブ部位(図１のＡ及びＥ部位)
Ｙ字型プローブの左側プローブ部位(図１のＡ部位)には、ノイラミニダーゼ遺伝子のプローブを入れて、右側プローブ部位(図１のＥ部位)には、ヘマグルチニン遺伝子のプローブを入れた。これを各亜型別に相異にした。各々のプローブは、全て１４４個がデザインされた(表１０)。
２) 幹部位(図１のＢ及びＤ部位)
左側幹部位(図１のＢ部位)には、ヒトテロメアシーケンスの逆方向であるＣＣＣＴＡＡを入れて、右側幹部位(図１のＤ部位)には、これと相補的に結合するシーケンスであるヒトテロメアシーケンスの順方向であるＴＴＡＧＧＧを入れてデザインした。
３) リンカー部位(図１のＣ部位)
Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ａｍｉｎｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ ｄＴ(ｉＡｍＭＣ６Ｔ)を入れてリンカーをデザインした。これによって、総１４４個類型のインフルエンザウイルス遺伝子型のＹ字型プローブを設計した。また、その中でインフルエンザウイルスＡ型の診断に必要なプローブを中心として、前述の実施例に記述した方法のどおり、スライドガラスに集積してインフルエンザウイルスの遺伝子型分析ＤＮＡチップを製作した。一つのチップで８個までの検体を分析することができるようにして製作した。そのプローブの名称と配列番号及び遺伝子型は、下記表１０に整理した。
表１０ インフルエンザＡ型ウイルス遺伝子に対するＹ字型プローブの配列
前記表１０のＹ字型プローブのうち、配列番号５６(Ｈ１Ｎ１)、５７(Ｈ１Ｎ２)、６５(Ｈ２Ｎ１)、６６(Ｈ２Ｎ２)、７４(Ｈ３Ｎ１)、７５(Ｈ３Ｎ２)、７６(Ｈ３Ｎ３)、８６(Ｈ４Ｎ４)、９６(Ｈ５Ｎ５)、１０６(Ｈ６Ｎ６)、１１６(Ｈ７Ｎ７)、１２６(Ｈ８Ｎ８)、１３６(Ｈ９Ｎ９)、１３７(Ｈ１０Ｎ１)、１４７(Ｈ１１Ｎ２)の１５個プローブを製作した。また、対照遺伝子プローブとして、Ｙ字型プローブではない直線型の単一プローブ４個も製作した。これには、ヒトインフルエンザプローブ(ｉｎｆ Ａ)で５’−Ｃ６Ａｍｉｎｅ ｌｉｎｋｅｒ−ＴＧＣ ＡＧＴ ＣＣＴ ＣＧＣ ＴＣＡ ＣＴＧ ＧＧＣ ＡＣＧ−３'、豚インフルエンザプローブ(ＳＷ ｉｎｆ Ａ)で５’−Ｃ６Ａｍｉｎｅ ｌｉｎｋｅｒ−ＣＹＡ ＣＴＧ ＣＡＡ ＧＣＣ ＣＡＴ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＡＧ ＣＡＧ ＧＣＡ−３'、豚インフルエンザＨ１遺伝子のプローブ(ＳＷ Ｈ１)で５’−Ｃ６Ａｍｉｎｅ ｌｉｎｋｅｒ−ＣＡ ＧＡＡ ＴＡＴ ＡＣＡ ＴＣＣ ＲＧＴ ＣＡＣ ＡＡＴ ＴＧＧ ＡＲＡ Ａ−３'、ＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子プローブで５’−Ｃ６ Ａｍｉｎｅ ｌｉｎｋｅｒ−ＴＴＣ ＴＧＡ ＣＣＴ ＧＡＡ ＧＧＣ ＴＣＴ ＧＣＧ ＣＧ−３'が含まれる。これらプローブを実施例４の方法によって、アルデハイドコーティングされたスライドガラスに集積してインフルエンザＡ型ウイルス診断チップを製作した。本発明のチップのグリッドを図１３に示した。
１０.２. 検体収集と処理及びＲＴ−ＰＣＲ方法
公知の方法で、インフルエンザ感染、特にｓｗｉｎｅ ｆｌｕ Ａ Ｈ１/Ｎ１の感染が疑心される患者の上気道から検体を得てＲＮＡを分離した。その後、 世界保健機関(ＷＨＯ)で２００９年４月３０日に提示した『ＣＤＣ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｏｆ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ ｆｏｒ ｓｗｉｎｅ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ Ａ(Ｈ１Ｎ１)』で、公知された方法とプライマーシーケンスを利用して、逆転写ＰＣＲとリアルタイムＰＣＲを実行した(Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ Ｂ、Ｚａｄｏｗ Ｉ、Ｈｅｃｋｌｅｒ Ｒ、Ｔｉｍｍ Ｈ、Ｐａｕｌｉ Ｇ. Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓａｍｐｌｅｓ. Ｊ Ｃｌｉｎ Microbiol. ２０００; ３８(４): １５５２−８; ＵＳＡ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ. ＣＤＣ ｓｗｉｎｅ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐａｎｅｌ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ２.０ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ. Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｕｓｅ. ２００９)。
鼻咽頭吸引物(ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ａｓｐｉｒａｔｅ)と鼻咽頭スワブ(ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｓｗａｂ)、咽頭スワブ(ｔｈｒｏａｔ ｓｗａｂ)などの検体を、ＲＮＡ分解酵素の拮抗剤(ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ)であるＤＥＰＣで事前処理した検体収去チューブに受けて、ＱｉａＡｍｐウイルスＲＮＡミニキット(Ｑｕｉａｇｅｎ Ｉｎｃ、ＵＳＡ)を利用してＲＮＡを精製分離した。以後、このＲＮＡで、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｋｉｔ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ., ＵＳＡ)とＨＡ及びＮＡ遺伝子のＰＣＲプライマーを利用して逆転写ＰＣＲ反応を実行した。この時、本発明のＹ字型プローブ分析に合わせて、ＨＡ遺伝子のＰＣＲプライマーはＣｙ５で標識して、ＮＡ遺伝子のＰＣＲプライマーはＣｙ３で標識した。また、ＲＰＰ、ＳＷＨ１、ＳＷ ｉｎｆＡ、ｉｎｆＡは全てＣｙ５で標識したプライマーを使用した。ＨＡとＮＡ遺伝子のＰＣＲは同時にデュプレックス(ｄｕｐｌｅｘ)で実行した。その条件は、次のようである。以下、各過程に対してより詳細に記述する。
１０.２.１. ウイルスＲＮＡの抽出
公知の方法のどおり、次のように実行した。
１) バッファー(ｂｕｆｆｅｒ)の準備
［１］ ＡＶＬバッファー１ｍｌを取った後、凍結乾燥したキャリアＲＮＡをチューブに入れて溶かし、再度ＡＶＬ バッファーを添加する。キャリアＲＮＡを入れたからは４℃に保管する。
［２］ ＡＷ１とＡＷ２バッファー容器に１００％エチルアルコールを添加する。
２)全てのバッファーとサンプル(ＶＴＭ)が準備されると、ＡＶＬバッファー５６０ｕｌを１.５ ｍｌチューブに入れる。
３)サンプル１４０ｕｌを入れて、約１０秒間ｖｏｒｔｅｘｅｒを利用して混ぜた後、スピンダウン(ｓｐｉｎ−ｄｏｗｎ)してチューブのふたや壁についているサンプルを集める。
４) 室温(約２４℃)で１０分間定置させる。
５) ９６−１００％のエチルアルコール５６０ｕｌを入れて、約１０秒間ｖｏｒｔｅｘｅｒを利用して混ぜた後、スピンダウンしてチューブのふたや壁についているサンプルを集める。
６) スピンコラムに上のサンプル６３０ｕｌを入れた後、８,０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。コレクションチューブを捨てて新しいコレクションチューブを装着する。
７) ６)過程をもう一度実施する。
８) ＡＷ１バッファー５００ｕｌを入れた後、８,０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。
９) ＡＷ２バッファー５００ｕｌを入れた後、１４,０００ｒｐｍで３分間遠心分離する。
１０) スピンコラムを新しい１.５ｍｌチューブに乗せた後、ＡＶＥバッファー６０ｕｌをコラム内メンブレン上に入れる。１分間定置した後、８,０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。
１０.２.２. リアルタイムワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｋｉｔ(ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ, Ｃａｔ. ｎｏ １１７４５)を使用して、一緒に提供されたマニュアルによって、次のようにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実行した。本発明リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで使用したＰＣＲプライマーは、ＷＨＯで公知した、次の表１１のような塩基配列のオリゴヌクレオチドを使用した。
表１１ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ用プライマーの配列
１) 表１１の配列を有する各オリゴヌクレオチド別に、下記表のように、Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘｔｕｒｅを製造してピペットでよく交ぜてスピンダウンする。
２) ２０ｕｌずつ各チューブに分株した後、陰性、サンプルウイルス−ＲＮＡ、陽性の順に５ｕｌずつ各チューブに入れる。
３) 準備したチューブは、下記表の条件に合わせておいたリアルタイムＰＣＲ装備のＲｏｔｏｒに順に差し込めて実行する。
４) ＰＣＲが終了すれば、分析画面を開いて各遺伝子別分析を実行し、各サンプル別に結果値を結果記録紙に入力する。図１５は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実行して得た結果である。
図１６は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実行して得た結果物のうち、一部検体のＰＣＲ産物を電気泳動したことで、実際検体の場合、ＰＣＲ産物の大きさのみを通じて電気泳動上で陽性と陰性を区分することは難しい。したがって、Ｈ１Ｎ１の場合には、本発明のＤＮＡチップや、あるいはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ方法を使用して確認する検査を実行しなければならない。
本発明で製作されたチップに使用するためのＲＴ−ＰＣＲプライマーは、次の表１２のように組成した。ＲＴ−ＰＣＲ方法は、Ｔａｑ ＆ ＲＴ ｍｉｘｔｕｒｅ ０.５ｕｌ、２ｘ ＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ １２.５ul、１０ｐｍｏｌｅ Ｆ ＆ Ｒプライマーを各々ｕｌずつ入れて、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ５ｕｌとウイルスＲＮＡ ５ｕｌを入れて、上述したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ方法と同一な条件でワンステップＲＴ−ＰＣＲを実行した。
表１２ インフルエンザＡチップのＰＣＲプライマーの配列
１０.３. ハイブリダイゼーション反応及び分析方法
オリゴヌクレオチドプローブをスポッティングさせたスライドチップ上に、検体のＲＮＡを鋳型としてＨとＮ遺伝子の逆転写ＰＣＲ増幅産物を各々１０μlずつ混合して最終容積５０μlになるようにして、これを９５℃で５分間変性させた後、直ちに氷に３分間放置した。以後、ハイブリダイゼーション反応溶液５０μlを添加して最終容積を１００μlに調整した後、４５℃でスライドに固定されたプローブと３０分間反応させた。この時、ハイブリダイゼーション反応溶液は、２０Ｘ ＳＳＣ ２mlと９０％のグリセロール１.７ｍｌ、５０ｍＭリン酸緩衝溶液６.３ｍｌを混合して最終１０ｍｌで作って組成した。ハイブリダイゼーション反応の終了後、ＤＮＡチップから区画カバー(ｗｅｌｌ ｃｏｖｅｒ)を除去し、チップを３Ｘ ＳＳＰＥ溶液(ＮａＣｌ(２６.２９５ｇ)、ＮａＨ２ＰＯ４−１Ｈ２Ｏ(４.１４ｇ)、Ｎａ２ＥＤＴＡ(１.１１ｇ)を蒸溜水１リットルに溶かして１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７.４に合わせる。)に浸した後、室温で２分間洗浄し、更に１Ｘ ＳＳＰＥ(ＮａＣｌ(８.７６５ｇ)、ＮａＨ２ＰＯ４−１Ｈ２Ｏ(１.３８ｇ)、Ｎａ２ＥＤＴＡ(０.３７ｇ)を、蒸溜水１リットルに溶かして１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７.４に合わせる)溶液で常温で２分間洗浄した後、常温で８００ｒｐｍで１分３０秒間遠心分離して乾燥させた。ハイブリダイゼーション反応後、洗浄を通じて非特異的な信号は除去し、乾燥したスライドは蛍光スキャナを利用してその蛍光信号とイメージを分析する。この時のスキャナでは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ Ｓｃａｎｎｅｒ(Ａｘｏｎ、ＵＳＡ)やＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｌｉｔｅ(Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ)、またはこれに準ずる装備であれば十分である。
図１３は、前記表１０のＹ字型プローブを利用したインフルエンザＡウイルスＤＮＡチップのグリッドを示し、図１４は、標準物質と人体上気道分泌物検体で各々ＲＴ−ＰＣＲを実行した後得た産物を、本発明のインフルエンザＡウイルスのＤＮＡチップ上においてハイブリダイゼーション反応を行った後、スキャナで分析して得たイメージの実例を示す。ここで、ｓｗｉｎｅインフルエンザウイルスＡ(Ｈ１Ｎ１)の陽性検体が明確に確認される。検体を受けて本発明の結果までは、約３−４時間が必要であった。また、２名の研究者が１００余個のチップを利用して一日に約８００個までの検体を検査することができる。
２００９年１１月から１２月までｓｗｉｎｅインフルエンザウイルスＡ(Ｈ１Ｎ１)が疑心されて依頼された韓国人患者７８３名の上気道分泌物検体を、本発明のインフルエンザウイルス遺伝子型検査ＤＮＡマイクロアレイとＷＨＯ勧奨リアルタイムＰＣＲ方法で重複検査を施行した。その結果、３０９例(３９.５％)がＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスＡ/Ｈ１Ｎ１で確認された。これら全てにおいてＤＮＡマイクロアレイとリアルタイムＰＣＲの両方から陽性で現われて１００％の一致率を示した。
Ｙ字型プローブが集積されたＤＮＡマイクロアレイを利用した遺伝子発現の分析
遺伝子検査の核心の中で一つは、トランスクリプトミクス(ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ)、すなわち遺伝子発現を分析することである。特に、ある生物体の細胞から発現される全ての遺伝子に対して、その発現様相と量を大単位(ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ)で分析すること、また、その細胞の遺伝子発現が、細胞が処した環境や外部刺激、ホルモン、薬物、刺激、老化、疾病有無などによってどのように変わるかを調査することは、分子生物学研究の花と言える。そのために一番有力な道具がＤＮＡマイクロアレイである。
遺伝子発現研究のため、初期のＤＮＡマイクロアレイは、プローブでｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ(ｃＤＮＡ)やＰＣＲ産物を使用したが、最近には目的によって変形が可能なオリゴヌクレオチドを使用する傾向である。多数の会社が、知られたすべての人体遺伝子の発現を調査することができるオリゴヌクレオチドマイクロアレイを生産販売している。代表的な製品には、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ ａｒｒａｙｓ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ.ｃｏｍ)とＭｕｌｔｉｐａｃｋ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ(Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ)、ＣｏｄｅｌＬｉｎｋ Ｂｉｏａｒｒａｙｓ(ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ/ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ)などがある。これら製品は、いずれもマイクロアレイ自体やハイブリダイゼーション反応、検体などからのエラーや変数を避けて、遺伝子発現の相対的差及び絶対量の分析のために、対照群及び対照実験を追加している。広く利用される方法では、マイクロアレイのコーナーにいわゆるハウスキーピング(ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ)遺伝子のプローブを内部対照物質(ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ)で集積する方法と、ｓｐｉｋｅ−ｉｎ ＲＮＡあるいは外部対照物質(ｅｘｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ)ＲＮＡを入れて標的物質ＲＮＡとともにマイクロアレイ上でハイブリダイゼーションする方法がある。これによって、相対的遺伝子発現の変化を一層正確で且つ敏感に調査し、マイクロアレイの間の差を分析するにおいて一層有利であり、遺伝子発現の絶対量を把握することも可能であると考えられている。しかし、これによっても各スポット間の差の変数とノイズの変数などを正確に分析しにくい。実際に、各スポットのシグナルの強度が決して遺伝子発現の程度と正比例するものではないことが明らかになった(Ｙａｎｇ ＩＶ. Ｕｓｅ ｏｆ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ. Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｘｚｙｍｏｌｏｇｙ. ２００６; ４１１:５０−６３; Ｓａｌｔ Ｍ. Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ. Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｘｚｙｍｏｌｏｇｙ. ２００６; ４１１:６４−８０; Ｉｒｉｚａｒｒｙ ＲＡ、Ｂｏｌｓｔａｄ ＢＭ、Ｃｏｌｌｉｎ Ｆ、Ｃｏｐｅ ＬＭ、Ｈｏｂｂｓ Ｂ、Ｓｐｅｅｄ ＴＰ. Ｓｕｍｍａｒｉｅｓ ｏｆ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ ｐｒｏｂｅ ｌｅｖｅｌ ｄａｔａ. Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. ２００３ Ｆｅｂ １５;３１(４):ｅ１５)。
これらオリゴヌクレオチドマイクロアレイは、いずれも各スポットに内部対照プローブが入っていないという共通点がある。しかし、本発明は、ＤＮＡマイクロアレイに内部対照物質と外部対照物質とを提供することで、遺伝子発現分析が一層正確に行われて、標準化を可能とすることに目的がある。
本実施例では、Ｙ字型プローブの原理を利用して遺伝子発現を分析する新しいＤＮＡマイクロアレイを示す。基本概念を要約すれば、標的遺伝子を検査するプローブと内部参照物質(ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ)のプローブを一緒に入れてＹ字型プローブを作ってこれを集積してマイクロアレイを準備し、一方では、検体に蛍光標識しながらｃＲＮＡを準備し、参照物質のｃＲＮＡにまた他の標識を行って準備した後、これらを混合してＤＮＡマイクロアレイ上に乗せてハイブリダイゼーション反応を実行する。以後、分析の際に、各々のスポットで参照物質の蛍光シグナル対比検体遺伝子のシグナルの差を考慮し正常化して分析する。本発明の特徴は、一つのスポット内で検査する遺伝子と内部参照物質の遺伝子のシグナルを一緒に分析する点である。すなわち、各々のスポットごとに対照実験を一つ一つ行う。これは、ＤＮＡマイクロアレイでの遺伝子発現分析時のエラーを極小化し、より正確な統計分析を可能とし、品質管理改善、時間とコスト節減など多くの長所が予想される。本発明は、大単位トランスクリプトミクス研究を進展させると期待される。
以下、本発明の実施例について詳しく説明する。
本発明のＹ字型プローブにおいて、一方のプローブ部分は、遺伝子発現を分析する多数の標的遺伝子に対して各々オリゴヌクレオチドプローブを組成し、他方のプローブ部分は、内部参照物質の遺伝子を選択してオリゴヌクレチドプローブを組成した後、これら多数のＹ字型プローブをスライドガラスに集積してマイクロアレイを製作する。この時、参照遺伝子のプローブは、標的遺伝子のプローブ部位と相補性がないようにし、検査しようとする個体、例えば、人体には存在又は発現されない遺伝子を選択する。本実施例では、大膓菌のｍｏｔＤ遺伝子に対するプローブを内部対照遺伝子としてＹ字型プローブの一方に入れた。
以後、ＤＮＡマイクロアレイに乗せる物質を２種で準備する。一つは検査する検体から全体ＲＮＡを分離した後ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写(ＩＶＴ)及び逆転写を経てｃＲＮＡを準備する。この時、その過程で蛍光染料(例えば、Ｃｙ−３)を入れて標識する。これと別個に、外部対照物質を準備する。そのためには、ＲＮＡポリメラーゼのプローモーター(Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６)とポリＡテールを有したプラスミドベクターに、対照遺伝子、すなわち、大膓菌のｍｏｔＤ遺伝子を挿入して作ったベクターを鋳型として、ＩＶＴ(試験管内転写)を実行することでｃＲＮＡを得る。あるいは、これをオリゴヌクレオシド形態で合成して使用しても関係ない。この時、ＩＶＴ過程で他の蛍光染料(例えば、Ｃｙ−５)を入れて標識する。各々のｃＲＮＡの量と質を確認した後、検査しようとする検体と対照物質のｃＲＮＡを混合してマイクロアレイ上に乗せてハイブリダイゼーション反応を行う。以後、蛍光スキャナで分析する。この時、各スポットでバックグラウンドのノイズシグナルを除外してＣｙ−５とＣｙ−３のシグナルを調査し、更にハウスキーピング遺伝子のＣｙ−３シグナルと比較して３重の正常化過程を経て分析すれば、各スポット内でハウスキーピング遺伝子対比標的遺伝子の発現比を把握することができる。これを総合すれば、検体で多数のすなわち、数万ヶ以上の遺伝子の相対的発現度を統計分析することもできる。したがって、知られたすべての人体遺伝子に対して大単位遺伝子発現分析が可能である(図１７)。
本発明では、Ｙ字型プローブを利用して細胞増殖に関する各種遺伝子の発現を分析するマイクロアレイを製作した。人体の非小細胞性癌(ｎｏｎ ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ)組職と正常人の肺組職及び末梢静脈血の白血球から各々ＲＮＡを分離して、本発明のマイクロアレイで信号伝達物質遺伝子の発現を分析した。これと共に、定量型リアルタイムＰＣＲ方法でも比較分析して、本発明のＤＮＡチップの正確度を評価した。
以下、一例として上皮細胞成長因子受容体(ＥＧＦＲ：ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ)の遺伝子発現分析に対して詳述する。
１１.１. Ｙ字型プローブとＤＮＡマイクロアレイの準備
１) 左側及び右側プローブ部位(図１のＡ及びＥ部位)
Y型プローブの右側プローブ(図１のＥ部位)には、各標的遺伝子のセンスストランドに対してプローブを組成した。左側は、大膓菌のｍｏｔＤ遺伝子に対するプローブを対照プローブを作って入れた。各々のプローブの長さは、７０ｂｐ程度にした。プローブの長さは、より短くしても関係ないが、敏感度を優先的に考慮して組成した。
２) 幹部位(図１のＢ及びＤ部位)
左側幹部位(図１のＢ部位)には、人体テロメアシーケンスの逆方向であるＣＣＣＴＡＡを２回入れて、これと相補的に結合するシーケンスである人体テロメアシーケンスの順方向であるＴＴＡＧＧＧを右側幹部位(図１のＤ部位)に２回入れてデザインした。
３) リンカー部位(図１のＣ部位)
Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ａｍｉｎｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ ｄＴ(ｉＡｍＭＣ６Ｔ)を入れてリンカーでデザインした。
前の実施例で記述した方法のとおり、本発明のＹ字型プローブをスライドガラスに集積してＤＮＡチップを製作した。下記表１３に、ＥＧＦＲ遺伝子とハウスキーピング遺伝子であるベータアクチン(β-ａｃｔｉｎ)遺伝子に対して各々Ｙ字型プローブの配列を示した。
表１３ ＥＧＦＲ遺伝子発現検査用Ｙ字型プローブの配列
１１.２. 検体の準備と標識
公知の方法で検体からＲＮＡを分離精製し、これを逆転写とｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を通じてＣｙ−３で標識した(Ｙｕ Ｊ、Ｏｔｈｍａｎ ＭＩ、Ｆａｒｊｏ Ｒ、Ｚａｒｅｐａｒｓｉ Ｓ、ＭａｃＮｅｅ ＳＰ、Ｙｏｓｈｉｄａ Ｓ、Ｓｗａｒｏｏｐ Ａ. Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ. Ｍｏｌ Ｖｉｓ. ２００２ Ａｐｒ ２６;８:１３０−７; Ｌｏｎｅｒｇａｎ Ｗ、Ｗｈｉｓｔｌｅｒ Ｔ、Ｖｅｒｎｏｎ ＳＤ. Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｗｉｔｈ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ. ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. ２００７ Ｍａｙ １８;７:２４)。
検体からＴｒｉｚｏｌ試薬(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)とＲＮｅａｓｙキット(Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｋｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ)を利用して全体ＲＮＡを分離しその量と質を調査して、Ａ２６０/Ａ２８０の比が１.９以上であり、リボソーム２８Ｓ及び１８Ｓ ＲＮＡバンドが電気泳動で明確に確認されるまで進行した。２５０ｎｇの全体 ＲＮＡをＴ７プローモータープライマー(Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)と５.８μLの容積で交ぜた後、６５℃で１０分間加温した後氷の上に入れる。ここに、４.４μLのｃＤＮＡ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ(２μL５× ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｂｕｆｆｅｒ、１μL ０.１Ｍ ＤＴＴ、０.５μL １０ ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、０.６μL Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａウイルス逆転写酵素(ＭＭＬＶ ＲＴ)及び０.３μL ＲＮａｓｅＯＵＴＴＭ(Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)を添加して交ぜた後、４０℃で２時間反応する。次に、６５℃で１５分間加温して反応を止めて冷却した後、０.５μLの１０ｍＭ ＣｙＴＭ３−ＣＴＰと１４.５μL転写マスターミックス(３.８３μL ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ、５μL ４×転写バッファー、２μL ＮＴＰ ｍｉｘ、１.６μL ５０％ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ(ＰＥＧ)、０.１２μL ＲＮａｓｅＯＵＴ、０.１５μL 無機ピロホスファターゼ及び０.３μL Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ)を入れて交ぜた後、４０℃で２時間の間反応させる。このように生成された標的遺伝子のｃＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ(Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ)で精製した後、マイクロアレイとハイブリダイゼーション反応させた。
１１.３. 外部対照物質の準備と標識
対照遺伝子の場合には逆転写はしないでｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のみで標識する。対照物質では、ｃＤＮＡの代わりに、図１８の(A)示したような、Ｔ７プローモーターとポリＡテールが付いているＥ. ｃｏｌｉ ｍｏｔＤ遺伝子をオリゴヌクレオチドで合成して直接使用するか、図１８(B)のような、Ｔ７プローモーターとポリＡテールを備えたプラスミドベクターにＥ. ｃｏｌｉ ｍｏｔＤ遺伝子をクローニングして組成した後、これを鋳型で使用して上述のようにｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を実行しながら標識する。この時、Ｃｙ−３の代わりにＣｙ−５を添加して標識する。
１１.４. ハイブリダイゼーションと結果分析
このように各々Ｃｙ−３とＣＹ−５で標識された標的遺伝子と対照遺伝子を交ぜた後マイクロアレイにハイブリダイゼーションさせると、図１９のように、各スポットでＣｙ−３とＣｙ−５シグナルが同時に出る。理論上では、すべてのスポットから出る対照遺伝子のＣｙ−５シグナルは全て同一でなければならない。しかし、スポットの模様と大きさが異なってその中にあるプローブ量にも差があるので、対照遺伝子のＣｙ−５シグナルがスポットごとに異なることがある。したがって、このようにスポットごとにそれぞれ異なるシグナルを正常化処理すれば、スポット間の差による遺伝子発現程度でのエラーを補正することができる。正常化(ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ)は、まず各スポットから出る対照遺伝子の蛍光強度Ｒｉをマイクロアレイ全体スポットの対照遺伝子蛍光強度の平均値Ｒｍ(＝(ΣＲｉ)/ｎ)で分けたθｉ(＝Ｒｉ/Ｒｍ)値を求めて、各スポット内の標的遺伝子の蛍光強度値Ｓｉ'をθｉで分けて得られた値Ｓｉ'(Ｓｉ/θｉ)を使用して行う。このようにすれば、スポット間の差によるエラーを除去することができる。したがって、標的遺伝子のＳｉ'値とハウスキーピング遺伝子のＳｈｋ'値を比較して標的遺伝子の相対的な発現程度(Ｓｉ'/Ｓｈｋ')が分かる。
１１.５. リアルタイム(Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ)ＰＣＲによる比較分析
定量型リアルタイムＰＣＲ方法で、各検体でのベータアクチン(β−ａｃｔｉｎ)遺伝子対比ＥＧＦＲ遺伝子の相手発現を調査した。各々の検体からＲＮＡを抽出して、逆転写反応を行ってｃＤＮＡを作った後、１００ｎｇをＰＣＲチューブに入れて、下記表１４のＥＧＦＲまたはβ−ａｃｔｉｎ遺伝子増幅用逆方向プライマーＥＧＦＲＲまたはＡＣＴＩＮＲ １０ｐｍｏｌ、ＥＧＦＲまたはβ−ａｃｔｉｎ遺伝子増幅用順方向プライマーＥＧＦＲＦまたはＡＣＴＩＮ Ｆ １０ｐｍｏｌ、蛍光物質であるＣｙ−３またはＣｙ−５が各々付着されたＥＧＦＲまたはβ−ａｃｔｉｎ遺伝子に特異なプローブＥＧＦＲＰまたはＡＣＴＩＮＰ １２ｐｍｏｌに、ＰＣＲバッファー(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.３、２５０ｍＭ ＫＣｌ、７.５ｍＭ ＭｇＣｌ２)、０.２ Ｉ.Ｕ.のＴａｑポリメラーゼ及び、ｄＮＴＰｓを含んでいる２Ｘプリミクス(ｐｒｅ ｍｉｘ)２５ｕｌを添加した後、蒸溜水で総容積が５０ｕｌになるようにした。混合と遠心分離過程を経た後、リアルタイム遺伝子増幅装置(Ｒｏｔｏｒ−ｇｅｎｅ ６００)を利用して５０℃で２分、９５℃で１０分間加温した後、９５℃で１５秒、５５℃で２０秒、７２℃で２５秒の反復過程を、４０回実施した。反応の終了後、増幅曲線(ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ)を分析して各々のＣｔ値を獲得した。獲得したＣｔ値を利用してＥＧＦＲ遺伝子のハウスキーピング遺伝子に対する相手発現程度の正確度を分析し、本発明のＹ字型プローブの最適条件を再点検した。
表１４ 定量型リアルタイムＰＣＲのためのオリゴヌクレオチドプライマー
１１.６. ＤＮＡマクロオレとｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲの分析結果
本実施例の実験結果を図１９と図２０に示した。図１９は、ベータアクチン遺伝子とＥＧＦ受容体(ＥＧＦＲ)遺伝子の発現をＹ字型プローブを使用して分析したイメージの写真である。標的遺伝子をハウスキーピング遺伝子であるベータアクチンとして、対照遺伝子をＥ. ｃｏｌｉ ｍｏｔＤ遺伝子で背増したＹ字型プローブのスポットから出る対照遺伝子のＣｙ−５蛍光強度(ＲＡＣＴＩＮ)をマイクロアレイ全体スポットのＣｙ−５蛍光強度の平均値(Ｒｍ)で分けて得た値であるＡＣＴＩＮ(＝ＲＡＣＴＩＮ/Ｒｍ)を求めて、ベータアクチンのＣｙ−３蛍光強度値ＳＡＣＴＩＮを求めて、ＡＣＴＩＮで分ければ、ＳＡＣＴＩＮ'(＝ＳＡＣＴＩＮ/ＡＣＴＩＮ)が得られる。これがベータアクチン遺伝子を正常化した発現値である。同一な方法で、標的遺伝子をＥＧＦＲとして、対照遺伝子をＥ. ｃｏｌｉ ｍｏｔＤ遺伝子で組成したＹ字型プローブのスポットのシグナルからＥＧＦＲ遺伝子の正常化した発現値ＳＥＧＦＲ'(＝ＳＥＧＦＲ/ＥＧＦＲ)を求める。以後、ベータアクチン遺伝子の正常化した発現程度値(ＳＡＣＴＩＮ')を利用して本検体でのＥＧＦＲ遺伝子のハウスキーピング遺伝子に対する相手発現程度値(＝ＳＥＧＦＲ'/ＳＡＣＴＩＮ')を測定することができる。本実施例においてＹ字型プローブを使用して測定した相手発現程度値が、図２０に示した定量リアルタイムＰＣＲで測定した値と一致することを確認することができた(Ｒ＝０.９)。
以上の結果から、本発明で製作したＹ字型プローブは、特定遺伝子の発現程度を正確に判別することが分かる。各遺伝子別プローブは、臨床検体で各々特定遺伝子のＲＮＡに対して特異的に結合し、プローブ間に交差ハイブリダイゼーション反応は現わさなかった。また、時間間隔を置いて異なる検査者が３回以上繰り返し検査した際に、いずれも同一な結果が出て１００％の再現性を示した。
本実施例では、人体肺癌組職の場合、正常肺組織や正常人の白血球に比べてＥＧＦＲ遺伝子の発現値が特に高く現われた。これは肺癌がＥＧＦＲ遮断薬剤であるｇｅｆｉｔｉｎｉｂやｅｒｌｏｔｉｎｉｂ、ｌａｐｉｔｉｎｉｂ、ｃｅｔｉｘｉａｍｂ、ｐａｎｉｔｕｍａｂなどによく反応することを示唆する。
実施例１１で使われたＴ７プローモーターとｐｏｌｙ Ａ ｔａｉｌ、Ｅ. ｃｏｌｉ ｍｏｔＤ遺伝子を含む合成オリゴヌクレオチド(図１８の(Ａ))とプラスミド(図１８の(B))を図１８に示した。これを鋳型で使用してＣｙ−５を入れてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写して蛍光で標識されたターゲットを作った後、検体から得たｃＲＮＡと混合してＤＮＡマイクロアレイ上に乗せてハイブリダイゼーション反応を行った。図１９は、正常人と患者の臨床検体からＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡを合成してＥＧＦＲ遺伝子とベータアクチン遺伝子の発現をＹ字型プローブマイクロアレイで分析した結果である。
Ｙ字型プローブが集積されたＤＮＡマイクロアレイを利用したＳＮＰ分析
遺伝子型検査のうち一番技術的に難しいことは単一塩基水準で遺伝子変異(ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ)を分析することであり、特に、正確で且つ迅速に、最小費用で多数の遺伝子を大単位(ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ)で分析する方法を開発することが一番重要な課題になっている。
遺伝子の単一塩基配列の変異を大単位で分析できる技法には、(１) 対照遺伝子特異ハイブリダイゼーション法(ＡＳＨ：ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｘｚａｔｉｏｎ)、(２) フラップ制限酵素判別法(ｆｌａｐ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ)、(３)プライマー伸張法(ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ)、(４) 対照遺伝子特異分解法(ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ)、(５) オリゴヌクレオチドライゲーション法(ＯＬＡ：ｏｌｉｇｏｎｅｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ)などがある。これら反応産物を蛍光やビオチンで標識して判読することで塩基配列を分析し、この時、判読道具では、Ａｐｐｌｉｅｄｃ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社のマイクロプレートリーダー(ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ)とキャピラリー電気泳動機(ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ)、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社の質量分光分析機(ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ)、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＡＢ社のＣＣＤカメラ、Ｌｕｍｉｎｅｘ社のマイクロビーズ(ｍｉｃｒｏｂｅａｄ)、ＤＮＡマイクロアレイがある。最近には、ＤＮＡマイクロアレイが一番広く使われており、人体遺伝体全体の単一ヌクレオチド多形成(ＳＮＰ：ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ)を分析するＤＮＡマイクロアレイも使われている(Ｔｓｕｃｈｉｈａｓｈｉ Ｚ ａｎｄ Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ＮＣ. Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ. Ｔｈｅ Ｐｈａｒａｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｊｏｕｒｎａｌ. ２００２; ２: １０３−１１０; Ｊｅｎｋｉｎｓ Ｓ ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ Ｎ. Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ. Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ. ２００２; ３: ５７−６６)。
本実施例１２では、Ｙ字型プローブを集積したＤＮＡマイクロアレイで、対照遺伝子特異ハイブリダイゼーション反応を通じてＳＮＰを分析して、これを臨床診療に応用する方法を開示する。
同じ遺伝子塩基配列の変異ではあるが、ＳＮＰと突然変異はお互いに克明な差がある。ＳＮＰは、人類において出現頻度が１％以上でよく現われる変異を示し、人類の各々の体格や顔つき、性格、疾病発病危険、薬物に対する反応を決定する要因である。ＳＮＰは、その自体が直接疾病を誘発するよりは、そのほかの遺伝子との相互作用や食事、生活習慣、環境的要因との相互作用を通じて特定疾病の危険を高めるか低める様相を示す。これに対して突然変異は、人類において出現頻度が１％未満で珍しく、タンパク質を変性させながらそれ自体だけで疾病を引き起こすことができる。突然変異は、病的な変異と作用する場合が多く、先天性でいわゆる遺伝病を起こすか、後天性疾病を誘発することがあり、その代表的な疾患が癌である。癌は、多数の癌遺伝子や腫瘍抑制遺伝子の突然変異が蓄積されて発生する。したがって、ＳＮＰ分析は疾病の予測に役に立ち、突然変異分析は疾病の診断に役に立つ場合が多い。
本発明のＹ字型プローブやその変形プローブを利用して、ＤＮＡマイクロアレイ上で対照遺伝子特異ハイブリダイゼーション技法でＳＮＰを検査する方法は、大きく次の２種類がある。
１．Ｙ字型プローブの変形型であるｄ字型のプローブを利用することができる。例えば、Ｙ字型プローブの右側は、調査する標的遺伝子のＳＮＰ部位に対するプローブを組成し、左側は除去したｄ字型のプローブを利用してマイクロアレイを製作する。この時、野生型乃至正常型(ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ)と変異型(ｍｕｔａｎｔ ｔｙｐｅ)を異にして、各々に特異なプローブ(ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｂｅ)を作り、両方の差がある塩基はプローブの中心部位において、プローブの長さは、１５乃至３０ｂｐ程度にする。標的遺伝子に対して標識をＣｙ−３またはＣｙ−５で同一にして、ハイブリダイゼーションして完全に一致(ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ)するスポットのプローブを探す。これによって、野生型であるか変異型であるかを確認することができる。この場合、単色(ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｒ)蛍光スキャナで分析が可能である。
２．Ｙ字型プローブの右側には、調査する標的遺伝子のセンスストランドのＳＮＰ部位に対するプローブを組成し、左側は、標的遺伝子のアンチセンスストランドのＳＮＰがない部位から内部参照用で対照プローブを作り入れてＹ字型プローブを準備し、これを利用してマイクロアレイを製作する。以後、ＳＮＰ分析用のセンスストランドと対照遺伝子用のアンチセンスストランドを相異なる蛍光、例えば、Ｃｙ−３とＣＹ−５で標識して一つのＰＣＲを実行すれば、標的遺伝子においてＳＮＰを見ようとする部位はＣｙ−３が付いて増幅され、アンチセンスストランドの対照部位遺伝子はＣＹ−５が付いて増幅される。この産物を単一ストランドで作って前記マイクロアレイ上に乗せてハイブリダイゼーションすれば、ＳＮＰを見ようとするセンスストランドの遺伝子増幅物は、Ｙ字型プローブの右側プローブに付いてＣｙ−３シグナルを示し、アンチセンスストランドの遺伝子増幅物は、Ｙ字型プローブの左側プローブに付いてＣｙ−５シグナルを示す。すなわち、Ｃｙ−５シグナルが内部参照シグナルであり、Ｃｙ−３シグナルがＳＮＰ検査シグナルになる。各スポットでバックグラウンドシグナルを除去した後、実施例１１で記述したとおりに、Ｃｙ−５対比Ｃｙ−３の、正常化処理したシグナルを調査し、これに基づいて完全に一致するスポットのプローブを探す。この場合、２色(ｄｕａｌ ｃｏｌｏｒ)蛍光スキャナが基本的に必要である。
本実施例では、前記２種の中で後者、すなわち、Ｙ字型プローブ利用方法の実例を示し、そのために、各種老令化関連疾患、特に、心臓疾患と痴ほう、老化関連黄斑変性(ＡＲＭＤ：ａｇｉｎｇ ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ)などに関連された遺伝子のＳＮＰを分析するＤＮＡマイクロアレイを準備した。一方、上述した２種類の方法の中でｄ字型プローブを使用する方法に対しては、実施例１３で後述する。
本発明のＳＮＰ検索用ＤＮＡマイクロアレイは、重要成人病の発病危険を予測し、危険が大きい場合、これを予防するために必要な指針を提示することができる。
１２.１.Ｙ字型プローブの製作
本発明のＹ字型プローブのデザイン規則に従って、標的遺伝子であるアルツハマー性痴ほう関連遺伝子(ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ、Ａｐｏ Ｅ)、インターロイキン１Ａ(ＩＬ１Ａ：ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １Ａ)、アンギオテンシン 転換酵素(ＡＣＥ：ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ)、酸化窒素合成酵素３(ＮＯＳ３：ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ−３)、エストロゲンレセプタ アルファ(ＥＳＲ１：ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ)、 メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素 (ＭＴＨＦＲ：ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ)、β−２アドレナリン性受容体(ＡＤＲＢ２：β−２ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ)、コレステロールエステル伝達タンパク質(ＣＥＴＰ：ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｅｓｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ)、補体因子Ｈ(ＣＦＨ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ Ｈ)など多数遺伝子に対してＹ字型プローブを、次のようにデザインした。これは公知の塩基配列(ＮＣＢＩ ｄｂＧＡＰ ＳＮＰ)に基礎したものである。
１) 左側及び右側プローブ部位(図１のＡ及びＥ部位)
Ｙ字型プローブの右側プローブ(図１のＥ部位)には、各標的遺伝子のセンスストランドのＳＮＰ部位に対するプローブを組成した。この時、野生型乃至正常型の各々に特異なプローブを準備し、両方の差がある塩基は、プローブの中心部上に置いて、プローブの長さは、１５乃至２８ｂｐにした。左側は、標的遺伝子のアンチセンスストランドのＳＮＰがない部位から内部参照用で対照プローブを作り入れてＹ字型プローブを準備した。
２) 幹部位(図１のＢ及びＤ部位)
左側幹部位(図１のＢ部位)には、人体テロメア配列の逆方向であるＣＣＣＴＡＡを２回入れて、これと相補的に結合する配列である人体テロメア配列の順方向であるＴＴＡＧＧＧを右側幹部位(図１のＤ部位)に２回入れてデザインした。
３) リンカー部位(図１のＣ部位)
Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ａｍｉｎｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ ｄＴ(ｉＡｍＭＣ６Ｔ)を入れてリンカーをデザインした。総９６個の老化疾患ＳＮＰのＹ字型プローブを設計し、これを前の実施例に記述した方法のどおり、スライドガラスに集積してＤＮＡチップを製作した。代表的なプローブの名称と配列番号及び遺伝子型は、下記表１５に整理した。
表１５ ＳＮＰ検索用Ｙ字型プローブの配列
１２.２.ＰＣＲ
各検体からＤＮＡを分離精製した後、蛍光染料を添加しながらＰＣＲを実行した。ＳＮＰ分析用のセンスストランドはＣｙ−３で標識し、対照遺伝子用のアンチセンスストランドはＣｙ−５で標識することで、一つのＰＣＲを実行すれば、標的遺伝子でＳＮＰを見ようとする部位はＣＹ−３が付いて増幅され、アンチセンスストランドの対照遺伝子はＣy−５が付いて増幅される。ＰＣＲのプライマーの配列は、次の表１６に整理した。ＰＣＲは、初期変性(ｉｎｉｔｉａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ)を９６℃で３分間行った後、３５ｃｙｃｌｅほど増幅し、各反応は、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で３０秒ずつ行って、最後の延長(ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ)は、７２℃で５分間実行した。
表１６ ＳＮＰ検索用プライマーの配列
１２.３. ハイブリダイゼーション反応及び分析
Ｃｙ−３及びＣｙ−５で標識されたＰＣＲ産物をハイブリダイゼーションバッファーと混合して、前で製作されたマイクロアレイ上に乗せて、４２℃で１時間の間ハイブリダイゼーション反応した後、洗浄して乾かして２色蛍光スキャナを利用して分析した。Ｃｙ−３は、５５０ｎｍで刺激、５７０ｎｍでシグナルを示して、Ｃｙ−５は、６４９ｎｍで刺激、６７０ｎｍでシグナルを示す。これと共に、ＰＣＲ産物を公知の方法を利用して塩基配列分析して比較分析を行った。分析は、前述の実施例で記述した方法を適用した。各スポットでバックグラウンドシグナルを除去した後、Ｃｙ−５対比Ｃｙ−３の、正常化処理したシグナルのＣｙ−５対比Ｃｙ−３のシグナルを調査し、これに基づいて完全に一致するスポットのプローブを探す。これによって、野生型であるか変異型であるかを確認することができ、混合型(ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ)も把握が可能である。
ＤＮＡマイクロアレイ分析とともにＰＣＲ産物を公知の方法を利用して塩基配列を分析して比較分析した。ＤＮＡマイクロアレイ結果は、本実施例の９６例が全て配列分析の結果と一致した。
図２１のＤＮＡマイクロアレイにおいて、本検体の対象者は、２５年間喫煙をして肥満である中年男性として、ＣＦＨ、ＣＥＴＰ、ＭＴＨＦＲ遺伝子に対して不利な(ｕｎｆａｖｏｒａｂｌｅ、ｈｉｇｈ ｒｉｓｋ)ＳＮＰを示した。これに対して、次のような解釈と指針を提示することができる。
すなわち、ＣＦＨ遺伝子の４０２番目のコドンにＳＮＰ(Ｙ４０２Ｈ、ｒｓ１０６１１７０)を示した。CFHは、免疫及び炎症反応に核心的な役目をする物質で、ＣＦＨにＳＮＰがある場合、老化関連黄斑変性(ＡＲＭＤ：ａｇｉｎｇ ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ)の危険が２.４倍から６.３倍高くなる。老化関連黄斑変性は、老人性視覚消失の主原因の中で一つで、世界的に千万人の超える患者がいる。特に、本例のように、喫煙者の場合には、その発病危険が約２０倍に大きくなる。したがって、その予防が必要であり、これのためには、必ず禁煙をしなければならないし、日中に外に出る時は、サングラスをつけた方がよく、また、抗酸化機能が強い野菜をたくさん食べて、ｌｕｔｅｉｎ、ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｅ、ａｓａｘａｎｔｈａｎｅのような栄養剤を服用することが勧奨される(Ｓｃｈｎｏｌｌ ＨＰＮ、Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ Ｍ、Ｉｓｓａ ＰＣ、Ｋｅｉｌｈａｕｅｒ Ｃ、Ｈｏｌｔｚ ＦＧ、Ｗｅｂｅｒ ＢＨＦ. Ａｎ ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｇｉｎｇ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ. ２００７; １３:１９６−２０５)。
また、ＣＥＴＰ遺伝子の１５５３番目の塩基にＳＮＰ(Ｇ１５３３Ａ)を示した。ＣＥＴＰは、高密度脂質タンパク質コレステロール(ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ(ＨＤＬ) ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ)においてトリグリセリドと高密度脂質タンパク質(ＬＤＬ)でコレステロールエステルを運ぶ酵素である。ＣＥＴＰに不利なＳＮＰがある場合、その活性が高くなりながら血清ＬＤＬが高くなり、ＨＤＬは落ちて、その結果、高脂血症と心血管疾患の危険が大きくなる。したがって、このような場合、それの予防のために、トランス脂肪(ｔｒａｎｓ−ｆａｔ)とファーストフードの摂取を減らして、Ｏｍｅｇａ−３ とＯｍｅｇａ−６を均衡を取って摂取する必要がある。また、ＬＤＬ血中値を周期的に検査して、高い際には、ＣＥＴＰを低める薬剤を服用することが勧奨される(Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｓ、Ｐｌａｎｅｌｌｓ Ｒ、Ｄｅｆｏｏｒｔ Ｃ、Ｂｅｒｎａｒｄ ＭＣ, Ｇｅｒｂｅｒ Ｍ、Ｐｒｕｄｈｏｍｍｅ Ｊ、Ｖａｇｕｅ Ｐ, Ｌａｉｒｏｎ Ｄ. Ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ａｎｄ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ to ｄｉｅｔｓ. Ｐｒｏｃ Ｎｕｔｒ Ｓｏｃ. ２００２; ６１(４):４２７−３４)。
また、ＭＴＨＦＲ遺伝子の６７７番目の塩基にＳＮＰ(Ｃ６７７Ｔ、Ａｌａ２２２Ｖａｌ)を示した。ＭＴＨＦＲは、ホモシステイン(ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ)と葉酸(ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ)の代謝に核心的な役目をする酵素で、ＭＴＨＦＲに不利なＳＮＰがある場合、ＭＴＨＦＲの機能が落ちながら体内ホモシステインが蓄積される。これは血管を固くして動脈硬化を起こして、心筋梗塞や痴ほうなどの危険が大きくなる。特に、本例のように、喫煙時、そしてＣＥＴＰのＳＮＰも不利な場合、その危険は一層加重される。このような場合、４種のＢ型ビタミン、すなわち、Ｖｉｔ Ｂ１２、Ｖｉｔ Ｂ６、リボフラビン、葉酸を充分な量でいつも取ることが勧奨され、徹底的な禁煙が必須である(Ｔｒａｂｅｔｔｉ E. Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ、ＭＴＨＦＲ ｇｅｎｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ、ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｉｓｋ. Ｊ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ. ２００８;４９(３):２６７−８２)。
ＤＮＡマイクロアレイを利用した癌遺伝子の突然変異検索
本発明の実施例１３では、Ｙ字型プローブの変形型を集積したＤＮＡマイクロアレイで対照遺伝子特異ハイブリダイゼーション(ＡＳＨ)反応を通じて突然変異を分析し、これを臨床診療に応用する方法を示す。
遺伝子の突然変異は、タンパク質の変化を誘発することで疾病を引き起こす。人体疾病の約半分は直接的又は間接的に遺伝子突然変異により誘発される。また、遺伝子突然変異の様相によって疾病の性格が変わって治療に対する反応も変わる。特に、癌の場合、その傾向は激しくて、癌遺伝子や腫瘍抑制遺伝子の突然変異を検索することは、癌の診断と早期発見、予後評価、治療方針決定及び治療薬剤選定のために非常に役に立つ 。代表的な例では、Ｋ−ＲＡＳ が挙げられる。
Ｋ−ＲＡＳは、人体で一番代表的な癌遺伝子である。Ｋ−ＲＡＳは、その下位物質であるＢＲＡＦ、前記ＥＧＦＲやその亜型であるＨＥＲ−２/ｅｒｂＢ２、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４とともに細胞増殖の信号伝達に核心的な役目をする。実際に、全てのヒト癌の半分以上、特に、腺癌(ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ)は、これらの異常と連関されて発生する。Ｋ−ＲＡＳの異常は、主に点突然変異(ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ)により発生する。この点突然変異は、Ｋ−ＲＡＳをいつも活性化させて(ｔｕｒｎ ｏｎ)、その結果、増殖の信号が継続無節制に伝達されながらその細胞は過剰増殖して癌細胞に進行する。Ｋ−ＲＡＳの点突然変異は、コドン１２と１３で集中発生し、特に、コドン１２の突然変異が９０％を占める。珍しくは、コドン５９と６１でも突然変異が発生する(Ｓｔａｈｅｌ ＲＡ. Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ, ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ. Ａｎｎａｌｓ of Oncology. ２００７; １８(ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ９): １４７−１４９)。
全てのヒト癌の約２０％からＫ−ＲＡＳの突然変異が発見される。特に、膵膓癌で最も好発して(９０％)、次に大膓癌(５０％)と肺癌、特に、腺癌(ａｄｅｎｏｃａｃｉｎｏｍａ、５０％)で高い頻度で現われる。したがって、膵液(ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｊｕｉｃｅ)や大便、血液、喀痰などからＫ−ＲＡＳの突然変異を調査して膵膓癌と大腸直腸癌、肺癌などの診断が行われている。それによって、放射線検査で識別されない早期癌も発見可能であり、癌の治癒率を大きく改善させると期待されている(Ｋｏｎｄｏ Ｈ、Ｓｕｇａｎｏ Ｋ、Ｆｕｋａｙａｍａ Ｎ、Ｋｙｏｇｏｋｕ Ａ、Ｎｏｓｅ Ｈ、Ｓｈｉｍａｄａ Ｋ. Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｋ−ｒａｓ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｔ ｃｏｄｏｎ １２ ｉｎ ｐｕｒｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｊｕｉｃｅ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ. Ｃａｎｃｅｒ １９９４; ７３:１５８９−１５９４; Ｐｒｉｘ Ｌ、Ｕｃｉｅｃｈｏｗｓｋｉ Ｐ、Ｂｏｃｋｍａｎｎ Ｂ、Ｇｉｅｓｉｎｇ Ｍ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｔｚ ＡＪ. Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｂｉｏｃｈｉｐ ａｒｒａｙ ｆｏｒ ｆａｓｔ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｋ−ｒａｓ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｔｏｏｌ. Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ. ２００２; ４８(３): ４２８−４３５; Ｈｉｂｉ Ｋ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＣＲ、Ｂｏｏｋｅｒ Ｓ、Ｗｕ Ｌ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＳＲ、Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ Ｄ、Ｊｅｎ Ｊ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ. Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ. １９９８; ５８:１４０５−１４０７)。
Ｋ−ＲＡＳ突然変異がある癌は、突然変異がない癌と比較してその経過や予後に差がある。Ｋ−ＲＡＳ突然変異がある場合、予後がさらに不良であり、手術後再発率も相対的に高くて、生存期間も短い傾向を示す(Ｃｅｒｏｔｔｉｎｉ ＪＰ、Ｃａｐｌｉｎ Ｓ、Ｓａｒａｇａ Ｅ、Ｇｉｖｅｌ ＪＣ、Ｂｅｎｈａｔｔａｒ Ｊ. Ｔｈｅ ｔｙｐｅ ｏｆ Ｋ−ｒａｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ. Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ. １９９８; １７５:１９８−２０２)。したがって、手術後にもさらに注意を要して、再発時には効果的な抗癌剤が必要である。しかし、問題はＫ−ＲＡＳ突然変異癌の場合よく抗癌剤に抵抗を示す点である。
現在、抗癌剤には大きく３種類がある。その一つは、伝統的な意味での抗癌剤である。正確に言って、細胞毒性坑癌化学剤(ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ)で、これらは癌細胞だけではなく正常細胞も殺生し、そのためによく副作用が問題になる。他の一つとして、最近には、癌細胞の特定標的のみを攻撃して破壊する標的薬物が開発された。これには、抗体、特に、単一クローン抗体薬剤と合成薬物の２種類がある。残り一つは、癌ではなく癌の血管や癌を補助する組職を攻撃して癌を治療する薬物である。最近には、標的薬物をより積極的に適用しようとする傾向があり、前記２種類の薬剤を併用投与して治療する方法が広く適用されている。特に、腺癌の場合、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ−２を攻撃する抗体薬剤(Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、Ｐａｎｉｔｉｍａｂ)や合成薬物(Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ、Ｌａｐｉｔｉｎｉｂ)が新しい標準治療剤で期待されている。Ｋ−ＲＡＳ突然変異型の肺癌や大膓癌の場合、大部分細胞毒性坑癌化学剤に抵抗する。不幸な事実は、これらＫ−ＲＡＳ突然変異癌が前記標的薬物に対しても抵抗するという点である。そのために、Ｋ−ＲＡＳ突然変異癌の場合、通常の抗癌剤ではない、突然変異Ｋ−ＲＡＳを標的とする新しい薬物、特に遺伝子治療剤の開発が至急な状況である(Ｌｉｎａｒｄｏｕ Ｈ、 Ｄａｈａｂｒｅｈ ＩＪ、 Ｋａｎａｌｏｕｐｉｔｉ Ｄ、Ｓｉａｎｎｉｓ Ｆ、Ｂａｆａｌｏｕｋｏｓ Ｄ、Ｋｏｓｍｉｄｉｓ Ｐ、Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ ＣＡ、Ｍｕｒｒａｙ Ｓ. Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｋ−ＲＡＳ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｓ ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ＥＧＦＲ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｇｅｎｔｓ: ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ. Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ. ２００８; ９(１０):９６２−７２; Ｂｅｐｌｅｒ Ｇ、Ｂｅｇｕｍ Ｍ、Ｓｉｍｏｎ ＧＲ. Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ−ｂａｓｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ. ２００８ Ａｐｒ;１５(２):１３０−９)。
前記文献の考察によって、Ｋ−ＲＡＳの突然変異を正確で且つ迅速であり、低コストで、大単位検索することができるＤＮＡマイクロアレイの開発が重要であることが分かる。本実施例では、Ｋ−ＲＡＳ遺伝子をモデルとして、本発明のＹ字型プローブの変形型を集積したＤＮＡマイクロアレイを利用して突然変異を分析した。
本実施例では、Ｙ字型プローブの左側は除去し、右側は調査しようとする標的遺伝子の突然変異部位検索用プローブを組成したｄ字型のプローブを使用した(図２２)。この時、右側に突然変異の有無を検査しようとする塩基別でＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの各々の塩基を分析することができる特異なプローブ(ｅａｃｈ ｂａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｂｅ)を作り、この時、変異部位の塩基をプローブの中心部位において、プローブの長さは、１５乃至３０ｂｐにして製作して、これを集積してマイクロアレイを作る。検体からＤＮＡを分離し、標的遺伝子であるＫ−ＲＡＳに対してＣｙ−３またはＣｙ−５で蛍光標識しながらＰＣＲを行った後、マイクロアレイ上に乗せてハイブリダイゼーションを行った後、スキャナで蛍光シグナルを分析して完全に一致するスポットのプローブを探す。これによって、変異を見ようとする塩基配列が、Ａであるか、Ｃであるか、Ｇであるか、Ｔであるか、すなわち、正常型(ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ)であるか変異型(ｍｕｔａｎｔ ｔｙｐｅ)であるかを確認することができる。
本発明のＤＮＡマイクロアレイを利用してＫ−ＲＡＳ遺伝子の突然変異可否を正確に把握することができる。したがって、肺癌や膵膓癌、大膓癌診断に役に立つ。また、この場合の癌患者は予後が不良であることを予測することができる。また、ＥＧＦＲ遮断薬剤や抗体薬剤は、耐性が高いので避けるように指示することができる。これは、本発明のＤＮＡマイクロアレイが癌の診断と予後評価、治療方法決定に役に立つことを立証する。
１３.１. プローブの準備とＤＮＡマイクロアレイの製作
本発明のｄ字型プローブを、下記表１７のように製作した。コドン１２に対して正常型１個と変異型６個のプローブを組成し、別個に陽性対照プローブも１個追加で組成した。
表１７ Ｋ−ＲＡＳコドン１２のｄ字型プローブの配列
Ｋ−ＲＡＳ ＤＮＡマイクロアレイのグリッド配列は、図２３のようにした。表１７から確認できるように、陽性対照群(ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｐ/Ｃ)は、Ｋ−ＲＡＳのｃＤＮＡの中で突然変異が現われるコドン１２と１３、５９、６１を避けてコドン１８から２３までをプローブでデザインしたので、突然変異の有無に関係なくＫ−ＲＡＳのＰＣＲが正常であれば必ず現われる。すなわち、これは陽性対照プローブであり、一種のコーナーマーカー(ｃｏｒｎｅｒ ｍａｒｋｅｒ)の役目もする。
１３.２. 検体準備及びＤＮＡ分離
まず、Ｋ−ＲＡＳ突然変異の有無と様相が明らかになったヒト癌細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｕｏｎ(ＡＴＣＣ)社から購入して標準検体で使用した。その内容は、前記表１７のようである。また、肺癌患者１０例、大膓癌患者１０例、膵膓癌患者３例から、各々パラフィン包埋組織と末梢静脈血２０ｍｌを得て、前者では微細剥離(ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ)で癌細胞部分を分離し、後者では血漿を分離した。各検体から公知の方法でＤＮＡを分離して精製した(Ｇｉｌｊｅ Ｂ、Ｈｅｉｋｋｉｌａ Ｒ、Ｏｌｔｅｄａｌ Ｓ、Ｔｊｅｎｓｖｏｌｌ Ｋ、Ｎｏｒｄｇａｒｄ Ｏ. Ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｌａｍｐ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｋ−ｒａｓ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ. ２００８ １０(４):３２５−３１)。
１３.３. ＰＣＲ
滅菌された３次蒸溜水、検体ＤＮＡ、Ｋ−ＲＡＳのプライマー(正方向プライマー：５’−ＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧ−３'、逆方向プライマー：５’−ＣＹ−５−ＣＴＡＴＴＧＴＴＧＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＧ−３')を一緒に一つのチューブに入れてＰＣＲを実行した。下記表１８の組成及び条件によって、０.２ｍｌ ＰＣＲチューブにＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅを加えてＰＣＲ反応を実行した。
表１８ Ｋ−ＲＡＳ ＤＮＡマイクロアレイのためのＰＣＲの条件
１３.４. ハイブリダイゼーション反応と分析
得られたＰＣＲ産物をマイクロアレイ上に乗せて前の実施例と同一な方法でハイブリダイゼーション反応を行った後、スキャナを利用して分析した。これと共に、ＰＣＲ産物を公知の方法で塩基配列を分析して比較分析した。
分析結果、本発明のＤＮＡマイクロアレイは、標準物質から全て正確にＫ−ＲＡＳのコドン１２の遺伝子型を把握した。パラフィン包埋癌組織の検査において、２３例の中で１１例でＫ−ＲＡＳの突然変異が発見されて、マイクロアレイと配列分析が全て一致した結果を示した。血液検体の検査において、前述の癌潮職陽性例の１１例のうち１０例はＤＮＡマイクロアレイで確認されて、また、８例は、シーケンス分析でもＫ−ＲＡＳ突然変異が確認された。図２３に、Ｋ−ＲＡＳ ＤＮＡマイクロアレイの分析例のイメージを示した。肺癌患者の血液検体の結果から、Ｋ−ＲＡＳコドン１２価ＧＴＴからＡＧＴ(Ｇｌｙ １２ Ｓｅｒ)に突然変異されたことが分かって、これは配列分析でも確認された。
ＤＮＡマイクロアレイを利用した癌遺伝子の突然変異検索
本発明の実施例１４でも、ＤＮＡマイクロアレイでＡＳＨ反応を通じてＫ−ＲＡＳの突然変異を分析する方法を示す。ここでは、プローブの構造と分析方法だけを異にした。
本実施例では、Ｙ字型プローブの右側は調査しようとする標的遺伝子の順方向で突然変異部位検索用プローブを組成して、左側には標的遺伝子の反対側らせん(ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｓｔｒａｎｄ)で突然変異がない部分を選択して内部対照プローブ(ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｒｏｂｅ)を組成する。この時、右側に突然変異可否を検査しようとする塩基別にＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの各々の塩基を分析することができる特異なプローブを作り、変異部位の塩基をプローブの中心部位において、プローブの長さは、短く１５乃至２５bｐにして製作して、これを集積してマアクロアレイを作る。検体からＤＮＡを分離し、標的遺伝子であるＫ−ＲＡＳの変異を調査する順方向に対してはＣｙ−３を標識、反対側らせんの対照遺伝子配列に対してはＣｙ−５など他の蛍光を標識しながらＰＣＲを実行する。以後マイクロアレイ上に乗せてハイブリダイゼーションを行った後、スキャナで蛍光シグナルを分析する。この時、前の実施例のように、バックグラウンドノイズ対比対照プローブのシグナルを正常化処理して、同様に検査用プローブのシグナルも正常処理して分析する。
１４.１. プローブの準備とＤＮＡマイクロアレイの製作
本発明のＹ字型プローブを下記表１９のように製作した。コドン１２に対して正常型１個、変異型６個に対してプローブを組成し、別個に陽性対照プローブも１個追加で組成した。
表１９ Ｋ−ＲＡＳコドン１２のＹ字型プローブの配列
１４.２. 検体準備とＤＮＡ分離及びＰＣＲ
各検体からＤＮＡを分離し精製した後、蛍光染料を入れながらＰＣＲを実行した。突然変異分析用のセンスストランドはＣｙ−３で標識して、対照遺伝子用のアンチセンスストランドはＣｙ−５で標識して、一つのＰＣＲを実行すれば、標的遺伝子で変異を見ようとする部位はＣｙ−３が付いて増幅されて、アンチセンスストランドの対照部位遺伝子はＣｙ−５が付いて増幅される。ＰＣＲのプライマーの配列は、正方向プライマーは、５’−Ｃｙ−５−ＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧ−３'にして、逆方向プライマーは、５’−Ｃｙ−３−ＣＴＡＴＴＧＴＴＧＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＧ−３'にして、一つのチューブに入れてＰＣＲを実行した。ＰＣＲは、初期変性(ｉｎｉｔｉａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ)を９６℃で３分行った後、３５ｃｙｃｌｅほど増幅した。各反応は、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で３０秒ずつ行って、最後の延長(ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ)は７２℃で５分間実行した。
１４.３. ハイブリダイゼーション反応及び分析
前記得られたＰＣＲ産物を、実施例１３のような方法で、ハイブリダイゼーション反応を行った後スキャナを利用して分析した。
分析は、前述の実施例で記述した方法を適用して、各スポットでバックグラウンドシグナルを除去した後、Ｃｙ−５対比Ｃｙ−３の、すなわち、正常化処理したシグナルのＣＹ−５対比Ｃｙ−３のシグナルを調査し、これに基づいて適正限界値(ｃｕｔ ｏｆｆ ｌｅｖｅｌ)を超えるシグナルを示すスポットを探した。これが完全一致対照遺伝子(ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ ａｌｌｅｌｅ)になる。これによって、野生型であるか変異型であるかを確認して正確な塩基を把握することができ、混合型も把握が可能である。
本発明のＫ−ＲＡＳマイクロアレイは、スパイク実験(ｓｐｉｋｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ)から見る時、検体内に正常型遺伝子対比変異遺伝子が１％のみ含まれていても確認が可能である。
以上、本発明の実施例を部分的に記述したが、これはあくまでも例示に過ぎず、本発明の思想から逸脱しない範囲で様々な変形と変更が可能であるという事実は当業者には明らかである。また、そのような変形と変更が全部本発明の権利範囲に属することは、添付した請求の範囲でより明らかになる。

Claims (47)

  1. 一つの本体に２個のプローブ部位を有すること
    を特徴とするＹ字型のヌクレオチドプローブ。
  2. 前記プローブは、５’→３'の方向に、そして左側上方から右側上方への方向に順に、(１)左側プローブ部位、(２)左側幹部位、(３)リンカー部位、(４)右側幹部位及び、(５)右側プローブ部位からなること
    を特徴とする請求項１に記載のプローブ。
  3. 請求項２によるプローブの、(１)左側プローブ部位は除去され、(２)左側幹部位、(３)リンカー部位、(４)右側幹部位及び、(５)右側プローブ部位からなること
    を特徴とするｄ字型のヌクレオチドプローブ。
  4. 請求項２によるプローブの、(５)右側プローブ部位は除去され、(１)左側プローブ部位、(２)左側幹部位、(３)リンカー部位及び、(４)右側幹部位からなること
    を特徴とするｂ字型のヌクレオチドプローブ。
  5. 前記左側幹部位と右側幹部位は、お互いに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで結合した構造であり、前記左側幹部位または右側幹部位は、各々に対する全体の塩基配列のうちＧ塩基が半分以上含まれること
    を特徴とする請求項２乃至請求項４のいずれか１項に記載のプローブ。
  6. 前記左側幹部位と右側幹部位は、お互いに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで結合した構造であり、幹部位の塩基配列がテロメアの塩基配列を含むこと
    を特徴とする請求項２乃至請求項４のいずれか１項に記載のプローブ。
  7. 前記左側幹部位または右側幹部位は、下記の塩基単位体からなる群より選択される塩基単位体が１回以上繰り返してなること
    を特徴とする請求項５に記載のプローブ。
    ＴＴＧＧＧ、
    ＴＡＧＧＧ、
    ＴＴＧＧＧＧ、
    ＴＴＴＧＧＧ、
    ＴＴＡＧＧＧ、
    ＴＴＴＧＧＧＧ、
    ＴＴＴＡＧＧＧ、
    ＴＴＴＴＧＧＧＧ、
    ＴＴＴＡＧＧＧＧ。
  8. 前記左側プロブ部位または右側プロブ部位は、標的遺伝子に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであること
    を特徴とする請求項２乃至請求項４のいずれか１項に記載のプローブ。
  9. 前記左側プロブ部位または右側プロブ部位は、１５個乃至１５０個の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであること
    を特徴とする請求項２乃至請求項４のいずれか１項に記載のプローブ。
  10. 前記左側プローブ部位は、上方から下方への塩基配列が５’→３'の手順に配列され、前記右側プローブ部位は、下方から上方への塩基配列が５’→３'の手順に配列されること
    を特徴とする請求項２乃至請求項４のいずれか１項に記載のプローブ。
  11. 前記リンカー部位は、アルデヒドコーディングされた固体支持体に結合するために、アミノ変形ジデオキシチミジンとしてＣ６ｄＴ、Ｃ３ｄＴ、Ｃ１２ｄＴまたはＣ１８ｄＴで構成されること
    を特徴とする請求項２乃至請求項４のいずれか１項に記載のプローブ。
  12. 前記プローブは、ペプチド核酸(ＰＮＡ)からなること
    を特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載のプローブ。
  13. 前記プローブは、１)脱トリチル段階(ｄｅｔｒｉｔｙｌａｔｉｏｎ)、２)カップリング段階(ｃｏｕｐｌｉｎｇ)、３)キャッピング段階(ｃａｐｐｉｎｇ)及び、４)酸化段階(ｏｘｉｄａｔｉｏｎ)を含む合成方法により製造されること
    を特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載のプローブ。
  14. 前記左側プローブ部位と右側プローブ部位は、一つの標的遺伝子内の２個の相違である部位に対して各々相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなること
    を特徴とする請求項１又は請求項２に記載のプローブ。
  15. 前記左側プローブ部位と右側プローブ部位は、各々一つの標的遺伝子内の同一な部位に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなること
    を特徴とする請求項１又は請求項２に記載のプローブ。
  16. 前記左側プローブ部位と右側プローブ部位は、相違である標的遺伝子に対して各々相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなること
    を特徴とする請求項１又は請求項２に記載のプローブ。
  17. 前記左側プローブ部位と右側プローブ部位の中で、一方のプローブ部位は、標的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、残り一方のプローブ部位は、対照遺伝子に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなること
    を特徴とする請求項１又は請求項２に記載のプローブ。
  18. 本発明の前記対照遺伝子は、標的遺伝子と相補性がなく、検体で存在または発現されないこと
    を特徴とする請求項１７に記載のプローブ。
  19. 前記対照遺伝子は、大膓菌のｍｏｔＤ遺伝子であること
    を特徴とする請求項１７に記載のプローブ。
  20. 前記プローブは、配列番号５乃至５０中で一つ以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであること
    を特徴とする請求項１又は請求項２に記載のプローブ。
  21. 請求項１乃至請求項４のいずれか１項のプローブが固型支持体に集積(ｓｐｏｔｔｉｎｇ)されてなること
    を特徴とするＤＮＡマイクロアレイ。
  22. 前記固型支持体は、スライドガラス、ビーズ、マイクロプレートウェル、シリコーンウェハ及びナイロンメンブレンからなる群より選択されること
    を特徴とする請求項２１に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
  23. 前記ＤＮＡマイクロアレイは、ヒトベータグロビン遺伝子がさらに集積されていること
    を特徴とする請求項２１に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
  24. 前記プローブの集積部位としてウェル(ｗｅｌｌ)が８個に区画されていること
    を特徴とする請求項２１に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
  25. 前記プローブは、配列番号５乃至５０の中で一つ以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、ＨＰＶの探知及び遺伝子型分析用であること
    を特徴とする請求項２１に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
  26. 前記プローブは、５’末端がＣｙ５で標識された配列番号４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと、５’末端がＣｙ３で標識された配列番号１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと、相補的に結合すること
    を特徴とする請求項２５に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
  27. 前記プローブは、配列番号５１乃至５５の中で一つ以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、性感染疾患(ＳＴＤ)の原因菌として、各々淋菌(ＮＧ)、クラミジアトラコマチス(ＣＴ)、ヘルペスシンプレックスウイルス(ＨＳＶ)、トレポネマパリダム(ＴＰ)及びヘモフィルスデュクレイ(ＨＤ)の探知及び遺伝子型分析用であること
    を特徴とする請求項２１に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
  28. 前記プローブは、配列番号５６乃至１９９の中で一つ以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、インフルエンザＡ型ウイルスの探知及び遺伝子型分析用であること
    を特徴とする請求項２１に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
  29. 前記プローブは、配列番号２１２乃至２１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、上皮細胞成長因子受容体(ＥＧＦＲ)とβ−アクチン遺伝子の発現分析用であること
    を特徴とする請求項２１に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
  30. 前記プローブは、左側プローブ部位と右側プローブ部位の中でいずれの一方が標的核酸のセンスストランドの単一ヌクレオチド多形成(ＳＮＰ)部位に対して相補的なオリゴヌクレオチドからなり、残りの一方が標的核酸のアンチセンスストランドのＳＮＰ部位がない部位に対して相補的なオリゴヌクレオチドからなり、ＳＮＰ分析用であること
    を特徴とする請求項２１に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
  31. 前記プローブは、配列番号２２０乃至２３９の中で一つ以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、ＡＣＥ、ＡＤＲＢ２、Ａｐｏ Ｅ、ＣＥＴＰ、ＣＦＨ、ＥＳＲ１、ＩＬ１Ａ、ＭＴＨＦＲまたはＮＯＳ３遺伝子のＳＮＰ分析用であること
    を特徴とする請求項３０に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
  32. 前記プローブは、配列番号２５８乃至２７２の中で一つ以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の突然変異分析用であると
    を特徴とする請求項２１に記載の ＤＮＡマイクロアレイ。
  33. 前記ｄ字型プローブは、右側プローブ部位がＡ、Ｃ、ＧまたはＴの点突然変異に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなり、この時、点突然変異に相補的な塩基を右側プローブ部位の中心部位に位置させて、右側プローブ部位の長さは、１５乃至３０ｂｐであり、点突然変異分析用であること
    を特徴とする請求項２１に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
  34. 請求項２１の前記ＤＮＡマイクロアレイ、検体の標的遺伝子に対するＰＣＲ反応用プライマーセットとバッファー及び、ハイブリダイゼーション反応用バッファーを含むこと
    を特徴とする検体の遺伝子分析用キット。
  35. 前記ＰＣＲ反応用プライマーセットは、インフルエンザウイルスＡ型ウイルスの遺伝子増幅用として、配列番号２０８乃至２１１の中で選択される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであること
    を特徴とする請求項３４に記載のキット。
  36. 本発明の前記ＰＣＲ反応用プライマーセットは、β-アクチンとＥＧＦＲ遺伝子の定量型リアルタイムＰＣＲ用として、各々配列番号２１４及び２１５、配列番号２１７及び２１８の塩基配列を有するオリゴヌクレオデドであること
    を特徴とする請求項３４に記載のキット。
  37. 前記ＣＲ反応用プライマーセットは、ＳＮＰ検出用として、配列番号２４０乃至２５７の中で２個以上選択される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであること
    を特徴とする請求項３４に記載のキット。
  38. 前記キットは、疾病の診断、予防、予測またはオーダーメイド治療用であること
    を特徴とする請求項３４に記載のキット。
  39. 請求項２１のＤＮＡマイクロアレイ上に、標識物質で標識された検体の標的核酸を乗せて、前記プローブと標的核酸をハイブリダイゼーションさせる段階を含むこと
    を特徴とする遺伝子分析方法。
  40. 前記標識物質は、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５.５、Ｂｏｄｉｐｙ、Ａｌｅｘａ ４８８、Ａｌｅｘａ ５３２、Ａｌｅｘａ ５４６、Ａｌｅｘａ ５６８、Ａｌｅｘａ ５９４、Ａｌｅｘａ ６６０、ロダミン(Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ)、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、Ｆｌｕｏｒ Ｘ、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｏｒａｎｇｅ ｇｒｅｅｎ ４８８Ｘ、Ｏｒａｎｇｅ ｇｒｅｅｎ ５１４Ｘ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、Ｏｙｓｔｅｒ ５５６、Ｏｙｓｔｅｒ ６４５、Ｂｏｄｉｐｙ ６３０/６５０、Ｂｏｄｉｐｙ ６５０/６６５、Ｃａｌｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５４６、Ｃａｌｆｌｕｏｒ ｒｅｄ ６１０、Ｑｕａｓａｒ ６７０及びビオチンからなる群より一つ以上選択されること
    を特徴とする請求項３９に記載の遺伝子分析方法。
  41. 前記標的核酸は、ＰＣＲ，ＲＴ−ＰＣＲまたは試験管内転写(ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ)方法を利用して標識物質で標識されること
    を特徴とする請求項３９に記載の遺伝子分析方法。
  42. 前記ハイブリダイゼーション反応後に蛍光スキャナを利用して標識物質のシグナルを分析し、標的核酸の発現程度を調査する段階をさらに含むこと
    を特徴とする請求項３９に記載の遺伝子分析方法。
  43. 前記シグナル分析は、正常化過程(ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ)を経て分析すること
    を特徴とする請求項４２に記載の遺伝子分析方法 。
  44. 前記正常化過程は、各スポットでバックグラウンドのノイズシグナルを除外してＣｙ５とＣｙ３のシグナルを調査し、更にハウスキーピング遺伝子としてβ−アクチン遺伝子のＣｙ３シグナルと比較する３重の正常化過程であること
    を特徴とする請求項４３に記載の遺伝子分析方法 。
  45. 前記標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡからなる群より選択されること
    を特徴とする請求項３９に記載の遺伝子分析方法 。
  46. 前記ｃＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＴを通じてＣｙ３で標識して、前記ｃＲＮＡは、試験管内転写を通じてＣｙ３で標識すること
    を特徴とする請求項４５に記載の遺伝子分析方法 。
  47. 前記Ｃｙ３で標識されたｃＤＮＡまたはｃＲＮＡに、外部対照物質(ｅｘｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ)として大膓菌のｍｏｔＤ遺伝子をＣｙ５で標識したものを混合して得た混合物をハイブリダイゼーションすること
    を特徴とする請求項４６に記載の遺伝子分析方法 。
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