KR101689390B1 - Hpv, 클라미디아 트라코마티스 및 임질균 동시 분자진단키트 - Google Patents

Hpv, 클라미디아 트라코마티스 및 임질균 동시 분자진단키트 Download PDF

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Abstract

인유두종 바이러스, 나이세리아 고노레아, 및 클라미디아 트라코마티스의 표적 서열을 증폭하기 위한 프라이머 세트, 그를 포함하는 조성물, 키트, 인유두종 바이러스, 및 나이세리아 고노레아, 및 클라미디아 트라코마티스의 표적 서열을 증폭 또는 검출하는 방법을 제공한다.

Description

HPV, 클라미디아 트라코마티스 및 임질균 동시 분자진단키트{A molecular simultaneous diagnostic kit for human papilloma virus, Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae}
인유두종 바이러스, 나이세리아 고노레아, 및 클라미디아 트라코마티스의 표적 서열을 증폭하기 위한 프라이머 세트, 그를 포함하는 조성물, 키트, 인유두종 바이러스,및 나이세리아 고노레아, 및 클라미디아 트라코마티스의 표적 서열을 증폭 또는 검출하는 방법에 관한 것이다.
인유두종 바이러스 (Human papilloma viruses: HPV)는 환상의 이중나선 바이러스로서, 20면체의 비리온 과 8000 여개의 염기쌍으로 이루어진 원형의 DNA를 가지며, 원형의 DNA 분자는 외피 단백질로 둘러싸여 있는데, 4.5 kb 의 초기 유전자 (early gene) 및 2.4 kb 후기유전자 (late gene)를 포함한다.
HPV는 여성의 자궁 경관, 질, 외음부, 요도 또는 항문 주위에서 감염될 수 있다. 현재 70개 이상의 HPV 타입이 동정되었고, 일반적으로 암과의 연관성 정도와 자궁경부 상피 내 종양의 고 위험군 (CIN 2-3)으로 전이되는 기전을 기준으로 고 위험군과 저 위험군으로 분류하게 된다.
여성의 생식계에는 Condyloma, Bowenoid papulosis, 자궁경관, 질 또는 외음부의 상피 내 종양과 암과 같은 많은 질병과 연관된 특정 유전형의 HPV가 존재한다. 이 Virus들은 성적인 접촉을 통해서 전염되고, 고 위험군 HPV는 자궁 경부암으로 발전되는 주된 위험 요소이다.
HPV 감염은 대부분 가역적인 세포학적 변화를 수반한다. HPV DNA는 정상 자궁경부 상피세포를 가진 여성의 대략 10% 정도에서 발견되지만 사실상 나이와 인구학적 변동에 크게 영향을 받는 특정 집단의 여성들에게 널리 퍼져있다. 16세에서 60세를 대상으로 한 연구결과를 보면 HPV 양성 여성 중 5-28%가 2년 안에 CIN 1-3 이나, 암으로 설명되어지는 편평상피 내 상해 (SIL)를 입게 되는 반면, HPV 음성 여성은 1-3%만이 상해를 가져왔고 특히, HPV 타입 16,18은 다른 HPV 타입 보다 위험 진행이 약 40% 빠르게 진행되었다.
매우 적은 수의 HPV DNA 양성 여성만이 CIN 2-3이나, 암의 전단계를 나타내는 세포학적으로 높은 수준의 상해 (HSIL)를 입었다. 현재의 과학적 보고서는 고위험군 HPV 유전형을 악성 종양과 암으로 진행시키는 주된 요소라고 제시하고 있다. 팝 스미어 (pap smear) 결과가 음성이고 고위험군 HPV 음성을 나타냈던 여성이 하나 또는 여러 유전형의 HPV에 지속적으로 감염되거나 재감염되었을 때 팝 스미어 결과가 양성으로 나타나거나 자궁경부암의 전단계로 발전한다고 명백히 주장하고 있다.
HPV의 유전자를 검출하기 위한 검사는 세포 검사의 결과가 정상으로 나왔다하더라도 자궁경부 종양으로 발전되는 어느 시점의 양성단계를 의미할 수 있으므로 비록 임상적으로 양성의 명확한 기간을 정의하기에 불충분하지만 그 위험성을 평가하는데 있어서는 매우 의미가 깊다.
고위험군 인유두종 바이러스는 경부암 (cervical cancer) 환자에서 99.7 %의 비율로 나타나는 것으로 알려져 있다. 따라서 고위험군 인유두종 바이러스 검사는 경부암의 일차 검색 (primary screening) 검사와 여성의 경부 상처 (cervical lesion)를 관리하는 검사로서 중요하다.
임질균 (Neisseria gonorrhoeae:NG)은 생식관계동(genital tract)의 감염을 가장 빈번하게 일으키는 성적 접촉을 통해 전염되는 질병 (Sexually Transmitted Disease: STD) 중 가장 중요한 병원균이다.
클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis:CT)는 생식기계통의 감염을 가장 빈번하게 일으키는 STD중의 한 병원균이다. CT는 감염 초기에 치료하지 않으면 골반염증, 자궁 외 임신 등의 심각한 후유증을 남길 수 있다.
위와 같이, 고위험군 인유두종 바이러스, 클라미디아 트리코마티스, 및 임질균은 STD 중에서도 가장 중요한 감염성 질환으로서, 이들을 동시에 효율적으로 검출할 수 있는 방법이 요구되고 있다.
일 양상은 시료 중의 HPV, NG 및 CT의 표적 서열을 효율적으로 증폭하기 위한 다중 PCR용 프라이머 세트를 제공한다.
다른 양상은 시료 중의 HPV, NG 및 CT의 표적 서열을 효율적으로 증폭하기 위한 다중 PCR용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 시료 중의 HPV, NG 및 CT의 표적 서열을 효율적으로 증폭하기 위한 다중 PCR용 키트를 제공한다.
다른 양상은 시료 중의 HPV, NG 및 CT의 표적 서열을 효율적으로 증폭하기 위한 방법을 제공한다
다른 양상은 시료 중의 HPV, NG 및 CT의 표적 서열을 효율적으로 검출하는 방법을 제공한다.
일 양상은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제1 프라이머; 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제2 프라이머; 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제3 프라이머; 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제4 프라이머; 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제5 프라이머; 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제6 프라이머; 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제7 프라이머; 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제8 프라이머; 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제9 프라이머; 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제10 프라이머; 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제11 프라이머; 및 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제12 프라이머;를 포함하는, 시료 중의 HPV, NG 및 CT의 표적 서열을 증폭하기 위한 다중 PCR용 프라이머 세트를 제공한다.
본 명세서에 있어서, HPV, NG 및 CT는 각각 인유두종 바이러스(human papilloma virus) 또는 인유두종 바이러스, 나이세리아 고노레아 (Neisseria gonorrhoeae) 또는 임질균, 및 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis)와 상호 교환가능하게 사용된다. 상기 시료는 개체로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 원숭이, 침팬지와 같은 유인원, 개, 말,소, 돼지, 양, 고양이, 마우스, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 시료는 사람의 생식기로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 생식기는 질, 자궁, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 시료는 질, 또는 자궁 스왑일 수 있다.
상기 프라이머 세트에 있어서, 제1 내지 제6 프라이머 세트는 HPV L1 영역을 증폭하기 위한 센스 프라이머이며, 제9 및 제10 프라이머는 HPV L1 영역을 증폭하기 위한 안티센스 프라이머이다. 또한, 제7 및 제8 프라이머는 각각 NG 16S rRNA 영역과 CT 16S rRNA 영역을 증폭하기 위한 센스 프라이머이고, 제11 및 제12 프라이머는 각각 NG 16S rRNA 영역과 CT 16S rRNA 영역을 증폭하기 위한 안티센스 프라이머이다.
상기 프라이머 세트는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제13 프라이머; 및 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제14 프라이머;를 더 포함할 수 있다. 제13 및 제14 프라이머는 내부 표준 프라이머로서 사람 β-글로빈 영역을 증폭하기 위한 센스 및 안티센스 프라이머이다.
이들 프라이머에 대하여는 표 2에 상세하게 기재하였다. 이들 프라이머 세트는 증폭 반응액에 동시에 존재하여 표적 핵산과의 혼성화 및 연장이 이루어질 수 있는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 프라이머 세트는 14개 프라이머를 사용한 다중 PCR에서도 프라이머 이량체, 및 간섭을 일으키지 않고 표적 핵산을 증폭할 수 있는 예기치 않은 효과를 갖는 것이다.
본 명세서에 있어서, 용어 "폴리뉴클레오티드 (polynucleotide)"는 DNA, RNA 또는 그 혼성체 (hybrid)일 수 있다. 또한 상기 폴리뉴클레오티드는 검출가능한 표지가 부착된 것을 포함한다. 검출가능한 표지는 광학적 표지, 전기적 표지, 방사능 표지, 기질을 검출가능한 물질로 전환할 수 있는 효소, 억제된 (quenched) FRET 쌍 염료, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 프라이머 세트에 있어서, 제9 프라이머, 제10 프라이머, 제11 프라이머, 제12 프라이머, 및 제14 프라이머는 5'-말단에 검출가능한 표지 물질에 특이적으로 결합하는 물질이 부착된 것일 수 있다. 5'-말단에 검출가능한 표지 물질에 특이적으로 결합하는 물질은 검출가능한 표지 물질, 예를 들면, 광학적 표지, 전기적 표지, 방사능 표지, 기질을 검출가능한 물질로 전환할 수 있는 효소, 억제된 (quenched) FRET 쌍 염료, 또는 그 조합에 결합하는 물질일 수 있다. 예를 들면, 5'-말단에 검출가능한 표지 물질에 특이적으로 결합하는 물질은 비오틴 또는 스트렙트아비딘이고, 검출가능한 표지 물질은 스트렙트아비딘 또는 비오틴-접합된 기질을 발색물질로 전환하는 효소일 수 있다. 상기 효소는 예를 들면, 알칼리 포스파타제, 베타-글루코시다제, 퍼옥시다제, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 프라이머 세트는 청구항 1에 있어서, 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제1 프로브; 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제2 프로브; 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제3 프로브; 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제4 프로브; 서열번호 19의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제5 프로브; 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제6 프로브; 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제7 프로브; 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제8 프로브; 서열번호 23의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제9 프로브; 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제10 프로브; 서열번호 25의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제11 프로브; 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제12 프로브; 서열번호 27의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제13 프로브; 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제14 프로브; 서열번호 29의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제15 프로브; 서열번호 30의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제16 프로브; 서열번호 31의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제17 프로브; 서열번호 32의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제18 프로브; 서열번호 33의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제19 프로브; 및 서열번호 34의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제20 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 프로브를 더 포함하는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기한 프라이머 세트를 포함하는, 시료 중의 HPV, NG 및 CT의 표적 서열을 다중 PCR에 의하여 증폭 또는 검출하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 조성물에 있어서, 상기 프로브는 막에 서로 구분되는 특정한 위치에 고정된 것일 수 있다. 상기 막은 니트로셀룰로즈 막일 수 있다.
다른 양상은 상기한 프라이머 세트를 포함하는, 시료 중의 HPV, NG 및 CT의 표적 서열을 다중 PCR에 의하여 증폭 또는 검출하기 위한 키트를 제공한다.
상기 키트에 있어서, 상기 프로브는 막에 서로 구분되는 특정한 위치에 고정된 것일 수 있다. 상기 막은 니트로셀룰로즈 막일 수 있다. 상기 키트는 시료 중의 HPV, NG 및 CT의 표적 서열을 증폭 및 검출하는데 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 상기 키트는 표적 핵산의 다중 PCR에 의한 증폭과 그 증폭 산물을 라인 블롯팅에 의하여 검출하기 위한 것일 수 있다. 본 명세서에 있어서, "라인 블롯팅 (line blotting)"이란 올리고뉴클레오티드와 같은 폴리뉴클레오티드 프로브가 평행선 (band 모양)으로 공유적으로 부착되어 있는 막에서 표적 핵산과 프로브의 혼성화를 수행하고, 그 혼성화 산물을 검출하는 것을 포함한다. 상기 검출은 증폭된 표적 핵산의 일 가닥의 5'-말단에 검출가능한 표지 물질에 특이적으로 결합하는 물질과 검출가능한 표지 물질 사이의 결합에 의하여 혼성화 산물을 검출가능한 표지 물질에 접합시키고, 그 검출가능한 표지 물질로부터의 신호를 확인하는 것을 포함할 수 있다. 표적 핵산의 구분은 각 프로브의 밴드(band)의 위치에 의하여 이루어질 수 있다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 시료 중의 핵산과 상기한 프라이머 세트를 접촉시켜 혼성화시키고 혼성화 산물을 연장시켜 표적 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하는, 시료 중의 표적 핵산을 증폭하는 방법을 제공한다.
상기 증폭은 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction; PCR)일 수 있다. 본 명세서에 있어서, "PCR"이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법으로서, 혼성화와 변성을 위한 열순환 (thermal cycle)을 포함하는 것일 수 있다. 이러한 PCR 방법은 일반적으로 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. 이러한 PCR 방법에는 한 번에 하나의 표적만을 증폭하는 단일 PCR과 한 번에 복수의 표적을 증폭하는 다중 PCR이 포함된다. 다중 PCR에서는 복수의 프라이머 쌍이 이용된다.
상기 표적 핵산은 HPV의 HPV L1 영역, NG의 16S rRNA 영역, 및 CT의 16s rRNA 영역일 수 있다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 시료 중의 핵산과 상기한 프라이머 세트를 접촉시켜 혼성화시키고 혼성화 산물을 연장시켜 표적 핵산을 증폭시키는 단계 및 상기 증폭된 표적 핵산을 프로브와 혼성화시켜 혼성화 산물을 검출하는 단계를 포함하는 시료 중의 HPV, NG 및 CT의 표적 서열을 검출하는 방법으로서, 상기 프로브는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제1 프로브; 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제2 프로브; 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제3 프로브; 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제4 프로브; 서열번호 19의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제5 프로브; 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제6 프로브; 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제7 프로브; 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제8 프로브; 서열번호 23의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제9 프로브; 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제10 프로브; 서열번호 25의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제11 프로브; 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제12 프로브; 서열번호 27의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제13 프로브; 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제14 프로브; 서열번호 29의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제15 프로브; 서열번호 30의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제16 프로브; 서열번호 31의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제17 프로브; 서열번호 32의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제18 프로브; 서열번호 33의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제19 프로브; 및 서열번호 34의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10 뉴클레오티드 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 제20 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상인 것인 방법을 제공한다.
개체로부터 분리된 시료 중의 핵산과 상기한 프라이머 세트를 접촉시켜 혼성화시키고 혼성화 산물을 연장시켜 표적 핵산을 증폭시키는 단계에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 증폭된 표적 핵산을 프로브와 혼성화시켜 혼성화 산물을 검출하는 단계에서, 상기 프로브는 막에 서로 구분되는 특정한 위치에 고정되어 있고, 상기 검출은 혼성화 산물이 존재하는 것으로 확인된 막 상의 프로브의 위치에 의하여 이루어지는 것일 수 있다. 상기 검출은 라인 블롯팅에 의하여 이루어지는 것일 수 있다. 상기 방법에 있어서, 제9 프라이머, 제10 프라이머, 제11 프라이머, 제12 프라이머, 및 제14 프라이머는 5'-말단에 검출가능한 표지 물질에 특이적으로 결합하는 물질이 부착된 것으로서, 상기 5'-말단에 검출가능한 표지 물질에 특이적으로 결합하는 물질은 비오틴 또는 스트렙트아비딘이고, 상기 검출은 스트렙트아비딘 또는 비오틴-접합된 기질을 발색물질로 전환하는 효소를 혼성화 산물과 접촉시켜 기질을 발색물질로 전환하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 효소는 예를 들면, 알칼리 포스파타제, 베타-글루코시다제, 퍼옥시다제, 또는 그 조합일 수 있다.
일 양상에 따른 프라이머 세트에 의하면, 시료 중의 HPV, NG 및 CT의 표적 서열을 효율적으로 증폭하기 위한 다중 PCR에 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 조성물 또는 키트에 의하면, 시료 중의 HPV, NG 및 CT의 표적 서열을 효율적으로 증폭하기 위한 다중 PCR에 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 시료 중의 표적 핵산을 증폭하는 방법에 의하면, 시료 중의 HPV, NG 및 CT의 표적 서열을 효율적으로 증폭할 수 있다. 이 경우 15 타입의 HPV와 함께 NG 및 CT의 표적 서열을 동시에 증폭할 수 있다.
다른 양상에 따른 시료 중의 HPV, NG 및 CT의 표적 서열을 검출하는 방법의하면, 시료 중의 HPV, NG 및 CT의 표적 서열을 효율적으로 검출할 수 있다. 이 경우 15 타입의 HPV와 함께 NG 및 CT를 동시에 검출할 수 있다.
도 1은 제작된 막 스트립 상의 각 프로브 위치를 나타낸다.
도 2는 HPV 시료를 다중 PCR한 후 전기영동한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 자궁경부 스왑에서 추출한 DNA 시료를 다중 PCR한 후 전기영동하여 NG 양성 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 자궁 경부 스왑에서 추출한 DNA 시료를 다중 PCR한 후 전기영동하여 CT 양성 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 자궁 경부 스왑에서 추출한 DNA 시료에 대하여 상기 프라이머 세트를 사용하여 다중 PCR 한 후 그 산물을 라인 블롯팅한 결과를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
하기 실시예에서는 달리 언급이 없으면 하기 재료 및 방법을 사용하였다.
(1) 라인 블롯팅 을 위한 막 스트립 ( membrane strip )의 제작
HPV 고위험군 15종 유전자형, NG, 및 CT를 검출하는데 사용하기 위한 라인 블롯팅용 막 스트립을 제작하였다.
사용된 프로브는 표 1에 기재된 바와 같다. 이들 프로브는 5' 말단의 -OH가 NH2로 치환되어 있어, 기판 표면 상의 카르보디이미드와 커플링 반응을 할 수 있도록 되어 있다.
명칭 표적 서열 서열번호
hr16 HPV 유전자형 16 15
hr18 HPV 유전자형 18 16
hr31 HPV 유전자형 31 17
hr33 HPV 유전자형 33 18
hr35 HPV 유전자형 35 19
hr39 HPV 유전자형 39 20
hr45 HPV 유전자형 45 21
hr51 HPV 유전자형 51 22
hr52 HPV 유전자형 52 23
hr53 HPV 유전자형 53 24
hr56 HPV 유전자형 56 25
hr58 HPV 유전자형 58 26
hr59 HPV 유전자형 59 27
hr66 HPV 유전자형 66 28
hr68 HPV 유전자형 68 29
NG capture NG 30
CT capture CT 31
universal probe 1 HPV 모든(universal) 유전자형 32
universal probe 2 HPV 모든 유전자형 33
ICP β-글로빈 (내부표준) 34
프로브의 농도는 500mM 소듐 카르보네이트 중 200-800 pmole이었다: 프로브-hr16, 프로브-hr18, 프로브-hr51, 프로브-hr52, 프로브-hr53, 프로브-hr56, 프로브-hr58, 및 프로브-hr59는 200 pmole, 프로브-hr31, 프로브-hr33, 프로브-hr35, 및 프로브-hr39는 400 pmole, 프로브-hr45, 프로브-hr66, 및 프로브-hr68은 500 pmole, universal probe 1, universal probe 2, 및 ICP는 600 pmole, 프로브-NG capture 및 프로브-CT capture는 800 pmole을 사용하였다.
도 1은 제작된 막 스트립 상의 각 프로브 위치를 나타낸다. 이 막 스트립의 구체적인 제작 과정은 다음과 같다:
Miniblotter (Miniblotter, Immunetics)는 사용하기 전에 솔과 전용세정제로 깨끗하게 닦은 다음 공기 중에서 건조시켰다. 막은 글러브 등이 닿지 않도록 하였다. 글로브용 분말은 배경오염의 주요 원인이므로 항상 포르셉 (forcep)을 사용하여 다루었다. 니트로셀룰로즈 막 (NC membrane)은 5cm x 10cm 크기로 잘랐다. 막은 깨끗한 봉투에 실온에서 사용할 때까지 보관하였다.
먼저, 니트로셀룰로즈 막을 증류수로 희석한 16%(g/v) 1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필)카르보디이미드) 히드로클로리드 (EDC) 용액 중에 담그고 실온에서 15분 동안 반응시켰다. 니트로셀룰로즈 막을 꺼내어 흐르는 물에 2분 동안 두어 세척하였다. 이렇게 얻어진 표면이 EDC로 활성화된 니트로셀룰로즈 막을 Miniblotter에 장착하였다. 상기와 같이 지정된 농도의 5' 말단이 NH2로 활성화된 각 프로브 60ul 및 마커 60ul를 도 1에 나타낸 바와 같은 상대적 위치에 첨가하고 약 5분 동안 반응시켜, 각 프로브를 특정 영역의 표면에 부착시켰다. 마커는 제도 펜 잉크 (drawing pen ink)를 희석한 것이다. 반응 후 남은 프로브를 제거한 후, 니트로셀룰로즈 막을 불활성화시키기 위하여, 100mM NaOH 용액 중에 담그고 약 8 내지 9분 미만의 시간 동안 흘들면서 (shaking) 반응시켰다. 니트로셀룰로즈 막을 세척하기 위해서 200ml 2xSSPE-0.1% SDS 용액 중에 담그고 60℃에서 10분 동안 반응시켰다. 얻어진 니트로셀룰로즈 막의 보관성을 좋게 하기 위하여 200ml 20mM 소듐 EDTA (pH 8.0) 용액에 담그고 실온에서 15 분 동안 반응시켰다. 얻어진 니트로셀룰로즈 막을 포일로 밀봉하여 사용 시까지 4℃에 보관하였다. 사용 시에는 니트로셀룰로즈 막을 3mm 넓이로 잘라 사용하였다.
(2) 표적 핵산의 증폭과 혼성화를 통한 검출
검출은 개체의 자궁 경부로부터 자궁 경부 스왑 (cervical swab) 시료를 채취하였다. 시료로부터 세포 파쇄물을 얻고 세포 파쇄물 중의 DNA를 주형으로 하고, 비오틴 표지된 프라이머를 프라이머로 사용한 PCR을 통하여 표적 핵산을 증폭하였다. 표적 핵산을 변성시키고, 니트로셀룰로즈 막 중의 HPV, NG 및 CT 프로브와 혼성화시켰다. 혼성화 산물을 알칼리 포스파타제 접합된 스트렙트아비딘 (Streptavidin-AP)과 반응시켜, Streptavidin-AP-biotin-혼성화 산물 복합체를 얻었다. 상기 복합체를 알칼리 포스파타제의 기질인 NBT/BCIP (p-nitroblue tetrazolium chloride: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)와 반응시켜 기질을 발색 물질 물질로 전환시켜, 발색되도록 하였다. 니트로셀룰로즈 막 중 발색이 나타낸 밴드 위치를 육안으로 확인하고, 이를 기준 밴드와 비교하여 표적 핵산의 유무를 결정하였다. 이때 개체는 임상적으로 HPV, CT 및 NG 양성 및 음성으로 확인된 개체를 포함한다.
구체적으로, 채취된 자궁 경부 스왑 시료를 잘 흔들어 섞은 다음 100ul를 PBS 1ml에 첨가하고 보르텍스 믹서 (vortex mixer)를 이용하여 강하게 섞었다. 세포의 존재를 육안으로 확인하였다. 시료를 1,2000rpm에서 1 분 동안 원심력을 가하여 침전시킨 후, 약 100ul가 남을 정도로 상청액을 버렸다. 이때 가라앉은 세포가 딸려가지 않도록 주의하였다. 시료에 3.3% (g/v) Triton X-100이 미리 첨가된 프로테나제 K (proteinse K) (200ul/ml) 40ul를 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 프로테나제 K를 불활성화시키기 위하여 95℃로 가열하여 10 분 동안 반응시켰다. 얻어진 세포 파쇄물 10ul를 PCR 시료로 사용하였다. PCR 반응 혼합물 50ul는 세포 파쇄물 10ul, DNA 폴리머라제 2.5U, dNTP 250uM, Tris-HCl (pH 9.0) 10mM, KCl 30mM, MgCl2 1.5mM, 각 프라이머 200pmole, 및 증류수 잔량을 포함한다. PCR의 열순환 조건은 95℃에서 10분; 94℃에서 30초, 50℃에서 20초, 및 38℃에서 20초 및 70℃에서 40초를 40회; 및 72℃에서 7분을 수행한 후 4℃에서 보관하였다.
상기 PCR에 사용된 프라이머는 표 2와 같은 특성을 가지고 있으며, 14개를 사용한 다중 PCR에서도 프라이머 이량체, 및 간섭을 일으키지 않고 표적 핵산을 증폭할 수 있는 예기치 않은 효과를 갖는 것이다.
명칭 방향성 서열번호 표적 서열 크기(bp) Tm (℃) 추정 PCR 산물
길이 (bp)
HPV-G51 센스 1 HPV L1 영역 23 43.8 145
HPV-G52 센스 2 HPV L1 영역 23 46.1 145
HPV-G53 센스 3 HPV L1 영역 23 43.2 145
HPV-G54 센스 4 HPV L1 영역 23 43.4 145
HPV-G55 센스 5 HPV L1 영역 23 43.2 145
HPV-G56 센스 6 HPV L1 영역 23 45.6 145
NGPF 센스 7 NG 16S rRNA 33 61.9 145
CTPF 센스 8 CT 16S rRNA 33 55 145
HPV-GP61 안티센스 9 HPV L1 영역 25 45.9 145
HPV-GP6c 안티센스 10 HPV L1 영역 25 50.6 145
NGPR 안티센스 11 NG 16S rRNA 27 59.1 420
CTPR 안티센스 12 CT 16S rRNA 27 52.3 192
MS3F 센스 13 β-글로빈 20 39.3 250
MS10R 안티센스 14 β-글로빈 20 39.2 250
이렇게 얻어진 PCR 증폭 산물로부터 예상되는 표적 핵산인 HPV 145bp, CT 192bp 및 NG 420bp 크기의 증폭 산물을 확인하였다. HPV L1 영역은 바이러스 주외피 단백질 (L1)을 코딩하는 영역을 나타낸다.
증폭된 표적 핵산의 라인 블롯팅 혼성화를 통한 검출은 다음과 같이 수행하였다. 모든 시약은 사용 전에 침전 등을 확인하고 잘 흔들어서 혼합한 후 사용하였다. 변성 용액 (0.2N NaOH) 15ul를 반응 트레이(tray)의 끝 부분에 분주하고, PCR 산물 15ul를 변성 용액에 첨가한 후 피펫을 사용하여 잘 혼합한 후 10분 동안 반응시켰다. 혼성화 반응 용액(3x SSC/0.1% SDS)은 사용 전에 37℃ 수조 (water bath)에서 가온하였다. 변성 반응 후, 혼성화 반응 용액 1ml를 상기 반응 트레이에 첨가하고 잘 섞었다. 다음으로, 각 반응 트레이 웰 마다에 1매의 상기 비오틴이 접합된 프로브가 고정된 니트로셀룰로즈 막을 넣고 잘 밀봉한 후, 니트로셀룰로즈 막을 흔들 수조 (shaking water bath) 안에 장착하고, 50℃에서 45분 동안 90rpm으로 흔들면서 반응시켰다. 반응 용액을 흡입을 통해 제거하고, 사전에 37℃로 가온한 A 세척용액 (3x SSC/0.1% SDS) 2ml를 반응 트레이에 넣고, 잘 밀봉한 후, 흔들 수조 안에 장착하고 50℃에서 30분 동안 90rpm으로 흔들면서 반응시켜 제1차 세척을 수행하였다. A 세척용액을 흡입에 의하여 제거하고, B 세척용액 2ml를 반응 트레이에 넣고, 잘 밀봉한 후 실온에서 흔들 수조 안에 장착하고 10 분 동안 90rpm으로 흔들면서 반응시켜 제2차 세척을 수행하였다. B 세척용액을 흡입에 의하여 제거하고, 효소 희석용 용액(0.1M Tris-HCl/0.15M NaCl, pH 7.5) 1ml를 반응 트레이에 넣고, 흡입에 의하여 제거하고, 스트렙트아비딘 접합된 알칼리 포스파타제 (Roche diagnostic) 용액 1ml를 반응 트레이에 넣고, 잘 밀봉한 후 실온에서 흔들 수조 안에 장착하고, 30 분 동안 90rpm으로 흔들면서 반응시켰다. 사용된 스트렙트아비딘 접합된 알칼리 포스파타제 용액은 스트렙트아비딘 접합된 알칼리 포스파타제와 그 희석 용액을 1:2,000 (즉, 0.5ul:1ml)으로 혼합한 것을 사용하였다.
스트렙트아비딘 접합된 알칼리 포스파타제 용액을 흡입에 의하여 제거하고, 그 희석용액 1ml를 반응 트레이에 넣고, 잘 밀봉한 후 실온에서 흔들 수조 안에 장착하고 1 분 동안 90rpm으로 흔들면서 반응시켜, 제3차 세척을 수행하였다. 상기 희석 용액을 흡입에 의하여 제거하고, NBT/BCIP 반용 용액(0.1M Tris-HCl/0.1M NaCl/0.05 M MgCl2, pH9.5) 1ml를 발색 반응 트레이에 넣고 잘 밀봉한 후, 실온에서 흔들 수조 안에 장착하고 5분 동안 90rpm으로 흔들면서 반응시켜, 발색시켰다. NBT/BCIP 반용 용액은 저장 (stock) NBT/BCIP 용액:그 희석용 용액을 1:50의 비율로 혼합하여 희석하여 얻었다. 그 후 발색 용액을 제거한 후, 증류수 1ml를 첨가하고, 니트로셀룰로즈 막을 0.05M 시트레이트 용액 (13mM citric acid/37mM Trisodium citrate/150mM NaCl)에 첨가하여 보관하였다.
대조군으로서 동일한 시료에 대하여 상업적으로 입수가능한 마이크로어레이 및 PCR 방법을 수행하였다.
실시예1 : 다중 PCR 및 라인 블롯팅 분석을 통한 HPV , CT 및 NG 의 동시 검출
(1) HPV 검출 결과
상기한 실험 방법에 의하여 개체로부터 분리된 자궁 경부 스왑 시료에 대한 HPV 검출 여부에 대한 분석 결과는 표 3과 같다. 표 3은 임상적으로 HPV 양성으로 확인된 개체로부터 분리된 시료를 사용한 것이다.
번호 마이크로어레이 본 발명 실제서열 번호 마이크로어레이 본 발명 실제서열
1 16 16 16 42 16 16,31 16
2 HPV+ HPV+ 6 43 16 16 16
3 31,18 18 18 44 66,68 66 66
4 31 31 31 45 other* 31* 84
5 16 16 16 46 16 16 16
6 39* HPV- HPV- 47 52 52 52
7 18 18 18 48 18 18 18
8 52 52,53 52 49 16,33 16 16
9 35* HPV+ 84 50 16 16 16
10 16 16 16 51 16 16,51 16
11 31,33 33 33 52 other* 16 16
12 52* 16 16 53 53 53 53
13 31 HPV+* 31 54 59 59 59
14 16 16 16 55 16 16 16
15 16 16 16 56 16 16 16
16 16 16 16 57 42 39 39
17 11 HPV+ 11 58 68 68 68
18 18 18 18 59 83 HPV+ 83
19 16 16 16 60 6 HPV+ 6
20 35 35 35 61 16 16 16
21 16 16 16 62 16 16,33 16
22 6,16 16 16 63 31 31 31
23 58 58 58 64 35 35 35
24 52* 58* 56 65 16 16 16
25 16 16 16 66 18 18 18
26 16 16 16 67 33 33 33
27 66,68 66 66 68 39 39 39
28 58 HPV+ 72 69 45 45 45
29 18 18 18 70 52 52 52
30 16 16,33 16 71 66 66 66
31 16 16,51 51 72 51 51 51
32 16 16 16 73 56 56 56
33 other HPV+ 6 74 16 16 16
34 52 52 52 75 16 16 16
35 39* HPV+ 70 76 other* 18 18
36 16 16 16 77 other* HPV+ 70
37 16 16 16 78 16 16 16
38 52 HPV+* 52 79 16,51 16 16
39 33 16,33 33 80 31,33 33 33
40 66 66 66 81 18 18 18
41 35 35 35 82 16,6,33 16 16
표 3에서 *는 불일치한 검출을 나타낸다.
임상적으로 HPV 음성으로 확인된 개체로부터 분리된 시료에 대한 검출 결과는 표 4에 나타내었다.
번호 마이크로어레이 본 발명 실제 서열 번호 마이크로어레이 본 발명 실제 서열
1 - - 38 -* 31 31
2 - - 39 - -
3 - - 40 - -
4 -* - 41 - -
5 - + 72 42 - -
6 - - 43 - -
7 - - 44 - -
8 - - 45 - -
9 - - 46 - -
10 - - 47 - -
11 - - 48 - +* -
12 - - 49 - -
13 - - 50 - -
14 - - 51 - -
15 - - 52 - -
16 - - 53 - -
17 - - 54 - -
18 - - 55 - -
19 - - 56 - -
20 - - 57 - -
21 - - 58 - -
22 - - 59 - -
23 - - 60 - -
24 - - 61 - -
25 - - 62 - -
26 - - 63 - -
27 - - 64 - -
28 - - 65 - -
29 - - 66 - -
30 - - 67 - -
31 - - 68 - -
32 - - 69 - -
33 - - 70 - -
34 - - 71 - -
35 - - 72 - -
36 - - 73 - -
37 - - 74 - -
표 4에서 *는 불일치한 검출을 나타내고, 빈칸은 PCR 결과가 음성이어서 검출을 실시하지 않고 음성으로 간주한 것이다.
(2) HPV 검출 결과의 해석
(2.1) 양성 시료에 대한 결과의 해석
양성 시료에 대한 본 발명과 기존 마이크로어레이의 결과를 비교하면 다음과 같다.
일치율 (concordance)(%)=(일치된 결과 수 72)/(전체 검사 수 82)x100=87.8%
양성 시료에 대한 본 발명의 결과와 실제 서열과 비교하면 다음과 같다.
일치율 (%)=(일치된 결과 수 78)/(전체 검사 수 82)x100=95.1%
양성 시료에 대한 기존 마이크로어레이의 결과와 실제 서열을 비교하면 다음과 같다.
일치율(%)=(일치된 결과 수 73)/(전체 검사 수 82)x100=89.0%
양성 시료에 대한 본 발명과 기존 마이크로어레이의 결과는 87.8%의 일치율을 보여 비교적 양호하였으며, 본 발명의 결과와 실제 서열을 비교한 결과 95.1%의 일치율을 보여 아주 좋았다. 기존 마이크로어레이의 결과와 실제 서열을 비교한 결과, 89.0%로서 본 발명의 결과와 실제 서열을 비교한 결과 보다 6.1% 낮은 일치율을 보였다. 따라서, 기존 마이크로어레이를 사용한 것보다 본 발명의 방법이 더 우수한 결과를 보였다.
(2.2) 음성 시료에 대한 결과의 해석
음성 시료에 대한 본 발명과 기존 마이크로어레이의 결과를 비교하면 다음과 같다.
일치율(%)=(일치된 결과 수 71)/(전체 검사 수 74)x100=95.9%
음성 시료에 대한 본 발명의 결과와 실제 서열과 비교하면 다음과 같다.
일치율(%)=(일치된 결과 수 73)/(전체 검사 수 74)x100=98.7%
음성 시료에 대한 기존 마이크로어레이의 결과와 실제 서열을 비교하면 다음과 같다.
일치율(%)=(일치된 결과 수 72)/(전체 검사 수 71)x100=97.2%
음성 시료에 대한 본 발명과 기존 마이크로어레이의 결과는 95.9%의 일치율을 보여 비교적 양호하였으며, 본 발명의 결과와 실제 서열을 비교한 결과 98.7%의 일치율을 보여 아주 좋았다. 기존 마이크로어레이의 결과와 실제 서열을 비교한 결과, 97.2%로서 본 발명의 결과와 실제 서열을 비교한 결과 보다 1.5% 낮은 일치율을 보였다. 따라서, 음성 시료에 대한 본 발명 및 기존 마이크로어레이를 사용한 결과는 모두 우수하였다.
(2.3) 양성 및 음성 시료 전체 검사 결과의 해석
양성 및 음성 시료에 대한 본 발명과 기존 마이크로어레이의 결과를 비교하면 다음과 같다.
일치율(%)=(일치된 결과 수 143)/(전체 검사 수 156)x100=91.6%
양성 및 음성 시료에 대한 본 발명의 결과와 실제 서열과 비교하면 다음과 같다.
일치율(%)=(일치된 결과 수 151)/(전체 검사 수 156)x100=96.8%
양성 및 음성 시료에 대한 기존 마이크로어레이의 결과와 실제 서열을 비교하면 다음과 같다.
일치율(%)=(일치된 결과 수 145)/(전체 검사 수 156)x100=92.9%
양성 및 음성 시료에 대한 본 발명과 기존 마이크로어레이의 결과는 91.6%의 일치율을 보여 비교적 양호하였으며, 본 발명의 결과와 실제 서열을 비교한 결과 96.8%의 일치율을 보여 아주 좋았다. 기존 마이크로어레이의 결과와 실제 서열을 비교한 결과, 92.9%로서 본 발명의 결과와 실제 서열을 비교한 결과 보다 3.9% 낮은 일치율을 보였다. 따라서, 양성 및 음성 시료에 대한 본 발명의 방법은 기존 마이크로어레이를 사용한 결과보다 우수하였다.
도 2는 HPV 시료를 다중 PCR한 후 전기영동한 결과를 나타낸 도면이다. 도 2에서, 레인 1, 4는 HPV 양성 시료에서 증폭된 HPV L1 영역 145bp, 레인 2는 크기 마커인 100bp 래더, 레인 3은 내부 표준인 250bp를 나타낸다.
(3) NG 검출 결과
상기한 실험 방법에 의하여 개체로부터 분리된 자궁 경부 스왑 시료에 대한 GN 검출 여부에 대한 분석 결과는 표 5와 같다. 비교군으로 기존에 알려진 PCR 방법을 사용하여 검출하였다.
표 5는 임상적으로 HPV 양성으로 확인된 개체로부터 분리된 시료를 사용한 것이다.
기존 PCR
시료 양성 음성 전체

본 발명
 양성 65 11 81
음성 4 67 71
전체 69 83 152
표 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법과 기존 PCR 방법은 152개 시료 중 132개가 일치하여, 86.8%의 아주 양호한 일치율을 보였다. 또한, 양성 결과 수는 기존 PCR 방법에 비하여 17.4% [(81-69)/69x100)] 증가하여, 민감도가 기존 PCR 방법에 비하여 높았다.
도 3은 자궁경부 스왑에서 추출한 DNA 시료를 다중 PCR한 후 전기영동하여 NG 양성 결과를 나타낸 도면이다. 도 3에서, 레인 1, 2, 5는 NG 양성 시료 420bp, 레인 3은 크기 마커, 레인 4는 음성 대조군을 나타낸다.
(4) CT 검출 결과
상기한 실험 방법에 의하여 개체로부터 분리된 자궁 경부 스왑 시료에 대한 CT 검출 여부에 대한 분석 결과는 표 6과 같다. 비교군으로 기존에 알려진 PCR 방법을 사용하여 검출하였다.
표 6은 임상적으로 HPV 양성으로 확인된 개체로부터 분리된 시료를 사용한 것이다.
기존 PCR
시료 양성 음성 전체

본 발명
 양성 44 9 53
음성 3 96 99
전체 37 115 152
표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법과 기존 PCR 방법은 152개 시료 중 140개가 일치하여, 92.1%의 아주 양호한 일치율을 보였다. 또한, 양성 결과 수는 기존 PCR 방법에 비하여 12.8% [(53-47)/47x100] 증가하여, 민감도가 기존 PCR 방법에 비하여 높았다.
도 4는 자궁 경부 스왑에서 추출한 DNA 시료를 다중 PCR한 후 전기영동하여 CT 양성 결과를 나타낸 도면이다. 도 4에서, 레인 1은 크기 마커, 레인 2는 음성 대조군, 레인 3은 양성 대조군 192bp를 나타낸다.
도 5는 자궁 경부 스왑에서 추출한 DNA 시료에 대하여 상기 프라이머 세트를 사용하여 다중 PCR 한 후 그 산물을 라인 블롯팅한 결과를 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 레인 1, 2, 3은 CT 양성으로 확인되었으며, 레인 2,3, 4는 HPV 양성으로 확인되었다.
<110> Pro Pre Diagnostics <120> A molecular simultaneous diagnostic kit for human papilloma virus, Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae <130> pn103499KR <160> 34 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer G51 <400> 1 tttgttactg tggtagayac tac 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer G52 <220> <221> modified_base <222> (15) <223> n is inosine <400> 2 tttgttactg ttgtngatac yac 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer G53 <220> <221> modified_base <222> (15) <223> n is inosine <400> 3 tttttaactg ttgtngatac tac 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer G54 <220> <221> modified_base <222> (15) <223> n is inosine <400> 4 tttgttactt gtgtngatac tac 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer G55 <220> <221> modified_base <222> (12) <223> n is inosine <400> 5 tttgttacwg tngtagacac tac 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer G56: n is inosine <400> 6 tttgttacwg tngtagatac cac 23 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer NGPF <400> 7 tctaatacga ctcactatag ggagaggcgg tca 33 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CTPF <400> 8 tctaatacga ctcactatag ggagacacat aga 33 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GP61 <400> 9 gaaaaataaa ytgtaaatca tattc 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GP6c <400> 10 gaaaaataaa ttgcaattca tattc 25 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer NPGR <400> 11 gcaaggtcgc atagatgcgt tctgaac 27 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CTPF <400> 12 gcaaggtcgc atagaattgt ttcggca 27 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MS3F <400> 13 aatatatgtg tgcttatttg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MS10R <400> 14 agattaggga aagtattaga 20 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe hr16 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 5'-terminal -OH is changed to -NH3 <400> 15 ggctggtacc tacgaagcca tggggag 27 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe hr18 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 5'-terminal -OH is changed to -NH3 <400> 16 aggtgtgatt gcccgttcta cacagtctcc tgtac 35 <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe hr31 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> 5'-terminal -OH is changed to -NH3 <400> 17 aagtgggcaa tgattgvaaa cagtgatac 29 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe hr33 <400> 18 ccgtgcgcct gcacacaagt aactagtga 29 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe hr35 <400> 19 ctgttgctgt gtcttctagt ga 22 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe hr39 <400> 20 cgtgctggct acattatcta cctctataga 30 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe hr45 <400> 21 ccagcgtaaa tgggcccgtt taacattatg tgcctc 36 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe hr51 <400> 22 gcatcacatg acatatgctg cggtttcccc aa 32 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe hr52 <400> 23 ggcgaccggg aatacaagct tcgtcatggc 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe hr53 <400> 24 gcgtatgtcc gtggcgaccg ggaatacaag 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe hr56 <400> 25 ggcaggtgtg atgcacgaaa aattaatcag 30 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe hr58 <400> 26 gcgggccgca gaatatgcca gacatgtg 28 <210> 27 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe hr59 <400> 27 gcgccggtcc gtttgagtat atgcactttc tgtg 34 <210> 28 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe hr66 <400> 28 cgtgaaatcg cgtgtggaaa tcaatacctt c 31 <210> 29 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe hr68 <400> 29 gccctacggc tgaatggaca gctgtaccaa a 31 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe NG capture <400> 30 caacttgatt cgttgctacg aagccatggg agc 33 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe CT capture <400> 31 ggcgatattt tgggcatcct acgaacg 27 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal Probe 1 <400> 32 gmcayrcaga rgaatatga 19 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal Probe 2 <220> <221> modified_base <222> (2) <223> n is inosine <220> <221> modified_base <222> (7)..(8) <223> n is inosine <400> 33 gncatgnnga rgaatatga 19 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal Control Probe (ICP) <400> 34 ggattgcgag cgaatgcact aaga 24

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제1 프라이머;
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제2 프라이머;
    서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제3 프라이머;
    서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제4 프라이머;
    서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제5 프라이머;
    서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제6 프라이머;
    서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제7 프라이머;
    서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제8 프라이머;
    서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제9 프라이머;
    서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제10 프라이머;
    서열번호 11의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제11 프라이머; 및
    서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제12 프라이머;를 포함하는, 시료 중의 인유두종 바이러스 (Human papilloma viruses:HPV), 임질균 (Neisseria gonorrhoeae:NG) 및 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis:CT)의 표적 서열을 증폭하기 위한 다중 PCR용 프라이머 세트.
  2. 청구항 1에 있어서, 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제13 프라이머; 및
    서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제14 프라이머;를 더 포함하는 것인 프라이머 세트.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 제9 프라이머, 제10 프라이머, 제11 프라이머, 제12 프라이머, 및 제14 프라이머는 5'-말단에 검출가능한 표지 물질에 특이적으로 결합하는 물질이 부착된 것인 프라이머 세트.
  4. 청구항 1에 있어서, 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제1 프로브;
    서열번호 16의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제2 프로브;
    서열번호 17의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제3 프로브;
    서열번호 18의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제4 프로브;
    서열번호 19의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제5 프로브;
    서열번호 20의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제6 프로브;
    서열번호 21의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제7 프로브;
    서열번호 22의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제8 프로브;
    서열번호 23의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제9 프로브;
    서열번호 24의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제10 프로브;
    서열번호 25의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제11 프로브;
    서열번호 26의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제12 프로브;
    서열번호 27의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제13 프로브;
    서열번호 28의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제14 프로브;
    서열번호 29의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제15 프로브;
    서열번호 30의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제16 프로브;
    서열번호 31의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제17 프로브;
    서열번호 32의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제18 프로브;
    서열번호 33의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제19 프로브; 및
    서열번호 34의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제20 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 프로브를 더 포함하는 것인 프라이머 세트.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 하나의 프라이머 세트를 포함하는, 시료 중의 인유두종 바이러스 (Human papilloma viruses:HPV), 임질균 (Neisseria gonorrhoeae:NG) 및 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis:CT)의 표적 서열을 다중 PCR에 의하여 증폭하기 위한 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 프로브는 막에 서로 구분되는 특정한 위치에 고정된 것인 조성물.
  7. 삭제
  8. 개체로부터 분리된 시료 중의 핵산과 청구항 1 내지 4 중 어느 하나의 프라이머 세트를 접촉시켜 혼성화시키고 혼성화 산물을 연장시켜 표적 핵산을 증폭시키는 단계 및
    상기 증폭된 표적 핵산을 프로브와 혼성화시켜 혼성화 산물을 검출하는 단계를 포함하는 시료 중의 인유두종 바이러스 (Human papilloma viruses: HPV), 임질균 (Neisseria gonorrhoeae:NG) 및 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis:CT)의 표적 서열을 검출하는 방법으로서,
    상기 프로브는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제1 프로브;
    서열번호 16의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제2 프로브;
    서열번호 17의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제3 프로브;
    서열번호 18의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제4 프로브;
    서열번호 19의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제5 프로브;
    서열번호 20의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제6 프로브;
    서열번호 21의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제7 프로브;
    서열번호 22의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제8 프로브;
    서열번호 23의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제9 프로브;
    서열번호 24의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제10 프로브;
    서열번호 25의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제11 프로브;
    서열번호 26의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제12 프로브;
    서열번호 27의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제13 프로브;
    서열번호 28의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제14 프로브;
    서열번호 29의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제15 프로브;
    서열번호 30의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제16 프로브;
    서열번호 31의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제17 프로브;
    서열번호 32의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제18 프로브;
    서열번호 33의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제19 프로브; 및
    서열번호 34의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 제20 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상인 것인 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 프로브는 막에 서로 구분되는 특정한 위치에 고정되어 있고, 상기 검출은 혼성화 산물이 존재하는 것으로 확인된 막 상의 프로브의 위치에 의하여 이루어지는 것인 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 제9 프라이머, 제10 프라이머, 제11 프라이머, 제12 프라이머, 및 제14 프라이머는 5'-말단에 검출가능한 표지 물질에 특이적으로 결합하는 물질이 부착된 것으로서, 상기 5'-말단에 검출가능한 표지 물질에 특이적으로 결합하는 물질은 비오틴이고, 상기 검출은 스트렙트아비딘-접합된 기질을 발색물질로 전환하는 효소를 혼성화 산물과 접촉시켜 기질을 발색물질로 전환하는 단계를 포함하는 것인 방법.
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